JPH06507918A - ｉｎ ｖｉｖｏ 結合対プレターゲティング - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

現在、広い範囲に適用可能な診断薬及び治療薬が癌や感染症の１０マ１マ０での 診断や治療に使用されている。医薬品の１つの重要な群である放射性核種はラジ オイメージングや放射線療法に有用であることが示されている。ラジオイメージ ング用化合物には、静脈内投与して癌の病巣を検出するために使用するＩｎ、Ｇ ａ、　Ｔｃまたは５７Ｃｏのような放射性同位Ｉ１１　６７　９９ｍ 元素の金属キレートを含んでいる。放射線療法用薬、例えば９０Ｙの金属キレ− １・は電離放射を介して局所的に細胞を破壊することにより細胞毒性作用を示す 。しかＩ７、放射性核種には多くの制約がある。特別な問題は、毒性のある副作 用により起こるものであり、そのため安全使用量が限定される。副作用が重篤な ため有効な治療用量を安全に投与できないことがある。従って、放射性核種を体 内の標的部位例えば固形腫瘍に特異的にターゲティングすることが現在の医学研 究の焦点となっている。 放射性核種ターゲティングの目的は、非標的組織での放射性核種の取り込みを最 小限に抑えながら、標的部位での放射性同位元素濃度を高めることにより、腫瘍 対正常組織の比を高めることである。 ヒトの腫瘍関連抗原に反応性のモノクローナル抗体は放射性核種を選択的に送達 する有望な薬剤を提供する。放射性核種を抗体と結合させる種々の方法について 述べられてきている。１つの方法では、抗体分子のチ■コシン残基を　１３１！ で標識する。 また、−官能性キレート試薬を使用して放射性同位元素を抗体に結合させる。こ の二官能性キレート試薬は１つの官能基として金属イオンと緊密な錯体を形成で きるキレート化部分を含んでおり、第一二の官能基として化学的反応性部分例え ば活性化エステル、ニトロまたはアミン基を有しており、これを介して化合物を 抗体と結合させることができる。二官能性キレート試薬分子は同位元素−抗体結 合体の安定性を高めることが示されているため、後者の標識手法が臨床試験に好 適であった。好ましい結果がいくつか得られているが、これらの研究のデータは 放射線同位元素−抗体Ｉｉ！ｉ？、体の使用には多くの制約があることを示して いる。最も重要な制約要因は、この結合体が正常組織例えば肝嘘、骨髄、腎臓に 非特異的に高率で取り込まれ、重篤な副作用を引き起こすことである。その結果 、研究者の中には、遠隔転移部位への分配は無視して、公知の病巣の領域に放射 性同位元素−抗体結合体を局所的または部分的に注射した。別の研究者は、分子 量が低く、従って腫瘍内に深く浸透できる抗体断片を送達剤として使用した。し かし、この抗体断片もある種の正常組織に高率で取り込まれ、治療指数を低下さ せる。 最近、これらの問題を克服するために二官能性モノクローナル抗体の開発が行な われている。このような抗体は二重特異性であり、疾患部位例えば腫瘍標的に対 する１つの結合部位と、放射性核種を含む種々の診断薬及び治療薬の担体として 機能できるハブテンに対する１つの結合部位を持つ。二重特異性があるために放 射性核種の二段階ターゲティング手法が開発できた。 先ず、抗ハブテン、抗腫瘍二官能性抗体を投与し、この二官能性抗体が腫瘍部位 に局在化するのに十分な時間の後で、放射性核種で誘導体化したハブテンを注射 する。この方法には、非毒性ターゲティング部分と毒性のある放射性核種で誘導 体化したハブテンを別々に投与できる利点がある。その結果、重篤な副作用を起 す危険性なく大量のターゲティング部分を投与できる。 さらに、体組織を介して迅速に分布され、腎臓から迅速に排泄されうる放射性核 種誘導体化ハブテンの低分子量構造に放射活性が結合しているため、取り込み率 の上昇及び放射性核種の迅速な局在化が期待できる。 しかし、二官能性抗体を使用する方法では、抗体分子が別々の特異性を持つ２つ の一価抗体断片からなるという難点がある。 Ｆｅｂ’断片のような一価抗体断片の結合新和性は二価抗体分子より数段低い。 しかし、２段階の二官能性抗体を使用する方法の効果は、放射性核種で誘導体化 したハブテンに対する、及び標的部位の細胞外または細胞表面の抗原に対する二 官能性抗体の高い結合新和性に依存している。さらに、放射性核種で誘導体化し たハブテンを注射する前に血中から未結合の二官能性抗体を効率よく浄化するの に、４−６日が必要である。−価抗体断片を使用すると、この期間に、結合した 抗体分子が標的部位から完全に解離すると予想される。表面に不動態化した抗原 に結合する抗体の動力学の最近の研究により、表面に不動態化した抗原に結合し た無傷の抗体はほぼ３日間顕著には解離しなかったが、一方、同じ抗体から調製 した一価の　Ｆ８ｂ’　断片は表面に結合した抗原から１６時間の半減期で解離 した（Ｎ、　Ｎ７ｇ＋ｅｎ。 Ｃ，Ｃ＋ｅ＋ｋｉ＋＋に７．　Ｍ、　Ｓ＋ｅ＋ｂ＋ｒｆ、表面に不動態化した抗 原に結合した抗体の解離（Ｄｉ＋＋ｏ＋ｉ＋ｌ１ｏａ　ｏｆ　１ｎｌｉｂｏｄｙ 　ｈｏｅｅｄ　ｔ。 ｒ＋＋ｌ＋ｃｅ−ｉｍｍｏｂｉｌｉ＋ｅｄ　５ｎｌｉｌ＠ｍ　）　１．　Ｉｍ■ ｏ１．　Ｍｓｌｈ、８５．　８７−９５、　１９８５）　。 一価結合による制約がある上に、現在の二官能性抗体の製造法にも問題がある。 １つの方法では、異なる特異性を持つ２つのＦ１ｂ’断片を化学的に結合させて 二重特異性を持つＦ（Ｉｂ）２断片を形成する。適切な抗体断片を調製するには 個々のモノクローナル抗体について実験条件をそれぞれ調整する必要があり、収 率が非常に低いことが多く、ハイブリッド抗体は通常顕著に不可逆的変性を受け る。このような変性が起こると免疫反応性が低下することがあり、１６マ１マ０ で異なる代謝特性が生じることが予期されている。また、ハイブリッドハイブリ ドーマを適切に物理的、生化学的に選択して、２つのハイブリドーマまたは免疫 膵臓細胞を持つハイブリドーマを融合させることができる。樹立されたハイブリ ッドハイブリドーマが産生ずる二官能性抗体の理論的な最高収率は合成された全 免疫グロブリンの５０％であり、残りは二価の親抗体であろう。しかし、二官能 性抗体の実際の産生量はこれよりかなり低い可能性がある。最近の研究で、メト トレキセート及びヒト腫瘍関連抗原に対する二特異性モノクローナル抗体を調製 してメトトレキセート−担体結合体の細胞毒性を高めた。（Ｍ、Ｖ、　Ｐｔ５ｗ 、　Ｒ＾、　Ｒａｂｉｔｓ。 Ｍ、Ｉ、　Ｅｍｂｌｃｔｏａ、　Ｅ、Ｉ＊ｃｏｂｓ、　Ａ、１．　Ｍ＊＋ｋｋｓ 置、　Ａ、Ｃｋｇ＋Ｉｅ＋ｌａｓ及びＬＷ、ＢＩｌｄｗｉ＊、Ｂｒ、１．　Ｃ＊ ｉｃｔ＋、ｙｏｌ、　６１．　ｐｐ５１１ｇ−５１３゜＋９９１１）。ハイブリ ッドハイブリドーマから回収した全免疫グロブリンの割合は元のハイブリドーマ 細胞由来の単一特異性抗体６０％、免疫膵臓細胞由来の単一特異性抗体２７％で 、二官能性抗体の割合は１３％に過ぎず、同種の重鎮が選択的に会合することを 示唆している。これらのデータはハイブリッド−ハイブリドーマ手法を使用する ときには、ハイブリドーマが産生ずる親杭体から二官能性抗体を精製する戦略を 開発することが常に必要とされることを示している。１つのハイブリッドハイブ リドーマ由来の異なる抗体分子はほとんどの特性を共有しているため、単一特異 性抗体を効率よく除去するためには、精製した抗体の一部を変性させることが知 られている時間のかかる方法である２つの親和性精製ステップが必要とされる。 上記に問題点を示したが、こねは網羅することを意図したものではなく、むしろ 上記薬剤の潜在的な臨床的な価値を限定する傾向のある要素のうちの多くについ て述べようとしたものである。二官能性抗体用に開発された二段階法には他のタ ーゲティング手法より優れた点がいくつかあるが、所望の結果を得るに十分な時 間、放射性核種または他の診断薬もしくは治療薬の濃度を１０マ１マ０標的部位 に維持できるより効果的な手段が必要とされている。また、高収率で容易に合成 、精製が可能な成分からなる有効な送達システムも必要である。 発明の概要 本発明の一般的な目的は、治療用または診断用化合物を　１１マ１マ０の標的に ターゲティングするための送達システムを提供することであり、これは従来技術 で公知の制約要因を実質的に克服することになる。本発明のより特定的な目的は 、放射性核種を固形腫瘍領域に選択的にターテゲイングするための方法及び成分 を提供することである。 本発明は、標的部位に局在するようになる、非毒性酵素に結合した非毒性ターゲ ティング部分と官能性部分で誘導体化

【、た酵素阻害剤または酵素基質とを使用 する１０マロ◇で局在化させるためのシステムからなる。投与すると、誘導体化 した酵素阻害剤または基質は局在するターゲティング部分に結合した非毒性酵素 に結合し、標的部位の組織に官能性部分を提供する。好ましい実施態様では、タ ーゲティング部分は抗体または抗体断片であり、酵素阻害剤に結合した官能性部 分は放射性核種である。本発明によると、ターゲティング部分及び酵素は結合し たときに両方とも非毒性であり、免疫原性は最小または全くなく、誘導体化した 酵素阻害剤または基質も免疫原性が弱く、毒性がないのが好ましい。ターゲティ ング部分に結合した酵素についての別の要件は、循環中に本質的に含まれない、 またはほんの少量しか存在しないことである。本発明を使用すると、酵素に結合 したター・ゲティング部分を迅速に特異的に局在化させ、非特異的結合をほとん ど持たない、官能性部分で誘導体化した酵素阻害剤または基質を比較的迅速に浄 化し、特異的にターゲティングする。これらの方法を使用すると、非常に毒性の 高いまたはこの方法で無ければ望みようのなかった官能性部分を治療やイメージ ングに使用できる。本発明は官能性部分で誘導体化した酵素阻害剤及び安定化し たジヒドロ葉酸レダクターゼを作製するために有用な新規なメトトレキセート類 似体も含む。 好ましい実施態様の説明 豐者体内の標的部位に放射性核種を局在化させるための好ましい方法には二、三 、四及び五段階方法が含まれる。三、四及び三段階法の実施態様は基本概念を改 良したものである。 先ず、非毒性酵素に結合した非毒性ターゲティング部分を患者に非経口投与し、 標的部位に選択的に局在化す唇。ターゲティング部分−酵素結合体の局在化され なかった循環している分子を循環系から浄化させる。必要であれば、ｉａ　ｔｉ ｒｏでは複合体形成により、ｅ！マ１マ０では結合相手例えば抗イデイオタイプ 抗体または抗原を使用して特異的なマトリックスに吸着させることによりこの浄 化を促進することができる（三段階法の第二段階）。次に、ターゲティング部分 に結合した酵素に対して特異性を持つ、放射性核種で誘導体化した酵素阻害剤ま たは基質を非経口投与する。放射性標識した酵素阻害剤または基質を、局在化し た酵素で誘導体化したターゲティング部分に結合させ、未結合の放射性標識酵素 阻害剤を迅速に浄化（ｃｌｅ烏＋ｅ＊ｅｅ　）すると、放射性核種が標的部位に 選択的に局在化する。 別の改良法には、放射性核種結合体を投与した後に別のステップとしてキレート 化剤を使用して未結合の放射性核種を排除することを含んでいる。別のステップ は、細胞上の酵素阻害剤または基質結合部位のブロッキング剤を投与し、結合体 を先に投与した酵素にのみ結合させることである。これらの手法を合わせたもの も本発明に含むものきする。 ターゲティング部分は一般にヒトの腫瘍関連抗原に反応性のある抗体である。本 発明に使用するのに特に好ましいものは、細胞外領域（例えば壊死領域）または 細胞表面にあり、細胞表面の抗原に結合したときにインターナリゼーシッンしな い腫瘍関連抗原に高い新和性で結合する二価または多価のヒトまたはキメラモノ クローナル抗体である。本発明に使用するために好ま１−い酵素部分はヒトまた はヒトに近い起源のものであり、遺伝的に保存されたものでも、遺伝的に同様な 種から得たものでもよい。本発明の重要な要件は、酵素阻害剤のブロッキングま たは非特異的結合を避けるために、免疫結合体に使用する酵素はｍ１血液中、細 胞外領域内または標的器官の細胞表面に本質的に存在（７ないかまたはほんの極 微量しか存在してはならないことである。］、っの実施ａｍでは、酵素は、細胞 外体液中に測定可能な置で存在することのないヒト起源の単鎖分子である、ヒト のジヒドロ葉酸レダクターゼである。ターゲティングシステムの第３の成分は、 抗体と結合した酵素に高い親和性で結合できる放射性核種で誘導体化した酵素阻 害剤である。本発明に使用するのに好ましいものは、体組織を介して迅速に分布 され、未結合阻害剤として排泄されて速やかに浄化されつる低分子量阻害剤であ る。本発明で使用する「酵素阻害剤」という用語は、酵素に結合し、酵素活性を 増強、低下または未変化のまま維持できる分子を包含する。さらに、阻害剤分子 は、酵素に対する親和性を損なうことなく、例えば、放射性金属と錯体を形成し たキレート化剤分子の共有結合によって、放射性核種による誘導体化に適したも のであるとよい。好適実施態様では、放射性核種で誘導体化した酵素阻害剤はヒ トのジヒドロ葉酸レダクターゼの強力な阻害剤であるメトトレキセートと　１１ １１ｎまたは９０Ｙと錯体を形成したジエチレン１−リアミンベンタ酢酸（Ｄ　 Ｔ　Ｐ　Ａ）との結合体である。キレート化剤との結合にメトトレキセートのγ −カルボキシル残基を使用すると、阻害剤のジヒドロ葉酸レダクターゼに対する 親和性は影響を受けない。 当業者は、本発明が放射性核種のターゲティングに限定されるものではないこと を認識するだろう。放射性核種以外の種々の診断薬及び治療薬を酵素阻害剤に結 合することができる。また、２つ以上の診断薬または治療薬残基を、例えば、１ つ以上の薬剤残基で修飾したオリゴマーまたはポリマー担体を介して、阻害剤に 結合させることができる。この点に関して有用なオリゴマーまたはポリマー担体 には天然及び合成の分子例えばポリペプチドまたはオリゴ糖が含まれる。当業者 はまた、本発明により別の残基を導入してメトトレキセート−薬剤結合体の薬動 力学的特性を変化させうろことも認識するだろう。例えば、親木性残基、例えば 硫酸またはスルホン酸基を結合体に共有結合させて、血清中または細胞表面上の 非標的蛋白質への非特異的結合を最小限に押え、非標的組織への細胞性の取り込 みを防ぐことができる。 本発明のもう１つの重要な要件は、システムの成分が非免疫原性であるか免疫原 性が弱くなければならないことである。ヒ　トの治療の場合、遺伝子的に保存す る二とによりまたは遺伝子的に同様の種から得ることにより、ターゲティング部 分例えば抗体及び酵素はヒト起源、ヒト用にした、またはヒトに近いものである とよい。また、マスキングした免疫原性エピトープを有する、すなわち免疫原性 の低い成分も使用できる。また、放射性核種で誘導体化した酵素阻害剤は本質的 に非免疫原性でなければならない。外来蛋白質に対するヒトの抗体の開発が多く の研究で示されてきた。マウス由来のモノクローナル抗体を単回注射した後に癌 生者でヒト抗マウス抗体が形成されたとの報告がある。マウス由来のモノクロー ナル抗体を単回注射した後に癌患者の５０％まででヒト抗マウス抗体（ＨＡ　Ｍ 　Ａ　）形成が起こり（Ｔ、１．　ＭｃＣｔｌｌｉ＋ｌ＋＋、ｓ、　Ｅ、ｔｌｓ ｌｐｓ＋ａ、　Ｒ，Ｏ，ＤｉｌｌａｓＩｌ。 Ｄ、Ｌ、５ｈｘｖｌ＋＋、ＦＡＳＥＢ　１．　２．　６９０．　１９８８）　、 そのため抗体の発生に必要な期間にこれらの薬剤の適用を制限する。 本発明に記載のターゲティングシステムは現在使用できるターゲティング手法の 重大な制約を排除する親和性システムを提供する。最も重要なことは、システム の成分が全て親和性の高い成分であることである。二価（例えばＩｇＧ抗体）ま たは多価（例えばＩｇＡまたはＩｇＭ抗体）の薬剤をターゲティング部分として 使用することにより、標的部位から結合体を完全に解離させる危険性なく、数日 間にわたり、未結合の抗体−酵素結合体を効率よく自然に浄化することができる 。親和性システムに酵素阻害剤及びそれに対応する酵素を使用するといくつかの 利点が得られる。第一に、酵素阻害剤の中には非常に高い親和性で対応の酵素に 結合することが知られているものがある。 例えば、メトトレキセートのヒトジヒドロ葉酸レダクターゼに対ｔル総結合定Ｍ 　（Ｋｏ、、　／に０．：　２．　Ｉ　Ｘ　１０”　Ｍ）　ハ抗ハブテンモノク ローナル抗体の親和性とほとんど釣り合わない。第二に、酵素・酵素阻害剤シス テムにより、多基質アナローブ阻害剤（ｍｗｌｌｉ＋ｗｂｓｌ＋ｇｌｔ　ｓｓ畠 １ｏＢｃ　１ｓｋＮ＋ｉｌｏ＋ｓ）を構築することにより親和性をさらに高める 独特な可能性が得られる（＾、　Ｄ、　Ｉｌ＋ｏｏｗ、“酵素阻害剤の論理的設 計：多基質アナローブ阻害剤（Ｒ喜１ｉｏ■ｌ　Ｄｅ＋ｉｇｅ　ｏｆ　Ｅ＊＋ｙ ｓｅ　１ｍｂｉｂｉｌｏｒ＋：Ｍ＊ｌＩｉ＋＊ｂ＋ｌ＋ｓｌｅ＾ａｇｌｏＨｅ　 Ｉａｂｉｂｉｉｏ＋ｓ、　）　”　１．　Ｍｅｄ、　Ｃｋｅｍ、　３２゜２−７ ．１Ｎ９　）。最近、ピコモルの解離定数を持つプリン生合成酵素（グリシンア ミドリボヌクレオチドトランスホルミラーゼ）の多基質アダクト阻害剤が合成さ れた（１．　Ｉｎπ１ｅｌｅ。 １、Ａ、Ｂｌ＋１ｃｂｌｙ、Ｓ、１．　Ｂｅａｋｏｙｉｅ、］、Ｍｓｄ、Ｃｂｔ ｍ、３２．　９３７−９４・、＋９！１９　）。この阻害剤は、生体分子の酵素 触媒反応の２つの基質、１０−ホルミルテトラヒドロ葉酸及びグリシンアミドリ ボヌクレオチドの誘導体を含む。゛この多基質阻害剤の結合親和性は２つの基質 のＫ　値を持つ生成物の約３倍高く、ど讃 ちらの基質の結合親和性よりも１０−１０’倍高い。多基質阻害剤の他に、自殺 または機構ベースの阻害剤（ｔｗｉｅｉｄｅ　ｏ【醋＋＋ｂｘｎｉ＋＊−ｂ＊＋ ｅｄ　１ｎｂｉｂｉｌｏ＋＋）を使用できる。これらの阻害剤は触媒過程を開始 するような仕方で標的酵素と相互作用しなければならない。反応が進むにつれて 、活性部位内で通常親電子性である潜在性の官能基のマスキングが外れる。適切 に置かれた活性部位の親核性部分をアルキル化またはアシル化すると酵素カ不Ｐ ｓ化すり、ル（Ｒ２Ｈ，５ｉｌｖｅ＋ａｓｓ、　Ｓ、］、　Ｌ）ｌｓｓａ、　Ｉ 、　Ｍｅｄ。 Ｌｓ、Ｒｔｗ、４．　４１５．　１９０）　。自殺阻害剤の利点は、阻害剤が酵 素と結合するときに、この２つの分子間で共有結合が形成されることである。そ の結果、ターゲティングした抗体−酵素結合体に結合した放射性核種誘導体化阻 害剤分子は解離できない。 従来のポリクローナル抗体は本発明の概念の範囲で担体分子として使用できる。 しかし、モノクローナル抗体では多くの利点が得られる。個々の抗体は１つの抗 原決定基に対して特異性を持つ。従って、モノクローナル抗体を使用すると、正 常組織・＼の非特異的結合、及びそれに続く正常な非標的組織への毒性の程度が 低下する。さらに、各モノクローナル抗体を非限定量製造できるため、抗体の個 々の作製はすべて調整することができ、抗体製品の寿命の間、抗原特異性は確実 に一定に保つことができる。同じ組織特異性を持つ種々のエピトープに特異的な 種々のモノクローナル抗体を組合わせることができる。従って、モノクローナル 抗体またはモノクローナル抗体の混合物を使用すると、従来のポリクローナル試 薬で得られたこのシステムの有効性への寄与を全く損なうことなく、送達システ ムの有効性や調節が改善される。 好適な方法は治療を受ける動物と同じ種を起源とするモノクローナルまたはポリ クローナル抗体を使用することである。これらの抗体が標的細胞にインターナリ ゼーションされる必要はない。多くの場合、獣医学の方面に使用する場合を除き 、構築にヒト、ヒト様またはキメラ抗体、主としてヒトの抗体を使用することが 最も望ましい。多数のヒトのモノクローナル抗体が報告されている。また、ヒト 以外の種のリンパ球から開発した人体に適応させた抗体を使用する方法やヒトの 抗体の定常領域の遺伝子に遺伝子的に結合させたヒト以外の抗体由来の可変領域 遺伝子を使用する方法が報告されている。遺伝子工学で得た同種抗体の利点は多 数ある。異種例えばマウスまたはラットの抗体とは異なり、同種抗体への免疫応 答は最小限である。その応答は最大でも、複数サイクル投与した後でのみ、ヒト 抗体のイディオタイプの決定基に対する弱い応答が起こるだけである。 本発明者のヒトモノクローナル抗体を使用した臨床研究では、２００ｍｇ１週ま での投与量で繰り返し投与した後でさえ、抗体のイデオタイブ、アロタイプまた はフレームワーク領域のどの領域でも免疫応答の誘導は検出されなかった。この 利点があるため、より迅速に代謝される抗体断片より無傷の免疫グロブリン全体 を使用することができ、無傷の免疫グロブリン全体を大量に投与することができ 、抗体を複数の投与サイクル使用できる。さらに、同種抗体は異種抗体または遺 伝子工学で得たヒト抗体でさえ認識できない微妙な抗原的な差を認識するため、 多くの利点がある。 抗体は任意の標的例えば腫瘍、組織、細菌、真菌、ウィルス、原虫、マイコプラ ズマの組織適合性または分化の抗原または受容体に対するものであってよい。抗 体は任意の種類、ＩｇＧ。 ＩｇＡ、ＩｇＥまたは１ｇＭ由来であってよく、種々の抗原決定基に反応性の抗 体を組合わせて使用することができる。 ターゲティング部分は抗体に限定する必要はなく、標的組織への親和性があれば 、本発明のターゲティング部分の基本要件を満たす任意の物質であってよい。従 って、ある種の組繊受容体に特異的に結合する薬剤、例えばホルモン、リンホカ インまたはある種の感染症治療剤が使用できる。 抗体−酵素複合体の構築 本発明のターゲティングシステムのための免疫結合体の作製には、酵素成分また は親和性成分（Ａ　Ｃ）を抗体に結合させ、６ずれの成分の活性も損なうことな く安定な複合体を形成する必要がある。本発明者の戦略には、ヘテロ三官能性架 橋結合剤５ＰＤＰ　（ｎ−サクンンイミジルー３−（２−ピリジルジチオ）プロ ピオネートを使用してＡＣに保護スルフヒドリルを導入し、次にスルフヒドリル を脱保護して、抗体上で別のスルフヒドリルとジスルフィド結合を形成すること を含んでいる。還元剤で抗体を脱安重化して遊離スルフヒドリルを生成する代わ りに、５ＰＤＰを使用して新しいスルフヒドリルも抗体に導入する。 保護した形態では、抗体の５ＰＤＰから生成されたスルフヒドリルはＡＣに取り 込まれた遊離スルフヒドリルと反応して必要なジスルフィド結合を形成する。反 応条件を最適にすることにより、各成分の５ＰＤＰ修飾の程度を調整することが でき、各成分の最大活性を維持しながら抗体にＡＣを最大限導入することができ る。５ＰＤＰは第一アミンと反応し、導入されたスルフヒドリルは２−ピリジル チオンで保護される。 ５ＰＤＰが抗体またはＡＣのどちらかの活性に影響を与えるとよい場合には、ジ スルフィド結合を形成するために使用できる他の多くの架橋結合剤、例えば２− イミノチオランまたはＮ−サクンンイミジルＳ−アセチルチオアセテ−）　（Ｓ ＡＴＡ）がある。２−イミノチオランは第一アミンと反応し、直ちにその蛋白質 に、保護されていないスルフヒドリルを導入する。 ５ＡＴＡも第一アミンと反応するが、保護スルフヒドリルを導入し、こねは次に ヒドロキシルアミンで脱アセチル化して遊離スルフヒドリルを生成する。各々の 場合、導入されたスルフヒドリルは、５ＰＤＰ同様に、他のスルフヒドリルまた は保護されたスルフヒドリルと自由に反応して、必要なジスルフィド結合を形成 する。 本発明の免疫結合体成分を架橋結合するための他の戦略で使用できる他の架橋結 合剤が入手可能である。ＴＰＣＨ（Ｓ−（２−チオピリジル）−Ｌ−ンステイン ヒドラジド及びＴＰＭＰＨ（（Ｓ−（２−チオピリジル）メルカブトプロピオノ ヒドラジド）は、緩和な過沃素酸処理で予め酸化した糖蛋白質の炭水化物部分と 反応し、架橋結合剤のヒドラジド部分と過沃素酸で生成したアルデヒドとの間で ヒドラゾン結合を形成する。架橋結合剤を抗体上に置くと、この修飾が部位特異 的であり、抗体の抗原結合部位を妨害しないので有用である。 Ｔ　Ｐ　ＣＨ及びＴ　Ｐ　Ｍ　Ｐ　Ｈは抗体に２−ピリジルチオンで保護したス ルフヒドリル基を導入し、これはＤＴＴで脱保護し、次に、例えば成分間でジス ルフィド結合を形成して、結合体に使用できる。ジスルフィド結合が安定な結合 体を作製するのに適していないことが判った場合、成分間により安定な結合を導 入する他の架橋結合剤を使用することができる。ヘテロ三官能性架橋結合剤にＭ ｎ５（Ｎ−γ−マレイミドーブチリルオキシ）サクシンイミド）及びＳＭＣＣ（ サクンンイミジル４−（Ｎ−マレイミド−メトル）ノクロヘキサン）は第一アミ ンと反応し、マレイミド基を成分に導入する。このマレイミド基は次に他の成分 −１−にある、上記架橋結合剤で導入できるスルフヒドリルと反応しい成分間に 安定な千オニーチル結合を形成することができる。成分間の立体障害がどちらか の成分の活性を妨害する場合、成分間に長いスベー升−の腕を導入し且つ上記の 架橋結合剤（すなわち、５ＰＤＰ）の一部の誘導体を含む架橋結合剤を使用する ことができる。従って、使用できる好適な架橋結合剤はたくさんあり、最適な免 疫結合体を作製する際には作用に応じてその個々の架橋結合剤を選択するとよい 。 １つの好適な実施態様では、親和性成分として組換え体のヒト酵素、ジヒドロ葉 酸レダクターゼ（ｒｈＤＨＦＲ）　、及びターゲティング成分として抗腫瘍１ｇ Ｍヒトモノクローナル抗体１６８８を選択した。両方の成分は、成分間にジスル フィド結合を形成することにより、５ＰＤＰ誘導体のスルホ−ＬＣ−８ＰＤＰで 修飾する。スルホ−ＬＣ−３ＰＤＰはアミノ反応性は５ＰＤＰと等しいが、サク シンイミジル基上にスルホ基を持ち、架橋結合剤に水溶性を与えるため、両方の 成分の活性に有害な作用を与える可能性がある有機溶媒の使用を回避できる。ス ルホ−ＬＣ−５ＰＤＰには５−炭素スペーサーが含まれ、これは成分間の立体障 害を低下させる。実施例Ｘに示すように、４つの最も好ましい実施態様では、最 初にＡＮＰＡＰ−ＮＡＤＰとの共有結合によりｒ　ｈ　Ｄ　ＨＦ　Ｒを安定化さ せる。 酵素阻害剤分子の選択 本発明に使用するのに適した酵素阻害剤を選択するために考慮すべきいくつかの 重要な点がある。阻害剤が対応の酵素に高い親和性で結合することが最も重要な 要件である。放射性核種で誘導体化した酵素阻害剤分子をターゲティングした抗 体−酵素結合体にしっかり結合させておくには、総結合定数（Ｋｏｆｆ／Ｋ　） は低ナノモルからピコモルの範囲であるとよ０゜こＩｎ のような阻害剤の一例がメトトレキセートである。メトトレヒトのジヒドロ葉酸 レダクターゼに結合し、Ｋ　値３．４×１０−’　Ｍでｓ［ｌｌ的＋：阻害す６ （ＩＲ，＾ｐ−１ｅｍｒ＋＋、　Ｎ。 Ｐ＋ｅａｄｅ＋１＋＋ｌ、　Ｔ、１．　［１ｅｌｃｔｓｐ、　１．Ｈ，Ｆ＋ｅｉ ｚｂｅｉｓ、　Ｒ，Ｌ、　８１ｋｌＢ。 ”組換えヒトジヒドロ葉酸レダクターゼのメトトレキセート複合体の形成及び異 性化の動力学Ｄｉａｅｌｉｃ＊　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆｏｎ＋ｔｌｉｏｍ■ｄ　Ｉ＋ ｏｍｓ目＋ｘｌｉｏＩｌｏｆ　Ｍｃｌｋｏｌ＋ｅｘ＊ｌｅ　ＣｏＢｌｅｘｅ＋　 ｏｌＲｅｃｏ■ｂｉｎｓａｌ　Ｈｌ＋ｕ＊　ＤｉｈＹｄ＋ｏｌｏ１８１ｅ　Ｒｅ ｄｗｃｔｓ＠ｅ、）　”　、１．　Ｂｉｏｌ。 Ｃｈｉｓ、２６３．　１０３０４−１０３１３．　１９８８）。 酵素阻害剤の親和性を高める１つの方法は多基質アダク゛ン阻害剤を構築するこ とである。原則として、このような阻害剤（よ２つ以」−の基質を同時に結合す るどんな酵素につ０ても設Ｕできる（ここで、コファクターは基質と考える）。 これに１よ、メチル−、ホルミル−及びアセチル−トランスフェラーゼ、デヒド ロゲナーゼ、ヒドロキシラーゼ、キナーゼ及び種々の他の酵素例えばジヒドロブ チロイン酸ソンターゼ、ＡＴＰ　：　Ｌ−メチンターゼが含まれるが、これに限 定されてはいない。例えば、生体分子反応を触媒する酵素の多基質アダクツ阻害 剤は両方の基質を共有結合させて合成できる。多くの研究で示されているように 、これらの基質結合体の一部は分子性（−ｏｌｅｔ１１ｉ＋１１７）が低下する というエントロピー上の利点に加え、個々の基質両方の結合安定化作用を持って いる（例えば、１．　１ａｌｌ！＋ｅ、　Ｒ，＾。 ８１＠１ｃｋ１７．　Ｓ、］、　Ｉｌ！ａｋｏｗｉｅ、　”ピコモルの解離定数 を持つプリン生合成酵素の多基質アダクツ阻害剤（八Ｍｗｌｌｉ＋＊ｂ＋ｌ＋ｇ ｌｚ＾ｄｄ＊ｃｌ　Ｉ＋ｂｉｂｉｌｏ＋　ｏｆ　ｓ　Ｐ１＋ｉａｅ　ＢｉｏＢｎ ｌｂｅｌｉｔ　Ｅｘｒｙｓｔ　ｖ自−１Ｐｉｃｏｓｏｌｓ＋　Ｄｉｔｓｏｃｉｓ ｌｉｏロ　Ｃｏ＋＋＋ｌ５ｎ１．　）　”　、　１．　１ｌｅｄ、Ｃｋｅｍ。 ３２、　９３７−９４０．　１９８９参照）。一般に、強力な多基質アダクツ阻 害剤の結合親和性はそのいずれの基質の結合親和性の１０３−１０６倍である。 阻害剤−酵素相互作用の親和性を高める別の方法は、−緒に結合した阻害剤が同 時に結合することができるのに十分近い位置に酵素結合部位を２つ以上もつ酵素 複合体に多基質アダクツ阻害剤を結合することである。 また、自殺または機構をベースとする非可逆的酵素阻害剤が使用できる。これら の阻害剤は標的酵素による触媒的変換を必要とする。阻害剤自体は化学的に反応 性ではないが、酵素変換産物は非常に反応性の高い分子である。この生成物は直 ちに活性部位部分と反応し、阻害剤が酵素に共有結合し１、従って酵素が非可逆 的に不活化される。この機構により、これらの阻害剤分子の効力は結合親和性だ けではなく標的酵素の基質として作用しうる能力によって決まる。共有結合触媒 作用により機能する酵素、特にビリドキ号ルホスフエート及びフラビン結合酵素 が好ましいが、機構をベースとする非可逆的阻害剤の唯一の標的というのではな い。このような阻害剤の例には、ビリドキサル結合したアスパルテートアミノト ランスフェラーゼ、γ−シスタチオナーゼ及びトリプトファン合成酵素の非可逆 的阻害に使用するβ、γ−不飽和アミノ酸がある。他の例には、各々非フラビン 結合モノアミン酸化酵素及びフラビン結合モノアミン酸化酵素の非可逆的阻害剤 である２−クロロアリルアミン及びメス−３−クロロアリルアミンが含まれる（ Ｒ，Ｒ，Ｒｓｎｄｏ、　’ＩＩ構をベースとする非可逆的酵素阻害剤（Ｍ＋ｃｂ ｉｅｉｓｓ−ｂｘ＋ｅｄ　１ｔｒｅマ＋ｒ＋１ｂｌｅ　ｅｎＢ＋ｕ　１ｅｂｉｂ ｉｌｏｒ＋、）　”　、Ｍｅｔｈ、Ｅｎ＋７■ｏｆ、４６．　２８−１１、１９ ７７）　。 好適な酵素阻害剤を選択するための他の重要な考慮事項には、ａ）正常組織との 最小の反応性、ｂ）低分子量、Ｃ）水溶液への溶解性、及びｄ）結合親和性を損 なうことなくエフェクター分子に阻害剤を化学的に結合できる可能性が含まれる 。本発明への使用に好ましいものは、体組織を介して迅速に分布され、腎臓から 迅速に排泄されうる水溶性の低分子量阻害剤である。 放射性核種で誘導体化した酵素阻害剤分子に対する抗体の発生を防ぐためには分 子量約５．０００ダルトン未満の阻害剤が好ましい。本発明の１つの実施態様で は、分子量５０８．５ダルトンの水溶性化合物であるメトトレキセート（Ｌ　− ４−アミノ、Ｉｎ−メチルプテロイル−グルタミン１１）をヒトのジヒドロ葉酸 レダクターゼの阻害剤として使用する。この阻害剤のグルタミン酸部分のγ−カ ルボキシル基は酵素に対する結合を損なうことなく誘導体化することができる。 低分子量阻害剤が好ましいが、分子量５，０００ダルトン以上の酵素阻害剤も本 発明に含まれる。例えば、ヒトの胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤（ＰＲＩ）は分泌 リボヌクレアーゼと細胞内リボヌクレアーゼの両方と緊密な複合体を形成する５ ０Ｋｄ蛋白質である（Ｐ、　ＢＩｘｃｋｂｉ＋ｍｅ、Ｓ、　Ｍｏｏｓｅ、　Ｔｋ ＊　ＥｉＢｓｅ　（Ｐ、　Ｄ。 ｅｏ７ｅ＋編１．　ｙｏｌ、ｌｓ、ｐｐｊ＋７−４３３．　＾ｅｉｄｅｍｉｃ　 Ｐｌｅａｔ、　ニューヨーク、　１９８２）。ＰＲＩは分子量５０，０００ダル トンの蛋白質であるため、体組織への分布が速く腎臓から迅速に除去されるとい う点に関して好ましい阻害剤の所望特性に合致しない。しかし、Ｐ　ＲＸはヒト 起源であり、４Ｘ１０−”Ｍの非常に低いに１値でＲＮｓｉｔＡを競合的に阻害 する。このＫｌ値はアビジンのビオチンに対する親和性に近いものである。さら に、ＰＲＩ＋よ、膵臓ＲＮＩｌｌと３５％の配列相同性を持つ血管誘導蛋白質で あるヒトのアンジオゲニンに、さらに低い７×１０　Ｍのに、値で結合する（Ｆ 、　Ｓ、　Ｌｅｅ、　Ｒ，５ｈｘｐｉ＋ｏ、　Ｂ。 Ｔ、Ｖｍｌｌｅｅ　“胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤にょるアンギオゲニン及びリ ボヌクし・アーゼＡの緊密な結合阻害（Ｔｉ（ｈｉｂ目ｄｉＢｉｎｈｉｂｉｔｉ 　Ｏｎ　ｏｆ　息ＢｉｏＨｎｉｃ　＋＋＋ｄ　＋ｉｂｏ＋＋５ｅｌｅ＊＋ｅ　Ａ 　ｂ７　ｐｌｘｃｅｎｌｓｌ＋１ｂｏａａｅｌｅａ＊ｅ　１ｎｈｉｂｉｌｏ＋、 ）　”　、　Ｂｉｏｅｈ＋ｍｉ＋ｔＢ　２１　２２５−２３０゜本発明の実施に 使用するエフェクター分子は薬理学的に活性な薬剤、例えば放射性核種、医薬品 、ホルモン、及び体謝拮抗剤である。意図し、た用途、例えば腫瘍細胞をイメー ジジグするまたは殺すといった用途に応じて選択する。さらに、水溶性及び活性 を消失せずに酵素阻害剤と共有結合しゃすいなどの特性も選択時に考慮する。 本発明の治療薬及び診断薬の１つの重要な種類は、腫瘍の治目６　９０ 療に有用な放射性核種例えば　Ｒｅ、Ｙまたは２１２Ｂ、、ラジオイメージング にを用な放射性核種例えば９９ｍ−ｒ　ｃまたは１１１Ｉｎ、磁気共鳴イメージ ングに有用なキ１ノート化した常磁性イオン例えばＧｄまたはＭｎ、及び放射線 に感受性のあるキレート化した金属例えばキレート化した鉄またはルテニウムを 含むキレート化した金属である。エフェクター分子には、例えば抗癌剤例えばＤ ＮＡアルキル化剤または架橋結合剤、毒素、抗微生物剤例えばポリエン抗生物質 （例えばアンプ−テリシンＢ）も含めることができる。最後に、化合物を組合せ て使用することもできる。この例示のリストは全て網羅することを意図したもの ではなく、また本発明の範囲を限定するものでもない。 他の多くのエフェクター分子も本発明の目的に好適でありうる。 治賓用放射性核種を使用したブレ・ターゲティングの利点は寿命の長い同位体が 治療状利点を持つ可能性があることである。 将来、これまでは放射性免疫療法に使用するには寿命が長すぎると考えられてき た放射性核種（例えば、Ａｃ、Ｐ）が好ましくなる可能性がある。 酵素阻害剤とエフェクター分子の結合 酵素阻害剤及び診断薬または治療薬を誘導体にしたり、共有結合させる方法が多 数あり、当業界でよく知られている。例えば、ａ核性部分例えば第一アミン、チ オールまたはヒドロキシル基を持つ酵素阻害剤は親電子性部分を含むまたはこの ような部分で誘導体化しであるエフ：フタ−分子と反応させることができる。親 電子性部分の例には、ハロゲン化アルギル、スルホン酸アルキル、活性エステル 例ズばＮ−ヒドロキシザクシンイミドエステル、アルデヒド、ケトン及び他の親 電子性部分例えばイソ千オシアバマレイミドまたはカルボン酸塩化物残基がある 。逆に、親核性部分を含むエフェクター分子を酵素阻害剤分子の親電子性部分と 反応させることもできる。従って、官能基が相補的なものであれば、酵素阻害剤 及びエフェクター分子の両方につい゛Ｃ広範囲の官能基を使用して結合すること ができる。また、ヘテロまたはホモニ官製性架橋結合試薬を使用してエフェクタ ー分子を酵素阻害剤に結合させることもできる。使用可能なまたは両方の分子に 既に導入しである反応基の性質及び阻害剤及びエフェクター分子の活性部位要件 についての情報に基づいて、好適な反応は当業者によく知られていよう。 放射性核種を酵素阻害剤に結合させるのに好ま１．いものは、種々の医薬品とし て有用な金属と緊密な金属錯体を形成できるキ！ノート試薬である。一般に、キ レート化部分は親核性部分例えば第一アミノ基または親電子性部分例えば活性エ ステルとの反応により酵素阻害剤と結合する。 ５ＰＤＰ修飾した１６．８８は、室ａで、３０分間、時々混合しながら、０．１ Ｍリン酸塩、０．１Ｍ　ＮａＣｆ　（ｐＨ７，２）　中で１５モルＪ剰のスルホ −ＬＣ−ＳＰＤＰｔ−抗体と反応させることにより調製した。一般的な反応液２ ｍＬにハ１　ｇ　Ｍ抗体（６，７ｎｍｏｌｅ）５ｒｒ＋ｇとスルホ−ＬＣ−３Ｐ ＤＰ　（１００ｒｉｍｏ／　ｅ）５３μｇを含ンテいり。ｆＦ［体化シタ後、５ ＰＤＰ修飾抗体を、０．１Ｍリン酸塩、Ｏ，ＬＭＮａＣｌ　（ｐＨ７，２）で平 衡化したセファデックスＧ−２５カラムで精製し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で 濃縮し、２ｍｇ／　ｍ　Ｌ以上の濃度で、４℃で保存した。５ＰＤＰの取り込み は、５ＰＤＰ修飾した抗体のアリコートに最終濃度１０ｍＭとなるようにジチオ スレイトール（ＤＴＴ）を加え、３４３　ｎ　ｍで２−ピリジルチオンの放出を 監視することにより測定した。２〜ビリジツチオン１モルの放出がスルフヒドリ ル１モルの取り込みに等しく、８，０８０Ｍ　’ｃｍ−’の吸光係数を使用して 定量した。ＢＣＡ蛋白質アッセイを使用して蛋白質濃度を測定し、スルフヒドリ ルの取り込みの程度を測定した。５ＰＤＰ修飾した１、６．８８の免疫反応性は 、腫瘍抗原ＣＴＡＡ−１６，８８への結合を測定し、元の１６．８８の活性と比 較して測定した（第１図）。 実施例■ ５ＰＤＰを使用したジヒドロ葉酸レダクターゼへのアミノ基を介した末端スルフ ヒドリル基を持つスペーサの取り込み５ＰＤＰ修飾した組換えヒトジヒドロ葉酸 レダクターゼ（ｒｈＤＨＦＲ）は、室温で、３０分間、時々混合しながら、０， １Ｍリン酸塩（ｐＨ７，５）中で１０モル過剰のスルホ−ＬＣ−３ＰＤＰを抗体 と反応させることにより調製した。一般的な調製１＃Ｌ２　ｍ　ＬにはｒｈＤＨ ＦＲ（２４膜ｍｏｌｅ）０．５ｍｇとスルホ−ＬＣ−３ＰＤＰ　（２４０ｎｍｏ ｊ　ｅ）１２６Ｍｇを含んでいた。誘導体化した後、５ＰＤＰ修飾ｒｈＤＨＦＲ を、０．１Ｍリン酸塩、Ｏ，ＬＭ　ＮａＣＩ（ｐＨ７，２）で平衡化したセファ デックスＧ−２５カラムで精製し、Ｃｅｎ　ｔ　ｒ　ｉ　ｃｏｎ−３０で濃縮し た。スルフヒドリルの取り込み（第２図）及び蛋白質ａ崖は抗体について記載し たと同様に測定した。ｒ　ｈ　Ｄ　）（Ｐ　Ｒはジスルフィド結合を含んでいな いため、酵素に取り込まれた５ＰＤＰは酵素に悪影響を与えることなくジチオス レイトール（ＤＴＴ）で脱保護できた。 これを実施するために、Ｓ　Ｐ　Ｄ　Ｐ−ｒ　ｈ　Ｄ　ＨＦ　Ｒを、室温で、２ ０分間、０．１Ｍリン酸塩、Ｏ，ＬＭ　ＮａＣ１，１，ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７ ，２）中最終濃度１．０　ｍ　ＭのＩ）　Ｔ　Ｔで処理し、脱気した０、１Ｍリ ン酸塩、Ｏ，ＬＭ　ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ　（ｐＨ７，２）で平衡化したセ ファデックスＧ−２５カラムで精製し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−３で濃縮した。蛋 白質濃度を２８０ｎｍの吸光度で測定した後直ちに、誘導体化したｒ　ｈ　Ｄ　 ＨＦ　Ｒを使用して最終的な免疫結合体を作製した。スルホ−ＬＣ−３ＰＤＰで 修飾した後、及びＤＴＴで還元した後のｒｈＤＨＦＲの活性は酵素活性に対する この処理の影響を測定して評価した（第３図）。 実施例■ 抗体−酵素複合体の形成 １６．８８−３ＰＤＰに誘導体化したｒｈＤＨＦＲを１〇−１５モル過剰に加え て免疫結合体を作製した。反応は窒素雰囲気Ｆ１４℃で、３−４日間、２．５ｍ Ｌの０．１ＭＩＪン酸塩、０．１Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７，２ ）中で実施した。典型的な反応では、１６．８８−８ＰＤＰを１−２ｍｇ　（１ ，３−２，６μｍｏｊ　ｅ）使用し、使用する誘導体化ｒｈＤＨＦＨの量は使用 する抗体量で決めた。４℃でインキュベートした後、混合物を１ｍＬ以下に濃縮 し、免疫結合体は０．１Ｍリン酸塩、０．１Ｍ　ＮａＣｌ　（ｐＨ７，２）で平 衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ　５５８カラムで精製した。免疫結合体をＣｅｎｔ ｒｉｐｒｅｐ−３０膜で濃縮し、４℃で保存した。免疫反応性及び蛋白質濃度は 上記のように測定した。第４図は１６．８８−ＤＨＦＨの２つの調製物の免疫活 性を示している。第５図及び第６図は、３つの別々な結合体調製物で、通常の５ ＰＤＰに比べてＬＣ−３ＰＤＰスペーサーを使用することの有利な効果を示して いる。どの場合にも、１ｇＭ上の活性ＤＨＦＨの数はＬＣ−３ＰＤＰの使用によ り改善された。 実施例■ １０　’−１０−９Ｍのジヒドロ葉酸レダクターゼ濃度はジヒドロ葉酸の還元と コファクターのニコチンアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の酸化に よって起こるＡ３４０の時間依存性の低下を追跡することにより簡単にアッセイ できる。 ７２セイは５０ｍＭトリフ、（ｐＨ７，５）及び６０４ＭＮＡＤＰＨ中、２２℃ （室温）で実施し、ジヒドロ葉酸を５０膜Ｍまで加えることにより開始する。１ 酵素量位は２２℃、１分間で、１μモルのジヒドロ葉酸を還元して１μモルのテ トラヒドロ葉酸にするのに必要な酵素量と等しく、１２．３００Ｍ’ｃｍ−’の 吸光係数を使用して定量できる。 ＭＴＸ及びその誘導体によるＤＨＦＲの阻害率はジヒドロ葉酸のテトラヒドロ葉 酸への変換の減少によって測定する。アッセイ条件は上記と同様であるが、［Ｍ ＴＸ］≦［Ｄ　ＨＦ　Ｒ］となるようにメトトレキセートまたはその誘導体を加 える。メトトレキセートの誘導体は、同じ濃度のときの阻害率をＭＴＸの阻害率 と比較することにより評価する。ＭＴＸ及びその誘導体の阻害定数（Ｋ、）は、 種々の阻害剤濃度で１／Ｖ　（Ｖ＝速度（μモル））対１／　［Ｓ］　（［Ｓ］ 　＝基質濃度、すなわちＤＨＦ）をブＯットし、Ｋｍ　（Ｋｍ　＝１／ｘ切片） を１ｐｐ　畠ｐｐ 決定し、Ｋ、を解くために式ニー１／Ｋｍ、ｐ、；−１／［Ｋ１→−（１＋　Ｈ ］　／に、）］　（［１］　＝０のときＫｍ＝Ｋｍ　）Ｉｉｐ を使用して測定できる。 ＤＰＴＡによるメトトレキセートの修飾の作用は知られておらず、等しいモル濃 度のメトトレキセートとＤＴＰＡ−ＭＴＸの活性の比較が必要であった。ＤＴＰ Ａ修飾の間に、オブテリン環は修飾されず、追加のクロモフォア−はメトトレキ セート十に置かれていなかったため、ＭＴＸの吸光係数（３０２ｎｍのＥ＝２２ ．ＬＯＯＭ−’ｃｍ−’）を使用してＤＴＰＡ−ＭＴＸの濃度を測定した。次に 、ＭＴＸ及びＤＴＰＡ−ＭＴＸにょるｒ　ｈ　Ｉ）　Ｉ（Ｆ　Ｒの阻害を上記の アッセイ条件で測定し、比較した。 第７図はｌＸｌ０　Ｍ及び５　Ｘ　１０　’Ｍの阻害剤濃度で、ジヒドロ葉酸の 還元速度の低ｔ′から判るように、ＤＴＰＡ−ＭＴＸの阻害効果はＭＴＸ阻害に 実質的に等しいことを示している。 実施例■ 恒１且艶り１創臼旦幻■１鼾び亙り目工υすＤＴＰＡ−ＭＴＸの阻害活性の分析 上記のように、容易にアッセイできる量のｒ　ｈ　Ｄ　ＨＦ　Ｒを持つ１６．８ ８−ＤＨＦＲ結合体を作製した。レダクターゼ活性は測定できたが、修飾ステッ プの間に結合された酵素のＭＴＸ結合特性が影響を受けていなかったという保証 はなかった。 １６．８８−ＤＨＦＲ中でＭＴＸ結合がジヒドロ葉酸レダクターゼ活性に比例し ていることを確認するために、結合体中のＤＨＦＲ活性を等量の元のｒ　ｈ　Ｄ 　ＨＦ　Ｒに対して滴定し、これらの活性等個物をＭＴＸ及びＤ　Ｔ　Ｐ　Ａ　 −Ｍ　Ｔ　Ｘで阻害されうる能力について比較した。第８図は、等しい活性を持 つ元のｒｈＤＨＦＲと１６．８８結合ｒ　ｈ　Ｄ　ＨＦ　ＲのＭＴＸ阻害の結果 を示しており、ＭＴＸ結合は迦離型が結合型かに無関係にレダクターゼ活性に比 例することを示している。ＤＴＰＡ−ＭＴＸを使用して同じ実験を行なったとこ ろ（第９図）、メトトレキセートについて得られたデータが確認された。これら の結果から、結合体ではレダクターゼ活性が維持されただけではなく、ＭＴＸ及 びＤＴＰＡ、−ＭＴＸが、結合されたｒ　ｈ　り　ＨＦ　Ｈに結合し、これを阻 害する能力も維持されていた。 強力な葉酸類似体を得るために多くの努力がはられれてきており、グルタミン酸 部分がＭＴＸのジヒドロ葉酸レダクターゼへの結合に寄与し、でいるが、γ−カ ルボキシルは寄与していないことがよく知られている。本発明者は、グルタミン 酸部分のγ−カルボキシル基にキＬ／−ト化剤分子を持つＭＴＸ類似体を設計［ また。 ＤＴＰＡ−Ｍ　Ｔ　Ｘの合成を第１０図に図示する。ＭＴＸ−Ａ　Ｂ−Ｇ　Ｈは 　Ｒｏ＋ｏｖ＋１７　ら、１．　Ｍｅｄ、Ｃｈｔ−、、１９８１，２４，１４５ ０−１４５５に記載の一般的な方法を使用して作製した。二無水ＤＴＰＡ　（９ ，３ｍｇ、２５μｍｏ　Ｉ）をＤＭＦに溶解し、Ｅ　ｔ　３　Ｎ　（０、１，ｍ 　Ｉ−）と−緒に５分間撹拌した。ＣＨ３ＣＮ２　ｍ　Ｌ中のＭＴＸ−ＡＢ−Ｇ Ｈ６，８ｍｇ　（１３，ｃｉｍｏ　Ｉ）をＦ記の混合物に加え、室温で一晩撹拌 した。溶媒を蒸発させ、残渣をｌＮＨＣｌとともに５０℃で１時間加熱した。反 応混合物を蒸発乾固させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｃ，８逆相シリカゲルカラム、２８ ０ｎｍでの吸光度、移動相は２％酢酸（ポンプＡ）と５０％メタノール中２％酢 酸（ポンプＢ）で形成、ｔ　＝１７．５６分（ＭＴＸのｔ、＝２５．２６分）で 精製すると生成物４．１ｍｇ　（３８％）が得られた。Ｆ＾ｅ−ＭＳ　ｓ／＋　 ＝８４４　（Ｍ＋Ｉｔ）”　；　’Ｉｔ　ＮＩＩＲＣＤ２０１δ８．４９　（＋ 、　Ｉｔり、６７．５２　（ｄ、Ｉ・８．６Ｈ＋。 ２１’１１．　６　６．７２　（ｄ、Ｉ・８．６Ｌ、　２旧、δ　４．４　（ｗ 、　１ｔ１１．　６３．０−３．９５　（ｓ。 １８１１＋、６３．７　（ｓ、２）１ｔ、δ３．１　（ｓ、３Ｈ１，δ２１９　 （＋、２Ｈ）、６１．９−”’Ｉｎｃ１．（１，５ｍＣ４）をＤ　Ｔ　Ｐ　Ａ− Ｍ　Ｔ　Ｘｏ、０６ｍＬ　（０，６ｍｇ）　、０．０６Ｍクエン酸ナトリウム（ ｐ　Ｈ５、５）　０　、　０２　ｍ　Ｌ及び０．６０Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５ ，５）０．０１ｍＬと共に室温で３０−２１５分間混合する。最終反応溶液０． ＯＯｌｍＬを使用して、プラスチックで裏打ちしたシリカゲル片上（ｐｌａｓｔ ｉｃ　ｂＲｅｋｓｄ　５ｉｌｉｃｒ　Ｈ１＋ｌ＋ｉｐ＋）で薄相クロマトグラフ ィー（酢酸アンモニウム：メタノール１：１）にかけると、９５　％以上ノ”’ 　Ｉ　ｎ　ｂ＜　”　ｌ　ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸ複合体に取り込まれていること が判った。 第１１図はシリカゲル中の　”’Ｎ　ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸの移動を示しており 、Ｒは０．５−０．７である。電離の　１１１１ｎはこの系では原点から移動し ない。 ｌｉｔ　ＩＩＩ この実施例では、　Ｉ　ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸと　Ｉｎ−ＤＴＰＡの全身からの クリアランスを比較している。　Ｉｎ−Ｄ　Ｔ　Ｐ　Ａ　ｌ！循環から速やかに 浄化され、正常組織にははとんど滞留しないことが知られている。　Ｉｎ−ＤＴ ＰＡ〜ＭＴＸが”Ｚｎ−ＤＴＰＡと同様の速度で浄化されることは、抗体−１） 　ＨＦ　Ｒにより腫瘍組織に結合していない結合体のその部分が迅速に体外に排 泄されうろことを示している。このように速やかに排泄されることにより未結合 放射性核種のほとんど全てが確実に体外で崩壊されるだろう。 ３匹の無胸腺（ｇｌｈｙｍｉｃ　）　ｎ　ｕ　／　ｎ　ｕマウスの尾の側部静脈 から、リンｌ！Ｅｌ衝通常塩水中１０％の正常マウス血清０．５ｍ　Ｌ中の５０ ｕＣｉの　”Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸを注射した。 第２群の３匹のマウスには同じ経路で５０μＣｉの　１１１．ｎ−ＤＴＰＡを注 射した。注射の３０分、１．２．３．４及び２４時間後に、Ｃａｐｉｎｔｅｃ用 量カリプレータを使用して全ての動物でＩ　ｎ−１，１１の全身での滞留を調べ た。 ｌｌ 第１２図に示す結果は、　Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸと１１ＩＩｎ−ＤＴＰＡが同 様の速度でマウスから浄化されることを示しており、このことは抗体−ＤＨＦＲ に結合していないＤＴＰＡ−ＭＴＸも同様に迅速に尿中排泄されることを示１２ ．てこの実施例では、ｉｎ　ｗｉｌ＋ｏで、培養したに５６２赤白血病細胞に結 合した抗体−ＤＨＦＲへの　”’Ｉ　ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸのターゲティングを 調べる。これを実証するために、実施例１に記載の方法を使用して、ヒトトラン スフ；、リン受容体（５Ｅ９Ｃ１，１）に対するマウス抗体にＤＨＦＲを結合し 、た。 この１０マｉｌ＋ｏの実験では培養細胞表面のエピトープと結合する抗体が必要 なため、ヒ）・の抗大腸腫瘍抗体１６゜８８ではなくこの抗体を使用した。 最初の研究では、標的細胞への抗体−ＤＨＦＨの結合を、１％牛血清アルブミン （プロテアーゼは含まない）を含むハンクス調整塩溶液からなる培地中のに５６ ２細胞１×１０６個と４℃で混合した１、５．３．０，６．０，１２．０及び２ ４．０μｇ　／　ｍ　Ｌの濃度の抗体＝Ｄ　ＨＦ　Ｒを使用して滴定して測定し た。トランスフェリン受容体と結合した抗体のインターナリゼーンヨンを防ぐた めに、反応容量は水浴中で６０分反応するのには０．２ｍＬとした。過剰の抗体 を洗い流した後で、”’Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸ　（０，５３μＣｉ）を加え、 水浴中で３０分間反応を続けた。 滴定の結果を第１３図に示す。Ｄ　）ｉ　Ｆ　Ｒが結合していない抗体を使用し て　１１’Ｉ　ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸの非特異的結合を測定すると、全ての抗体 濃度で平均して０．８５％であった。こ、１１１ の研究かり、　Ｉ　ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸは腫瘍細胞と結合した抗体−〇　ＨＦ 　Ｈに結合できることが示された。細胞に結合したＤ　ＨＦ　Ｈの量及び”Ｚ　 ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸの比活性の算定値から決定されるように、使用できるＤ　 ＨＦ　Ｒ部位全部を飽和させるのに部分な結合が得られた。この研究では、プラ トーに達しなかったため、抗体−ＤＨＦＲＱ度２４μｇ　／　ｍ　ｌでは、聯瘍 細胞上の使用可能な結合部位は飽和されなかったことが明かである。 第一二の研究では、第一の研究に関して述べたと同じ条件で、１２．５．２５． ５０，１００または２００ｎｇ、／ｍＬ（０，３１−３，７μＣｉ／ｍＬ）の濃 度の１１１．ｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸを滴定するためにバックグラウンドレベル（ ６，０μｇ／ｍｌ　）以上の顕著な結合が得られる最低製炭の抗体−ＤＨＦＲを 使用した。結果は第１４図に示す。ここでも細胞に結合した抗体−ＤＨＦＲへの ”’Ｉｎ−ＤＴＰＡ−ＭＴＸの結合が認められた。５０　ｎ　ｇ　／　ｍ　Ｌ以 上の濃度では結合はプラトーに達し、使用できるＤ　ＨＦ　Ｒ結合部位が飽和さ れたことを示し、これは第一の研究の結論と一致した。 実施例Ｘ ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｒｈＤＨＦＲ）の安定化量も好ましい実施態様では 、酵素として安定化したｒ　ｈ　Ｄ　ＨＦ　Ｒ（Ｄ＋、ＩｓｍｅＫＦ＋ｅｉ＋ｂ ｅｉｍ、Ｍｅｄｉｅｌｌ　Ｃｏ１１ｅ（ｅ　ｏｆＯｂｉｏ、Ｔｏｌｅｄｏ、　０ ｈｉｏ）を使用した。ＤＨＦＲをＮ　Ａ、　Ｄ　Ｐ　’の光親和性アナローグ（ ＡＮＰＡＰ−ＮＡＤＰ）と共有的に結合シ、次にタングステンハロゲンランプ（ ６１５Ｗ；ＤＶＹ。 ３４００’Ｋ）を使用して光活性化することにより安定化させた。 １０倍モル過剰の光親和性アナローグを酵素と混合し、】０ｍＭのトリス塩酸バ ッファ（ｐＨ７，５）を使用して蛋白質濃度１ｍｇ／ｍ７となるように容量を調 整した。この混合物を光源から１０ｃｍの所で水中に保持し、その間に時々撹拌 しながら５分間光活性化を行なった。アリコートを取り、光活性化前後のＤ　Ｈ Ｆ　Ｒ活性をアッセイした。ＮＡＤＰ＋に結合した酵素は、２０　ｍ　ＭのＮａ Ｃ１を含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７，２）を使用してゲル濾 過して精製した。両分をＤＨＦＲ活性についてアッセイしてから、蛋白質量の算 定（Ｐｉｅ「ｃｅ　ＢＣ＾試薬を使用する）及び酵素１分子当りに取り込まれた ＮＡＤＰ＋部分の測定のために保存した。 結合された酵素の安定性は３７℃で数時間インキュベートして測定した。安定率 は４℃に維持し、た試料との比較から計算した。 光活性化時間　５分間 活性化後に残存する活性の率・　１００％酵素１一分子当りの部分の数　２．２ １・１家ＪＬ快 １　値は３７℃でインキュベートした後に残存した酵素活性の３　値は２３℃で インキュベートした後に残存した酵素活性の率を示す。 安定化剤Ｎ３’　−〇−ｒ３−　（４−アジド−２−ニトロフェーーーーーーー ーーーーーー　二： ＣｈｉｎとＧ５１ｌｌｏＢの方法（Ｃｈｉｎ、Ｓ、＆　Ｇａ１ｌｌｏＢ、Ｒ，１ ，、ＩＢｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、、１９８［１，２５５，２４４５−２４５３）の変 法を使用し、その詳細を次に示す二カルボジイミダゾール（ＣＤＩ）（３２４ｍ ｇ、２ｍｍｏり及び３−（４−アジド−２−ニトロフエニ／１，７ミノ）プロピ オン酸（ＩｅＢ、Ｓ、１．　＆　Ｇ５１ｌｌｏ＋７．　Ｒ，Ｌ、Ｉ。 Ｓａｐｒｇｗｏｌｅｅ山＋　Ｓｌ＋ｗｅｌａ＋＋、　１９７５．３．４４５−４ ６８）　（１５ｍｇ。 ０．６ｍｍｏ／）のジメチルポルムアミド（ＤＭＦ）溶液を室温で１５分間撹拌 １１．た。次に、約３ｍｌのＮＡＤＰ’（６４，６ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の 水溶液をＤＭＦ溶液に加えた。窒素雰囲気Ｆで一晩撹拌を続けた。次に、溶媒を ロータリー・エバポレターで除去し、残渣を遠心してアセトンで洗った。次に、 残渣を少量の水に溶解し、分離用薄相クロマトグラフィー（Ｔａｐｅｒ（登録商 標）プレート；溶媒系・１−ブタノール／′水／　ｔ（ＯＡ　ｃ　＝　５　／　 ３　／　２　）　テｆＲＨＬ　ｆ：。物ｉ（Ｒ，＝０．４）を回収した。化合物 はＨＰＬＣ（逆相ｃ　カラム、Ｕ　Ｖ　２６０　ｎ　ｍ　）でさらに精製した。 Ｎｏ。 ｄ ″”ＯＪｆ！　夏￥違 Ｆｉｇ、　２ Ｆｉｇ、　３ ｗ’　ｏｗ−１ｙ　圓某違 Ｆｉｇ、　５ 零〇ＮＥ”／”Ａ’Ｗ！Ａ　ＨＧ　’　Ｉ　Ｏ↓’（りＯ力蛎　面￥違 ＜１−”１）１４電項　２ ４福／　！　：）　ｎ （％）Ｘ、、１．Ｗｌｄ、ＬＧ　ＴＴ’Ｔ−ｕ□４］与與（％）■ｄ↓Ｇ　Ｘ　 、Ｌ　Ｈ”　Ｉ、、、’Ｊ　”ｌ　８ｎフロントページの続き （７２）発明者　ホーキンス、グレゴリ−・エイアメリカ合衆国、ネブラス力・ ６８９０１、ヘイスティンゲス、ノース・カンサス・アベニュー・８３９ （７２）発明者　ブリードホルスト、ラインハルトドイツ連邦共和国、ハンブル グ・１３．２０００、アイヒエンストラーセ・６２（７２）発明者　キム、チョ シーホウ アメリカ合衆国、メリイランド・２０８５３、ロックビル、マイヤー・テラス・ １４６２２（７２）発明者　フォーゲル、カール−ウィルヘルムドイツ連邦共和 国、ハンブルグ・１３．２０００、ハイムフーデルストラーセ・１３

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．ｉｎ　ｖｉｖｏで官能性部分を患者にターゲティングするための方法であっ て、最初に、酵素に結合したターゲティング部分を投与し、このターゲティング 部分は標的領域の結合部位に対して親和性を持っており、次に酵素の結合相手を 投与し、この結合相手は酵素阻害剤または酵素基質であって、官能性部分と結合 してエフェクター複合体を形成し、それによってエフェクター複合体は結合相手 を介して酵素に結合し、前記官能性部分を標的領域に局在させることからなる方 法。
2. ２．酵素の結合相手が酵素基質である請求項１記載の方法。
3. ３．酵素の結合相手が酵素阻害剤である請求項１記載の方法。
4. ４．酵素が無傷の酵素、酵素断片、酵素の阻害剤結合部位を含む酵素誘導体、ま たは酵素の阻害剤結合領域を模倣した分子である請求項１記載の方法。
5. ５．ターゲティング部分を抗体、抗体断片、抗体可変領域、抗体の相補性決定領 域、二価抗体、ハイブリッド抗体及びキメラ抗体からなる群から選択する請求項 １記載の方法。
6. ６．ターゲティング部分が標的領域に対する受容体を持つ抗体以外のリガンドで ある請求項１記載の方法。
7. ７．官能性部分が薬理学的活性化合物である請求項１記載の方法。
8. ８．官能性部分が放射性核種または毒素である請求項１記載の方法。
9. ９．官能性部分が放射性金属である請求項８記載の方法。
10. １０．酵素阻害剤がメトトレキセートであり、官能性部分が放射性金属を含む請 求項３記載の方法。
11. １１．エフェクター複合体がメトトレキセート及び式：▲数式、化学式、表等が あります▼ ［式中、Ｒ１は式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の基を表わす］のジエチレントリアミンペンタ酢酸誘導体からなる請求項１記載 の方法。
12. １２．酵素が安定化したジヒドロ葉酸レダクターゼである請求項１記載の方法。