FI97692B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen aktivaattori-kohdistusosa -konjugaatin ja esilääkkeen valmistamiseksi - Google Patents

Description

97692

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen aktivaattori-kohdistusosa -konjugaatin ja esilääkkeen valmistamiseksi

Keksinnön kuvaus 5 Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisen aktivaattori-kohdistusosa -konjugaatin valmistamiseksi, joka sisältää lysotsyymin aktivaattorina ja ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen tai sen fragmentin kohdistusosana. Keksintö koskee myös menetelmää terapeutit) tisesti käyttökelpoisen esilääkkeen valmistamiseksi, joka sisältää syöpää tuhoavan aineen, joka sisältää pilkottavissa olevan molekyylin, joka estää solun sisään joutumisen.

Keksinnön tausta 15 Lääkkeet eivät ole yleensä valikoivia kohde-elin- tensä tai -solujensa suhteen ja tämän tuloksena niillä on toksisia sivuvaikutuksia. Käsite, jossa liitetään terapeuttinen aine kantajamolekyyliin (esim. vasta-aineeseen), jolla on spesifisyyttä määrättyä kohdesolupopulaatiota 20 kohtaan on näin ollen houkutteleva, jotta saataisiin aikaan paikkaspesifinen lääkkeen vapautuminen. Viime vuosina esimerkiksi on käytetty useita monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat syöpään liittyviä solun pinta-antigeeneja, monien kliinisessä käytössä olevien syöpää 25 tuhoavien aineiden kantajina, kuten selostetaan katsauksessa (Vogel, C.-W., 1987). Tutkijat ovat kuvanneet sellaisten immunokonjugaattien spesifisiä ja voimakkaita sy-totoksisia vaikutuksia monissa in vitro -järjestelmissä. Vähemmän vaikuttavia ja jopa pettymyksen aiheuttaneita 30 tuloksia saatiin tutkittaessa sellaisten immunokonjugaattien immunoterapeuttista vaikutusta syöpää kantavilla eläimillä samoin kuin syöpäpotilailla. Nämä tulokset osoittavat, että immunokonjugaattien käsite asettaa joukon vaikeuksia, jotka täytyy vielä voittaa, koska ei ole ollut 35 mahdollista vapauttaa riittäviä määriä monoklonaalisiin . 97692 2 vasta-aineisiin liitettyjä lääkkeitä (katsauksena katso Vogel., C.-W. 1987).

Varhaisessa vaiheessa tajuttiin, että entsyymit voivat olla ylivoimaisia lääkkeisiin nähden. Ribosomeja 5 inaktivoivat proteiinit (RIP:t) ovat entsyymejä, ja niiden sytotoksista vaikutusta vahvistaa tämä entsymaattinen aktiivisuus. Kuitenkin, lääkkeiden tavoin RIPrien on jouduttava solun sisään, vapauduttava vasta-ainekantajasta ja päästävä asianmukaiseen solunsisäiseen osaan vaikutustaan 10 käyttääkseen. Lisäksi, ollakseen tehokkaita RIP:t tarvitsevat sen, että jokainen kohdesolu ilmentää antigeeniä, ja niillä on luontaista sytotoksisuutta, joka rajoittaa sitä määrää joka voidaan antaa.

Toinen entsymaattinen lähestymistapa käyttää vasta-15 aineeseen kytkettyä pinta-aktiivista entsyymiä. Tämä vasta- aine-entsyymikonjugaatti ei vaatisi solun sisään joutumista ja kykenisi käyttämään sytotoksista vaikutusta alueen soluihin. Yksi esimerkki pinta-aktiivisesta entsyymistä, jota on käytetty vasta-ainekonjugaattina, on fos-20 folipaasi C, joka hyökkää kaikkien solukalvojen fos-folipidien kimppuun suoraan tarvitsematta solun sisään joutumista. Fosfolipaasin kyky hyökätä fosfolipidien kimppuun kaikissa soluissa on kuitenkin luontaisen sytotok-sisuuden merkki, mikä rajoittaa sen hyödyllisyyttä (Flic-25 kinger & Trost, 1976). Toinen vasta-ainekonjugaattina käytetty pinta-aktiivinen entsyymi on kobran myrkyn faktori (CVF), komplementtia aktivoiva entsyymi, joka sen lisäksi ettei sen tarvitse joutua solujen syömäksi ei ole luontaisesti sytotoksinen (Vogel, C.-W., 1987). Kuitenkin, 30 kaikkien vieraiden proteiinien tavoin CVF on hyvin immuno-geeninen ja sen käyttö syöpäsolujen hoidossa on näin ollen rajoittunut.

Toinen lähestymistapa käytti vasta-aine-emäksinen fosfataasi -konjugaatteja etoposidijohdannaisen defosfo-35 rylaatioon. Tämän lähestymistavan ongelmia ovat kilpailu 3 976 92 veressä kiertävien sisäsyntyisten substraattien kanssa, mikä rajoittaa entsymaattista aktiivisuutta kohteessa, ja korkea entsyymiaktiivisuuden taso verenkierrossa ja ei-kohdekudoksissa, mikä johtaa epäsuotavan sytotoksisen ak-5 tiivisuuden nousuun (Senter et ai., 1988).

Erilainen entsymaattinen käsite käytti karboksipep-tidaasi-G2:ta, joka katkaisee olennaisen kasvutekijän, fo-laatin (Searle et ai., 1986). Riittävä folaattitason lasku vaatii kuitenkin kohdekudoksessa korkeamman entsyymikon-10 jugaattitason kuin voidaan saavuttaa käyttämällä vasta-aine-entsyymikonjugaattia in vivo.

Yllä kuvatun kaltaisten erityisten haittojen lisäksi kaikilla entsymaattisilla lähestymistavoilla on immuno-geenisyysongelma. Vasta-aineiden kehittyminen entsyymejä 15 vastaan johtaa vaikutuksen inaktivoitumiseen tukkimisen ja eteerisen esteen kautta ja vasta-aine-entsyymin nopeaan poistumiseen verenkierrosta. Tästä syystä K.D. Bagshawen (1987) ehdottama järjestelmä, joka käyttää entsyymi-vasta-ainekonjugaattia lääkkeen aktivoimiseen, antaisi parhaim-20 millään hyödyllisiä tuloksia vain yhtenä annoksena, ja immuunivaste saattaa estää tehon jopa tällöin. Bagshawen käsite käyttää ei-nisäkäsperäisiä entsyymejä, joilla ei ole analogeja ihmisillä, jotta vältettäisiin muiden entsyymien kuin konjugaatissa läsnäolevan entsyymin aiheut-25 tama aktivoituminen. Nämä entsyymit olisivat kuitenkin hyvin immunogeenisia, erityisesti konjugoituina.

Keksinnön yhteenveto

Olemme keksineet uuden lähestymistavan lääkkeen vapautumiseen käyttäen kohdistettua entsyymiä joka kier-30 tää yllä mainitut rajoitukset. Ehdotamme kaksivaiheista menetelmää. Ensimmäiseksi olennaisesti ei-immunogeeninen kohdistusosa-aktivaattori -konjugaatti, joka sisältää ak-tivaattorin, tyypillisesti entsyymin, kohdistusosaan kytkettynä. Edullisessa suoritusmuodossa kohdistusosa on vas-35 ta-aine, joka sitoutuu solun pinnalla tai syövän solunul- 97692 4 koisella alueella (esim. nekroottisella alueella) sijaitsevaan, syöpään liittyvään antigeeniin. Vasta-aine-akti-vaattori -konjugaatti pysyy spesifisesti syövässä. Jos on tarpeen, sitoutumattoman konjugaatin annetaan poistua ve-5 renkiertojärjestelmästä riittävässä määrin toksisten sivu vaikutusten välttämiseksi. Tarvittaessa tätä menetelmää voidaan nopeuttaa in vivo kompleksin muodostuksella tai ex vivo adsorboimalla spesifiseen matriisiin. Toiseksi annetaan suhteellisen myrkytön lääkejohdannainen (esilääke), 10 jota solut eivät voi ottaa sisäänsä. Syöpäkohdassa vasta-aineeseen sitoutunut entsyymi "aktivoi" lääkejohdannaisen, muuttaen esilääkkeen lääkemolekyyliksi joka pystyy menemään antigeenipositiivisten samoin kuin antigeeninegatii-visten syöpäsolujen sisään syöpäkohdassa ja käyttämään 15 vaikutustaan. Lisäksi lähestymistapamme sallii ei-immuno-geenisen esilääkkeen toistetun antamisen, täten voimakkaasti vahvistaen tämän terapeuttisen lähestymistavan tehokkuutta. Lisäksi tämä lähestymistapa ei rajoitu syöpää tuhoavaan hoitoon, vaan sitä voidaan soveltaa mihin tahan-20 sa järjestelmään tarvittaessa terapeuttisen aineen paik-kaspesifistä vapautumista. Esimerkkeihin muista taudeista, joiden kanssa tätä paikkaspesifistä aktivaatiomenetel-mää voidaan käyttää, kuuluvat tarttuvat taudit, autoimmuunitaudit ja muut tulehdustaudit. Kohdistettu aktivaatio-25 kohta voi olla täten erityinen kudos tai erityinen solu-tyyppi, tartuntaa aiheuttavat organismit mukaan lukien.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle aktivaattori-koh-distusosa -konjugaatin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään ja keksinnön 30 mukaiselle menetelmälle esilääkkeen valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 2 esitetään.

Keksinnön etuna on, että konjugaattien ei tarvitse joutua kohdesolun syömäksi. Täten potilaassa voidaan pitää yllä toistuva ja pitkäaikainen esilääkkeen muuttaminen, 35 mukaan lukien vasta-aine-aktivaattori -konjugaattien toistuvat inj ektiot.

97692 5

Tiettyjen vaatimusten täytyy täyttyä keksintöä varten. Ensiksikin kohdistusosan (vasta-aineen) ja kohdis-tusosaan sitoutuneen aktivaattorin (entsyymin) täytyy olla alkuperää, joka on yhteensopiva hoidettavan lajin kanssa, 5 jotta estetään konjugaattien immunologinen inaktivaatio. Siinä tapauksessa että hoidetaan ihmisiä, niiden pitäisi olla ihmisperäisiä tai ihmistyyppisiä, joko olemalla geneettisesti konservoituneita tai olemalla peräisin geneettisesti samankaltaisesta lajista, ja täten olla olennai-10 sesti ei-immunogeenisiä jotta estetään näitä molekyylejä vastaan suuntautuneiden vasta-aineiden kehittyminen. Esi-lääkkeen täytyy myös olla olennaisesti ei-immunogeeninen. On osoitettu, että tapahtuu vasta-aineiden kehittymistä immunokonjugaateissa (esim. hiiren vasta-aineissa) olevia 15 vieraita proteiineja vastaan. Ihmisen anti-hiiri -vasta-aineen muodostusta on raportoitu syöpäpotilaissa näiden saatua yksittäisiä injektioita hiiren monoklonaalisia vasta-aineita (McCallister et ai., 1988), mikä täten rajaa näiden aineiden soveltuvuuden yhteen hoitosarjaan. Monilla 20 yksilöillä on jopa ennalta olemassaolevia vasta-ainetasoja hiiren immunoglobuliinia vastaan ennen kuin he saavat ensimmäisen annoksensa hiiren vasta-ainetta (Schroff, R. W. et ai, 1985). Lisäksi, kahden tai useamman injektion jälkeen 50 %:lla potilaista voidaan havaita vasta-ainevas-25 teitä jopa heikosti immunogeenisiä vasta-aineiden F^-fragmentteja vastaan (Reynolds, J. C. et ai, 1986). Täten, tarkoitamme olennaisesti ei-immunogeenisella sitä, että aktivaattori-kohdistusosa -konjugaatti ja esilääke voidaan antaa potilaalle toistuvasti aiheuttamatta potilaassa im-30 muunivastetta, joka estää konjugaattien paikantumista, esilääkkeen aktivoitumista tai aktivoidun lääkkeen aktiivisuutta siinä määrin että terapeuttinen teho estyy.

Toinen vaatimus on, että vasta-aineeseen sitoutuneella entsyymillä ei olennaisesti saa olla luontaisesti 35 esiintyvää substraattia verenkierrossa tai ei-kohdesolujen 97692 6 pinnalla. Luontaisesti esiintyvän substraatin olemassaolo isännässä on epäedullista, koska se kilpailee esilääkkeen aktivoitumisen kanssa ja johtaa siihen että esilääkettä aktivoituu vähemmän. Luontaisesti esiintyvien substraat-5 tien poissaolo on myös tärkeää, jotta vältetään vahingolliset sivuvaikutukset, jotka johtuvat entsymaattisesta aktiivisuudesta isännässä ennen vasta-aine-aktivaattori -konjugaatin paikantumista. Vastaavasti sellaiset entsyymit kuten fosfolipaasi-C ja fosfataasit eivät ole sove-10 lialta, koska niillä on luontaisia substraatteja ihmisillä. Määritellään "olennaisesti ei luontaisesti esiintyvän substraatin" sellaisten substraattimäärien poissaoloksi, jotka joutuessaan kontaktiin aktivaattorin kanssa konju-gaattia annettaessa estäisivät esilääkkeen terapeuttisesti 15 tehokkaan muuttumisen lääkkeeksi syöpäkohdissa. Samoin substraatti ei voi olla läsnä määrinä, jotka aiheuttaisivat haitallisia sivuvaikutuksia luontaisesti läsnäolevaan substraattiin kohdistuvan entsymaattisen vaikutuksen johdosta.

20 Kolmas tärkeä vaatimus keksinnölle on, että konju gaatin entsymaattista aktiivisuutta ei saa olennaisesti olla läsnä tai sitä saa olla läsnä vain hyvin alhaisina määrinä verenkierrossa tai ei-kohde-elinten solujen pinnalla, jotta vältetään kohdistumaton esilääkkeen aktivoi-25 tuminen, joka johtaisi aktivaatioon muualla kuin syöpäkoh-dassa. Esimerkiksi emäksisen fosfataasin, ihmisseerumissa varsin korkeina tasoina esiintyvän entsyymin, osoitetaan defosforyloivan molekyylipainoltaan alhaisia yhdisteitä muutamassa minuutissa ihmisseerumissa (Hamm et ai, 1988). 30 Vähäisissä määrin läsnäolevaa entsymaattista aktiivisuutta voidaan edelleen laskea tämän keksinnön vaatimuksen saavuttamiseksi poistamalla vasta-aine verenkierrosta. Tämä voidaan tehdä in vivo muodostamalla immuunikomplekseja tai ex vivo spesifiseen matriisiin adsorboimalla. Konjugaatin 35 entsymaattisen aktiivisuuden olennainen poissaolo määri- 97692 7 tellään niin, että esilääke ei aktivoidu muissa kohdissa kuin syöpäkohdissa siinä määrin että lääkkeen terapeuttinen vaikutus estyy tai ei-syöpäkudoksessa aiheutuu epä-suotavaa sytotoksisuutta, tai molempia.

5 Edullisten suoritusmuotojen kuvaus

Alla kuvatut esimerkit käyttävät ihmisen mono-klonaalista IgM-vasta-ainetta ja ihmisen lysotsyymiä ak-tivaattorina ja doksorubisiinijohdannaista efektorikom-ponenttina (esilääkkeenä). Tämä järjestelmä havainnollis- 10 taa keksintömme etuja, jotka ovat: a) kaikki komponentit, kohdistusosa, aktivaattori ja esilääke ovat olennaisesti ei-immunogeenisiä, mikä sallii toistuvan kohdistuksen samoin kuin esilääkkeen toistuvan antamisen; 15 b) vasta-aine-efektori -kompleksi on myrkytön, tä ten sallien suurten kompleksimäärien antamisen. Esilääke käyttää täyttä sytotoksista aktiivisuuttaan vain aktivaation jälkeen; c) konjugaatin joutumista solun sisään ei vaadita, 20 täten esilääkkeen toistuvaa muuttumista lääkkeeksi voidaan käyttää peräkkäisissä antamisissa; d) antigeenin ilmentymistä kohdekudoksen kaikissa soluissa ei vaadita, koska muutoksen jälkeen lääkemolekyy-lit kykenevät menemään sekä antigeenipositiivisten että 25 antigeeninegatiivisten solujen sisään; e) lysotsyymillä ei ole ihmisissä luonnollisesti ilmenevää substraattia aktiivisuudelleen, millä näin vältetään lysotsyymin aktiivisuudesta kilpaileminen ja tätä seuraavat haitalliset vaikutukset (Lysotsyymin luonnolli- 30 sena substraattina ovat bakteerien soluseinien polymee rit, jotka koostuvat vuorottelevista N-asetyylimuramiini-happo- ja N-asetyyliglukosamiinitähteistä. ); ja f) lysotsyymiä esiintyy verenkierrossa vain hyvin alhaisina määrinä, jotka ovat peräisin lysotsyymiä sisäl- 35 tävistä valkosoluista, eikä sitä ilmennetä solujen pinnoilla (Briggs et ai, 1966).

97692 8 Tässä kuvattu menetelmä on kuitenkin sovellettavissa moniin perusvaatimukset täyttäviin vasta-aineisiin ja aktivaattorijärjestelmiin, eikä käsite ole rajoittunut lysotsyymi-aktivaattori -järjestelmiin. Todellakin, yksi 5 lähestymistapamme etu on se, että se on paljon sallivampi vasta-aineen ominaisuuksien suhteen kuin järjestelmä, joka vaatii, että kohdesolut syövät vasta-aineen. Lisäksi ak-tivaattorin ei tarvitse olla entsyymi, vaan mikä tahansa yhdiste joka toimii muuttaen esilääkkeen aktiiviseksi 10 osaksi, kuten esimerkiksi katalyyttiseksi vasta-aineeksi (Napper et ai, 1987).

Kohdistusosan valinta Tämän keksinnön mukaisesti mitä tahansa antigeeniä vastaan suunnattuja vasta-aineita voidaan käyttää kohdis-15 tusosana. Vasta-aineiden lisäksi kohdistusosina voidaan käyttää muita molekyylejä joilla on affiniteettia kohdistettuihin spesifisiin soluihin, kudostyyppeihin tai tar-tunnanaiheuttajiin. Esimerkiksi sytokiineilla on erityistä spesifisyyttä tietyntyyppisiä soluja kohtaan ja niitä voi-20 daan käyttää kohdistusosina. Vaikka kohdistusosana voidaan käyttää muunkintyyppisiä molekyylejä kuin vasta-aineita, kuten antigeenejä, vasta-ainefragmentteja, lektiiniä, hormonia tai ligandia, yksinkertaisuuden vuoksi termiä vasta-aine käytetään seuraavassa pohdinnassa siinä tarkoitukses-25 sa, että muunkintyyppisiä kohdistusosia voidaan käyttää niiden sijasta.

Tavanomaisia polyklonaalisia vasta-aineita voidaan käyttää käsitteeseen kuuluvina kantajamolekyyleinä. Kuitenkin monoklonaaliset vasta-aineet tarjoavat monia etuja. 30 Kukin monoklonaalinen vasta-aine on spesifinen yhdelle antigeeniselle determinantille. Täten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa normaalikudoksiin kohdistuvan epäspesifisen sitoutumisen määrä ja tätä seuraava myrkyllisyys normaaleille ei-kohdekudoksille vähenee. Lisäksi, 35 koska voidaan tuottaa rajattomia määriä kutakin monoklo- 97692 9 naalista vasta-ainetta, kaikkia yksittäisiä vasta-aine-valmisteita voidaan kontrolloida sen varmistamiseksi, että antigeenispesifisyys pysyy vakiona vasta-ainetuotteen kes-toiän ajan. Erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka 5 ovat spesifisiä eri epitoopeille samoilla kudosspesifi-syyksillä, voidaan yhdistää. Täten, kun käytetään mono-klonaalista vasta-ainetta tai monoklonaalisten vasta-aineiden seosta, vapautumissysteemin tehokkuus ja hallinta paranee ilman, että uhrataan mitään sellaisia myötävaiku-10 tuksia järjestelmän tehokkuuteen, jotka voidaan saavuttaa tavanomaisilla polyklonaalisilla reagensseilla.

Edullinen lähestymistapa on käyttää monoklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat peräisin samasta lajista kuin hoitoa saava eläin. Enimmäkseen, 15 poikkeuksena eläinlääketieteelliset sovellutukset, on suotavinta käyttää ihmisen, ihmistyyppiseksi tehtyjä tai yhdistelmä-vasta-aineita, jotka ovat koostumukseltaan lähinnä ihmistyyppiä. Monia monoklonaalisia ihmisvasta-aineita on kuvattu. Myös on kuvattu lähestymistapoja, 20 Joissa tehdään ihmistyyppiseksi vasta-aineita jotka ovat kehittyneet ei-ihmislajin imusoluista, ja menetelmiä jotka käyttävät ei-ihmisvasta-aineiden vaihtelevan alueen geenejä, jotka on geneettisesti liitetty ihmisen vasta-aineen vakioalueen geeneihin. Homologisten ja geneettisesti muo-25 kettujen vasta-aineiden edut ovat lukuisia. Toisin kuin heterologisille, esim. hiiren tai rotan vasta-aineille, immuunivaste homologiselle vasta-aineelle on minimaalinen. Enintään ilmenee heikko vaste ihmisvasta-aineen idiotyyp-pisille determinanteille ja silloinkin vain monien anto-30 kertojen jälkeen. Ihmisen monoklonaalista vasta-ainetta 16-88 käyttävissä kliinisissä tutkimuksissamme emme ole havainneet mitään immuunivasteen induktiota vasta-aineen minkään alueen, idiotyyppisen, allotyyppisen tai runko-osan (framework) suhteen, toistettujen annosten - jopa 200 35 mg/viikko - jälkeenkään (Steis et ai, 1990). Tämä etu sai- 97692 10 lii koskemattoman, kokonaisen immunoglobuliinin pikemminkin kuin nopeammin metaboloituvien vasta-ainefragmenttien käytön, sallii koskemattoman, kokonaisen immunoglobuliinin korkeiden annosten antamisen, ja sallii monien vasta-ai-5 neen antokertojen käytön. Homologisissa lajeissa tuotetuilla vasta-aineilla on lisäetuja, sillä ne tunnistavat hienoja antigeenisiä eroja, joita heterologiset vasta-aineet tai edes geeniteknologisin menetelmin käsitellyt ihmisvasta-aineet eivät tunnista.

10 Vasta-aine voidaan suunnata mitä kohdetta vastaan tahansa, esim. syöpä-, kudos-, bakteeri-, sieni-, virus-, lois-, mykoplasma-, kudostyyppi- tai erilaistumisanti-geeneja tai -reseptoreja ja jne. Vasta-aine voi olla mistä luokasta tahansa, IgG, IgA, IgE tai igM, ja voidaan käyt-15 tää yhdistelmänä vasta-aineita, jotka reagoivat erilaisten antigeenisten determinanttien kanssa. Yksinkertaisuuden vuoksi kohteeseen viitataan seuraavassa kohdekudoksena, mikä on mikä tahansa näistä materiaaleista joille kohdis-tusosalla on affiniteettia.

20 Keksinnön sovellutuksissa, joissa sytotoksiset ai neet aktivoidaan syöpäsolujen ympäristössä, syöpäsolujen ei tarvitse syödä kohde-antigeenia tai -vasta-ainetta jotta sytotoksinen aine menee solun sisään, kuten tapauksessa jossa vasta-aine on kemiallisesti sitoutuneena sytotoksi- 25 seen aineeseen.

Aktivaattorin valinta

Aktivaattoriaktiivisuuden ei normaalisti pitäisi olla läsnä verenkierrossa tai saatavilla olevissa ei-koh-dekudoksissa, tai sen pitäisi olla läsnä hyvin matalina 30 tasoina, niin että verenkierrossa ja ei-kohdekudoksissa olevan lääkkeen epäsuotavaa aktivaatiota tapahtuu vain hyvin vähäisessä määrin, joka ei johda haitallisiin sivuvaikutuksiin. Lisäksi aktivaattorin substraattien tai aktivaattorin inhibiittoreiden ei pitäisi olla läsnä veren-35 kierrossa tai kohdekudoksissa siinä määrin, että se vaa- 97692 11 rantaa terapeuttisen edun. Ylivertainen etu saavutetaan, jos konjugaatti valitaan niin että se on ei-immunogeeninen valitsemalla samasta lajista peräisin oleva entsyymi kuin hoitoa saava eläin tai lähes identtinen entsyymi. Monet 5 entsyymit ovat säilyneet hyvin evoluutiossa, niin että alemmista lajeista eristetyt molekyylit ovat lähes identtisiä ihmi sent syyniin kanssa.

Vasta-aineeseen kiinnittynyt aktivaattori voi olla minkä luokan entsyymi tahansa; hydrolaasi, oksidoreduktaa-10 si, transferääsi, isomeraasi, lyaasi tai ligaasi, tai vasta-aine jolla on samanlaisia katalyyttisia vaikutuksia (viite Napper et ai, 1987).

Endoglykosidaasientsyymi täyttää yllämainitut vaatimukset aktivaattorin aktiivisuudelle. Lisäksi sen pieni 15 molekyylipaino, yhdestä ketjusta koostuva rakenne ja hyvin tutkitut kemialliset ja rakenneominaisuudet (Imoto et ai, 1972) mahdollistavat entsyymin kemiallisen liittämisen vasta-aineeseen. Lystosyymi on 129-130 aminohapon emäksinen endoglykosidaasi, joka on hyvin konservoitunut. Niin-20 kin erilaisista lajeista kuin kanasta, viiriäisestä ja ihmisestä peräisin olevat lysotsyymit ovat lähes identtisiä aminohappotähteiden lukumäärän, primaaristen amiinien lukumäärän ja tässä katalyyttisessä mekanismissa mukanaole-vien aminohappojen lukumäärän suhteen. Lysotsyymi on sta-25 biili välillä pH 2 - pH 11 aina 77 eC lämpötiloihin saakka. Lisäksi lysotsyymi kestää epätavallisen hyvin useimpien denaturoivien aineiden alhaisia konsentraatioita. Täydellinen disulfidisidoksien pelkistyminen eliminoi ly-sotsyymin entsyymiaktiivisuuden. Ihmisessä lysotsyymiä 30 esiintyy maidossa, kyynelissä, syljessä, istukassa, pernassa, valkosoluissa ja monosyyteissä. Veressä oleva lysotsyymi on peräisin valkosoluista ja monosyyteistä. Normaalit veren tasot ovat noin 1 % kyynelten tasoista (Os-serman ja Lawlor, 1966). Lysotsyymi hyökkää N-asetyyliglu-35 kosamiinin (GlcNAc) ja N-asetyylimuramiinihapon välisen β- 12 97692 (1 -» 4) -sidoksen kimppuun joidenkin bakteerien solusei-nässä ja hyökkää kitiinin, lineaaristen B-(l -» 4) -sidok-slsten Nasetyyllglukosamllnlpolymeerlen kimppuun. Edulliset substraatit ovat polymeerejä, jotka ovat yhtä suuria 5 tai suurempia kuin (GlcNAc)6.

Aktivaattorin kytkentä vasta-aineeseen Tämän keksinnön menetelmän mukaisesti aktivaattori-entsyyml tai katalyyttinen vasta-aine kytkeytyy kohdistus-vasta- aineeseen tavalla, joka säilyttää kompleksin kyvyn 10 sitoutua antigeeniin ja aktivoida esilääkekomponentti. Tämä saadaan aikaan käyttämällä homo- tai heterobifunktionaalisia ristisidoksia muodostavia aineita tai suoraan proteiinia muokkaavia reagensseja, jolloin saadaan aikaan hyvin reaktiivisia ryhmiä sekä aktivaattorikomponenttiin 15 että kohdistusosaan. Näillä reaktiivisilla ryhmillä deri-vatisoituina aktivaattori ja kohdistuskomponentit kytkeytyvät yhteen kovalenttisella sidoksella kun ne sekoitetaan yhteen.

Proteiineihin tai peptideihin voidaan tuoda kytken-20 täryhmiä (linkers) saattamalla ne reagoimaan amino-, kar-boksyyli- tai sulfhydryyliryhmien kanssa (Wawrzynczak ja Thorpe, 1987) ja glykoproteiiniin ja hiilihydraatteihin sokerin hapetuksen jälkeen, jolloin saadaan aldehydejä (Sela ja Hurwitz, 1987). Aldehydit voidaan saattaa reagoi-25 maan kytkentäryhmän aminoryhmien kanssa (esim. hydratsi-din), jolloin muodostuu Shiffin emäs (esim. hydratsoni).

Sulfhydryyliryhmiä voidaan saada aikaan monien biologisten molekyylien kysteiinitähteistä, mukaan lukien vasta-aineet ja entsyymit. Nämä tähteet voidaan derivati-30 soida reaktiivisten ryhmien kanssa muuttamatta molekyylien biologista toimintaa. Vasta-ainemolekyylien joukossa kaikki luokat sisältävät ketjun sisäisiä ja ketjujen välisiä disulfidisidoksia, jotka stabiloivat molekyylin tertiääri-ja kvaternäärirakennetta. IgM-luokan vasta-aineiden ta-35 pauksessa raskaan ketjun rakenne sisältää useita disul-

·» Mi anti UIN

97692 13 fidisidoksia, jotka voidaan derivatisoida miedon pelkistyksen jälkeen vasta-aineen menettämättä toimintaansa. Vapaat sulfhydryyliryhmät reagoivat sitten halogeenialkyy-liryhmien, p-elohopea(2)bentsoaattiryhmien ja Michael-tyy-5 pin additioreaktioon kykenevien ryhmien kanssa, mukaan lukien esimerkiksi malemiidit ja sentyyppiset ryhmät joita on kuvattu Mitran ja Lawtonin (1979) artikkelissa.

Useimmin käytetyt proteiineihinliittämismenetelmät perustuvat lysiinin nukleofUlisten epsilon-aminoryhmien 10 hyökkäykseen. Aminoryhmä voi reagoida karbonyylifunktioi-den kanssa joita ovat saaneet aikaan hyvin reaktiiviset sukkinimidiesterit, anhydridit tai sykliset tioesterit, tai aktivoimalla karbonyylifunktioita karbodi-imidien kanssa, jolloin muodostuu karboksiamidisidoksia. Vaihto-15 ehtoisesti voidaan muodostaa amidiniumsidos hyökkäämällä aminoryhmään metyyli-imidaattiestereillä.

Efektorimolekyylien valinta Käytettävät efektoriyhdisteet valitaan aiotun sovelluksen tarkoituksen mukaan (esim. tappaminen, solun 20 lisääntymisen estäminen, hormoni terapia tai geeniterapia). Nämä yhdisteet voivat sisältää esimerkiksi farmaseuttisia aineita, toksiineja, alkyloivia aineita, entsyymejä, antibiootteja, antimetaboliitteja, lisääntymistä estäviä aineita, hormoneita, hermoston välittäjä-aineita, DNA:ta, 25 röntgensäteitä läpäisemättömiä väriaineita, paramagneetti- sia väriaineita, radioaktiivisia isotooppeja, fluorogeeni-sia yhdisteitä, markkeriyhdisteitä, solukalvon läpäisevyyttä muuttavia yhdisteitä ja liukenemattomia matriiseja. Ylläolevan ei millään tavoin ole tarkoitus olla kattava 30 lista eikä sen ole tarkoitus rajoittaa keksinnön suoja-alaa. Lopuksi, voidaan käyttää yhdisteiden yhdistelmää. Esimerkkeihin syöpää tuhoavista aineista, joita voidaan käyttää esilääkkeiden valmistuksessa keksinnön mukaisesti kuuluvat nukleosidianalogit, syklofosfamidit ja analogit, 35 nitrosokarbamidit, mitromysiinit, alkyloivat aineet, aika- 97692 14 loidit, bleomysiini, antrasykliinit ja sisplatiini ja analogit.

Edullinen esimerkki antrasykliinistä on doksorubisiini, joka voidaan konjugoida negatiivisesti varautunei-5 siin tähteisiin katkaistavissa olevalla väliryhmällä. Negatiivisesti varautuneiden tähteiden läsnäolon vuoksi solut eivät ota sisäänsä koskematonta lääkejohdannaista eikä se voi käyttää solunsisäistä sytotoksista aktiivisuuttaan. Kuitenkin, väliryhmän pilkkoutuessa (esim. entsymaattises-10 ti) negatiivisesti varautuneet tähteet poistetaan ja lääke johdannainen voi mennä solujen sisään käyttämään vaikutustaan.

Suunnittelimme lääkejohdannaisen, joka koostuu seu-raavista osista: 15 a) syöpää tuhoava aine doksorubisiini; b) kitiini-oligomeeriväliryhmä, joka on konjugoitu doksorubisiiniin pelkistävän päänsä välityksellä lääkkeen C13-karbonyyliryhmään; ja c) kaksi tauriinitähdettä, jotka ovat liittyneet 20 kahteen aldehydiryhmään, jotka ovat syntyneet kitiini-oli- gomeeriväliryhmän ei-pelkistävään päähän periodaattihape-tuksella.

Doksorubisiini kuuluu ryhmään antrasykliinilääkkei-tä, joita on tutkittu laajasti kasvaimia tuhoavina ainei-25 na syöpäpotilaiden hoidossa (Young ja Ozols, 1981). Dok-sorubisiinilla on tärkeä rooli monien kasvainsairauksien, kuten leukemian, rintasyövän ja sarkoomien tehokkaassa hoidossa. Doksorubisiinin tehokasta käyttöä ovat kuitenkin vaikeuttaneet tavanomaiset myrkyllisyydet (veren muodos-30 tuksen suppressio, pahoinvointi ja oksentelu sekä tukan-lähtö) samoin kuin ainutlaatuiset myrkyllisyydet (sydän-lihassairaus). Tässä hahmotellun kaltainen paikkaspesifi-nen aktiivisten doksorubisiinimolekyylien vapautus vähentää suuresti lääkkeen epäsuotavia sytotoksisia vaikutuksia 35 ja täten avaa kokonaisen uuden aikakauden tämän ja muiden antrasykliinien käytössä.

97692 15

Kitiini-oligomeerit (N-asetyyliglukosamiinin oligo-meerit) valittiin väliryhmiksi, koska kitiini-oligomeerit ovat alttiita ihmislysotsyymin aiheuttamalle katkaisulle (Holler et ai, 1975a; Holler et ai, 1975b). Lysotsyymin 5 valinta tarjoaa useita etuja ehdotetulle hoitoperiaatteelle. Ensiksikin, lysotsyymiä on runsaasti nisäkkäiden eritteissä (syljessä, kyyneleissä, maidossa, kohdunkaulan limassa) ja solunsisäisesti kudosten lysosomeissa (erityisesti valkosoluissa ja munuaisissa), mutta lysotsyymitasot 10 seerumissa ovat suhteellisen alhaisia. Tuloksena lääke- johdannaisten epäsuotavan pilkkoutumisen määrä verenkierrossa on oleva rajoittunut. Toiseksi, lysotsyymille ei ole verenkierrossa luonnollista substraattia, joka kykenisi kilpailemaan lääke johdannaisten kanssa kohdistettujen ent-15 syymimolekyylien aktiivisista kohdista.

Lääke johdannaisen soluun ottamisen estämiseksi hii-lihydraattitilaan kiinnitetään kaksi sulfonihappotähdet-tä. Negatiivisesti varautuneiden sulfonihapporyhmien estävä vaikutus molekyylipainoltaan pienten yhdisteiden ottoon 20 solun sisään on dokumentoitu hyvin monilla molekyyleillä, kuten värin ekskluusiotesteissä käytetty Trypan blue (Phillips, 1973) tai Evans blue, jota käytetään apuna diagnostiikassa määritettäessä ihmisen veren tilavuutta (The Merck Index, yhdeksäs painos, 1976).

25 Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1. SPDP-muokatun 16.88:n immunoreaktiivisuus.

Kuvio 2. TPCH-muokatun 16.88:n immunoreaktiivisuus.

Kuvio 3. 16.88-lysotsyymi -konjugaatin immunoreak-tiivisuus.

30 Kuvio 4. Standardikäyrä: lysotsyymiaktiivisuus.

Kuvio 5. 16.88-lysotsyymin pysyminen seerumissa "nude"-hiirissä, joilla on toisesta lajista saatu syöpä-siirre.

Kuvio 6. 16.88-lysotsyymin pysyminen syöpäkasvai-35 messa "nude"-hiirissä, joilla on toisesta lajista saatu syöpäsiirre.

97692 16

Kuvio 7. Doksorubisiinin derivatisointi pyridyyli-disulfiditähteellä.

Kuvio 8. Tioesteri-derivatisoitujen kitiinioligo-sakkaridien valmistus.

5 Kuvio 9. Tioesteri-derivatisoitujen kitiinioligo- meerien liittäminen pyridyylidisulfidi-derivatisoituun doksorubisiiniin.

Kuvio 10. Tauriinitähteiden kiinnitys tioesteri-derivatisoituihin kitiinioligomeereihin.

10 Kuvio 11. Doksorubisiinijohdannainen, joka sisältää tauriinitähteitä pilkottavissa olevan kitiinioligomeeri-väliryhmän välityksellä.

Kuvio 12. Doksorubisiinin annosvaste A2780-munasar-jasyöpäsoluja vastaan.

15 Kuvio 13. Doksorubisiinijohdannaisen, joka sisältää tauriinitähteitä pilkottavissa olevan kitiinioligomeerivä-liryhmän välityksellä, sytotoksinen aktiivisuus.

Esimerkki 1

Vasta-aine-entsyymikonjugaattien valmistus lysot-20 syymientsyymiä ja ihmisen monoklonaalista vasta- ainetta 16.88 käyttäen

Ihmisen monoklonaalisen vasta-aineen 16.88 derivatisointi pyridyylidisulfidiryhmillä

Seuraavat kokeet osoittavat sulfhydryyli-derivati-25 soituun lysotsyymiin (aktivaattoriin) konjugoidun pyri-dyylidisulfidi-derivatisoidun vasta-aineen muodostuksen. Monia aktivoituja disulfidiryhmiä tuodaan vasta-aineeseen N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyliditio)propionaattia (SPDP) käyttäen ennemmin kuin destabiloidaan vasta-ainetta ket-30 jujen välisiä tai ketjunsisäisiä disulfidisiltoja pelkistämällä, jolloin saataisiin aikaan sulfhydryyliryhmiä lysotsyymiin liitettäväksi.

Vaihtoehtoisia kytkentäryhmiä voidaan käyttää siinä tapauksessa, että vasta-aine menettää immunologisen aktii-35 visuutensa SPDP:llä derivatisoitaessa. Uusi väliryhmä t» «M:t *««> Intä· < 97692 17 S-(2-tiopyridyyli)-L-kysteiinihydratsidi (TPCH) (Zara et al, 1989) on kuvattu. TPCH tuo mukaan kytkentäryhmän, jolla on päässään reaktiivinen pyridyylidisulfiditähde, joka on liitetty vasta-aineen hapetettuihin hiilihydraattitäh-5 teisiin. TPCH saattaa sallia useampien väliryhmien mukaan tuomisen vasta-aineen toiminnan heikentymättä kuin ne kyt-kentäryhmät, jotka kytkeytyvät vasta-aineen epsilon-ami-noryhmien välityksellä, kuten SPDP. Yhteen sekoitettuina sulhydryylit, jotka on tuotu aktivaattorientsyymiin 2-imi-10 notiolaanilla (2-IT), reagoivat pyridyylidisulfiditähtei-den kanssa, jotka on tuotu vasta-aineeseen SPDP:llä tai TPCH:11a, jolloin muodostuu disulfidisidos. Disulfidi-sidoksin kytketyillä vasta-aine-toksiini -konjugaateilla tehdyt tutkimukset viittaavat siihen, että vasta-aineen ja 15 aktivaattorientsyymin välinen disulfidisidos voi olla osittain epästabiili in vivo, mikä johtaa aktivaattorientsyymin vapautumiseen vasta-aineesta ennen kuin se on kohdistunut kasvaimeen. Tämä voitaisiin estää kytkemällä vasta-aine ja aktivaattori käyttämällä stabiilimpaa tio-20 eetterisidosta, joka tuodaan mukaan käyttämällä risti- sidoksia muodostavaa reagenssia kuten N(gamma-maleimido-butyryylioksi)sukkinimidia (GMBS) SPDHrn tai TPCH:n sijasta. GMBS saa aikaan terminaalisen reaktiivisen malemiidi-ryhmän pikemminkin kuin sulfhydryylin, jolloin muodostuu 25 stabiilimpi tioeetterisidos sulfhydryylin kanssa, joka tuotiin mukaan lysotsyymiin 2-IT:llä.

Esitetyssä esimerkissä vasta-aine on ihmisen syöpää vastaan suunnattu IgM-luokan monoklonaalinen vasta-aine 16.88 (Haspel et ai, 1985), joka reagoi antigeenin (CTA#1) 30 kanssa, jota löytyy tietyntyyppisten syöpäsolujen solu-limasta, mukaan lukien paksusuoli-, rinta-, munasarja-, haima- ja keuhkosyöpä. Pyridyylidisulfiditähteet saatiin aikaan kahdella eri menetelmällä.

Menetelmä A: Vasta-aine 16.88 derivatisoitiin 35 lysiinitähteiden aminoryhmissä käyttäen heterobifunktio- 18 97692 naalista kytkentäryhmää, N-sukkinimidyyli-3-(2-pyridyyli-ditio)propionaattia (SPDP). Kahdeksan moolia SPDP:tä voitiin tuoda per mooli 16.88:aa 16.88:n vasta-aine-aktii-visuuden vähentyessä hyväksyttävässä määrin (kuva 1). Jot-5 ta saataisiin aikaan sisällytyssuhde 8:1, 10 moolia SPDP:tä saatettiin reagoimaan kunkin 16.88-moolin kanssa 30 minuutin ajan huoneenlämmössä 0,01 M fosfaattipuskurissa, pH 7,0, joka sisälsi 0,1 M natriumkloridia. Konjugoitu vasta-aine erotettiin ylimääräisestä SPDP:stä Sephadex G-10 25 -geelisuodatuksella. Immunoreaktiivisuus arvioitiin modifioimattoman 16.88-referenssin suhteen vertaamalla SPDP-muokatun ja muokkaamattoman 16.88-referenssin kykyä kilpailla I-125-leimatun muokkaamattoman 16.88-referenssin kanssa samaa alkuperää olevan antigeenin CTA#1 sitomises-15 sa. Sisällytyssuhteella 8,6:1 se SPDP-16.88:n määrä, joka vaadittiin vähentämään 125I-16.88:n sitomista 50 %:lla, kas-voi nelinkertaiseksi.

Menetelmä B: 16.88:n hiilihydraattiosat hapetettiin aldehydifunktioiden luomiseksi, joihin kiinnitettiin hete-20 robifunktionaalinen väliryhmä S-(2-tiopyridyyli)-L-kys- teiinihydratsidi (TPCH). Toisin kuin SPDP, joka liittyy vasta-aineeseen proteiinissa olevien aminoryhmien välityksellä, TPCH:n hydratsidiosa muodostaa hydratsoneja alde-hydiryhmien kanssa, jotka saatiin aikaan 16.88:n hiili-25 hydraattiosiin miedolla periodaattihapetuksella. Kuten kuvassa 2 näkyy, voitiin saada aikaan niinkin monen kuin 17 TPCH-moolin sisällytys per 16.88-mooli ilman havaittavaa vasta-aineaktiivisuuden menetystä.

16.88:n derivatisointi tehtiin saattamalla reagoi-30 maan 16.88-liuos konsentraatiossa 2 mg/ml 0,1 M natrium-asetaattipuskurissa, pH 5,5, 10 mM natriumperiodaatin kanssa +4 °C lämpötilassa 10 minuutin ajan. TPCH lisättiin suhteessa 7 000 TPCH-moolia/16.88-mooli (vastaa noin 20-kertaista molaarista ylimäärää TPCH:ta 16.88:n primaaris-35 ten aminoryhmien suhteen) 0,1 M natriumasetaattipuskuris- SK ' Itt t Hill I i MH : : 97692 19 sa, pH 5,5. Ylimääräinen TPCH poistettiin Sephadex G-25 -geelisuodatuksella 0,01 M fosfaattipuskurissa, pH 7,0, joka sisälsi 0,1 M natriumkloridia.

Derivatisoidun vasta-aineen immunoreaktiivisuus 5 arvioitiin kompetitiivisella sitoutumisanalyysillä. Ver rattiin derivatisoidun ja alkuperäisen 16.88-vasta-aineen kykyä kilpailla radioleimatun alkuperäisen 16.88-vasta-aineen kanssa spesifiseen antigeeniin sitoutumisessa. Verrattiin ID50-arvoja derivatisoidulle ja alkuperäiselle vas-10 ta-aineelle.

Lysotsyymin derivatisointi

Lysotsyymin aminoryhmät voidaan derivatisoida ami-noreaktiivisilla heterobifunktionaalisi11a reagensseilla 16.88:aan liittämistä varten. Aminoryhmän derivatisointia 15 tutkittiin SPDP-.llä, GMBS-.llä ja 2-IT:llä. Sekä SPDP että GMBS haittasivat kovasti entsyymiaktiivisuutta jopa niinkin alhaisilla sisällytyssuhteilla kuin 2 kytkentäryhmä-molekyyliä/lysotsyymi (Taulukko 1). Derivatisointi 2-IT:llä suhteessa 2 väliryhmämolekyyliä/lysotsyymi johti 20 lysotsyymiaktiivisuuden säilymiseen 60-68 -prosenttisesti.

Lysotsyymi derivatisoitiin 100-kertaisella molaari-sella ylimäärällä 2-IT:tä 0,01 M fosfaattipuskurissa, pH 8,0, joka sisälsi 0,1 M natriumkloridia ja 0,001 M di-tiotreitolia, 10 minuutin ajan huoneenlämmössä. Reaktio 25 pysäytettiin lisäämällä 10-kertainen molaarinen ylimäärä (2-IT:n suhteen) etanoliamiinia. Derivatisoitu lysotsyymi poistettiin ylimääräisestä 2-IT:stä ja etanoliamiinista Sephadex G-10 -geelisuodatuskromatografiällä samassa puskurissa, pH 7,0, joka sisälsi 2 mM etyleenidiamiinitetra-30 etikkahappoa ja se käytettiin välittömästi pyridyylidisul- fididerivatisoituun 16.88-vasta-aineeseen liittämiseen. Lysotsyymiaktiivisuus mitattiin käyttäen Micrococcus lyso-deikticus -suspensiota (Shugar, 1949).

20 97692

Taulukko 1

Lysotsyymin muokkauksen vaikutus entsyymiaktiivisuuteen 5 Heterobifunktio- Molaariset suhteet Jäljelläoleva naalinen (kytkentäryhmä: lysotsyymi- ryhmä lysotsyymi) aktiivisuus (%)

Koe I Koe II

10 2-iminotiolaani 2,1:1 60 % 68 % SATA 2,0:1 10 % GMBS 1,8:1 5 % 18 % * Mitattuna Micrococcus lysodeiktlcus -määrityksellä 15 (Shugar, 1949).

16.88-lysotsyymi -konjugaattien synteesi 2-IT-derivatisoitu lysotsyymi liitettiin SPDP-deri-vatisoituun 16.88:aan (menetelmä A) tai TPCH-derivatisoi-20 tuun 16.88:aan (menetelmä B).

Menetelmä A: 16.88-SPDP ja 2-IT-derivatisoitu lysotsyymi liitettiin yhteen sekoittamalla kaksi komponenttia suhteessa 1:1 (w/w). Liuosta huuhdeltiin typpikaasulla 24-48 -tuntisen liittämisreaktion aikana 4 eC 25 lämpötilassa. 16.88-lysotsyymi erotettiin vapaasta lysot- syymistä Fractogel 55F-geelifiltraatiolla 0,01 M fosfaattipuskurissa (pH 7,0) joka sisälsi 0,1 M natriumkloridia.

Menetelmä B: 2-IT-derivatisoitu lysotsyymi sekoitettiin TPCH-derivatisoidun 16.88:n kanssa 1:1 (w/w) suh-30 teessä ja saatettiin reagoimaan yli yön huoneenlämpötilassa. 16.88-lysotsyymi erotettiin vapaasta lysotsyymistä geelifiltraatiolla kuten menetelmässä A.

Liittämissaantojen vertailu SPDP-derivatisoidun 16.88:n ja TPCH-derivatisoidun 16.88:n välillä osoitti 35 korkeamman kokonaissaannon SPDP-muokatun vasta-aineen -R m t Rt il l!l i Bi I 1 1 97692 21 kanssa. Rutiininomaisesti 3-4 moolia lysotsyymiä voitiin liittää per mooli SPDP-muokattua 16.88:aa. 16.88-lysot-syymi -konjugaatin antigeeniä sitova aktiivisuus mitattiin kompetitiivisessa sitoutumismäärityksessä muokkaamattoman 5 16.88-referenssin suhteen. Kuviossa 3 näytetyt tulokset osoittavat, ettei vasta-aineaktiivisuutta enää menetetty 16.88-lysotsyymi -konjugaatissa SPDP-muokattuun 16.88:aan verrattuna, kuten näytetään kuviossa 1.

Konjugaattien entsymaattinen aktiivisuus mitattiin 10 uudella määrityksellä, joka käytti esilääkkeen kaltaista liukoista substraattia. Määrityksen substraatti oli N-ase-tyyliglukosamiini-pentameeri (GlcNAc)5 (1 mM) 0,005 M sit-raattipuskurissa, pH 4,5. Pilkottu (GlcNAc)5 erotettiin substraatista 4 tunnin jälkeen 37 eC lämpötilassa ohutker-15 roskromatografiällä piin päällä käyttäen 2-propanoli/ve si /ammoniumhydroksidi (62/37/1) liuotinjärjestelmää. (G1cNAc)5 ja pilkottu substraatti visualisoitiin sulauttamalla päälle 10 % rikkihappoa etanolissa. Kvantitaatio tehtiin densitometrisella skannauksella. Menetelmä mittaa 20 lysotsyymin aktiivisuutta konsentraatioalueella 6,25 - 50 yg/ml. Standardikäyrä (kuvio 4) osoitti, että määritys on herkin lysotsyymin konsentraatioalueella 6,25 - 10 μg/ ml. Taulukko 2 osoittaa, että 16.88-lysotsyymillä on noin 90 % vastaavan 2-IT-derivatisoidun lysotsyymimäärän ak-25 tiivisuudesta.

16.88-lysotsyymin stabiilisuutta on seurattu 4 °C ja huoneenlämpöisissä (25 eC) varasto-olosuhteissa. Tulokset (taulukko 3) osoittavat, että lysotsyymin aktiivisuus ei laske merkittävästi yhden kuukauden aikana 4 °C tai 25 30 °C lämpötilassa. Yhden kuukauden varastoinnin jälkeen ha vaittiin 16.88 -vasta-aineen aktiivisuuden vähentyvän 54 % huoneenlämmössä ja vasta-aineen aktiivisuuden vähentyvän 33 % 4 °C lämpötilassa.

22 97692

Taulukko 2

Vasta-aineen liittämisen vaikutus lysotsyymin aktiivisuuteen 5

Lysotsyymi- Molaarlset suhteet Jäljelläoleva johdannainen (Lysotsyymi:16.88) lysotsyymi- aktilvisuus (%) 10

Lysotsyymi-IT 100

Lysotsyymi-16.88 4:1 92 3:1 90 15

Taulukko 3 20

Lysotsyymi-16.88 -immunokonjugaattien stabiilisuus Päivämäärä Tarvittava vasta-aineen Jäljellä oleva määrä (pg) sitoutumisen lysotsyymi- 25 50 %:een inhiboitumiseen aktiivisuus (%)

25 eC 4 °C 25 eC 4 °C

30 10/13/89 6 pg (100 %) 7 pg (100 %) 100 % 100 % 11/13/89 13 pg (46 %) 10,5 pg (67 %) 90 % 106 %

•I : M li tilli , I

97692 23

Syöpäkasvaimen paikallistaminen in vivo ja 16.88 -lysotsyymin farmakologinen kinetiikka ihmisen paksusuolensyövän syöpäsiirremallissa "nude"-hiirissä 16.88-lysotsyymi tai 16.88, joka oli leimattu 5 1-125:llä spesifiseen aktiivisuuteen 1 mCi/mg, injektoi tiin suonensisäisesti (50 mCi, 50 pg) 15 Balb/c kateen-korvattomien "nude" hiiren ryhmiin, joilla oli 0,2 gramman ihonalaisia ihmisen paksusuolensyövän siirteitä. Paksusuolensyöpä (THO) ilmentää antigeeniä, jonka ihmisen monok-10 lonaalinen vasta-aine 16.88 tunnistaa. Tarkoitus oli verrata vasta-aine-lysotsyymi -konjugaattia (1:4) ja konju-goitumatonta 16.88-vasta-ainetta arvioitaessa lysotsyymin vaikutusta normaaliin syövän etenemiseen ja vasta-aineen säilymiseen seerumissa (veressä). Seerumissa säilyminen 15 (kuvio 5) oli arviolta sama 16.88-lysotsyymille ja 16.88:lie ajanjaksona neljä tuntia - kaksi päivää injektion jälkeen, ja 16.88:n puoliintumisajaksi seerumissa osoittautui 12,4 tuntia ja 16,88-lysotsyymin puoliintumis-ajaksi seerumissa 11,8 tuntia. Injektioajankohdasta yhteen 20 tuntiin injektion jälkeen, 16.88-lysotsyymi vaikutti poistuvan nopeammin seerumista. 16.88-lysotsyymin tai 16.88:n määrät syöpäsiirteessä olivat suurimmillaan yhden tunnin kuluttua injektion jälkeen; 4 % 16.88-lysotsyymille, 3,5 % 16.88:lie. Sekä 16.88-lysotsyymillä että 16.88:11a poistu-25 misnopeudet syöpäkasvaimesta olivat samanlaiset yhden tunnin - kahden päivän jälkeen antamisesta (kuvio 6).

Esimerkki 2

Doksorubisiinijohdannaisen valmistus Lääkejohdannainen koostuu seuraavista osista: 30 a) doksorubisiinista; b) kitiini-oligomeeriväliryhmästä, joka on konju-goitu pelkistävän päänsä välityksellä doksorubisiiniin, lääkkeen C13-karbonyyliryhmään; ja c) kahdesta tauriinitähteestä, jotka ovat liit-35 tyneet kahteen aldehydiryhmään, jotka on tehty kitiini- 97692 24 oligomeeriväliryhmän ei-pelkistävään päähän periodaatti-hapetuksella.

Doksorubisiinin derivatisointi pyridyylidisulfidi- tähteellä 5 Jotta saataisiin liitettyä doksorubisiini kitiini- oligomeeriväliryhmän pelkistävään päähän, molekyyliä muokataan sen C13-karbonyyliryhmässä hydratsidijohdannaisella julkaistujen menetelmien mukaisesti (Hurwitz et ai, 1980; Hurwitz et ai, 1983). Tässä esimerkissä käytetty hydratsi-10 dijohdannainen on heterobifunktionaalinen reagenssi, joka sisältää yhden hydratsidiosan ja yhden pyridyylidisulfidi-osan (kuva 7). Hydratsidijohdannaisen [3-(2-pyridyylidi-tio)propionihappohydratsidin (PDPH)] synteesi suoritetaan kolmivaiheisena menetelmänä: 3-merkaptopropionihapon pyri-15 dyylidisulfidijohdannaisen valmistus, karboksyyliryhmän kondensaatio t-butyyli-karbatsaatilla, jota seuraa suojauksen poisto HCl:llä kyllästetyllä etyyliasetaatilla.

Doksorubisiini*HC1 -liuos (58 mg, 0,1 millimoolia) 0,85 ml:ssa H20:ta käsiteltiin liuoksella, joka koostui 20 PDPH:sta (380 mg, 1 millimooli) ja NaOAc:sta (84 mg, 1,02 millimoolia) 0,6 ml:ssa vettä. Tähän kirkkaanpunaiseen liuokseen lisättiin 4,8 ml 0,1 M Na2C03:a ja sekoitettiin huoneenlämpötilassa (RT) yli yön. Reaktioseos uutettiin CHCl3/MeOH: 11a (3/1), yhdistetty uute haihdutettiin ja puh-25 distettiin preparatiivisella TLC:llä (ohutkerroskromato- grafiällä) (Tapered Preparative Uniplate-T, CHCl3/MeOH/ NH4OH=90/10/1), jolloin saatiin yhdiste 1. FAB-MS; m/z = 755(M+1).

Tioesteri-derivatisoitujen kitiini-oligosakkari-30 dien valmistus (Kuvio 8)

Kitiini hydrolysoitiin Rupleyn (1964) kehittämällä menetelmällä ja puhdistettiin P2-geelisuodatuspylvään läpi. Täten saadut kitiini-oligosakkaridit derivatisoitiin 35 kuten näytetään kuvassa 8. Penta-N-asetyylikitopentaoosi - 97692 25 (2e) palvelee esimerkkinä. Penta-N-asetyylikitopentaoosin (2e) seos (0,44 g, 0,42 millimoolia) 10 ml:ssa vettä, 8 mlrssa etanolia ja 1 ml:ssa fenyylihydratsinia kuumennettiin 125 °C lämpötilaan kahdeksi päiväksi. Reaktioseos 5 jäähdytettiin huoneenlämpötilaan, lisättiin 20 ml vettä ja tehtiin eetteriuutto (25 ml x 3). Vesipitoinen kerros lyo-filisoitiin ja tuote puhdistettiin edelleen käänteisfaasi-pylvään läpi (C18) (40 % Me0H/H20). Yhdiste 3e (0,33 g, 0,29 millimoolia) liuotettiin veteen (20 ml), lisättiin 10 1/4 teelusikallinen Raney Nickel W-2:ta ja hydrattiin

Parr-laitteessa yli yön. Reaktioseos suodatettiin Celite-kerroksen läpi, konsentroitiin ja ladattiin Dowex 50-WK2 (H*) -ioninvaihtopylvääseen. Pylväs eluoitiin ensin 80 ml:11a vettä, jota seurasi 50 ml 2N-NH40H:ta. Eluaatti 15 lyofilisoitiin, jolloin saatiin 0,15 g yhdistettä 4e. Yhdiste 4e (0,15 g, 0,15 millimoolia) liuotettiin veteen (5 ml), sekoitettiin 0,067 g (0,29 millimoolia) SATA-mää-rän kanssa 0,8 ml:ssa DMF:ää ja sekoitettiin huoneenlämpö-tilassa yli yön. Reaktioseos laimennettiin vedellä (20 20 ml), uutettiin kloroformilla (20 ml x 3) ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin yhdiste 5e, joka hydrolysoitiin 10 miellä 0,1 M NaOH:ia huoneenlämmössä kahden tunnin ajan ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin kellertävä jauhe 6e.

Tioesteri-derivatisoitujen kitiini-oligomeerien 25 kiinnitys pyridyylidisulfididerivatisoituun dokso- rubisiiniin (kuva 9) PDPH-derivatisoitu doksorubisiini 1 (0,01 g, 0,013 millimoolia) liuotettiin etanoliin (12 ml), lisättiin 30 katalyyttinen määrä H0Ac:tä, jonka jälkeen 0,25 g (0,023 millimoolia) yhdistettä 6e, ja sekoitettiin yli yön huoneenlämmössä. Liuotin haihdutettiin ja jäännös liuotettiin veteen (10 ml), uutettiin (CHCl3/MeOH=7/3) ja yhdistetyt uutteet haihdutettiin, jolloin saatiin tummanruskeaa jau-35 hetta 7 [TLC ei osoittanut havaittavaa määrää tioesteri- 97692 26 derivatisoitua kitiiniollgomeeriä (6e). Piigeeli, 2-propa-noli/vesi/NH4OH=72/27/l] .

Tauriinitähteiden kiinnitys tioesteri-derivatisoi-tuihin kitiinioligomeereihin 5 (Kuvio 10)

Tioesteri-derivatisoidun kitiinioligomeerin hapetus NaI04:llä muodosti dialdehydejä ei-pelkistävässä päässä, jotka saatettiin reagoimaan tauriinin kanssa, jolloin muodostui Schiffin emäs (8). Yhdiste 8 pelkistettiin stabii-10 limmaksi amiiniksi NaBH4:llä, jolloin saatiin yhdiste 9. Yhdisteen 9 hydrolyysi 0,1 M NaOHrlla muodosti derivati-soidun kitiinoligomeeriväliryhmän, joka sisälsi vapaan sulfhydryylin pelkistävässä päässä (10).

Doksorubiinijohdannaisen valmistus, joka sisältää 15 tauriinitähteitä pilkottavissa olevan kitiinioligo- meeriväliryhmän välityksellä

Disulfidisidoksen (7) välityksellä kitiinioligomeerin sisältävä doksorubisiinijohdannainen saatettiin miedon Nal04-käsittelyn alaiseksi pH:ssa 6,0 60 minuutin ajan huo-20 neenlämpötilassa. Kun ylimääräinen NaI04 oli sammutettu etyleeniglykolilla, reaktioseokseen lisättiin 10-kertainen molaarinen ylimäärä tauriinia (doksorubisiinijohdannaisen suhteen). Kun oli inkuboitu yksi lisätunti huoneenlämpö-tilassa, johdannaista käytettiin sytotoksisuusmäärityksiin 25 sen jälkeen kun pH oli säädetty 7,2:een. Yhdisteen 7 muuttuminen tauriinijohdannaiseksi vahvistettiin TLC-analyy-sillä piin päällä (2-propanoli/vesi/NH4OH=72/27/l).

Vaihtoehtoinen synteesimenetelmä sallii stabiilimman lääkejohdannaisen valmistuksen, jossa käytetään kuvas-30 sa 10 esitettyä kitiiniväliryhmää. Pyridyylidisulfidi-de-rivatisoitu doksorubisiini (1^) saatetaan reagoimaan tau-riini-derivatisoidun kitiinioligomeerin kanssa, joka sisältää vapaan sulfhydryyliryhmän pelkistävässä päässä (10), jolloin muodostuu doksorubisiinijohdannainen (11), 35 joka näytetään kuvassa 11.

97692 27

Sul f onihappo tähteiden lukumäärä per doksorubisiini-j ohdannainen

Tarvittaessa sulfonihappotähteiden lukumäärää per lääkejohdannainen voidaan helposti muuttaa. Esimerkiksi 5 neljä sulfonihappotähdettä kahden asemesta voidaan liittää lääkejohdannaista kohti käyttäen hydratsidijohdannaisia, joista kukin kantaa kahta sulfonihappotähdettä. Lisäksi negatiivisesti varautuneiden ryhmien sisällyttäminen ei rajoitu sulfonihappotähteisiin. Esimerkiksi voidaan myös 10 käyttää fosfaatteja tai fosfonihappotähteitä (esim. 3-ami-nopropyylifosfonihappoa).

Kitiinioligomeeriväliryhmän pituus esilääkkeessä Lysotsyymin aikaansaama suhteellinen kitiinioligo-meerien pilkkoutumisnopeus on suhteessa ketjun pituuteen. 15 Esimerkiksi kitoheksaoosi pilkkoutuu 30 000 kertaa nopeammin kuin kitotrioosi (Imoto et ai, 1972). Näin ollen pen-tameereja suurempien kitiinioligomeeriväliryhmien voidaan odottaa muodostavan lääkkeitä, jotka lysotsyymi aktivoi helpommin.

20 Eripituisia kitiinioligosakkarideja sisältävien doksorubisiinijohdannaisten sytotoksinen aktiivisuus

In vitro -sytotoksisuus mitattiin käyttäen 3H-tymi-diinin sisäänoton inhibitiota A2780-munasarjasyöpäsoluil-25 la. Lyhyesti, 0,1 ml solususpensiota, joka sisälsi 2 x 104 solua Eaglen modifioidussa MEM-ravintoliemessä, lisättiin 96-kaivoisen mikroviljelylevyn kaivoihin. Lisättiin neljä kertaa 0,1 ml:n tilavuuksia doksorubisiinia tai doksorubi-siinijohdannaista 0,6 - 10 pg/ml konsentraatioina ja se-30 koituksia inkuboitiin 4 tuntia 37 eC lämpötilassa kosteutetussa C02-lämpökaapissa. 0,1 ml 3H-tymidiiniä (10 pCi/ml) lisättiin kuhunkin kaivoon ja inkuboitiin 16 tuntia. Sen jälkeen solut pestiin, kerättiin 0,5 N natriumhydroksidil-la ja mitattiin laskurilla 3H-tymidiinin sisäänotto. Kuvio 35 12 näyttää tulokset tyypillisessä doksorubisiinia käyttä- 26 97692 vässä määrityksessä. Taulukko 4 vertailee sellaisen dok-sorubisiinin aktiivisuutta, joka on muokattu väliryhmällä (PDPH) jota käytetään liittämään (GlcNAc)„, ja doksorubi-siinia joka on liitetty (GlcNAc^raan tai (GlcNAc)5:aan.

5 Doksorubisiinin muokkauksen määrästä riippumatta lääkkeen aktiivisuus ei havaittavasti heikentynyt. Tämä tulos osoittaa, että lysotsyymin toiminnan aikaansaama lääke on yhtä sytotoksinen kuin alkuperäinen doksorubisiini.

10 Taulukko 4

Doksorubisiinijohdannaisen sytotoksisuus

Johdannainen Sytotoksisuus (%)* 15 ------------------------------------------------

Dox-PDPH 67,1

Dox-(GlcNAc)x 99,6

Dox-(G1cNAc)5 100,0 20 * sytotoksisuus (%) doksorubisiiniin verrattuna. Lääkkeen konsentraatio vastaa 0,625 pg/ml.

Tauriinijohdannaisia pilkottavissa olevan kitiini-oligomeeriväliryhmän välityksellä sisältävän dokso-25 rubisiinijohdannaisen sytotoksinen aktiivisuus

Kuvio 13 näyttää tauriinitähteitä sisältävän dokso-rubisiinijohdannaisen sytotoksisen aktiivisuuden verrattuna doksorubisiinijohdannaiseen, joka sisältää kitopen-taoosiväliryhmän ilman kiinnittyneitä tauriinitähteitä. 30 Sytotoksisuus suoritettiin aikaisemmin kuvatulla tavalla. Tauriinia sisältävä lääke oli noin 20-kertaisesti vähemmän sytotoksinen. Kiinnittyneitä tauriinitähteitä sisältävän kitiinioligomeeriväliryhmän altistuminen lysotsyymille johti väliryhmän pilkkoutumiseen, mikä vahvistettiin 35 TLCrllä (2-propanoli/vesi/NH4OH=67/32/l). Nämä tiedot vah- 97692 29 vistavat, että tauriinia sisältävä esilääke voidaan muuttaa eripituisia kitiinioligomeereja sisältäviksi aktiivisiksi lääkelajeiksi, jotka ovat yhtä aktiivisia kuin läh-tölääke (taulukko 4).

5

Viitteet

Bagshawe, K.D. Antibody Directed Enzymes Revive Anti-Cancer Prodrugs Concept. Br. Med. J. 56, 531-537 (1987).

10

Briggs, R.S., Perillie, P.E. ja Finch, S.C. Lysozyme in Bone Marrow and Peripheral Blood Cells. J. Histochem. Cytochem. 14, 167-170 (1966).

15 Ellman, G.L. Tissue Sulfhydryl Groups. Arch. Biochem. Biophys. 87, 70-79 (1959).

Flanagan, P. ja Lionetti, F. Lysozyme Distribution in Blood. J. Hematology 10, 497-501, 1955.

20

Flickinger, R.A. ja Trost, S.R. Cytotoxicity of Antibody Phospholipase C Conjugate on Cultured Friend Leukemia Cells. Eur. J. Cancer 12, 159-160 (1976).

25 Gallego, J., Price, M.R. ja Baldwin, R.W. Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 79IT/36 Conjugates with Anti-Tumor Activity. Int. J. Cancer 33, 737-744 (1984). 1

Hamm, C.W., Kupper, W., Bredehorst, R., Hilz, H., Bleifeld, W. Quantitation of Coronary Venous Adenosine in Patients: Limitations Evaluated by Radioimmunoassay.

Cardiovascular Res. 22, 236-243 (1988).

97692 30

Haspel, M.V., McCabe, R.P., Pomato, N., Janesch, N.J.,

Knowlton, J.V., Peters, L.C., Hoover, H.C., Jr. ja Hanna, M.G., Jr. Generation of Tumor Cell-Reactive Humor 5 Monoclonal Antibodies Using Peripheral Blood Lymphocytes from Actively Immunized Colorectal Carcinoma Patients. Cancer Res. 45:3931-3961, 1985.

Holler, E., Rupley, J.A. ja Hess, G.P. Productive and 10 Unproductive Lysozyme-Chitosaccharide Complexes.

Equilibrium Measurements. Biochemistry 14, 1088- (1975a).

Holler, E., Rupley, J.A. ja Hess, G.P. Productive and

Unproductive Lysozyme-Chitosaccharide Complexes. Kinetic 15 Investigations. Biochemistry 14, 2377- (1975b).

Hurwitz, E., Wilchek, M. ja Phita, J. Soluble Macro molecules as Carriers for Daunomycin. J. Appi. Biochem. 2, 25-35 (1980).

20

Hurwitz, E., Arnon, R., Sahar, E. ja Danon, Y. A Conjugate of Adriamycin and Monoclonal Antibodies to Thy-1 Antigen Inhibits Human Neuroblastoma Cells In Vitro. Ann. N. Y. Acad. Sci 417, 125-136 (1983).

25

Imoto, T., Johnson, L.N., North, A.C.T., Phillips, D.C. ja Rupley, J.A. Vertebrate Lysozymes. Teoksessa: The Enzymes (toim. P.D. Boyer) Vol. 7, 665-868 (1972). 1

McCallister, T.J., Halpern, S.E., Dillman, R.O. ja Shawler, D.L. Human Anti-Mouse Antibody (HAMA) Formation in Cancer Patients Following Single Injections of Murine Monoclonal Antibodies. FASEB J. 2:690 (1988).

97692 31

Mitra, S. ja Lawton, R.G. Reagents For the Cross-Linking of Proteins by Equilibrium Transfer Alkylation. J. Amer. Chem. Soc. 101, 3097-3110 (1979).

5 Napper, A.D., Benkovic, S.J., Tramontano, A. ja Lerner, R. A. A Stereospecific Cyclization Catalyzed by an Antibody. Science 237, 1041-1043 (1987).

Osserman, E.F. ja Lawlor, D.P. Serum and Urinary Lysozyme 10 (Muramidase) in Monocytic and Monomyelocytic Leukemia. J. Exp. Med. 124, 921-951 (1966).

Phillips, H.J. Teoksessa: Tissue Culture: Methods and

Applications (toim. P.F. Kruse, Jr. ja M.K. Patterson, 15 Jr.) s. 406 (1973).

Prakash, C. ja Vi jay, I.K. A New Fluorescent Tag for Labeling of Saccharides. Analyt. Biochem. 128, 41-46 (1983).

20

Raftery, M.A., Rand-Meir, T., Dahlquist, F.W., Parsons, S. M., Borders, Jr., C.L., Wolcott, R.G., Beranek, Jr., W., ja Jao, L. Separation of Glucosaminoglycan Saccharide and Glycoside Mixtures by Gel Filtration. Analyt. Biochem. 30, 25 427-435. (1969).

Reynolds, J.C., Carrasquillo, J.A., Keenan, A.M., Lora, M.E., Sugarbaken, P., Abrams, P., Foon, K., Mulshine, J.L., Roth, J., Colcher, D., Schlom, J. ja Larson, S.M.

30 Human Anti-murine Antibodies Following Immunoscintigraphy on Therapy With Radiolabeled Monoclonal Antibodies. J. Nucl. Med., 27, 1022 (1986).

32 97692

Rodwell, J.D. ja McKearn, T.J. Antibody Conjugates for the Delivery of Compounds to Target Sites. US-patentti 4 671 958, 9. kesäkuuta 1987.

5 Rupley, J.A. The Hydrolysis of Chitin. Biochem. Biophys. Acta 83, 245-255 (1964).

Schroff, R.W., Foon, K.A., Bratty, S.M., Oldham. R.K. ja Morgan, Jr. A.C., Human Anti-Murine Immunoglobulin 10 Responses in Patients Receiving Monoclonal Antibody Therapy. Cancer Res. 45, 879-885 (1985).

Searle, F., Bier, C., Buckley, R.G. ja 8 muuta. The Potential of Carboxypeptidase G2-Antibody Conjugates as 15 Anti-Tumour Agents. Br. J. Cancer 53, 377 (1986).

Sela, M. ja Hurwitz, E. Conjugates of Antibodies with Cytotoxic Drugs. Teoksessa: Immunoconjugates. Antibody

Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer (toim. 20 C.-W. Vogel), 189-216 (1987).

Senter, P.D., Saulnier, M.G., Schreiber, G.J., Hirschberg, D.L., Brown, J.P., Hellstroem, I. ja Hellstroem, K.E. Anti-Tumor Effects of Antibody Alkaline Phosphatase 25 Conjugates in Combination with Etoposide Phosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4842-4846 (1988).

Shugar, D. Measurement of Lysozyme Activity and the Ultraviolet Inactivation of Lysozyme. Biochem. Biophys. 30 Acta, 8, 302-309, 1949.

Steis, R., Carrasquillo, J.A. ja 16 muuta. An Evaluation of the Toxicity, Immunogenecity, and Tumor Radioimmuno-detecting Ability of Two Human Monoclonal Antibodies in ii < - w;t aim i;t i n : : 97692 33

Patients with Metastatic Colorectal Carcinoma. J. Clin. Oncology, 1990 (painossa).

Thorpe, P.E., Wallace, P.M., Knowles, P.P., Relf, M.G., 5 Brown, A.N.F., Watson, G.J., Knyba, R.E., Wawrzyczak, E.J. ja Blakey, D.C. New Coupling Agents for the Synthesis of Immunotoxins Containing a Hindered Disulfide Bond with Improved Stability In Vivo. Cancer Res. 47, 5924-5931 (1987).

10

Vogel, C.-W (toim.) Immunoconjugates. Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer. Oxford University Press, New York, 1987.

15 Wawrzynczak, E.J. ja Thorpe, P.E. Methods for Preparing Immunotoxins: Effect of the Linkage on Activity and

Stability. Teoksessa: Immunoconjugates. Antibody

Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer, (toim. C.-W. Vogel), 28-55 (1987).

20

Young, R.C. ja Ozols, R.F. The Anthracycline Antineoplastic Drugs. N. Engl. J. Med. 305, 139-153 (1981). 1 2 3 4 5 6

Zara, J.J., Wood, R.C., McCabe, R.P., Pomato, N., Hanna 2

Jr., M.G., Bredehorst, R. ja Vogel, C-W., Synthesis of a 3

Novel Site-Specific Heterobifunctional Crosslinker: Use 4 for the Preparation of Antibody Conjugates with Cobra 5

Venom Factor. Fourth International Conference on 6

Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer, San

Diego, CA. 30. maaliskuuta - 1. huhtikuuta 1989.

Claims (10)

34 97692 Patentt ivaat imukset

1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen akti-vaattori-kohdistusosa -konjugaatin valmistamiseksi, joka 5 sisältää lysotsyymin aktivaattorina ja ihmisen monoklonaa-lisen vasta-aineen tai sen fragmentin kohdistusosana, tunnettu siitä, että kytketään kovalenttisella sidoksella mainittu aktivaattori mainittuun kohdistusosaan tavalla, joka säilyttää konjugaatin kyvyn sitoutua anti- 10 geeniin ja aktivoida esilääke, joka sisältää pilkottavissa olevan molekyylin.

2. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen esi-lääkkeen valmistamiseksi, joka sisältää syöpää tuhoavan aineen, joka sisältää pilkottavissa olevan molekyylin, 15 joka estää solun sisään joutumisen, tunnettu siitä, että mainittu pilkottavissa oleva molekyyli konjugoi-daan syöpää tuohoavaan aineeseen.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syöpää tuhoava aine on deri- 20 vatisoitu kitiinioligomeeriväliryhmällä.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että syöpää tuhoava aine on antra-sykliini.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, 25 tunnettu siitä, että kitiinioligomeeriväliryhmä on kiinnittynyt aminoryhmän välityksellä kohtaan, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu antrasykliinin C13-karbonyy-likohdasta ja antrasykliinin sokeriosasta.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että kitiinioligomeerijohdannainen sisältää (GlcNAc)n:n, jossa n on 1 - 10, joka sisältää negatiivisesti varautuneita ryhmiä ja reaktiivisen ryhmän, joka sallii kovalenttisen kiinnittymisen antrasykliiniin.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 35 tunnettu siitä, että negatiivisesti varautuneet ryhmät ovat sulfonaatteja, fosfaatteja, karboksylaatteja tai fosfonaatteja. i· «UI MC lii li* i 97692 35

8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että negatiivisesti varautuneiden ryhmien lukumäärä on 1 - 10.

9. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että kitiinioligomeeriväliryhmä on sitoutunut kovalenttisesti lääkkeeseen aktiivisen ryhmän välityksellä, joka valitaan disulfidi-, tioesteri-, imi-di-, halogeeni-, amiini-, karboksyyli-, esteri-, tioli-ja alkoholiryhmistä.

10. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että reaktiivinen ryhmä valitaan disulfidi-, tioesteri-, imidi-, halogeeni-, amiini-, karboksyyli-, esteri-, tioli- ja alkoholiryhmistä. 36 97692