JPH10503478A

JPH10503478A - 細胞核に毒性放射性同位元素を伝達するための組成物及びその使用

Info

Publication number: JPH10503478A
Application number: JP7528249A
Authority: JP
Inventors: マッテス，エム．ジュールズ
Original assignee: センター・フォー・モレキュラー・メディシン・アンド・イムノロジー
Priority date: 1994-04-29
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 1998-03-31
Also published as: EP0757559A1; US5759514A; CA2189051A1; CA2189051C; EP0757559A4; AU2284595A; WO1995029707A1

Abstract

(57)【要約】腫瘍細胞を標的にするタンパク質またはポリペプチドと、オージェ電子を放出する核種によって標識された、核酸を標的とする小さな分子との複合体は、腫瘍の治療に有用である。腫瘍細胞を標的とするタンパク質またはポリペプチドとしては、抗体またはそのフラグメント、あるいはホルモンまたは成長因子を用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称細胞核に毒性放射性同位元素を伝達するための組成物及びその使用発明の背景本発明の分野は、抗腫瘍化学療法である。より詳しくは、本発明は、核酸を標的とする放射能標識された小さな分子と複合した標的タンパク質(targeting pro tein)またはポリペプチドを用いた、腫瘍細胞の核への細胞毒性を有する放射性同位元素の伝達に関する。いくつかの放射性同位元素、特に¹²³Iや¹²⁵Iのようなオージェ(Auger)電子を放出する放射性同位元素は、もし、それらが細胞の核の中に存在するのであれば、生存する細胞に対して非常な毒性を有することが知られている(Warters et al .，Curr．TOP．Rad．Res.，12: 389(1977))。正常な細胞に対し腫瘍細胞にいくらかの選択性をもつ抗体が知られているが、抗体自身で効率的に核に到達することはできない。大抵のそのような抗体は、細胞表面と反応し、徐々に内部に取り込まれ、リソソームに運ばれ、分解される(Kyriakos et al.，Cancer Res.，52: 835(1992))。その抗体に付着した放射性同位元素を含む分解生成物は、その後、リソソーム膜と細胞膜を通過することによって、徐々に細胞から離れる。抗体分解生成物上の従来の放射性同位元素標識は、理論的には、核膜を通過し、核にいくらかの放射能を与えることができるが(Woo et al.，WO90/03799)、実際の観察は、その量が非常にわずかであり、腫瘍細胞に細胞毒性を与えるには不十分であることを示す。従来技術は、従来のヨウ素が抗体の異化後に細胞から急速に離脱することを示す。タンパク質やポリペプチドのホルモンや成長因子、特に細胞表面受容体に伴うそれらは、直接放射能標識され、腫瘍細胞を標的とするのに用いられるであろう。しかし、直接放射能標識された標的抗体を用いた場合のように、ホルモンや成長因子のアミノ酸残基と結合した放射性同位元素は、異化後に細胞から放出され、核の核酸とは結合しない。腫瘍細胞を標的とし、腫瘍細胞によってエンドサイトーシスされて分解されることができ、また、核物質と相互作用することによって細胞毒性を発揮することができる放射性同位元素を核に伝達することができる組成物に対する重要な必要性が存在する。そのような発明を以下に記載する。発明の概要本発明の目的は、腫瘍標的タンパク質またはポリペプチドと、核酸を標的とする放射能標識された小さな分子との共有結合複合体を提供することにある。該小さな分子は、標的タンパク質から離脱した後、リソソーム膜と核膜を通過し、核の構成成分に結合することができる。それによって、該小さな分子と結合した放射性同位元素の崩壊は、核の構成成分、そして結果的に、標的とされた腫瘍細胞の生存性(viability)を破壊する。本発明の他の目的は、上記複合体を生産する方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、腫瘍を有する対象物に、上述の腫瘍細胞を標的とする複合体を含む組成物を投与することからなる腫瘍の治療方法を提供することにある。治療上の抗腫瘍複合体は、オージェ電子を放出する放射性同位元素を用いて誘導された核酸を標的とする小さな分子と共有結合によって複合した、腫瘍細胞を標的とするタンパク質またはポリペプチドからなる。該複合体は、腫瘍細胞の表面に付着して、腫瘍細胞の中にエンドサイトーシス(飲食作用)されることができる。エンドサイトーシスされた複合体は、放射能標識された小さな分子を含む生成物へと、溶菌的(lytically)に分解されることができる。遊離した放射能標識された小さな分子は、腫瘍細胞の核の中に入り、核内に存在する核酸に結合することができる。該結合は、ＤＮＡへの挿入(intercalation)を含む。放射能標識は、小さな分子が結合した核酸を分解することができる。腫瘍を有する患者の治療方法は、治療学的に有効な量の上記治療上の抗腫瘍複合体を、患者に投与する段階を含む。これらの及び他の目的は、明細書と添付の請求の範囲を参照することによって、明らかになるであろう。好ましい態様の詳細な説明本発明の一般的な形は、ＤＮＡまたは他の核の核酸物質と結合し、腫瘍細胞を標的とするタンパク質またはポリペプチドと共有結合で複合し、核内で崩壊すれば細胞に毒性を示すオージェ電子を放出する放射性同位元素で標識された小さな分子である。本発明の好ましい形は、腫瘍を標的とする抗体またはそのフラグメントと複合する、¹²⁵Iまたは¹²³Iまたはその両方で標識された、核酸と結合するまたはＤＮＡに挿入される小さな分子である。標的タンパク質またはポリペプチドがホルモンまたは成長因子であることが、また、好ましい。これらの放射性核種は、高い比活性のものを容易に入手することができ、核酸と結合する及びＤＮＡに挿入される小さな分子を標識するのに用いることができ、非常に大きな毒性を有する。この毒性は、放出されるオージェ電子によるものである。オージェ電子は、また、多数の他の放射性同位元素によって放出される。これら多数の放射性同位元素の全てが、本発明の範囲に含まれる。例示すれば、⁷⁷Br、¹³¹I、²²⁵At、²¹³Bi、¹¹¹ In、¹⁸⁸Rh等である。本発明の実施に適する多くの核酸と結合する及びＤＮＡに挿入される小さな分子は、クロラミンＴ(chloramine T)またはヨードゲン(Iodogen)を用いた標準的な酸化ヨウ素化によって放射能標識することができ、さらに、多くの標準的な手法のいずれか一つによって、抗体と複合することができる。放射性同位元素を効率的に用いるために、複合方法は、効率的(efficient)でなければならない。本発明の実施に適するそのような小さな分子としては、フルオレセイン及びその誘導体、アクリジン及びその誘導体、ジアクリジン(diacridine)及びその誘導体、アントラサイクリン(anthracyclines)及びビスアントラサイクリン、短いアルキル鎖で結合されたジアミノアクリジン、２−ニトロイミダゾール・フェナントリジン(2-nitroimidazole phenanthridine)やビス−フェナントリジンのようなフェナントリジン、３−アセトアミド−５−ヨード−６−アミノアクリジン(3-aceta mido-5-iodo-6-aminoacridine)のようなアミノアクリジン、臭化エチジウム誘導体、ジキノリン(diquinolines)、ニトラクリン(nitracrine)、リンカーによってオリゴヌクレオチド認識システムと複合したフェナントリジウム(phenanthridiu m)、ドーノマイシン(daunomycin)、メパクリン(mepacrine)、アクリジン・オレンジ(acridine orange)、メチジウム・スペルミン(methidium spermine)、縮合芳香多環(fused aromatic polycyclic rings)を含有するピリミドン・ヌクレオシド塩基、８−アミノ−１２−オキソ−１０，１２−ジヒドロインドロ誘導体(8 -amino-12-oxo-10,12-dihydroindolo derivative)のようなキナゾリン(quinazol ine)誘導体、Hoechst 33258、蛍光染料等が含まれるが、それらに限定されるものではない。細胞系、抗体、放射能標識本発明の複合体を試験するのに用いられる細胞系、及び本発明の複合体を生産するのに用いられるモノクローナル抗体(mAbs)は、容易に入手することができる (例えば、上記のKyriakos et al.、Mattes et al.，Cancer(Suppl.)73: 787(199 4)、0ng et al.，Molec．Immunol．30: 1455(1993)、Demignot et al.，Cancer Immunol．Immunotherap．33: 359(1991)、Ali et al.，Cancer Res．50:783S(19 90)、Halpern et al.，Cancer Res．43: 5347(1983)、Anderson-Berg et al.，C ancer Res．47: 1905(1987)を参照されたい。これらの文献は、引用することによって本明細書に含められる。)。実験で用いるモノクローナル抗体(mA bs)は、マウスの免疫グロブリンＧ(IgG)抗体でよいが、ヒト化した(humanized) 及びヒト抗体も本発明の範囲に含まれる。モノクローナル抗体ＭＡ１０３は、試験される全てのヒト腫瘍細胞系上に存在する高密度の抗原と高い結合活性で反応し、細胞表面と反応する大抵の他の抗体と同様に処理される(上記Mattes et al. ，1994)。ヒトがん腫症細胞系ＭＥ１８０は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)(Rockville，MD)から得ることができる。放射能標識された抗体は、上述のように、SDS-PAGE及びオートラジオグラフィーによって機械的に監視され(Cairncross et al.，Proc．Natl．Ac ad．Sci USA，79: 5641(1982))、少なくとも９０％の放射能標識が、免疫グロブリンＧのサブユニット上に存在していた。複合体は、以下に述べるように、ＴＣＡを用いた種々の時点での沈降によって、少なくとも３日間、組織培養培地中の安定性について試験されるべきである。¹²⁵Iを用いた従来の抗体の直接標識は、上述のように行われる(上記Kyriakos et al.)。抗体と¹²⁵I-フルオレセインの複合は、従来行われているように行なうことができる。一つの手順として、始めに、0.05M、pH8.0のトリス塩酸中に13μg/mlで 25μlの放射能標識されたフルオレセイン・イソチオシアネート(Sigma Chemical s，St．Louis，MO)を、Pittman et al.(Biochem．J.，212:791(1983))に記載されているように、ヨードゲン(Iodogen)(Pierce)でプレコート(precoated)した0. 5mlのマイクロヒュージ・チューブ(microfuge tube)に加える。同じ緩衝液中に2 mCi(74MBq)の¹²⁵Iを加える。室温で３０分経過後、pH9.5、0.1Mの炭酸ナトリウム緩衝液0.2ml中に0.1mgのIgGを含有する他のマイクロフュージ・チューブに、溶液を移す。４℃で一晩、インキュベートした後、複合体をPD-10カラム上でゲル濾過することによって精製する。生成物の比活性は、典型的には約0.3mCi/mg( 11.1MBq/mg)である。抗体とフルオレセイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド(fluorescein-β-D-gala ctopyranoside)(Sigma F-4146)の複合は、他のガラクトース含有分子のために開発されたStrobel et al．(Arch．Biochem．Biophys.，240: 635(1985))の方法によって行なうことができる。ヨードゲンで被覆されたマイクロフュージ・チューブに、1〜10nmolのフルオレセイン−ガラクトシドを含むpH7.0の25μlの0.5MのK PO₄緩衝液を加える(生成量及び最終の比活性は、この濃度範囲では実質的に変わらない)。25μlの同じ緩衝液中の1〜2mCi(37〜74MBq)の¹²⁵Iを加えた後、試料を室温で３０分間、インキュベートし、その後、5μlの同じ緩衝液中に4単位のガラクトース・オキシダーゼ(Sigma G-3385)を含有する他のマイクロフュージ・チューブに移す。３７℃で４５分経過後、50μlのリン酸緩衝食塩水中の0.1mgのIg Gを加え、その後、直ちに2.1μlの2.0Mのソジウム・シアノボロハイドライド(so dium cyanoborohydride)を加える。３７℃で３時間経過後、複合体は、上述のように、PD-10カラム上で精製される。¹²⁵Iの結合は、9〜11％であり、生成物の比活性は、0.8〜1.0mCi/mg(30〜37MBq/mg)である。意図した方法によって実際に標識されたことを確認するために、ガラクトース・オキシダーゼを省いた対照試験が行われる。対照試験では、有意な結合が生じないはずである。 DTAFを用いたヨウ素化は、試薬の量が大幅に削減されるRushfeldt et al.，Ca ncer Res.，53: 658(1993)の方法によって本質的に行なうことができる。pH9.0 の25μlの0.1Mホウ酸ナトリウム中の1nmolのDTAFを、ヨードゲンで被覆したチューブに加える。1mCi(37MBq)の¹²⁵Iを、25μl中に加え、室温で３０分間、インキュベートする。反応混合物を、1.0mg/mlで10μlのNa₂S₂O₃を含有するチューブに移す。室温で３分経過後、25μgのIgGを50μl以下のリン酸緩衝食塩水中に加え、室温で２時間、インキュベートする。50mMの最終濃度となるまでグリシンを加えた後、３７℃で３０分間、インキュベーションし、試料を上述のように精製することができる。ヨウ素化の効率は、一般的には8〜10％の範囲であり、約3〜5m Ci /mg(111〜185MBq/mg)の比活性という結果となる。抗体保持実験詳細に前述したように(上記のKyriakos et al.)、９６個のウェルのプレート中の密集した細胞を、３７℃で２時間、5×10⁵cpmの抗体でインキュベートし、その後、４回洗浄する。0.2mlの組織培養培地を加え、インキュベーションを、例えば、４時間から７日間の種々の時間で続ける。種々の時点で、0.1mlの上澄み液を集め(全上澄み液の1/2)、さらに洗浄後、細胞を、2.0MのNaOHで溶液中に分散させる。上澄み液中のcpmを測定後、試料を、5mlの冷たい10%TCAを用いて沈澱させる。Sorvall SS-34ローター中で１５分間、6000rpmで遠心分離することによって、沈澱を集める。各実験に含められるであろう対照ウェルにおいて、標識されない多くの過剰の抗体をいくつかのウェルに加える。これらの条件下のcpm 結合は、非特異的であると考えられている。全ての実験において、少なくとも80 〜90％の活性結合は、一般的に特異的に結合される。異なる標識の比活性は、約７倍の範囲にわたって、変化するかもしれない。しかし、少なくとも従来の¹²⁵I 標識を用いた場合、抗体濃度中の同様な変化が抗体処理(Kyriakos et al.)に有意な影響を及ぼさないことがわかっている。核酸を標的とする放射能標識された小さな分子と、核構成成分との結合は、本発明の複合体の投与後に、冷却下に細胞を溶菌(Iysing)し、セル分画の従来技術によって核を遊離させ、核分画中の放射能を測定することによって、測定することができる。本発明の複合体で処理した後に、並行して腫瘍細胞の生存性を試験することによって、核構成物質と結合した放射能標識の量と、放射能標識の細胞毒性の間の相互関係を見い出すことができる。種々の方法ガラクトサミンと複合したウシアルブミンをSigma Chemicals(A-1159)から購入し、上述のようにクロラミンＴを用いてヨウ素化することができる。それは、非特異的結合を測定するために対照ウェル中で0.5mg/mlで用いられるgalNAc-BSA を用いて、ヨウ素化された抗体のために記載された結合及び処理実験の中で用いることができる。患者への投与従来の製薬的に受容できる担体(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCEを参照されたい。)中に溶解または懸濁された本発明の複合体は、従来の手順によって患者に非経口的に投与することができる。投与量は、患者の大きさ、体重、他の医学的条件を含む因子によって、及び腫瘍の浸潤の段階によって決定されるであろう。これらの決定は、臨床技術分野の専門家による過度の実験を要しない。次の実施例は、本発明の態様を述べるために提供されるものであり、いかなる場合でも明細書及び添付の請求の範囲に記載された本発明の範囲を制限するように解釈されるべきではない。実施例１ヨウ素化されたフルオレセイン誘導体で標識された抗体予備的な実験において、ヨウ素化に対するフルオレセインの感度を示すために、FITC-デキストラン(Sigma Chemicals，FD-20s)を、ヨウ素化タンパク質に対して通常用いられる条件下でヨウ素化した。17,000の平均分子量をもつ50μgのFIT C-デキストランを、同じ重量のIgGを用いて通常得られるのとほぼ同じである30 〜40％の効率で、ヨウ素化した。タンパク質複合前に直ちに放射能標識したFITC を用いて、ヨードフルオレセインを抗体MA103と複合させた。この複合は、比較的低い比活性である約0.5mCi/mg(18.5MBq/mg)を結果的に示したが、これは、細胞表面への抗体結合の後の放射能標識の運命を決定するには十分であった。ヨードフルオレセインの複合の第二の手順は、上記のStrobel et al.によって開発された方法に続いて、フルオレセイン−ガラクトシドを用いて行われた。ヨウ素化に続いて、ガラクトース部分をガラクトースオキシダーゼによって酸化し、次に、シッフ塩基(Schiff base)による還元的アミノ化によって、MA103上のアミノ基と複合させた。この複合方法は、約10％の効率のヨウ素化と約1mCi/mg(37MBq/mg)の比活性を結果的に示した。IgGサブユニットへのこれらの放射能標識の包含は、SDS-PAG E(データは示さない。)によって示された。これらの放射能標識を用いた2〜3の実験において、ヨード−FITCまたはヨード−フルオレセイン−ガラクトースと、従来のイオジンの間の処理における有意の相違は、検出されなかった(表１)。使用された第三のヨードフルオレセイン複合体は、ヨード−DTAFであった。ヨード−DTAF標識は、他の非クロラミンＴのヨウ素化手順のいずれよりもかなり効率的であり、3〜5mCi/mg(111〜185MBq/mg)の比活性を結果的に示した。ヨード− DTAF−MA103は、従来の¹²⁵Iよりもわずかに良好に、SK-RC-18細胞によって保持されたが、In-DTPAやDLTほどには良好でなかった(表１)。上澄み液中の分解した物質のいくらかは、10%TCAによって沈澱し、それゆえ、この放射能標識のためにメタノール沈澱を用いた。従来のイオジン標識を用いた対照実験において、TCA と培養上澄み液のメタノール沈澱は、区別がつかない結果を示した。これらのデータは、上記Rushfeldt et al.の結果と一致しないように思われる。それゆえ、細胞表面レクチンによってガン腫細胞に侵入すると報告されている、これらの研究者によって用いられたリガンドであるGalNAc-BSAを試験した。このタンパク質は、従来のクロラミンＴによるヨウ素化の後に、初めて試験された。試験されたガン腫細胞のSK-RC-18とヒーラ(HeLa)の両方に、特異的にかつ比較的高いレベルで結合するように見えた。９６個のウェルのプレート中の１個のウェルにおいて、20〜50,000cpmが結合し、そのうち、非特異的結合は、約15%であった。しかし、予期せぬことに、この従来のヨウ素化リガンドは、３日以内に分解物質を本質的に放出せず、細胞によって強く保持されているように見えた。このゆえに、この標識の長い保持は、ヨウ素化の様式(mode)に依存するのではなく、むしろ運搬役(carrier)のタンパク質に依存すると考えられた。さらなる研究は、しかし、リガンドが、細胞よりもむしろ、プラスチックのウェルに結合することを示した。この結論を支持する証拠は、次に掲げるものを含む。１）¹¹¹In標識で以前行われたような細胞のトリプシニゼーション(trypsinization)は、細胞ペレットと放射能の関連を結果的に示さなかった。cpmのほんの1〜2%が、細胞と関連し、ほんの2%が、トリプシナイズされペレット化された細胞の上澄み液中に存在した。対照的に、cpmの89〜91％が、空のウェル中に残り、2.0MのNaOHを用いて抽出された。さらなる実験は、これらのプラスチックに結合したカウント(cou nts)が、2%のSDSで抽出されないことを示した。２）細胞をもたないが、組織培養培地でプレインキュベートした空のウェルを用いて行った実験は、細胞を含むウェルを用いた場合と非常に似た結合及びプロセシング(processing)を示した。それゆえ、このリガンドの異化作用の欠如は、細胞よりはむしろプラスチックに結合しているという事実に寄与し得る。追加の実験は、プラスチックへのリガンドの結合が血清タンパク質を必要としないこと、及び、実際に、血清のない培地中で結合が約３倍に増加すること(このことは、血清タンパク質が部分的に結合を阻害することを示唆する。)を示した。本発明の原理は、放射能標識が付着する標的タンパク質(例えば、抗体)の分解後の放射能標識の運命の分析を基礎とする。この因子は、腫瘍に位置する標的タンパク質によって腫瘍に伝達される放射線の量に大きく影響する。例えば、抗体異化は、放射免疫療法に通常用いられる同位体の物理的半減期と比べて、比較的速い。この例の重要な点は、１５の異なる抗原と反応する１７の抗体の評価に基づく、実験のための典型的な抗体の選択である(上記Kyriakos et al.及び上記Ma ttes et al.)。抗体のインターナリゼーションとプロセシングの大抵の以前の研究は、被覆小胞(coated pit)に入る、急速にインターナライズする抗体を意図的に選択し、その結果は、急速にインターナライズする抗体にのみ適用されると考えられてきた(LaBadie et al.，Biochem．J.，152;271(1975); Geissler et a l.，Cancer Res.，52: 2907(1992);上記Anderson-Berg et al.)。これゆえに、この研究の主要な結論は、抗体異化が、急速にインターナライズする抗体のためだけではなく、むしろ細胞表面に結合する全ての抗体のために重要な因子であるということである。表１は、抗体MA103と複合する７つの放射能標識を用いて得られた結果の概要である。21〜69時間からの細胞からの損失率のT_1/2は、細胞による標識の保持の最も意味のある測定を提供する。最も多く残留した標識は、従来のイオジンよりも4〜6倍高いT_1/2を有していた。ヨードフルオレセイン複合体は、ＤＮＡと結合するこれらの分子の能力のために幾分、研究された。ＤＮＡに挿入される¹²⁵Iの細胞毒性の潜在能力は、よく確認されており(上記Warters et al.)、テトラヨードフルオレセイン(エリトロシンＢ)は、死滅した細胞の核と結合することが知られており(McCoy et al.，Canc er Res.，36: 3339(1976))、ジヨードフルオレセインは、また、死滅した細胞の核の染色剤である(現結果)。一旦、分子がリソソームから離脱すれば、分子は、核の中に侵入し、細胞から出る前にＤＮＡやＲＮＡと結合する機会を得る。 DTAF標識は、二つの観点から論ずることができる。それがフルオレセイン誘導体であれば、ヨウ素化したDTAFは、核構成成分と結合する潜在能力をもつ。しかし、ヨード−DTAFは、また、上記Rushfeldtらによって、残留(residualizing)標識として働くと報告されている。ヨード−DTAFを用いた我々の実験は、しかし、上記Rushfeldtらによって用いられたリガンドであるヨウ素化されたGalNAc-BSA が、プラスチックのウェルと食欲に結合し、これが、それが分解しない理由であることを示した。プラスチックへのこのリガンドの結合は、異常な性質を有し、特異的であると思われる。結合は、7.5%の胎児ウシ血清を含有する組織培養培地を用いたウェルの一晩の先インキュベーションによって遮断されなかった。それは、過剰の標識されないリガンドによって80%以上遮断された。この結合の性質は、タンパク質の広範な修飾によるかもしれないと推測する。全てのアミノ基は、グリセルアルデヒドと複合し、約２０のカルボキシル基は、炭水化物ハプテンと複合した。この解釈は、標識した細胞懸濁液を利用した上記Rushfeldtらのin vivo の実験と一致しない。これらの実験において、細胞は、リガンドを用いて２０時間、インキュベートされ、ピノサイトーシスのためのいくらかの理解(uptake)が、期待された。プラスチックの皿への小さな分子の結合のような因子から得られるもっともらしい結果の可能性を上記のように試験するために、過度の実験は要しないであろう。現結果は、腫瘍細胞の生存性を破壊する有効な手段が、オージェ電子を放出する放射性同位元素を用いて誘導された核酸を標的とする小さな分子に共有結合で結合した標的タンパク質(例えば、腫瘍細胞表面抗原に対して相補的な抗体またはそのフラグメント、またはタンパク質またはポリペプチド、ホルモンまたは成長因子)からなる複合体を、患者に投与することからなることを示す。複合体は、腫瘍細胞中にインターナライズ(internalize)され、また、放射能標識された小さな分子を遊離させるように溶菌的に異化(おそらくはリソソーム膜において) することが可能でなければならない。この小さな分子は、腫瘍細胞の核の中に拡散し、好ましくはＤＮＡへの挿入によって、核内に含まれる核酸と結合することが可能でなければならない。核酸への接近した近接状態における放射性同位元素の崩壊は、この分子を分解し、腫瘍細胞の生存性を減少させるはずである。上述した実験は、標的抗体を含有する複合体に集中したが、他の標的タンパク質やポリペプチドもまた、本発明を実施する上で適する。そのような標的タンパク質やポリペプチドは、受容体が細胞表面にあり、例えば受容体仲介エンドサイトーシスによって細胞に侵入することのできるホルモンや成長因子を含む。ここで用いられる方法を提供する上記の文献は、参照することによって含められる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年５月２９日【補正内容】請求の範囲（補正）１．使用に適するオージェ電子を放出する放射性同位元素で標識された小さな分子と共有結合によって複合された、腫瘍細胞を標的とするタンパク質またはポリペプチドからなり、該複合体は、次の生化学的性質、（ａ）該腫瘍細胞の表面への付着、（ｂ）該表面から該腫瘍細胞の内部へのエンドサイトーシス、（ｃ）該放射能標識された小さな分子を遊離するための、該腫瘍細胞内に存在する細胞内溶菌酵素による該複合体の分解、（ｄ）該遊離した放射能標識された小さな分子の、該腫瘍細胞の核の中への侵入、（ｅ）該放射能標識された小さな分子の、該核内に含まれる核酸への挿入、（ｆ）該腫瘍細胞の核酸を分解するための、挿入された該放射能標識された小さな分子の放射能標識の崩壊、を示す、治療上の抗腫瘍複合体。２．腫瘍細胞を標的とする上記タンパク質またはポリペプチドが、抗体またはそのフラグメントである請求項１に記載の複合体。３．腫瘍細胞を標的とする上記タンパク質またはポリペプチドが、ホルモンまたは成長因子である請求項１に記載の複合体。４．上記使用に適するオージェ電子を放出する放射性同位元素が、¹²⁵I、¹⁸⁸R h、¹³¹I、⁷⁷Br、²⁵⁵At、²¹³Biからなる群より選ばれる請求項１に記載の複合体。５．上記小さな分子が、フルオレセイン、アクリジン、ジアクリジン、フェナントリジン、ビス−フェナントリジン、２−ニトロイミダゾール・フェナントリジン、アミノアクリジン、３−アセトアミド−５−ヨード−６−アミノアクリジン、アントラサイクリン、ビス−アントラサイクリン、臭化エチジウム、メパクリン、フェナントリジウム、ＤＴＡＦ、ＤＬＴ、メチジウム・スペルミン、ドーノマイシン、アクリジン・オレンジ、ジキノリン、ピリミドン・ヌクレオシド塩基、キナゾリン、及び８−アミノ−１２−オキソ−１０，１２−ジヒドロインドールからなる群より選ばれる請求項１に記載の複合体。６．上記放射能標識された小さな分子が、核ＤＮＡに挿入されることができる請求項１に記載の複合体。７．治療学的に有効な量の請求項１に記載の抗腫瘍複合体を、患者に投与する段階を含む、腫瘍を有する患者の治療方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．オージェ電子を放出する放射性同位元素で標識された小さな分子と共有結合によって複合した、腫瘍細胞を標的とするタンパク質またはポリペプチドからなり、該複合体は、腫瘍細胞の表面に付着して、腫瘍細胞の中にエンドサイトーシスされることができ、該エンドサイトーシスされた複合体は、該腫瘍細胞によって溶菌的に分解されて、該放射能標識された小さな分子を遊離することができ、該遊離した放射能標識された小さな分子は、該腫瘍細胞の核の中に入って、核内に含まれる核酸に結合することができ、該結合した放射能標識の崩壊は、該核酸を分解することができる、治療上の抗腫瘍共有結合複合体。２．腫瘍細胞を標的とする上記タンパク質またはポリペプチドが、抗体またはそのフラグメントである請求項１に記載の複合体。３．腫瘍細胞を標的とする上記タンパク質またはポリペプチドが、ホルモンまたは成長因子である請求項１に記載の複合体。４．上記オージェ電子を放出する放射性同位元素が、¹²⁵I、¹¹¹In、¹⁸⁸Rh、¹² ³ I、¹³¹I、⁷⁷Br、²²⁵At、²¹³Biからなる群より選ばれる請求項１に記載の複合体。５．上記小さな分子が、フルオレセイン及びその誘導体、アクリジン及びその誘導体、ジアクリジン及びその誘導体、フェナントリジン及びその誘導体、ビス −フェナントリジン、２−ニトロイミダゾール・フェナントリジン、プロフラビン、３−アセトアミド−５−ヨード−６−アミノアクリジンのようなアミノアクリジン、ビス−ピリドカルバゾール、アントラサイクリン、ビス−アントラサイクリン、臭化エチジウム及びその誘導体、メパクリン、オリゴヌクレオチド認識システムと複合したフェナントリジウム、ＤＴＰＡ、メチジウム・スペルミン、ドーノマイシン、アクリジン・オレンジ、ジキノリン、縮合芳香多環を含有するピリミドン・ヌクレオシド塩基、及び８−アミノ−１２−オキソ−１０，１２− ジヒドロインドール誘導体のようなキナゾリン誘導体からなる群より選ばれる請求項１に記載の複合体。６．上記放射能標識された小さな分子が、核ＤＮＡに挿入されることができる請求項１に記載の複合体。７．治療学的に有効な量の請求項１に記載の抗腫瘍複合体を、患者に投与する段階を含む、腫瘍を有する患者の治療方法。