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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet von
therapeutischen Anwendungen für tumorspezifische
monoklonale Antikörper, spezieller auf radiotherapeutische
Immunkonjugate, die für die Krebstherapie einsetzbar sind.
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Immuntherapeutische Verfahren, die ausgelegt sind, um
Radioisotope nahe an Krebszellen zu lokalisieren, werden
mit einer Vielzahl von Radionucliden in breitem Maßstab
getestet. In der Theorie könnten solche Radionuclide
ausreichend Strahlung abgeben, um einen Tumor durch zahlreiche
Zellschichten zu zerstören, der von dem primären
Zerfallsereignis entfernt liegt. Klinische Studien zeigen jedoch,
daß radioaktiv markierte monoklonale Antikörper in der
Lage sind, weniger als etwa 0,004 % einer injizierten Dosis
Radioaktivität an einem menschlichen Tumor zu lokalisieren.
Als Folge davon ist es unsicher, ob monoklonale Antikörper
in der Lage sein werden, therapeutische Mengen einer
Strahlung an ein Tumorvolumen abzugeben, ohne signifikante
Strahlungstoxizität in dem übrigen Körper zu verursachen.
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Therapeutische Anwendungen von Immunkonjugaten von
radioaktivem Jod bei Patienten war beschränkt auf die Anwendung
von Jod-131 (¹³¹I). In jüngster Zeit wurde in der
technischen Literatur von Untersuchungen berichtet, die sich
auf die in vitro Zytotoxizität von mit radioaktivem Jod-125
(¹²&sup5;I) markierte monoklonalen Antikörpern beziehen.
Cancer Research 45: 5080 (1985) beschreibt spezifisches
Abtöten von menschlichen Melanomzellen durch einen mit
¹²&sup5;I markierten von Mäusen stammenden monoklonalen
Antikörper, der gegen ein Mr 250.000 Melanom-assoziiertes
Antigen gerichtet ist. Blood 67:429 (1986) beschreibt
selektive Zytotoxizität von mit ¹²&sup5;I markiertem von Mäusen
stammenden monoklonalen Antikörper, der spezifisch für das
T65 Antigen auf menschlichen malignen T-Zellinien ist. In
dieser Referenz wird beschrieben, daß ausgedehnte
Exponierzeiten unter Gefrierbedingungen erzielt wurden und zu einem
niedrigen Grad der Internalisierung führten. Klinisch
brauchbare Anwendungen für ¹²&sup5;I-markierte monoklonale Antikörper
sind von signifikantem Interesse für das biomedizinische
Gebiet. Mariani et al. (Nucl. Med. Bio. Vol. 16(2), 1989,
Seiten 147-150) beschreiben einen ¹²&sup5;I-markierten
monoklonalen Antikörper (345), der spezifische für
Oberflächenmembranen von Ratten-Insulinomzellen ist. Obgleich gefunden wurde,
daß der Antikörper internalisiert wurde, wurde er auch von
dem Marker gelöst, was zu der Freigabe von freiem ¹²&sup5;I
außerhalb der Zellen führte.
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Die vorliegende Erfindung liefert ein radiotherapeutisches
Immunkonjugat, das einen tumorspezifischen monoklonalen
Antikörper und ein Auger-Elektronen emittierendes
Radionuclid umfaßt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß der
Antikörper der 17-1A monoklonale Antikörper oder ein
Fragment desselben ist, der zur Tumor-Nucleus-Lokalisierung
des Radionuclids fähig ist, und das Auger-Elektronen
emittierende Radionuclid ¹²&sup5;I ist. Das radiotherapeutische
Immunkonjugat kann in einer therapeutisch wirksamen Menge
Patienten verabreicht werden, die eine mit dem Antikörper
oder dem Fragment reaktionsfähige Malignität haben oder von
denen man annimmt, daß sie sie haben.
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Die Erfindung kann brauchbar sein zum Behandeln von 17-1A-
positiven Malignitäten, wobei sie das Verabreichen einer
therapeutisch wirksamen Menge des obigen radiotherapeutischen
Immunkonjugats umfaßt.
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Figur 1a zeigt die Internalisierung von ¹²&sup5;I MAb 17-1A in
17-1A-positiven Tumorzellen (SW1116) auf Inkubation bei
0ºC folgend. Figur 1b zeigt Internalisierung auf Inkubation
bei 37ºC folgend.
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Figur 2 zeigt Internalisierung von ¹²&sup5;I MAb 17-1A in SW1116
Zellen auf Inkubation bei 37ºC folgend.
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Figur 3 zeigt die Ergebnisse eines Kontrollexperiments, bei
dem Internalisierung von ¹²&sup5;I MAb 1116-NS-19-9 in SW1116
Zellen gemessen wurde folgend auf Inkubation bei 0ºC und
37ºC.
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Die Figuren 4a, 4b, 4c und 4d zeigen Chromosomenaberrationen,
die in SW1116 Zellen - aufgrund von
spezifischen ¹²&sup5;I-markierten monoklonalen Antikörpern und
Kontrollmitteln eingeschnitten sind.
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Figur 5* zeigt die Anzahl von Zellen mit Chromosomenbrüchen
(CB) pro 100 Metaphasen nach dem Aussetzen verschiedener
Konzentrationen von ¹²&sup5;I-radiomarkiertem und unmarkiertem
MAb 17-1A.
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Figur 6** zeigt eine Zellüberlebenskurve für SW1116 und 17-1A-
negative Tumorzellen (WISH) folgend auf Inkubation mit
¹²&sup5;I-radiomarkiertem MAb 17-1A.
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Anmerkung: Es muß richtig heißen bei *) Fig. 5 und 6 und
bei **) Fig. 7
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Wie der Ausdruck "Tumorzellennucleus-Lokalisierung" hier
verwendet wird, bedeutet er, daß der Antikörper oder das
Fragment spezifische Inkorporierung in den Kern (Nucleus)
von Säugetierzellen und seine verwandten Komponenten
(Kernmembran, Kernplasma, Chromatin, Chromosomen, Nucleolus,
Nucleosomen, DNA und RNA) zeigt. Es wurde gefunden, daß die
Immunkonjugate der Erfindung zur selektiven Zytotoxizität
für Tumor in der Lage sind, ohne normale Gewebe zu
beschädigen.
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Es wurde berichtet, daß der monoklonale Antikörper 17-1A
(hier MAb 17-1A) an ein tumorspezifisches Antigen (hier
"17-1A Antigen") bindet, das gastrointestinalen
Adenokarzinomen zugeordnet ist (Koprowski, H., Steplewski, Z.,
Mitchell, K., Herlyn, M., Herlyn, D. & Fuhrer, J.P.
Somat. Cell Genet., 5:957-972 (1979); Sears, H.F.,
Herlyn, D., Herlyn, M., Grotzinger, P.J., Steplewski, Z.,
Gerhard, W. & Koprowski, H.J. Surg. Res., 31:145-150 (1981)).
Das Antigen wurde charakterisiert (Ross, A.H., Herlyn, D.,
Iliopoulos, D. und Koprowski, H. Biochemical and Biophys
Res. Comm., 135:297-303 (1986)) und wird als ein
Zelloberflächenprotein mit zwei Untereinheiten mit 30.000 bis
40.000 Daltons beschrieben.
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Auger-Elektronen emittierende Radionuclide sind in der
Technik bekannt. Beispielsweise zerfällt radioaktives Jod-125
durch Elektroneneinfang (T1/2 = 60,5 Tage) zu dem
metastabilen Zustand von Tellur-125m, das sofortige Zerfallsereignisse
durch innere Konversion (93%) und durch Gammastrahlen-
Emission (7%) zu der Tellur-125-Tochter durchläuft. Aufgrund
erzeugter Leerstellen in den inneren Schalen tritt eine
komplexe Serie von Elektronenschalenumordnungen auf, die
zu Röntgenstrahlen mit niedriger Energie (27-35 kev) und
einer Kaskade von Elektronen mit niedriger Energie führt.
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Tumorspezifische 17-1A monoklonale Antikörper oder Fragmente
derselben können mit einem Auger-Elektronen emittierenden
Radionuclid durch irgendeines der vielen bekannten
Markierungsverfahren markiert werden. Die bevorzugte Technik für
¹²&sup5;I-Markierung ist die von Markwell, M.A.K. & Fox, C.F.
Biochemistry 17: 4807-4817 (1978). Die Antikörper können
auch mit radioaktivem Jod durch eine Vielzahl anderer gut
bekannter Verfahren (z.B. Chloramine T, Bolton-Hunter oder
Lactoperoxidase) markiert werden.
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Das radiotherapeutische Immunkonjugat kann in einer
therapeutisch wirksamen Menge einem Patienten verabreicht werden,
der eine Malignität hat, oder von dem man annimmt, daß er
eine Malignität haben kann, die mit dem Antikörper oder der
Fragmentkomponente des Immunkonjugats reaktionsfähig ist.
Verfahren zum Verabreichen von radiotherapeutischen
Immunkonjugaten an Patienten sind in der Technik bekannt.
Vorzugsweise wird das vorliegende Immunkonjugat in einer Menge
von etwa 20 bis 200 milliCurie Radioaktivität, die
Massenquantitäten des Antikörpers von etwa 2 bis 20 mg
repräsentiert, verabreicht.
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Obgleich keine Bindung durch die Theorie erwünscht ist, wird
angenommen, daß, damit der vorliegende ¹²&sup5;I-markierte
monoklonale Antikörper wirksam ist, der monoklonale Antikörper
zuerst signifikant in die Zelle als ein Ergebnis der Bindung
an ihr spezifisches Membran-Antigen internalisiert werden
muß. Es wird weiter angenommen, daß für maximale Zelltötung
von 17-1A positiver Malignität der I-125 radioaktiv
markierte monoklonale Antikörper oder seine radioaktiven
Zerfallsprodukte direkt an den Kern (Nucleus) binden müssen.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
beschrieben, wobei alle Teile und Prozentsätze Gewichtsteile
und Gewichts-Prozentsätze und die Grade Celsius-Grade sind.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
Tumorzellinien und monoklonale Antikörper.
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Menschliche
Colon-Krebs-SW1116-Zellen wurden in RPMI 1640 Medium,
ergänzt mit 20% fötalem Kälberserum, gezüchtet. Eine andere
als WISH bezeichnete Zellpopulation, menschliche Amnion-
Zellen, die von der American Type Tissue Collection
(Rockville, Md) erhalten worden waren, wurde in dem
gleichen Medium, das 10% fötales Kälberserum enthielt,
gezüchtet. Diese Zellinie enthielt keine tumorspezifischen
Antigene, die den MAb 17-1A binden. Die Zellinien wurden
in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von
5% CO&sub2; in Luft bei 37ºC gehalten. Für die folgenden
Beispiele und Kontrollexperimente wurden alle Zellen in log-
Phase (logarithmische Wachstumsphase) geerntet, indem das
Medium entfernt wurde, mit 0,05% Trypsin, enthaltend 0,02%
EDTA und 5 µg/ml DNAase gewaschen wurde und in frischem
Medium bis zu verschiedenen Zellkonzentrationen in
Abhängigkeit von der Untersuchung wieder suspendiert wurde.
Die monoklonalen Antikörper 17-1A, IgG(2a) Isotop;
1116-NS-19-9, IgG(2a) Isotop und R11D10, IgG(2a) Isotop
wurden in den Versuchsanordnungen verwendet. Der 1116-NS-19-9
monoklonale Antikörper bindet an ein Colon-Krebs-Antigen,
das von der SW1116 Zellinie abgeworfen wird. Der R11D10
monoklonale Antikörper zeigt Reaktionsfähigkeit mit
Kardia-Myosin (Herzmuskelprotein) und wurde als ein nicht-
immunreaktionsfähiger Kontroll-Antikörper verwendet.
Radiojodierung.
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Alle monoklonalen Antikörper wurden mit
¹²&sup5;I markiert, wobei das Iodogen (Pierce Chemical Co.)
Verfahren (Markwell, M.A.K. & Fox, C.F. Biochemistry
17:4807-4817 (1978)) angewendet wurde. Zu mit Iodogen
beschichteten Rohren wurden 200 µg Antikörper (10 mg/ml,
albuminfrei) hinzugegeben, woraufhin 80 µl PBS (0,1M
Phosphatpuffer in Salzlösung, pH 7,0) folgten. Etwa 2,5
milliCurie Na ¹²&sup5;I (trägerfrei, Dupont NEN) wurden sofort
hinzugegeben, und die resultierende Reaktion wurde 10
Minuten durchgeführt. Die Reaktion wurde abgeschreckt,
indem eine Ascorbinsäurelösung (0,5 ml, 10 mg/ml) verwendet
wurde und das gebundene ¹²&sup5;I von jeglichem freien Iodid-Ion
auf einer Sephadex G-25M Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden)
abgetrennt wurde, die mit einer 2-prozentigen
Humanserumalbimin-Salzlösung vorgewaschen worden war. Der radioaktiv
markierte Antikörper wurde in dem leeren Volumen eluiert
und in einem Natriumiodid-Gamma-Scintillationszähler
untersucht.
Immunreaktivität und Internalisierung.
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Immunreaktivität des
¹²&sup5;I-markierten MAb 17-1A wurde durch direkte Zellbindung
mit verschiedenen Konzentrationen des radioaktiven
Antikörpers bewertet. SW1116 Zellen (5 x 10&sup5;) wurden in 100 µl
RPMI 1640 Medium (20% fötales Kälberserum) bei 37º 4 Stunden
in "Microfuge-Röhrchen" (Beckman) mit verschiedenen
Konzentrationen von markiertem Antikörper (0,039 - 20 µCurie/ml)
inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen
zentrifugiert und zweimal mit PBS (pH 7,4), das 10% Pferdeserum
(Flow Laboratories, Va) und 0,02% NaN&sub3; enthielt, gewaschen.
Die endgültige Zelltablette (das endgültige Zellpellet)
wurde in einer
Natriumiodid-Gamma-Scintillationszähleranordnung gemessen, um die 35 keV Röntgenstrahlen von ¹²&sup5;I
zu erfassen.
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Die Internalisierung von I-markiertem MAb 17-1A wurde
bestimmt, indem 2 x 10&sup6; Zellen in RPMI 1640 Medium (20%
fötales Kälberserum) in einer festen Konzentration von
Antikörpern (0,5 µCurie/ml, 0,72 µg, 10 µl) über
verschiedene Zeitperioden (von 0 bis 48 Stunden) inkubiert wurden.
Nach der Inkubation bei 37º unter gelegentlichem Schütteln
wurde das Gemisch zentrifugiert und viermal mit 1 ml des
PBS, das 10% Pferdeserum und 0,02% NaN&sub3; enthielt, gewaschen.
Nach dem endgültigen Zentrifugieren wurden die überstehenden
Flüssigkeiten weggeworfen und das Zellpellet wurde auf
Radioaktivität untersucht. Die gesamte Zellbindungs-(der
Zelle zugeordnete )Radioaktivität wurde bestimmt. Die
Zellpellets wurden dann in 0,2 ml Glycin-HCl-Puffer, pH 2,8,
wieder suspendiert und 20 Minuten bei 0º inkubiert. Die
gesamte der Zelle zugeordnete Radioaktivität wurde durch
Zentrifugieren in die Zellpellets, die den
säure-unentfernbaren Anteil enthielten, und die Uberstände, die den
säureentfernbaren Anteil der Radioaktivitäten enthielten,
getrennt. Die Überstände und die Zellpellets wurden
getrennt auf ihren radioaktiven Inhalt untersucht. Dieses
Verfahren wurde dann wiederholt, wobei die
Inkubationsperioden bei 0º durchgeführt wurden.
Versuchsanordnungen (Assays) für Chromosomenschädigung.
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Näherungsweise 10&sup6; Zellen in Log-Phase wurden in einen
Kolben (25 cm²), der 5 ml Wachstumsmedium enthielt,
eingeimpft. Nach Inkubation bei 37º über 24 Stunden wurden
verschiedene Konzentrationen von ¹²&sup5;I-markierten monoklonalen
Antikörpern oder Kontrollmittel zu der Kultur hinzugegeben,
und die entstandenen Gemische wurden weiter 48 Stunden
inkubiert. Die Zellen wurden in Metaphase mit Demecolcin
(0,06 µg/ml) 5 Stunden vor der Beendigung der Inkubation
festgehalten. Die Monoschichten wurden durch Inkubieren
mit 0,05% Trypsin über 10 Minuten dispergiert, und die
Zellen wurden mit 10 ml 0,075 M KCl als einem Hypotonikum
40 Minuten bei 37º behandelt. Die entstandene
Zellsuspension wurde in 15 ml Zentrifugenröhrchen übergeführt und
mit 5 ml frisch zubereiteter Carnoy-Lösung (Essigsäure
:-Methanol, 1:3) leicht gemischt und bei Umgebungstemperatur
10 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden gewonnen durch
Zentrifugieren bei 1000 Upm über 10 Minuten, Entfernen des
Überstands und leichtes Wiedersuspendieren in 10 ml frischer
Carnoy-Lösung. Die Inkubationsperiode bei Umgebungstemperatur,
das Zentrifugieren und das Wiedersuspendieren wurden dreimal
wiederholt. Schließlich wurden 3 - 4 Tropfen Zellsuspension
auf saubere, kalte nasse Scheiben tropfen gelassen und an
Luft trocknen gelassen. Die Scheiben wurden dann mit Giemsa
gefärbt. Eine Gesamtheit von 100 Zellen von
Duplikatexperimenten
(50 Zellen von jedem) wurden bei jedem Dosisniveau
unter Ölimmersion analysiert. Sie wurden auf
Chromatidenbrüche, azentrische Fragmente, multizentrische Chromosomen,
Ringe und Chromatiden-Austausch gemessen.
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In der quantitativen Analyse wurden die verschiedenen Typen
von Chromosomenaberrationen als Chromosomenbrüche (CB)
ausgedrückt. Fragment und Chromatidenbrüche wurden einem
Bruch zugeordnet; dizentrische und Ringfiguren wurden als
zwei Brüche gezählt. In Fällen von Chromatidenaustausch
wurde die Anzahl der Brüche durch die Konfiguration und die
Anzahl von Chromosomen, die an der Austauschfigur beteiligt
waren, bestimmt.
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Für die Bestimmung von Mikrokernen (Mikronuclei MN) waren
die Verfahren für Zellkultur und die
¹²&sup5;I-Antikörperbehandlungen die gleichen wie die Chromosomenversuchsanordnung.
Nach Trypsinisierung und Quellen lassen in Hypotonikum KCl
über 10 Minuten bei 37º wurden die Einzelzellen-Suspensionen
in eiskaltem Carnoy-Fixativ fixiert und wurden auf saubere
Glasscheiben tropfen gelassen. Zytoplasmische Strukturen
wurden als MN gezählt, wenn sie die gleiche Giemsa-
Färbungsreaktion wie der Nucleus zeigten, klar von dem
Nucleus aufgelöst wurden (um sie von Nuklearbläschen zu
unterscheiden) und Durchmesser hatten, die 1/6 bis 1/3 von
dem des Nucleus waren. Eine Gesamtheit von 2000 Zellen von
Duplikatexperimenten (1000 von jedem) wurde bewertet und
für jeden Datenpunkt gemittelt.
Zellüberleben.
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Exponentiell wachsende Zellen wurden
trypsiniert, und es wurden Serienverdünnungen von Zellsuspensionen
zubereitet. Eine geeignete Anzahl von lebensfähigen
Einzelzellen (1x10³ - 4x10&sup4;) , was von dem erwarteten
Plattierungswirkungsgrad und Überlebensanteil abhing, wurde auf 3 - 5,
60 mm Petrischalen gesät, die 4 ml Wachstumsmedium enthielten.
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Die unterschiedlichen Konzentrationen von ¹²&sup5;I-markiertem
MAb 17-1A (0-40 µCurie/ml) und Kontrollmittel wurden zu
dieser Zeit hinzugegeben. Die Zellen wurden bei 37º 48
Stunden inkubiert. Die Verdopplungszeit für die SW1116
Zellen wurde bestimmt, und es wurde gefunden, daß sie etwa
48 Stunden war (direkte Zellzählung durch Typan-Blau-
Ausschluß von bekannten Zellzahlen bei verschiedenen
Zeitintervallen). Nach dem Exponieren über 48 Stunden mit den
Testmitteln wurde das Medium abgesaugt, und die Zellen
wurden einmal mit PBS gewaschen. Es wurde neues
Wachstumsmedium hinzugegeben, und die Zellen wurden über weitere 19
Tage in der angefeuchteten 5% CO&sub2; Atmosphäre bei 37º
inkubiert, um Koloniebildung zu gestatten. Platten wurden dann
mit Crystal Violet (Fisher Scientific Co.) gefärbt, und
einzelne Kolonien, die mehr als 50 Zellen enthielten,
wurden gezählt. Der Zellüberlebenswert wurde unter
Verwendung der folgenden Formel bestimmt.
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Teilüberleben = mittlere Plattenzählung der Tests/Anzahl der plattierten Zellen x P.E.
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P.E. (Plattierungseffizienz) = mittlere Plattenzählung der Kontrollen/Anzahl der plattierten Zellen
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Duplikatunabhängige Experimente wurden verwendet, um das
durchschnittliche Teilüberleben zu bestimmen. Eine 17-1A-
negative Tumorzellinie (WISH) wurde auch für Zellüberleben
mit dem radioaktiv markierten MAb 17-1A verwendet.
ERGEBNISSE
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Die Radiomarkierung von MAb 17-1A mit ¹²&sup5;I führte zu einer
spezifischen Aktivität von 10-12 milliCurie/mg. Die
durchschnittlichen Radiojodierungsausbeuten waren 90 - 95%
effizient. Dieses Verfahren kann aufgebaut werden zum
Radiomarkieren viel größerer Mengen von I-125, größer als
25 milliCurie. Die Immunreaktivität des endgültigen
markierten Produktes wurde in einer einfachen
Zellbindungsversuchsanordnung (Figur 1) bewertet, die die relative
Menge der Radioaktivität anzeigt, die an Tumorzellen (SW1116)
gebunden ist, die verschiedenen Konzentrationen von ¹²&sup5;I-
markierten Antikörpern ausgesetzt waren, im Vergleich zu
einem nicht-immunreaktionsfähigen ¹²&sup5;I Antikörper (R11D10),
der vernachlässigbare Bindung zeigte (nicht graphisch
aufgetragen, weil sie außerhalb der Skala lag). Die Menge
der Radioaktivität, die durch Zellen gebunden war, die
MAb 17-1A ausgesetzt waren, wurde ein konstanter Bruchteil,
wenn die radioaktive Konzentration größer als 10 µCurie/ml
ist. Für die Anzahl der Zellen (2 x 10&sup5;), die in dieser
Versuchsanordnung verwendet wurden, scheint 0,67 pCurie
von ¹²&sup5;I maximal pro Zelle oder 1,5 dpm/Zelle gebunden zu
sein. Dies beläuft sich auf näherungsweise 1,9 x 10&sup5;
Radiojod-Atome pro Zelle oder 0,047 Picogramm Antikörper (unter
der Annahme 1 Jod-Atom pro Antikörper Molekül). Der
radiomarkierte nicht-immunreaktionsfähige MAb R11D10 zeigte
geringe Gesamtzellbindung an die SW1116 Zellen (etwa
2,5 x 10&supmin;&sup4; dpm pro Zelle).
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Die Internalisierung von ¹²&sup5;I-markiertem MAb 17-1A durch
SW1116 Zellen wurde bestimmt, indem die Zellbindung entweder
bei 0 oder 37º gemessen wurde und eine milde Säurewaschung
angewendet wurde, um den Antigen-Antikörper-Komplex
auseinanderzubringen, der freie Antikörper von membrangebundenem
Antigen zurück in die Lösung freigab. In diesen Beispielen
und Experimenten wurde die folgende Formel angewendet:
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% Internalisierung = radioaktive Zähleinheiten im Zell-Pellet (säure-unentfernbar) x 100 %/gesamte Zellbindungszelleinheiten
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Der Betrag der internalisierten I-125 Radioaktivität, nachdem
die Zellen dem ¹²&sup5;I-markierten MAb 17-1A ausgesetzt worden
waren, wurde bestimmt, und die Ergebnisse sind in Figur 1a
und 1b dargestellt. Wie in Figur 1a gezeigt ist, sind die
Gesamt-Zellbindungskurve (der Zelle zugeordnete
Radioaktivität) und die Überstandskurve (säure-entfernbare
Radioaktivität) ähnlich bei 0º, da mehr als 90% von dem Antikörper
von dem membrangebundenen Antigen entassoziiert wurde und
in dem Uberstand zu den verschiedenen Zeitperioden
rückgewonnen wurde. Eine Inkubation von SW1116 Zellen bei 37ºC
(Figur 1b) mit dem radioaktiven MAb 17-1A führte zu einem
signifikanten Anteil an Radioaktivität, der bei dem
Zellpellet (säure-unentfernbar) verblieben war, der mit der Zeit
der Inkubation anstieg, so daß weniger Radioaktivität in
dem Überstand (säure-entfernbar) verblieb.
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Der relative Prozentsatz, der in die SW1116 Zelle
internalisierte, stieg signifikant von 4 Stunden (29%) bis 48 Stunden
(49%) Inkubation, wie es in Figur 2 gezeigt ist. Deshalb
legen diese Ergebnisse die Vermutung nahe, daß
Internalisierung des radiojodierten MAb 17-1A nach der Bindung an sein
zellspezifisches Antigen eintritt und diese internalisierte
Menge mit der Zeit ansteigt. Ergebnisse, die von
Untersuchungen mit dem radiomarkierten (¹²&sup5;I)
nicht-immunreaktionsfähigen R11D10 Antikörper (458-695 cpm (Zählung/min),
0 - 4 Stunden bei 37º; 372 - 491 cpm, 0 - 4 Stunden bei 37º)
und ¹²&sup5;I-markiertem 1116-NS-19-9 Antikörper erhalten wurden,
sind in Figur 3 gezeigt und legen die Vermutung nahe, daß
wenig oder keine Internalisierung bei 37º stattfand.
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Chromosomenaberrationen in mitotischen Figuren von Zellen,
die steigenden Konzentrationen von radiomarkierten 12
monoklonalen Antikörpern und Kontrollmitteln ausgesetzt
waren, wurden bewertet, und die Ergebnisse sind in den
Figuren 4a, 4b, 4c und 4d gezeigt. In diesen Experimenten
wurde die Anzahl von Zellen pro 100 Metaphasen mit
Chromosomenbrüchen (CB) von Duplikatproben bewertet, die um
± 10% variierten, und die Ergebnisse sind in Figur 4a
gezeigt (Null µC/ml Konzentrationen repräsentieren
Untergrund-Chromosomenaberrationen, die zu der Zeit mit jedem
Testmittel bestimmt wurden). In jeder Probe wurden 50
Zellmetaphasen analysiert. Die gesamte Zahl von CB in 100
Metaphasen ist in Figur 4b gezeigt. Die Ergebnisse zeigten,
daß mehrfache Brüche bei höheren radioaktiven
Konzentrationen eintraten. Die Anzahl der Zellen mit Mikronuclei
(MN), gebildet pro 1000 Zellen, wurde auch bewertet, und
die Ergebnisse (Durchschnittswert von Duplikatproben, die
um ± 10% variierten) sind in Figur 4c gezeigt. Die
durchschnittliche Gesamtzahl von MN pro 1000 Zellen von
Duplikatproben (+10% Schwankung) sind in Figur 4d gezeigt.
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Die Figuren 4a-d zeigen spezifische Kernbeschädigung durch
die ¹²&sup5;I Zerfallsereignisse an. Das ¹²&sup5;I-R11D10 und das
Na¹²&sup5;I bei ansteigenden radioaktiven Konzentrationen
führten nicht zu irgendeiner erhöhten Frequenz der
Aberrationen oder der gesamten Zahl der Aberrationen. Das nicht-
internalisiert ¹²&sup5;I-markierte 116-NS-19-9, das ein
abgestoßenes Antigen auf den SW1116 Zellen bindet, führte zu
etwas höherer Frequenz der Chromosomenaberrationen als
normale Kontrollwerte. Die durch den ¹²&sup5;I-markierten MAb
17-1A verursachte Auger-Elektronen-Beschädigung zeigte
eine mit dem Dosis-abhängigen Ansprechen verbundene
Erhöhung in den Chromosomenaberrationen, wie ersichtlich ist,
mit erhöhter Frequenz und Gesamtanzahl von gemessenen
Aberrationen (Figuren 4a und 4b).
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Chromosomen-Untersuchungen mit äquivalenten Massemengen von
radioaktivem und nicht-radioaktivem MAb 17-1A bei
konstanter spezifischer Aktivität wurden durchgeführt, um zu
bestimmen, ob die Zellularschädigung dem ¹²&sup5;I allein zu
zuschreiben ist. Bei diesem Experiment wurden numerische
Werte von Duplikatproben (50 Zell-Metaphasen) mit ± 10%
Schwankung gemessen. Figur 5a* zeigt Chromosomenbrüche in SW1116
in dem Vergleich zu WISH Zellinien, die ¹²&sup5;I-markiertem
MAb 17-1A ausgesetzt waren. Figur 5b** zeigt die Ergebnisse,
wenn radiomarkierter MAb 17-1A mit äquivalenter molarer
Konzentration von unmarkiertem MAb 17-1A in SW1116 Zellen
verglichen wird, und zeigt keine erhöhte
Chromosomenbeschädigung über normalen Untergrundniveaus für
unmarkierten Antikörper.
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Chromosomenbeschädigung wurde nicht in irgendeinem
signifikanten Grad in der WISH Zellinie beobachtet, die dem
¹²&sup5;I-markierten MAb 17-1A ausgesetzt worden war, wie es
in Figur 5a* gezeigt ist. Eine andere Anzeige für
spezifische Kernbeschädigung, die durch Strahlenwirkung verursacht
worden ist, ist die Bildung von Mikronuclei (Mikrokernen)
in Zellen. Die mittlere Frequenz und die gesamte mittlere
Anzahl von Mikronuclei pro 1000 Zellen (Mittelwert von 2
getrennten Experimenten) war signifikant erhöht über
Kontrollmitteln, wie es in den Figuren 4c und 4d gezeigt ist.
Diese Ergebnisse legen nahe, daß der ¹²&sup5;I-markierte MAb
17-1A spezifische Chromosomenbeschädigung induzieren kann,
was wahrscheinlich auf die Auger-Elektronen zurückzuführen
ist, die proportional mit ansteigender radioaktiver
Konzentration ansteigt. Bei den höheren radioaktiven
Konzentra-* richtig muß es heißen: Fig. 5
** richtig muß es heißen: Fig. 6
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tionen (größer als 10 µCurie/ml) gibt es eine größere
Anzahl von Gesamt-Chromosomenbrüchen (CB) aufgrund erhöhter
Mehrfachbrüche pro Zelle und auch eine erhöhte Anzahl von
Mikronuclei (MN). Zusätzlich gab es einen etwa 10-fachen
Anstieg in den Anzahlen von Zellen, die charakteristische
strahleninduzierte Pulverisierung der Chromosomen bei den
höheren radioaktiven Konzentrationen zeigten. Die
Ergebnisse legen nahe, daß spezifische Chromosomenbeschädigung
durch einen Auger-Elektronen-Emitter verursacht werden
kann, der an einem monoklonalen Antikörper befestigt ist,
welcher internalisiert wird und direkt mit der DNA
wechselwirkt.
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Die Wirkung von ¹²&sup5;I-markiertem MAb 17-1A auf Zellüberleben
wurde bestimmt, indem SW 1116 und WISH Zellinien verwendet
wurden, und die Ergebnisse sind in Figur 6* dargestellt.
In diesen Experimenten wurde log (% Teilüberleben) gegen
radioaktive Konzentration gemessen. Numerische Ergebnisse
basierten auf dem Mittelwert von Duplikatexperimenten.
¹²&sup5;I-markierter R11D10 als nicht-immunreaktionsfähiger
Antikörper wurde mit ¹²&sup5;I-markiertem MAb 17-1A in SW1116
Zellen verglichen. Zusätzlich wurde ¹²&sup5;I-markierter MAb
17-1A-Zellüberleben in WISH Zellen mit unmarkiertem MAb
17-1A bei äquivalenten molaren Konzentrationen (1,4 - 5,6
x 10&supmin;&sup9; M) verglichen.
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Die Zellüberlebenskurve für ¹²&sup5;I-markierten MAb 17-1A zeigt
eine 3 log Reduktion in den Kolonie-Zelleinheiten (Figur 7)
als eine Funktion von ansteigender radioaktiver
Konzentration (2,5 bis 40 µCurie/ml). Der ¹²&sup5;I-markierte MAb-17-1A
zeigte keine Zytotoxizität auf die WISH Zellinie, und
Exponieren von SW1116 Zellen einer wachsenden
nicht-radioaktiven MAb 17-1A Konzentration (1,4 - 5,6 x 10&supmin;&sup9; M) hatte
keinen Einfluß auf Kolonie-Uberleben. Auch die Wirkung von
* richtig muß es heißen: Fig.7
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radiomarkiertem ¹²&sup5;I-R11D10 (nicht-immunreaktionsfähiger
Antikörper) hatte keinen Einfluß auf Zellüberleben. Diese
Ergebnisse legen nahe, daß das ¹²&sup5;I verantwortlich ist für
die Verursachung von verringertem Überleben von Zellen,
die Antigen enthalten, das spezifisch für den
radiomarkierten MAb 17-1A ist, da Zellen, die kein Antigen enthalten,
nicht durch das ¹²&sup5;I angegriffen werden.
Diskussion
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Es ist gefunden worden, daß das Exponieren von
17-1A-positiven Tumorzellen mit einem Immunkonjugat, das einen
monoklonalen Antikörper, der spezifisch für das 17-1A Antigen
ist, und ¹²&sup5;I umfaßt, zu letalen Wirkungen führen kann.
Es wird angenommen, daß das erste Erfordernis, daß solche
letalen Wirkungen auftreten, ist, daß der
Antigen-Antikörper-Komplex Internalisierung in die Zelle durchläuft.
Es wird angenommen, daß das zweite Erfordernis eine ¹²&sup5;I-
Bindung an den Kern der Tumorzelle ist, wodurch die
maximale Wirkung aufgrund der subzellularen Reichweite von
Auger-Elektronen erzielt wird. Die Strahlungsbeschädigung
an der Zelle ist letztendlich auf Chromosomenbeschädigung
zurückzuführen, bei der viele der bestehenden Daten stark
darauf hinweisen, daß ¹²&sup5;I, wenn es in DNA inkorporiert
wird, zu einer irreparablen Beschädigung und effizienter
Zelltötung führen kann.
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Die vorstehenden Untersuchungen zeigen an, daß
radiomarkierter MAb 17-1A das erste Erfordernis erfüllt, indem
er signifikant internalisiert wird nach Bindung an das
spezifische der Zellmembran zugeordnete Antigen. Die
Internalisierung von ¹²&sup5;I-markiertem MAb 17-1A führt dazu,
daß 29,7% der gesamten der Zelle zugeordneten
Radioaktivität in die Zelle nach 4 Stunden inkorporiert sind, was
sich auf 49% nach 48 Stunden erhöht. Während dieser
Zeitperioden ist keine Enthalogenisierung oder Freigabe von
Jod zurück in das extrazellulare Medium beobachtet worden,
wenn standardmäßige Chromatografie-Verfahren angewendet
werden, um irgendein freies Jodid-Ion in den
extrazellularen Fluiden und überstehenden Flüssigkeiten (nach
Zentrifugierung und Waschung) während der Inkubationsperioden
nachzuweisen.
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Die maximale Bindung von ¹²&sup5;I-markiertem MAb 17-1A in SW1116
Zellen scheint um 10 µCurie/ml Konzentration ein Plateau
zu bilden. Der Betrag der berechneten Radioaktivität wird
konstant bei etwa 0,67 pCurie/Zelle. Angenommen, daß 29
bis 49% der gesamten an die Zelle gebundenen Radioaktivität
internalisiert ist, dann sind 0,19 bis 0,33 pCurie mit dem
intrazellularen Volumen der Zelle verbunden. Dieser Wert
ist angenähert 5 bis 10 mal höher als die Aufnahme pro Zelle
von ¹²&sup5;I-Joddesoxyuridin (0,035 pCurie/Zelle), die
erforderlich ist, um ein 37%iges überleben in V79 chinesischen
Hamsterzellen zu erzielen. In unseren Experimenten wurde
jedoch der Bruchteil der internalisierten Radioaktivität,
die mit dem Kern assoziiert wird, nicht bestimmt und konnte
signifikant niedriger sein, jedoch mehr als adäquat sein,
um letale Konsequenzen in den angegriffenen Zellen zu
erzeugen, wenn sie direkt mit dem Kern und der DNA
assoziiert wird.
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Die Kernbeschädigung, die mit ¹²&sup5;I verbunden ist, das in den
Kern inkorporiert wird, führt zu charakteristischer
Strahlenbeschädigung der Chromosomen. Diese Beschädigung
manifestiert sich selbst als die Anzahl sowohl der
Chromosomenbrüche (CB) als auch der Mikrokerne (Mikronuclei MN) und
ist proportional zu der radioaktiven Konzentration in dem
Kern. Die vorstehend beschriebenen Studien zeigen ein
ähnliches dosisabhängiges Ansprechen, das mit erhöhter
Chromosomenbeschädigung aufgrund der Inkorporation von
radiomarkiertem MAb 17-1A verbunden ist, welcher
spezifisch nur auf Tumorzellen ist, die das erforderliche
Antigen enthalten. Kontrollmittel wie Na ¹²&sup5;I, ¹²&sup5;I-markierter
R11D10 Antikörper und ¹²&sup5;I-markierter 116-NS-19-9
Antikörper führten nicht zu einem merklichen Anstieg in der
Chromosomenbeschädigung bei ähnlichen radioaktiven
Konzentrationen in der SW1116 Zellinie. Aber radioaktives
116-NS-19-9 zeigte einen leichten Anstieg in
Chromosomenaberrationen, der nicht dosisabhängig zu sein schien.
Da der 116-NS-19-9 monoklonale Antikörper nicht an ein
anderes dem Tumor assoziiertes Antigen auf der SW11116
Zellinie bindet, das in das extrazellulare Medium
abgestoßen wird, ist es möglich, daß der Antigen-Antikörper-
Komplex in diese Zellen während der Inkubationsperiode
aufgenommen werden kann, und zwar aufgrund von
phagozytotischer Aktivität eher als durch direkte Internalisierung.
Unsere Untersuchungen haben weiterhin angezeigt, daß
radioaktives 116-NS-19-9 nicht internalisiert zu werden scheint,
wie es in Figur 3 gezeigt ist. Außerdem scheint es, daß,
wenn das spezifische Antigen nicht auf der Tumorzelle
anwesend ist, Zellen, die das Antigen (WISH Zellinie) nicht
enthalten, nicht durch den radiomarkierten
tumorspezifischen Antikörper angegriffen werden und daß keine Erhöhung
der Chromosomenaberrationen über normalen Untergrundniveaus
beobachtet werden.
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Unabhängig von dem verwendeten Zellsystem ist durch
Strahlung induzierte Chromosomenbeschädigung in hohem Maße
erhöhter Letalität korreliert, was zu einem verringerten
Zellüberleben führt. Die Zytoxizität von ¹²&sup5;I-markiertem
MAb 17-1A wurde bestimmt, indem Zellüberlebensdaten
verwendet
wurden. Nicht-immunreaktionsfähige radiomarkierte
Antikörper und Zellen, die kein Antigen enthielten, werden
nicht durch den radiojodierten MAb 17-1A angegriffen. Die
nicht-antigenische WISH Zellinie, die für diese
Untersuchungen verwendet wurde, hat ähnliche
Strahlungsempfindlichkeiten wie die SW1116 Zellinie, basierend auf
Zellüberlebensstudien, bei denen Photonenbestrahlung
angewendet wurde. Da jedoch ¹²&sup5;I-Auger-Elektronen-Letalität
durch den direkten Einfluß wie mit hoch-linearer
Energieübertragungs (LET)-Strahlung entsteht, würden variierende
Grade von Strahlungsempfindlichkeiten durch
Röntgenstrahlphotonen wahrscheinlich einen kleinen oder gar keinen
Einfluß auf die direkte Wirkung von Auger-Elektronen in
der DNA haben. Die Länge der Zeit für die Inkubationen
von Zellen mit den radioaktiven Testmitteln waren 48
Stunden. Als Inkubationen nur 4 Stunden durchgeführt wurden,
wurde kein Einfluß auf Zellüberleben bei der SW1116
Zelllinie und dem ¹²&sup5;I-markierten MAb 17-1A beobachtet.
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Dieser Faktor kann dem Betrag der Internalisierung des
radioaktiven Antikörpers zugeschrieben werden, der mit
der Zeit anstieg. Der Einfluß eines internalisierten
tumorspezifischen monoklonalen Antikörpers, der mit
¹²&sup5;I-markiert ist, auf Zellüberleben scheint dosisabhängig von der
Menge des ¹²&sup5;I zu sein, das in der Zelle zurückgehalten
wird.
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Im Vergleich zu der Internalisierung von ¹²&sup5;IUdR (ein
Uridin-Derivat) in V79 Zellen ist Kernaufnahme nur abhängig
von mitotischer Aktivität, die mit einer radiomarkierten
Bindung zusammenhängen kann und nicht notwendigerweise
nur auf Zellteilung bezogen ist. Die überlebenskurve, die
für ¹²&sup5;I-markierten MAb 17-1A in SW1116 Zellen erhalten
wird, scheint eine leichte Schulter zu haben, die den
Schluß nahelegt, daß die ¹²&sup5;I-Letalität nicht ähnlich
der hohen LET-Bestrahlung sein kann, wie es für ¹²&sup5;IUdR
vermutet wurde, wenn dieses in DNA inkorporiert ist. Jedoch
kann die durch Strahlung induzierte Schädigung von 125I
Auger-Elektronen in Anwesenheit von Sauerstoff modifiziert
sein, was nahelegt, daß sekundäre Mechanismen, die
reaktionsfähige freie Radikale erzeugen, auch für
Zellbeschädigung verantwortlich sein können. Außerdem kann die hohe
lethale Schädigung von ¹²&sup5;I der DNA eine Folge des stark
positiv geladenen ¹²&sup5;Te-Tochteratoms (+8) sein, was direkt
chemische Änderungen innerhalb biologisch empfindlicher
Moleküle verursachen kann.
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Diese Untersuchungen spiegeln die kritische Wichtigkeit
von spezifischer zellularer Bindung, Internalisierung und
Kernwechselwirkung für die Förderung individueller
Tumorzellen-Zytotoxizität wider, wenn bestimmte
¹²&sup5;I-radiomarkierte monoklonale Antikörper wie MAb 17-1A benutzt werden.
Der primäre Mechanismus der Zelltötung wird in allgemeinen
Ausdrücken hoch lokalisierter Energieablagerung innerhalb
der DNA verstanden.
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Theoretische und experimentelle Argumente für die
scheinbare hohe LET Toxizität von ¹²&sup5;I stützen die Vorstellung
von der Elektronenenergie-Ablagerung (315 eV) von Auger-
Elektronen innerhalb einer Kugel von 10 Ångstrom-Radius
um die Zerfallsstelle herum innerhalb der DNA. Es ist
postuliert worden, daß die erwartete Energiedichte
äquivalent zu 1,3 x 10&sup9; Rad pro Zerfall ist. Deshalb ist
vorausgesagt worden, daß ein kurzes Segment von DNA,
entsprechend etwa drei Basenpaare lang auf jeder Seite des
Zerfallsereignisses, ernsthaft beeinflußt werden sollte, was
zu mehrfachen Strang-Brüchen und Basenzerstörung führt.
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Die Fähigkeit von tumorspezifischen ¹²&sup5;I-markierten
monoklonalen Antikörpern, spezifische Tumorzellenzerstörung
in vivo zu verursachen, bietet einen deutlichen Vorteil
für die Radio-Immuntherapie. Radiojodinierung anwendende
Verfahren und Techniken sind relativ einfach, sicher
(niedrige Strahlungsexponierung) und wirtschaftlich
durchzuführen und liefern ein hoch-spezifisches
Aktivitätsprodukt. Das Aussetzen von Nicht-Tumorzellen dem Radiojod-
125 scheint nicht irgendwelche Schäden zu verursachen,
und gewiß wird Ganzkörperbestrahlung wahrscheinlich durch
die schwache Jod-Röntgenstrahlung keine größere
Beeinträchtigung ausüben, wenn Patienten mit hohen Dosen von
radioaktivem Jod behandelt werden. Andere Radionuclide
wie ¹³¹I, &sup9;&sup0;Y und alpha-emittierende Substanzen haben
wesentlich höhere teilchenartige Strahlungen und haben
die Fähigkeit, signifikant mehr als nur die Tumorzellen
zu zerstören, wodurch potentiell mehr Radiotoxizität
verursacht wird. Es wird angenommen, daß die Möglichkeit,
¹²&sup5;I-markierte monoklonale Antikörper zirkulieren zu
lassen, um individuelle Tumorzellen zu zerstören, ohne Nicht-
Tumorzellen zu beschädigen, solch eine Therapie zu einem
idealen Anwärter als Adjuvants für standardmäßige
Krebsbehandlungen machen wird, sollte eine Möglichkeit zum
Wiederauftreten oder für Metastasen-Erkrankung bestehen.