JPH03503898A - 薬剤輸送系に関する更なる改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 薬剤輸送系に関する更なる改良 本発明は、新生物細胞増殖（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ　ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ） の制御方法及び制御系に関し、特に、腫瘍部位に細胞毒性剤を局在化させること を伴う方法及び系に関する。

本出願人の先願である特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８１００１８１において、本出願 人は、 （ｉ）　　プロドラッグを細胞毒性薬剤に転化することができる酵素に結合して おり且つ腫瘍関連抗原と結合することができる抗体フラグメントである第１成分 （成分Ａ−Ｅ）と、 （ｉｆ）　　前記酵素の作用下に細胞毒性剤（ＣＤ）に転化できるプロドラッグ である第２又は最終成分（成分ＰＤ）、を含んで成る２成分系を開示している。

本出願人の上記ＰＣＴ先願及び本願において、“腫瘍”なる用語は、癌腫（ｃａ ｒｃｉｎｏｍａｓ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａｓ）、リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａ ｓ）及び白血病（Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ）を包含するすべての形態の新生物細胞増 殖を指すものと理解される。

本出願人の現存の系は、新生物細胞増殖部位を標的として細胞毒性プロドラッグ を使用する。しかしながら、この２成分系は、腫瘍の制御には有用であるけれど も、ヒトにおいて腫瘍１グラム当たりに局在化する第１成分の量は投与した第１ 成分の総量の０．　１％未満であることがある。相当な割合の、活性酵素を含む 非局在化第１成分が、循環血液中に残留する。故に、プロドラッグの投与の前に この自由に循環している抗体−酵素第１成分の量を減少させ、それにより、血液 中に活性薬剤が形成されてそれが血液から普通の組織に運ばれるのを制限するこ とが望ましい。第１成分が全抗体（ｗｈｏｌｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）から調製さ れる場合に、同様な問題が生じる。

本発明は、残留する前記酵素の結合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を血液から除去 する方法、又は第１成分が腫瘍部位に局在化した後、全抗体又は抗体フラグメン ト又は同等な成分を有する残留第１成分中の酵素を不活性化させる方法を提供す る。

本発明は、本出願人の上記２成分系を臨床的に使用する際に、非局在化第１成分 が患者中に存在することから生じる問題を減少させることに関するものであり、 そして第１成分の性質を更に拡大することを可能とする。

本発明は、悪性疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｄｉｓｅａｓｅｓ）の処置において 互いに関連して使用するための３成分系であって、（ａ）第一成分が悪性細胞の 部位に選択的に局在化する傾向を有するような悪性細胞に関連した分子配置（ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎｓ）に対して相補的な１個又は それより多くの分子配置と、（ｂ）それに追加して１個又はそれより多くの触媒 部位とにより特徴付けられる物質又は物質の結合体である第１成分と、第１成分 のこのような部分に結合することができ、それにより第１成分の触媒部位を不活 性化させ及び／又は第１成分及び第２成分が臨床的に投与されるとき第１成分の 血液からのクリアランスを促進する第２成分と、第１成分の触媒部位に対する基 質である第３成分であって、この触媒作用の最終生成物の１つが悪性細胞に対し て第３成分よりも細胞毒性が大きい物質であるような第３成分、とを含有して成 る３成分系を提供する。

第１成分の臨床的に最も有用な形態は、抗体又はそのフラグメントと酵素の結合 体であり、一方、第３成分の臨床的に最も有用な形態は、第１成分の酵素活性の 作用下に細胞毒性化合物に転化できるプロドラッグである。抗体は、望ましくは 、腫瘍関連抗原を認識しそして選択的に結合する抗体である。処置されるべき特 定の腫瘍に関連した抗原を第１成分に使用されるべき抗体又はフラグメントとい かにして適合させるか、細胞毒性化合物を処置されるべき腫瘍にいかにして適合 させるか及びプロドラッグを第１成分の酵素活性にいかにして適合させるかは、 当業者には明らかであろう。

本出願人の上記同時係属国際特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８８１００１８１に記載のよ うに、プロドラッグは、カルボキシペプチダーゼの作用下に安息香酸マスタード ［ｐ−（ビス−２−クロロエチル）アミノ］安息香酸に転化する安息香酸マスタ ードグルタミドであることができる。しかしながら、本発明の原理は、細胞毒性 薬剤からプロドラッグを区別する特徴をプロドラッグから除去するのに適した酵 素を使用して、安息香酸マスタード又はその類似体又は他の細胞毒性薬剤を放出 する他のプロドラッグにも同等に適用できる。

第１成分中に抗体が使用される場合には、それは、本出願人の上記先願の国際特 許出願に記載のように、全抗体又は抗体フラグメントの１つ、例えばＦ（ａｂ’ 　）！又は他のフラグメントであることができる。第１成分中の抗体の機能は、 処置されるべき腫瘍の領域に第１成分を局在化させるのを助けることであり、こ の機能は、抗体以外の物質、例えば、他の腫瘍関連化合物に対して親和性を有す るホルモン又は成長因子により達成することもできる。

本発明の系の１つの態様においては、第１成分は、腫瘍関連抗原に対する抗体の 結合体又は該抗体の抗原結合部位を含む該抗体のフラグメントの結合体であり、 該抗体又はそのフラグメントは、酵素又は触媒機能を有する抗体もしくはそのフ ラグメントに、直接又は連結成分を介して間接に結合されている。この場合に、 この結合は、化学的結合によって行うことがてきるか、又は、１個又はそれより 多くの抗原結合部位及び１個又はそれより多（の触媒部位を少な（ともコードし ている核酸配列と分子のベクター機能を保持するのに必要な及び再構築された核 酸配列の遺伝子生成物力慎核細胞又は原核細胞により発現されるときペプチドの 触媒機能を保持するのに必要な他の配列とを一緒にスプライシングすることによ り行うことができる。

更なる態様においては、第１成分中の抗体は二価であり、該抗体は、１つのフラ グメントが腫瘍マーカー物質に対して親和性を有しており、他方のフラグメント が酵素に対して親和性を有しているところの、２つの一価抗体フラグメントを相 互に結合させることにより、又は組換えＤＮＡ技術により形成される。このよう な場合に、結合体は、投与の前に生体外で形成させることができるか、又は最初 に二価抗体を投与して、それが腫瘍部位に局在化する時間を許容し、次いで腫瘍 部位に局在化した抗体の第２アームで捕捉するために酵素を投与することにより 生体内で形成させることができる。

第１成分の抗体は、ヒト起源の抗原結合部位（１個又はそれより多くの）又は非 ヒト種の抗原結合部位を有するヒト免疫グロブリン又はそのフラグメントである ことができる。

ライヒマン・エル、クラーク・エム及びウィンター・ジー［治療用のヒト抗体の 再形成（Ｒｅｓｈａｐｉｎｇ　ｈｕｍａｎ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｆｏｒ　ｔ ｈｅｒａｐｙ）−ネイチャー　　３３２：３２３−３２７．１９８８］は、遺伝 子工学技術により、誓書動物モノクローナルの抗原結合部位を、ヒト免疫グロブ リンフラグメントに導入して、ヒト対象中でのこの分子の免疫原性を最小にする ことができることを示している。免疫グロブリン遺伝子ＤＮＡは、抗体のＦＣ部 分が活性酵素部分で置換されるように操作することができ［ノイノ（−ガー・エ ム・ニス、ウィリアム・ジー・チー、フォックス・アール・オー　−ネイチャー 　３１２：６０４−６０８．１９８４コ、そして１個又はそれより多くの抗原結 合部位と１個又はそれより多くの酵素活性部位を有するこのような遺伝子工学的 に作り出された構築物を本発明で使用することができる。

１つの種由来のモノクローナル抗体を他の種に注入すると、宿主抗体反応は注入 されたモノクローナルのイディオタイプを指向することがある（少なくとも部分 的に）が観察された（Ｒｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ、　　Ｉ　ＲＣＳ　　ＭｅｄＳｃｉ 、１３：９３６−７．１９８５）。同様に、酵素を包含するノくクチリア生産物 は、ヒトを含めて哺乳動物種において免疫原性であることは周知されている。

本発明の系は、ヒトに最も有効であり、そして第１成分抗体−酵素結合体の免疫 原性が最小にされる場合に又はこのような結合体に対する免疫耐性が誘発された ならば反復使用に適する。これは、ヒトノ１イブリドーマによる特異的抗原に対 するモノクローナルの生産は一貫して達成することは困難であることがこれまで 証明されているので、遺伝子工学的方法により達成されそうである。醤歯動物モ ノタローナル抗体の抗原結合部位は、ヒト免疫グロブリン骨格に導入されうるこ とが示された（う酵素として機能する抗体を生産することができ（ポルラック・ ニス・ジエー等、サイエンス　２３４．１５７０−１５７３．１９８６）、それ 故抗体−酵素結合体の最後の形態は、非ヒト起源のペプチド配列及び１個又はそ れより多くの触媒部位により特徴付けられる１個又はそれより多くの抗原結合部 位を発現しているヒト免疫グロブリン構築物であってもよいことも示された。

ヒト酵素又はヒト中で非免疫原性にされた非ヒト酵素に結合した人体に適合した 抗体又は、ヒト免疫グロブリン上の抗原結合部位及び触媒部位の両方を有する構 築物を使用すると、大多数のヒト免疫グロブリンに対する清掃化抗体（ｃｌｅａ ｒｉｎｇ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）は不適当であるので、本発明の系の第２成分は、 酵素の活性部位又は抗体のイディオタイプを指向させられることが必要であろう 。

本出願人は、処置されるべき腫瘍の領域において第１成分の最大局在化が起こっ た後、望ましくない循環第１成分となるものを除去する幾つかの異なる方法を開 発した。第２成分の正確な性質は、非局在化第１成分の除去のために使用される 特定の方法に依存するが、第２成分は、常に、第１成分中の触媒部位を不活性化 する及び／又は血液からのその消散を促進するものであろう。

１つの態様に従えば、第２成分は、第１成分の抗体の抗原結合部位又は第１成分 の酵素の活性部位又は第１成分の他の構成部分に対する親和性を有する抗体又は そのフラグメントである。

更なる態様に従えば、第２成分は、腫瘍部位からの酵素活性の有意な損失を招く ことなく、血漿中の第１成分の酵素活性の急速な損失を引き起こす成分である。

更なる態様に従えば、第２成分は、第２成分が血漿中の酵素に結合することがで きるがしかし血漿から酵素又は抗体−酵素結合体と一緒に除去されるように、十 分な数の共有結合で結合したガラクトース残基又は、ラクトースもしくはマンノ ースの如き他の糖の残基を含み、この除去は、肝臓においてガラクトース又は他 の糖に対する受容体によりなされ、この除去は、それが腫瘍局在化酵素を不活性 化することができるところの腫瘍の血管外空間に、該抗体が認められる程には入 って行かないような期間になされる。この場合には、第２成分中のガラクトース 残基は、化学的に付加されるか、又は末端シアル酸残基を除去することにより露 出される。

末端シアル酸残基は、血液中の糖タンパク質の存在を維持することにおいて役割 を果たす。ノイラミニダーゼによる末端シアル酸の除去は、ガラクトースのよう な近接糖残基を露出させる。脱シアル酸タンパク質（ｄｅｓｉａｌｙｌａｔｅｄ 　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、肝臓及び場合により他の部位で受容体により血液から 迅速に除去される。（モレル等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト リー・２４６：１４６１−１４６７．１９７１）。

２０ｕｇのノイラミニダーゼ［ビブロ　コレラエ（Ｖｉｂｒｏ　ｃｈｏｌｅｒａ ｅ）からのシグマ　タイプｎ（Ｓｉｇｍａ　Ｔｙｐｅ　Ｉｔ）］と共に０．１５ ＭＮａＣ１を含む、ｐＨ５，６の、０．０５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液１ｍＡ’中 で糖タンパク質１＋ｇを３７℃で３０分間消化することにより、アシアロヒト絨 毛性性腺刺激ホルモン（ａｓｉａｌｏ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　ｇｏ ｎａｄｏｔｒｏｐｈｉｎ）を調製した。次いでノイラミニダーゼを除去した。シ ア口及びアシアロ調製物をＡ２Ｇマウス中でのクリアランスについて比較した。

シアル酸つき（ｓｉａｌｙｔｅｄ）ｈＣＧのＴ１／２は、２４時間以上であった が、脱シアル酸形態のＴ１／２は〈５分であった。

本発明の更なる態様は、第１成分が、追加のガラクトース又は他の糖残基の付加 又は露出により修飾された抗体酵素結合体であり、そしてガラクトシル化された 又は同様なタンパク質を血液から除去することに関与している対応する糖受容体 に対してより大きい親和性を有するアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔ ｕｉｎ）の如き作用物質と共に投与用であり、アシアロフェチュイン封鎖（ｂｌ ｏｃｋａｄｅ）は、腫瘍中の結合体の満足なレベルが達成されるまで保持され、 次いで血漿中の結合体の濃度を第３成分を投与する前に低下させるようにした態 様である。

この態様は、清掃化抗体のガラクトシル化について述べた方法と同様な方法によ り、抗体−酵素結合体へのガラクトース残基の付加を必要とする。ガラクトシル 化結合体を投与する前に、ガラクトース受容体は、これらの受容体にガラクトシ ル化結合体よりも強（結合する作用物質により封鎖される。これにより、ガラク トース受容体が結合体を取り上げることが再び自由になるまで、血漿中の結合体 の高レベルが維持される。

アシアロフェチュインは、ガラクトース受容体に強く結合することが知られた物 質であるが、他の免疫原性の少ない物質を、同じ目的で同定又は開発することが できる。

本発明の更なる態様では、第２成分が、５００．　ＯＯＯダルトン以上の分子量 を有するデキストラン、リポソーム、アルブミン微少法又はマクログロブリン、 又は血液群０赤面球の如き生物分解性粒子に結合されていて、第２成分が結合体 のサイズにより血管区画を抜は出すのを阻止されている。

本発明の更なる態様では、第２成分が、第１成分と結合して血漿からの消散を促 進されている複合体を形成することができるエピトープを有する抗原、ハブテン 又はタンパク質構築物である。

更に修飾された本発明の系では、第１成分は、ビオチン又はビオチンの誘導体に 共有結合で連結されており、その場合には、第２成分は、卵白中に見出だされる ビオチン結合性糖タンパク質アビジン又はストレプトアビジンを含んで成り、こ れらは随時ガラクトースに連結されていてもよい。

ビオチンは、１０モル過剰のスルホスクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘ キサノエートとの、ｐＨ８，５で、４℃で１６時間の反応により抗体又はそのフ ラグメントに結合させることができる。生成物は、セファデックスＧ−２５での クロマトグラフィーにより精製される。

すべてのこれらの場合に、アシアロフェチュインの関与する方法を除いては、第 ２成分は、追加の成分が血管区画から認められる程度に逃げないように、巨大分 子又は生物学的に分解可能な粒子と結合させることができる。巨大分子は随意に ガラクトシル化されていてもよい。

消散成分が血管区画から逃げるのを制限する巨大分子は、５００．０００ダルト ン以上であるらしく、そしてデキストランの如き炭水化物、リポソームにおける 如き脂質又はアルブミン微小球における如きタンパク質又はマクログロブリンを 包含する。この目的の生物分解性粒子の例は血液群０の赤血球である。

抗体に第１成分を結合させることに替わる方法として、それはホルモン又は生長 因子又は抗体以外の物質であって、その物質に結合することができる受容体が腫 瘍上に存在しているところの物質に基づくことができる。

腫瘍は、生長因子、ホルモン及び他の代謝物のための受容体を発現することがで き、それによりこれらは選択的輸送のための標的部位として使用することができ る。対応する生長因子、ホルモン、代謝物又は遺伝子構築物をベクターとして使 用して、酵素を抗体に匹敵する方法で腫瘍部位に運ぶことができる。腫瘍に局在 化している放射標識されたホルモン、生長因子及び代謝物の文献の例がある［ク レニング等、ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　　ｉ　　２４２−２４４．１９８９ （ソマトスタチン）；／’・ｙトナー等、アメリカン・ジャーナル・オブ・ロー エントゲノロジー（Ａｍ、　Ｊ、　Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ）、１４３：３７３− ３７４．１９８４］が、これらのいずれにも、腫瘍部位に酵素を運ぶのにベクタ ーは使用されていない。

第１成分の酵素部分は、ヒト又は非ヒト起源であることができる。ヒト起源の酵 素を使用することの利点は、非ヒト起源の酵素の免疫原性作用を回避するか又は 最小にすることにある。ヒト起源の酵素の欠点は、ヒト組織における酵素の存在 がプロドラッグを活性化させ、か（して非腫瘍部位で活性薬剤を放出する可能性 があることである。しかしながら、この活性化が深刻な問題を引き起こさないよ うに分布している成る種のヒト酵素を同定すること力呵能である。第１成分結合 体を与える前に血漿から迅速に消散せしめられる高い親和性の抗酵素フラグメン トを使用することにより、組織中のこのような酵素の不活性化を達成することも できる。ヒト酵素が血漿中に普通に存在する場合には、これは血漿中のプロドラ ッグを活性化し、これは非常に不利でありそして一般的毒性効果を引き起こしが ちである。しかしながら、結合体中の酵素を指向する適当に選ばれた抗体（１種 又は１種より多くの）又はフラグメントは、血漿中の同じタイプの遊離の天然に 循環している酵素を不活性化させる効果を有する。ヒトホスファターゼの場合に 、異なる組織中で生産されたい（つかの異なる形態があるが、基質に対する特異 性の証拠は殆どない。

アルカリホスファターゼの１つのアイソタイプを指向する抗体が他のアイソタイ プに結合することがあるという証拠もある。

非ヒト起源の酵素の免疫原性は、そのアミノ酸配列の修飾により減少させること ができる。

抗体−酵素結合体の免疫原性を少なくするために、それは、例えば、メトキシポ リエチレングリコール５０００のシアヌール酸クロライド誘導体との反応により 、ポリエチレングリコール又は他のポリマーに結合させることにより修飾するこ とができる。得られる物質は、直接使用してもよく又は、生の結合体の更なる注 入に対して宿主を耐性にするために前以て注入してもよい。Ｄ−グルタミン酸及 びｄ−リシンの合成ポリマーとの反応、又は側鎖の外方端部に交互にＤ−グルタ ミン酸とＤ−リシンを含んで成るトリペプチジル−修飾有機ポリマーとの反応は 、結合体の免疫原性を下げることを予想することができる。例えば、アブコラス キー・ニー、ファン・ニス・チー、パレツーク・エン・シー、ダビス・エフ・エ フ　−　ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ）、２５２：（１１）、３５７８−８１．１９７７、又は カワムラ・チー、イガリシン・チー、フジイ・チー、カマサキ・ジェー、ワダ・ エイチ、キシモト・ニス、　　インターナショナル・チーキブス・オブ・アレル ギー・アンド・アプライド・イムノロジー（Ｉｎｔ、　Ａｒｃｈ、　Ａｌｌｅｒ ｇｙ　ａｐｐｉ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ）、７６：３２４−３３０．１９８５、参照 免疫原性抗体酵素結合体及び免疫原性抗体又はアビジン様構築物の使用により生 じる臨床的問題を最小にするためには、反復処理の輸送のために十分な時間を与 えるために、シクロスポリン、シクロホスファミド、メトトレキセート、アザチ オプリン等の免疫抑制剤を使用することにより、異種特異的（ｘｅｎｏｓｐｅｃ ｉｆｉｃ）タンパク質に対する宿主抗体の生産を最小にするか又は遅延させるこ とが望ましい。

ウサギによる及び患者中の抗ネズミ抗体反応を阻止するべきシクロスポリンの能 力が証明された。例えば、レダーマン・ジェー・ニー、ビーアンド・アール・エ イチ・ジエー、バッグシャウニ・チー・デー、　ブリティッシュ・ジャーナル・ オブ・キャンサー（Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ）　　５８　：　５６２−５６ ６．１９８８、又は、レダーマン・ジエー・ニー、ビーアンド・チー・エイチ・ ジェー、リッグス・ニス・ジエー、サール・エフ・グレーザー・エム・ジー、グ リーン・ニー・ジエー、ディル・アール・ジー、　ブリティッシュ・ジャーナル ・オブ・キャンサー　５８：６５４−６５７．１９８８゜ 成る臨床的条件においては、腫瘍部位に第１成分が局在化しているのを確かめる ように、ガンマ線カメラによるシンチグラフィー映像化に適した放射性同位元素 の如き信号発生分子に第１成分を結合させるのが有利である。

放射性標識は、クロラミンＴを使用する標準方法で】２５Ｉ又は＋３１１により 達成することができる（グリーンウッド・エフ、ハンター・ダブリュ、プロバー ・ジェー・ニス、　バイオケミカル・ジャーナル・８９：１１４−１２３．１９ ６３；　　フレーカ−・ピー・ジエー、スペック・ジエー・シー、　バイオケミ カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミユニケージＢ　ン（Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍａ）　・Ｆ３０　：　８４９− ９５７．１９７８）が、他のヨウ素化又はインジウム又はテクネチウムのような 他の同位元素による他の放射標識法を使用することもできる。このような放射標 識結合体は、一般に、免疫シンチグラフィーによる放射免疫局在化に必要な量で 臨床的実施において使用され、そして一般に投与された結合体の小部分のみを構 成するであろう。

結合体の放射標識画分と共に現代の分析法を用いて、標的部位及び非標的部位に おける結合体の濃度を決定し、かくしてプロドラッグの投与の最適時間を決定す るのを助けることができる。（リッグス等、インターナショナル・ジャーナル・ オブ・キャンサー・補遺（Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｐｐ）・２．９ ５−９８．１９８８；デウールスト等、（アブストラクト）、ブリティッシュ・ ジャーナル・オブ・キャンサー１９８８）。

本発明の系は、１種より多くの第１成分及び／又は１種より多くの第２成分及び ／又は１種より多くの第３成分を含むことができる。腫瘍中の細胞上の標的抗原 及び受容体の発現の不均一性は、酵素を腫瘍部位に運ぶのに１種より多くのベク ターの使用を必要とすることがある。多重ベクターは、腫瘍部位に酵素をより多 量に又はより経済的に輸送することを可能とする。１種より多くのプロドラッグ を使用して、多重薬剤化学療法と同等な状態を作り出して、薬剤耐性の危険を減 少させるのも有利であり、これは、１種より多（の酵素の処理における使用を必 要とする。これらの変法は、血漿及び他の非腫瘍部位からの酵素の必要な消散を 達成するのに、１種より多（の第２成分の使用を結局は必要とする。

本発明の系を形成する３つの成分は、治療によるヒト又は動物身体の処理方法に おいて相互に関連して使用されるように設計されている。

それは、癌腫、肉腫、リンパ腫及び白血病を含む悪性疾患の処置を必要とする宿 主に有効量の系を投与することより成る、かかる悪性疾患の処置方法に使用され るように特に設計される。

このような方法では、第１成分を最初に投与し、第２成分を、第１成分の後に、 第１成分が悪性細胞の部位に選択的に局在化するような時間間隔の後投与し、第 ３成分を第２成分の後で、血液中の第１成分の濃度がそのピーク値から減少する ような時間間隔の後投与する。

下記の実施例は、本発明の種々の面を説明するために示される。

実施例１ 本実施例は、抗体による活性酵素部位の不活性化を説明するための実施例である 。

カルボキシペプチダーゼＧ２によるリンパ球供与マウスの免疫に従って慣用の方 法によりモノクローナル抗体（Ｓ　Ｂ　４３）を生産した。マイクロタイタープ レートを、３単位／ウェルのカルボキシペプチダーゼＧ。

で被覆し、ハイブリドーマ培養物からの上澄液と共にインキュベーションし、そ して１２５ヨウ素標識ウサギ抗マウス抗体が、緩衝液中１：８００の希釈率で５ ０％結合力価で前記被覆ウェルに結合したことが見出だされた。抗体（ハイブリ ドーマ上澄液）の１０００倍希釈液を含む緩衝液中で３７℃での２４時間のイン キュベーションの後、酵素活性のアッセイを評価した。２４時間だけ緩衝液とイ ンキュベーションされた酵素は、光学密度の測定値により示されたようにメトト レキセートを切断する能力の大部分を保持していた（最初は５４．１力ルボキシ ペプチダーゼ単位／ｍＡは２４時間後には４０単位／ｍｌに下がった）。抗体（ ハイブリドーマ上澄液）を含むウェルにおいては、活性は１３．０力ルボキシペ プチダーゼ単位／ｍｌに減少した。抗体単独では、メトトレキセートの光学密度 に対して影響を及ぼさなかった。これらの実験は、カルボキシペプチダーゼの酵 素活性部位が、該酵素に対して生じた抗体により実質的に不活性化されうること を示す。上記の方法により生じたカルボキシペプチダーゼＧ２に対するモノクロ ーナル抗体は、それらがこの酵素の活性部位の又は活性部位近（のエピトープに 向けられる場合のみ同様な抑制性を有するであろう。

１、ＬＳ１７４Ｔヒト結腸癌異種移植片を左側腹部（Ｌ　ｆｌａｎｋ）に有して いる４匹のヌードマウスに、カルボキシペプチダーゼＧ２に結合されそして１２ ５Ｉで標識された癌胎児性抗原（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉ ｇｅｎ）に向けられたＡ　５　Ｂ　７　（Ｆａｂ’　）２モノクロ一ナル抗体を 注射した。４８時間後に取った免疫シンチグラフは、腫瘍部位への上記結合体の 局在化を確証する。

下記の結合体を使用して同様な結果が得られた。

２、Ａ３Ｂ７完全（ｉｎｔａｃｔ）　Ｉ　ｇＧ−カルボキシペプチダーゼ３、　 Ａ３Ｂ７−Ｆ（ａｂ’　）ｚ　　＝トｏレダクターゼ４．５Ｂ１０（抗ＨＣＧ） −Ｆ　（ａｂ’　）ｚ−カルボキシペプチダーゼ２、酵素への抗体の結合方法 カルボキシペプチダーゼとＩｇＧ又はＦ（ａｂ’　）ｚとの結合は、この酵素の マレイミド誘導体をチオール化抗体と混合することにより達成した。

１）　　Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル （ＳＡＴＡ）によるチオール化ｐＨ７，６の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ ３７２ｍｇ／／のＥＤＴＡを含む）中の１−２ｍｇ／ｌのＩｇＧ又はＦ（ａｂ’ 　）２を、１５モル過剰のＳＡＴＡ（ＤＭＦ中２０ｍｇ／ｍに構成された）で処 理しそして約２０℃で約２時間放置した。次いで、チオール化された抗体をセフ ァデックスＧ−２５のカラムに通して過剰の５ＡＴＡを除去した。ヒドロキシル アミン塩酸塩の水性溶液にリン酸水素二ナトリウムを加えることにより調製した ｐＨ７，５の３．５％ヒドロキシルアミン０．１容量を加えることにより前記チ オールを脱アセチル化した。

２）Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−）ＸＳＰＤ Ｐ）によるチオール化 ｐＨ８，６の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の４ｍｇ／ｍＩの濃度のＩｇＧ 又はＦ（ａｂ’　）２を、１５モル過剰のエタノール中５ＰＤＰで処理した。過 剰の５ＰＤＰを、ｐＨ４，５の０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液と平衡化されたセ ファデックスＧ−２５のカラムで除去した。次いでピリジルジスルフィド基を、 １１００ＩＩＩジチオトレイト一ル５０ｕｌ／ｍｌで３０分分間光し、そして過 剰の還元剤をセファデックスＧ−２５ゲル濾過により除去した。

３）カルボキシペプチダーゼの誘導体化ｐＨ７，６の０．１Ｍリン酸ナトリウム 緩衝液（３７２ｍｇ／ｌのＥＤＴＡを含む）中の２ｍｇ／２．５ｍｌのカルボキ シペプチダーゼを、ＴＨＦに溶解した１５モル過剰のスクシンイミジル　４−（ ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）で３時間処理した。過剰のＳ ＭＰＢをセファデックスＧ−２５でのゲルー過により除去した。

４）結合 上記誘導体化された酵素を、等モル量のチオール化抗体と混合し、結合の進行を ゲル濾過により監視した。更には反応が起こらないと判定されたとき、混合物を 濃縮しそしてゲルを濾過により結合体を精製した。得られた典型的な酵素活性は 結合体ｍｇ当たり１５０−２００単位であった。

実施例３ ＳＢ４３が生体外でカルボキシペプチダーゼＧ２に結合する証拠マイクロタイタ ーウェルをカルボキシペプチダーゼＧ２で被覆し、そしてモノクローナル抗体５ Ｂ４３（カルボキシペプチダーゼＧ２に対して生じた）及び５ＢＩＯ（ヒト絨毛 性性腺刺激ホルモンに対して生じた）を希釈して加えそして吸引の前にインキュ ベーションした。次いで＋２５■抗マウスＩｇＧを加えそして３０分間インキュ ベーションし、続いて吸引及び洗浄を行った。ウェルを切り出しそしてガンマ計 数管で計数した。

下記する結果は、カルボキシペプチダーゼ被覆ウェルに対する５ＢＩＯの有意な 結合を示さないが、使用した５Ｂ４３のすべての希釈物は、カルボキシペプチダ ーゼに対する結合を示す高い計数を示した。ガラクトース部分の付加により修飾 された５Ｂ４３は同様な希釈物を包含しそして非修飾５Ｂ４３と同様な結合を示 した。

マイクロタイタープレートを、ウェル当たり０．　１μｇのＣＰＧ２で被覆しそ して５Ｂ４３と共に一夜インキユベーションした。次いで１２５Ｉ−マウスＩｇ Ｇを導入し、プレートを１時間インキュベーションし、洗浄しそして放射能を計 数した。

試料　時間　計数（１）ＣＰＭ（１）　　％ＣＶ２　　３０　　　８０５　　　 １５８８．６　　　３．６　　　　　　”３　　３０　　１６４２８　　　３３ ２７８．０　　　　．８　　　５Ｂ４３Ｘ２０４　　３０　　２３３３９　　　 ４７３０２．９　　　　．７　　　　　　ｌ／５　　３０　　２２０２０　　４ ４６７９Ｊ　　　　　、７　　５Ｂ４３ｘ１００６　　３０　　２２０９６　　 　４４ｇ３３．８　　　　．７　　　　　ｌ／７　　３０　　　　ｇ４３７　　 　１６８７３．４　　　１．Ｉ　　　　５Ｂ４３Ｘ１０００８　　３０　　　７ ６７１　　　１５３３６．８　　　１．１　　　　　１／９　　３０　　１５４ １１　　　３１０５２．２　　　　．８　　　５Ｂ４３−Ｇａｌ−１０Ｘ２０１ ０　　３０　　１５４１８　　　３１０６６．３　　　　．８　　　　　　ｌｌ 実施例４ ＳＢ４３は生体内で血漿からＡｂ−Ｅ−結合体を不活性化／消散させるという証 拠 血漿中のカルボキシペプチダーゼＧ２活性のレベルは、菓酸類似体であるメトト レキセートのブチロエート及びＬ−グルタメートへの加水分解切断を観測するこ とにより監視することができる。Ａ　５　Ｂ　７−Ｆ　（ａｂ’）ｚ−カルボキ シペプチダーゼＧ２の結合体（２５酵素単位）を静脈内に注射しそして２０時間 後に血漿試料を得る場合に、分光光度法による打ち出しくｐｒｉｎｔ−ｏｕｔ） の工程により示された如＜１．１２−１．４５酵素単位／ｍｌに相当のメトトレ キセートの有意な加水分解が観察された。

Ａ３８７　　Ｆ（ａｂ’　）２−ＣＰＧ２の１９時間後にガラクトシル化抗カル ボキシペプチダーゼ（ＳＢ４３−ＧａｌｌＯ）を注射されたマウス及び５分及び １５分後に採取された血漿は、メトトレキセートの有意な加水分解を引き起こさ ず、これは、酵素が不活性化され及び／又は血漿から消散させられたことを示す 。

ｐＨ８，５の１０５Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（１，５ｍ１）中のカルボキシ ペプチダーゼＧ２（４４，４ｍｇ）を、スルホスクシンイミジル１−６−（ビオ チンアミド）ヘキサノエート（緩衝液７３ｕＩ！中の２９２ｕｇ）と混合し、そ して室温で３時間放置した。次いで、酵素を、３７２ｍｇ／ＩのＥＤＴＡを含み そして２．５ｍｌに容量調節された、ｐＨ７，６の０．１５Ｍリン酸ナトリウム 緩衝液中で平衡化されたセファデックスＧ−２５で分離した。次いでビオチニル 化酵素をテトラヒドロフランに溶解した１５モル過剰のスクシンイミジル　４− （ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）で３時間処理し、そして過 剰のＳＭＰＨをセファデックスＧ−２５でのゲル濾過により除去した。次いで誘 導体化された酵素を、実施例２に記載の如くして、Ａ３Ｂ７抗体のチオール化Ｆ 　（ａｂ′）２フラグメントに結合させた。

アフィニティ精製されたアビジンを、シグマ社から得られたままで、タンパク質 ｍｇ当たり１０−１５単位で、使用した。マウスは、ビオチニル化Ａ３Ｂ７−カ ルポキシペブチダーゼＧ２結合体２０Ｌ１ｇを受は取り、続いて１時間後に２２ ０−５００ｕの用量範囲でアビジンを受は取った。

血漿中の急速な酵素活性の消失が観察された。これは実施例４において５Ｂ４３ モノクロ一ナル抗体で観察されたそれに匹敵しつる。

実施例６ 異なる抗体を生産するハイブリドーマを使用する融合技術（ミルスタイン・シー 及びキュエロ・ニー・シー、ネイチャー　３０５：５３７−５４０．１９８３； スファエルツ・ニー・デー及びベバン・エム・ジ工−、プロシーディンゲス・オ ブ・ザ・ナチュラル・アカデミ−・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ニーニスニー ８３：１４５３−１４５７．１９８６）又はここに使用されるような必要な抗体 の各々の一価調製物の化学的結合により、２つに結合部位に異なる特異性を有す るＩｇＧクラス免疫グロブリンを製造することができる。モノクローナル５ＢＩ Ｏ（抗ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（抗ｈＣＧ））の及びＡ３Ｂ７（抗癌胎児性 抗原、（抗ＣＥＡ））のＦ（ａｂ’　）ｚフラ、グメントを亜ヒ酸塩の存在下に 還元した。０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，６（１０ｍｌり中のＦ　（ ａｂ’　）　２フラグメント（２０ｍｇ）を亜ヒ酸ナトリウム（１２，４ｍｇ） ＥＤＴＡ（３゜７２ｍｇ）及び２−メルカプト−エチルアミン（１，１３ｍｇ） と混合し、そして室温で放置した。固体５．５′　−ジチオ−ビス−（２−ニト ロ安息香酸Ｘ１９．　８ｍｇ）を加え、混合物を約２０℃で１８時間放置した。

チオニトロベンゾエートで修飾されたＦａｂ’　（ＴＮＢ誘導体）をセファデッ クスＧ−２５でのゲＡｙｉ濾過により精製した。収率はタンパク質回収率に基づ いて約７０％であった。

１ｍＭＥＤＴＡを含むｐＨ６，８の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液５ｍＩ中の 抗ＣＥＡのＴＮＢ誘導体（４，８ｍｇ）を、メルカプトエチルアミンで３０分間 処理して１０ｍＭの最終濃度を得た。次いでこの還元されたＴＮＢ−抗ＣＥＡＦ ａｂ’を、ＥＤＴＡｌｍＭを含むｐＨ７，’ｏの０．１Ｍリン酸ナトリウム中で 平衡化されたセファデックスＧ−２５でのゲル濾過により精製した。次いでこの 還元されたＴＮＢ−抗ＣＥ　Ａ　Ｆ　ａｂ’を。

抗ｈＣＧのＴＮＢ誘導体４．９＋ｇ（５ｍｚ）と共に１６時間インキュベーショ ンし、モして二特異性抗体の形成をスペロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　５−１２ カラム（フチーマシア）でのゲル濾過により監視した。収率は、スベロース５− １２カラムでのこの二特異性抗体の精製後のタンパク質に基づいて２０％であっ た。この＋２５■標識二特異性抗体の生体内で機能する能力及びその対応する抗 原に結合する能力は、ＣＥＡ生産性ＬＳ１７４Ｔ腫瘍又はｈＣＧ生産性ＣＣ３腫 瘍を有するヌードマウスへの注入により示された。注入後２０時間めの平均腫瘍 対器官比（ｍｅａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｔｏ　ｏｒｇａｎ　　ｒａｔｉｏｓ）は下記 のとおりであった。

抗ＣＥ＾／抗ｈＣＧ　　　非特異的Ｆ（ａｂ’）２血液　　２．９　　　　０． ６ 肝臓　　３．９　　　　１．９ 腎臓　　１．８１゜２ 肺　　　３．２　　　　１．２ 膵臓　　６３．０ 結腸　　９５．３ （Ａ５Ｂ７と５Ｂ４３（抗カルボキシペプチダーゼ）の結合はまだ行なわ無水メ タノール（１０ｍ／）中のシアノメチル２．３．４．６−チトラー〇−アセチル ー１−チオ−ｂ−Ｄ）ガラクトピラノシド（４００ｍｇ）を、無水メタノール１ ｍｌ中のナトリウムメトキシド５．　４ｍｇにより２０℃で４８時間処理した。

１．３ｍｇ／ｍｌのｐ）（ｓ、　　５の領　２５Ｍホウ酸ナトナトリウム中ｇＧ のストック溶液を調製した。ＩｇＧに結合したガラクト−ス残基の数は決定され なかったので、１．３ｍｇ／ｍｌの濃度のＩｇＧ２００ｕｇに付加した活性化ガ ラクトース誘導体のμｌ数に対応する単位量（ｕｎｉｔａｇｅ）を採用した。活 性化ガラクトース誘導体のアリフォート（例えば、３００．８０．４０．１０． ５及び２　ｕＡりを３ｍＡ’のガラスアンプルに分配しそして真空下に窒素流中 でガラス状残留物となるまで蒸発させた。

ＩｇＧ２００μｇ（ストック溶液１５３　ｕＡりを各アリフォートに加えそして 残留物が溶解するまで混合した。約２０℃で２時間後、溶液をＰＢＳ（リン酸緩 衝液）に対して透析し、その際ＰＢＳを３回取り替えた。どんなレベルのガラク トシル化が最も有効な結果を与えるかを決定するために試験を行った。上記の単 位量として表して、２ｇＧ２００ｕＩ！に付加した活性化ガラクトース誘導体Ｉ ＱｕＩ！が最も満足な結果を与えることが見出だされた。第１図は、モノクロー ナル５Ｂ４３（抗カルボキシペプチダーゼ）の注入後４８時間までの血液及び腫 瘍レベルを示す。Ａは天然形態、Ｂはガラクトシル化形態である。ＬＳＩ７４Ｔ 腫瘍を有しておりそしてＡ３Ｂ７Ｆ（ａｂ’　）２−ＣＰ（カルボキシペプチダ ーゼＧ２）結合体を受は取り、続いて２４時間後、１Ｑｕｌレベル（上記した） にガラクトシル化された５Ｂ４３（抗カルボキシペプチダーゼ）を受は取り又は 対照として食塩水を使用し、続いて１時間後にビス−クロロ安息香酸マスタード プロドラッグ、４−［ビス−（２−クロロエチル）アミノコ−安息香酸グルタミ ドを受は取る、各々４匹のマウスの群において、更に検討を行った。プロドラッ グの投与に続いて間隔を置いてマウスを殺し、組織を抽出し、そしてプロドラッ グ及び活性薬剤レベルをＨＰＬＣ法により測定した。

第１Ｂ図は、５Ｂ４３−ＧａｌｌＯ清掃化抗体を受は取らなかったマウス及び受 は取ったマウスの種々の組織における活性薬剤のレベルを示す。

５Ｂ４３−ＧａｌｌＯ清掃化抗体の不存在下では、活性薬剤のレベルは肝臓及び 肺で見出だされるレベルよりは有意に低かったが、５Ｂ４３−Ｇａ１１０清掃化 抗体を受は取った動物では、腫瘍レベルは他の組織でのレベルより高かった。

同じ実験の一部として、１つの群は５Ｂ４３−ＧａｌｌＯを有しそして１つの群 は５Ｂ４３−ＧａｌｌＯを有していない２つの群のマウスを、プロドラッグを受 は取ることなく殺した。組織を抽出しそしてプロドラッグを生体外で活性薬剤に 転化する能力を試験した。結果を表に示しそして組織１グラム当たりのカルボキ シペプチダーゼの注入用量の百分率と腫瘍　　　血漿　　　Ｔ／Ｐ Ａｂ−ＣＰＧ２　　　　８．１（＋０．６９）　　０．２２　　　３６＾Ｂ−Ｃ ＰＧ２　　　　７．２（＋１．４２）　　０．０２６　　２７７＋ Ｇａｌ　１０抗ＣＰＧ２ ２４時間後 実施例８ 静脈内投与した抗体に対応する抗原が血液中に存在する場合には、抗原−抗体複 合体が生じ、これらは循環系から細網内皮細胞への抗体のクリアランスを促進す る。抗ｈＣＧ抗体Ｗ１４及び５ＢＩＯの促進されたクリアランスは、ＬＳＩ７４ Ｔ細胞膜にＣＥＡを発現するがＣＥＡを血液中に分泌しないＬＳ１７４Ｔを持っ ているマウスにおけるＡ３Ｂ７抗ＣＥＡ抗体と比較して、ＣＣ３ｈＣＧ分泌腫瘍 を有するヌードマウスに注入したときに起こる。

第２図は、６匹（７）ＣＣ３を有するヌードマウスに５ＢＩＯＦ（ａｂ’　）２ −ＣＰ（５０単位ＣＰ）を静脈内投与し、続いてモノメシルモノクロロ安息香酸 マスタードプロドラッグ４−［（２−クロロエチル）メシルアミノコ安息香酸グ ルタミドの３回の注入（各１０ｍｇ）の１回目の注入を行い、５６時間めに第２ の注入を、７２時間めに３回目の注入を行った結果を示す。２週間後には、腫瘍 はもはや検出できず、１２週間ではマウスの腫瘍はなくなった。６匹の未処理マ ウスにおけるＣＣ３腫瘍の増殖も示される。

Ａ３８７Ｆ（ａｂ’　）ｚ　　ＣＰ５０単位の投与後１２０時間以前ｉ：Ｌｓ１ ７４Ｔ保持マウスにプロドラッグを導入しようとする試みは、動物の死をもたら し、これは、血液中の持続する酵素活性によるものであることが示された。

第２Ｂ図は、７７ｕｇの対応する抗原、カルボキシペプチダーゼＧ２を１時間後 に投与した場合のＡ２Ｇマウスの血液からの２００Ｈのモノクローナル’２５Ｉ −３Ｂ４３抗カルボキシペプチダーゼの促進されたクリアランスを、該抗原を受 は取らなかった対照と比較して、示す。

これらのデータは、投与された抗体の促進されたクリアランスは、抗体の結合部 位に対応するエピトープを発現している物質の投与により達成されうることを示 す。

実施例９ ＳＢ４３に対するＴＣＫ９ヒトアルブミン微少球微少台１ｍｇのＴＣＫ９ヒトポ リアルブミン微少球微少台計１ｍ／のリン酸塩緩衝液ｐＨ８，７中で約２０℃で ２時間、１２．５Ｍ過剰のスルホ−ＭＢＳ（６６Ｋｄのモノマ一単位を基準とし て）により誘導体化した。混合物を３００Ｏｒｐｍで３分間遠心分離しそして緩 衝液１ｍＡ’に再懸濁させ、もう１回再洗浄した。１．５ｍｇのＩ’ｌＳＩ標識 ５Ｂ４３を製造会社（フチーマシア）のインストラクションに従って２０Ｍ過剰 の５ＰＤＰにより約２０℃でチオール化した。この誘導体化した微少法を３００ ０ｒｐｍで３分間遠心分離し、次いでチオール化５Ｂ４３溶液に再懸濁させ、混 合物を４℃で７２時間インキュベーションすることにより結合を行った。

１３０００ｒｐｍで２分間遠心分離するＥＭＳＥ？イクロセントール（ＭＳＥＭ ｉｃｒｏ　ｃｅｎｔａｕｒ）：ｌことにより、抗体ポリアルブミン結合体を反応 混合物から分離した。ペレットを使用のために無菌食塩水２５０ｕハニ再懸濁さ せた。

実施例１０ ＬＳ１７４Ｔ異種移植片を有するマウスに、アシアロフェチュインを０時間めに 静脈内に与えそして再び１２０分めに与えた。１０単位にガラクトシル化された ”ｌ−Ａ３Ｂ７を、時間＋５分に投与した。マウスを間隔を置いて殺し、組織を 切り出し、放射能レベルを計数した。２４時間めに、腫瘍対血液比は２７．８： １であり、腫瘍対肝臓比は４゜２：１であった。総ての他の組織は、更に好まし い比すら示した。肝臓により取り込まれた酵素は迅速に不活性化されるのに対し て、器官中では放射能は持続することが認められよう。

蓮 国際調査報告 国際調査報告 ＧＢ　８９００４２７

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．悪性疾患の処置において互いに関連して使用するための３成分系であって、 （ａ）第１成分が悪性細胞の部位に選択的に局在化する傾向を有するような悪性 細胞に関連した分子配置に対して相補的な１個又はそれより多くの分子配置と、 （ｂ）それに追加して１個又はそれより多くの触媒部位とにより特徴付けられる 物質又は物質の結合体である第１成分と、第１成分のこのような部分に結合する ことができ、それにより第１成分の触媒部位を不活性化させ及び／又は第１成分 及び第２成分が臨床的に投与されるとき第１成分の血液からのクリアランスを促 進する第２成分と、第１成分の触媒部位に対する基質である第３成分であって、 この触媒作用の最終生成物の１つが悪性細胞に対して第３成分よりも細胞毒性が 大きい物質であるような第３成分、とを含有して成る３成分系。
2. ２．第１成分又は第１成分の一部がビオチニル化されており、第２成分がアビジ ンであるか又はビオチニル化タンパク質に結合するための高い親和性を有する他 のタンパク質である、請求の範囲第１項記載の系。
3. ３．第１成分が腫瘍関連抗原に対する抗体の結合体又は該抗体の抗原結合部位を 含む該抗体のフラグメントの結合体であり、該抗体又はそのフラグメントは、酵 素又は触媒機能を持った抗体もしくは抗体のフラグメントに、直接に又は連結成 分を介して間接に結合している、請求の範囲第１項記載の系。
4. ４．前記結合が、化学的結合により達成されるか、又は、１個又はそれより多く の抗原結合部位及び１個又はそれより多くの触媒部位を少なくともコードしてい る核酸配列と、分子のベクター機能を保持するのに必要であり且つ再構築された 核酸配列の遺伝子生成物が真核細胞又は原核細胞により発現されるときペプチド の触媒機能を保持するのに必要な配列とを、一緒にスプライシングすることによ り達成される、請求の範囲第３項記載の系。
5. ５．第１成分中の抗体が二価であり、そして該抗体は、１つのフラグメントが腫 瘍マーカー物質に対して親和性を有しており、他方のフラグメントが酵素に対し て親和性を有している、２つの一価抗体フラグメントを相互に結合させることに より、又は組換えＤＮＡ技術により形成される、請求の範囲第３項又は４項記載 の系。
6. ６．抗体と酵素との結合体は、投与の前に生体外で形成されるが、又は量初に前 記二価抗体を投与して、それが腫瘍部位に局在化する時間を許容し、次いで腫瘍 部位に局在化した抗体の第２アームで捕捉するために酵素を投与することにより 生体内で形成される、請求の範囲第５項記載の系。
7. ７．第１成分の抗体は、ヒト起源の抗原結合部位（１個又はそれより多くの）又 は非ヒト種の抗原結合部位（１個又はそれより多くの）を有するヒト免疫グロブ リン又はそのフラグメントである、請求の範囲第１−６ｂ４のいずれかに記載の 系。
8. ８．第２成分が、第１成分の抗体の抗原結合部位又は第１成分の酵素の活性部位 又は第１成分の他の構成部分に対する親和性を有する抗体又はそのフラグメント である、請求の範囲第１−７項のいずれかに記載の系。
9. ９．第２成分は、腫瘍部位からの酸素活性の有意な損失を招くことなく、血漿中 の第１成分の酸素活性の急速な損失を引き起こす成分である、請求の範囲第１− ８項のいずれかに記載の系。
10. １０．第２成分は、該第２成分が血漿中の酵素に結合することができるがしかし 血漿から前記酵素又は抗体−酵素結合体と一緒に除去されうるように、十分な数 の共有結合で結合したガラクトース残基又は、ラクトースもしくはマンノースの 如き他の糖の残基を含んでおり、この除去は、肝臓においてガラクトース又は他 の糖に対する受容体によりなされ、この除去は、それが腫瘍局在化酵素を不活性 化することができるところの腫瘍の血管外空間に、該抗体が留められる程には入 って行かないような期間になされる、請求の範囲第９項記載の系。
11. １１．第２成分中のガラクトース残基は、末端シアル酸残基を除去することによ り露出される、請求の範囲第１０項記載の系。
12. １２．第１成分が、追加のガラクトース又は他の糖残基の付加又は露出により修 節された抗体酵素結合体であり、そしてガラクトシル化された又は同様なタンパ ク質を血液から除去することに関与している対応する糖受容体に対してより大き い親和性を有するアシアロフェチュインの如き作用物質と共に投与するためのも のであり、アシアロフェチュイン封鎖は、腫瘍中で結合体の満足なレベルが達成 されるまで保持され、次いで血漿中の結合体の濃度を第３成分を投与する前に低 下させる、請求の範囲第１項記載の系。
13. １３．第２成分が、５００，０００ダルトン以上の分子量を有するデキストラン 、リボソーム、アルブミン微少球又はマクログロブリンのような巨大分子に結合 されているか、又は血液群０赤血球の如き生物分解性粒子に結合されていて、第 ２成分が結合体のサイズにより血管区画を抜け出すのを阻止されている、請求の 範囲第１−１１項のいずれかに記載の系。
14. １４．第２成分が、第１成分と結合して血漿からの促進されたクリアランスを有 する複合体を形成することができるエピトープを有する抗原、ハプテン又はタン パク質構築物である、請求の範囲第１−１３項のいずれかに記載の系。
15. １５．第１成分が、ホルモン又は成長因子又は抗体以外の物質を含み、その物質 に結合することができる受容体が腫瘍上に存在している、請求の範囲第１項又は ２項記載の系。
16. １６．第１成分がヒト起源又は非ヒト起源の酵素を含む、請求の範囲第１−１５ 項のいずれかに記載の系。
17. １７．前記酵素が、非ヒト起源であるが、アミノ酸置換により修飾されていて、 ヒト中でのその免疫原性が最小になっている、請求の範囲第１６項記載の系。
18. １８．前記酵素が、ポリエチレングリコール又は他のポリマーの如き残基に結合 されていて、免疫原性を減少させている、請求の範囲第１７項記載の系。
19. １９．第１成分が、ガンマカメラによるシンチグラフ映像化に適した放射性同位 元素のような信号発生分子に結合されていて、第１成分の腫瘍部位への局在化を 確証するようになっている、請求の範囲第１−１８項のいずれかに記載の系。
20. ２０．１積より多くの第１成分、及び／又は１種より多くの第２成分、及び／又 は１種より多くの第３成分を含む、請求の範囲第１−１９項のいずれかに記載の 系。
21. ２１．シクロスポリン又は他の免疫抑制性薬剤又は抗体と共に使用して、宿主中 での該系に対する抗体反応を抑制する、請求の範囲第１−２０項のいずれかに記 載の系。
22. ２２．治療により一つのヒト又は動物身体の処置方法に使用するための請求の範 囲第１−２１項のいずれかに記載の系。
23. ２３．癌腫、肉腫、リンパ腫及び白血病を包含する悪性疾患の処置方法であって 、このような処置を必要としている宿主に、有効量の請求の範囲第１−２１項の いずれかに記載の系を投与することを特徴とする方法。
24. ２４．第１成分を最初に投与し、第１成分が悪性細胞の部位に選択的に局在化す るような時間間隔の後、第２成分を第１成分の後に投与し、血液中の第１成分の 濃度がそのピーク値から減少するような時間間隔の後、第３成分を第２成分の後 に投与する、請求の範囲第２３項記載の方法。