JPH04503945A - 血管透過性抱合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血管透過性−促進接合体 発明の分野 この発明は、免疫学的薬剤および生体内においてユニークな特異性を有するその 他の薬剤の使用に関し、特に、人の疾患の診断および治療のために用いられるモ ノクローナル抗体およびその他の高分子の浸透および結合を促進するための手段 に関する。

関係出願とのつながり この出願は、１９８８年１０月１１日、アラン（Ａ　ｌ　ａｎ）Ｌ、ｘプスタイ ン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）およびマイケル（Ｍｔｃｈａｅｌ）　グロブスキー（Ｇｌ ｏｖｓｋｙ）の名前で、「血管浸透性促進免疫接合体」と題されて出願された米 国出願連続番号２５５，５１３の一部継続出願である。出願連続番号２５５．５ １３における主題と共通のこの出願における主題の優先権がここに主張される。

発明の背景 いくつかの異なるタイプの人の癌に向けられた治療において、腫瘍特異的なモノ クロナール抗体（ｍＡｂｓ）の使−用が精力的に研究されてきた（レビーおよび ミラー（ＬｅｖｙおよびＭｉｌｌｅｒ）、Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、４２：２６５０− ２６５６　（１９８３））　、また現在のところ、多（の臨床試験が報告されて きた。臨床試験のフェイズＩおよび■の両方のレベルは、高い投与レベルにおい てもこれらの薬剤の安全性が納得のいくよう示されてきたが、それらは、モノク ローナル抗体（“ｍＡｂｓ”）が生体内で予測されたように効果的ではなかった ことも示している。

癌の治療において、膿瘍に結合された抗原に対する抗体の効果は、抗体が直接的 な細胞障害性または補体により媒介される細胞の溶解のいずれかによりそれらの 標的細胞を破壊する抗体の能力に依存している。補体により介在される溶解は、 古典的な補体経路のＣ１ｑ成分が腫瘍細胞の表面に結合された抗体のＦｃ部に結 合し、膜攻撃複合体の形成に導くときに誘発される。腫瘍に結合された抗体は、 それ自身が標的を溶解するエフェクタ細胞と相互に作用することにより宿主の本 来の防御を増強することもできる。しかしながら、それらの複合的な細胞障害性 の能力にもかかわらず、細胞障害性の薬剤としてｍＡｂｓ単独の実際の実験的な 使用は、不満足なものであった。試験はいくらかの鎮静を結果としてもたらして きたが、一般的に、はとんど研究者らは、抗体分子そのものの細胞障害性を、細 胞障害性の放射性核種、毒素、およびそれらに付加された薬剤を用いて補うこと により、モノクローナル抗体の治療上の抗力を改善しようと試みてきた（ドナル ド（ＤｅＮａｒｄｏ）、Ｓ、等、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、１３：３０３− ３１０　（１９８６）；ハーウィッツ（Ｈｕｒｗｉｔｚ）、Ｅｏ等、Ｃａｎｃｅ ｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　３５：１１７５−１１８１　（１９７５）；ゴース（Ｇ ｈｏｓ　ｅ）、Ｔ。

等、Ｊ、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、５８：８４５−８５２　（１９７ ７）　）。

ｍＡｂｓの殺腫瘍能力の改善のための試みは、抗体結合部位において、局所的な 本来の免疫応答をも刺激するような抗体接合体を提供するために、生物学的応答 修飾物を付与することも含んできた。

この生物学的応答修飾物の使用の一例は、抗体とコブラ毒因子（ＣＶＦ）の接合 体である。ＣＶＦは糖タンパク質であり、補体の代替的な経路のＣ３ｂ、Ｃ３／ Ｃ５変換酵素の性質を有している。しかしながら、ＣＶＦはその本来の類似体と 異なって、補体制御タンパク質により不活性化されない。細胞により結合された 抗体上でのＣＶＦの存在は、膜攻撃複合体の組立てを開始し、かつそれにより細 胞を殺す（ボーゲル（Ｖｏｇｅ　１）、Ｃ，およびミューラ一エベルハード（Ｍ ｕ　１１　ｅ　ｒ−Ｅｂｅ　ｒｈａ　ｒｄ）　、Ｈ。

の傾向Ｖｌ（Ｍｏｄｅｒｎ　Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａ９８５）Ｂｅｒｌｉ ｎ　Ｎｅｔｈ、等。）。

他の例は、モノクローナル抗体およびインターフェロンを含む免疫接合体の使用 であり、そこにおいてインターフェロンは、ナチュラルキラー（Ｎ　Ｋ）細胞を 含む予め存在する細胞の免疫機構を活性化することにより標的細胞の溶解を促進 する。（フラネリ（Ｆ　１ａｎｎｅｒｙ）、Ｇ、等、他の研究者らは、腫瘍に結 合された抗体の部位において、単球／マクロファージ濃度を増加するよう作用す る走化性の薬剤、ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン（ｆ　Ｍ Ｌ　Ｐ）を含む免疫接合体の効果を研究してきた。

（オブリスト（Ｏｂｒｉｓｔ）、Ｒ，、サンドベルブ（Ｓスト（Ｏｂｒｉｓｔ） 、Ｒ，等、Ｂｅｎｔ　５３：２５１（１９８６））。しかしながら、これらの研 究のいずれもが、抗体の腫瘍治療の臨床的な有効性を実質的に改良してこなかっ た。

研究は、この臨床的な有効性の不足が、膿瘍部位へ不十分な量しかｍＡｂｓが配 達されないことに大きく依存していることを示している。治療の前後において組 織化学的な方法による腫瘍組織の試験は、高い投与レベルにおいてさえも、抗体 による腫瘍の飽和は部分的にすぎないことを示した。（ローダ（Ｒｏｗｄ　ｅ　 ｒ）、等、Ｂｌｏｏｄ　６９：１９９−２１０　（１９８７）　）。放射性ラベ ルされた抗体の調製物を用いる定量的な薬量測定の研究は、用いられる抗体の高 い特異性、すなわち高い腫瘍：器官の比の実現にもかかわらず、全投与量に対し て非常に低い割合（０，０５−０，２％）しか腫瘍に実際に結合しないことを示 してきた。腫瘍特異的なモノクローナル抗体を用いる研究は、血液に対する腫瘍 の分配比が良好な場合でさえも、腫瘍１グラム当たり検出される放射性ラベルさ れたｍＡｂｓの量は、注入された全投与量の約０．０１５％であることを示（１ ９８６））。

体内において、物質の伝達および配達の最初の態様は、循環系を介してである。

一般的に、循環系は血管系およびリンパ系を備えている。栄養物質、酸素、ホル モンおよびその他の物質を体のすべての部分に運ぶ一方、細胞の代謝産物を除く 血管系は、心臓ならびに一連の脈管：動脈、静脈および毛細管を含む。枝分かれ により定常的に数が増加し、かつ内径が減少する動脈は、血液を心臓から毛細管 へと導く。血液と他の組織との間において成分の交換が起こる毛細管は、管を網 状につないだ網状組織を形成している。

一方、静脈は血液を毛細管から心臓へと戻している。

毛細管は、循環系の動脈および静脈側に接続する単純な内皮細胞から典型的にな っている。毛細管ネットワークの網状組織は、異なる組織および器官において異 なるサイズおよび形状で体内全体に存在している。ある領域における代謝の強さ は、一般的にこの網状組織の緊密さを一般的に決定する。したがって、肺、肝臓 、腎臓、粘膜、腺および骨格筋においては、脳の灰白質と同様に緊密なネットワ ークが存在する。このネットワークは、鍵、神経、平滑筋および漿膜のような組 織においては、大きな網目を有しかつまばらである。

毛細管の壁を介する物質の輸送能力は、透過性として言及される。透過性は、場 所によって異なり、かつ違う条件下でその場所において異なる。

一般的に、腫瘍が数ミリメートルの直径を越えて成長するような場合、腫瘍は新 しい血液供給を誘導するに違いないことについて意見が一致しており、しかも腫 瘍が脈管形成を誘導するメカニズムについて大きな注目が集められてきた。（た とえば、参照、フォルクマン（Ｆ　ｏ　１　ｋｍａ　ｎ）、Ｊ、、Ａｔｖ、Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４３：１７５−２０３　（１９８５）。）さらに、腫瘍を補 うようになる新しい血管の解剖学および生理学に大きな注目が振向けられてきた 。（同上） 一般的に、腫瘍組織が解剖学的に異質な構造であることについて意見が一致して いる。しばしば、それらは、正常な細胞において予期されるであろう同等の大き さの管よりもより少ない層成細胞および平滑筋細胞とともに、単純な内皮により 並べられた相対的に画一的な管状構造からなる。

腫瘍脈管の機能的な性質は多く論争されてきており、腫瘍脈管は正常な脈管より も血管作動性の媒介物に対してより応答的であるかまたは応答的でないかのいず れかが報告されてきた。（参照、たとえば、ホリ（Ｈａ　ｒ　ｉ）、に、等、Ｊ 、Ｎａｔｌ、Ｃａｎｃｅｒ　ｌｌ５ｔ、７４：４５３−４５９　（１９８５）） 。しかしながら、はとんどの研究者が同意している腫瘍脈管の１つの性質は、正 常な脈管に比較して、腫瘍脈管は循環する高分子に対して過度に透過性であるこ とである。固体の腫瘍におけるモノクローナル抗体および殺腫瘍剤の局在化の理 解にそれが明らかに関連するため、この所見は説明を必要とする。（参照、たと えば、正常な毛細管および無償の内皮細胞接合を有する他の脈管を自由に通過す るのに対して、高分子に対する正常な脈管構造の透過性は厳しく制御されている 。通常、高分子は大部分が循環内に保持されており、外に出る少量のものは、小 胞の輸送手段、または内皮細胞を横切る一時的な細胞質輸送経路の形成により外 に出ると考えられる。（参照、た）。しかしながら、炎症において、高分子の散 逸は大きく増加し、ヒスタミンのような作動物質は毛細管の後の内皮細胞の萎縮 を刺激して、高分子および微粒子までもが散逸できるような内皮細胞のギャップ の形成を結果としてもたらす。しかしながら、腫瘍の脈管構造が「漏れやすい」 かそうでないにかかわにず、我々は、不十分な量のモノクローナル抗体しか腫瘍 部位に配達されないということを多くの研究が示しているということを繰返さな ければならない。

我々は、血液による腫瘍の不十分な潅流のための理由が、広く解剖学的であるこ とを信じている。腫瘍細胞は中心の芯となる細胞から放射状に成長し、すぐに血 液の供給が追付かなくなり、壊死性で低酸素の芯を残すことになる。この例の場 合、芯となる細胞から最も近い毛細管までの距離は、約１００ないし１５０μｍ であり、この距離は顕著な低酸素症および潅流の不足を招くのに大変十分である 。このような低酸素細胞は放射線照射に対して抵抗性を示し、さらに注入された 薬剤または抗体が近付きにくい。（ケリン（Ｔｈｏｒｒｉｌ　１ｎｓｏｎ）、Ｐ 、およびグレイ（Ｇ　ｒ　ａｙ）、Ｌ、　、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　９：５３ ９−５４９（１９５５））。

したがって、ｍＡｂの腫瘍治療上における制限は、まずｒｎＡｂが腫瘍中に浸透 しかつ腫瘍部位において局在および持続することができるような輸送に関連した 因子に起因することか明らかになる。腫瘍細胞へのｒｒＩＡｂｓの不十分な配達 および結合ならびにその臨床上の有効性における制限は、診断および治療のため の抗体の使用にとって大きな障害である。放射性の化学種、化学治療剤およびｍ Ａｂｓに付加された毒性の薬剤のような強化剤の使用は、この障害を克服しない 。実際、ｍＡｂｓが腫瘍部位によく集中しなければ、これらの付加された強化剤 は、正常な組織への損傷が増加される危険性を有している。

研究は、腫瘍組織によるｍＡｂｓの取込みが、血管の透過性および血液の流れに よく相関していることを示してい血管作動性の薬剤の投与が、ある環境下で、他 の組織と比べて腫瘍の潅流を増加し、かつ腫瘍の取込みおよび放射性の薬剤の濃 度を増加し得ることを示している。（ボンバー（Ｂｏｍｂｅｒ）、Ｐ、等、Ｊ、 　Ｎｕ　ｃ　１９Ｍｅ　ｄ、２７　：２４３−２４５　（１９８６））。

それゆえに、この発明の目的は、治療をより効果的にするために、殺履瘍性の免 疫治療または化学治療の適用に先立って、血管の透過性を増強し、かつ腫瘍の血 液量を拡大するために使用され得る特異的に目標付された薬剤を提供することに ある。

また、不十分な配達に関する同様の研究は、診断像を形成する目的のために、生 体内において使用される特異的に目標付された薬剤の利用に適用される。腫瘍部 位に配達された免疫診断薬の量が増加すると、診断法の精度が改善され、かつ診 断薬の利用がより効果的になり、しかも放射性同位体でラベルされた抗体のよう な免疫診断薬がある危険を有するような場合において、看者に対する安全性はよ り高くなるであろう。したがって、この発明の目的は、免疫診断法に先立って、 血管作動性薬剤の特異的な目標付けにより腫瘍への免疫診断薬の配達を同様に促 進するであろう薬剤を提供することにある。

図面の簡単な説明 策１図は、ラージ（Ｒａｊｉ）−保持ヌードマウスにおいて、放射性ラベルされ たＬｙｍ−Ｉ　Ｆ　（ａｂ’　）　２７ウスの取込みに関するＬｙｍ／ＩＬ−２ 免疫接合体の、効果を示している。

第２図は、リンパ腫−保持ヌードマウスにおけるＩＬ−２およびＬｙｍ〜ｌ／Ｉ Ｌ−２血管接合体の併用注入の効果を示している。

茶３図は、ｌ−１２５Ｌｙｍ−Ｉ　Ｆ　（ａｂ’　）２　トレーサによる腫瘍取 込みに関してＬｙｍ−１／ＩＬ−２血管接合体の先投与の上昇効果を示している 。

第４図は、リンパ腫−保持ヌードマウスにおけるＬｙｍ−１／ＩＬ−２血管接合 体の投与時間の効果を示している。

発明の要約 この発明は、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）に結合された血管作動応答を刺激 することができる生物学的に活性な試薬を備える免疫接合体を提供する。上記ｍ Ａｂｓは、宿主の生体内に投与されたとき、腫瘍細胞または腫瘍細胞血球形のよ うな新生物組織に選択的に結合する能力を有している。生物学的に活性な試薬は 、この態様において、新生物組織の部位に局在化し、血管膨張および増強された 血管透過性の手段により、または炎症性の応答メカニズムを介して、腫瘍組織へ の局所的な循環および血液供給が改善されるような応答を刺激する。腫瘍内にお ける血液の体積の拡大は、続いて宿主内に導入された治療および診断のための薬 剤をより完全に腫瘍に浸透させ、かつ、したがってより大量のより効果的な投与 量が配達されるようになる。

いくつかのタイプの免疫治療に先立つ効果的な血管作動性接合体の使用は、その 治療の効力を増強させるだけでなく、抗腫瘍剤、毒素または放射性核種のような 細胞変性物質を含む抗体接合体の使用において、有害な副作用の危険を実質的に 減少させるであろう。循環内で結合されずに残っているそのような抗体接合体は 、正常な組織、特に抗体接合体を必ず体から排除するような腎臓、肝臓および網 内系の器官組織の意図しない破壊をもたらすであろう。標的である腫瘍に結合し 得る相対的な投与量を増加することにより、血管作動性接合体は効果的でより少 ない投与量の使用を可能にし、したがって結合しないまま循環する細胞障害性の 薬剤の量を減らし、かつ正常な組織への危険性を減らすことができる。

上述され、また上記において引用された我々の先の出願において開示された免疫 接合体に加えて、この発明は、モノクローナル抗体、またはさらに拡張して、浸 透性の脈管に局在化する他の成分（たとえば、高分子またはリポソーム）に結合 された血管作動性の薬剤を備える接合体を提供する。したがって、この開示全体 にわたって「免疫接合体」という用語が用いられるが、少なくとも１つの免疫活 性成分からなる接合体は、この発明により意図された多くの異なった接合体の一 例にすぎないことをはっきりと理解すべきである。

静脈内（“Ｉ、Ｖ、”）投与される場合、モノクローナル抗体は、腫瘍もしくは 血管および炎症の領域において関連する構造、または血管が腫瘍部位において構 造的に異常である場所に優先的に結合できる能力により選択される。

血管作動性薬剤は、この態様において膿瘍または炎症の部位に選択的に集められ 、そこで透過性のさらなる増加を刺激する。そのような増加は、部位に対して選 択的でありかつその部位において、引続き１．Ｖ、投与された治療剤の血液から 組織への通過を容易にするように働く。

これらの血管作動性抗体接合体により誘導された選択的透過性の増強は、治療が 必要とされる部位へ届（１，Ｖ。

投与された薬剤の割合または量を増加するように働く。このことは治療を強化さ せるだけでなく、毒性の代謝産物または免疫学的な過剰応答の発生による有害な 副作用の危険性を実質的に減少させるであろう。

この発明の１つの局面に従って、腫瘍組織の部位に集まる能力を有する配達媒体 、および腫瘍組織への血液供給を増加するように働く配達媒体に結合された薬剤 を含む薬剤接合体が提供される。より好ましい局面において、この接合体は、正 常で健康な血管内皮を透過することができない一方で、腫瘍組織の血管内皮を透 過することができるに十分な大きさである。もう１つの変更において、その薬剤 は、血管内皮における活性部位において血管透過性を向上するように働き、ある いは血管内皮の活性部位において局所的な炎症性の反応を刺激または激化するよ うに働く。この発明の他の変更は、抗腫瘍性放射性同位体または抗腫瘍性トキシ ンを組合わせた血管接合体を提示する。もう１つの具体例において、配達媒体は 、高分子または３０．０００と２００．０００との間に分子量（ＭＷ）を有する 粒子を含む。

もう１つの局面において、この発明は、腫瘍細胞の診断のための方法を提案し、 その方法は、抗体が腫瘍組織への血液供給を増加するように働く薬剤に接合され た、その部位に集中することができる能力を有する有効な量の配達媒体を、腫瘍 組織を有する宿主に投与するステップ、および同時またはその後に腫瘍の像を造 る薬剤を宿主に投与するステップを備える。もう１つの具体例において、診断薬 は、腫瘍組織部位に集中することができる能力を有する、腫瘍の像を造る薬剤と 接合された配達媒体を含む接合体として投与される。

この発明のもう１つの局面に従って、腫瘍もしくは構造的に異常な血管の付近、 新しい脈管、または腫瘍部位において炎症を起こした血管に集中することができ る能力を有するモノクローナル抗体を備える免疫接合体が提供され、これらの接 合体は選択された血管作動物質をさらに含む。

１つの好ましい具体例において、モノクローナル抗体は、腫瘍において見られる ような炎症性の脈管および構造的に異常な脈管の中で循環する抗体に近付くよう になる血管壁の内皮下の成分に対して特異性を有する。そのような標的抗原はフ ィブロネクチン、ラミニン（ｌａｍｔｎｉｎ）およびＩＶ型コラーゲンを含む。

もう１つの具体例において、抗体は、血管壁、炎症を起こした血管のすぐ近くの 環境、または腫瘍の壊死領域において、活性化される凝固カスケードの成分とと もに特異性を有する。そのような抗原は、フィブリン、トロンビン、および補体 系の成分を含み、かつ抗体はこれらの特異性に対して有効である。さらにもう１ つの具体例は、正常な脈管でな（、炎症を起こした血管における内皮細胞で選択 的に発現される抗原に対して特異性を備える抗体を用いるであろう。そのような 抗原は、炎症を起こした血管壁への多形核白血球の付着の原因として同定されて きた種々の細胞付着分子を含むであろう。血液凝固産物フィブリンは、この方法 のための特に好ましい標的である。血管において内皮下区分に分配され、かつ構 造的な異常または透過性の変化により明らかにされるフィブロネクチンは、この 方法のためのもう１つの注目される標的である。

この発明により提案されるもう１つの具体例は、腫瘍に対する特異性を備えるｍ Ａｂへの血管作動成分の化学的結合である。この例において、ｍＡｂは、腫瘍内 で腫瘍細胞と結合する間または結合した後、腫瘍の部位に血管作動性成分を配置 するように働くであろう。次に、血管作動性成分は、ｍＡｂ結合の隣接領域にお いて周囲の血管に作用するであろう。

この発明により提案されるもう１つの具体例は、分子レベルにおいて、すなわち 、生体に導入されるべき「カセット」の構築による血管作動性薬剤への配達媒体 の結合であり、前記カセットは、最小限で、配達媒体および血管作動性ペプチド をコードする遺伝子を含む。もう１つの具体例においては、カセットは、制御配 列も含むことができるであろう。カセットは、生体のゲノム、プラスミド、また は、たとえばウィルスもしくはレトロウィルスのようなベクタ中に挿入すること ができるであろう。

さらにこの発明は、腫瘍の脈管構造または新しい腫瘍の脈管構造と競合する「漏 れやすい」脈管構造に対する少なくとも３つの抗原標識を開示し、かつ腫瘍部位 、炎症を起こした組織、膿瘍、および「漏れやすい」脈管を含む同様の部位への 特異的な局在化が可能な配達媒体を構成するために同じものを使用する手段を提 案する。

したがって、この発明の一局面に従って、腫瘍組織の部位に集中することができ る能力を有するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、およびそれに結合された血管作 動性の薬剤を備える免疫接合体が提供される。好ましい具体例において、ｍＡｂ は腫瘍細胞に対する特異性を有し、かつ特に好ましい具体例において、ｍＡｂは Ｂ細胞の腫瘍細胞に結合された抗原に対する特異性を有する。この具体例に従っ て、モノクローナル抗体はＬｙｍ−１またはＬｙｍ−２であり得る。

一具体例に従って、血管作動性薬剤はペプチドを備え、かつ好ましい具体例にお いてこのペプチドはタキキニンである。特に好ましい具体例において、タキキニ ンはフイロメダシン（ｐｈｙｌｌｏｍｅｄｕｓｉｎ）、フィザレミン（ｐｈｙｓ ａｌａｅｍｉｎ）およびサブスタンスＰからなる群から選択される。

もう１つの好ましい具体例に従って、血管作動性ペプチドはロイコトリエンを含 む。特に好ましい具体例において、ロイコトリエンはＢ４、Ｃ４、Ｄ４、および Ｅ４からなる群から選択される。

もう１つの好ましい具体例に従って、血管作動性ペプチドはアナフィラトキシン を含む。特に好ましい具体例において、アナフィラトキシンはＣ３ａおよびＣ５ ａからなる群から選択される。

さらにもう１つの具体例に従って、血管作動性ペプチドはリンフ才力インである 。特に好ましい具体例において、リンフ才力インはインターロイキン−１、イン ターロイキン−２および腫瘍壊死因子からなる群から選択される。

もう１つの好ましい具体例において、血管作動性ペプチドは走化性因子ＥＣＦ− Ａである。

さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動性ペプチドは炎症性物質で ある。特に好ましい具体例において、炎症性物質はマストパラン（ｍａｓｔｏｐ ａｒａｎ）およびベスタチン（ｂｅｓｔａｔｉｎ）からなる群から選択される。

さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動性ペプチドはプロテアーゼ である。特に好ましい具体例において、プロテアーゼはトリプシン、キマーゼ（ ｃｈｙｍａｓｅ）およびトロンビンからなる群から選択される。

さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動性薬剤は血管作動性炭水化 物である。特に好ましい具体例において、炭水化物はグルカンおよびプロテオグ ルカンからなる群から選択される。

さらにもう１つの好ましい具体例において、血管作動性薬剤は脂質である。特に 好ましい具体例において、脂質は血小板活性因子およびプロスタグランジンから なる群から選択される。代替的に、脂質は薬剤、ビプロストール（Ｖｉｐｒｏｓ ｔｏｌ）として誘導され得る。

この発明のもう１つの具体例において、血管作動性薬剤は生物学的アミンである 。特に好ましい具体例において、アミンはヒスタミンである。

この発明のもう１つの局面に従って、免疫接合体のｍＡｂは無傷の免疫グロブリ ンであり得る。好ましい具体例において、ｍＡｂは一価のＨＬアイソフオームか らなる免疫グロブリンフラグメントであり得る。もう１つの好ましい具体例にお いて、ｍＡｂはＦｃ部が取除かれたものの１つである。特に好ましい具体例にお いて、ｍＡｂはＦ（ａｂ′）２部の形態である。

この発明のもう１つの局面に従って、腫瘍を治療するための方法が提供され、そ の方法は腫瘍の宿主に血管作動性の免疫接合体を投与するステップ、そこにおい て免疫接合体は腫瘍組織の部位に集中する能力を有しているｍＡｂまたはその他 の配達媒体を有し、免疫接合体を腫瘍組織に結合させかつ免疫接合体の血管作動 性効果を起こさせるステップ、および、それと同時またはその後において腫瘍の 宿主に治療薬を投与するステップを備える。好ましい実施例において、投与され る治療薬は細胞障害性の化学剤である。

特に好ましい具体例において、投与される治療薬は細胞障害性の免疫学的薬剤で ある。

もう１つの具体例において腫瘍を診断するための方法が提供され、その方法は、 腫瘍の宿主に血管作動性の免疫接合体を投与するステップ、そこにおいて免疫接 合体は腫瘍組織の部位に集中する能力を有するｍＡｂを備え、腫瘍組織に免疫接 合体を結合させかつ免疫接合体の血管作動効果を起こさせるステップ、およびそ れと同時またはその後に宿主に免疫診断薬を投与するステップを備える。

さらに、この発明のもう１つの局面に従って、腫瘍組織の部位に集中する能力を 有する配達媒体、および配達媒体に結合された薬剤を備える接合体が提供され、 上記薬剤は腫瘍組織に対して組織への血液供給を増加することにより、異なる抗 腫瘍剤の作用を増強するよう働く。もう１つの具体例は、正常で健康な血管内皮 を透過することができず、一方、腫瘍組織の血管内皮を透過することができるた めに十分な大きさの接合体を提案する。

もう１つの具体例において、薬剤は、血管内皮の活性部位で血管透過性を増加す るように働き、一方、この発明のさらにもう１つの具体例は、上記薬剤が血管内 皮の活性部位で局所的な炎症反応を刺激または激化するよう働くことを提案する 。

開示される発明の種々の具体例において、上記薬剤は、たとえば、薬物、血管作 動性ペプチド、生物学的アミン、または製薬化合物を含むことができる。同様に 、接合体は、たとえば、グルカンまたはプロテオグルカンのような炭水化物を含 むことができ、あるいは、それは血小板活性化因子またはプロスタグランジンの ような脂質を含むことができる。

この発明のもう１つの局面は、損傷を受け、炎症が起こり、または構造的に異常 な血管の内皮において選択的に発現される分子に対して特異性を有する配達媒体 を提供する。

好ましい配達媒体は、限定されることなく、Ｆ　（ａｂ’　）２、Ｆ（ａｂ）、 もしくは免疫グロブリン分子のＨＬフラグメント、デキストラン、モノクローナ ル抗体、またはリポソームを含む。特に好ましい具体例において、リポソー−ム は８０ｎｍのオーダーの直径を有し、かつデキストランは高分子量のデキストラ ン（７０−１５０ＫＤ）である。

さらにより好ましい具体例において、デキストランは透過性の血管壁において選 択的に局在化する。

もう１つの具体例において、腫瘍に見られるような炎症を起こした脈管および構 造的に異常な脈管において循環する抗体に近付きやすくなる血管壁の内皮上成分 に対して、配達媒体は特異性を有する。提案される成分は、限定されずに、フィ ブロネクチン、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲンを含む。

さらなる具体例は、血管壁、炎症を起こした血管のすぐ周囲の環境、または腫瘍 の壊死領域において活性化される凝固カスケードの成分に対して特異性を有する 配達媒体を開示する。もう１つの好ましい具体例において、この成分はフィブリ ン、トロンビンおよび補体系の成分を含む。

さらにもう１つの具体例において、配達媒体は、腫瘍の付近には認められ、炎症 を起こしていない血管組織には認められないような炎症を起こした血管組織の内 皮細胞中または上に選択的に発現される抗原に対して特異性を有する。

この発明により提案される抗原は、炎症を起こした血管組織への多形核白血球の 付着を引起こすことができる細胞付着分子、フィブリン、フィブロネクチン、フ ィブリン減成産物、細胞酵素、血小板、および血小板産物を含む。さらなる具体 例において、酵素はパーオキシダーゼまたは壊死もしくは炎症を起こした組織に おいて放出される他のタンパク質を含む。

また、この発明は、腫瘍組織の治療または診断のための方法を提案し、その方法 は、腫瘍組織の部位に、その部位への血液供給を増加させることによりその組織 に対する異なる抗腫瘍剤の作用を強化するように働く薬剤と接合されている抗体 を集中させる能力を有する効果的な量の配達媒体を宿主の組織に投与するステッ プ、および治療または診断のための薬剤に接合された、組織の部位に集中する能 力を有する配達媒体を備える、第２の接合体を宿主に同時にまたは後に投与する ステップを含む。

もう１つの具体例は、腫瘍組織の免疫治療のための方法を提案し、その方法は、 ここに示された接合体の有効な量を腫瘍の宿主に投与するステップ、およびそれ と同時またはその後に、その組織の部位に集中する能力を有し、かつその治療に 向けられる配達媒体を腫瘍の宿主に投与するステップを備える。さらなる具体例 は、殺腫瘍剤の配達媒体への接合を開示する。

さらにもう１つの具体例は、腫瘍組織の免疫治療のための方法を提案し、その方 法は、ここに示された接合体の有効な量を宿主の組織に投与するステップ、およ びそれと同時またはその後にその組織の治療に向けられる薬剤を宿主に投与する ステップを備える。

さらなる具体例において、腫瘍組織の免疫診断のための方法が開示され、前記方 法は、ここに示された接合体の効果的な量を宿主の組織に投与するステップ、お よびそれと同時たまはその後にその組織の部位に集中する能力およびそこに結合 された検ａ可能な試薬を有する配達媒体を備える第２の接合体を宿主に投与する ステップを備える。

もう１つの具体例は、炎症を起こした組織の免疫治療のための方法を開示し、そ の方法は、ここに示された接合体の効果的な量を腫瘍の宿主に投与するステップ 、およびそれと同時またはその後にその組織の部位に集中する能力を存し、かつ その治療に向けられた第２の配達媒体を腫瘍宿主に投与するステップを含む。

炎症を起こした組織の免疫治療のための方法がさらにここに開示され、その方法 は、ここに示された接合体の有効な量を宿主の組織に投与するステップ、および それと同時またはその後にその組織の治療に向けられた薬剤を宿主に投与するス テップを備える。

この発明のもう１つの局面は、薬剤として使用のために接合体を構成するための 方法を提示し、その方法は、腫瘍細胞の部位に集中する能力を有する配達媒体ま たはそれと同じものをコードするヌクレオチドを、腫瘍組織への血液の供給を増 強するよう働く少なくとも１つの薬剤またはそれと同じものをコードするヌクレ オチドに付加することを含む。この発明はさらに、治療用のキットを提示し、そ のキットは、腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配達媒体、および腫瘍組織 への血液供給を増強するよう働く、配達媒体に結合された薬剤、ならびに抗腫瘍 性の治療薬を含む接合体を備える。加えて、この発明は、診断用キットを開示し 、そのキットは、腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配達媒体、および腫瘍 組織への血液の供給を増強するよう働く、配達媒体に結合された薬剤、ならびに 腫瘍造影剤を含む接合体を備える。

最後に、この具体例のもう１つの具体例は、遺伝子を構成する接合体のための方 法を提示し、その方法は、少なくとも１つの薬剤またはそれと同じものをコード するヌクレオチドを少なくとも１つの配達媒体またはそれと同じものをコードす るヌクレオチドに付加することを備える。

この発明のこれらまたはその他の長所および特徴は、以下の記述およびそれに続 く請求の範囲からより十分に明らかになるであろう。

詳細な記載 系統だって投与される血管作動性の薬剤は正常な血管においてよりも腫瘍性の血 管においてより幅広い変化を引起こすことが示されている。（たとえば、ケイタ ー（Ｃａｔｅｒ）、ｅｔ　ａｌ、、Ｂｒ、Ｃａｎｃｅｒ　２０：５１７　（１９ ６６）参照）この効果はモノクローナル抗体もしくは腫瘍内の異常な血管の血管 壁または直接包囲する環境において分子と結び付く他の成分に血管作動性の薬剤 を結合することにより最大限にすることが可能である。この応用はこのように先 の応用の延長であり、上記に引用したように、そこでは腫瘍に対して特異性を有 する抗体は、透過性の変化を誘導する目的で、血管作動性の薬剤に接合された。

この応用は透過性の変化が血管壁の構成成分、または直接血管に近い環境におけ る他の分子に対して特異性を有する抗体を利用することによりより効果的に得ら れることを認める点において異なり、腫瘍細胞に対する抗体の使用の代替とされ 、それは血管から切離されたある程度の範囲でもよく、それゆえ血流内で循環す る抗体によって「示される」ものではない。

好ましくは、使用される抗体は次の特異性を有する。第一として、種々の血管作 動性の薬剤との化学的な接合に続いて、それらは抗原に結合する能力を保持する 。第二として、それらは血液または正常で無傷の非炎症の内皮のいずれの構成要 素にも結合しない。第三として、それらは血液から組織内に正常な血管の内皮を 横切って通過する傾向をほとんど示さないかまたは示さない。第四としてそれら は腫瘍内の多くの血管のように、炎症しているまたは構造上異常である血管内に 送出される、または隣接した分子に結合する。最後に、結合した上で、接合した 抗体は血管壁における活性部位に直接に血管作動性の化合物を配達する。

爆発的な透過性の変化はさらに部位におけるモノクローナル抗体に結付けるのに 有効に働き、それにより腫瘍血管において生理的な変化が確立されるが、一方で 正常な血管は影響されない。

直接に腫瘍血液流におけるこの局在された透過性の変化および／または増加の誘 発に続いて、静脈内に注入された薬剤またはモノクローナル抗体のような可能な 治療薬は異常に透過性のある部位において血液から組織液への選択的な通過を示 す。この機構により、腫瘍部位に配達される薬剤の投与量のパーセンテージはこ こに記述されるべき研究において２〜６倍に増加されている。この方法は、腫瘍 部位に、モノクローナル抗体、または薬剤、毒素もしくは放射性同位体を伴なう モノクローナル抗体の接合体のいずれかの薬剤での制ガン剤の配達を改良するた めに利用されてもよい。

代替的に、透過性の血管壁において選択的に局在する高分子量デキストラン（い わゆる７０−１５０キロダルトン。

ＫＤ）のような他の成分は血管作動性の薬剤のための配達媒体としてモノクロー ナル抗体の代わりに使用されてもよい。（たとえば、ドボラーク（Ｄｖｏｒａｋ ）、ｅｔ　ａｌ、、Ａｍ、Ｊ、Ｐａｔｈｏｌ、１３３：９５−１０９（１９８８ ）参照）さらに例として、約８０ナノメーター（ｎｍ）の直径を有するリポソー ムは腫瘍の透過性の血管壁を横切って選択的な通過を示すものとして開示され、 かつまたリポソームは透過性−増強された治療に対して配達媒体として使用され てもよい。（ガン治療において薬剤媒体としてリポソームの使用の議論に対して は、バインスタ９８４）参照） 同様の考えが、１）改良された放射性画像診断を手に入れるという目的に対して 腫瘍部位への抗体−同位体接合体の配達、２）患者への全体的投与量を増加する ことなしに生体に近接して薬剤の濃度を増加するために、炎症性の薬剤により引 起こした炎症の部位への抗微生物剤の配達、および３）炎症の有毒な効果を抑制 する目的で、生体を通じて急性的または慢性的炎症の部位への種々の抗炎症性薬 剤の配達に適用される。各実例において、指示された治療薬のｒ、ｖ、投与は抗 体−血管作動性の薬剤接合体の１．Ｖ。

注入により開始され、治療薬の作用の要求される部位の一時的な透過性の増進を 作出することがデザインされる。

さらに具体例では腫瘍または炎症した組織における壊死性部分内の構造に異常な 血管における血流に晒されている高分子にはモノクローナル抗体を使用している 。このような抗原はフィブリン減成産物、または壊死性のまたは炎症性の組織に おいて顆粒細胞または他の細胞により放出されたベルオキシターゼのような種々 の細胞酵素を含む。

抗体への結合のための種々の血管作動性の化合物は以下に記述した化合物に類似 であり、かつペプチド、炭水化物、脂質およびそれらの誘導体を含む。

もう１つの具体例は炎症した血管における内皮細胞上で選択的に表出される抗原 に対して特異性を有する抗体を使用している、しかし正常な血管においてではな い。このような抗原は炎症した血管壁への多形核白血球の付着に対し原因がある と認められてきた種々の細胞付着分子を含んでいる。血管凝固生成物フィブリン は特にこのアプローチに対して恵まれた標的である。フィブリンは正常には血流 内に存在せず、循環する前駆物質分子、フィブリノーゲンとしてのみ存在し、そ れは約３４０キロダルトン（ＫＤ）の分子量を有する。同様に、フィブリンは正 常な組織または組織液には存在しない、なぜならその高分子量が正常で無傷な内 皮を横切って血液からの逸脱を不可能にするからである。

内皮の損傷または増加した透過性の存在下では、しかしながら、フィブリノーゲ ンは、脈管内の血餅形成のしくみの活性化を通じて急速にフィブリンに転換され るような組織に逸脱することができる。このようにフィブリン沈渣は透過性の変 化の部位において形成される。膿瘍では、フィブリンの微量沈渣は特に毛細管の 新芽および完全な内皮の内層を欠く血液チャンネルの近傍に存在する。

さらに、フィブリノーゲンはその分子量特性により血管性漏出のマーカーとして 役立つ。第二として、その検出は血管からの逸脱において直ちに不溶性生成物へ の転換によって容易なものとされる。フィブリンに対してむけられたモノクロー ナル抗体（フィブリノーゲンと非−反応性である）はそれゆえフィブリノーゲン 漏出およびフィブリン沈渣により「標識された」透過性のある血管に選択的に帰 することを示すであろう。

フィブロネクチン、これは血管における内皮下の区分に分配されかつ構造上の異 常または透過性の変化により明“らかにされ、このアプローチに対して重点的に 取扱われるもう一つの標的である。（たとえば、クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔ ｅｎｓｅｎ）、ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ、１９８８；ドボラーク　（Ｄｖｏ ｒａｋ）、ｅｔ　ａｌ、、ＮＥＪＭ　３１５：１６５０　（１９８６）；および ジエイン（Ｊａｉｎ）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４８：２６４１（１９８８）参 照）　血管作動性の接合体の他の具体化例はまた、他の薬剤または分子と同様に 、血管外の浸透またはモノクローナル抗体の結合を改良するものを含んで、有効 性を示してもよい。巨大分子が使用されるときここに開示された接合体が有効で あることが示されたのと同様、化学的治療薬剤のようなより小さい分子もまた浸 透および結合を増加させることを示してもよい。

モノクローナル抗体より他の媒体を使用する具体化例では、高分子（分子量範囲 ニア０．０００−１，０００，０００またはそれ以上）もしくはリポソームを含 み、生理−化学的な特性に基づいて透過性のある血管に局在する約８０ナノメー ター（ｎｍ）の直径を有する微粒子を使用する。

−例では、デキストラン（分子量１５０ＫＤ）は血管作動性薬剤と接合されかつ 最低限の透過性の変化を示す血管に生物学的に活性のある分子を配達する役目を 果たし、それゆえ部位にのみにおいて著しく透過性を高める。結果として、その 後投与された治療のモダリティ（ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）は最初の部位における 投与量のより高い割合を示す。

発明の免疫接合体は遺伝的アプローチにより、または共有結合的にないし、炎症 を刺激するあるいは好ましくは血管作動性である、生物学的に選択される活性化 剤へ臨床的に選択される有効なモノクローナル抗体を連結する他の方法により用 意される。免疫接合体を組立てる結合剤および化学的手段は標的細胞に結合する 抗体の有効性または天然の防御機構を刺激する際の血管作動性薬剤の有効性を損 なわないように選択されかつ遂行されるべきである。

１、モノクローナル抗体 発明における使用に対して最適なモノクローナル抗体は腫瘍細胞に特有の抗原に 対して特異性を有するものだけでなく、正常な組織の抗原に対して共有される特 異性を有するものも含む。必須の特性は、これらのモノクローナル抗体が腫瘍部 位において血管作動性の薬剤を選択的に集中する担体として、発明の目的に従っ て効果的であるということである。適切なモノクローナル抗体は細胞間の物質の ように、抗原への特異性を有するものであってもよく、それらは正常な組織にお いてよりも腫瘍細胞においてより大量にまたはより容易に結合される。−例は、 米国特許Ｎｏ。

４．８６１，５８１に開示されるように、核の抗原への抗体である。

腫瘍または正常な細胞抗原に対するいくつかのモノクローナル抗体は、発明の免 疫接合体における使用に最適であり、商業的に利用可能である。（Ｃｅｎｔｏｃ ｏｒ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＰＡ；Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ ）それ以外のものはコウレル（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔ ｅｉｎ）のよく確立され（Ｋｉｔｓ）はこの過程を容易にする。ハイブリドーマ 細胞系統を用意するためには、腫瘍抗原を有する免疫されたマウスからの膵臓細 胞は、たとえば、ＨｙＢＲＬプレツブキット（Ｐｒｅｐ　ｋｉｔ）（Ｂｅｔｈｅ ｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）のようなキッ ト（ｋ　ｉ　ｔ）の教示に従って、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８−６５３　（Ａｍｅｒｉ ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｏｒ、Ｒｏｃｋｗｅｌｌ、Ｍ Ｄ）のような、非−分泌であるマウスミエローマ融合系統からの細胞と融合され る。融合されたハイブリドーマ細胞はその後マイクロタイタブレートのウェル（ Ｗｅｉｌｓ）に移植され、そこでそれらは数日間生育される。ウェル（Ｗｅｌｌ ｓ）における上清は、たとえば、ＥＬＩＳＡのような簡便なイムノアッセイによ り腫瘍または細胞抗原へのモノクローナル抗体の生成のために試験され、かつ陽 性のハイブリドーマ細胞系統、すなわち、受容可能なモノクローナル抗体を作出 するものは永久培養へと展開される。モノクローナル抗体は、たとえば、アフィ ニティー−ゲル（Ａｆｆｉ−Ｇｅ１）Ａカラム（ｃｏｌｕｍｎ）（Ｂｉｏ−Ｒａ ｄ、Ｒｊｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を使用するように、ゲルクロマトグラフィーによ りこれらの培養物の上清から精製されてもよい。

発明の好ましい具体化例では、リンパ腫細胞に対して特異的で商業的に利用可能 なモノクローナル抗体、Ｌｙｍ−１およびＬｙｍ−２が使用される。（Ｔｅｃｈ ｎｉｃｌ。

ｎｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ、、Ｔｕｓｔｉｎ、Ｃａｌ　１ｆｏ ｒｎｉａ） 生体内での使用に対する腫瘍−特異的モノクローナル抗体の適合性は、生体分配 、細胞局在化、選択的結合、および腫瘍宿主からのクリアランスの割合、または 腫瘍宿主の動物モデルにより決定付けられる。組立てられた免疫接合体の作用は また平行研究によっても決定付けられる。この適合性を評価するための研究は、 たとえば、放射性ヨウ素で標識された　Ｉ−モノクローナル抗体（１３１Ｉ−ｍ Ａｂｓ）のようにラベルされたモノクローナル抗体の手段により、またマクフ７ −レン、Ａ、（ＭｃＦａｒｌａｎｅ。

Ａ、、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、６２：１３５−１４３　（１９５６））の修飾され たクロラミン−Ｔ法により簡便に行なわれる。

放射性同位体でラベルされた抗−腫瘍モノクローナル抗体の免疫反応性はＬｙｍ −１およびＬｙｍ−２モノクローナル抗体に対する例１において記述されるよう な試験管内の正細胞ラジオイムノアッセイ法により決定付けられてよい。（ニブ スタン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）、Ａ、ｅｔ　ａｌ、。

悪性リンパ腫およびホジキン病：実験的および治療的進歩ｏ、、Ｂｏｓｔｏｎ　 （１９８５）、Ｉ）ｐ、５６９−５７７）生体内における抗−腫瘍モノクローナ ル抗体の有効性は、ラベルされたモノクローナル抗体を、腫瘍を有する宿主に注 入した後に続いて行なわれる適切な放射性画像診断、生体分配、組織学的な研究 、およびオートラジオグラフィック法により評価されてもよい。

腫瘍部位において選択的に集中するモノクローナル抗体の能力は、放射性画像診 断により決定される。後方ガンマシンチレーション画像（１００，ＯＯＯｃｐｍ ）は、ピンホール絞りを有するガンマシンチレーションカメラを使用して、放射 性同位体でラベルされたモノクローナル抗体の注入後１日おきごとに麻酔された 宿主から得られる。できることならばカメラはコンピュータシステムにインター フェイスされているとよい。同じ活性を有する適切な１３１　■標準物質がデー タを定量化するためカウントされる。

最適な時期に、画像診断研究により示されるので、宿主動物はと殺されかつ血液 、主要な器官および腫瘍組織が切取られ、重さを計られ、かつモノクローナル抗 体の生体分配を決定するためにカウントされる。さらに、腫瘍組織は固定されか つ包埋されてもよく、かつ組織切片は、腫瘍に結合された放射線同位体でラベル されたモノクローナル抗体を決定するためオートラジオグラフィーによって調査 される。

免疫接合体のモノクローナル抗体は無傷の全抗体、−価のＨＬアイソ７　＝Ｉ− −ム（ＨＬ　ｉｓｏｆｏｒｍ）、抗体のＦ　（ａ　ｂ’　）　２部位、またはＦ ａｂ抗体フラグメントのいずれであってもよい。抗体分子のＦ　、ｃ部位の全体 または部分の除去は、無傷で部位に結合する抗原を除去するのと同時にＦｃ受容 体または補体と同様に非−腫瘍性の構成要素と相互に作用する部位または領域を 取除くことによりその使用を容易にする。Ｆａｂ、ＨＬおよびＦ　（ａ　ｂ’　 ）　２のような抗体フラグメントは、それぞれ全抗体の１／３．１／２および２ ／３の質量を有し、毛細血管壁を通り抜けるための能力を有しかつより急速に間 質組織を通って拡散するので腫瘍内により急速に拡散することができる。しかし 一方で、ＦａｂＳＨＬ、およびＦ　（ａ　ｂ’　）　２フラグメントはより急速 に循環から排除される。ウィルボンら（Ｗｉｌｂｏｎｋ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎ ｃｅｒ　４８：１７６８−１７７５　（１９８１））は、器官に対して腫瘍がＦ ａｂフラグメントと結合する割合がより高くなり、しかし全抗体を有する腫瘍に おいては絶対濃度が３倍より高くなることを見出した。モノクローナル抗−ガン 胎児性抗原（Ｃ（１９８３））は、Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２がフラグメントが急 速に排除されたＦａｂフラグメントおよび緩慢に排除された全抗体との最も好ま しい中間物であることを見出した。Ｆａｂフラグメントはパパインによる全抗体 の消化、またはペプシンによるＦ　（ａ　ｂ’　）　２フラグメントへの全抗体 の消化により用意されてもよく、−価のフラグメントを産出するため分子間鎖ジ スルフィド結合の消化により与えられてもよい。（ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）、 Ｒ，、Ｂｉｏｃにおいてすでに示された技術に従って誘導されてもよい。

２、高分子または巨大粒子 リポソームおよびデキストランのような高分子は、実験モデルにおいて放射性画 像診断により見付けられるように、腫瘍に局在する能力に基づいて選択される。

使用される方法はモノクローナル抗体に対して上記に記述した方法に類この発明 の血管作動性の免疫接合体はそれらの作用の様式において薬剤または毒素接合体 から区別される。薬剤および毒素接合体は直接的に腫瘍細胞を殺すのに使用され る。

血管作動性の接合体は、血管外の浸透ならびにモノクローナル抗体および他の薬 剤または生体内の分子との結合を改良するため、血液の流れおよび／または腫瘍 における血管透過性を増加するために使用される。それらは直接的に腫瘍血液流 の体積または腫瘍血管の「漏れやすさ」の程度を増大することにより、もしくは 間接的に腫瘍部位における炎症の免疫反応を引起こすことにより作用する。炎症 は、白血球、肥満細胞、Ｔ−細胞および炎症に関連のある他の細胞を引き寄せる 走化性因子により引起こされることが可能である。これらの細胞は刺激されると 免疫活性調節因子を分泌し、それらは腫瘍へ浸透しかつ結合する注入された投与 量のパーセンテージを増大するため腫瘍血液流および血管透過性に作用する。

腫瘍部位において記述した反応性を有しかつ免疫接合体においてモノクローナル 抗体に接合するのに適している血管作動性の薬剤は、ペプチド、炭水化物、およ び脂質ならびにそれらの誘導体を含んでいる、いくつかの生化学種において見出 される。

天然の、合成の、または組換体のいずれのペプチドも、免疫接合体における使用 に適合する血管作動性の薬剤の最も豊富な源を含む。

タキキニンはデカ（ｄｅｃａ−）、エンセダ（ｅｎｃ゛ｅｄａ−）、およびドデ カ（ｄｏｄｅｃａ−）ペプチドアミド族であり、Ｃ０ＯＨ末端から５の位置に１ つのフェニルアラニン（Ｐｈｅ）残基を有する。それらは血圧、非血管性の平滑 筋、および外分泌腺において効果的な薬物的効力を有する。（エルスパメル（Ｅ ｒｓｐａｍｅｒ）、Ｖ、。

ＴｌＮ５．　Ｎｏｖ、　１９８１．　ｐｐ、　２６７−２６９）サブスタンス− ＰＳＳ補額類タキキニンは、化学的感受性の神経繊維の逆行性の刺激を通じて血 管拡張およびプラズマ血管外遊出を促進する。（ラムベック（Ｌａｍｂｅｃｋ） 。

Ｆ、ａｎｄ　ハルツエル（Ｈａｌｚｅｒ）、Ｐ、、Ｎａｕｎｙｎ−３ｃｈｍｅｉ ｄｅｂｅｒｇ’　ｓ　Ａｒｃｈ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、３１０：１７５−１８３ 　（１９７９））サブスタンス−Ｐはまた組織肥満細胞からヒスタミンの放出を 仲介する。（ハゲルマルク（Ｈａｇｅ　ｒｍａ　ｒｋ）。

北側では、サブスタンス−Ｐおよび両生類の類似体、フィザレミンは腫瘍脈管構 造の拡張を促進するのに使用するため臨床的に有効なモノクローナル抗体に接合 される。

ロイコトリエンはアトピー性アレルギーにおいて抗力のある媒介物質であるスル フィドペプチドである。臨床の症状発現および疾患の身体的な特徴は、炎症作用 に関連を有する血管におけるこれらの媒介物質の作用が原因である。

ｌｎｍｏｌのロイコトリエンＣ４，Ｄ４またはＥ４でも紅斑およびじんま疹形成 を引起こす。発明の好ましい具体化例において、ロイコトリエンＢｉ、、Ｃ４、 Ｄ４またはＥ４は腫瘍部位において局部的炎症反応をもたらすのに使用するため 臨床的に有効なモノクローナル抗体に接合される。

アナフィラトキシンは血清補体の活性化の間に放出されたペプチドフラグメント である。補体プロティンＣ３およびＣ５の酵素的開裂は、それぞれ活性化ペプチ ドＣ３ａおよびＣ５ａを放出する。これらのペプチドはアナフィラキシ−ショッ クに似た反応を作出する能力のためアナフィラトキシンと称されてきた。Ｃ３ａ およびＣ５ａは血管性の透過性を増大し、かつ組織肥満細胞からセロトニンおよ びヒスタミンを含む顆粒を放出する能力を有する。加えてかっおそら＜Ｃ３ａと 協力して、Ｃ５ａは走化性であり、好中球の遊走および凝集を引起こす。（ナガ タ（Ｎａｇａｔ参照）発明の好ましい具体化例では、Ｃ３ａ、Ｃ５ａまたはそれ らの生物学的に活性のあるペプチド配列は、単独または組合わせのいずれでも、 腫瘍−特異的なモノクローナル抗体に接合され、モノクローナル抗体の血管外の 浸透性を促進するための新たなアプローチとして、腫瘍部位において局在された 炎症の反応を引起こすために使用される。

これらのペプチドの生物学的な活性は、合成のオリゴペプチド、長さにして８か ら２１アミノ酸、Ｃ０ＯＨ末端において本来の０３の共通の残基を含んでいるも のにより再インターロイキンＩＬ−１およびＩ　Ｌ−２ならびに腫瘍ネクローシ ス因子（ＴＮＦ）を含むリンフ才力インは外的な作動物質に対して生物の防御に おける複雑な役割において作用しかつ相互作用する免疫反応の内因性の刺激物質 である。（たとえば、カンシュミット（Ｋａｍｐｓｃｈｍｉｄｔ）、Ｒ，、Ｊ、 Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌ、３６：３４１−３５５　（１９８４）参照） ＩＬ−２は免疫接合体への使用に対して特に重要である。

このリンフ才力インはそれ自体に抗−腫瘍活性を持たないが、リンフ才力イン活 性化されたキラー（ＬＡＫ）とともに投与されるとき、抗力のある活性を有する ようである。

抗−腫瘍薬剤としての使用は限定されるようである、なぜなら宿主の血管性の透 過性および血管外遊出を仲介する能力は体液保持のため重傷部位効果をもたらす ためである。

（フェアマン（Ｆａｉｒｍａｎ）、Ｒ，ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、 ４７：３５２８−３５３２　（１９８７；Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、 、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３７：１７３５−１７４２　（１９８６）参照）しか しながら、ＩＬ−２の血管作動性の特性はこの発明の免疫接合体としての使用に よく適応している。ｒＬ−１がリンパ球からのＩ　Ｌ−２の作出を刺激し、かつ ＴＮＦが他のリンフ才力インと接合して共力的な特性を働かせるようなので、リ ンフ才力インの免疫接合体はＩ　Ｌ−２の免疫接合体と協力して有用となる。（ タルマッシ（Ｔａｌｍａｄｇｅ）　ｅｔ　ａｌ、、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、４７ ：２５６３−２５７０　（１９８７）；フィリップ（Ｐｈｉｌｉｐ）、Ｒ，ａｎ ｄ　エプスタイン（Ｅｐｓ　ｔ　ｅ　ｉｎ）　、Ｌ。

、Ｎａｔｕｒｅ　３２３，５ｅｐｔ、４．１）り、８６−８９（１９８６）参照 ） Ｃ３ａアナフイラトキシンの場合では、インターロイキンの機能的領域を含む小 合成オリゴペプチドはまた免疫接合体における使用に適している。（たとえば、 アントニ（Ａｎｔｏｎｉ）、Ｇ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｉｍｍｕｎ。

１．１３７：３２０１−３２０４　（１９８６）参照）また血管作動性の免疫接 合体における使用に適しているペプチドのもう１つのグループは人間の好酸球酸 性テトラペプチド（ＥＣＦ−Ａ）　、Ｖａ　ｌ　−Ｇ　ｌ　ｙ−３ｅ　ｒ−Ｇ　 ＩＵおよびＡｌａ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｇｌｕであり、それらは局所好酸球増加症 を促進する能力を化学走性を通じて有する。（ターンボール（Ｔｕｒｎｂａｌｌ ）、Ｌ、ｅｔさらに血管作動性の免疫接合体において使用されるとき、ある種の ペプチドである炎症物質は腫瘍部位において？！満細胞を脱顆粒化し、ヒスタミ ンを放出し、かつ局所炎症反応を刺激する能力を有するだろう。このような炎症 物質の１つであるマストバランはハチ毒から分離されたテトラデカペプチドであ る。（オカツ（Ｏｋａｎｏ）、Ｙ、ｅ　を体側において、天然源から分離された または合成的に作出されたいずれのマストパランでも腫瘍−特異的モノクローナ ル抗体（ｍＡｂ）に結合される。（ヒライ（Ｈｉｒａｉ）、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、 Ｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌ　ｌ。

２７　（８）：１９４２−１９４４　（１９７９）参照）免疫学的活性化におい て肥満細胞から放出されたプロテアーゼは皮膚における過敏症反応を刺激するよ うである。

これらのプロテアーゼの可能な作用は結果的には血管透過性を増加させかつ二次 的炎症細胞の流入を伴なう血管基底膜の消化を含む。トリプターゼ、膵臓トリプ シンに類似したエンドペプチターゼは、２つの３０キロダルトンおよび２つの３ ７キロダルトン　サブユニットから成る四量体である。それらは人間の肺臓肥満 細胞の重要なプロテアーゼでありかつあらゆる位置からの肥満細胞においても存 在する。人間の皮膚肥満細胞において見出された、キマーゼは膵臓キモトリプシ ンと同じような特異性を有する。（Ｓｅｒａｆ　ｉｎ、Ｗ、ａｎｄ、Ａｕｒｔ　 ｉｎ、に、、ＮＥＪＭ。

Ｊｕｌｙ　２．ｐｐ、３０−３４　（１９８７））、発明の好ましい具体例では 、トリプターゼおよびキマーゼは腫瘍部位における局所炎症反応を引起こす際の 使用目的のため腫瘍−特異的モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）に接合される。

ある脂質化合物は免疫接合体として有効性がありうる。

発明の一興体側では血小板−活性化因子（ＰＡＦ）は免疫接合体の血管作動性の 薬剤である。ＰＡＦは免疫反応の抗力のある媒介物質であると思われる人間の好 中球によってもたらされるリン脂質である。（ブラケット（Ｂ　ｒ　ａ　ｑ　ｕ ｅｔ）、Ｐ、ａｎｄ　Ｒｏｌａ−Ｐｌｅｚｚｅｚｙｈｓｋｉ、Ｍ、、Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、８　（１１）：　３４５−３５２　（１９８７）　） ＰＡＦは、たとえば前に載せた血管作動性のペプチドに関してあらゆる炎症およ び免疫作用と実質的に結合され、ＰＡＦはサブスタンス−Ｐの放出を刺激し、か つロイコトリエンまたはプロスタグランジンのような他の血管作動性剤の形成を 誘導する。免疫接合体におけるその使用は、内生的であろうとまた補足的な免疫 接合体として使用されようともこれら他の薬剤の効果を拡大することができる。

発明のまたもう１つの具体例では、血圧降下薬剤、ビプロストール（Ｖｉｐｒｏ ｓｔｏｌ）、プロスタグランジン誘導体（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｙａｎａｍｆｄ 、ＰｅａｌＲｉｖｅｒ、ＮＹ）は免疫接合体として活性のある薬剤である。ビプ ロストールは血管拡張を通じて主に動脈の血圧を低くする。（チャン（Ｃｈａｎ ）、Ｐ、ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　４　（６）ニア４ｌ−７４６（１９８６）参照 ）腫瘍−特異的で目的にされたビプロストール投与の利用はそこでの血液体積の 増大のため腫瘍の脈管構造を拡大するだろう。

同様に、他の具体化例において、血圧降下の効果を有することが知られている天 然のプロスタグランジン、（ＰＧＥ′　Ｓ）、または合成類似体は効果的に使用 されることが可能である。（ビルンボイム（Ｂｉｒｎｂａｕｍ）　ｅｔ＋４９２ −４９４　（１９８２）参照）免疫刺激作用において放出される肥満細胞顆粒の 化合物である、ヒスタミンは、他の効果の中でも、ロイコトリエンとして記述さ れるような、血管の透過性の増大および血管特徴を引起こすため、ＨおよびＨ２ とデザインされた２の形の受容体を通じて作用する。（セラフイン（Ｓｅｒａｆ 　ｉｎ）、Ｗ、ａｎｄ　オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）。

Ｋ、、ＮＥＪＭ、Ｊｕｌｙ　２．　ｐｐ、３０−３４　（１９８７））発明の好 ましい具体化例では、ヒスタミンは腫瘍部位における局所炎症反応を引起こすの に使用するため腫瘍−特異的なモノクローナル抗体に接合される。

発明のまた他の具体化例では、免疫接合体の効果的な薬剤は血管作動性の炭水化 物化合物である。好ましい具体化例では、血管作動性の炭水化物はグルカンであ る。グルカンは多くの免疫増強効果を有するサツカロミセス　セルビジエ（Ｓａ ｃ力ａｒｏｍｙｃｅｓ　Ｃｅｒｅｒｒｊｓｉ、ｇｅ）から誘導されるβ−１，６ 結合されたポリグルコースである。　（グロブスキー（Ｇｌｏｖｓｋｙ）、Ｍ、 ｅｔ　ａｌ、。

Ｊ、Ｒｅｔｉｃｕｌｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　５ｏｃｉｅｔｙ、３３：４０１ −４１３　（１９８８））が、インク−ロイキンＩ　Ｌ−２とは異なり無毒性で ある。（シャーウッド（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ）、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｐｏｎｓｅ　Ｍｏｄｉｆｉｅｒ合物システムを刺激し、他 の複合物フラグメントのうちでも、血管作動性のＣ３ａおよびＣ５ａペプチドを 生成することによりその効果を及ぼすようである。特異的なモノクローナル抗体 によって腫瘍へ目標を定められたグルカンは腫瘍脈管構造を拡張するためＣ３ａ およびＣ５ａを通じて局部的に作用することが可能である。

接合体分子は治療または研究の定まった目標に対する有効性および適用性によっ て選択される。

化学的な接合方法 モノクローナル抗体、高分子、または巨大粒子および血管作動性の薬剤との間の 構造上の連結ならびにそれらが結合される場合の化学的な方法は、モノクローナ ル抗体の結合能力および薬剤の生物学的能力が、接合体に接続されるとき、損失 が最小限にされるように選択されるべきである。

最も効果的な接合反応に選ばれた方法は次のようなものである。

ａ）　カルボジイミドは、ウレアの無水物として扱われてもよい。１−エチル− ３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＣＤＩ）は、いずれの 分子の配向に関係なく、抗体と接合体の間に架橋を生成する。接合体はＥＣＤＩ を伴なう酸性状態下で抗体および接合体の縮合により誘導される。この方法は接 合作用の敏速でかつ簡単な１手段を提供する。（グツドフレンド（Ｇｏｏｄｆｒ ｉ１３４４−１３４６　（１９６４）参照）フエザレミンまたはインターロイキ ンをＬｙｍ−１またはＬ　ｙ　ｍ　−２に結合するためのＥＣＤ　Ｉの使用は、 例２および例７において例示した。

ｂ）　Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰ ＤＰ）は、プロティンの末端アミノにチオール基を誘導し、かつ多くの免疫接合 体において使用されてきたヘテロニ価試薬である。（カールソン（ＣａＣ）　モ ノクローナル抗体のＦ　（ａ　ｂ　’　）　２フラグメントにＣ３ａを接合する ためＳ　Ｍ　ＣＣ法の使用は例３に例示した。

ｄ）　ジエンら（Ｓｈｅｎ、ｅｔ　ａｌ、）より記述されるシス−アコニット結 合は、二次リソソームにおいて次の受容体−結合抗体分子のエンドサイト−シス のように、低いｐＨにおいて接合体を放出するような性質を有する。

その方法は抗体分子の炭水化物部位基への接合を与える。

（ジエン（Ｓｈｅｎ）、Ｗ、−Ｃ１，および　ライセル（１９８１））モノクロ ーナル抗体に薬剤ビプロスタール（Ｖｉｐｒｏｓｔａｌ）を接合するためシスー アコニチル誘導体化の使用は例４に例示した。

ｅ）　過ヨウ素酸酸化は糖源における炭素−炭素結合を酸化しかつ裂開するのに 使用できる。さらにむき出しの末端基はＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４で還元されたシッフ塩 基結合でプロティン上のＮＨ２基と結合することができる。（キタオ（Ｋｉｔａ ｏ）、Ｔ、ａｎ４　ハラトリ（Ｈａｔｔｏｒｉ）、Ｋ。

、Ｎａｔｕｒｅ　２６５．Ｊａｎｕａｒｙ　６．Ｉ）Ｉ）、８１−８２　（１９ ７７））モノクローナル抗体ヘグルヵンを接合するためＣ過ヨウ素酸酸化の使用 は例５に例示した。

ｆ）　Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ８）はモノクローナル抗体のプロテ ィンに共有結合されることが可能な活性エステル誘導体を形成するため、たとえ ばペプチドの末端Ｃ０ＯＨ基を活性化する。この方法は結合活性をほとんど損失 することなくクロランプシル／抗体の３０個の分子を結付けるのに使用されてい る。（スミス（Ｓｍｙ　ｔツクローナル抗体にマストパランを接合するためのＮ Ｈ９法の使用は例６に例示した。

血管接合体の構成に対する遺伝子工学法モノクローナル抗体に血管作動性の薬剤 を化学的結合させる代替的方法として、血管作動性のペプチドの遺伝子配列は例 １１に例示したようにモノクローナル抗体の配列中に設計されることが可能であ る。

それらが生体内で応用される前に、免疫接合体は生成物により維持される免疫再 活性および生物学的活性の程度を決定付けるため（ビントンら（Ｂｉｎｄｏｎ　 ｅｔ　ａｌ。

）、Ｂｒ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　４７：１２３−１３３　（１９８３））によって 記述された増殖放射性免疫反応測定法により試験管内で評価され、かつ例８にお いて例示される。

非接合型の抗体に比較して８０％以上の免疫再活性を有するとみなされる免疫接 合体のみが生体実験に使用される。

好結果の免疫接合体はモノクローナル抗体を基にした診断および治療における臨 床での有効性を最大にするであろう。臨床的には、血管作動性の免疫接合体が免 疫診断、化学治療法または免疫治療法投与に先立ってまたは同時に与えられるこ とで、腫瘍の脈管構造は効果的な薬剤により、より浸透されやすくなされるであ ろう。最大の血管作動性効果を引出すのに必要とされる時間は選択される特異的 な接合体およびその作用機構によっている。もしモノクローナル抗体が投与され るのに先立って与えられるなら、血管作動性の免疫接合体の投与と診断薬および 治療薬の投与との間の最小時間は少なくとも約２０分はかかり、かつ最長時間で は約７２時間もかかることは予想される。血管作動性の免疫接合体を投与する時 間と投与との間の適切な間隔は、動物実験または上記に記述した画像診断、生体 分配研究、および組織的な方法を用いて標識された免疫接合体を使用して腫瘍宿 主に関する適切な研究により、経験的に決定されることが可能である。

与えられるべき血管作動性の免疫接合体の投与量は、客観および主観に双方にお ける、医学的判定および経験の分類基準に基づいている。しかしながら、十分な 量の効果的な投与量は、治療の臨床上の有効性または診断の正確さを統計的に意 味のある程度にまで改善する範囲まで後に投与される診察上のまたは治療上の薬 剤の局在化を増進するのに必要とされる総量である。比較は増量の投与量の診察 上のまたは治療上の薬剤が投与される治療を受ける腫瘍宿主動物および治療を受 けない宿主動物との間で行なわれる。

たとえば、正常な組織にとっては毒性があるような診察上のまたは治療上の薬剤 の使用において適用可能な場合には、血管作動性の接合体の効果的な投与量はま たこのような毒性効果を同様に減するような量となる。

免疫診断上の投与量は、腫瘍に対して特異性を有するあるいは生体内で検出可能 である標識を有するモノクローナル抗体を含む。好ましい具体例では、この標識 は放射性活性のある同位体を含む。免疫治療上の投与量は臨床的に有用なモノク ローナル抗体を同様に含んでもよい。このモノクローナル抗体はさらにたとえば 、放射性同位体、化学的治療薬剤または毒素のような殺腫瘍性の薬剤に結付けら れてもよい。

例１ 放射性同位体で標識されたモノクローナル抗体の免疫反応性 ラージ細胞は１ｍｇ／ｍｌウシの血清アルブミンおよび０．０２％窒化ナトリウ ムを含む冷ＰＢＳで２度洗浄される。（ラージ細胞の説明および同じものを得る ための方法０μｌの洗浄バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）において再び懸濁された細 胞（５×１０５）はマイクロタイタのウェル（ｗｅｌｌｓ）にピペットで注入さ れる。（イムロン　レモバウエル　ストリップス；ダイナテックラボラトリーズ インコーポレイテッド、アレクサンドリア、ＶＡ）（Ｉｍｍｕｌｏｎ　Ｒｅｍｏ ｖａｗｅｌｌ　５ｔｒｉｐｓ；Ｄｙｎａｔｅｃｈ　Ｌａｂｓ、、Ｉｎｃ、、Ａｌ ｅｘａｎｄｒｉａ、ＶＡ）マイクロタイタブレートは抗体溶液がウェルに結合す るのを防ぐためにアジドを含むＰＢＳにつきＢ５Ａ１０ｍｇ／ｍｌで一夜前処理 される。（商業的に手に入れることができるＬｙｍ−１およびＬｙｍ−２のよう なリンパ腫細胞に対して特異的なモノクローナル抗体はテクニクローン　インタ ーナショナル　インコーホレイティラド（Ｔｅｃｈｎｉｃｌｏｎｅ　Ｉｎｔｅｒ ｎａｔｉｏｎａｌ。

Ｉｎｃ、）タスチン（Ｔｕｓｔｉｎ）、カルフォルニア（ＣＡｌｉｆｏｒｎｉａ ）から入手可能である。）放射性同位体で標識されたＬｙｍ−１およびＬｙｍ− ２はさらに体積１００μＬ／ウエル内に（１００，０００ｃｐｍ／ウェルで）加 えられかつプレートは一定の振とうで室温で３０分間懸濁される。さらにプレー トは５分間の１．　００Ｏｒｐｍ回転でかつ１２−チップ　マイクロマチイック 　マニホールド（１２−ｔｉｐ　ｍｉｃｒｏｍａｔｉｃ　ｍａｎｉｆｏｌｄ）で 上清を吸引しながら４度洗浄され、かつさらにタイターティック　マルチチャネ ル　ピペット（フローラボラトリーズ、マクリーン、ＶＡ）（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂ ｓ、ＭｃＬｅａｎ、ＶＡ）を使用して２００μｍの洗浄バッファー内に細胞を再 び懸濁する。ウェル（ｗｅｌｌＳ）はその後機械的に切り離され、細胞に結合し た標識の総量を定量するためガンマ−カウンター内で針山される。

例２ ＣＤＩ法によるモノクローナル抗体へのフィザレミンの接合 フィザレミン（シグマケミカルコーポレーション、セン−トルイス、ＭＯ）　（ Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ。

、Ｓｔ、Ｌｏｕｔｓ、ＭＯ）はカルボジイミド法によりモノクローナル抗体Ｌｙ ｍ−１およびＬｙｍ−２に接合される。フィザレミン、Ｌｙｍ−１またはＬｙｍ −２、および１−シクロへキシル−３−（２−モルフォリノエチル　１）カルボ ジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＤＩ）（アルドリッチケミカルコ ーポレーション、ミルウォーキー、Ｗｌ）　（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ　Ｃｏ、。

Ｍ　ｉ　ｌ　ｗ　ａ　ｕ　ｋ　ｅ　ｅ　、　Ｗ　Ｉ　）は質量にして１：３．６ ：３６の割合で混合されかつ室温でｐＨ５，０で２０分間懸濁される。反応はｐ ｆ（’７．　２で一晩中、ＰＢＳに対する透析により終結させられる。接合体は ＦＰＬＣシューブロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）（ファルマシア、ビス力タウエイ ・ＮＪ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）カラムクロマト グラフィで精製されかつＰＢＳにおいて４℃で保存される。

例３ ＳＭＣＣ法によるＦ　（ａ　ｂ’　）　２モノクローナル抗体へのＣ３αペプチ ドの接合 Ｃ３α（５７−７７）ペプチドは、三機能性の試薬、スクシンイミジル−４−（ Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン１−カルボキシレート（ｓｕｃｃｉｎｉ ｍｉｄｙｌ−４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏ　ｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘ ａｎｅ　１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（ＳＭＣＣ）を使用してＦ　（ａ　ｂ’ 　）　２モノクローナル抗体に結合させられる。（Ｍ、　バー？ンら（Ｍ、Ｈｅ ｒｍａｎ、ｅｔａｌ、、）ｒ予め決定されている特異性を有する抗ペプチド抗体 は全一特異的造血Ｉ　Ｌ−３の生物活性を認識しかつ抗力を失活させるＪ　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３８：１０９９−１１０４．（１９８７）） モノクローナル抗体は、抗体のＦｃ部位により白血球に非−特異的に結合するこ とを避けるためペプシンを使用してＦ　（ａ　ｂ’　）　２フラグメントに切断 される。Ｎ−末端システィン残基を含む、Ｃ３α（５７から７７）はオートメー ション化されたプロティン合成を使用して合成される。

Ｃ３αペプチド（１ｍｇ）はｐＨ７，５で３００μｌの４Ｍグアナシニウム−Ｐ ＢＳ　（ｇｕａｎａｄｉｎｉｕｍ−ＰＢＳ）に溶解される。ｐＨは約３Ｌの１７ ％Ｈ３ＰＯ４で３と４の間に透析により調整される。この溶液はレシービング（ ’ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）管（１７ｘ１００ｍｍ）に収容される。

Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２抗体（６０ｎｍｏ　１　ｅ）はｐＨ７，５で１．０ｍＩ ＰＢＳに溶解されかつジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した２４００ｎｍ ｏｌｅｓ　「試薬Ｊ　（ＳＭＣＣ）と反応させかつ室温で３０分間かき混ぜられ る。

Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２混合物はセファデクス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　 ｘ）（７ｙ−７シア、ビス力タウエイ、ＮＪ）（Ｐｈａｒｍ、ａｃｉａ、Ｐｉｓ ｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）Ｇ−１０カラム（２ｍｌ）に適用され、１分間１５００ Ｇで遠心分離されかつレシービング（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）管に集められる。

カラムはｐＨ７，５の３００μＩＰＢｓで洗浄し、かつ再−遠心分離される。ｐ Ｈは７．０および７．７の間に調整されかつ混合物は室温で３時間かき混ぜられ る。

接合された抗体は４℃で保存される。

Ｃ５αは三機能性の架橋試薬ジメチルスーパーイミデートまたは５ＰＤＰを使用 してＦ　（ａ　ｂ’　）　２抗体に結合される。条件は１／ＩＣ５α−Ｆ　（ａ 　ｂ’　）　２接合体を生成するためかつＣ５αまたはＦ　（ａ　ｂ’　）　２ いずれか単独の重合作用を最小限にするために調節されるだろう。

例４ シスーアコニチル誘導体化によるモノクローナル抗体へのビプロストール（Ｖｉ ｐｒｏｓｔｏｌ）の接合ビプロストール（Ｖｉｐｒｏｓｔｏｌ）は、１１−ヒド ロキシ基によってシスーアコニチルのスペーサーアーム（ａ　ｃｉｓ−ａｃｏｎ ｉｔｙｌ　５ｐａｃｅｒ　ａｒｍ）を付加することにより誘導されることができ る。この反応において、ビプロストール（Ｖｉｐｒｏｓｔｏｌ）（５ｍｇ）は試 験管内で１ｍｇの０．１Ｍ　Ｎａ２ＨＰＯ４に溶解されかつ水浴で冷却される。

モル過剰（５ｍｇ）のシスーアコニチル（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｙｌ）アンヒド リド（アンドリッチケミカル、ミルウォーキー、ＷＩ）（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ。

ＷＩ）が混ぜながら溶液にゆっくりと加えられ、かつｐＨはＩＮ　ＮａＯＨを注 意深く加えることにより８と９の間に保たれる。サンプルの薄層クロマトグラフ ィーは反応の進行をモニタするのに使用される。　Ｈ−または１４Ｃ−でラベル されたビプロストール（Ｖｉｐｒｏｓｔｏｌ）のトレーサー（ｔｒａｃｅｒ）は 反応混合物に加えられてよく、反応の経過は薄層プレートのオートラジオグラフ ィーによってモニターされる。誘導体の分離および精製は生成物の酸性化および 精製またはカラムクロマトグラフィーを使用することにより達成されてもよい。

モノクローナル抗体にビプロストール（Ｖｉｐｒｏｓｔｏｌ）を接合するため、 シスーアコニチルビプロストール（ｃ　１ｓ−ａｃｏｎｉ　ｔｙｌ　Ｖｉｐｒｏ ｓｔｏｌ）誘導体はＬｙｍ−１またはＬｙｍ−２モノクローナル抗体を含んだ溶 液に加えられる。

混合物はさらにｐＨ５，０室温で３０分間懸濁されてもよい。反応は終了し、か つ接合体はセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５カラムを通じて、また はＦＰＬＣシューブロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）カラムクロマトグラフィによっ てサンプルを溶離することにより精製される。

例５ 過ヨウ素酸酸化によるモノクローナル抗体へのグルカンの接合 グルカンは生物活性に影響することなく、Ｎ　ａ　Ｉ　０４の１から２モルの過 剰のみを使用して、糖部分の１つを切断するため過ヨウ素酸酸化を使用すること により注意深く酸化される。酸化によるグルカン内に生じたアルデヒド基はシッ フ塩基を形成するためモノクローナル抗体上の−ＮＨ２基に反応するだろう。シ ッフ塩基結合はさらにグルカン−モノクローナル抗体接合の安定したアミン結合 を形成するため、０．３ｍｇ／ｍｌの濃度でＮ　ａ　Ｂ　Ｈ４により還元される 。

例６ ＮＨ３法によるモノクローナル抗体のマストパランの接マストパラン（ｍａｓｔ ｏｐａｒａｎ）の活性エステルはジメチルホルムアミド（ｄ　ｉｍｅ　ｔ　ｈｙ 　ｌ　ｆ　ｏ　ｒｍａｍｉｄｅ）におけるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨ ３）による反応および縮合試薬としてＮ、Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド （Ｄ　ＣＣ）を利用した反応によって調製される。Ｄ　Ｍ　Ｆにおけるマストパ ラン（ｍａｓｔｐａｒａｎ）活性エステルの溶液はさらにｐＨ７，０でＬｙｍ− １またはＬｙｍ−２モノクローナル抗体を含む溶液に加えられ、かつ室温で１時 間から２時間かけて反応させられる。

不溶解の物質、主にジシクロへキシルウレアおよび／または沈殿したプロティン は遠心分離により除去される。遊離マストパランおよび他の不活性の開始物質は セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−２５（ファルマシア、ビス力タウエイ 、ＮＪ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）カラムを使用す るゲル濾過クロマトグラフィーにより除去されることができる。接合において結 合されるマストパランの総量はトリチウム（Ｈ３）で標識されたマストバランの トレーサーを使って決定される。

例７ ＣＤＩによる腫瘍−特異的なモノクローナル抗体へのインターロイキン−２の接 合 組換型インターロイキン−２（ｒＩＬ−２）（シータスコーポレーション、ニメ リービル、カルホルニア）（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｅｍｅｒｙ ｖｉｌｌｅ。

Ｃａ　Ｉ　ｉ　ｆｏｒｎｒａ）は０．３ｍｇまたは１．２ｍｇ／バイアル（ｖ　 ｉ　ａ　ｌ）を含むようバイアル（ｖ　ｉ　ａ　ｌ）内に提供される。Ｌｙｍ− １のように精製されたモノクローナル抗体は、ｐＨ７，４、リン酸バッファー（ ｂｕｆｆｅｒ）で全体積が０．３ｍｇが与えられるように、ｒｌＬ−２に、１− シクロへキシル−３−（２−モルホリノエチルカルボジイミド　メト−ｐ−トル エンスルホネート）（ｒＣＤ　ＩＪ　）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイ ミドを１・２・５０：５０の質量比で使用して接合される。

反応混合物は４°Ｃで一晩中懸濁させる。４℃で１５分間４０００ｒｐｍで遠心 分離後、可溶性の結合抗体はブルーデキストランで目盛りづけされたセファデッ クス（Ｓ　ｅ　ｐ　ｈａｄｅｘ）Ｇ−１００カラムにおいてクロマトグラフィー される。この方法を使用することでｒＩＬ−２の約１−２分子が各モノクローナ ル抗体（ｒｍＡｂＪ）分子に結合される。その免疫接合した調合薬剤はさらに１ 　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌに調整され、無菌濾過されかつ使用まで４℃で保存される 。

この方法はいかなる腫瘍−特異的なモノクローナル抗体にｒｌＬ〜２を結合する のにも使用することができる。

例８ 治療薬へのインターロイキン−２の接合上述と同様の接合方法が、腫瘍の内皮に 対して特異性を有するモノクローナル抗体にＩ　Ｌ−２を結合するために使用す ることができる。例として、フィブロネクチンに対するモノクローナル抗体が、 正常な内皮と比較して、腫瘍の脈管構造に選択的に結合するため示されてきた。

腫瘍部位におけるｒＩＬ−２の最初の作用が、血管の透過性を促進することであ るため、腫瘍内皮への血管作動性免疫接合体の攻撃は最良となるであろう。加え て、同様の方法論を用いて、ｒｒＬ−２接合体の治療は、たとえば、異なったタ イプの癌の治療のためのシスプラチナ（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）を含む通常 の化学治療剤の使用により補われるかまたは継続され得る。

髭 遺伝子組換処理した血管作動性免疫接合体腫瘍または腫瘍の脈管構造を目標とす るモノクローナル抗体に血管作動性ペプチドを化学的に結合する代わりに、血管 作動性ペプチドの遺伝子配列をモノクローナル抗体の配列に組込むことができる 。例として、抗フィブロネクチンモノクローナル抗体をコードするｍＲＮＡが分 離される。

このｍＲＮＡから、免疫グロブリンのＨおよびＬ鎖の両方のためのｃＤＮＡが合 成される。このｃＤＮＡは、順次、１）ポリメラーゼ連鎖反応を利用して増やさ れ、２）配列決定され、かっ３）制限エンドヌクレアーゼによりマツピングされ る。ＩＬ−２のような血管作動性ペプチドの適切なりＮＡ配列は、次に、定常部 におけるＨ鎖遺伝子の末端に連結される。

次に、完全に処理された遺伝子は、遺伝子トランスフェクション法（たとえば、 エレクトロポレーションまたは燐酸カルシウム法を用いる）により、真核生物ま たは原核生物の発現系内に導入され、大量の細胞培養においてタンパク質生産物 として発現される。第１図に示されるように、２つの活性Ｉ　Ｌ−２成分が、そ れぞれの免疫グロブリン分子の一部分となるであろう。それぞれの血管作動性ペ プチドに対する最良の付着部位は、異なり得、かつ実験的方法により容易に決定 し得る。血管作動性ペプチドの配列は、人、マウス、キメラもしくは他の種の免 疫グロブリン分子の組合わせを生産するために、人またはマウスの免疫グロブリ ンのＨ鎖配列に連結され得る。

例１′０ 増殖検定により決定された免疫接合体の機能的活性ｒＩＬ−２免疫接合体の機能 的活性を試験するために１、増殖検定が行なわれる。

新鮮なマウスの牌蔵細胞が、ＰＨＡにより３日間刺激された後、ｒｌＬ−２とと もに７日間静置培養される。次に、細胞は洗浄されてｒＩＬ−２が取除かれ、か つ１０％牛脂児血清および抗性物質が補われたＲＰＭＩ−１６４０倍地に再懸濁 される。１０５の細胞を含む１００μｍが、異なる濃度の免疫接合体（テスト試 料）、ｒＩＬ−２（正のコントロール）およびＬｙｍ−１もしくはＬｙｍ−２（ 負のコントロール）を１００μｌ存在させたマイクロタイタープレートウェルに ３連で培養される。培養物は、時間２μＣｉのＩ２５Ｉ−ＩＵＤＲ（Ｎｅｗ　Ｆ ｎｇｆａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｃｏ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）が４時間のインキ ュベーション期間において添加された後、３７℃で２４時間インキュベートされ る。次に、細胞は、γ線カウンタにおいて計数される前に、ＰＢＳを用いて３回 、かつ５％トリクロロ酢酸を用いて１回洗浄されることにより採集される。正の コントロールとして生成されたｒＩＬ−２を用いることにより、投与応答曲線を 形成するために、ｌｏｇ２のｒｌＬ−２希釈に対して１２５　Ｉ−ＩＵＤＲ取込 データをプロットすることができる。５０％の最大＋２５１．−ＩＵＤＲ取込（ ｙ軸座標）においてこの曲線が交わるコントロール試料のＸ軸希釈座標は、ｒｌ Ｉ、−２活性の１ユニツトに相当する値として定められる。このようにして、免 疫接合体調製物のｒＩＬ−２活性がバッチからバッチまで定量され得る。

例１１ モノクローナル抗体Ｌｙｍ−１による血管外腫瘍の浸透を増加するための血管作 動性化合物の使用生体内の分配におけるＩ　Ｌ、−２血管作動性免疫接合体の相 対的な効果およびリンパ腫を保持するヌードマウスにお腫瘍のＬｙｍ、−１の取 込を試験するために、０．５ｇラーン（Ｒａｊｉ）’Ｊリンパ腫皮下移植片をそ れぞれ保持する５匹のマウスの群が、５０μＣｉのｌ−１２５で放射性ラベルさ れたＬｙｍ−１のＦ　（ａｂ′）２２０μｇの投与前の０時間、または２１／２ 時間において、血管内に、Ｌｙｍ−１（）ントロール）またはＬｙｍ−Ｌ／ＩＬ −２免疫接合体（実験）を投与された。３日の後、すべてのマウスは殺され、か つ腫瘍および正常な器官が組織１グラム当たりのラベル量を定量するために取除 かれた。以下に示すように、実験のＬｙｍ−１／ＩＬ−２血管接合体を接種した これらのマウスは、適切なコントロールに対してｍＡｂの局在化について２００ ％の増加を示した（第１図）。さらに、第２図−第４図に示されるように、ｍＡ ｂの局在化についてのこの増加は、腫瘍／′血液比を約２倍高め（第２図）、投 与量に依存しく血管接合体の３０−５０μｇの間において最大の効果；第３図） 、かつｍＡｂの投与の前の２１／２時間で最大の効果が示されるように時間依存 性（第４図）である。

例１２ 臨床的な利用および応用 血管作動性免疫接合体は、１）薬剤または薬剤を含むリポソーム、および２）治 療用モノクロ−カル抗体、の配達を促進するために使用されることが意味される 。この免疫接合体の作用機構は、腫瘍部位において透過性および／または血液の 流れを増加させることによる。それゆえに、薬剤、モノクローナル抗体、または リポソームが治療のために投与される１−３時間前に、免疫接合体は一般的に投 与される。

動物モデルにおいて、ｌ−１３１Ｌｙｍ−Ｉ　Ｆ　（ａｂ′）２を投与する２　 １／２時間前におけるＬｙｍ−１に結合されたｒＩＬ−２の使用は、コントロー ルに比べて、後者の投与を２００％増加させる。組換えされた免疫接合体の使用 は、生体内におけるその効力を顕著に高めるであろう。

この発明は、その思想または本質的な特徴から外れることなく、その他の特定的 な形態において具体化され得る。

上記具体例は、すべての点で、限定されずに例としてのみ考慮されるべきであり 、かつ、したがってこの発明の範囲は上記記載よりもむしろ次に掲げられる請求 の範囲により示される。請求の範囲と均等な手段および範囲の中にあるいかなる 変更もこの発明の範囲内に包含されるべきである。

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Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配達媒体、および前記腫瘍組織への 血液供給を増加するよう働く配達媒体に結合された薬剤を備える、薬剤接合体。
2. ２．前記接合体が、正常で健康な血管内皮を透過することができないが、腫瘍組 織の血管内皮を透過できるのに十分な大きさである、請求項１に記載の接合体。
3. ３．前記薬剤が、血管内皮の活性部位において、血管透過性を増加するよう働く 、請求項１に記載の接合体。
4. ４．前記薬剤が、血管内皮の活性部位において、局所的な炎症性反応を刺激また は激化するよう働く、請求項１に記載の接合体。
5. ５．抗腫瘍性の放射性同位体と組合わされた、請求項１、３または４に記載の接 合体。
6. ６．抗腫瘍性の毒素と組合わされた、請求項１、３または４に記載の接合体。
7. ７．前記薬剤が、薬事的に活性な化合物を含む、請求項１、３または４に記載の 接合体。
8. ８．前記薬剤が、炭水化物である、請求項１に記載の接合体。
9. ９．前記炭水化物が、グルカンおよびプロテオグルカンからなる群から選択され る、請求項８に記載の接合体。
10. １０．前記薬剤が脂質である、請求項１、３または４に記載の接合体。
11. １１．前記脂質が、血小板活性化因子およびプロスタグランジンからなる群から 選択される、請求項１０に記載の接合体。
12. １２．前記薬剤が生物学的アミンである、請求項１、３または４に記載の接合体 。
13. １３．前記配達媒体が、損傷を受け、炎症を起こし、または構造的に異常な血管 内皮において選択的に発現される分子に対して特異性を有する、請求項１、３ま たは４に記載の接合体。
14. １４．前記配達媒体が、免疫グロブリンまたはその断片を備える、請求項１、３ 、または４に記載の接合体。
15. １５．前記配達媒体が、モノクローナル抗体を備える、請求項１、３または４に 記載の接合体。
16. １６．前記配達媒体が、１つまたは２つ以上のリポソームを備える、請求項１、 ３または４に記載の接合体。
17. １７．前記リボソームが、８０ｎｍのオーダーの直径を有する、請求項１６に記 載の接合体。
18. １８．前記配達媒体が、透過性の血管壁に選択的に集中する高分子量のデキスト ラン（７０−１５０ＫＤ）を備える、請求項１、３または４に記載の接合体。
19. １９．前記配達媒体が、３０，０００と２００，０００との間の分子量を有する 高分子または粒子を備える、請求項１、３または４に記載の接合体。
20. ２０．前記配達媒体が、腫瘍に見られるような炎症を起こした血管および構造的 に異常な血管において循環する抗体またはその他の高分子に接近するようになる 血管壁の内皮下成分に対して特異性を有する、請求項１、３または４に記載の接 合体。
21. ２１．前記成分が、フィブロネクチン、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、およびＩ Ｖ型コラーゲン、またはそれらの類似分子を備える、請求項２０に記載の接合体 。
22. ２２．前記配達媒体が、血管壁、炎症を起こした血管壁のすぐ近くの環境、また は腫瘍の壊死領域において活性化される凝固カスケードの成分に対して特異性を 有する、請求項１、３または４に記載の接合体。
23. ２３．前記成分がフィブリンおよびトロンビンを含む、請求項２２に記載の接合 体。
24. ２４．前記配達媒体が、炎症を起こしていない脈管組織でなく、炎症を起こした 脈管組織の内皮細胞の中または上において選択的に発現される抗原に対して特異 性を有する、請求項１、３または４に記載の接合体。
25. ２５．前記抗原が、炎症を起こした脈管組織への多形核白血球の付着の原因とな る細胞付着分子を含む、請求項２４に記載の接合体。
26. ２６．前記抗原がフィブリンを備える、請求項２４に記載の接合体。
27. ２７．前記抗原がフィブロネクチンを備える、請求項２４に記載の接合体。
28. ２８．前記抗原がフィブリン減成産物を備える、請求項２４に記載の接合体。
29. ２９．前記抗原が、細胞酵素、血小板または血小板細胞生産物を備える、請求項 ２４に記載の接合体。
30. ３０．前記酸素が、壊死性または炎症を起こした組織において放出されるペルオ キシダーゼを含む、請求項２９に記載の接合体。
31. ３１．前記配達媒体が、新しい脈管組織の内皮細胞の中または上において選択的 に発現される抗原に対して特異性を有する、請求項１、３または４に記載の接合 体。
32. ３２．腫瘍組織の診断のための方法であって、前記腫瘍組織への血液の供給を増 加するように働く薬剤に接合されている抗体を前記組織の部位に集める能力を有 する有効な量の配達媒体を前記組織を有する宿主に投与するステップ、および それと同時またはその後に、前記宿主に腫瘍の像を造る薬剤を投与するステップ を備える方法。
33. ３３．前記腫瘍の像を造る薬剤と接合された、前記組織の部位に集中する能力を 有する配達媒体を備える接合体として、診断薬が投与される、請求項３２に記載 の方法。
34. ３４．腫瘍組織の免疫診断のための方法であって、有効な量の請求項１の接合体 を前記組織を有する宿主に投与するステップ、および それと同時またはその後に、前記組織の部位に集中する能力を有する配達媒体お よびそれに接合された検出可能な薬剤を備える接合体を前記宿主に投与するステ ップを備える、方法。
35. ３５．薬剤としての使用のために、接合体を構成するための方法であって、腫瘍 組織の部位に集中する能力を有する配達媒体またはそれと同じものをコードする ヌクレオチドを、前記腫瘍組織への血液供給を増加するように働く少なくとも１ つの薬剤またはそれと同じものをコードするヌクレオチドに付加することを備え る、方法。
36. ３６．腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配達媒体に接合された、前記腹痛 組織の治療のための薬剤組成物の調製において、前記腫瘍組織への血液供給を増 加するよう働く薬剤の使用。
37. ３７．腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配達媒体に接合された、前記腫瘍 組織の診断のための組成物の調製における、前記腫瘍組織への血液供給を増加す るよう働く薬剤の使用。
38. ３８．腫瘍組織の部位に集中する能力を有する配達媒体、および前記腫瘍組織へ の血液供給を増加するよう働く配達媒体に結合された薬剤を備える接合体、およ び抗腫瘍性の治療薬、 を備える治療用キット。
39. ３９．腫瘍組織の部位に集中する能力を備える配達媒体、および前記腹痛組織へ の血液供給を増加するよう働く配達媒体に結合された薬剤を備える接合体、およ び腫瘍の像を造る薬剤、 を備える診断用キット。