JP2961173B2 - 血管透過性促進抱合体 - Google Patents

血管透過性促進抱合体

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JP2961173B2 JP1511059A JP51105989A JP2961173B2 JP 2961173 B2 JP2961173 B2 JP 2961173B2 JP 1511059 A JP1511059 A JP 1511059A JP 51105989 A JP51105989 A JP 51105989A JP 2961173 B2 JP2961173 B2 JP 2961173B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、免疫学的薬剤および生体内においてユニ
ークな特異性を有するその他の薬剤の使用に関し、特
に、ヒトの疾患の診断および治療のために用いられるモ
ノクローナル抗体およびその他の高分子の浸透および結
合を促進するための手段に関する。
関係出願とのつながり この出願は、1988年10月11日、アラン（Alan）L.エプ
スタイン（Epatein）およびマイケル（Michael）グロブ
スキー（Glovsky）の名前で、「血管浸透性促進免疫抱
合体」と題された出願された米国出願連続番号255,513
の一部継続出願である。米国出願連続番号255,513にお
ける主題と共通のこの出願における主題の優先権がここ
に主張される。
発明の背景 いくつかの異なるタイプのヒトの癌に向けられた治療
において、腫瘍特異的なモノクローナル抗体（mAbs）の
使用が精力的に研究されてきた（レビー（Levy）および
ミラー（Miller）,Fed.Proc.42:2650−2656（198
3））。また現在のところ、多くの臨床試験が報告され
てきた。臨床試験のフェイズＩおよびIIの両方のレベル
は、高い投与レベルにおいてもこれらの薬剤の安全性が
納得のいくよう示されてきたが、それらは、モノクーナ
ル抗体が生体内で予測されたように効果的でなかったこ
とも示している。
癌の治療において、腫瘍に結合された抗原に対する抗
体の効果は、抗体が直接的な細胞障害性または補体によ
り媒介される細胞の溶解のいずれかによりそれらの標的
細胞を破壊する抗体の能力に依存している。補体により
介在される溶解は、古典的な補体経路のClq成分が腫瘍
細胞の表面に結合された抗体のFc部に結合し、膜攻撃複
合体の形成に導くときに誘発される。腫瘍に結合された
抗体は、それ自身が標的を溶解するエフェクタ細胞と相
互に作用することにより宿主の本来の防御を増強するこ
ともできる。しかし、それらの複合的な細胞障害性の能
力にもかかわらず、細胞障害性の薬剤としてmAbs単独の
実際の実験的な使用は、不満足なものであった。試験は
いくらかの鎮静を結果としてもたらしてきたが、一般的
に、ほとんどの患者は、しばしば一時的な軽い応答を有
するだけであった（フーン（Foon）他、BLood 64:1085
−1093（1984）；シアーズ（Sears）他、Cancer Res.4
5:5910−5913（1985））。
研究者らは、抗体分子そのものの細胞障害性を、細胞
障害性の放射性核種、毒素およびそれらに付加された薬
剤を用いて補うことにより、モノクローナル抗体の治療
上の効力を改善しようと試みてきた（ドナルド（DeNard
o）他、Nucl.Med.Biol.13:303−310（1986）；ハーウィ
ッツ（Hurwitz）他、Cancer Research.35:1175−1181
（1975）；ゴース（Ghose）他、J.Natl.Cancer Inst.5
8:845−852（1977））。
モノクローナル抗体の殺腫瘍能力の改善のための試み
は、抗体結合部位において、局所的な本来の免疫応答を
も刺激するような抗体抱合体を提供するために、生物学
的応答修飾物を付与することも含んできた。
この生物学的応答修飾物の使用の一例は、抗体とコブ
ラ毒因子（CVF）の抱合体である。CVFは糖タンパク質で
あり、補体の代替的な経路のC3b、C3/C5変換酵素の性質
を有している。しかし、CVFは、その本来の類似体と異
なって、補体制御タンパク質により不活性化されない。
細胞により結合された抗体上でのCVFの存在は、膜攻撃
複合体の組み立てを開始し、かつそれにより細胞を殺す
（ボーゲル（Vogel）,C.およびミューラー−エベルハー
ド（Muller−Eberhard）,H.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,
78（12）:7707−7711;ボーゲル（Vogel）,C.他、「血液
学および輸血」、ヒト白血病における最近の傾向VI（Mo
dern Trends in Human Leukemia VI）,29:514−51
7（1985）Berlin Neth,他）。
他の例は、モノクローナル抗体およびインターフェロ
ンを含む免疫抱合体の使用であり、そこにおいて、イン
ターフェロンは、ナチュラルキラー（NK）細胞を含む予
め存在する細胞の免疫機構を活性化することにより標的
細胞の溶解を促進する（フラネリ（Flannery）,G他、Eu
r.J.Cancer Clin.Oncol.,20（６）:791−798（198
4））。
他の研究者らは、腫瘍に結合された抗体の部位におい
て、単球／マクロファージ濃度を増加するよう作用する
走化性の薬剤、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェ
ニルアラニン（fMLP）を含む免疫抱合体の効果を研究し
てきた（オブリスト（Obrist）,R.,サンドベルグ（Sand
berg）,A.,Cellular Immunology 81:169−174（198
3）；オブリスト（Obrist）,R.他、Bent 53:251（198
6））。しかし、これらの研究のいずれもが、抗体の腫
瘍治療の臨床的な有効性を実質的に改良してこなかっ
た。
研究は、この臨床的な有効性の不足が、腫瘍部位へ不
十分な量しかモノクローナル抗体が配達されないことに
大きく依存していることを示している。治療の前後にお
いて組織科学的な方法による腫瘍組織の試験は、高い投
与レベルにおいてさえも、抗体による腫瘍の飽和は部分
的にすぎないことを示した（ローダ（Rowder）他、Bloo
d 69:199−210（1987））。放射性ラベルされた抗体の
調製物を用いる定量的な薬量測定の研究は、用いられる
抗体の高い特異性、すなわち高い腫瘍：器官の比の実現
にもかかわらず、全投与量に対して非常に低い割合（0.
05−0.2％）しか腫瘍に実際に結合していないことを示
してきた。腫瘍特異的なモノクローナル抗体を用いる研
究は、血液に対する腫瘍の分配比が良好な場合でさえ
も、腫瘍１グラム当たり検出される放射性ラベルされた
モノクローナル抗体の量が、注入された全投与量の約0.
015％であることを示している（エペネトス（Epeneto
s）他、Cancer Research 46:3183−3191（1986））。
体内において、物質の伝達および配達の最初の態様
は、循環系を介してである。一般的に、循環系は血管系
およびリンパ系を備えている。栄養物質、酸素、ホルモ
ンおよびその他の物質を体のすべての部分に運ぶ一方、
細胞の代謝産物を除く血管系は、心臓ならびに一連の脈
管：動脈、静脈および毛細管を含む。枝分かれにより定
常的に数が増加し、かつ内径が減少する動脈は、血液を
心臓から毛細管へと導く。血液と他の組織との間におい
て成分の交換が起こる毛細管は、管を網状につないだ網
状組織を形成している。一方、静脈は血液を毛細管から
心臓へと戻している。
毛細管は、循環系の動脈および静脈側に接続する単純
な内皮細胞から典型的になっている。毛細管ネットワー
クの網状組織は、異なる組織および器官において異なる
サイズおよび形状で体内全体に存在している。ある領域
における代謝の強さは、一般的にこの網状組織の緊密さ
を決定する。したがって、肺、肝臓、腎臓、粘膜、腺お
よび骨格筋においては、脳の灰白質と同様に緊密なネッ
トワークが存在する。このネットワークは、腱、神経、
平滑筋および漿膜のような組織においては、大きな網目
を有しかつまばらである。
毛細管の壁を介する物質の輸送能力は、透過性として
言及される。透過性は、場所によって異なり、かつ違う
条件下でその場所において異なる。
一般的に、腫瘍が数ミリメートルの直径を越えて成長
するような場合、腫瘍は新しい血液供給を誘導するに違
いないことについて意見が一致しており、しかも腫瘍が
脈管形成を誘導するメカニズムについて大きな注目が集
められてきた（たとえば、フォルクマン（Folkman）,
J.,Atv.Cancer Res.43:175−203（1985）参照）。さら
に、腫瘍を補うようになる新しい血管の解剖学および生
理学に大きな注目が振り向けられてきた（同上）。
一般的に、腫瘍組織が解剖学的に異質な構造であるこ
とについて意見は一致している。しばしば、それらは、
正常な細胞において予期されるであろう同等の大きさの
管よりもより少ない周皮細胞および平滑筋細胞ととも
に、単純な内皮により並べられた相対的に画一的な管状
構造からなる。腫瘍脈管の機能的な性質は多く論争され
てきており、腫瘍脈管は正常な脈管よりも血管作動性の
媒介物に対してより応答的であるかまたは応答的でない
かのいずれかが報告されてきた（たとえば、ホリ（Hor
i）,K.他、J.Natl.Cancer Ilst.74:453−459（1985）
参照）。しかし、ほとんどの研究者が同意している腫瘍
脈管の１つの性質は、正常な脈管に比較して、腫瘍脈管
は循環する高分子に対して過度に透過性であることであ
る。腫瘍塊におけるモノクローナル抗体および殺腫瘍剤
の局在化の理解にそれが明らかに関連するため、この所
見は説明を必要とする（たとえば、ドボラーク（Dvora
k）他、Am.J.Pathol.133:95−109（1988）参照）。小さ
な分子は、正常な毛細管および無傷の内皮細胞接合を有
する他の脈管を自由に通過するのに対して、高分子に対
する正常な脈管構造の透過性は厳しく制御されている。
通常、高分子は大部分が循環内に保持されており、外に
出る少量のものは、小胞の輸送手段または内皮を横切る
一時的な細胞質輸送経路の形成により外に出ると考えら
れている（たとえば、ミリシ（Milici）,H.A.他、J.Cel
l Biol.105:2603−2612（1987）参照）。しかし、炎症
において、高分子の散逸は大きく増加し、ヒスタミンの
ような作動物質が毛細管の後の内皮細胞の萎縮を刺激し
て、高分子および微粒子までもが散逸できるような内皮
細胞のギヤップの形成をもたらす。しかし、腫瘍の脈管
構造が「漏れやすい」かそうでないかにかかわらず、本
発明者は、不十分な量のモノクローナル交替しか腫瘍部
位に配達されていないということを多くの研究が示して
いるということを繰返さねばならない。
本発明者は、血液による腫瘍の不十分な灌流の理由
が、広く解剖学的構造にあることを信じている。腫瘍細
胞は中心の芯となる細胞から放射状に成長し、すぐに血
液の供給が追いつかなくなり、壊死性で低酸素の芯を残
すことになる。この例の場合、芯となる細胞から最も近
い毛細管までの距離は、約100から150μｍであり、この
距離は顕著な低酸素症および灌流の不足を招くのに十分
である。このような低酸素細胞は放射線照射に対して抵
抗性を示し、さらに注入された薬剤または抗体に近づき
にくい（ケリン（Kaelin）,W他、Cancer Research 4
4:896−899（1984）；トムインソン（Thomlinson）,P.
およびグレイ（Gray）,L.,Br.J.Cancer 9:539−549（1
955））。
したがって、モノクローナル抗体の腫瘍治療上におけ
る制限は、まずモノクローナル抗体が腫瘍中に浸透しか
つ腫瘍部位において局在および持続することができるよ
うな輸送に関連して因子に起因することが明らかにな
る。腫瘍細胞へのモノクローナル抗体の不十分な配達お
よび結合ならびにその臨床上の有効性における制限は、
診断および治療のための抗体の使用にとって大きな障害
である。放射性の化学種、化学治療剤およびモノクロー
ナル抗体に付加された毒性の薬剤のような強化剤の使用
は、この障害を克服しない。実際、モノクローナル抗体
が腫瘍部位によく集中しなければ、これらの付加された
強化剤は、正常な組織の損傷を増加させる危険性を有し
ている。
研究は、腫瘍細胞によるモノクローナル抗体の取込み
が、血管の透過性および血液の流れによく相関している
ことを示している（サンド（Sands）他、Cancer Res.4
8:188−193（1988））。同様の研究は、血管作動性の薬
剤の投与が、ある環境下で、他の組織と比べて腫瘍の灌
流を増加させ、かつ腫瘍の取込みおよび放射性薬剤の濃
度を増加させ得ることを示している（ボンバー（Bombe
r）,P.他、J.Nucl.Med.27:243−245（1986））。
かくして、本発明の目的は、治療をより効果的にする
ために、殺腫瘍性の免疫治療または化学治療の適用に先
立って、血管の透過性を増強し、かつ腫瘍の血液量を拡
大するために使用され得る特異的に標的が定められた薬
剤を提供することにある。
また、不十分な配達に関する同様の研究は、診断造影
を行なう目的のために、生体内において使用される特異
的に標的が定められた薬剤の利用に適用される。腫瘍部
位に配達される免疫診断薬の量が増加すると、診断法の
精度は向上し、診断薬の利用がより効果的になり、しか
も放射性同位体でラベルされた抗体のような免疫診断薬
が危険を有するような場合において、患者に対する安全
性はより高くなる。かくして、本発明の目的は、免疫診
断法に先立って、血管作動性薬剤の特異的な目標付けに
より腫瘍への免疫診断薬の配達を同様に促進する薬剤を
提供することにある。
図面の簡単な説明 第１図は、ラジ（Raji）保有ヌードマウスにおいて、
放射性ラベルされたLym−１ Ｆ（ab′）２取込みに対
するLym/IL−２免疫抱合体の効果を示している。
第２図は、リンパ腫保有ヌードマウスにおけるIL−２
およびLym−1/IL−２血管抱合体の併用注入の効果を示
している。
第３図は、Ｉ−125 Lym−１ Ｆ（ab′）２トレーサ
ーによる腫瘍取込みに関して、Lym−1/IL−２血管抱合
体の先投与の上昇効果を示している。
第４図は、リンパ腫保有ヌードマウスにおけるLym−1
/IL−２血管抱合体の投与時間の効果を示している。
発明の概要 本発明は、モノクローナル抗体に結合された、血管作
動応答を刺激することができる生物学的に活性な薬剤を
備える免疫抱合体を提供する。上記モノクローナル抗体
は、宿主の生体内に投与されたとき、腫瘍細胞または腫
瘍細胞ゴーストのような新生物組織に選択的に結合する
能力を有している。生物学的に活性な薬剤は、この態様
において、新生物組織の部位に局在化（集中）し、血管
拡張および血管透過性の増加により、または炎症性の応
答メカニズムを介して、腫瘍組織への局所的な循環およ
び血液供給が改善されるような反応を刺激する。腫瘍内
における血液容量の拡大は、続いて宿主内に導入される
治療薬および診断薬をより完全に腫瘍に浸透させ、した
がって、より大量のより効果的な用量が配達されるよう
になる。
いくつかのタイプの免疫治療に先立つ効果的な血管作
動性抱合体の使用は、その治療の効力を増強させるだけ
でなく、抗腫瘍剤、毒素または放射性核種のような細胞
変性物質を含む抗体抱合体の使用において、有害な副作
用の危険を実質的に減少させる。循環内で結合されずに
残っているそのような抗体抱合体は、正常な組織、特に
抗体抱合体を必ず体から排除するような腎臓、肝臓およ
び網内系の器官組織の意図しない破壊をもたらすであろ
う。標的である腫瘍に結合し得る相対的な容量を増加す
ることにより、血管作動性抱合体は効果的でより少ない
用量の使用を可能にし、したがって、結合しないまま循
環する細胞障害性の薬剤の量を減らし、正常な組織への
危険性を減らすことができる。
上述され、上記において引用された本発明者による先
の出願において開示される免疫抱合体に加えて、本発明
は、モノクローナル抗体、またはさらに拡張して、浸透
性の脈管に局在化（集中）する他の成分（たとえば、高
分子またはリポソーム）に結合された血管作動性の薬剤
を備える抱合体を提供する。したがって、この開示全体
にわたって「免疫抱合体」という用語が用いられるが、
少なくとも１つの免疫活性成分からなる抱合体は、本発
明により意図された多くの異なった抱合体の一例に過ぎ
ないことをはっきりと理解すべきである。
静脈内（I.V.）投与される場合、モノクローナル抗体
は、腫瘍もしくは血管および炎症の領域において構造的
に異常である場所に優先的に結合できる能力により選択
される。血管作動性薬剤は、この態様において腫瘍また
は炎症の部位に選択的に集められ、そこで透過性のさら
なる増加を刺激する。そのような増加は、部位に対して
選択的であり、その部位において、引き続きI.V.投与さ
れた治療剤の血液から組織への通過を容易にするように
働く。
これらの血管作動性抗体抱合体による誘導される選択
的透過性の増強は、治療が必要とされる部位へ届くI.V.
投与された薬剤の割合または量を増加するように働く。
このことは治療を強化させるだけでなく、毒性の代謝産
物または免疫学的な過剰応答の発生による有害な副作用
の危険性を実質的に減少させる。
本発明の１つの局面によれば、腫瘍組織の部位に集ま
る能力を有する配達媒体、および腫瘍組織への血液供給
を増加するように働く、該配達媒体に結合された薬剤を
含む薬剤抱合体が提供される。より好ましい局面におい
て、この抱合体は、正常で健康な血管内皮を透過するこ
とができない一方で、腫瘍組織の血管内皮を透過するこ
とができるのに十分な大きさである。もう１つの変更に
おいて、該薬剤は、血管内皮における活性部位において
血管透過性を向上させるように働き、あるいは血管内皮
の活性部位において局所的な炎症性の反応を刺激または
激化するように働く。本発明の他の変更は、抗腫瘍性放
射性同位体または抗腫瘍性トキシンを組合わせた血管抱
合体を提示する。もう１つの具体例において、配達媒体
は、30,000と200,000との間に分子量（MW）を有する高
分子または粒子を含む。
もう１つの局面において、本発明は、腫瘍細胞の診断
のための方法を提供し、該方法は、抗体が腫瘍組織への
血液供給を増加するように働く薬剤に結合された、当該
部位に集中することができる能力を有する有効な量の配
達媒体を、腫瘍組織を有する宿主に投与する工程と、そ
れと同時にまたはその後に腫瘍の造影剤を宿主に投与す
る工程とを備える。もう１つの具体例において、診断薬
は、腫瘍組織部位に集中することができる能力を有す
る、腫瘍の造影剤に抱合された配達媒体を含む抱合体と
して投与される。
本発明のもう１つの局面によれば、腫瘍もしくは構造
的に異常な血管の付近、新しい脈管、または腫瘍部位に
おいて炎症を起こした血管に集中することができる能力
を有するモノクローナル抗体を備える免疫抱合体が提供
され、当該抱合体は、選択された血管作動物質をさらに
含む。１つの好ましい具体例において、モノクローナル
抗体は、腫瘍において見られるように炎症性の脈管およ
び構造的に異常な脈管の中で循環する抗体に近づくよう
になる血管壁の内皮下の成分に対して特異性を有する。
そのような標的抗原は、フィブロネクチン、ラミニン
（laminin）およびIV型コラーゲンを含む。もう１つの
具体例において、抗体は、血管壁、炎症を起こして血管
のすぐ近くの環境、または腫瘍の壊死領域において、活
性化される凝固カスケードの成分に対して特異性を有す
る。そのような抗原は、フィブリン、トロンビンおよび
補体系の成分を含み、抗体はこれらの特異性とともに利
用できる。さらにもう１つの具体例は、正常な脈管でな
く、炎症を起こした血管における内皮細胞で選択的に発
現される抗原に対して特異性を備える抗体を用いるもの
とすることができる。そのような抗原は、炎症を起こし
た血管壁への多形核白血球の付着の原因として同定され
てきた種々の細胞付着分子を含むことができる。血液凝
固産物フィブリンは、この方法のための特に好ましい標
的である。血管において内皮下区分に分配され、構造的
な異常または透過性の変化により明らかにされるフィブ
ロネクチンは、この方法のためのもう１つの注目される
標的である。
本発明により提案されるもう１つの具体例は、腫瘍に
対する特異性を備えるモノクローナル抗体への血管作動
成分の化学的結合である。この例において、モノクロー
ナル抗体は、腫瘍内で腫瘍細胞と結合する間または結合
した後、腫瘍の部位に血管作動性成分を配置するように
働く。次に、血管作動性成分は、モノクローナル抗体結
合の隣接領域において周囲の血管に作用する。
本発明により提案されるもう１つの具体例は、分子レ
ベルにおいて、すなわち、生体に導入されるべき「カセ
ット」の構築による血管作動性薬剤への配達媒体の結合
であり、該カセットは、最小限で、配達媒体および血管
作動性ペプチドをコードする遺伝子を含む。もう１つの
具体例においては、カセットは、制御配列も含むことが
できる。カセットは、生体のゲノム、プラスミド、また
は、たとえばウイルスもしくはレトロウイルスのような
ベクター中に挿入することができる。
さらに本発明は、腫瘍の脈管構造または新しい腫瘍の
脈管構造と競合する「漏れやすい」脈管構造に対する少
なくとも３つの抗原標識を開示し、腫瘍部位、炎症を起
こした組織、腫瘍、および「漏れやすい」脈管を含む同
様の部位への特異的な局在化が可能な配達媒体を構成す
るために同じものを使用する手段を提案する。
従って、本発明の一局面によれば、腫瘍組織の部位に
集中することができる能力を有するモノクローナル抗
体、およびそれに結合された血管作動性の薬剤を備える
免疫抱合体が提供される。好ましい具体例において、モ
ノクローナル抗体は腫瘍細胞に対する特異性を有し、特
に好ましい具体例において、モノクローナル抗体はＢ細
胞のリンパ腫細胞に結合された抗原に対する特異性を有
する。この具体例によれば、モノクローナル抗体はLym
−１またはLym−２であり得る。
一具体例によれば、血管作動性薬剤は、ペプチドを備
え、好ましい具体例において、このペプチドは、タキキ
ニンである。特に好ましい具体例において、タキキニン
は、フィロメダシン（phyllomedusin）、フィザレミン
（physalaemin）およびサブスタンスＰからなる群から
選択される。
もう１つの好ましい具体例によれば、血管作動性ペプ
チドはロイコトリエンを含む。特に好ましい具体例にお
いて、コイコトリエンは、B4、C4、D4、およびE4からな
る群から選択される。
もう１つの好ましい具体例によれば、血管作動性ペプ
チドは、アナフィラトキシンを含む。特に好ましい具体
例において、アナフィラトキシンは、C3aおよびC5aから
なる群から選択される。
さらにもう１つの具体例によれば、血管作動性ペプチ
ドは、リンフォカインである。特に好ましい具体例にお
いて、リンフォカインは、インターロイキン−１、イン
ターロイキン−２および腫瘍壊死因子からなる群から選
択される。
もう１つの好ましい具体例において、血管作動性ペプ
チドは走化性因子ECF−Ａである。
さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動
性ペプチドは、炎症性物質である。特に好ましい具体例
において、炎症性物質は、マストパラン（mastoparan）
およびベスタチン（bestatin）からなる群から選択され
る。
さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動
性ペプチドは、プロテアーゼである。特に好ましい具体
例において、プロテアーゼは、トリプシン、キマーゼ
（chymase）およびトロンビンからなる群から選択され
る。
さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動
性薬剤は、血管作動性炭水化物である。特に好ましい具
体例において、炭水化物はグルカンおよびプロテオグル
カンからなる群から選択される。
さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動
性薬剤は、脂質である。特に好ましい具体例において、
脂質は、血小板活性因子およびプロスタグランジンから
なる群から選択される。代わりに、脂質は、薬剤ビプロ
ストール（Viprostol）として誘導され得る。
本発明のもう１つの具体例において、血管作動性薬剤
は生物学的アミンである。特に好ましい具体例におい
て、アミンはヒスタミンである。
本発明のもう１つの局面によれば、免疫抱合体のモノ
クローナル抗体は、無傷の免疫グロブリンとすることが
できる。好ましい具体例において、モノクローナル抗体
は、一価のHLイソ型からなる免疫グロブリンフラグメン
トであり得る。もう１つの好ましい具体例において、モ
ノクローナル抗体はFc部が取り除かれたものの１つであ
る。特に好ましい具体例において、モノクローナル抗体
はＦ（ab′）２成分の形態である。
本発明のもう１つの局面によれば、腫瘍を治療するた
めの方法が提供され、その方法は、腫瘍の宿主の血管作
動性の免疫抱合体を投与する工程（そこにおいて、免疫
抱合体は、腫瘍組織の部位に集中する能力を有している
モノクローナル抗体またはその他の配達媒体を有する）
と、免疫抱合体を腫瘍組織に結合させかつ免疫抱合体の
血管作動性効果を起こさせる工程と、それと同時または
その後において腫瘍の宿主に治療薬を投与する工程とを
備える。好ましい具体例において、投与される治療薬は
細胞障害性の化学剤である。特に好ましい具体例におい
て、投与される治療薬は細胞障害性の免疫学的薬剤であ
る。
もう１つの具体例において腫瘍を診断するための方法
が提供され、その方法は、腫瘍の宿主に血管作動性の免
疫抱合体を投与する工程（そこにおいて、免疫抱合体は
腫瘍の部位に集中する能力を有するモノクローナル抗体
を備える）と、腫瘍組織に免疫抱合体を結合させかつ免
疫抱合体の血管作動効果を起こさせる工程と、それと同
時またはその後に宿主に免疫診断薬を投与する工程とを
備える。
さらに、本発明のもう１つの局面によれば、腫瘍組織
の部位に集中する能力を有する配達媒体、および配達媒
体に結合された薬剤を備える抱合体が提供され、該薬剤
は、腫瘍組織に対して、組織への血液供給を増加させる
ことにより、異なる抗腫瘍剤の作用を増強するよう働
く。もう１つの具体例は、正常で健康な血管内皮を透過
することができず、一方、腫瘍組織の血管内皮を透過す
ることができるために十分な大きさの抱合体を提供す
る。
もう１つの具体例において、薬剤は、血管内皮の活性
部位で血管透過性を増加させるように働き、一方、本発
明のさらにもう１つの具体例は、上記薬剤が血管内皮の
活性部位で局所的な炎症反応を刺激または激化するよう
に働くことを提案する。
開示される発明の種々の具体例において、上記薬剤
は、たとえば、薬物、血管作動性ペプチド、生物学的ア
ミン、または製薬化合物を含むことができる。同様に、
抱合体は、たとえば、グルカンまたはプロテオグルカン
のような炭水化物を含むことができ、あるいは、それは
血小板活性化因子またはプロスタグランジンのような脂
質を含むことができる。
本発明のもう１つの局面は、損傷を受け、炎症が起こ
り、または構造的に異常な血管の内皮において選択的に
発現される分子に対して特異性を有する配達媒体を提供
する。好ましい配達媒体は、限定されることなく、Ｆ
（ab′）２、Ｆ（ab）もしくは免疫グロブリン分子のHL
フラグメント、デキストラン、モノクローナル抗体、ま
たはリポソームを含む。とくに好ましい具体例におい
て、リポソームは、80nmのオーダーの直径を有し、デキ
ストランは、高分子量（70−150kD）のデキストランで
ある。さらにより好ましい具体例において、デキストラ
ンは透過性の血管壁において選択的に集中する。
もう１つの具体例において、腫瘍に見られるような炎
症を起こした脈管および構造的に異常な脈管において循
環する抗体に近づきやすくなる血管壁の内皮下成分に対
して、配達媒体は特異性を有する。提案される成分は、
限定されずに、フィブロネクチン、ラミニンおよびIV型
コラーゲンを含む。
さらなる具体例は、血管壁、炎症を起こした血管のす
ぐ周囲の環境、または腫瘍の壊死領域において活性化さ
れる凝固カスケードの成分に対して特異性を有する配達
媒体を開示する。もう１つの好ましい具体例において、
この成分はフィブリン、トロンビンおよび補体系の成分
を含む。
さらにもう１つの具体例において、配達媒体は、腫瘍
の付近には認められ、炎症を起こしていない血管組織に
は認められないような、炎症を起こした血管組織の内皮
細胞中または上に選択的に発現される抗原に対して特異
性を有する。本発明により提案される抗原は、炎症を起
こした血管組織への多形核白血球の付着を引起こすこと
ができる細胞付着分子、フィブリン、フィブロネクチ
ン、フィブリン減成産物、細胞酵素、血小板、および血
小板産物を含む。さらなる具体例において、酵素は、ペ
ルオキシダーゼまたは壊死もしくは炎症を起こした組織
において放出される多のタンパク質を含む。
また、本発明は、腫瘍組織の治療または診断のための
方法を提供し、その方法は、腫瘍組織の部位に、その部
位への血液供給を増加させることによりその組織に対す
る異なる抗腫瘍剤の作用を強化するように働く薬剤と抱
合されている抗体を集中させる能力を有する効果的な量
の配達媒体を宿主の組織に投与する工程と、治療薬また
は診断薬に結合された、組織の部位に集中する能力を有
する配達媒体を備える、第２の抱合体を宿主に同時にま
たは後に投与する工程とを含む。
もう１つの具体例は、腫瘍組織の免疫治療のための方
法を提案し、その方法は、ここに示された抱合体の有効
量を腫瘍の宿主に投与する工程と、それと同時にまたは
その後に、その組織の部位に集中する能力を有しかつそ
の治療に向けられている配達媒体を腫瘍の宿主に投与す
る工程とを備える。さらなる具体例は、殺腫瘍剤の配達
媒体への抱合を開示する。
さらにもう１つの具体例は、腫瘍組織の免疫治療のた
めの方法を提案し、その方法は、ここに示された抱合体
の有効量を宿主の組織に投与する工程と、それと同時に
またはその後にその組織の治療に向けられる薬剤を宿主
に投与する工程とを備える。
さらなる具体例において、腫瘍組織の免疫診断のため
の方法が開示され、この方法は、ここに示された抱合体
の有効量を宿主の組織に投与する工程と、それと同時ま
たはその後にその組織の部位に集中する能力およびそこ
に結合された検出可能な試薬を有する配達媒体を備える
第２の抱合体を宿主に投与する工程とを備える。
もう１つの具体例は、炎症を起こした組織の免疫治療
のための方法を開示し、その方法は、ここに示された抱
合体の有効量を腫瘍の宿主に投与する工程と、それと同
時またはその後にその組織の部位に集中する能力を有
し、かつその治療に向けられた第２の配達媒体を宿主に
投与する工程とを含む。
炎症を起こした組織の免疫治療のための方法がさらに
ここに開示され、その方法は、ここに示された抱合体の
有効量を宿主の組織に投与する工程と、それと同時また
はその後にその組織の治療に向けられる薬剤を宿主に投
与する工程とを備える。
本発明のもう１つの局面は、薬剤として使用するため
に抱合体を構成するための方法を提供し、その方法は、
腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配達媒体または
それと同じものをコードするヌクレオチドを、腫瘍組織
への血液の供給を増強するよう働く少なくとも１つの薬
剤またはそれと同じものをコードするヌクレオチドに付
加することを含む。本発明は、さらに、治療用のキット
を提供し、該キットは、腫瘍組織の部位に集中する能力
を有する配達媒体および腫瘍組織への血液供給を増強す
るよう働く配達媒体に結合された薬剤からなる抱合体、
ならびに抗腫瘍性の治療薬を含む。加えて、本発明は、
診断用キットを開示し、該キットは、腫瘍組織の部位に
集中する能力を有する配達媒体および腫瘍組織への血液
の供給を増強するよう働く配達媒体に結合された薬剤か
らなる抱合体、ならびに腫瘍造影剤を含む。
最後に、もう１つの具体例は、遺伝子によって抱合体
を構成するための方法を開示し、該方法は、少なくとも
１つの薬剤またはそれと同じものをコードするヌクレオ
チドを、少なくとも１つの配達媒体またはそれと同じも
のをコードするヌクレオチドに付加することを備える。
本発明のこれらまたはその他の長所および特徴は、以
下の記述およびそれに続く請求の範囲からより十分に明
らかになるであろう。
詳細な記述 系統だって投与される血管作動性の薬剤は、正常な血
管においてよりも腫瘍性の血管において、より幅広い変
化を引起こすことが示されている（たとえば、ケイター
（Cater）他、Br.Cancer 20:517（1966）参照）。この
効果は、モノクローナル抗体もしくは腫瘍内の異常な血
管の血管壁または直接包囲する環境において分子と結び
つく他の成分に血管作動性の薬剤を結合することにより
最大限にすることが可能である。本出願は、上記に引用
した本発明者による先の出願の延長であり、そのでは、
腫瘍に対して特異性を有する抗体は、透過性の変化を誘
導する目的で、血管作動の薬剤に結合された。本出願
は、腫瘍細胞に対する抗体を使用する代わりに、血管壁
の構成部分または直接血管に近い環境における他の分子
に対して特異性を有する抗体を利用することにより、透
過性の変化がより効果的に得られることを認める点にお
いて先の出願と異なる。腫瘍細胞に対する抗体は、血管
から切離された少し遠くにあるものであり、したがっ
て、血流中で循環する抗体によって「示される」もので
はない。
好ましくは、使用される抗体は、次の特異性を有す
る。第１として、種々の血管作動性の薬剤との化学的な
抱合の後、それらは抗原に結合する能力を保持する。第
２として、それらは、血液または正常で無傷の非炎症性
の内皮のいずれの構成要素にも結合しない。第３とし
て、それらは、血液から組織内に、正常な血管の内皮を
横切って通過する傾向をほとんど示さないかまたは示さ
ない。第４として、それらは、腫瘍内の多くの血管のよ
うに、炎症を起こしているかまたは構造上異常である血
管内またはその付近で選択的に発現される分子に結合す
る。最後に、結合の際、抱合された抗体は血管壁におけ
る活性部位に直接、血管作動性の化合物を配達する。爆
発的な透過性の変化が、さらにその部位におけるモノク
ローナル抗体の結合に有効に働き、それにより、腫瘍血
管において生理的な変化が確立されるが、一方で正常な
血管は影響されない。
腫瘍血液流におけること局在された透過性の変化およ
び／または増加の誘発に続いてすぐに、静脈内に注入さ
れた薬剤またはモノクローナル抗体のような効果のある
治療薬は、異常に透過性のある部位において血液から組
織液への選択的な通過を示す。この機構により、腫瘍部
位に配達される薬剤の容量のパーセンテージは、ここに
記述される実験において２〜６倍に増加されている。こ
の方法は、腫瘍部位に、モノクローナル抗体、または薬
剤、毒素もしくは放射性同位体を伴うモノクローナル抗
体のいずれかの薬剤での制癌剤の配達を改良するために
利用されてもよい。
透過性の血管壁において選択的に局在する高分子量デ
キストラン（すなわち、70−150キロダルトン,kD）のよ
うな他の成分が、血管作動性の薬剤のため配達媒体とし
てモノクローナル抗体の代わりに使用されてもよい（た
とえば、ドボラーク（Dvorak）他、Am.J.Pathol.133:95
−109（1988）参照）。さらなる例として、80ナノメー
ター（nm）のオーダーの直径を有するリポソームは、腫
瘍の透過性の血管壁を横切って選択的に通過を示すもの
として開示され、透過性増強治療のための配達媒体とし
て使用されてもよい（癌治療における薬剤媒体としての
リポソームの使用の議論に関しては、バインスタイン
（Weinstein）,J.N.,Cancer Treatment Rep 68:127−13
4（1984）参照）。
同様の考えが、１）改良された放射性造影を得るとい
う目的に対して腫瘍部位へ抗体−同位体抱合体を配達す
ること、２）患者への全体的用量を増加することなしに
微生物付近に薬剤濃度を増加するために、炎症性の薬剤
により引起こした炎症の部位へ抗微生物剤を配達するこ
と、および３）炎症の有毒な効果を抑制する目的で、生
体を通じて急性的または慢性的炎症の部位へ種々の抗炎
症性薬剤を配達することに適用される。各場合におい
て、指定された治療薬のI.V.投与は、抗体−血管作動性
薬剤の抱合体のI.V.注入の後行われ、治療薬の作用の必
要な部位の一時的な透過性の増進を得ることが図られ
る。
さらに、具体例では、腫瘍または炎症を起こしている
組織における壊死性領域内の構造的に異常な血管におい
て血流に晒されている高分子に対するモノクローナル抗
体を使用する。このような抗原は、フィブリン分解産
物、または壊死性のまたは炎症性の組織において顆粒細
胞または他の細胞により放出されるペルオキシダーゼの
ような種々の細胞酵素を含む。
抗体への結合のための種々の血管作動性の化合物は、
以下に記載した化合物に類似であり、かつペプチド、炭
水化物、脂質およびそれらの誘導体を含む。
もう１つの具体例は、正常な血管ではなく、炎症を起
こした血管において、内皮細胞上で選択的に発現される
抗原に対して特異性を有する抗体を使用する。このよう
な抗原は、炎症を起こした血管壁への多形核白血球の付
着を生じさせるものとして同定されてきた種々の細胞付
着分子を含んでいる。血管凝固産物フィブリンは、特に
このアプローチに対して好ましい標的である。フィブリ
ンは、正常には、血流内に存在せず、循環する前駆物質
分子フィブリノーゲンとしてのみ存在し、それは約340
キロダルトン（kD）の分子量を有する。同様に、フィブ
リンは、正常な組織または組織液には存在しない。なぜ
なら、その高分子量のため、正常で無傷の内皮を横切る
血液からの逸脱は不可能であるからである。
しかし、内皮の損傷または増加した透過性の存在下で
は、フィブリノーゲンは、脈管内の血餅形成機構の活性
化を通じて急速にフィブリンに転換されるような組織に
移行することができる。そして、フィブリン沈積物が、
透過性の変化の部位において形成される。腫瘍では、フ
ィブリンの微量沈積物が、特に毛細管の新芽および完全
な内皮の内層を欠く血液チャンネルの近傍に存在する。
さらに、フィブリノーゲンは、その分子量特性によ
り、血管の漏出マーカーとして役立つ。第２に、その検
出は、血管からの逸脱において直に不溶性産物へ転換す
ることによって、容易なものとされる。フィブリンに対
して向けられたモノクローナル抗体（フィブリノーゲン
と非反応性である）は、それゆえ、フィブリノーゲン漏
出およびフィブリン沈積により「標識された」透過性の
ある血管に選択的に帰することを示す。
フィブロネクチン、これは血管における内皮下の区分
に分配され、かつ構造上の異常または透過性の変化によ
り明らかにされ、このアプローチに対して重点的に取り
扱われるもう１つの標的である（たとえば、クリステン
セン（Christensen）他、Cancer,1988;ドボラーク（Dvo
rak）他、NEJM 315:1650（1986）；およびジェイン（Ja
in）,Cancer Res.48:2641（1988）参照）。血管作動性
の抱合体の他の具体例はまた、他の薬剤または分子と同
様に、血管外の浸透およびモノクローナル抗体の結合を
向上させるものを含んで、有効なものとなり得る。巨大
分子が使用される場合に、ここに開示される抱合体が有
効であることが示されるのと同様に、化学的治療薬のよ
うなより小さい分子もまた浸透および結合を増加させる
ことができる。
モノクローナル抗体以外の媒体を使用する具体例で
は、高分子（分子量範囲:70,000−1,000,000またはそれ
以上）、または、生理−化学的な特性に基づいて透過性
のある血管に局在する80ナノメーター（nm）のオーダー
の直径を有するリポソームを含む微粒子を使用する。一
例では、デキストラン（分子量150kD）が、血管作動性
薬剤と抱合され、最低限の透過性の変化を示す血管に生
物学的に活性のある分子を配達する役目を果たし、それ
によって当該部位のみにおいて著しく透過性を高める。
結果として、その後投与される治療のモダリティ（moda
lity）は、開始部位においてより高い割合の用量をもた
らす。
本発明の免疫抱合体は、遺伝子を用いる方法により、
または共有結合的もしくは他の態様で、選択された臨床
的に有用なモノクローナル抗体を、炎症を刺激し好まし
くは血管作動性である、選択された生物学的に活性な薬
剤に、結合することにより、調製される。免疫抱合体を
組み立てる結合試薬および化学的方法は、標的細胞に結
合する抗体の有効性または天然の防御機構を刺激する際
の血管作動性薬剤の有効性を損なわないように選択さ
れ、遂行されるべきである。
配達媒体の選択 1.モノクローナル抗体 本発明における使用に対して最適なモノクローナル抗
体は、腫瘍細胞に特有の抗原に対して特異性を有するも
のだけでなく、正常な組織の抗原に対して共有される特
異性を有するものも含む。必須の特性は、これらのモノ
クローナル抗体が腫瘍部位において血管作動性の薬剤を
選択的に集中する担体として、本発明の目的に従って効
果的であるということである。適当なモノクローナル抗
体は、正常な組織においてよりも腫瘍細胞においてより
豊富にあるかまたは容易に結合される細胞間物質のよう
な抗原に対して特異性を有するものとすることがえき
る。一例は、米国特許第4,861,581号に開示されるよう
な核抗原に対する抗体である。
腫瘍または正常な細胞抗原に対するいくつかのモノク
ローナル抗体で、本発明の免疫抱合体での使用に適用な
ものは、市販品として入手できる（Centocor,Malvern,P
A;Hybritech,San Diego,CA）。それ以外のものは、コウ
レル（Kohler）およびミルスタイン（Mlistein）のよく
確立されたハイブリドーマ法に従って調製されてもよく
（Nature 256:495（1975））、市販のキットはこの方法
を容易にする。ハイブリドーマ細胞系を調製するため
に、腫瘍抗原で免疫化されたマウスからの脾臓細胞が、
たとえば、HyBRLプレップキット（Prep Kit）（Bethesd
a Research Labs,Bethesda,MD）のようなキットの教示
に従って、P3X63−Ag8.653（American Type Culture Co
llector,Rockwell,MD）のような、非−分泌性マウスミ
エローマ融合系からの細胞と融合される。融合されたハ
イブリドーマ細胞は、その後マイクロタイタープレート
のウェルに移植され、そこでそれらは、数日間生育され
る。ウェルにおける上清は、たとえば、ELISAのような
簡便なイムノアッセイにより、腫瘍または細胞抗原に対
するモノクローナル抗体の生産について試験され、陽性
のハイブリドーマ細胞系、すなわち条件にあうモノクロ
ーナル抗体を生産するものが永久培養へと広げられる。
モノクローナル抗体は、たとえば、Affi−Gel Protein
Aカラム（Bio−Rad,Richmond,CA）を使用するゲルクロ
マトグラフィーによりこれらの培養物の上清から精製す
ることができる。
本発明の好ましい具体例では、リンパ腫細胞に対して
特異的で市販品として入手できるモノクローナル抗体、
Lym−１およびLym−２が使用される（Techniclone Inte
rnational,Inc.,Tustin,California）。
生体内での使用に対する腫瘍特異的モノクローナル抗
体の適合性は、生体分布、細胞位置測定、選択的結合、
および腫瘍宿主からのクリアランスの割合、または腫瘍
宿主の動物モデルにより測定される。組立てられた免疫
抱合体の作用はまた平行する複数の調査によっても測定
することができる。この適合性を評価するための調査
は、たとえば、放射性ヨウ素で標識された131I−モノク
ローナル抗体のようなラベルされたモノクローナル抗体
の手段により、またマクファーレン,A.（McFarlane,A.,
Biochem.J.62:135−143（1956））の修飾されたクロラ
ミン−Ｔ法により都合よく行われる。
放射性同位体でラベルされた抗腫瘍モノクローナル抗
体の免疫反応性は、Lym−１およびLym−２モノクローナ
ル抗体に関する例１において記述されるような試験管内
の生細胞ラジオイムノアッセイ法により測定されてもよ
い（エプスタイン（Epstein）,A.他、悪性リンパ腫およ
びホジキン病：実験的および治療的進歩（Malignant Ly
mphomas and Hodgkin's Disease:Evperimental and The
rapeutic Advances）,Martinus Nijoff Publ.Co.,Bosto
n（1985）,pp.569−577）。
生体内における抗腫瘍モノクローナル抗体の有効性
は、ラベルされたモノクローナル抗体を、腫瘍を有する
宿主に注入した後、続いて行われる適切な放射性造影、
生体分布、組織学的調査およびオートラジオグラフィー
法により評価することができる。
腫瘍部位において選択的に集中するモノクローナル抗
体の能力は、放射性造影により測定される。後方ガンマ
シンチレーション造影（100,000cpm）は、ピンホール絞
りを有するガンマシンチレーションカメラを使用して、
放射性同位体でラベルされたモノクローナル抗体の注入
後、１日おきに麻酔された宿主から得られる。できるこ
とならばカメラはコンピュータシステムにインターフェ
イスされているとよい。同じ活性を有する適当な131I標
準物質がデータを定量化するためカウントされる。
造影調査により示されるような最適な時期に、宿主動
物は、殺され、血液、主要な器官および腫瘍組織が摘出
され、重量を計られ、モノクローナル抗体の生体分布を
測定するためにカウントされる。さらに、腫瘍組織は、
固定され、包埋されてもよく、組織切片は、腫瘍に結合
された放射性同位体でラベルされたモノクローナル抗体
を測定するためオートラジオグラフィーによって調査さ
れる。
免疫抱合体のモノクローナル抗体は、無傷の前抗体、
一価のHLイソ型、抗体のＦ（ab′）２部位、またはFab
抗体フラグメントのいずれであってもよい。抗体分子の
Fc部位の全体または部分の除去は、抗原結合部位を無傷
のまま残して、Fc受容体または補体のような腫瘍でない
構成要素と相互作用する部位または領域を取除くことに
より、その使用を容易にし得る。Fab、HLおよびＦ（a
b′）２のような抗体フラグメントは、それぞれ全抗体
の1/3、1/2および2/3の重量を有し、毛細血管壁を通り
抜けるための能力を有し、より急速に間質組織を通って
拡散するので、腫瘍内により急速に拡散することができ
る。しかし、一方で、Fab、HL、およびＦ（ab′）２フ
ラグメントはより急速に循環から排除される。ウィルボ
ン他（Wilbonk et al.,Cancer 48:1768−1775（198
1））は、Fabフラグメントを用いてより高い腫瘍：器官
の結合比を見出す一方、全抗体を用いれば、腫瘍におい
て３倍高い絶対濃度が必要であることを見出した。モノ
クローナル抗癌胎児性抗原（CEA）を用いた研究におい
て、ワール他（Wahl et al.,J.Nucl.Med.24:316−325
（1983））は、Ｆ（ab′）２が、急速に排除されるFab
フラグメントとゆっくり排除される全抗体との間の最も
好ましい中間物であることを見出している。Fabフラグ
メントは、パパインにより全抗体の消化、またはペプシ
ンによるＦ（ab′）２フラグメントへの全抗体の消化に
よって調製することができ、一価のフラグメントを産出
するため分子間鎖ジスルフィド結合の消化により与えら
れてもよい（ポーター（Porter）,R.,Biochem.J.73:119
（1959）参照）。HLフラグメントは、Nature 194:355
（1962）またはPNAS（USA）50:314−321（1963）におい
てすでに示された技術に従って誘導されてもよい。
2.高分子またはマイクロ粒子 リポソームおよびデキストランのような高分子は、実
験モデルにおいて放射性造影により検出されるような腫
瘍に局在する能力に基づいて選択される。使用される方
法は、モノクローナル抗体に対して上述した方法に類似
する。
血管作動性の薬剤の選択 本発明の血管作動性の免疫抱合体は、それらの作用の
様式において薬剤または毒素抱合体から区別される。薬
剤および毒素抱合体は、直接的に腫瘍細胞を殺すのに使
用される。血管作動性の抱合体は、血管外に浸透ならび
にモノクローナル抗体および他の薬剤または分子の結合
を生体内で向上させるため、血流の流れおよび／または
腫瘍における血管透過性を増加するのに使用される。そ
れらは、直接的に腫瘍血液流の体積または腫瘍血管の
「漏れやすさ」の程度を増大させることにより、もしく
は間接的に腫瘍部位における炎症の免疫反応を引起こす
ことにより使用する。炎症は、多形核白血球、マクロフ
ァージ、好酸性白血球、好塩基性白血球、肥満細胞、Ｔ
−細胞および炎症に関連のある他の細胞を引き寄せる走
化性因子により引起こされることが可能である。これら
の細胞は刺激されると免疫活性調節因子を分泌し、腫瘍
血液流および血管透過性に作用して、腫瘍へ浸透し、注
入された用量に対する結合割合を増大させる。
腫瘍部位において上述したような反応性を有し、免疫
抱合体においてモノクローナル抗体に結合するのに適し
ている血管作動性の薬剤は、ペプチド、炭水化物、およ
び脂質ならびにそれらの誘導体を含んでいる、いくつか
の生化学種において見出される。
天然の、合成の、または組換え体のいずれのペプチド
も、免疫抱合体における使用に適合する血管作動性の薬
剤の最も豊富な源である。
タキキニンは、デカ（deca）、エンセダ（enceda）お
よびドデカ（dodeca）ペプチドアミド族であり、COOH末
端から５の位置に１つのフェニルアラニン（Phe）残基
を有する。それらは、血圧、非血管性の平滑筋および外
分泌腺において効果的な薬効を有する（エルスパメル
（Erspamer）,V.,TINS,Nov.1981,pp.267−269）。サブ
スタンス−Ｐ、哺乳類のタキキニンは、化学的感受性お
神経繊維の逆行性の刺激を通じて血管拡張およびプラズ
マ血管外遊出を促進する（ラムベック（Lambeck）,F.お
よびハルツェル（Halzer）,P.,Naunyn−Schmeideberg'
s,Arch.Pharmacol.310:175−183（1979））。サブスタ
ンス−Ｐは、また、組織肥満細胞からヒスタミンの放出
を仲介する（ハゲルマルク（Hagermark）,O.他、J.Inve
rt.Dermatol.71:233−235（1978））。本発明の好まし
い具体例では、サブスタンス−Ｐおよび両生類の類似体
フィザレミンが、腫瘍脈管構造の拡張を促進するのに使
用するため、臨床的に有効なモノクローナル抗体に結合
される。
ロイコトリエンは、アトピー性アレルギーにおいて効
力のある媒体物質であるスルフィドペプチドである。臨
床の症状発現および疾患の身体的な特徴は、炎症作用に
関連を有する血管におけるこれらの媒介物質の作用が原
因である。1nmolのロイコトリエンC4、D4またはE4でも
紅斑およびじんま疹形成を引起こす。本発明の好ましい
具体例において、ロイコトリエンB4、C4、D4、またはE4
が、腫瘍部位において局所的炎症反応をもたらすのに使
用するため臨床的に有効なモノクローナル抗体に接合さ
れる。
アナフィラトキシンは、血清補体の活性化の間に放出
されるペプチドフラグメントである。補体プロテインC3
およびC5の酵素的開裂は、それぞれ活性化ペプチドC3a
およびC5aを放出する。これらのペプチドは、アナフィ
ラキシーショックに似た反応をもたらす能力のため、ア
ナフィラトキシンと称されてきた。C3aおよびC5aは血管
の透過性を増大させ、組織肥満細胞からセロトニンおよ
びヒスタミンを含む顆粒を放出させる能力を有する。加
えて、おそらくC3aと協力して、C5aは走化性であり、好
中球の遊走および凝集を引起こす（ナガタ（Nagata）,
S,他、Int.Arch.Allergy Appl.Immun.82:4−９（198
7））。本発明の好ましい具体例では、C3a、C5aまたは
それらの生物学的活性のあるペプチド配列は、単独また
は組み合わせのいずれでも腫瘍特異的なモノクローナル
抗体に結合され、モノクローナル抗体の血管外の浸透性
を促進するための新たなアプローチとして、腫瘍部位に
おいて局在される炎症の反応を引起こすために使用され
る。
これらのペプチドの生物学的な活性は、合成のオリゴ
ペプチド、長さにして８から21アミノ酸、COOH末端にお
いて本来のC3の共通の残基を含んでいるものにより、再
生することができ（たとえば、ハグリ（Hugli）,T.およ
びエリクソン（Erickson）,B.PNAS USA 74:1826−1830
（1977）参照）。
インターロイキンIL−１およびIL−２ならびに腫瘍壊
死因子（TNF）を含むリンフォカインは外来因子に対す
る生物防御における複雑な役割において作用し、相互作
用する免疫反応の内因性刺激物質である（たとえば、カ
ンシュミット（Kampschmidt）,R.,J.Leukocyte Biol.3
6:341−355（1984）参照）。
IL−２は、免疫抱合体への使用に対して、特に重要で
ある。このリンフォカインは、それ自体、抗腫瘍活性を
持たないが、リンフォカイン活性化されたキラー（LA
K）細胞とともに投与されるとき、強い活性を有するよ
うである。抗腫瘍剤としての使用は、限定されるようで
ある。というのも、宿主における透過性および血管外遊
出を仲介する能力は、体液の停留により、激しい副作用
をもたらすからである（フェアマン（Fairman）,R.他、
Cancer Res.47:3528−3532（1987）;Rosenstein他、J.I
mmunol.137:1735−1742（1986）参照）。しかし、IL−
２の血管作動性の特性は、本発明の免疫抱合体における
使用によく適している。IL−１リンパ球からのIL−２の
生産を刺激し、TNFが他のリンフォカインと結合して共
力的な特性を働かせるようなので、それらの免疫抱合体
はIL−２の免疫抱合体と組合わせて有用となる（タルマ
ッジ（Talmadge）他、Cancer Res.47:2563−2570（198
7）；フィリップ（Philip）,R.およびエプスタイン（Ep
stein）,L.,Nature 323,Sept.4,pp.86−89（1986）参
照）。
C3aアナフィラトキシンの場合では、インターロイキ
ンの機能的領域を含む小さな合成オリゴペプチドはまた
免疫抱合体における使用に適している（たとえば、アン
トニ（Antoni）,G.他、J.Immunol.137:3201−3204（198
6）参照）。
また血管作動性の免疫抱合体における使用に適してい
るペプチドのもう１つのグループは、ヒトの好酸球酸性
テトラペプチド（ECF−Ａ）、Val−Gly−Ser−Gluおよ
びAla−Gly−Ser−Gluであり、それらは局所好酸球増加
症を促進する能力を化学走性を通じて有する（ターンボ
ール（Turnball）,L.他、Immunology 32:57−63（197
7））。
さらに血管作動性の免疫抱合体において使用されると
き、ある種のペプチドである炎症物質は腫瘍部位におい
て肥満細胞を脱顆粒化し、ヒスタンミンを放出し、かつ
局所炎症反応を刺激する能力を有する。このような炎症
物質の１つであるマストパランはハチ毒から分離された
テトラデカペプチドである（オカノ（Okano）,Y.他、Fe
d.Europ.Biochem.Soc.188（２）:363−366（1985））。
好ましい具体例において、天然源から分離されたまたは
合成されたいずれのマストパランでも腫瘍特異的モノク
ローナル抗体に結合される（ヒライ（Hirai）,Y.他、Ch
em.Pharm.Bull.27（８）:1942−1944（1979）参照）。
免疫学的活性化において肥満細胞から放出されるプロ
テアーゼは、皮膚における過敏症反応を刺激するようで
ある。これらのプロテアーゼの可能な作用は、結果的に
は血管透過性を増加させかつ二次的炎症細胞の流入を伴
う血管基底膜の消化を含む。トリプターゼ、膵臓トリプ
シンに類似したエンドペプチダーゼは、２つの30キロダ
ルトンおよび２つの37キロダルトンのサブユニットから
なる四量体である。それらはヒトの肺臓肥満細胞の重要
なプロテアーゼであり、あらゆる位置からの肥満細胞に
おいても存在する。ヒトの皮膚肥満細胞において見出さ
れたキマーゼは、膵臓キモトリプシンと同じような特異
性を有する（Serafin,W.およびAurtin,K.NEJM,July 2,p
p.30−34（1987））。本発明の好ましい具体例では、ト
リプターゼおよびキマーゼは、腫瘍部位における局所炎
症反応を引起こす際の使用目的のため腫瘍特異的モノク
ローナル抗体に結合される。
ある脂質化合物は免疫抱合体として有用であり得る。
本発明の一具体例では、血小板−活性化因子（PAF）
が、免疫抱合体の血管作動性の薬剤である。PAFは、免
疫反応の強い媒介物質であると考えられるヒトの好中球
によってもたらされるリン脂質である（ブラケット（Br
aquet）,P.およびRola−Plezzezyhski.M.,Immunology T
oday,8（11）:345−352（1987））。PAFは、たとえば前
に載せた血管作動性のペプチドに関してあらゆる炎症お
よび免疫作用と実質的に結合され、PAFはサブスタンス
−Ｐの放出を刺激し、ロイコトリエンまたはプロスタグ
ランジンのような他の血管作動性剤の形成を誘導する。
免疫抱合体におけるその使用は、内生的であろうとまた
補足的な免疫抱合体として使用されようと、これら他の
薬剤の効果を拡大することができる。
本発明のまたもう１つの具体例では、血圧降下剤ビプ
ロストール、プロスタグランジン誘導体（American Cya
namid,Peal River,Ny）が、免疫抱合体として活性のあ
る薬剤である。ビプロストールは血管拡張を通じて主に
動脈の血圧を低くする（チャン（Chan）,P.他、J.Hyper
tension 4（６）:741−746（1986）参照）。腫瘍特異的
に目標を定められたビプロストールの投与の利用は、そ
こでの血液体積の増大のため、腫瘍の脈管構造を拡大す
る。
同様に、他の具体例において、血圧降下の効果を有す
ることが知られている天然のプロスタグランジン（PGE'
s）またはその合成類似体を効果的に使用することがで
きる（ビルンボイム（Birnbaum）他、J.Medicinal Che
m.25（５）:492−494（1982）参照）。
免疫刺激作用において放出される肥満細胞顆粒の化合
物であるヒスタミンは、他の効果の中でも、ロイコトリ
エンとして記述されるような血管の透過性の増大および
血管拡張を引起こすべく、H1およびH2と呼ばれる２つの
タイプの受容体を通じて作用する（セラフィン（Serafi
n）,W.およびオースチン（Austin）,K.,NEJM,July 2,p
p.30−34（1987））。本発明の好ましい具体例では、ヒ
スタミンは腫瘍部位における局所炎症反応を引起こすの
に使用するため腫瘍特異的なモノクローナル抗体に結合
される。
本発明の他の具体例では、免疫抱合体の効果的な薬剤
は、血管作動性の炭水化物化合物である。好ましい具体
例では、血管作動性の炭水化物はグルカンである。グル
カンは多くの免疫増強効果を有するサッカロミセス・セ
ルビシエ（Sacharomyces Cerevisiae）から誘導される
β−1,6結合されたポリグルコースである（グロブスキ
ー（Glovsky）,M.他、J.Reticuloendotholial Society,
33:401−413（1988））が、インターロイキンIL−２と
は異なり無毒性である（シャーウッド（Sherwood）,E.
他、J.Biological Respones Modifiers7:185−198（198
8）参照）。グルカンは、補体系を刺激し、他の補体フ
ラグメントのうちでも、血管作動性のC3aおよびC5aペプ
チドを生成させることによりその効果を及ぼすようであ
る。特異的なモノクローナル抗体によって腫瘍へ目標を
定められたグルカンは、腫瘍脈管構造を拡張するためC3
aおよびC5aを通じて局部的に作用することができる。
抱合体分子は治療または研究の定まった目標に対する
有効性および適用性によって選択される。
化学的な抱合方法 モノクローナル抗体、高分子、またはミクロ粒子と血
管作動性の薬剤との間の構造上の結合ならびにそれらが
結合される場合の化学的な方法は、モノクローナル抗体
の結合能力および薬剤の生物学的活性について、抱合体
において接続されるとき、損失が最小限にされるように
選択されるべきである。
最も効果的な化学反応を選択し得る方法には次のよう
なものがある。
ａ） カルボジイミドは、尿素類の無水物として扱われ
てもよい。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミド（ECDI）は、いずれの分子の配向
に関係なく、抗体と抱合すべき物質との間に架橋を形成
する。抱合体はECDIを伴う酸性条件下で抗体と抱合すべ
き物質との縮合により誘導される。この方法は、抱合の
迅速でかつ簡単な手段を提供する（グッドフレンド（Go
odfriend,T.他、Science 144:1344−1346（1964）参
照）。フィザレミンまたはインターロイキン−２をLym
−１またはLym−２に結合するためのECDIの使用が、例
２および例７において例示される。
ｂ） Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチ
オ）プロピオネート（SPDP）は、蛋白質の末端アミノに
チオール基を導入し、多くの免疫抱合体において使用さ
れてきたヘテロ二価試薬である（カールソン（Carlsso
n）,J.他、Biochem.J.173:723−737（1978））。
ｃ） モノクローナル抗体のＦ（ab′）２フラグメント
にC3aを結合するためのSMCC法の使用が例３に示され
る。
ｄ） シェンら（Shen,et al.）により記述されるシス
−アコニット結合は、受容体−結合抗体分子のエンドサ
イトーシスに続く二次リソソームにおけるように、低い
pHにおいて抱合した物質を放出する性質を有する。その
方法は、抗体分子の炭水化物側基への抱合を可能にする
（シェン（Shen）,W.C.およびライセル（Ryser）,H.,Bi
ochem.Biophys.Res.Comm.102（３）:1048−1054（198
1））。モノクローナル抗体に薬剤ビプロスタールを抱
合するためのシス−アコニチル誘導体化の使用が、例４
に示される。
ｅ） 過ヨウ素酸酸化は、糖環における炭素−炭素結合
を酸化し、開裂するのに使用できる。さらにむき出しの
末端基は、NaBH4で還元されるシッフ塩基結合で蛋白質
のNH2基と結合することができる（キタオ（Kitao）,T.
およびハットリ（Hattori）,K.Nature 265,January 6,p
p.81−82（1997））。モノクローナル抗体へグルカンを
接合するための過ヨウ素酸酸化の使用が、例５に示され
る。
ｆ） Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）は、モノ
クローナル抗体の蛋白質に共有結合することが可能な活
性エステル誘導体を形成するため、たとえばペプチドの
末端COOH基を活性化する。この方法は、結合活性をほと
んど損失することなくクロランブシル／抗体の30個の分
子を付着するのに使用されている（スミス（Smyth）,M.
他、J.Natl.Cancer Inst.76（３）503−510（198
6））。モノクローナル抗体にマストパランを結合する
ためのNHS法の使用が、例６に示される。
血管抱合体の構成に対する遺伝子工学法 モノクローナル抗体に血管作動性の薬剤を化学結合さ
せる方法に代わる方法として、血管作動性のペプチドの
遺伝子配列を、例11に示されるようにモノクローナル抗
体の配列に組込むことができる。
血管作動性の免疫抱合体の使用 それらが生体内で応用される前に、免疫抱合体に維持
される免疫反応性および生物学的活性の程度を測定する
ため、ビンドら（Bindon et al.）,Br.J.Cancer47:123
−133（1983）によって記述され、例８に示される増殖
ラジオイムノアッセイにより、インビトロで評価する。
非抱合型の抗体に対して80％以上の免疫反応性を有する
とみなされる免疫抱合体のみが生体実験に使用される。
好結果の免疫抱合体は、モノクローナル抗体に基づく
診断および治療における臨床での有効性を最大にするで
あろう。臨床的には、血管作動性の免疫抱合体が、免疫
診断、化学治療法または免疫治療法の投与に先立って、
または同時に与えられることで、腫瘍の脈管構造は効果
的な薬剤をより浸透させやすくなるであろう。最大の血
管作動性効果を引出すのに必要とされる時間は、選択さ
れる特異的な抱合体およびその作用機序によっている。
もし、モノクローナル抗体投与の後に与えられるなら、
血管作動性の免疫抱合体の投与と診断薬または治療薬の
投与との間の最小時間は少なくとも約20分となり、最長
時間は約72時間となることが予想される。血管作動性の
免疫抱合体を投与する時間と薬剤投与との間の最適な間
隔は、動物実験または上述した造影、生体分布調査、お
よび組織学的な方法を用いて標識された免疫抱合体を使
用する腫瘍宿主の適当な調査により、経験的に決定する
ことができる。
与えられるべき血管作動性の免疫抱合体の投与量は、
客観および主観の双方における、医学的判定および経験
の基準に基づく。しかし、効果的な投与量の適切な尺度
は、続いて投与される診断薬または治療薬の局在化を増
進させ、臨床上の治療効果または診断の精度を統計的に
有意な程度にまで向上させるのに必要な量である。等し
い用量の診断薬または治療薬が投与される抱合体で処置
された腫瘍宿主動物と処置されていない腫瘍宿主動物と
の間で比較が行なわれる。たとえば、正常な組織にとっ
ては毒性があるような診断薬または治療薬の使用におい
て適用可能な場合には、血管作動性の抱合体の効果的な
用量は、このような毒性効果をも同様に減ずるような量
となる。
免疫診断上の投与量は、腫瘍に対して特異性を有する
あるいは生体内で検出可能である標識を有するモノクロ
ーナル抗体を含み得る。好ましい具体例では、この標識
は、放射性活性のある同位体を含む。免疫治療上の投与
量は、臨床的に有用なモノクローナル抗体を同様に含ん
でもよい。このモノクローナル抗体はさらに、たとえ
ば、放射性同位体、化学的治療薬または毒素のような殺
腫瘍性の薬剤に取付けられてもよい。
例１ 放射性同位体で標識されたモノクローナル抗体の免疫反
応性 ラジ細胞が、1mg/mlウシ血清アルブミンおよび0.02％
アジ化ナトリウムを含む冷PBSで２度洗浄される（ラジ
細胞の説明および同じものを得るための方法について
は、たとえば、J.Nat'l Cancer Inst.37:547−559（196
6）参照）。10μｌの洗浄緩衝液に再び懸濁された細胞
（５×105）は、マイクロタイターウェルにピペットで
注入される（イムロン レモバウェル ストリップス；
ダイナテックラボラトリーズインコーポレイテッド、ア
レクサンドリア、VA）（Immulon Removawell Strips;Dy
natech labs,.Inc.,Alexandria,VA）。マイクロタイタ
ープレートは、抗体溶液がウェルに結合するのを防ぐた
め、アジドを含むPBS中BSA10mg/mlで一晩前処理され
る。（市販品として入手できるLym−１およびLym−２の
ようなリンパ腫細胞に対して特異的なモノクローナル抗
体は、テクニクローン インターナショナル インコー
ポレイティッド（Techniclone International,Inc.）タ
スチン（Tustin）、カルフォルニアから入手可能であ
る）。放射性同位体で標識されたLym−１およびLym−２
はさらに、100μl/ウェルの容量で（100,000cpm/ウェ
ル）で加えられかつプレートは一定の振とうで室温にお
いて30分間インキュベートされる。さらにプレートは、
５分間1,000rpmで回転させることにより４回洗浄され、
12−チップマイクロマティックマニホールド（12−tip
micromatic Manifold）で上清を吸引し、さらにタイ
ターティックマルチチャンネルピペット（フローラボラ
トリーズ、マクリーン、VA）（Flow Labs,McLean,VA）
を使用して200μｌの洗浄緩衝液中に細胞を再び懸濁す
る。ウェルはその後機械的に切り離され、細胞に結合し
た標識の量を定量するためガンマーカウンタにおいてカ
ウントされる。
例２ CDI法によるモノクローナル抗体へのフィザレミンの抱
合 フィザレミン（シグマケミカルコーポレーション、セ
ントルイス、MO）（Sigma Chemical Co.,St、Louis,M
O）は、カルボジイミド法によりモノクローナル抗体Lym
−１およびLym−２に結合される。フィザレミン、Lym−
１またはLym−２および１−シクロヘキシル−３−（２
−モルホリノエチル １）カルボジイミドメト−ｐ−ト
ルエンスルホネート（CDI）（アルドリッチケミカルコ
ーポレーション、ミルウォーキー、WI）（Aldrich Chem
ical Co.,Milwaukee,WI）は、1:3.6:3の重量比で混合さ
れ、室温でpH5.0において20分間インキュベートされ
る。反応は、pH7.2で一晩、PBSに対する透析により終結
させられる。抱合体は、FPLCシュープロース（Superos
e）（ファルマシア、ピスカタウェィ、NJ）（Pharmaci
a,Piscataway,NJ）カラムクロマトグラフィーで精製さ
れ、PBSにおいて４℃で保存される。
例３ SMCC法によるＦ（ab′）２モノクローナル抗体へのC3α
ペプチドの抱合 C3α（57−77）ペプチドは、二官能性の試薬、スクイ
ンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキ
サン−１−カルボキシレート（SMCC）を使用してＦ（a
b′）２モノクローナル抗体に結合される（M.ハーマ他
（M.Herman,et al.）「予め決定されている特異性を有
する抗ペプチド抗体は汎−特異的造血IL−３の生物活性
を認識しかつ中和する」J.Immunol.138:1099−1104（19
87））。
モノクローナル抗体は、抗体のFc部位により白血球に
非特異的に結合することを避けるためペプシンを使用し
てＦ（ab′）２フラグメントに切断される。Ｎ−末端シ
ステイン残基を含むC3α（57から77）は自動化されたプ
ロテイン合成を使用して合成される。C3αペプチド（1m
g）はpH7.5で300μｌの4Mグアナジニウム−PBSに溶解さ
れる。pHは、約3Lの17％H3PO4で３と４の間に透析によ
り調整される。この溶液は、レシービング管（17×100m
m）に収容される。
Ｆ（ab′）２抗体（60nmol）は、pH7.5で1.0mlPBSに
溶解され、ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解した240
0nmolの「試験」（SMCC）と反応させ、室温で30分間か
き混ぜられる。Ｆ（ab′）２混合物は、セファデクッス
（Sephadex）（ファルマシア、ピスカタウェイ、NJ）Ｇ
−10カラム（2ml）にかけられ、１分間1500Gで遠心分離
され、レシービング管に集められる。カラムはpH7.5の3
00μl PBSで洗浄し、かつ再遠心分離される。pHは、7.0
と7.7の間に調整され、混合物は室温で３時間かき混ぜ
られる。
抱合された抗体は４℃で保存される。
C5αは二官能性の架橋試験ジメチルスーパーイミデー
トまたはSPDPを使用してＦ（ab′）２抗体に結合され
る。条件は、1/1 C5α−Ｆ（ab′）２抱合体を生成する
ため、かつC5αまたはＦ（ab′）２いずれか単独の重合
を最小限にするため、調節される。
例４ シス−アコニチル誘導体化によるモノクローナル抗体へ
のビプロストールの抱合 ビプロストールは、その11−ヒドロキシ基を介してシ
ス−アコニチルのスペーサアームを付加することにより
誘導体化することができる。この反応において、ビプロ
ストール（5mg）は、試験管内で1mlの0.1M Na2HPO4に
溶解され、氷浴で冷却される。モル過剰（5mg）のシス
−アコニチルアンヒドリド（アルドリッチケミカル、ミ
ルウォーキー、WI）（Aldrich Chemicals,Milwaukee,W
I）が混ぜながら溶液にゆっくりと加えられ、pHは1N N
aOHを注意深く加えることにより８と９との間に保たれ
る。サンプルの薄層クロマトグラフィーが反応の進行を
モニタするのに使用される。3H−または14C−でラベル
されたビブロストールのトレーサーが反応混合物に加え
られてもよく、反応の経過は薄層プレートのオートラジ
オグラフィーによってモニタされる。誘導体の分離およ
び精製は、生成物の酸性化および精製またはカラムクロ
マトグラフィーを使用することにより行なってもよい。
モノクローナル抗体にビプロストールを結合するため、
シスアコニチルビブロストール誘導体は、Lym−１また
はLym−２モノクローナル抗体を含んだ溶液に加えられ
る。混合物は、さらにpH5.0において室温で30分間イン
キュベートされる。反応は停止され、抱合体はセファデ
ツクスＧ−25カラムを通じて、またはFPLCシュープロー
スカラムクロマトグラフィーによってサンプルを溶離す
ることにより精製される。
例５ 過ヨウ素酸酸化によるモノクローナル抗体へのグルカン
の抱合 グルカンは生物活性に影響を与えることなく、NaIO4
の１から２モル過剰のみを使用して、糖部分の１つを切
断するため過ヨウ素酸酸化を使用することにより注意深
く酸化される。酸化により、グルカン内に生じたアルデ
ヒド基は、モノクローナル抗体上の−NH2基に反応して
シッフ塩基を形成する。シッフ塩基結合は、さらにグル
カン−モノクローナル抗体抱合体の安定したアミン結合
を生成するため、0.3mg/mlの濃度でNaBH4によら還元さ
れる。
例６ NHS法によるモノクローナル抗体へのマストパランの抱
合 マストパランの活性エステルは、縮合試薬としてN,N
−ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）を使用した
ジメチルホルムアミド中のＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ド（NHS）との反応によって調製される。DMFにおけるマ
ストパラン活性エステルの溶液は、さらにpH7.0でLym−
１またはLym−２モノクローナル抗体を含む溶液に加え
られ、室温で１時間から２時間かけて反応させられる。
不溶物質、主にジシクロヘキシルウレアおよび／または
沈殿した蛋白質が、遠心分離により除去される。遊離マ
ストパランおよび他の未反応の出発原料は、セファデッ
クスＧ−25（ファルマシア、ピスカタウェイ、NJ）カラ
ムを使用するゲル濾過クロマトグラフィーにより除去す
ることができる。抱合体において結合されるマストパラ
ンの量は、トリチウム（H3）で標識されたマストパラン
のトレーサーを使って測定される。
例７ CDIによる腫瘍特異的なモノクローナル抗体へのインタ
ーロイキン−２の抱合 組換型インターロイキン−２（rIL−２）（シータス
コーポレーション、エメリービル、カルフォルニア）
（Cetus Corporation,Emeryville,California）は、バ
イアル当り0.3mgまたは1.2mgを含むようバイアルに与え
られる。pH7.4のリン酸塩緩衝液において全体積が0.3ml
となるよう、Lym−１のような精製されたモノクローナ
ル抗体、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリノエ
チルカルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート）
（CDI）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドを
1:2:50:50の重量比で使用して、精製されたモノクロー
ナル抗体をrIL−２に抱合する。反応混合物は４℃で一
晩インキュベートされる。４℃で15分間4000rpmで遠心
分離後、可溶性の結合抗体はブルーデキストランで検量
されたセファデックスＧ−100カラムにおいてクロマト
グラフィーにかけられる。この方法を使用することでrI
L−２の約１−２分子が各モノクローナル抗体分子に結
合される。その免疫抱合調製物は、さらに1mg/mlに調整
され、無菌濾過され、使用まで４℃で保存される。この
方法は、いかなる腫瘍特異的なモノクローナル抗体にrI
L−２を結合するのにも使用することができる。
例８ 治療薬へのインターロイキン−２の抱合 上述と同様の抱合方法が、腫瘍の内皮に対して特異性
を有するモノクローナル抗体にIL−２を結合するために
使用することができる。例として、フィブロネクチンに
対するモノクローナル抗体が、正常な内皮と比較して、
腫瘍の脈管構造に選択的に結合するため示されてきた。
腫瘍部位におけるrIL−２の最初の作用が、血管の透過
性を促進することであるため、腫瘍内皮への血管作動性
免疫接合体の攻撃は最良となるであろう。加えて、同様
の方法論を用いて、rIL−２抱合体の治療は、たとえ
ば、異なったタイプの癌の治療のためのシスプラチナを
含む通常の化学治療剤の使用により補われるかまたは継
続され得る。
例９ 遺伝子組換により生産される血管作動性免疫抱合体 腫瘍または腫瘍の脈管構造を標的とするモノクローナ
ル抗体は、血管作動性ペプチドを化学的に結合する代わ
りに、血管作動性ペプチドの遺伝子配列をモノクローナ
ル抗体の配列に組込むことができる。例として、抗フィ
ブロネクチンモノクローナル抗体をコードするmRNAが分
離される。このmRNAから、免疫グロブリンのＨおよびＬ
鎖の両方のためのcDNAが合成される。このcDNAは、順
次、１）ポリメラーゼ連鎖反応を利用して増やされ、
２）配列決定され、かつ３）制限エンドヌクレアーゼに
よりマッピングされる。IL−２のような血管作動性ペプ
チドの適切なDNA配列は、次に、定常領域におけるＨ鎖
遺伝子の末端に連結される。
次に、組換えの完了した遺伝子は、遺伝子トランスフ
ェクション法（たとえば、エレクトロポレーションまた
は燐酸カルシウム法を用いる）により、真核生物または
原核生物の発現系内に導入され、大量の細胞培養におい
て蛋白質生産物として発現される。第１図に示されるよ
うに、２つの活性IL−２成分が、それぞれの免疫グロブ
リンの一部となる。それぞれの血管作動性ペプチドに対
する最良の付着部位は、異なり得、かつ実験的方法によ
り容易に決定し得る。血管作動性ペプチドの配列は、ヒ
ト、マウス、キメラもしくは他の種またはそれらの組合
せの免疫グロブリン分子を生産するために、ヒトまたは
マウスの免疫グロブリンのＨ鎖配列に連結することがで
きる。
例10 増殖検定により測定される免疫抱合体の機能的活性 rIL−２免疫抱合体の機能的活性を試験するために増
殖検定が行なわれる。
新鮮なマウスの脾臓細胞が、PHAにより３日間刺激さ
れた後、rIL−２とともに７日間静置培養される。次
に、細胞は洗浄されてrIL−２が取除かれ、かつ10％ウ
シ胎児血清および抗生物質が補われたRPMI−1640培地に
再懸濁される。105の細胞を含む100μｌが、異なる濃度
の免疫抱合体（テスト試料）、rIL−２（正のコントロ
ール）およびLym−１もしくはLym−２（負のコントロー
ル）を100μｌで存在させたマイクロタイタープレート
ウェルに３連で培養される。培養物は37℃で24時間イン
キュベートされ、その後、２μCiの125I−IUDR（New En
gland Nuclear Co.Boston,MA）が４時間のインキュベー
ション期間において添加される。次に、細胞は、γ線カ
ウンタにおいて計数される前に、PBSを用いて３回、５
％トリクロロ酢酸を用いて１回洗浄されることにより採
集される。正のコントロールとして精製されたrIL−２
を用いることにより、投与応答曲線を形成するために、
log2のrIL−２希釈に対して125I−IUDR取込データをプ
ロットすることができる。50％の最大125I−IUDR取込
（ｙ軸座標）においてこの曲線と交わるコントロール試
料のｘ軸希釈座標は、rIL−２活性の１ユニットに相当
する値として定められる。このようにして、免疫抱合体
調製物のrIL−２活性がバッチからバッチへ定量され得
る。
例11 モノクローナル抗体Lym−１による血管外腫瘍浸透を増
加するための血管作動性化合物の使用 リンパ腫を保有するヌードマウスにおけるLym−１生
体分布および腫瘍取込についてIL−２血管作動性免疫抱
合体の相対的な効果を試験するために、0.5gラジ（Raj
i）リンパ腫の皮下移植片をそれぞれ保持する５匹のマ
ウス群に、50μCiのＩ−125で放射性ラベルされたLym−
1F（ab′）220μｇ投与の前、０時間または2.5時間にお
いて、静脈に、Lym−１（コントロール）またはLym−1/
IL−２免疫抱合体（実験）が投与された。３日の後、す
べてのマウスは殺され、腫瘍および正常な器官が、組織
１グラム当りのラベル量を定量するために取除かれた。
以下に示すように、実験のLym−1/IL−２血管抱合体を
注入されたこれらのマウスは、適当なコントロールに対
してモノクローナル抗体の局在化について200％の増加
を示した（第１図）。さらに、第２図−第４図に示され
るように、モノクローナル抗体の局在化についてのこの
増加は、腫瘍／血液比を約２倍高め（第２図）、投与量
に依存し（血管抱合体の30−50μｇの間において最大の
効果；第３図）、しかもモノクローナル抗体の投与の前
の2.5時間で最大の効果が示されるように時間依存性
（第４図）である。
例12 臨床的な利用および応用 血管作動性免疫抱合体は、１）薬剤または薬剤を含む
リポソーム、および２）治療用モノクローナル抗体、の
配達を促進するために使用することができる。この免疫
抱合体の作用機序は、腫瘍部位において透過性および／
または血液の流れを増加させることによる。それゆえ
に、薬剤、モノクローナル抗体、またはリポソームが治
療のために投与される１−３時間前に、免疫抱合体は一
般的に投与される。
動物モデルにおいて、Ｉ−131 Lym−１ Ｆ（ab′）
２を投与する前2.5時間におけるLym−１に結合されたrI
L−２の使用は、コントロールに比べて、用量を200％増
加させる。遺伝子組換えによる免疫抱合体の使用は、生
体内におけるその効力を顕著に高めるはずである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/70 Ａ６１Ｋ 31/70 38/00 39/395 Ｃ 38/17 Ｌ 38/46 Ｙ 38/48 43/00 39/395 49/02 37/02 37/12 51/00 37/54 37/547 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/395 A61K 43/00 A61K 9/127 A61K 31/00 A61K 45/00 A61K 49/02 A61K 37/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims (36)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配
    達媒体、および前記配達媒体に結合された薬剤からな
    り、 前記配達媒体に結合された薬剤は、前記腫瘍組織への血
    液供給を増加させるよう働くものである、薬剤抱合体。
  2. 【請求項２】前記抱合体が、正常で健康な血管内皮を透
    過することができないが、腫瘍組織の血管内皮を透過で
    きるのに十分な大きさである、請求項１に記載の抱合
    体。
  3. 【請求項３】前記薬剤が、血管内皮の活性部位におい
    て、血管透過性を増加させるよう働く、請求項１に記載
    の抱合体。
  4. 【請求項４】前記薬剤が、血管内皮の活性部位におい
    て、局所的な炎症性反応を刺激または激化するよう働
    く、請求項１に記載の抱合体。
  5. 【請求項５】請求項１、３または４に記載の抱合体、お
    よび抗腫瘍性の放射性同位体を含む、組成物。
  6. 【請求項６】請求項１、３または４に記載の抱合体、お
    よび抗腫瘍性の毒性を含む、組成物。
  7. 【請求項７】前記薬剤が、薬事的に活性な化合物を含
    む、請求項１、３または４に記載の抱合体。
  8. 【請求項８】前記薬剤が、炭水化物である、請求項１に
    記載の抱合体。
  9. 【請求項９】前記炭水化物が、グルカンおよびプロテオ
    グルカンからなる群から選択される、請求項８に記載の
    抱合体。
  10. 【請求項１０】前記薬剤が脂質である、請求項１、３ま
    たは４に記載の抱合体。
  11. 【請求項１１】前記脂質が、血小板活性化因子およびプ
    ロスタグランジンからなる群から選択される、請求項10
    に記載の抱合体。
  12. 【請求項１２】前記薬剤が生物学的アミンである、請求
    項１、３または４に記載の抱合体。
  13. 【請求項１３】前記配達媒体が、損傷を受け、炎症を起
    こし、または構造的に異常な血管内皮において選択的に
    発現される分子に対して特異性を有する、請求項１、３
    または４に記載の抱合体。
  14. 【請求項１４】前記配達媒体が、免疫グロブリンまたは
    その断片からなる、請求項１、３または４に記載の抱合
    体。
  15. 【請求項１５】前記配達媒体が、モノクローナル抗体か
    らなる、請求項１、３または４に記載の抱合体。
  16. 【請求項１６】前記配達媒体が、１つまたはそれ以上の
    リポソームからなる、請求項１、３または４に記載の抱
    合体。
  17. 【請求項１７】前記リポソームが、80nmのオーダーの直
    径を有する、請求項16に記載の抱合体。
  18. 【請求項１８】前記配達媒体が、透過性の血管壁に選択
    的に集中する高分子量のデキストラン（70−150KD）か
    らなる、請求項１、３または４に記載の抱合体。
  19. 【請求項１９】前記配達媒体が、30,000と200,000との
    間の分子量を有する高分子または粒子からなる、請求項
    １、３または４に記載の抱合体。
  20. 【請求項２０】前記配達媒体が、腫瘍に見られるような
    炎症を起こした血管および構造的に異常な血管において
    循環する抗体またはその他の高分子に接近するようにな
    る血管壁の内皮下成分に対して特異性を有する、請求項
    １、３または４に記載の抱合体。
  21. 【請求項２１】前記成分が、フィブロネクチン、ラミニ
    ン（laminin）、IV型コラーゲン、または内皮下起源の
    類似物質からなる、請求項20に記載の抱合体。
  22. 【請求項２２】前記配達媒体が、血管壁、炎症を起こし
    た血管壁のすぐ近くの環境、または腫瘍の壊死領域にお
    いて活性化される凝固カスケードの成分に対して特異性
    を有する、請求項１、３または４に記載の抱合体。
  23. 【請求項２３】前記成分が、フィブリンまたはトロンビ
    ンからなる、請求項22に記載の抱合体。
  24. 【請求項２４】前記配達媒体が、炎症を起こしていない
    脈管組織でなく、炎症を起こした脈管組織の内皮細胞の
    中または上において選択的に発現される抗原に対して特
    異性を有する、請求項１、３または４に記載の抱合体。
  25. 【請求項２５】前記抗原が、炎症を起こした脈管組織へ
    の多形核白血球の付着の原因となる細胞付着分子を含
    む、請求項24に記載の抱合体。
  26. 【請求項２６】前記抗原がフィブリンからなる、請求項
    24に記載の抱合体。
  27. 【請求項２７】前記抗原がフィブロネクチンからなる、
    請求項24に記載の抱合体。
  28. 【請求項２８】前記抗原がフィブリン減成産物からな
    る、請求項24に記載の抱合体。
  29. 【請求項２９】前記抗原が、細胞酵素、血小板または血
    小板細胞生産物からなる、請求項24に記載の抱合体。
  30. 【請求項３０】前記酵素が、壊死性または炎症を起こし
    た組織において放出されるペルオキシダーゼを含む、請
    求項29に記載の抱合体。
  31. 【請求項３１】前記配達媒体が、新しい脈管組織の内皮
    細胞の中または上において選択的に発現される抗原に対
    して特異性を有する、請求項１、３または４に記載の抱
    合体。
  32. 【請求項３２】薬剤としての使用のために、抱合体を構
    成するための方法であって、腫瘍組織の部位に集中する
    能力を有する配達媒体または前記配達媒体をコードする
    ヌクレオチドを、前記腫瘍組織への血液供給を増加する
    ように働く少なくとも１つの薬剤または前記薬剤をコー
    ドするヌクレオチドに付加することを備える、方法。
  33. 【請求項３３】配達媒体に結合された薬剤を有効成分と
    し、前記配達媒体は腫瘍組織の部位に集中する能力を有
    するものであり、かつ前記薬剤は前記腫瘍組織への血液
    供給を増加させるよう働くものであることを特徴とす
    る、腫瘍組織の治療薬。
  34. 【請求項３４】配達媒体に結合された薬剤を有効成分と
    し、前記配達媒体は腫瘍組織の部位に集中する能力を有
    するものであり、かつ前記薬剤は前記腫瘍組織への血液
    供給を増加させるよう働くものであることを特徴とす
    る、腫瘍組織の診断薬。
  35. 【請求項３５】腫瘍組織の部位に集中する能力を有する
    配達媒体、および前記配達媒体に結合された薬剤からな
    り、前記配達媒体に結合された薬剤は前記腫瘍組織への
    血液供給を増加させるよう働くものである、抱合体、な
    らびに 抗腫瘍性の治療薬、 を備える治療用キット。
  36. 【請求項３６】腫瘍組織の部位に集中する能力を備える
    配達媒体、および前記配達媒体に結合された薬剤からな
    り、前記配達媒体に結合された薬剤は前記腫瘍組織への
    血液供給を増加させるよう働くものである、抱合体、な
    らびに 腫瘍造影剤、 を備える診断用キット。
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