JPH02503088A - 抗体フラグメント複合体の調製方法 - Google Patents

抗体フラグメント複合体の調製方法

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JPH02503088A JP1502162A JP50216289A JPH02503088A JP H02503088 A JPH02503088 A JP H02503088A JP 1502162 A JP1502162 A JP 1502162A JP 50216289 A JP50216289 A JP 50216289A JP H02503088 A JPH02503088 A JP H02503088A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体フラグメント複合体の調製方法 １、主班夙分立 本発明は、広義には、物質をインビボで標的部位へる。より狭義には、本発明は その抗体フラグメントの酸化された炭水化物部分を通じて化合物と特異的に結合 した抗体フラグメント部分を含む複合体を調製するための新規方法を目指すもの である０本発明の方法に従って調製された合成物はインビボでの投与後に化合物 を標的部位に運搬するために有利に利用される。
２、光皿勿！且 ロッドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）らにより出された米国特許第４．６７１．９５ ８号は、アルデヒド基を生ぜしめるために抗体の抗原結合領域の外側に位置する 抗体の炭水化物部分を選択的に酸化すること、およびその結果生じたアルデヒド 基をさらｉアミン類、例えば−級アミン、二級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド 、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジンまたはセミカルバジドと反応させる ことによって化合物を抗体に部位特異的に共有結合させ、結合していない抗体と 実質的に同等の免疫特異性を有することを特徴とする抗体−化合物複合体を生成 させるための方法を記載している。
１９８６年３月５日公開のヨーロッパ特許出願番号８５４０１６９５．３は、金 属イオンと対合した相溶性キレータ−が抗体の抗原結合部位の外側に位置する抗 体分子の酸化された炭水化物部分に該キレータ−のアミノ基を通じて共有結合し ているような水溶性の抗体−金属イオン複合体を調製する方法、および該複合体 からなる合成物を記載している。この抗体−金属イオン複合体は（１）複合体を 形成していない抗体分子と免疫特異性が事実上同等で（２）インビボでの投与に 適合するように水溶性であることを特徴とする。
１９８６年３月２６日公開のヨーロッパ特許出願番号８５４０１７７６、１は、 治療薬が直接あるいはリンカ−を介して抗体の抗原結合領域の外側に位置する抗 体分子の酸化された炭水化物部分とアミノ基で結合しているような水溶性の抗体 −治療薬複合体の調製方法、および該複合体からなる合成物を記載している。こ の抗体−治療薬複合体（１）複合体を形成していない抗体分子と免疫特異性が事 実上同等で（２）インビボでの投与に適合するように水溶性であることを特徴と する。
上記参考文献に記載された方法は、抗体−化合物複合体を形成するための、抗体 分子全体あるいは予めつ（られた抗体フラグメント、例えば半分の抗体分子（す なわち重鎮、軽鎖１本づつの１対）、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２またはＦａｂ”フ ラグメントのいずれかと化合物との部位特異的な結合に関するものである。従っ て、従来の方法によれば、抗体フラグメント複合体を形成するために、予め作成 された抗体フラグメントが化合物に連結される。
これに対して、本方法は抗体合成物の開裂に関わるものであり、その抗体合成物 は化合物、リンカ−１またはリンカー−化合物中間体に結合した抗体からなる。
ここにおいてその結合は完全な抗体の酸化された炭水化物部分に部位特異的であ る０本発明による抗体合成物の開裂は抗体フラグメント合成物を生成する０本発 明は、ここに明らかにされた方法にしたがって調製した抗体フラグメント複合体 が、インビボで投与された場合、従来の複合体とは有意に差異のある挙動を示し 、さらに生体内部位への標的を定めた運搬に利用するのに好都合なインビボの生 体分布を示すという驚くべき発見に基づいている。
３、主班■翌１ 本発明は水溶性抗体−フラグメント合成物の新規調製方法ならびに該方法により 調製されたユニーククラス抗体（Ｆａｂ”）２フラグメント合成物を与えるもの である。
驚くべきことには、本発明の方法により調製された抗体フラグメント合成物は、 インビボで投与された場物と比較して、標的を定めた運搬により優れた挙動を示 す。したがって、本合成物は治療や診断に適用される種々広範な化合物を標的部 位に運搬するのに大変有用である。
そのもっとも広範な局面において、本発明は抗体化を与えるものであり、以下の 部分からなる：抗体の抗原結合領域の外側に位置する該抗体の酸化された炭水化 物部分との共有結合によって化合物（リンカ−中間体）と結合した抗体から成る 可溶性抗体化合物複合体（抗体−リンカ−中間体）を活性チオールプロテアーゼ 酵素と反応させて抗体（Ｆａｂ’）ｚ化合物複合体（抗体（Ｆａｂ’）ｚ−リン カ−中間体）を生成させる、さらに該複合体は（ａ）複合体を形成していない抗 体と事実上置等の免疫特異性を有することおよび（ロ）その抗体（Ｆａｂ’）ｚ 化合物複合体（抗体（Ｆａｂ’）ｚ−リンカ−中間体）がインビボ投与に適合す るように水溶性であることを特徴とする。
本発明はまた新規抗体（Ｆａｂ’　）　ｚ合成物および該合成物を種々の細胞性 疾患の治療や診断処置に利用する方法も与えるものである。
４、Ｚ国刈ｉ単癲」【吸 本発明は、以下に述べる発明の詳細な説明、特定の実施態様の実施例、および添 付の図を参照することによってより完全に理解することができよう。これらの図 において： 第１図（Ａ−Ｂ）は、８７２．３抗体複合体のインビトロでの結合活性のグラフ である。第１図Ａはここで述べた反応計画にしたがって調製されたＢ７２．３　 （Ｆａｂ”）ｔ−リンカ−中間体および従来法で調製されたＢ７２．３（Ｆａｂ ”）２フラグメントの結合活性を示す。第１図Ｂは全８７２．３リンカ−中間体 および天然型金８７２．３抗体の結合活性を示す。
第２図は８７２．３全抗体および（Ｆａｂ”）２フラグメントの炭水化物部分を 表している。
５、主恩■詳亙星区班 本発明は、直接あるいはリンカ−を介して化合物と部位特異的に結合した抗体− （Ｆａｂ’）ｚフラグメントからなる水溶性抗体合成物を調製するための新規方 法を目指すものである。この抗体合成物はインビボで抗原部位に標的とする運搬 に有利に利用される。本発明は、記載の方法にしたがって調製した抗体合成物が 、インビボで投与された場合、従来法で調製された類似の合成物と比較して有意 に差異のある好都合な挙動および生体分布を示すという驚くべき発見に基づいて いる。
「抗体（Ｆａｂ’）ｚ　Ｊまたは「抗体（Ｆａｂ’）ｚフラグメン原結合活性お よび見かけの分子サイズまたは分子量において、ニソノフ（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ） らにより１９６０、Ａｒｃｈ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、３９：２３０で述べられたペプシン分解法を用いて得られた抗 体フラグメントと実質的に同等な抗体のフラグメントを含むものとする。本発明 の（Ｆａｂ’）ｚフラグメントは上記ニソノフらのペプシン分解法によっては得 られない。むしろそれらは予め活性化されたチオールプロテアーゼ酵素を用いて 抗体−化合物、抗体−リンカ−中間体または抗体−リンカー−化合物複合体を分 解することにより調製される。該チオールプロテアーゼ酵素にはここで述べる反 応計画におけるパパイン、キモパパイン、プロメライン、フィシン等を含むがこ れに限定されない。抗体（Ｆａｂ’）ｚフラグメントは本発明によれば遊離の（ Ｆａｂ”）ｔフラグメントとして存在するのではなく、むしろ抗体（Ｆａｂ’） ｚ−化合物複合体、抗体（Ｆａｂ’）、−リンカ−中間体または抗体（Ｆａｂ’ ）ｚ−リンカー−化合物複合体として存在する。
５．１．星製立法 抗体（Ｆａｂ’　）　ｚ−化合物複合体は、従来記載されている他のいかなる抗 体フラグメント合成物とも異なったユニーククラスの抗体フラグメント合成物を 結果として生せしめる方法によって調製される。
従って本発明によれば抗体（Ｆａｂ’）ｚ−化合物複合体は以下のように調製さ れる： 抗体−化合物複合体、抗体−リンカ−中間体、または抗体−リンカー−化合物複 合体は、有効量のチオールプロテアーゼと反応させ、抗体（Ｆａｂ’）ｚ−化合 物複合体、抗体（Ｆａｂ’）ｚ−リンカ−中間体、または抗体（Ｆａｂ’）ｚ− リンカー−化合物複合体を生成させる。好適なチオールプロテアーゼ酵素として は、パパイン、キモパパイン、プロメライン、フィシン等があるがこれらに限定 されない。チオールプロテアーゼ酵素はシスティンまたはジチオスレイトール、 メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミン等の低分子量のスルフヒドリル 還元剤との反応により活性化される。
実際は、抗体−化合物複合体、抗体−リンカ−中間体、または抗体−リンカー− 化合物複合体は、重量ベースでおよそ１−２０％の抗体合成物と等しい量の活性 化チオールプロテアーゼ酵素と反応させる。この反応混合液は、りん酸、くえん 酸、または酢酸緩衝液のようなおよそｐＨ５，０−７，０、望ましくはｐＨ５， ０−６，０の緩衝液を用いて緩衝化される。この反応混合液を温度およそ４−３ ７°Ｃで、通常はおよそ室温で（約２５゛Ｃで）インキュベートする。反応は、 例えば約１−３ａ＋Ｍのエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレ ート剤の存在下で行うのが望ましく、該キレート剤はチオ−ルプロテアーゼ酵素 の安定性を高める。
実際は、チオールプロテアーゼ酵素は、システィンまたはジチオスレイトール、 メルカプトエタノール、メルカプトエチルアミン等のスルフヒドリル還元剤との インキュベートにより予め活性化される。例えば、あるチオールプロテアーゼ酵 素は、５０ｍＭシスティン含有緩衝液に約１■／−の該酵素を溶解し、その反応 混合液を室温で約１時間インキュベートすることによって活性化することができ る。システィンは、ゲル濾過クロマトグラフィーによって除去することができ（ 「脱塩」）、さらに流出した活性化された酵素は抗体合成物を分解するために記 載の通り利用することが形成された抗体（Ｆａｂ’）ｚ合成物の分離を簡便かつ 容易にするために、酵素は、活性化を行う前に、アガロース、セファロース（商 標）またはセファデックス（商標）、ポリアクリルアミド、またはアガロース− アクリルアミドビーズのような基質へのアタッチメントによって固定化すること ができる。例えば、カルボニルジイミダゾール（Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎの“ＲｅａｃｔｉＧｅｌ　Ｐｉｅｒｃｅ″として市販されている） と反応させて活性化したアガロースビーズは、本反応計画に用いられるチオール プロテアーゼ酵素の固定化に使用することができる。
抗体−リンカ−中間体を出発物質として使用する場合、化合物は、有用な抗体（ Ｆａｂ’　）　ｚ−リンカ−化合物カー合成物に連結される。抗体−化合物複合 体または抗体−リンカ−化合物複合体を出発物質として用いる場合には、作成さ れた抗体（Ｆａｂ’）ｚ化合物複合体は様々なインビボでの応用に有用である。
本発明の方法を用いて調製した抗体（Ｆａｂ’）ｚ化合物等に免疫特異的である こと、および（２）それらがインビボ投与に好適であるように水溶性であること 、によって特徴づけられる。
本発明で用いられる抗体−化合物複合体、抗体−リンカ−中間体、および抗体− リンカー−化合物複合体は、ロッドウェルらにより出された米国特許第４，６７ １．９５８号、１９８６年３月５日公開のヨーロッパ特許出願番号８５４０１６ ９５．３、および１９８６年３月２６日公開のヨーロッパ特許出願番号８５４０ １７７６、１に記載の方法にしたがって調製される。
概説すると、抗体の抗原結合領域の外側に位置する抗体の炭水化物側鎖が、選択 的に酸化されるかまたは酵素的に修飾されて、アルデヒド基を生ずる。その結果 生じたアルデヒドはアミン類（すなわち１級アミン、２級アミン、ヒドロキシル アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、フェニルヒドラジン、セミカルバジドまたは チオセミカルバジドの様なアンモニア誘導体）と反応して、シフ塩基または還元 型シフ亨基（すなわち、イミン、エナミン、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒ ドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾンまたはこれらの還元型）を生成 する。
５．１．１．化学班酸上立抜 抗体分子の炭水化物部分の酸化がアルデヒド基の生成をもたらす。過よう素酸、 パラ過よう素酸、メタ過よう素酸ナトリウム、メタ過よう素酸カリウムのような 様々な酸化剤を使用することができる。このような酸化剤のうちここに挙げた酸 素酸及び塩は二次的または望ましくない副反応が起こりにくいので好適である。
一般論としては、ジャクソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）の１９４４．　Ｉｎ６５＋　０ ｘｉｄａｔｉｏｎ　ｆｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅ＋ｗｉｓｔｒｙ、　Ｖｏｌ、 １（Ｗｉｂｅｒｔ。
ｅｄ、）　Ａｃａｄｅａ＋ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｅｅ　Ｙｏｒｋ、　ｐ、３ ６７を参照のこと。
これらの酸化剤による抗体の酸化は公知の方法によって行うことができる。酸化 に際して、抗体は一般に水溶液の形で使用されるが、その濃度は一般的には１０ ０■／−以下、望ましくは１から２０■／ｄである。ここに挙げた酸素酸または 塩を酸化剤として用いるとき、一般に水溶液の形で用いられ、その濃度は一般的 には０．００１から１０ｏ＋Ｍ、望ましくは１．０から１０ｍＭである。ここに 挙げた酸素または塩の総量は抗体の種類によるが、一般的には過剰量、例えば酸 化される炭水化物の２倍から１０倍量を用いる。しかしながら、最適量は通常の 実験操作によって決定することができる。
ここに挙げた酸素酸または塩を用いた抗体の酸化過程においては、ｐＨはおよそ ４から８に、温度は０から３７°Ｃに、さらに反応時間は約１５分から１２時間 に最適範囲がある。
ここに挙げた酸素酸または塩を用いて抗体を酸化する間、糖タンパクの過剰な酸 化を防ぐため、光を排除することが望ましい。
５．１．２．鼠案豹１化方法 抗体分子の炭水化物部分の酸化は、酵素ガラクトースオキシダーゼ（クーパー（ Ｃｏｏｐｅｒ）ら、１９５９．　Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｅｋ、％３４：４４５−４４８）によって行うこともできる。
抗体は水溶液で使用されるが、その濃度は一般的には０．５から２０■／ｄであ る。酵素は一般に５から１００ユニツト／ｄ溶液で、ｐＨ５，５から８．０の範 囲で使用される。酵素反応へのｐＨ５基質濃度、緩衝液、及び緩衝液濃度の影響 は、クーパーらの上記論文に報告されている。
５．１．３．漣１Ｌ己とｂＬ化 抗体複合体（または抗体リンカー−中間体）は、抗体の酸化された炭水化物部分 を、１級アミン、２級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、 フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド類からなる一部 から選択された利用可能なアミン部分を有する化合物、リンカ−１またはリンカ ー−化合物と反応させることにより産生される。直ちに生じる生成物は、最初の 付加生成物から水分子が脱離したことに起因する炭素−窒素二重結合を有する： アルデヒドとヒドラジドとの反応に関する一般論は、マーチ（Ｍａｒｃｈ）の１ ９８’Ｌ　Ｉｎ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅ＋＋＋１−ｓｔｒ ｙ：　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒ ｅ、　ＭｃＧｒａｗＨｔｌｌ　Ｃｏ、、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　ｐｐ、８２４− ８２５を参照のこと。
約０．５から２０■／Ｉｄの濃度の酸化された抗体の溶液を、化合物、リンカ− １またはリンカー−化合物と混合しく反応性アミン類と抗体アルデヒドのモル比 は約１から約１０，０００の範囲である）、その溶液をおよそ１時間から１０時 間インキュベートする。好適な温度はＯから３７°Ｃであり、ｐＨは約６から８ までをとることができる。
抗体と化合物、リンカ−５またはリンカー−化合物との間に抗体−複合体（また は抗体−リンカ−中間体）が形成されたのち、それらは任意にソジウムシアノボ ロハイドライドまたはソジウムボロハイドライドのような適当な還元剤で安定化 することができる。還元剤は通常、反応に供されるアルデヒド基に対して、約１ ０から１００倍当量過剰まで当量過剰に添加される。概説としては、ジェントフ トＣＪｅｎ　ｔｏｆ　ｔ）およびデアボーン（Ｄｅａｒｂｏｒｎ）の１９７９． 　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、　２５４：４３５９を参照の酸化された炭水化物部 分に該化合物のアミン部分を通じて直接結合することができ、抗体−化合物複合 体を生成する。
あるいはまた、化合物は部位選択的に、抗体の酸化された炭水化物部分に、少な くとも二つの反応性基、一つは抗体の酸化された炭水化物部分と反応するアミン 部分であり、一つは化合物と反応する、を有する中間リンカ−を通じて結合する ことができる。リンカ−は、なんらかの相溶性化合物を含有するが、その抗体（ または化合物）との反応が抗体の反応性及び選択性に悪影響を与えることのない よう選択されねばならない。さらに、もし連結された化合物が治療薬であるなら ば、このような結合は治療薬の活性を損なってはならない、酸化された抗体との 反応に適したリンカ−には、１級アミン、２級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド 、ヒドロキシ〉レアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミ カルバジド類からなる一部から選択されたアミンを含むリンカ−がある。このよ うな反応性官能基は、リンカ−の構造の一部として存在することもあり、またこ のような基を含まないリンカ−を化学修飾することにより導入されることもある 。
化合物は、リンカ−が抗体分子に連結される前または後に、リンカ−に連結する ことができる。ある種の適用においては、そのリンカ−が化合物と結合していな いような抗体−リンカ−中間体をまず第一に作成することが望ましい。特別の適 用に応じて、特定の化合物をさらに共有結合または配位結合によって該リンカ− に連結することができる。
化合物との複数の結合部位を有する「ブランチドリンカー」は、さらに興味深い 。複数部位リンカ−については、抗体または抗体フラグメントとの単一の共有結 合により、多数の部位で化合物を結合することのできる抗体−リンカ−中間体を 生成させる。
他の実施態様においては、種々の機構によって開裂しやすい開裂可能なリンカ− を使用することができる。
補体系の酵素、ウロキナーゼ、テイッシュプラスミノーゲンアクチベータ、トリ プシン、プラスミン、またはその他のタンパク質分解活性を有する酵素によって 開裂しやすいペプチドリンカ−が使用できる。本発明の一方法において、化合物 は補体によって開裂しやすいリンカ−で連結される。次に補体を活性化すること のできるクラスから選択された抗体を、本発明の抗体（Ｆａｂ’）ｚリンカ−化 合物と共に投与する。このように投与された第二の抗体が補体カスケードを活性 化し、標的部位で抗体（Ｆａｂ”）よ−リンカ−化合物複合体から化合物を遊離 させる。本発明の他の実施態様にしたがって、化合物はウロキナーゼ、テイッシ ュプラスミノーゲンアクチベータ、プラスミン、トリプシン、または同様なタン パク質分解活性を有する酵素によって開裂しやすいリンカ−で連結される。
さらに他の実施態様において、化合物と抗体の距離を最適にするようにリンカ− を構築することが必要であろう。これは、以下のような一般構造のリンカ−を使 用することによって成し遂げられる。
讐−（ＣＨｚ）ｎ−Ｑ ここにおいて−は−ＮＨ−ＣＨ２−または−ＣＵｔ−のいずれか； Ｑはアミノ酸、ペプチド；そして ｎはＯから２０までの整数である さらに他の実施態様において、リンカ−はスペーサー成分と開裂成分からなるこ とがある。スペーサー成分は、開裂成分が開裂を起こす酵素に近づき易いように 、開裂成分の位置を抗体分子の中心部から離れたところに定めるのに役立つ。
上記の“枝分れしたリンカ−”のいくつかはスペーサー成分としての役割を果た すことができる。
うな化合物を抗体分子に結合させるために、相溶性キレータ−であるリンカ−が 利用される。「相溶性キレータ−（ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ　ｃｈ、ｅｌｅｔｏｒ ）　Ｊという用語は、（１）電子を供与して共有結合によって金属イオンと結合 することができ、キレートあるいはキレート化複合体と呼ばれる構造をつくり、 さらに（２）金属イオンとキレートする能力を失うことなく、また抗体分子の免 疫特異性を損なうことなしに、抗体と共有結合するのに適しレータ−には、ガン ソーらにより記載された（１９８１゜Ｊ、ＨｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃＣｈｅｍ、 　１８：２９７）のようなジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレンジアミン テトラ酢酸、ジメルカプトこはく酸、２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸 、メタロチオニインおよびクリブタテスの誘導体を含むがこれに限定されなυ） 。
本発明にしたがう、抗体の酸化された炭水化物部分との反応に好適な相溶性キレ ータ−には、１級アミン、２級アミン、ヒト長ジン、ヒドラジド、ヒドロキシル アミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド類から ある一部から１択されたアミンを含むものがある。このような反応性官能基はキ レータ−の構造の一部として存在することがあり、またはこれらの基を有しない キレータ−へ適当な化学作例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ ）は酸化さ・れた炭水化物と容易に反応する適当なアミン部分を欠いている。し かしながら、ＤＴＰＡの混合無水物のアミンを含む誘導体、これにはＰ−アミン アニリン−ＤＴＰＡ、ヒドラジド−ＤＴＰＡ、フェニルヒドラジド−ＤＴＰＡ、 チオセミカルバジド−ＤＴＰＡ、ポリエチレンイミン−ＤＴＰＡ、　ｐ−フェニ レンジアミン−ＤＴＰＡ、　ＤＴＰＡモノ〔（４−アミンフェニル）メチルコア ミドを含むがこれに限定されない、あるいはＤＴＰＡのアミン酸を含む誘導体、 これにはα−Ｎ−ＤＴＰＡ−Ｌ−リジン、グリシル−チロシル−リジン−ＤＴＰ ＡおよびＬ−リジンベンジルエステル−ＤＴＰＡを含むがこれに限定されない、 のような様々な適当な誘導体を化学修飾によって生成させることができる。
本発明の抗体（Ｆａｂ”）を化合物複合体を調製するために抗体合成物に連結さ れる化合物は、意図する適用目的（すなわち、キリ゛ング、細胞増殖の予防、ホ ルモン療法、標的の造影、または遺伝子療法）に応じて選択される。このような 化合物には例えば薬剤、毒素、毒抗真菌剤、抗マイコプラズマ剤等の）抗生物質 、抗ウィルス剤、代謝拮抗物質、増殖抑制剤または抗腫瘍薬、ホルモン、神経伝 達物質、ＤＮＡ、放射線不透過性色素、（ｌ−１２３、ｌ−１３１、及び放射性 金属イオンの様なものを含む）放射性同位体、金属イオン、蛍光発生化合物、マ ーカー化合物、レクチン、および細胞膜透過性を変える化合物がある。
ヨーロッパ特許出願番号８５４０１７７６．１の第１表は、本発明で使用できる いくつかの治療薬を記載しており、ここに参照によって具体化される。しかしな がら第１表は、けっして網羅的な表であることを意味するものではない、最後に 、本発明の抗体（Ｆａｂ’）ｚ化合物複合体を調製するために、複数の組合せの 化合物を部位特異的に抗体合成物に結合することができる。
５．３五−生 いかなる抗原またはハブテンのいかなる決定因子に対しても指向する抗体は、本 発明に用いることができる。従来の抗体とモノクローナル抗体の両者が適する場 合には、モノクローナル抗体がいくつかの点で有利である。それぞれのモノクロ ーナル抗体は単一の抗原決定因子に特異的である。さらに、当業者広く知られる 技術を用いて大量の実質的に均一なモノクローナル抗体を効率よく経済的に生産 することができる。
ＩｇＧ、　　ＩｇＭ、およびＩｇＡを含むクラスの抗体は本発明の方法に使用で きる。
上記のように、いかなる抗体またはハプテンのいかなる決定因子に対しても指向 する抗体は、ここに述べた反応計画に使うことができる。このような決定因子に は、腫瘍および悪性腫瘍細胞；細菌、真菌類、ウィルス、寄生虫、マイコプラズ マ、組織適合性、分化、および他の細胞膜抗原；病原体表面抗原；毒素；酵素； アレ゛ルゲン；薬剤；いかなる生物学的に活性な分子等をも含むがこれに限定さ れない。いくつかの例においては、異なった決定因子と反応する複数のモノクロ ーナル抗体を組合せて使用することができる。
５．４ｊＬ１ 本発明の水溶性抗体（Ｆａｂ’　）　を化合物複合体は、種々のインビボの治療 や診断の適用に利用するのに好都合である。
インビボ投与は、水溶性抗体（Ｆａｂ’　）　ｚ化合物複合体からなる治療上有 効な合成物または診断に役立つ合成物を、ヒト血清アルブミンのような別のタン パクとともにまたは該タンパクなしで、血清または生理的食塩水を含むいかなる キャリアーであれその適当なキャリアー中で使用することに関わるものである。
抗体（Ｆａｂ’）ｚ複合体の投与量は、通常の手法のうちの一つにより容易に決 定することができ、結合した化合物の性質や複合体の意図する目的によって変化 する。
投与経路は一般に非経口であり、静脈内経路による投与が一般に望ましい。
治療上の通用は、一般に、その化合物が治療薬であるような抗体（Ｆａｂ’）ｚ 化合物複合体の有効量を投与することによる様々な細胞性疾患の治療に関するも のである。細胞性疾患に関連した特定の抗原や抗原決定因子に免疫特異的かつ免 疫反応性であるという抗体（Ｆａｂ’　）　ｚの性質により、該合成物は、特定 の細胞、組織、器官、またはその抗原決定因子を有する他のいかなるインビボ部 位へも治療薬を運搬するために、理想的に適したものとなる。従来法で調製され た抗体フラグメント複合体とくらべて長い生物学的半減期をゆうするという抗体 （Ｆａｂ″）２化合物複合体の性質により、標的部位に治療薬が持続することが 望ましいときは本合成物はインビボでの治療薬の運搬に特に適したものとなる。
治療に適用するためには、本発明の抗体（Ｆａｂ’　）　２合成物に結合させる 化合物は、意図する目的に応じて選択された治療薬である。上記５６２節に述べ た様な治療薬を使用することができる。いくつかの例において治療薬は、ｌ−１ ３１、Ｙｔｔｒｉｕｍ−９０、Ｃｏｐｐｅｒ−６７、Ｒｈｅｎｉｕｍ−１８６、 Ｒｈｅｎｉｕｍ−１８８、Ｉｒｏｎ−５９、Ｂｉｓｍｕｔｈ−２１２、Ｌｅａｄ −２１２等のような放射性同位体である。
この適用に用いられるように「細胞性疾患」という用語は、癌、腺腫、過形成等 のようなあらゆる新生物；移植体対非移植体疾患（たとえば骨髄移植後）を含む ある種の免疫性疾患；、免疫抑制疾患（たとえば後天性免疫不全症候群（ＡＩＤ Ｓ）、腎臓または骨髄移植後）：アテローム性動脈硬化斑の形成に関わる疾病等 のような心臓血管系疾患；ウィルス、細菌、真菌類、マイコプラズマ、または寄 生虫の作因により引き起こされる感染等を含むものとする。
診断上の適用はおもに、検出可能な十分量の抗体（Ｐａｂ’　）　を化合物複合 体を投与すること、または適当な時間枠のなかで標的組織にその複合体を局在さ せることによって、特定の組織または細胞性疾患の造影を行うことに関わる。診 断に有用な造影を行う目的で、抗体（Ｆａｂ’）ｚ化合物複合体は、本発明の方 法にしたがってリンカ−を通じて連結されたｌ−１２３のような非金属の放射性 同位体である化合物を含むことができる。あるいは、診断に有用な造影を行うた めの抗体（Ｆａｂ”）を化合物複合体は、本発明の方法にしたがって相溶性キレ ータ−であるリンカ−に連結された金属イオンである化合物を含むことができる 。したがって、診断上に適用するための合成物は、望ましくは抗体（Ｆａｂ’　 ）、キレータ−金属イオン複合体である。該複合体投与の用量や他の側面は、通 常の技法により容易に決定される。
多様な金属イオンが抗体（Ｆａｂ’）ｚ金属イオン複合体を調製するために好適 であり、これにはＩ　ｎｄ　ｉ　ｕｌｌ−１１１、Ｔｅｃｂｎｅｔｉｕａ＋９９ ｍ、　Ｃｏｐｐｅｒ−６７等のような放射性同位体、Ｓｃａｎｄｉｕｍ−４３、 Ｓｃａｎｄｉｕｍ−４７、Ｉｒｏｎ５２、Ｃｏｂａｌ　ｔ−５５、Ｇａｌｌｉｕ ｍ−６８のような陽電子放出型金属イオン、Ｉｒｏｎ−５４、Ｉｒｏｎ−５６、 Ｉｒｏｎ−５７、Ｉｒｏｎ−５８、Ｇａｄｏｌｉｕｍ−５７、Ｍａｎｇａｎｅｓ ｅ−５５等のような核磁気共鳴分光法により検出可能な非放射性常磁性金属イオ ンを含む。
造影されうる組織および細胞性疾患には、いかなる充実性新生物；リンパ節、上 皮小体、肺臓および腎臓のような特定の器官；炎症および感染部位（たとえばこ のような部位のマクロファージ）；心筋梗塞または血栓症（新抗原決定因子また はフィブリン、血小板）も含まれる。
５．５．ｉ自トエく」４孕」〉！−χＪ−−イヒ、１昏グ１ログ１４連治川体の 抗原結合領域の外側に位置する抗体の炭水化物部分に直後またはリンカ−を介し て化合物を結合している本発明の抗体（Ｆａｂ’）ｚ化合物複合体は、複合体を 形成していない完全な抗体分子と実質的に同様な免疫特異性を有している。さら に、インビボ投与した場合、本発明の抗体（Ｆａｂ’　）　ｚ化合物複合体は、 予め作成された（Ｆａｂ’　）　ｚフラグメントを用いる従来法で調製した類似 の（Ｆａｂ’）ア複合体と比較して、たとえば腎臓、肝臓、または肺臓の通過で は、循環の中でより長く持続し、早急には排泄されない。抗体（Ｆａｂ”）を複 合体が治療および／または診断に適用するためにインビボでの標的を定めた運搬 系に利用される場合には、体内での持続時間または滞留時間がより長く、意図す る標的抗原部位に対し該複合体が特異的であることは、重大な利点を与えるもの である。
以下の実施例は例証の目的でのは提示されるのであって、本発明の範囲を限定す るためのものではない。
以下の実験は、本発明の方法にしたがって調製した、放射性同位体で標識した抗 体（Ｆａｂ’）ｉフラグメント−キレータ−金属イオン複合体が、実験動物に投 与したとき、類似の従来の複合体に比べて顕著に生体分布を増加させたことを示 す。
これらの実験に使用された抗体は、シュロム（ＳｃｈｌｏＩｌｌ）らにより出さ れた米国特許第４．５２２，９１８号（ヌティ（Ｎｕｔｔ）ら、１９８２．　Ｉ ｒ＋ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２９：５３９−４５参照）に記載のハイブリドーマ 細胞系統ＡＴＣＣ番号８７２．３から得られた、ヒト乳ガンおよび結腸ガンと反 応するモノクローナル抗体（ＩｇＧ＋）である（今後はｒＢ７２．３抗体」とす る）。
一連の実験において、８７２．３抗体（Ｆａｂ’）ｚ−キレータ−金属イオン複 合体は以下のような発明の方法に従って調製した： 功１ＬＮ （１）抗体−キレータ−中間体はロッドウェル（Ｒｏｄｔｍｅｌｌ）概説すると 、抗体の炭水化物部分は、暗黒下、りん酸で緩衝化した食塩水（０，１５Ｍ　Ｎ ａＣ１１０，０１Ｍりん酸ナトリウムＳ　ＰＢＳ）中、ｐ）Ｉ６．０で氷冷下１ 時間、１１０３０ｉ　ＮａＩＯ４とインキュベートすることにより酸化した。抗 体はｐＨ６，０のＰＢＳで平衡化したセファデックス（商標）　Ｇ−２５カラム を用いて精製した。
酸化された炭水化物部分を有する抗体は次に１時間室温で、キレータ−、ジエチ レントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の誘導体、すなわちグリシルチロシルリ ジルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＧＹＫ−ＤＴＰＡ）とＧＹＫ−ＤＴＰＡ の一千当量過剰下でインキュベートした。
ソジウムシアノボロハイドライド（Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃｈｅ閣１ｃａｌＣｏ、Ｉ ｎｃ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ）を最終濃度１０＋＋ｉＭとなるように 添加した。反応液はさらに４時間インキュベートしたのち、多少の変更を加えた ＰＢＳに対して４℃で透析するか、またはセファデックスＧ−５００カラムに通 した。
（２）　　Ｂ７２．３−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ抗体−キレータ−中間体は、予め活性 化したプロメラインでバラム（Ｐａｔｈａｍ）により概説された方法（１９８３ ，Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　ｔｌ：２８９５−０２）に従って分解し、Ｂ７２．３ （Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ中間体を作成した。プロメライン（１■／ｄ ）は、３ＩＩＩＭ　ＥＤＴＡを含む酢酸緩衝液（１００ｍＭ酢酸、ｐＨ５，５） 中で５０ＩＩＩＭシスティンと、約１時間室温でインキュベートすることにより 活性化した。システィンは、セファデックスＧ−２５での脱塩によって活性化反 応液から除去された。　Ｂ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡは、次に 、酢酸緩衝液中で、活性化プロメライン（抗体−リンカ−中間体の重量に基づい て５％）によって分解した０分解反応は分子篩いクロマトグラフィー（ＳＥＣ） 高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いてモニターした。
得られた８７２．３（Ｆａｂ’）　ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡは、プロティンＡカラ ム（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ　Ｐｒｐｔｅｉｎ　Ａ、　ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、’Ｒｔｃｂ＋５ｏｎｄ、　ＣＡ）を用いて、さらにｐ）１６．０の ＰＢＳでゲＭＤ）を用いて精製した。生成物はドデシル硫酸ナトリウムポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＯＳ−ＰＡＧＥ）およびＨＰＬＣ−（ＳＥＣ）を用 いて分析し、およそ１００．０００ダルトンの分子量を有するＢ７２．３（Ｆａ ｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡであると同定した。
（３）　　ＢＴ２．３（Ｆａｂ’）ｚ金属イオン複合体は、さらにＢＴ２．３（ Ｆａｂ’　）　２−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ中間体を”ＪｎＣｌｓ（１ｍｃｉ）（Ｎｅ ｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）とＰＢＳ　ｐＨ ６，ｏ中で約１時間３７℃でインキュベートすることにより作成した。つ（られ たＢ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−”’Ｉｎは、ＴＳＫ−Ｇ３０ ００Ｓ−カラムを用いたＨＰＬＣによって遊離のｌｌｌＩｎから分離した。
別の一連の実験においては、８７２．３抗体（Ｆａｂ’　）　ｚ−キレータ−金 属イオン複合体は以下のように発明に従って調製した。
方法Ｊ− （１）抗体−キレータ−中間体はロッドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）らの上記の方 法を用いて上述のように作成した。
（２）抗体−キレータ−金属イオン複合体は、さらに８７２．３−ＧＹＫ−ＤＴ ＰＡ中間体の”’ＩｎＣｌ５（１ｏ＋ｃｉ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇ−１ａｎｄ　Ｎｕ ｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）とＰＢＳ　ｐ）１６．０中で１時間３７ °Ｃでのインキュベートにより作成した。
（３）　　Ｂ７２．３　（Ｆａｂ’　）　ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−”　’　Ｉｎ 複合体は、ＥＤＴＡを緩衝液から省く以外は上述の通りに予め活性化したプロメ ラインで分解した。Ｂ７２．３　（Ｐａｂ’　）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−１１１ Ｊｎは、ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷ　ＨＰＬＣカラムを通すことによって精製した 。
類似の従来の８７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−キレータ−金属イオン複合体もまた下 記のように調製した：（１）　　８７２．３抗体は予め活性化したプロメライン でバラム（Ｐａｒｈａａ＋）の上記の一般法に従って分解し、Ｂ７２．３（Ｆａ ｂ’）ｚフラグメントを作成した。Ｂ７２．３（Ｆａｂ’）ｚフラグメントは、 Ｆｃフラグメントおよびいかなる残存する完全な抗体からも、プロティンＡおよ び上述のようなゲル濾過カラムを用いて分離された。
（２）　　Ｂ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ中間体は、さらにＢ７ ２．３（Ｆａｂ”）２フラグメントの炭水化物部分を上記ロッドウェル（Ｒｏｄ ｗｅｌｌ）らの方法にしたがって酸化し、そのようにして形成されたアルデヒド 基をキレータ−誘導体ＧＹＫ−ＤＴＰＡの反応性アミンと反応させることにより 作成された。８７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ中間体は、次に上述 のようにソジウムシアノボロハイドライドとともにインキュベートすることによ り安定化された。
（３）　　Ｂ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ中間体（１００ｕ　ｇ ）は、１＋＋１ｎＣｈ（１ｍｃｉ）（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ 、　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）とＰＢＳ　ｐＨ６，０中で１時間３７℃でインキュ ベートした。
このようにして作成された８７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−ｌｌ ｌＩｎ複合体は、ＴＳＫ−Ｇ３０００Ｓ−カラムを用いたＨＰＬＣによって精製 された。
本発明に従って、および従来法に従って調製された８７２．３（Ｆａｂ’　）　 ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−”　’　Ｉｎ複合体は、分子篩いクロマトグラフィー（ ＳＥＣ）　ＨＰＬＣを用いて分析した。両タイプの複合体の５ＥＣ−ＨＰＬＣは 、これらの化合物が実質的に同一の大きさを持ち、均一であることを示した。
完全な８７２．３抗体−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−”　’　Ｉｎ複合体も比較のために 、上述のように、酵素分解せずに調製した。
本発明に従って、および従来法に従って調製されたＢ７２．３（Ｆａｂ”）２金 属イオン複合体の生体分布を、完全な８７２．３金属イオン複合体と同様に、実 験動物へのインビボ投与にしたがって評価した。
一連の実験で、ヒト腫瘍移植片を担う雌ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスが、およそ ｌＸｌ０’のＬＳＩ７４Ｔ　（ＡＴＣＣ）ヒト結腸腺ガン細胞（０，２１ｄ）を 左後方脇腹に皮下注射することにより得られた。腫瘍がおよそ１０−１５ｍｍ　 Ｘ　１５−２０ｍｍとなったとき、２００ａｆの本発明のＢ７２．３（Ｆａｂ’ ）ｚ複合体（１３ｄｇ）、および従来法のＢ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ− ＤＴＰＡ−”　’　Ｉｎ複合体（１３ｄｇ）をそれぞれ３匹の腫瘍を有する、お よびコントロールとして３匹の腫瘍を持たないヌード（ｎｕ／ｎｕ）動物に静脈 注射した。完全なり７２ｔ３（Ｆａｂ’）ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−”’Ｉｎ複合 体（１３ｄｇ）も、比較のため、同様に２匹の腫瘍を担う、および３匹の腫瘍を 担わないヌード（ｎｕ／ｎｕ）動物に投与した。動物は、量的な生体分布データ を得るために注射後４日で解剖に供した。解剖時に、腫瘍は平均して１．１２± ０．５９ｇであった。腫瘍を有する動物で得られた結果を第１表に、腫瘍を持た ない動物で得られた結果は第２表に示す。
（来夏以下余白） 第１表 騙１シを担う獣中磐盃り土ｉ６　Ｂ７２．ユ鄭ｍ１ｔｙ、９暉−ＤＴ賀ｔ−１− 環１１合伴ヂどｔ住りト句肺　　　　　　１．０４±０．５８　　　　２．８１ ±０．２２　　　　０．７７±０．１９１１１１　　　　　　　１．２６　上０ ゜７２　　　　　　６−３４　上０゜６７　　　　　　０．８６　上０゜２１Ｊ ｌｆｌｉ　　　　　　　　２．５２±１．２１　　　　　２７．群±４．＄　　 　　　　１．田±０．９１ｆｉ　　　　　　　１１．８０　＋　５．７０　　　 　　１６８．９６　＋４１．１８　　　　　　１．７３　＋　０．７３則駄墓　 　　　　　　４．９３±３．２４　　　　　　６．１８±１．９９　　　　　　 ７．０８　±３．０７筋肉　　　　　０．９８±１．３３　　　　１．４０±０ ．２６　　　　０．２２±０．０４艇■哉 方法り吋届シうＬ 虫卦良　　　　　　　２．お上２゜０５　　　　　　０．ω±０．乾　　　　　 　３．３７　上２゜１１肺　　　　　　１．８１±０．３０　　　　０．２４± ０．０５　　　　２．４１±０．９８１ｆ！！１１　　　　　２．２４　”　０ ．５３　　　　　０．５４　＋　０．０９　　　　　２．６７　＋　１．０９ｆ ｌ　　　　　　　　４．５９±１．０２　　　　　　２．３３±０．υ　　　　 　　５．乾±０．９１詔　　　　　　２匹石０±６．２３　　　　　　１４．３ ７　上３゜９８　　　　　　４．８８±０．５２腫瘍　　　　　８．３９±２． ０３　　　　　０．Ｓ２±０．１４　　　　２０．６３±４．５５筋肉　　　　 　１．４０±１．４７　　　　０．１２±０．０２　　　　０．７０±０．３４ 世玲８本 岸吻ｎ勇Ｃ３，３＋　０．１０．９　　＋　０．１　　　　　　　６．１　　＋ 　１．２ａ値はｘ４：ｓ、Ｄ、、Ｎ　＝３を表す。
ｂ値はＸ±Ｓ、Ｄ、、Ｎ＝２表す。
Ｃ半減期（日改番戴注射直後から始めて解剖直前に終了した研究の間毎日の動物 全体の線量検定値に基づいて決定した第２表 腫瘍を持たない動物におけるＢ７２．３σａｂ’　）　ｚ−ＧＹＫ−１１ｒｒＰ Ａ−”　’　Ｉｎ複合体の生体骨ケ組織　　　　　本発明の　　　　　　　従来 法の　　　　　　　完全な器官：血液比釘４市ム虻り複合体　Ｂ７２．３（Ｆａ ｂ’）ｚ複合体　Ｂ７２沼複合体肺　　　　　　１．０５　＋　０．１９　　　 　３．０７　＋　１．３０　　　　０．６８　＋　０．１６牌臓　　　　　１． １５±０．４３　　　　　７．２４±２．９４　　　　　０．４６±０．１０肝 臓　　　　　３．４２±２．３２　　　　２５．２９±４．３６　　　　　０． ８１±０．６５腎臓　　　　　１１．９１±２．７６　　　　１９５．３１±１ ０７．３５　　　　０．６５±０．１８筋肉　　　　　２．０１±１．８１　　 　　１．７０±０．６５　　　　０．１１±０．０４組織 ％注射量／Ｌ 血液　　　　　１．９９±０．３５　　　　　０．０８±０．０３　　　　　８ ．４９±３．６１肺　　　　　　２．１１±０．５５　　　　０．２４±０．０ ４　　　　５．４３±１．５７牌臓　　　　　２，３０±０．９０　　　　　０ ．５５±０．０８　　　　　３．６３±Ｏ８金肝臓　　　　　６．６８±４．５ ２　　　　　２．０３±０．２６　　　　　７．０９±３．８６腎臓　　　　　 詔、３２±４．７２　　　　１４．１９±４．９８　　　　　４．９８±０．５ ９筋肉　　　　　３．５９±２．８４　　　　　０．１３±０．お　　　　　０ ．８５±０．１１同位体 半減期ｂ　　　３．１　上０゜２　　　　　０．８　　上０゜２　　　　　５． ８　　上０゜９ａ値はＸ±Ｓ、Ｄ、、Ｎ＝３を表す。
ｂ半減期（日改シ訟注射直後から始めて解剖直前に終了した研究の間毎日の動物 全体の線量検定値に基づいて決定し九明らかに示されているように、本発明の８ ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ金属イオン複合体の同位体半減期として表される平均残 留時間は、従来法で調製された類似の複合体より顕著に長い。さらに二つの異な った調製の抗体（Ｆａｂ”）２複合体の生体分布型は明らかに異なっている。と りわけ、本発明のＢ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ複合体は標的の腫瘍部位には、非常 に、より特異的に局在し、標的でない器官にはより特異性が低かった（組織器官 ：血液比参照）。
別の一連の実験において、ヒ）　ＬＳ１７４Ｔ腫瘍移植片を担う雌ヌードマウス （ｎｕ／ｎｕ）が、上記のように得られた。１または２匹の腫瘍を有する動物お よび２または３匹の腫瘍を持たない動物に、上記方法Ｂにより調製した本発明の Ｂ７２．３　（Ｆａｂ’　）　ｚＧＹＫ−ＤＴＰＡ−”　’　Ｉ　ｎ複合体３０ ０μ２、および３００μ！（８μｇ）の完全なり７２．３ＧＹＫ−ＤＴＰＡ−” 　’　Ｉｎ複合体（３ｐｇ　）　ＰＢＳ溶液を静脈注射した。動物は、注射後３ 日で解剖に供した。解剖時に、腫瘍は平均して１．１３±０．５４ｇであった。
腫瘍を持たないコントロールとして正常なりａｌｂ／ｃマウスを用いた。
腫瘍を有する動物で得られた結果を第３表に、腫瘍を持たない動物で得られた結 果は第４表に示す。
（来夏以下余白） 第３表 組織　　　　　本発明の　　　　　　完全な＝　：　’　　Ｂ７２．３（Ｆａｂ ’　　入１ユ亘註ゝ肺　　　　　　　　０．７４±０．０５　　　　　　０．６ ９膵臓　　　　　０．４４±０．０２　　　　　０．９５肝臓　　　　　０．４ ６±０．０４　　　　　１．４１腎臓　　　　１１．４４±１．２０　　　　　 ２．０３腫ｆＪｌｌ＆　　　　　　１．４０±０．０２　　　　　５．１１筋肉 　　　　　０．２６±０．０４　　　　　０．２７組織 ５且１１．会− 血液　　　　　２．９６±０．２９　　　　　４．８２肺　　　　　　　　２． ０８±０．０６　　　　　　　３．３２牌臓　　　　　１．３２±０．０６　　 　　　４．６０肝臓　　　　　１．３６±０．０２　　　　　６．７Ｂ腎臓　　 　　３３．７４±１．０１　　　　　９．７５１Ｉｌ瘍　　　　　４．１４±０ ．４８　　　　２４．６４筋肉　　　　　０．７８±０．０５　　　　　１．２ ９同位体 菫　　　２．６±０９．５ ａ値はＸ±Ｓ、Ｄ、、　Ｎ＝２を表す。
ｂＮ＝１ 第４表 組織　　　　　本発明の　　　　　　完全な’＝　：　’　　Ｂ７２．３（Ｆａ ｂ’　　人”　８７２．３　’−ｂ肺　　　　　　　　０．７９±０．０３　　 　　　　０．０６±０．０２牌臓　　　　　０．５３±０．０７　　　　　０． ４８±０．０１肝Ｗｔ０．８４±０．１６　　　　　０．６６±０．０６腎臓　 　　　１１．０８±０．８７　　　　　０．９２±０．０８筋肉　　　　　０． １０±０．０２　　　　　０．１１±０．０１組織 ｙ並＆今一 血液　　　　　５．３６±０．３８　　　　２１．１７±０．２７肺　　　　　 　　　４．２３±０．２２　　　　　　１２．７３±０．５９牌臓　　　　　２ ．８１±０．３２　　　　１０．１８±０．２７肝臓　　　　　３．４５±０． ９９　　　　１３．８３±１．５６腎ｉ＠ｉ　　　　　５９．５８±７．１６　 　　　１９．４８±１．９５筋肉　　　　　０．９４±０．０４　　　　　２． ３２±０．１６同位体 半減期　　　３．３　±０．３日　　　　　１３．９　±２．４日ａ　（＋！は χ±Ｓ、Ｄ、、　Ｎ＝３を表す。
ｂ値はＸ±Ｓ、Ｄ、、　Ｎ＝２を表す。
第３表および第４表のデータは第１表および第２表に示された結果を確認する。
本発明の方法に従って調分布は、従来法にしたがって調製された類似の複合体の それとは著しく異なっていた。本発明の複合体の注射後４日で、注射された複合 体の約８％が腫瘍標的部位に局在していたが、同時に従来法で調製された複合体 はわずか約０．５％が腫瘍部位に存在するのみであった。さらに、従来法で調製 された（Ｆａｂ’）ｚ複合体は、非常に早く排泄され、標的部位ではない腎臓や 肝臓に高い局在性を示した。これに対して、本発明の方法にしたがって調製した （Ｆａｂ”）２複合体は、従来法で調製した複合体より約３倍長く循環の中で持 続し、腎臓や肝臓への局在は顕著に少なかった。
７、Ｂ７２．３おびＢ７２．３（Ｆａｂ’　　人のイー乙亘」」１１ｂ乱注 次の実験は、本発明の方法にしたがって調製された抗体（Ｆａｂ”）ｔ−リンカ −中間体および従来法により調製された抗体（Ｆａｂ’）ｚフラグメントが、イ ンビトロ結合アッセイを用いて測定したとき、実質的に等しい結合活性を有して いたことを示す、実験はさらに（Ｆａｂ’）ｚ合成物の結合活性が複合体を形成 していない抗体のそれと事実上等しかったことを示している。
完全な８７２．３リンカ−中間体（すなわち８７２．３−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ）お よびＢ７２．３（Ｆａｂ’）ｚ　リンカ−中間体（すなわち８７２．３　（Ｆａ ｂ’　）　ｚ−ＧＹＫ−ＤＴＰＡ）は上記第６節に記載したように調製した。従 来法の８７２．３（Ｆａｂ’）ｚも上述のように調製した。　ｅｎｚｙｍｅ−１ ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ法）によっ て、抗体および（Ｆａｂ’　）　ｚフラグメント合成物のインビトロ結合活性を 以下のように評価した：アッセイは、８７２．３抗体が特異的に結合するＴＡＧ −７２抗原を含むヒトＬＳＩ７４Ｔ細胞を生育させさらに固定化したマイクロタ イタープレートを用いて行った。
試験する抗体または（Ｆａｂ’）ｚフラグメント合成物は、１０μｇ／ｄから０ ．０４μｇノーまでプレート上で連続的に１：２に希釈したくこれは完全な抗体 に対して６７ｎＭ／１から０．２６ｎＭ／／！まで、　（Ｆａｂ’）ｚフラグメ ントに対しては１００ｎ）’ｌ／Ｊ！から０．３９ｎＬ／　ｌにそれぞれ対応す る）。
結合した抗体または（Ｆａｂ’　）　ｇフラグメント合成物はパーオキシダーゼ （Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉａ＋ｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）と結合した抗−マウスＩ ｇＧ−Ｆａｂを用いて検出した。使用した基質はテトラメチルベンジジンである 。得られた結果は第１図（ＡおよびＢ）に図示した。
第１図Ａに示したように、本発明の方法に従つて調製されたＢＴ２．３抗体（Ｆ ａｂ’　）　ｚ合成物および従来法の８７２．３（Ｐａｂ’）ｚは両方とも、イ ンビトロＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いて測定した場合には、実質的に等しい特 異的な結合活性を有していた。さらに第１図Ｂで示すように、完全な天然型８７ ２．３抗体およびリンカ一部分を酸化された炭水化物部分に部位特異的に結合し た８７２．３抗体もインビトロＥＬＩＳＡアッセイで（Ｆａｂ’　）　、フラグ メントと大体同じ結合活性を有している。コントロールのＩｇＧ、抗体ＭＯＰＣ −２１はＥＬＩＳＡアッセイで活性を示さなかった（データは示さず）。
以下の実験は、完全なり７２．３抗体分子および本発明の反応計画に沿って作成 されたものと類似の８７２．３（Ｆａｂ’）ｚフラグメントの炭水化物部分を評 価するために行った。
Ｂ７２．３　（Ｆａｂ’　）　ｚフラグメントはＢ７２．３抗体の一部を上記第 ６節で述べたように活性化したプロメラインで分解することにより得られた。完 全な８７２．３抗体分子とＢ７２．３（Ｆａｂ’）ｚフラグメントの両者の炭水 化物部分を以下のような３通りの加水分解によって分析した：（１）グルコサミ ン（Ｇｌｃ−Ａｍ）およびガラクトサミン（Ｇａｌ−Ａｍ）のようなアミノ糖は 、６Ｎ塩酸中で１００’Ｃ１３時間加水分解したのち分析した； （２）ガラクトース、マンノース、フコースのような中性糖は、４Ｍ１−Ｉ７７ ００酢酸（ＴＦＡ）中、１００″Ｃ１２時間加水分解したのち分析した；さらに （３）　　シアル酸は２０ｍＭ　ＨｚＳＯｎ中で、８０°Ｃ，１時間加水分解し たのち分析した。
中性糖は分析に先立ってアミノ基を含む形に変換した。
加水分解した試料は、オルト−フタアルデヒドリアクターおよび蛍光検出器を使 用して、カチオン交換ＨＰＬＣによって分析した。結果は第２図に図示した。
第２図に示したように、Ｂ７２．３（Ｆａｂ”）２フラグメントの炭水化物部分 は、ガラクトサミン、ガラクトースおよびシアル酸残基からなる。グルコサミン 、マンノースおよびフコースは、完全な抗体分子に存在する他のシアル酸残基同 様Ｂ７２．３（Ｆａｂ”）ｔフラグメントには見いだされなかった。（Ｆａｂ’ 　）　ｚフラグメント上の炭水化物部分の組成は、それが〇−結合性の炭水化物 部分であることを示している。
ここに記載し請求される発明は、ここに発表された特定の実施態様によって、範 囲を限定されない、同様の実施態様も本発明の観点内にあるものと意図されてい る。それはこれらの実施態様が、本発明のい（つかの側面を説明することを意図 するものだからである。
実際、ここで示し記載したことに加えて、本発明の様々な部分的な変更が、前述 の説明により当業者にとっては明らかな事であろう。このような部分的な変更も 、添付の請求の範囲に含まれるものとする。
Ｂ７２．３ＧＹＫ−ＤＴＰＡ活性 ＬＳ１７４Ｔ細胞でのＥｌ、ＩＳＡ法 対数抗体濃度 第１　図Ｂ Ｂ７２．３およびＢ７２．３ＧＹＫ−ＤＴＰＡの活性ＬＳ１７４Ｔ細胞でのＥＬ ＩＳＡ法 対数抗体濃度 第２図 炭水化物の分析：　Ｂ７２．３およびＦ（ＡＢ’）ｚグルコサミンガラクトサミ ンガラクトースマンノース　　フコース　　　シアル酸炭水化物残基 ｚＺ完全な抗体　　　　　　　区コＦ（ａｂ’）を国際調査報告

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．抗体の抗原結合領域の外側に位置する該抗体の酸化された炭水化物部分との 共有結合によって化合物と結合した抗体からなる可溶性抗体−化合物複合体を、 活性化されたチオールプロテアーゼ酵素と反応させ、抗体（Ｆａｂ′）２化合物 複合体を生成せしめることからなり、（ａ）複合体でない抗体と実質的に同等な 免疫特異性を有し及び（ｂ）該抗体（Ｆａｂ′）２化合物複合体がインビボ投与 に適合するように水溶性であることを特徴とする抗体フラグメント化合物複合体 の調製方法。 ２．チオールプロテアーゼがプロメライン、パパイン、キモパパイン、またはフ イシンである請求の範囲第１項記載の方法。 ３．チオールプロテアーゼが、システインとの反応、またはジチオスレイトール 、メルカプトエタノールまたはメルカプトエチルアミンからなる群から選択され たスルフヒドリル還元剤との反応により、活性化される請求の範囲第１項記載の 方法。 ４（ａ）抗体を酸化剤と反応させて、該抗体の抗原結合領域の外側に位置する抗 体の炭水化物部分にアルデヒド基を生成せしめ、及び （ｂ）その結果生じた抗体の酸化された炭水化物部分のアルデヒド基を、１級ア ミン、２級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒ ドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド類からなる群から選択され た化合物のアミン部分と反応させて、（ｉ）複合体でない抗体と実質的に同等な 免疫特異性を有し及び（ｉｉ）該抗体化合物複合体がインビボ投与に適合するよ うに水溶性であることを特徴とする可溶性抗体化合物複合体を形成させる ことからなる方法によって抗体化合物複合体を形成せしめる請求の範囲第１項記 載の方法。 酸化剤が酵素である請求の範囲第４項記載の方法。 酸化剤が酸素酸である請求の範囲第４項記載の方法。 ７．（ａ）炭水化物部分がその抗体の抗原結合領域の外側に位置し、その抗体− リンカ−中間体が（ｉ）複合体でない抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、 及び（ｉｉ）該抗体−リンカ−中間体がインビボ投与に適合するように水溶性で あることを特徴とするような抗体の酸化された炭水化物部分と共有結合を介して 結合したリンカーを含む抗体−リンカ−中間体を、活性化されたチオールプロテ アーゼと反応させ、可溶性抗体（Ｆａｂ′）２−リンカ−中間体を生成せしめ； 及び （ｂ）その抗体−（Ｆａｂ′）２リンカ−中間体のリンカ−部分を共有結合また は配位結合によって化合物と結合させ、（ｉ）複合体でない抗体と実質的に同等 な免疫特異性を有し、及び（ｉｉ）その抗体（Ｆａｂ′）２−リンカ−化合物複 合体がインビボ投与に適合するように水溶性であることを特徴とするような可溶 性抗体（Ｆａｂ′）２リンカ−化合物複合体を形成させることを包含する抗体フ ラグメント複合体の調製方法。 ８．チオールプロテアーゼがプロメライン、パパイン、キモパパイン、またはフ イシンである請求の範囲第７項記載の方法。 ９．（ａ）抗体を酸化剤と反応させて、該抗体の抗原結合領域の外側に位置する 抗体の炭水化物部分にアルデヒド基を生成せしめ、及び （ｂ）その結果生じた抗体の酸化された炭水化物部分のアルデヒド基を、１級ア ミン、２級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒ ドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド類からなる群から選択され たリンカーのアミン部分と反応させて、（ｉ）複合体でない抗体と実質的に同等 な免疫特異性を有し、及び（ｉｉ）該抗体リンカ−中間体がインビボ投与に適合 するように水溶性であることを特徴とする可溶性抗体一リンカー中間体を形成さ せる ことからなる方法によって抗体−リンカ−中間体を形成せしめる請求の範囲第７ 項記載の方法。 １０．酸化剤が酵素である請求の範囲第９項記載の方法。 １１．酸化剤が酸素酸である請求の範囲第９項記載の方法。 １２．炭水化物部分がその抗体の抗原結合領域の外側に位置し、その抗体−リン カ−化合物複合体が（ａ）複合体を形成していない抗体と実質的に同等な免疫特 異性を有し、及び（ｂ）水溶性であってその抗体−リンカ−化合物複合体がイン ビボ投与に適合することを特徴とするような抗体の酸化された炭水化物部分と共 有結合を介して結合したリンカ−−化合物部分からなる可溶性抗体−リンカ−化 合物複合体を、活性化されたチオールプロテアーゼと反応させ、（ｉ）複合体を 形成していない抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、及び（ｉｉ）その抗体 （Ｆａｂ′）２−リンカ−化合物複合体がインビボ投与に適合するように水溶性 であることを特徴とするような可溶性抗体（Ｆａｈ′）２−リンカ−化合物複合 体を生成させることからなる抗体フラグメント化合物複合体の調製方法。 １３．チオールプロテアーゼがプロメライン、パパイン、キモパパイン、または フイシンである請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．炭水化物部分は抗体の抗原結合領域の外側に位置し、その抗体の酸化され た炭水化物部分に共有結合したリンカーからなる抗体一リンカ−中間体のリンカ ー部分を共有結合または配位結合によって化合物と結合させ、（ａ）複合体でな い抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、及び（ｂ）その抗体−リンカ−化合 物複合体がインビボ投与に適合するように水溶性であることを特徴とするような 可溶性抗体−リンカー化合物複合体を形成させることからなる方法によって、抗 体−リンカ−化合物複合体を形成せしめることからなる方法によって、抗体−リ ンカ−化合物複合体を形成せしめる請求の範囲第１２項記載の方法。 １５．（ａ）抗体を酸化剤と反応させて、該抗体の抗原結合領域の外側に位置す る抗体の炭水化物部分にアルデヒド基を生成せしめ； （ｂ）その結果生じた抗体の酸化された炭水化物部分のアルデヒド基を、１級ア ミン、２級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒ ドラジン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド類からなる群から選択され たアミン類を包含するリンカーのアミン部分と反応させ；（Ｃ）化合物を抗体− リンカ−中間体のリンカー部分に共有結合または配位結合で結合させ、（ｉ）複 合体でない抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、及び（ｉｉ）その抗体リン カ−化合物複合体がインビボ投与に適合するよう水溶性であることを特徴とする 抗体−リンカ−化合物複合体を形成させることからなる方法によって、抗体−リ ンカ−化合物複合体を生成せしめる請求の範囲第１２項記載の方法。 １６．抗体の酸化された炭水化物部分に、１級アミン、２級アミン、ヒドラジン 、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジドおよ びチオセミカルバジド類からなる群から選択された反応性アミン類を含むリンカ ー−化合物中間体のリンカー部分のアミン部分と共有結合させ、（ａ）複合体で ない抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、及び（ｂ）その抗体リンカ−化合 物複合体がインビボ投与に適合するよう水溶性であることを特徴とするような抗 体リンカ−化合物複合体を生成せしめることからなる方法によって、抗体リンカ −化合物複合体が形成される請求の範囲第１２項記載の方法。 １７．（ａ）抗体を酸化剤と反応させて、その炭水化物部分が該抗体の抗原結合 領域の外側に位置する抗体の炭水化物部分にアルデヒド基を生成せしめ；（ｂ） その結果生じた抗体の酸化された炭水化物部分のアルデヒド基を、１級アミン、 ２級アミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジ ン、セミカルバジドおよびチオセミカルバジド類からなる群から選択されたアミ ン類を含むリンカ−−化合物中間体のアミン部分と反応させて、（ａ）複合体で ない抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、及び（ｂ）その抗体リンカ−化合 物複合体がインビボ投与に適合するように水溶性であることを特徴とする、抗体 −リンカ−化合物複合体を形成せしめることからなる方法により、抗体リンカ− 化合物複合体が生成される請求の範囲第１２項記載の方法。 １８．抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲第１，７，または１２項記載 の方法。 １９．リンカーが、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、エチレンジアミンテトラ 酢酸、ジメルカプトこはく酸、２，３−ジメルカプトプロパンスルホン酸、メタ ロチオエインおよびクリブタテスのアミン含有誘導体からなる群から選択された 相溶性キレーターである請求の範囲第７または第１２項記載の方法。 ２０．リンカーが、ｐ−アミノアラニン−ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ヒ ドラジドージエチレントリアミンペンタ酢酸、フェニルヒドラジドージエチレン トリアミンペンタ酢酸、ヒドロキシルアミン−ジエチレントリアミンペンタ酢酸 、セミカルバジドージエチレントリアミンペンタ酢酸、チオセミカルバジドージ エチレントリアミンペンタ酢酸、ポリエチレンイミン−ジエチレントリアミンペ ンタ酢酸、ｐ−フェニレンジアミン−ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ジエチ レントリアミン−ペンタ酢酸モノ［（４−アミノフェニル）メチル〕アミド、α −Ｎ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸−Ｌ−リジン、グリシルーチロシルーリ ジン−ジエチレントリアミンペンタ酢酸およびＬ−リジンベンジルエステルージ エチレントリアミンペンタ酢酸からなる群から選択される請求の範囲第７項また は１２項記載の方法。 ２１．抗体の抗原結合領域の外側に位置する該抗体の酸化された炭水化物部分と の共有結合によって化合物と結合した抗体からなる可溶性抗体一化合物複合体を 、活性化されたチオールプロテアーゼ酵素と反応させ、抗体（Ｆａｂ′）２化合 物複合体を生成せしめ、該抗体（Ｆａｂ′）２化合物複合体が（ａ）複合体でな い抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、及び（ｂ）該抗体−リンカ−化合物 複合体がインビボ投与に適合するように水溶性であることを特徴とすることから なる方法によって調製された、抗体（Ｆａｂ′）２化合物複合体からなる抗体フ ラグメント化合物複合体。 ２２．（ａ）炭水化物部分が、（ｉ）複合体でない抗体と実質的に同等な免疫特 異性を有し、及び（ｉｉ）その抗体−リンカ−化合物複合体がインビボ投与に適 合するように水溶性ことを特徴とするような抗体−リンカ−中間体の、抗原結合 領域の外側に位置するような抗体の、酸化された炭水化物部分と共有結合を介し て結合したリンカーからなる抗体−リンカ−中間体を、活性化されたチオールプ ロテアーゼと反応させ、可溶性抗体（Ｆａｂ′）２−リンカ−中間体を生成せし め；及び （ｂ）その抗体−（Ｆａｂ′）２リンカ−中間体のリンカー部分を共有結合また は配位結合によって化合物と結合させ、（ｉ）複合体でない抗体と実質的に同等 な免疫特異性を有し、及び（ｉｉ）その抗体−リンカ−化合物複合体がインビボ 投与に適合するように水溶性であることを特徴とするような抗体（Ｆａｂ′）２ リンカー化合物複合体を形成させる ことからなる方法によって調製された可溶性抗体（Ｆａｂ′）２化合物複合体か らなる抗体フラグメント化合物複合体。 ２３．炭水化物部分がその抗体の抗原結合領域の外側に位置し、そしてその抗体 −リンカ−化合物複合体が（ａ）複合体でない抗体と実質的に同等な免疫特異性 を有し、及び（ｂ）その抗体−リンカ−化合物複合体がインビボ投与に適合する ように水溶性であることを特徴とするような抗体の、酸化された炭水化物部分と 共有結合を介して結合したリンカー−化合物部分からなる可溶性抗体−リンカ− 化合物複合体を、活性化されたチオールプロテアーゼと反応させ、（ａ）複合体 でない抗体と実質的に同等な免疫特異性を有し、及び（ｂ）その抗体−リンカ− 化合物複合体がインビボ投与に適合するように水溶性であることを特徴とするよ うな可溶性抗体（Ｆａｂ′）２−リンカ−化合物を生成させることからなる方法 によって調製された、可溶性抗体（Ｆａｂ′）２化合物複合体からなる抗体フラ グメント化合物複合体。 ２４．（ａ）請求の範囲第２１，２２または２３記載の水溶性抗体（Ｆａｂ′） ２化合物複合体であって、その抗体（Ｆａｂ′）２複合体が特定の組織の抗原決 定因子に対しては免疫反応性でありかつ免疫特異的であり、非特異的な組織に対 しては免疫特異的でなく及びその抗原決定因子は非特異的組織では実質的な量が 見いだされないものであるものの効果量を動物またはヒトに対して投与すること ；及び （ｂ）その抗体（Ｆａｂ′）２化合物複合体が特定の組織に局在したかどうかを 検出すること を包含する、インビボで特定の組織を造影するための方法。 ２５．請求の範囲第２１，２２または２３項記載の抗体（Ｆａｂ′）２複合体で あって、その抗体（Ｆａｂ′）２複合体が細胞性疾患に関連した標的部位に対し ては免疫反応性でかつ免疫特異的であり、該細胞性疾患とは無関係な組織に対し ては実質的に免疫反応性でなく及び免疫特異性を示さないものであるものを動物 またはヒトに対して投与することを包含する細胞性疾患の治療処置のための方法 。
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