JPH04503068A - 治療薬の部位特異的インビボ活性化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療薬の部位特異的インビボ活性化 本出願は、１９８９年１月２３日提出の、アメリカ合衆国出願番号０７／３００ ．９９９の部分継続出願である。

発明の説明 本発明は、治療薬の部位特異的活性化に基づく治療システムに関わり、その中に は、治療薬の化学、治療薬の疾患部位への搬送、特異的非標的器官毒性のコント ロール及び治療薬使用に関わる一般的副作用のコントロールを含む。

発明の背景 一般に、薬は、その標的器官ないし細胞にたいして選択的ではなく、結果として 、有毒な副作用を及ぼす。したがって、治療薬を、限定された標的細胞集団にた いする特異性を育するあるキャリアー分子（例えば、抗体）と結合させるという 考えは、部位特異的薬剤搬送を実行するためには、魅力的なものである。

例えば、近年、腫瘍関連性細胞表面抗原を認識する、各種モノクローナル抗体が 、臨床的に使用されている多数の抗癌剤のキャリアーとして用いられている。こ れについては、Ｖｏｇ！ｌ、　Ｃ，−Ｗ、１９８７が総覧している通りである。

このような免疫複合体の特異的で有力な細胞毒性活性については、各種インビト ロ系において、研究者が既に記載している。そのような免疫複合体について、そ の免疫性治療活性を、癌患者ばかりでなく、腫瘍を有する動物で調べたところ、 その結果はあまりはかばかしくないどころか、期待はずれのものでもあった。こ のようなデータから明らかにされたことは、免疫複合体という考えは、なお克服 すべきいくつかの困難を抱えているということである。なぜなら、モノクローナ ル抗体と結合した薬剤の十分量を搬送することができないからである（線輪につ いては、Ｖｏｌｔｌ、、Ｃ，４゜１９８７参照）。

初期には、薬剤よりも酵素の方が優れているかもしれないと言われていた。リポ ソーム不活性化蛋白（ＲＩ　Ｐ）は酵素であり、その＊梅毒性作用は、この酵素 活性による。しかしながら、薬剤同様ＲＩＰも、その活性を発揮するためには内 部に取り込まれ、抗体キャリアーから遊離し、適切な細胞内区画に達しなくては ならない。さらに、ＲＩＰは、効果を発揮するためには、各標的細胞による抗原 発現を必要とし、また、固有の毒性を有するから、与える量に限界がある。

もう一つの酵素法は、抗体に結合した、表面活性酵素を用いる。この抗体−酵素 複合体は、内部取り込みを必要とせず、領域内の細胞に細胞毒性を発揮すること ができる。抗体複合体として用いられる、表面活性酵素の一例は、ホスホリパー ゼＣであって、これは、内部取り込みを必要とせず、直接、あらゆる細胞膜のリ ン脂質を攻撃する。しかしながら、ホスホリパーゼが、あらゆる細胞のリン脂質 を攻撃できるということは、固有の毒性を発揮していることであり、このことが 、その有効性に制限を与える（Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ及び丁＋ｏ＋１．　１９） ６）。抗体複合体として用いられるもう一つの表面活性化酵素は、コブラ毒因子 （ＣＶＦ）すなわち補体活性化酵素であって、これは、細胞によって内部に取り 込まれることを必要としない上に、本質的に毒性を持たない（Ｖｏｇｅｌ、　Ｃ ，−Ｌ、１９ｇ？）　、しかしながら、すべての外来蛋白同様、ＣＶＦもきわめ て免疫原性が高く、腫瘍細胞治療に利用するには、その使用が制限される。

もう一つの方法は、エトポシド誘導体の脱燐酸化に、抗体アルカリ性ホスファタ ーゼ複合体を使用するものであった。この方法に関する問題は、標的での酵素活 性を制限する循環する内在性基質との競合並びに、好ましくない細胞毒性活性を 増加させる循環中および非標的組織での高レベルの酵素活性である（Ｓｅ＋＋＋ ！＋　ｅｔ　ｔｌ、　１９８８）。

また別の酵素法では、カルボキシペプチダーゼＧ２が用いられた。これは、必須 成長因子である葉酸を開裂する（Ｓ■ｒｌｔＮ　！ｌ、１９１１６）。しかしな がら、葉酸レベルが十分な減少を示すには、標的組織に、インビボで抗体酵素複 合体を用いて達成できるレベルよりも高いレベルの酵素複合体がなければならな い。

前述したような特定の欠点に加えて、酵素法はすべて、免疫原性という共通の問 題を抱えている。酵素にたいする抗体が生じると、ブロックや立体化学的障害に よる活性成分の非活性化、また、循環からの抗体−酵素の急速な排除が起こる。

このため、薬剤活性化に酵素−抗体複合体を用いる、ＢＢ＋ｌ＋＊ｗ＊、　［１ （１９Ｎ）の示したようなシステムは、せいぜいのところ、単発投与においての み好結果を与えるに過ぎず、その場合でも、免疫反応は、薬効を妨げる。

１１Ｂ＋ｂｘｖｃの方法では、ヒトと類似しない非は乳類酵素を用いており、こ れは、複合体のもの以外の酵素による活性化を避けるためであった。しかしなが ら、この酵素はきわめて免疫原性が高く、特に、複合体となう、た場合はそうで あった。

発明の概要 標的決定された酵素を用いた薬剤搬送について、上記の制限を回避し得る新規の 方法を考えだした。２段階操作が提案される。先ず、本質的に免疫原性を持たな い、標的決定成分アクチベータ複合体があって、これは、標的決定成分と結合す るアクチベータ、過常酵素であるが、を含む。好ましい実施態様においては、標 的決定成分は、腫瘍部の細胞表面または細胞外領域（例えば、壊死部）に存在す る、腫瘍関連性抗原と結合する抗体である。抗体−７クチベ一タ複合体は、腫瘍 に特異的に保持される。必要なら、非結合複合体を、循環系から十分排除し、毒 性副作用を避ける。必要なら、この過程を、生体内において複合体形成によって 促進してもよいし、または、生体外において特定のマトリックスに吸着させるこ とによって促進してもよい。第二には、細胞に取り込まれない比較的低毒の薬剤 誘導体（前駆薬（プロドラッグ））を投与する。腫瘍部位において、その薬剤誘 導体は、抗体結合酵素によって「活性化」され、前駆薬が薬剤分子に変換される 。これは、腫瘍部において、抗原陰性腫瘍細胞及び抗原陽性腫瘍ＩＭｍに侵入し て、その活性を発揮することができる。さらに、本方法では、非免疫原性前駆薬 を繰り返し投与することができるから、この治療法の効能を大きく増幅すること も可能である。さらに、この方法は、抗腫瘍治療に限定されるものではな（、あ る治療剤の部位特異性搬送が必要とされる、どのようなシステムにも適用可能で ある。この部位特異的活性化法を適用できる疾患例としては、他に、感染症、自 己免疫性疾患、その他の炎症性疾患がある。したがって、活性化標的部位は、感 染生物体を含む、特定の組織であってもよいし、特定の細胞種であってもよい。

本発明の利点は、この複合体は、標的細胞の内部に取り込まれる必要はない、と いうことである。したがって、患者の体内において、繰り返し、長期にわたって 前駆薬の変換を維持することも、抗体−アクチベータ複合体の反復注射を含めて 、可能である。

ある程度の要求事項は、本発明においても、満たされなければならない。先ず、 標的決定成分（例えば、抗体）と、その標的決定成分と結合するアクチベータ（ 例えば、酵素）は、治療の対象となる生物種にたいし適合性の起源のものでなけ ればならない。これは、複合体の免疫性非活性化を防ぐためである。

ヒトを治療する場合には、この複合体は、ヒト由来のもの、または、°遺伝的に 保存されているか、もしくは、遺伝的に類似の生物種のものから得ることによる ヒト様のものでなければならない。これによって、はとんど非免疫原性となり、 これらの分子にたいする抗体の発生を防ぐことができる。また、前駆薬も、本質 的に非免疫原性でなければならない。免疫複合体の異種蛋白質（例えば、マウス 抗体）にたいし抗体が発生することは、確かめられている。マウス・モノクロー ナル抗体の単発注入後、癌患者において、ヒト抗マウス抗体が形成されることが 、既に報告されている（ＭｃＣＩＩ１口１ｇｒ　Ｎ　＊１．　１９８ｇ　）　ｏ これによって、この薬剤の適用性が、あるーコースの治療に限定される。個人個 人の多くが、マウス抗体の第１回投与前に、マウス免疫グロブリンにたいする、 先夜抗体レベルを有している（Ｓｃｈｒｏ’ｌＬ　ＲｏＷ　ｓｌ　ｒｌ、１９８ ５）。さらに、２回以上の注入後には、免疫原性の弱い抗体Ｆｓｂフラグメント にたいしても、抗体反応が、患者の５０％に検出された（ＲＢｏｏｌｄＩ、１． Ｃ，ｔＩ＊Ｉ、１０６）　ｏしたがって、本質的に免疫原性を有さない、と言う とき、われわれは次の意味で使っている。すなわち、アクチベーター標的決定成 分複合体と前駆薬を、複合体の局在化、前駆薬の活性化または活性薬の活性を、 治療の効能を妨げる程度にまで抑制するような免゛疫反応を患者に誘発すること な（患者に繰り返し投与できるという意味である。

第２の要求事項は、抗体結合酵素は、循環系または非標的細胞表面に、天然の基 質を本質的に持ってはならない、ということである。宿主に天然の基質が存在す ることは不利である。なぜなら、それは、前駆薬の活性化と競合し、前駆薬の活 性化量を少なくするという結果を招くからである。天然基質が無いことは、また 、抗体−アクチベータ複合体の局在化前に、宿主における酵素活性によつて生ず る有害副作用を避けるためにも重要である。したがって、ホスホリパーゼＣやホ スファターゼのような酵素は、われわれの発明には適当ではない。なぜなら、上 記酵素は、ヒトの中に天然の基質を持っているからである。

「本質的に天然には見られない基質」とは、基質が、複合体の投与によってアク チベータと接触しても、腫瘍部位における、前駆薬から薬剤への治療的に有効な 転換を妨げるほどの量としては存在しないことと定義する。また、基質は、天然 性基質にたいする酵素活性による有害副作用を引き起こすに足るほどの量として は存在してはならない。

本発明にとってｊ［３の重要な要求事項は、複合体の酵素活性は、循環系もしく は非標的器官の細胞表面には、本質的にあってはならない、または、ごく少量で しかあってはならないということである。これは、腫瘍部位以外での活性化を招 く標的決定されない前Ｉｆ活性化を防ぐためである。例えば、アルカリ性ホスフ ァターゼは、ヒト血清中にかなり高レベルで存在する酵素であるが、これは、ヒ ト血清中において、低分子量の化合物を、数分内に脱燐酸化することが分かうて いる（Ｔｏｗ＠Ｎ＊１．　１９８ｇ）。低度に存在する酵素活性を、循環系から 抗体を排除することによってさらに低下させて、本発明の要求亭項に合致させて もよい。これは、生体内では、免疫複合体の形成によって、生体外では、特定の マトリックスへの吸着によって実行することができる。複合体の酵素活性が本質 的にないということは、前駆薬が、腫瘍部以外の場所では、薬剤の治療効果を阻 害したり、非腫瘍細胞に好ましからざる細胞毒性を引き起こしたり、または、そ の両方をもたらしたりするほどには活性化されないことと定義される。

好ましい実施態様の説明 下に述べる実施態様は、ヒト・モノクローナルｉｇＭ抗体とアクチベータとして ヒト・リゾチーム、作用成分（前駆薬）として、ドキンルビシン誘導体を用いて いる。このシステムは、われわれの発明の利点を例示する。その利点を挙げるな らば下記のとおりである。

（ａ）全成分、すなわち、標的決定成分、アクチベータ、前駆薬が本質的に非免 疫原性であうで、前駆薬の反復投与ばかりでなく、反復標的決定も可能である。

（ｂ）抗体作用体複合体は、非毒性であって、この複合体を大量に投与すること ができる。前駆薬は、活性化後始めて、その細胞毒性を完全に発揮する。

（Ｃ）複合体の内部取り込みは必要でなく、連続投与において、前駆薬から薬剤 への繰り返し転換が可能である。

（ｄ）全ての細胞について、標的組織における抗原発現は必要でない。なぜなら 、薬剤分子は、転換後、抗原陽性細胞にも、抗原陰性細胞にも侵入することがで きるからである。

（ｅ）リゾチームは、ヒトにおいて活性に対する天然基質を有さない。したがっ て、リゾチーム活性にたいする競合、および、それに伴う有害作用を避けること ができる（リゾチームの天然基質は、Ｎ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグ ルコサミン残基の交互の連なりから成る細菌細胞壁由来のポリマーである。）。

÷４−一 （ｆ）リゾチームは、循環中では、リゾチーム含有性白血球由来のものがごく少 量存在するにすぎず、細胞表面には発現されない（Ｂ＋１ｇｇ５　ｅｔ　ｉｆ、 １９６６）。

しかしながら、本発明になる方法は、基本的な要求事項を満たす各種抗体及びア クチベータシステムへの応用が可能であり、その概念は、リゾチームアクチベー タシステムのみに限定されるものではない。実際、本方法の利点の一つは、標的 細胞による抗体の取り込みを必要とするシステムに比べて、抗体の特性に関して 、許容性がはるかに高いことである。さらに、アクチベータは、酵素である必要 はな（、前駆薬を、活性成分に変換するように機能するものであればどのような 化合物でもよく、例えば、触媒性抗体であってもよい（Ｎ！ｐｐｓ＋　ｃ＋　＋ １．　１９８７）。

標的決定成分の選択 本発明によれば、何かの抗原に対する抗体を、標的決定成分として使用してもよ い。抗体の他に、特定の細胞、組織種または標的とされた感染体にたいして親和 性を有する他の分子を、標的決定成分として用いてもよい。例えば、サイトカイ ンは、ある種の細胞にたいし特別な特異性を有し、標的決定成分として用いるこ とができる。抗体以外の他の型の分子も、標的決定成分として用いることができ る。例えば、抗原、抗体フラグメント、レクチン、ホルモンやリガンドである。

しかし、簡単のため、以下の論議では、抗体という用語を、他の型の標的決定成 分でもその代わりに使用することが７きるという意図を含めて用いることにする 。

従来のポリクａ−ナル抗体を、本発明の概念に含めて、キャリアー分子として用 いてもよい。しかしながら、モノクローナル抗体の方が多くの利点を有する。各 モノクローナル抗体は、抗原決定因子にたいして特異的である。したがって、モ ノクローナル抗体の場合は、正常組織にたいする非特異的結合の程度、および、 その後の、正常非標識細胞にたいする毒性の程度が、低（なる。さらに、各モノ クローナル抗体について、生産量は無ｆｉＩＪ限であるから、抗体の個々の調製 品を、抗原特異性が抗体製品の使用期間に渡って定常になるよう調整することが できる。

同一の組織特異性を持ちながら、異なるエピトープにたいして特異的な異なるモ ノクローナル抗体を混合してもよい。単一モノクローナル抗体またはモノクロー ナル抗体の混合物を用いることで、搬送システムの有効性と制御性を、従来のポ リクローナル試薬で得ることのできるそのシステムの有効性にあづかるいかなる 寄与も犠牲にすることなく、改善することができる。

好ましい方法は、治療を受ける動物と同じ生物種起源のモノクローナル抗体また はポリクローナル抗体を使用することである。多くの場合、献医学の適用を除い ては、ヒト抗体、ヒト化（ｈｓｓｕ＋ｉｓ＊ｄ）抗体、その構造が基本的にヒト のものであるキメラ抗体の使用がもっとも好ましい。ヒトモノクローナル抗体に ついてはたくさんのものが記載されている。また、非ヒト生物種のリンパ球細胞 から生成した抗体を、ヒト化する方法や、ヒト抗体不変領域遺伝子に遺伝的に結 合させた非ヒト抗体の可変領域遺伝子を用いる方法についても記載されている。

同種の遺伝工学的に加工した抗体を用いる利点はいくつかある。異種の抗体、例 えば、マウスやラットの抗体と違って、同種抗体にたいする免疫反応はごく小さ い。せいぜい、ヒト抗体のイディオタイプの決定因子にたいする弱い反応が見ら れるのみで、それも、投与を多数回繰り返して始めて現われるだけである。ヒト ・モノクローナル抗体＋６−１１８による本出願人の臨床研究では、最高、週当 り２００ｍｇまで繰り返し投与を行なった後にも、抗体のいかなる領域について も、免疫反応誘発を検出することはできなかった。これは、イディオタイプのも のであろうと、アロタイプのものであろうと、フレームワーク（ｆｒａｍｅｗｏ 「ｋ）　ｆ）ものであろうと、そうであった（Ｓｊｅ目ｅＤ１．　１９９０）。

この利点により、比較的速やかに代謝される抗体フラグメントではなく、そのま まの全免疫グロブリンを使用することができ、高用量のそのままの全免疫グロブ リンを投与することができ、また、抗体投与を多数回繰り返すことができる。同 生物種で生じた抗体は、他にも利点を育する。なぜなら、このような抗体は、異 種抗体や、さらには遺伝工学的に加工されたヒト抗体をもってしても認識されな いような微妙な抗原の差異を認識するからである。

抗体は、どのような標的に向けることもできる。標的には、例えば、腫瘍、組織 、細菌性、真菌性、ウィルス性、寄生虫性、マイコブラスマ性、組織適合性また は分化の抗原または受容体などがある。抗体は、　ＩｊＧ、ＩｊＡ、ＩｊＥ、Ｉ ｊＭなど、いかなるクラスのものでもよい。また、異なる抗原性決定基にたいし て反応性を持つ抗体を併用してもよい。簡単のために、下記では、標的を、標的 組織と称することとする。これは、標的決定成分が親和性を持つ上記物質のどれ であってもよい。

本発明では、細胞毒性剤を、腫瘍細胞近辺で活性化させるわけであるが、その適 用にあたっては、抗体を化学的に細胞毒性剤に結合させている場合のように、標 的抗原ないし抗体は、細胞毒性剤が細胞内に侵入できるよう、腫瘍細胞に取り込 まれる必要はない。

アクチベータの選択 アクチベータ活性は、通常、循環系や影響をうけやすい非標的組織にあってはな らないか、または、ごく低レベルであって、循環系や非標的組織における薬剤の 不都合な活性化が極小程度に抑えられていて、有害副作用を招くことがないよう になっていなければならない。さらに、アクチベータにたいする基質や、アクチ ベータの阻害剤が、循環系や標的組織の中に、本発明の治療効果を妨げるほどあ ってはならない。もし、治療を受ける動物と同一生物種起源の酵素か、それとほ とんど同一の酵素を選択することによって複合体が非免疫原性になるように選ば れているならば、すぐれた効果を得られる。多くの酵素は、進化を通じて、下等 生物種から単離した分子が、ヒトの酵素とほとんど同一である程、裏皮に保存さ れている。

抗体に付着させるアクチベータは、どのクラスの酵素であってもよい。ヒドロラ ーゼ、酸化・還元酵素、トランスフェラーゼ、イソメラーゼまたはリアーゼ、リ ガーゼでもよいし、あるいは同様の触媒活性を持つ抗体でもよい（Ｎ＊ｐｐｓｒ 　ｔｌ　１１．１９８７参照）。

エンドグリコシダーゼのリゾチームは、アクチベータ活性に関する上記要求事項 を満たすものである。さらに、その低分子量、一本鎖構造及び十分に研究された 化学的・構造的特性（Ｉｍｏｔｏ　Ｎ　ｔｌ、　１９７２　）によッテ、当該酵 素を、抗体ニ化学的に結合させることが可能である。リゾチームは、１２９−１ ３０個のアミノ酸から成る塩基性エンドグリコシダーゼであって、保存性が高い 。ニワトリ、ウズラ及びヒトのように多様な生物種から得たりゾチームが、アミ ノ酸残基の数、−級アミンの数及びこの触媒機構に関与するアミノ酸残基に関し ては、はとんど同じである。リゾチームは、最高７７℃までの温度、ｐＨ２から １１で安定である。さらに、リゾチームは、低濃度の大抵の変性剤にたいして異 常に高い抵抗性を有する。ジスルフィド結合を完全に還元すると、リゾチーム酵 素活性は消失する。ヒトでは、リゾチームは、乳、涙、唾液、胎盤、膵臓、白血 球及び単球に見られる。血中のりゾチームは、白血球や単球由来のものである。

正常の血液レベルは、涙のものの約１％である（０＋＋ｅｒｍｔｎ及びＬｉｖｌ ｏｒ、＋９６６）　ｏ　リゾチームは、ある種の細菌の細胞壁中の、Ｎ−アセチ ルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）とＮ−アセチルムラミン酸との間のβ−（１→ ４）結合を攻撃し、また、キチン、すなわちＮ−アセチルグルコサミンの、β− （１−４）結合ポリマーを攻撃する。好ましい基質は、（ＧＩｃＮＡｃ）６以上 のポリマーである。

アクチベータの抗体への結合 本発明の方法によれば、アクチベータ酵素あるいは触媒性抗体は、標的決定抗体 に、その複合体が、抗原に結合し、前駆薬剤成分を活性化する能力を保持するよ うに結合される。これは、ホモないしヘテロ三官能性架橋剤または、直接蛋白質 修飾試薬を用いて、反応性の高い基を、アクチベータ成分と、標的決定成分の両 方に導入することによって達成される。この反応基によって誘導体化した後、ア クチベータと標的決定成分は、混合すると、共有結合を通じて結合する。

リンカ−を、アミノ基、カルボキシル基、またはスルフヒドリル基と反応させて 、蛋白質やペプチドに導入してもよい。

（ＷｘｗｒＢａｃ＋１ｋ及びＴｈｅｒｐｃ、１９ｇ７）　ｅまた、糖を酸化して アルデヒドを生成させた後で糖蛋白質や炭水化物に導入してもよい（Ｓｅｔｓ及 びＢａｒｖＨｚ、１９８７　）　ｏアルデヒドは、リンカ−（例えば、ヒドラジ ド）上のアミノ基と反応し、シッフの塩基（例えば、ヒドラゾン）を形成するこ とができる。

スルフヒドリル基は、抗体及び酵素を含む、多くの生物性分子のシスティン残基 から生成することができる。この残基は、当該分子の生物機能を変更することな く反応基で誘導体化することができる。抗体分子においては、すべてのクラスの ものが、分子鎖内に、また、分子鎖間に、ジスルフィド結合を含み、これらが、 当該分子の３次、４次構造を安定化する。ｌｆｆ１ｌｌＩクラスの抗体の場合、 Ｈ鎖構造は、穏やかな還元反応後、抗体機能を失うことなしに、誘導体化できる いくつかのジスルフィド結合を含む。次に、遊離スルフヒドリル基は、ハロアル キル基、ｐ−メルクリ安息香酸基、および、ミカエル型の付加反応の可能旧Ｉｒ ＆及びＬｓｔｌｏｅ　（１９７９）に記載された型の基が含まれる。

蛋白質へ付着させるのにもっとも良く使われる方法は、リジンの核性イプシロン ・アミノ基の攻撃に基づく。アミノ基は、きわめて反応性の高いスクシンイミド 嘩エステル、無水物、または、環状チオエステルによって導入されるカルボニル 官能基と反応させてもよいし、または、カルボニル官能基をカルボジイミドで活 性化して、カルボキサミド結合を形成させてもよい。

また、別のやり方として、アミノ基をメチル・イミド酸エステルで攻撃すること によって、アミジニウム結合を形成させても本発明の実行に用いられる作用化合 物は、意図する適用の目的にしたがつて選択される（ｆ！４えば、殺細胞、細胞 増殖の防止、ホルモン療法、または遺伝子療法）。この化合物としては、例えば 、製薬、毒素、アルキル化剤、酵素、抗生物質、抗代謝薬、抗増殖剤、ホルモン 、神経伝達物質、Ｄ　Ｎ　Ａ　、放射線不透過染料、常磁性染料、放射性同位元 素、蛍光性化合物、マーカー化合物、細胞膜透過性を変える化合物及び不溶性マ トリックスがある。上記は、網羅的なリストを意図したものではなく、また、本 発明の範囲を限定するためのものでもない。最後に、化合物同士を併用してもよ い。本発明の前駆薬を調製するのに用いられる抗癌剤の例としては、ヌクレオシ ド類似体、サイクロホスファミドおよびその類似体、ニトロソ尿素、ミトロマイ シン、アルキル化剤、アルカロイド、プレオマイシン、アントラサイクリン、シ スプラチンおよびその類似体が挙げられる。

アントラサイクリンの好ましい例としては、ドキソルビシンがある。これを、開 裂性スペーサーを介して、負に帯電した残基に結合させてもよい。負に帯電した 残基の存在によって、その薬剤誘導体は、そのままでは、細胞によって取り込ま れないので、細胞内性細胞毒性を発揮できない。しかしながら、一旦、スペーサ ーが開裂すると（例えば、酵素的に）、負に帯電した残基は取り除かれ、薬剤誘 導体は細胞の中に入り、その活性を発揮する。

われわれは、次の部分から成る薬剤誘導体を設計した。

ａ）抗癌剤のドキソルビシン ｂ）ドキソルビシンに、そのＣ１３カルボニル基へ還元性末端を介して複合する キチン・オリゴマー・スペーサー。

Ｃ）過ヨウ素酸酸化によってキチン・オリゴマー・スペーサーの非還元性末端に 生成された２個のアルデヒド基に結合した２個のタウリン残基。

ドキソルビシンは、癌患者を治療するための抗新生物剤として広く研究されてい るアントラサイクリン薬剤グループに属する（ＹｏｗＢ及びＯ！０１１．　１９ ０　）　ｏ　ドキソルビシンは、白血病、乳癌及び肉腫のような各種新生物性疾 患の有効治療に大きな役割を果たしている。しかしながら、ドキソルビシンの有 効な使用は、通例の毒性（造血機能低下、悪心およびおう吐、並びに脱毛）、及 び、独特の毒性（心筋症）によって妨げられてきた。

ここに述べたような、活性を持つドキソルビシン分子の部位特異的な搬送は、本 薬剤の不都合な細胞毒性作用を激減させることになり、本則ばかりでなく他のア ントラサイクリン剤の使用にとって、画期的な新時代を開くことになろう。

キチン・オリゴマー（Ｎ−アセチルグルコサミンのオリゴマー）をスペーサーと して選んだのは、キチン・オリゴマーの、ヒトリゾチームの開裂作用にたいする 感受性が高いからである（Ｈａｌｔｅｒ　ｃｌ　ｓｌ、＋９７５Ｂ　Ｈｏ１ｌ！ ｒ　ｔｌ　鳳１．　１９７５ｂ）　ｏ　リゾチームを選んだことは、本性の治療 原理にとって、いくつかの利点を育する。先ず、リゾチームは、は乳類の分泌物 の中や（唾液、涙、乳、頚管粘液）、細胞内では組織（特に、白血球と腎臓）の リゾソームの中に豊富に存在するが、血清中のりゾチーム・レベルは比較的低い 。その結果、循環における薬剤誘導体の不都合な開裂が制限される。第二に、リ ゾチームにたいしては、その薬剤誘導体と、標的酵素分子の活性部位に関して競 合するような天然基質が循環系に存在しない。

薬剤誘導体の細胞による取り込みを防ぐために、２個のスルホン酸残基を、炭水 化物スペースに付着させる。負に帯電したスルホン酸基が、細胞の、小分子量化 合物の取り込みを抑制する作用については、染料排除試験に用いられるトリパン ・ブルー　（ｐｈｉｌｌｉｐｓ、１９７３）　、ヒトにおける血液容量測定のた め、診断用として用いられるエバンス・ブルー（メルク・インデックス、９版、 １９７６）のような各種の分子について十分に記載され第１図、５ＰＤＰ−修飾 １６．８８　の免疫反応性第２図、　ＴＰＣ［Ｉ　修飾１６．■　の免疫反応性 第３図、　１６．８８−リゾチーム複合体の免疫反応性第４１！１．標準曲線： リゾチーム活性第５図、腫瘍異種移植ヌードマウスにおける、１６．８８−リゾ チームの血清滞留率 篇６図、腫瘍異種移植ヌードマウスにおける。１６．８８−リゾチームの腫瘍滞 留率 第７に、ピリジル・ジスルフィド残基によるドキソルビシンの誘導体化 第８図、チオエステル誘導によるキチン参オリゴ糖の調製第９図、チオエステル 誘導体化キチン・オリゴマーの、ピリジル・ジスルフィド誘導体化ドキソルビシ ンへの付着第１０図、タウリン残基の、チオエステル誘導体化キチン・オリゴマ ーへの付着 第１１図、開裂性キチン・オリゴマー・スペーサーを介して、タウリン残基を含 むドキンルビシン誘導体第１２図、＾２７８０卵巣癌細胞にたいするドキソルビ シンの用量・反応 第１３図、開裂性キチン・オリゴマー・スペーサーを介して、タウリン残基を含 むドキソルビシン誘導体の細胞毒性活性実施例１ リゾチーム酵素とヒト・モノクローナル抗体１６．８８を用いた、抗体−酵素複 合体の調製 ピリジル・ジスルフィド基による、ヒト・モノクローナル抗体１６、８８の誘導 体化 下記の実験は、スルフヒドリル誘導体化リゾチーム（アクチベータ）と複合する 、ピリジル・ジスルフィド誘導体化抗体の形成を例示するものである。リゾチー ムに結合するスルフヒドリル基を生成するために、分子鎖間、または、分子鎮内 ジスルフィド架橋を還元して抗体を非安定化せずに、多数の活性ジスルフィド基 を、トスクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ Ｐ）を用いて抗体に導入する。

５ＰＤＰで誘導体化したときに、抗体が免疫活性を失う場合には、別のリンカ− を用いることができる。新規のリンカ−１Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−シス ティン　ヒドラジド＋ＴＰＣＩ）について記載がある（Ｘ＠ｒ＊　ｅＩ＊Ｉ、１ ９８９）　ｏ　ＴＰＣＩは、抗体の酸化した炭水化物残基に結合した、反応性の 、末端ピリジル・ジスルフィド残基を有するリンカ−を導入する。ＴＰＣＨは、 ５ＰＤＰのような抗体のイプシロンアミノ基を通じて結合するリンカ−よりも、 抗体機能を損なわずに、より多くのスペーサー基を導入することを可能にする。

−緒に混合すると、２−イミノチオレーン（２−ｉｍｉｎｏｊｈｉｏｌｓｎｓｌ 　（２−Ｉ　Ｔ　）によってアクチベータに導入されたスルフヒドリル基は、５ ＰＤＰまたはＴＰＣＨによって抗体に導入されたピリジル・ジスルフィド基と反 応し、ジスルフィド結合を形成する。ジスルフィド結合によりて結合した抗体− トキシン複合体に関する研究から（丁ｈｏｒｐｅ　Ｎ　ｔｌ、１Ｎ？）　、抗体 とアクチベータ酵素の間のジスルフィド結合は、インビボでは、部分的に不安定 であり、これは、腫瘍に局在する前に抗体から７クチベータ酵素を遊離させる結 果を招くことが示唆される。これは、抗体とアクチベータを、より安定な千オニ ーチル結合で結合することによって防ぐことができる。この結合は、ＳＦ’ＤＰ またはＴＰＯＨの代わりに、架橋試薬、例えば、Ｎ（ガンマ−マレイミドブチリ ルオキシ）スクシンイミド　（ＧＭＢ！ｉ）を用いて導入する。ＧＭＢ　Ｓは、 スルフヒドリル基ではなく、反応性の、末端マレミド基を導入し、２−ＩＴによ ってリゾチームに導入されたスルフヒドリルと、より安定な千オニステル結合を 形成する。

ここに挙げる実施例では、抗体は、ある種の癌細胞の細胞原形質に見られる抗原 （ＣＴＡｔｌ　）と反応するヒト　Ｉｇ’ｌｌ抗腫瘍モノクローナル抗体１６． ８１１　（Ｈｘ＋ｐ！ｌ　ａｔ　ｃｌ、１９８５）である。この癌種には、結腸 癌、乳癌、卵巣癌、すい臓癌、肺癌が挙げられる。

ピリジル・ジスルフィド残基は、二つの異なる方法で導入した。

Ｌ垂Ａ 抗体　１６．８８は、ヘテロニ官能性リンカ−のＮ−スクシンイミジル−３−（ ２−ピリジルジチオ）プロピオネート　（ＳＰＤＰＩ　を用いて、リシン残基の アミノ基で誘導体にした。１６．１８抗体活性の低下が許容域にありながら、１ モルの１６．８８当り、８モルの！３ＦＤＰを導入することができた（第１図） 。８：１の導入比を得るために、１モルの　１６．８８につき１０モルの５ＰＤ Ｐを反応させた。反応は、Ｄ、ＩＭ＃１化ナトジナトリウム、Ｏ，１１１Ｍリン 酸バッファー　ｐＨ７，０中で室温で３０分間行なった。複合抗体は、セファデ ックスＧ−２５によるゲルろ過によって、過剰の５ＰＤＰから分離した。免疫反 応性は、非修飾１６．８８参照と比較して測定した。これは、５ＰＤＰ修飾１６ ．８８と、非修飾１６．１８参照について、同種抗原ＣＴＡｔｌへの結合におい て、１−１２５標識非修飾１６．８８参照と競合する能力を比較することによっ て行なった。導入比８．６＋１のところで、！−１６．８８の結合を５０％低下 させるのに要する５ＰＤＰ−１６，８８量が、係数４で増加した。

方法Ｂ １６．８８の炭水化物部分を酸化し、アルデヒド官能基を生成し、これに、ヘテ ロニ官能性リンカ−の５−（２−チオピリジル）−Ｌ−システィン　ヒドラジド 　（丁ＰＣＩＩＩ　を付着させた。蛋白質上のアミノ基を介して抗体に結合する ５ＰＤＰと違って、ＴＰＣＩ（のヒドラジド部分は、穏やかな過ヨウ素酸酸化に よって１６．８８の炭水化物成分中に生成したアルデヒド基と反応してヒドラゾ ンを形成する。第２ＦｌｌＪに示したように、１モルの１６，８８当り１７モル ものＴＰＯＨの導入が、検出できるほどの抗体活性の損失もなく、実現できた。

１６．８８の誘導体化は、０．１Ｍ酢酸ナトリウムバッファー　ＰＨ５，５中に 　２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した　１６．１１８の溶液を、ｌｏａＭ過ヨウ素酸 ナトリウムと、４℃で１０分間反応させて行なった。

ＴＰＣＨは、１モルの　１６．８８当り７０００モルのＴＰＣＨの割合で加えた （１６．８８の一級アミノ基にたいし、モルにして、ＴＰＣＨの約２０倍過剰に 相当する）。過剰のＴＰＣＨは、０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む００１Ｍリン酸 バッファーｐＨ７，０を用いたセファデックスＧ−２５によるゲルろ過によって 除去した。

誘導体化した抗体の免疫反応性は、競合結合分析を用いて測定した。誘導体化１ ６．８８抗体と天然１６．８８抗体について、放射性標識天然１６８８抗体と、 特異的抗原への結合における競合能力を比較した。誘導体化抗体及び天然抗体に ついて、そのＩ　Ｄ　ｓ−を比較した。

リゾチームの７ミノ基は、１６．１１８に結合させるために、アミノ反応性へテ ロニ官能性試薬によって誘導体化してもよい。アミノ基誘導体化は、５ＰＤＰ、 ＧＭＢＳ及び２−ＩＴについて調べた。５ＰＤＰ、ＧＭＢＳ共に、導入比が、１ リゾチーム当りリンカ−２分子という低比率でも酵素活性を著しく低下させた（ 第１表）。１リゾチーム当りリンカ−２分子という比率で、２−ＩＴで誘導体化 すると、リゾチーム活性の６０−６８％が保持された。

リゾチームは、モルにして１００倍過剰の２−ＩＴによって誘導体化した。反応 は、０．１Ｍ塩化ナトリウムと　０．００１Ｍジチオトレイトールを含む、　０ ．　ＯＩＭリン酸バッファーｐＨｌＯ中で、室温で１０分間行なった。反応は、 モルにして１０倍過剰（２−ＩＴにたいして）のエタノールアミンを加えて停止 させた。誘導体化されたリゾチームは、過剰の２−ｒ’ｒやエタノールアミンか ら、２１Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸を含む、同じバッファーｐＨ７，０を用 いたセファデックスＧ−１０によるゲルろ過りａマドグラフィーによりて分離し た。分離後直ちに、ビリジルジスルフィド誘導体化１６−８８抗体への結合に使 用した。リゾチーム活性は、Ｍｉｃｒｏｅｏｃｃｗｓ　Ｉ　５ｏｄｅｉＨｉｅ＊ ｓ懸濁液を用いて測定した（Ｓｈｕｓｒ、１９４９）。

第　１　表 リゾチーム修飾の酵素活性に及ぼす作用ヘテロニ官能性　モル比　リゾチームの 残存活性リンカ−（リンカー：リゾチーム）　実験！　実験■２−イミノチオレ ーン　２．１：１　６０％　６８％５ＡＴＡ　２．ｆＪ：１　１Ｇ％ ＧＭＢＳ　１．８：Ｉ　５％　１８％ （ＨＢ＊ｒ、１９４９） １６、８１１−リゾチーム複合体の合成２−ＩＴ−誘導体化リゾチームを、５Ｐ ＤＰ誘導体化１６．８８（方法Ａ）またはＴＰＣＩ誘導体化１６．Ｈ（方法Ｂ） に結合させた。

方法Ａ １６、８８−５ＰＤＦと２−ＩＴ誘導体化リゾチームを、この二つの成分を１　 ：　１　（Ｗ／Ｗ）の比で混合して、結合させた。４℃で２４から４８時間の結 合反応中、この溶液に窒素ガスをフラッシュした。１６．８８−リゾチームを、 ０．１Ｍ塩化ナトリウムを含む０、ＯＩＭ＋Ｊン酸バッファー（ｐ［＋７．０） を用いたフラクトゲル５５Ｆによるゲルろ過によって遊離リゾチームから分離し た。

方法Ｂ ２−ＩＴ誘導体化リゾチームを、ＴＰＣＩ誘導体化１６．０と１　：　１　（Ｗ ／Ｗ）の比で混合して、室温で一晩反応させた。

１６、０−リゾチームは、方法Ａと同様にして、ゲルろ過によって、遊離リゾチ ームから分離した。

結合収率を、５ＰＤＰ誘導体化１６．８８とＴＰＣＨ誘導体化１６．８８の間で 比較すると、５ＰＤＰ修飾抗体の方が、全体の収率は高いことが示された。通常 には、５ＰＤＰ修飾１６．８８の１モル当り３から４モルのリゾチームを結合さ せることができた。

１６．８８−リゾチーム複合体の抗原結合能は、非修飾１６．８８参照に関して 、競合結合アッセイによって測定した。第３図に示した結果から、第１図に示し た５ＰＤＰ修飾１６．８１１に比べて、＋６．ＩＨ−リゾチーム複合体において 、抗体活性がさらに低下したということはない、ということが判明した。

複合体の酵素活性は、前駆薬と類似の溶解性の基質を用いる新規のアッセイによ って測定した。アッセイ基質は、０００５Ｍクエン酸バッファーｐＨ４，５に溶 解したドアセチル　グルコサミン　ペンタマー（ＧＩＣＮ川５（用ＩＭ）であっ た。３７℃で４時間後、消化されたｆＧＩｃＮＡｔ）ｓを、薄層クロマトグラフ ィーによって基質から分離した。クロマトグラフィーは、２−プロパツール／水 ／水酸化アンモニウム（６２／３７／１　）溶媒系使用のシリカによるものであ った。［ＧＩｃＮＡｃ）５と消化基質は、エタノールに溶かした１０％硫酸をス プレーして視像化した。定量は、走査密度計によつて行なった。この方法では、 ６．２５から５０μ！／■１の濃度範囲でリゾチーム活性が測定される。標準曲 線（第４図）から、このアッセイは、６．２５から　１０μｇ／■１のリゾチー ム濃度範囲でもっとも感度が高いことが分かる。第２表は、１６．８８−リゾチ ームの活性は、等量の２−ＩＴ誘導体化リゾチーム活性の約９０％であることを 示す。

ＩＬ　８ｇ−リゾチームの安定性を、４℃、室温の保存状態で監視した。その結 果から（′ＩＩＥ３表）、４℃または２５℃で１力月の期間ではりゾチーム活性 には目立った低下が見られないことが分かる。室温では、１６．８８抗体活性に おいて５４％の低下が、４℃では、抗体活性に３３％の低下が、１力月の保存後 に認め抗体結合のリゾチーム活性に及ぼす作用リゾチーム−誘導体　モル比　残 存リゾチーム活性（％）リゾチーム−Ｉ　Ｔ　１０１１ リゾチーム−１６，８８４：Ｉ　Ｎ ３：１　９０ 第　３　表 リゾチーム−１６，８８免疫複合体の安定性日付　結合の５０％抑制に必要な　 残存リゾチーム活性抗体　（μｇ）　（％） ２５℃　４℃　２５℃　４℃ １０／１３／８９　６μＩ（１００％）　７μ５（１００％１　１００％　１０ ０％１１／Ｈ／８９　１３μｍ（４６％）１０．５ｇｇ（６７％１　９０％　１ １１６％ヌードマウスのヒト結腸腫瘍異種移植モデルにおける。　１６．８８− リゾチームのインビボ腫瘍局在と薬理動態１６、８８−リゾチーム、または、ｌ −１２５”ｌ？比放射能１ｍｃｉ７１１ｇに放射性標識した１６．８８を、１５ 匹の、皮下に０．２グラムのヒト結腸腫瘍異種移植片が植え付けられているＢｓ １ｂ／ｃ無胸腺ヌードマウスに静脈注入した。結腸腫瘍（ＴＨＯ）は、ヒト・モ ノクローナル抗体１６．８８によって認識される抗原を発現する。

この目的は、抗体−リゾチーム（１：　４）複合体と、複合していない１６．８ ８抗体とを比較し、リゾチームの、腫瘍の通常の抗体取り込み量や抗体の通常の 血清（血液）滞留量に及ぼす作用を測定することにある。血清滞留量（第５図） は、Ｕ、Ｏ−リゾチームと　１６．８８の両方とも、注入後４時間から２日の期 間に渡って、はぼ同じであった。すなわち、１６．Ｈの血清半減期は１２．４時 間、　１６．８８−リゾチームの血清半減期は１１．８時間であった。注入時か ら、注入後１時間までは、１６．　Ｈ−リゾチームの方が、血清中からより速や かに排除されるようであった。

異種移植腫瘍における　１６８８−リゾチームまたは１６．！１８の量は、注入 後１時間に極大になった。すなわち、１６．８８−リゾチームの場合４％、１６ ．８８の場合３．５％である。　１６．８８−リゾチーム、１６．８１１いずれ についても、腫瘍からの排除率は、投与後１時間から２日にかけて、同様であっ た（菓６図）。

この薬剤誘導体は、下記の成分から成る。

ａ）ドキソルビシン、 ｂ）ドキソルビシンと、そのＣＩ３カルボニル基に還元性末端を介して複合した キチン・オリゴマー・スペーサー。

Ｃ）キチン・オリゴマー・スペーサーの非還元性末端に過ヨウ素酸酸化によって 生成された２個のアルデヒド基に結合した２個のタウリン残基。

ピリジル・ジスルフィド残基によるドキソルビシンの誘導体化ドキソルビシンを キチン・オリゴマー・スペーサーの還元性末端に結合させるために、そのＣＤカ ルボニル基を、既報の方法（Ｈｏｌｙ目ｒ　ｆｌ　ｔｌ、１９８０；　Ｈｕｔｖ ｉｌｘｅｌ　ｚｌ、１９８３）により、ヒドラジド誘導体を用いて修飾した。本 実施例で用いたヒドラジド誘導体は、ヘテロニ官能性試薬であり、１つのヒドラ ジド部分と１つのピリジル・ジスルフィド部分を含む（策７図）。ヒドラジド誘 導体［３１２−ピリジルジチオ）プロピオン酸　ヒドラジド（ＰＤＰＩＩｌｌ　 の合成は、３段階の操作によって行なう。すなわち、３−メルカプト　プロピオ ン酸のピリジル・ジスルフィド誘導体の調製、１−ブチル　カルバゼートによる カルボキシル基の總合、次いで、ｌｌＣｌで飽和させた酢酸エチルによる脱プロ テクト、である。

５８ｍｇ　（０，ｌ　ｍｍｏｌ）のドキソルビシンーＨＣＩを０．８５ｍ１の水 に溶かした溶液を、３８ｈｇ　ｆｌ　ｉｍｏｌ）のＰＤＰＨ及び８４ｆｆｉｇ　 （１，０２ｍｍｏｌ）のＮ５ＯＡｃを０．６ｍｌの水に溶かした溶液で処理した 。この透き通った赤色溶液に、Ｇ、１ＭのＮ１２Ｃ０３を４．８１加え、室温（ ＲＴ）で−晩撹拌した。この反応混合物を、ＣＢＣｌ３／ＭｅＯＨ（３／１）で 抽出し、結合抽出物を蒸発させ、調製用ＴＬ　（：、　（ＴｔｐｔｒｔｄＰｒｅ ｐ８＋ｘｌｉｙｅ　ｌＪ＋１ｐｌｘｌｅ−Ｔ、　ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／ＮＨ４ ＯＨ：９Ｇ／Ｉｆｔ／Ｉ）によキチンは、ＲｕｐｌＢ　［１９６４）の開発した 方法によって加水分解し、Ｐ２ゲルろ過カラムを通して精製した。このようにし て得られたキチン・オリゴ糖を、第８図に示すように、誘導体化した。−例とし て、ベンタートアセチルキトペンタオース　（ロ）ヲ用いる。０．４４ｇ　！０ ．４２ｍａｏｌ）のペンタ−Ｎ−アセチルキトペンタオース　（葺）を、ｌｈｌ の水、８１のエタノール及び１ｍｌのフェニルヒドラジンに溶解した混合液を、 三日間、１２５℃に加熱した。反応混合物を、ＲＴに冷却し、２０ｍ１の水を加 え、エーテル（２５ｍｌｔ３）で抽出した。水相を凍結乾燥し、その生成物をさ らに、逆相カラム（Ｃ１８）（４０％ＭｅＯＨ／Ｈ２０）を通して精製した。化 合物３ｅ　（０，３３ｇ、　０．２９　ｍ＋１ｏｌ）を、水（２０ｉ１）　ｌ： 溶かし、茶匙１へのラネー・ニッケルＷ−２を加え、パー（Ｐｓｒｒｌの装置を 用いて一晩水素化した。反応混合物を、セライト床を通してろ過し、濃縮し、Ｄ ｏｖｓｘ　５Ｏ−ＷＸ、２　（１’！　）イオン交換力ラムニロードした。カラ ムは、最初、８０１の水で溶出し、次に、５０１の２Ｎ−ＮＨ４０ｉｌで行なっ た。溶出液を凍結乾燥し、Ｏ，１５ｇの化合物口を得た。この化合物４ｓ　（０ ，１５ｇ、　０．１５　ａｍｏｌ）を、水（５＋ｚｌ　）に溶解し、０８１のＤ ＭＦに溶解した０、０６７１　（０，２９■ｏｌ）の５ＡＴＡと混合し、ＲＴで 一晩撹拌した。この反応混合物を、水（２０ｍｇ）で希釈し、クロロホルム（Ｈ ｍｌｘ３）で抽出し１．凍結得た。

チオエステル誘導体化キチン惨オリゴマーの、ピリジル・ジスエタノール（１２ ｍ１）に溶解し、触媒量のＨＯＡｃを加え、次に、０２５１　ｆｏ、Ｉ１２３ｍ ｍｏｌｌ　の化合物口を加え、ＲＴで一晩撹拌した。

溶媒を蒸発させ、残渣を水（１０ｍ１）に溶解させ、Ｃ［ＩＣｌ３　／Ｍ＜Ｏ［ Ｉ・７／３で抽出し、結合抽出物を蒸発させ、暗褐色の粉末Ｉを得た（Ｔ　Ｌ　 Ｃでは、検出できる量の千オニステル誘導体化キチン・オリゴマー（ム）は示さ れなかった。シリカ・ゲル、２−プロパツール／水／Ｎｉ！４０１１富７２／２ ７／ｌ）。

ＮｔｌＯ４によって、千オニステル誘導体化キチン・オリゴマーを酸化すると、 非還元性末端にジアルデヒドが形成され、これは、タウリンと反応して、シッフ の塩基を形成する（旦）。化合物足は、Ｎ５Ｂ）Ｉｉにより、より安定なアミン に還元され、化合物足を与えた。０．　ＩＭ　ＮｒＯＨで化合物足を加水分解す ると、還元性末端に遊離スルフヒドリルを含む誘導体化キチン・オリゴマー・ス ペーサー（１０）が形成された。

ジスルフィド結合を介してキチン・オリゴマーを含むドキソルビシン誘導体（７ ）を、ＤＨ６，０で、ＲＴで６０分分間中かにＮ＋ＩＯＪ６理した。過剰のＮ＊ 　１０４をエチレングリコールによって消滅させたのち、モルにして１０倍過剰 のタウリン（ドキソルビシン誘導体にたいして）を、この反応混合物に加えた。

さらにＲＴで１時間インキュベージタンした後、この誘導体を、ｐＨ７，２に調 整して、細胞毒性アッセイに用いた。化合物Ｉのタウリン誘導体への変換は、シ リカ使用（２−プロパツール／水／ＮＨ４０１１−７２／２７／１）　Ｔ　Ｌ　 Ｃ分析によって確認した。

別の合成法では、第１０図に示したキチン・スペーサーを用いて、より安定性の 高い薬剤誘導体の調製が可能である。ピリジルジスルフィド誘導体化ドキソルビ シン（１）を、還元性末端に遊離スルフヒドリル基を含むタウリン誘導体化キチ ン・オドキソルビシン誘導体当りのスルホン酸の数もし必要なら、薬剤誘導体当 りの、スルホン酸残基の数は簡単に変えることができる。例えば、１薬剤誘導体 当り、２個ではなく、４個のスルホン酸残基を結合させることができる。これは 、各々２個のスルホン酸残基を含む、ヒドラジド誘導体を用いて行なう。また、 負に帯電した基の導入は、スルホン酸残基に限られるものではない。例えば、リ ン酸塩またはリン酸残基（例えば、３−アミノプロピルホスホン酸）を用いても よい。

前駆薬におけるキチン・オリゴマー・スペーサーの長さリゾチームによるキチン ・オリゴマーの開裂の相対的速度は、鎖の長さに比例する。例えば、キトヘキサ オースは、キトトリオースよりも、３０．０００倍も高い速度で開裂される（Ｉ ｍｏｌｏ　ｅｌ　ＩＩ、＋９７２　）　ｏ　したがって、ペンタマーよりも大き なオリゴマー・スペーサーの場合、リゾチームによってより活性化されやすい薬 剤を形成することが予想される。

様々な長さのキチン・オリゴ糖を含むドキソルビシン誘導体の細胞毒性 ＾２７８０卵巣癌細胞による　３Ｈ−チミジン取り込みの阻害を用いて、インビ トロ細胞毒性を測定した。簡単に言うと、イーグル改変最小必須培養液中の２！ ｉ１１’個の細胞の懸濁液０．１ｍｌを、９６ウエルの微小培養プレートのウェ ルに加えた。０．６から１０μ（／ｍｌ　濃度のドキソルビシンまたはドキソル ビシン誘導体の分岐（０，１ｍ１）を加え（同じものを４つずつ）、その混合物 を、加湿ＣＯ２インキニペニラ−ター中３７℃で４時間インキュベートした。Ｏ ，１ｍｌ　３Ｈ−チミジン（１０μＣｉ／＊Ｉ）を各ウェルに加え、１６時間イ ンキュベートした。その後、細胞を洗浄し、０．５１１水酸化ナトリウムで収穫 し、３Ｈ−チミジンの取り込みについてカウントした。第１２図は、ドキソルビ シンについて、典型的なアッセイの結果を示したものである。第４表は、ｆＧＩ ＣＮＡＣ）　と結合させるのに用いたリンカ−（Ｐ　Ｄ　Ｐ　Ｈ）で修口 飾したドキソルビシンと、ｆＧｌｃＮＡｃｌ　またはｆＧＩＣＮＡｃ）５と結合 させたドキソルビシンとを比較したものである。ドキソルビシンの修飾の程度に かかわらず、薬剤活性には検出できるような低下は見られなかった。この結果か ら、リゾチームの作用によって生成される薬剤は、天然のドキソルビシンと同様 の細胞毒性を持つことが分かる。

第　４　表 ドキソルビシン誘導体の細胞毒性 誘導体　％細胞毒性ゝ Ｄｏｇ−ＰＤＰ）Ｉ　６７．１ Ｄｏｘ−（Ｇ　ＩｃＮＡｅ）　、　９１６Ｄｏｘ−（ＧｌｃＮＡｃ）、　１００ ．０コ ＊ドキソルビシンと比較した場合の％毒性。薬剤濃度は０６２５μｇ／１１に等 しい。

開裂性キチン・オリゴマー・スペーサーを介してタウリン残基を含むドキソルビ シン誘導体の細胞毒性活性第１３図は、タウリン残基を含むドキソルビシン誘導 体の細胞毒性を、キトペンタオース・スペーサーを含むが、タウリン残基を付着 させないドキソルビシン誘導体の細胞毒性と比較して示す。細胞毒性は、前述の ように測定した。タウリン含有薬剤の細胞毒性は、約２０倍低かった。タウリン 残基を付着させたキチン・オリゴマー・スペーサーを、リゾチームに暴露すると 、スペーサーの開裂が起こった。これは、ＴＬＣ（２−プロパツール／水／ｌｉ ｌ＋４０［１−６７／３２／ｌ）によって確認した。上記データから、タウリン 含有前駆薬は、様々な長さを持つキチン・オリゴマーを含み、かつ、元の薬剤と 同程度の活性を持つ、活性薬剤種に変換できることが分かった（軍４表）。

又級 Ｒｕｐｌｅｙ、Ｊ、入、Ｔｈａ　Ｈｙｔ６ｒｏ１ｙｓＬｓ　ｏｆ　Ｃｈｉｔｉｎ 、　Ｂｉｏｃｈａｍ、　Ｂｉｏｇｐｈｙｓ。

入ｅｔａ　８３，２４５−２５５　（１９６４１゜２結合ニー１２５１６．８８ Ｘ結合１’−１２５１６，８８ ％結合ニー１２５１６．８８ 相対吸収単位 ２注入量　／　ＧＭ 先注入量／　ＧＭ −−σ　−４ ＦＩＧ、７ ＦＩＧ、１１ 九細胞毒性 ム　ｃｎｃ。

ロ　巴　ロ　ロ　ロ ２細胞毒性 補正書の写しく翻訳力提出書（特許法第１８４条の８）特許庁長官　深　沢　亘 　殿　平成３年７月２３日ＥＮ１、特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ　９０１００ ５０３２、発明の名称　治療薬の部位特異的インビボ活性化３、特許出願人 住　所　オランダ国、量云工二渉暉６８００・エル・ニス・アーネム、ピー・オ ー・ボックス・１８６、フエルペルウエヒ・７６名　称　アクゾ拳エヌ・ヴ工− ４、代　理　人　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提 出年月日　１９９１年３月８日２・、　薬理学的活性が酵素活性である請求項１ ４の方法。

２１、薬理学的活性が、標的組織の細胞によって取り込まれ、細胞内で活性化さ れる前駆薬のものである請求項１４の方法。

２２、薬理学的活性が生物反応修飾剤のものである請求項１４の方法。

２３、薬理学的活性が有毒物質のものである請求項１４の方法。

２４、アクチベータがリゾチームである請求項１の方法。

２５、　アクチベータがリゾチームであり、アクチベータによって開裂できる構 造がキトオリゴマーである請求項１４の方法。

２６、薬理学的活性の発現を妨げる構造が、薬剤が標的組織の細胞の原形質膜を 通過して細胞内の活性化部位に移るのを妨げるか、その薬理学的活性が細胞表面 の受容体と効果的な相互作用をするのを妨げるか、または、一旦活性化されると 、直接または一連の従属反応を通じて、近傍の細胞機能を損なう薬理学的活性の 細胞内活性化を妨げる機能を有する請求項１４の方法。

２７、前駆薬を繰り返し投与する請求項１の方法。

２８、アクチベーター標的決定成分複合体を繰り返し投与する請求項１の方法。

２９、アクチベーター標的決定成分複合体を標的組織に結合させることができ、 非結合の複合体を、前駆薬の投与前に患者から排除することができる請求項１の 方法。

３０、アクチベーター標的決定成分複合体が、体外的手段によって排除される請 求項２９の方法。

３１、アクチベータとしてリゾチーム及び標的決定成分としてヒト・モノクロー ナル抗体またはそのフラグメントを含むアクチベーター標的決定成分複合体。

３２、細胞の取り込みを妨げる開裂可能な分子を含む抗癌剤を含む前駆薬。

３３、キチン・オリゴマー・スペーサーによって誘導体化される抗癌剤を含む請 求項３３の前駆薬。

３４、抗癌剤がアントラサイクリンである請求項３４の前駆薬。

３５、アントラサイクリンがドキソルビシンである請求項３５の前駆薬。

３６、キチンΦオリゴマー〇スペーサーが、アントラサイクリンのＣＢカルボニ ル位とアントラサイクリンの糖部分とから成るグループから選ばれる部位に、ア ミノ基によって付着する請求項３６の前駆薬。

３７、キチン・オリゴマー誘導体が、負に帯電した基とアントラサイクリンと共 有的に結合することを可能にする反応基を持つ、ｎが１から１０である［　Ｇ　 Ｉ　ｃ　Ｎ　Ａ　ｃ　ｌ　＊を含んでいる請求項３５の前駆薬。

３８、負に帯電した基が硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸塩、または、ホスホ ン酸塩を表わす請求項３８の前駆薬。

３９、負に帯電した基の数が１から１０である請求項３８の前駆薬。

４０、　キチン・オリゴマー・スペーサーが、ジスルフィド、千オニステル、イ ミド、ハロゲン、アミン、カルボキシル、エステル、チオールおよびアルコール の基から選ばれる活性基によって、薬剤と共有的に結合している請求項３５の前 駆薬。

４１、反応基が、ジスルフィド、チオエステル、イミド、ノーロゲン、アミン、 カルボキシル、エステル、チオールおよびアルコールの基から選ばれる請求項３ ８の前駆薬。

国際調査報告

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．患者の標的組織の位置で、前駆薬をインビボに活性化する方法であって、 ａ．アクチペータを標的決定成分と複合させたアクチペーター標的決定成分複合 体を投与し、 ｂ．複合体のアクチペータによって活性薬剤に変換される前駆薬を投与すること から成り、標的決定成分は、標的組織にたいして親和性を有し、アクチペータは 、患者の循環系には本質的に見られない活性である、前駆薬を活性薬剤に変換す る活性を有し、上記アクチペータは、循環系中に天然にはほとんど存在しない基 質に作用し、本質的に細胞毒性を有さないものであり、上記アクチペータは標的 決定成分に結合しており、前駆薬は、アクチペータの活性による修飾によって、 標的組織にたいして作用する機能薬剤となり、さらに、アクチペーター標的決定 成分複合体と前駆薬は、患者にたいして本質的に非免疫原性である該方法。
2. ２．アクチペータが酵素活性を有する請求項１の方法。
3. ３．標的決定成分が抗体である請求項１の方法。
4. ４．標的決定成分が抗体フラグメントである請求項１の方法。
5. ５．標的決定成分がホルモンである請求項１の方法。
6. ６．標的決定成分がリガンドである請求項１の方法。
7. ７．標的決定成分がサイトカインである請求項１の方法。
8. ８．標的決定成分が抗原である請求項１の方法。
9. ９．患者がヒトであり、標的決定成分が、ヒト・モノクローナル抗体、非ヒト成 分によって付与された抗原特異性を有する、ヒト成分から主として成るキメラ・ モノクローナル抗体、天然ホルモン誘導体または天然ホルモンの類似体、ヒトあ るいはヒトの近縁生物種から得られた抗原、及び、遺伝工学的に生産されたまた は合成によるヒト由来成分の類似体から成るグループから選ばれる請求項１の方 法。
10. １０．アクチペータが、酵素または触媒活性を有する抗体である請求項２の方法 。
11. １１．酵素活性が、ヒドロラーゼ、トランスフェラーゼ、酸化還元酵素、リガー ゼ、イソメラーゼ及びリアーゼから成るグループから選はれる酵素の活性である 請求項１０の方法。
12. １２．酸秦活性が、ホモ二官能性架橋剤、ヘテロニ官能性架橋剤及び蛋白修飾性 試薬から成るグループから選ばれる結合剤によって標的決定成分に結合している 請求項１０の方法。
13. １３．酵素活性が、ヒト由来のものか、または、進化の発達段階を通じて高度に 保存されており、本質的にヒト酸素活性と同じであり、ヒトにたいして非免疫原 性である下等生物種由来の構造のものである請求項１０の方法。
14. １４．前駆薬が、薬理学的活性、アクチペータによって開裂可能な構造及び薬理 学的活性の発現を妨げる構造を含む請求項１の方法。
15. １５．前駆薬が、アクチペータの活性による変換によって活性薬剤になる多様な 成分を含む請求項１の方法。
16. １６．薬理学的活性が細胞毒性剤のものである請求項１４の方法。
17. １７．薬理学的活性が抗微生物物質のものである請求項１４の方法。
18. １８．薬理学的活性が血管拡張剤のものである請求項１４の方法。
19. １９．薬理学的活性が、放射線撮影画像または核磁気共鳴画像を生成するまたは 強調する物質のものである請求項１４の方法。
20. ２０．薬理学的活性が酵素活性である請求項１４の方法。
21. ２１．薬理学的活性が、標的組織の細胞によって取り込まれ、細胞内で活性化さ れる前駆薬のものである請求項１４の方法。
22. ２２．薬理学的活性が生物反応修飾剤のものである請求項１４の方法。
23. ２３．薬理学的活性が有毒物質のものである請求項１４の方法。
24. ２４．アクチペータがリゾチームである請求項１の方法。
25. ２５．アクチペータがリゾチームであり、アクチペータによって開裂できる構造 がキトオリゴマーである請求項１４の方法。
26. ２６．薬理学的活性の発現を妨げる構造が、薬剤が標的組織の細胞の原形質膜を 通過して細胞内の活性化部位に移るのを妨げるか、その薬理学的活性が細胞表面 の受容体と効果的な相互作用をするのを妨げるか、または、一旦活性化されると 、直接または一連の従属反応を通じて、近傍の細胞機能を損なう薬理学的活性の 細胞内活性化を妨げる機能を有する請求項１４の方法。
27. ２７．前駆薬を繰り返し投与する請求項１の方法。
28. ２８．アクチペーター標的決定成分複合体を繰り返し投与する請求項１の方法。
29. ２９．アクチペーター標的決定成分複合体を標的組織に結合させることができ、 非結合の複合体を、前駆薬の投与前に患者から排除することができる請求項１の 方法。
30. ３０．アクチペーター標的決定成分複合体が、体外的手段によって排除される請 求項２９の方法。
31. ３１．リゾチームをアクチペータとして含むアクチペーター標的決定成分複合体 。
32. ３２．標的決定成分がヒト・モノクローナル抗体である請求項３１のアクチペー ター標的決定成分複合体。
33. ３３．細胞の取り込みを妨げる開裂可能な分子を含む抗癌剤を含む前駆薬。
34. ３４．キチン・オリゴマー・スペーサーによって誘導体化される抗癌剤を含む請 求項３３の前駆薬。
35. ３５．抗癌剤がアントラサイクリンである請求項３４の前駆薬。
36. ３６．アントラサイクリンがドキソルビシンである請求項３５の前駆薬。
37. ３７．キチン・オリゴマー・スペーサーが、アントラサイクリンのＣ１３カルボ ニル位とアントラサイクリンの糖部分とから成るグルーブから選ばれる部位に、 アミノ基によって付着する請求項３６の前駆薬。
38. ３８．キチン・オリゴマー誘導体が、負に帯電した基とアントラサイクリンと共 有的に結合することを可能にする反応基を持つ、ｎが１から１０である（Ｇｌｃ ＮＡｃ）ｎを含んでいる請求項３５の前駆薬。
39. ３９．負に帯電した基が硫酸塩、リン酸塩、カルボキシル酸塩、または、ホスホ ン酸塩を表わす請求項３８の前駆薬。
40. ４０．負に帯電した基の数が１から１０である請求項３８の前駆薬。
41. ４１．キチン・オリゴマー・スペーサーが、ジスルフィド、チオエステル、イミ ド、ハロゲン、アミン、カルボキシル、エステル、チオールおよびアルコールの 基から選はれる活性基によって、薬剤と共有的に結合している請求項３５の前駆 薬。
42. ４２．反応基が、ジスルフィド、チオエステル、イミド、ハロゲン、アミン、カ ルボキシル、エステル、チオールおよびアルコールの基から選ばれる請求項３８ の前駆薬。