JPH0647560B2 - 放射性標識された抗体断片用のカツプリング剤 - Google Patents

放射性標識された抗体断片用のカツプリング剤

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JPH0647560B2
JPH0647560B2 JP60223860A JP22386085A JPH0647560B2 JP H0647560 B2 JPH0647560 B2 JP H0647560B2 JP 60223860 A JP60223860 A JP 60223860A JP 22386085 A JP22386085 A JP 22386085A JP H0647560 B2 JPH0647560 B2 JP H0647560B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は金属イオンで標識された抗体またはその断片の
生産に有効なカップリング剤に関する。このイオンは放
射性核種又は常磁性イオンのどちらでもよい。本発明の
カップリング剤を結合している放射性標識された抗体断
片は治療的及び生体内診断の用途で有用である。本発明
のカップリング剤を結合している常磁性の標識された抗
体またはその断片は生体内診断の用途で有用である。
画像を強調するためにNMRの緩和性に影響を及ぼすこと
ができる常磁性金属は以前から知られており、例えば、
Gd(III)、Mg(II)、Fe(III)及びCr(II)がある。
生体内診断の用途における常磁性金属イオンの効力は目
標部位にその金属を届ける能力によって決まり、その金
属にNMR撮像実験におけるその部位での水の緩和に影響
を及ぼす。
治療的及び生体内診断の用途における放射性核種金属イ
オンの使用は以前から行われてきた。例えば、インジウ
ム−111、ガリウム−67、及びテクネチウム−99のよう
なガンマ線放射放射性核種金属イオンが腫瘍の発見のた
めに診断用のシンチグラフィーで使用されてきた。レニ
ウム186、レニウム−188、レニウム−189、サマリウム
−153、イットリウム−90及び銅−67のようなベータ線
放射同位元素が腫瘍の処置において治療学的に使用する
ことができる。
生体内診断及び治療的用途における放射性核種の効能は
目標細胞の部位にこの放射性核種を届ける能力によって
決まる。目標細胞の部位に放射性核種を届けるにあたっ
てのある方法は、目標細胞を選択的に確認し、目標細胞
に含まれる特異な部位子と結合する抗体のような生物学
的に有用な分子に放射性核種金属イオンをカップリング
することを必要とする。例えば、悪性腫瘍細胞によって
産生され、又はその細胞に結合していることが知られて
いる抗原は、診断用の撮像のために又は腫瘍に放射線を
当てて腫瘍を崩壊するために放射性核種を結合した抗体
によって結合される。
ゴールデンベルグ(Goldenberg)等は公知の腫瘍に結合し
た抗原〔ゴールド(Gold)等、「実験医学ジャーナル(J.E
xp.Med.)」121、439〜462ページ(1965)〕である発癌生抗
原(CEA)に対する抗体ヨウ素−131で標識し、次いでそれ
を癌細胞を有する患者に注射する実験を開示している
「ニュー・イングリッシュ・ジャーナル・オブ・メデイ
シン(N.Engl.J.Med.)」298、1384〜1388ページ(197
8)〕。48時間後、患者をガンマシンチレーションカメラ
で走査し、腫瘍をガンマ線放射パターンによって局在化
した。同様に、英国特許出願番号第GB2,109,407号は、
生体内で腫瘍を発見及び局在化するために金属性放射性
核種で標識された。腫瘍に結合した抗原に対するモノク
ローン抗体の使用を開示している。
抗体断片が所望の目標部位に浸透でき、かつその抗体断
片が完全な抗体に関連する免疫原性及び交差反応性の問
題を少なくすることができるので、放射性標識された完
全な抗体よりもむしろ放射性標識された抗体断片の方が
生体内診断及び治療の用途のために使用されることが示
唆された〔例えば、英国特許第4,036,945号；「ランセ
ット(Lancet)」II巻、8087号、462ページ(1978)；及び
ベリトスキー(Belitsky)等の「核医学ジャーナル(J.Nuc
l.Med.)」19、429ページ(1978)参照〕。抗体断片はいろ
いろな方法で生産することができる。抗体分子は酵素的
に処理されて、二価のF(ad′)2断片、即ち、重鎖を結合
する一個以上のジスルフィド結合によって結合された二
個のFab′部分をそのままにして、重鎖のカルボキシル
末端（Fc断片）を除去される。次いで、F(ab′)2断片は
二個の重鎖を結合するジスルフィド結合で選択的に還元
され、その結果それぞれが単一の抗原結合部位を有する
二個の一価Fab′断片を生産することになる。
抗体分子はこの抗体に放射性核種イオンを結合するため
の取付け部位として使用することのできる沢山の反応性
側鎖を有している。例えば、放射性核種は、アスパラギ
ン酸もしくはグルタミン酸残基のカルボキシル基、リシ
ン残基のアミノ基又はチロシンもしくはヒスチジンの芳
香族基と反応するリンカー分子によって抗体に結合する
ことができる。具合の悪いことに、これらの残基は抗体
分子全体にばらばらに分散している。従って、これらの
反応性基への放射性核種の取付けは抗体分子のあらゆる
点で起りうる。抗体分子上の抗原結合部位又はその近く
に放射性核種を持つ基が取付けられると、抗体の抗原へ
の結合力を抑制し、診断剤又は治療剤としての抗体−放
射性核種結合体の効力を喪失又は減少する結果となる。
抗体の免疫反応性に重大な悪影響を与えない抗体への放
射性核種の取付け方法が必要である。
本発明は、常磁性又は放射性核種金属イオンと結合する
ことができ、生体内診断及び治療の用途に有用な物質を
与えることができる抗体のような生物学的に有用な分子
と結合体を形成するのに有効な二官能価のカップリング
剤を提供する。本発明の二官能価カップリング剤を抗体
のFab′断片の遊離SH基と反応させることによって生産
される抗体結合体は抗原結合活性、即ち、それらが誘導
される完全な抗体の免疫反応性を保持している。この二
官能価カップリング剤はFab′断片の遊離SH基又はpka′
≦８を有するアミンとpH６〜８で特異的に反応するマレ
イミド基及び常磁性又は放射性核種金属イオンとキレー
ト錯体を形成することができる基を含んでいる。代案と
しては、より塩基性のpHで、マレイミド基を生物学的に
有用な分子のアミノ基と反応させることができる。
本発明のカップリング剤を含む抗体結合体は次の一般式 （式中、AbはFc断片の酸素反応的除去及び重鎖を結合す
るジスルフィド結合の還元的分裂の結果得られる抗体−
結合活性を保持する抗体のFab′断片の残基であり、Ｒ
は二価有機リンカーであり、Ｒ′は常磁性イオン又は放
射性核種金属イオンをキレート化することができる基で
ある）によって示すことができる。
式Ｉの抗体結合体はキレート形成基によって常磁性イオ
ン又は放射性核種と錯体を形成し、治療用として、例え
ば、悪性腫瘍の処置に又は生体内診断用撮像剤として使
用することができる抗体−放射性核種結合体を形成す
る。
式Ｉの抗体結合体は本発明の二官能性カップリング剤を
抗体のFab′断片と反応させることによって生成され
る。使用されるFab′断片は、完全な抗体を少なくとも
一個の遊離SH基を有するFab′断片に転換する酵素反応
的及び化学的処理を行った後に抗原−結合活性を保持す
ることができる抗体から誘導される。完全な抗体は二つ
の重鎖の部位特異分裂を行う酵素でまず処理され、重鎖
のカルボキシル末端でFc部分が除去される。その結果得
られたF(ab′)2抗体断片は、附随する鎖内ジスルフィド
結合の分裂なしに、二個の重鎖を結合する鎖間ジスルフ
ィド結合を選択的に分裂させるゆるい還元条件におかれ
る。このようにして各々が重鎖から垂れ下っている少な
くとも一個の遊離SH基を有する二個のFab′断片が生産
される。SH基は抗体結合体を生成するためにFab′断片
をカップリング剤に結合する反応性部位として作用す
る。この部位は抗原結合部位から離れて置かれているの
で、結合されたカップリング剤は抗原結合を邪魔しな
い。
上記したように、遊離基を有するFab′断片は完全な抗
体のFc部分の酵素反応的除去、次いで得られたF(ab′)2
二量体の還元によって生産される。二個の重鎖間の鎖間
ジスルフィド結合を選択的に還元する比較的ゆるい化学
条件化で還元を行うことによって軽−重鎖の附随する分
裂を防止することが望ましい。使用される抗体は、Fc部
の除去が一個のジスルフィド結合によって結合されたF
(ab′)2二量体の二個の単量体部分を残すように置かれ
ている酵素反応的分裂部位を有しているのが好ましい。
一個のジスルフィド結合は、軽−重鎖結合を分断しない
ゆるやかな還元条件下で優先的に分裂させることができ
る。例えば、ペプシン又はパパインによって酵素反応的
に分裂され、二個の単量体部分が多くのジスルフィド結
合によって結合されているF(ab′)2を産生する抗体は、
重鎖間の多くの結合を分裂させるために必要である比較
的過酷な化学条件が軽−重鎖結合もまた分裂させるよう
なので、本発明に使用するには一般に好ましくない。
チオール活性化剤の存在下にパパインで酵素反応的に分
裂される抗体は、得られた抗体断片がカップリングに必
要である遊離SH基を欠いているので、本発明に有用でな
いFab断片を産生する。
本発明の実施に有効な抗体は、発癌性抗体、アルファー
フェート蛋白質、ヒト絨毛ゴナドトロピン又はそのペー
タサブユニット、結腸特異抗原−Ｐ、腫瘍特異糖蛋白質
等のような生体内腫瘍標識として有効であると知られて
いるいかなる抗原に対する抗体も含む。
サブクラスIgG1は本発明の実施に使用するのに好まし
い。抗体のこのサブクラスは、ハイブリドーマ細胞によ
って産生されたモノクローン抗体の優位サブクラスであ
る。モノクローン抗体を産生するハイブリドーマ細胞
は、骨髄腫細胞と抗体を産生するリンパ球とを融合する
ことによって産生される〔ジー・コラー（G.Kohler）及
びシー・ミルステイン（C.Millstein「ネーチャー(Natu
re)」ロンドン、256、495〜497ページ(1975)〕。本発明
の実施にあたって使用されるFab′断片を生産するのに
使用するための抗体の一例としては、腫瘍関連抗原(CE
A)に対するIgG1型モノクローン抗体がある。このマウス
モノクローン抗−CEA抗体（サブクラスIgG1）は、重鎖
を結合する一個のジスルフィド結合を有するF(ab′)2を
生産するためにパラーム(Parham)等「免疫法ジャーナル
(J.Immunol.Methods)」53、133〜173ページ、(1982)」
の方法を用いて、予め活性化したチオールを有しないパ
パインで分裂させることができる。次いで、この断片
は、各々が一個の垂れ下がったSH基を有する二個のFa
b′を生産するために重鎖を結合する鎖間ジスルフィド
結合を選択的に分裂する温和な還元条件化で２−メルカ
プトエタノール又はシステインのような還元剤を使用し
て、還元される。還元は、中性又はその付近のpHに調節
された溶液中で培養することによって行なわれるのが便
利である。培養の温度は重要ではないが、室温が適当で
ある。培養は一般に約１〜２時間行なわれる。システイ
ンは、重鎖を結合する鎖間ジスルフィド結合の選択的な
分裂を行うのに好ましい還元剤である。還元反応におけ
るシステインの濃度は約2.5から約40mM、好ましくは５
から20mMであり得る。これより低いシステインの濃度で
も、F(ab′)2の実質的量は減少しないが、これより高い
濃度では重鎖と軽鎖を結合するジスルフィド結合の望ま
しからざる分裂を生じる。
式Ｉの抗体結合体はFab′を次式 によって示される本発明のカップリング剤と反応させる
ことによって生産される。
式IIにおいて、Ｒはマレイミド基をＲ′基に結合するた
めに作用する二価有機ラジカルである。抗体分子の側鎖
と非反応性であるいかなる二価の有機ラジカルも使用す
ることができる。Ｒは-(CH2)n-（ｎは１〜20の整数）又
はフェニレンであるのが好ましい。実例としては、Ｒは
ｎが５又は７の-(CH2)n-である。
Ｒ′は常磁性又は放射性核種金属イオンをキレート化す
ることができる基である。適切なキレート化基を選択す
るには、多くの基準が考慮される。キレート化基は常磁
性イオン又は放射性核種の循環しているトランスフェリ
ンとの交換を最小にする非常に高い安定係数を有してい
るべきである。キレート錯体は生理学的条件下で熱力学
的に安定であるべきである。これは、宿主に無害である
キレート化剤から誘導されるべきである。さらに、分子
が生物担体の分解に際して細胞外に分割し、その後尿中
に排出されるように、キレート化基は弱酸性であるべき
である。
下記のものがFab′断片に放射性核種を取り付けるため
に使用できるカップリング剤の例である。
式IIａの化合物及びその類縁化合物は次の反応式に従っ
て製造できる。
式IIａの化合物及びその類縁化合物は次の反応系に従っ
て製造できる。
式IIのカップリング剤は抗体Fab′と反応させられて式
Ｉの抗体結合体を生成する。反応は次のように示すこと
ができる。
（式中、Ab-SHは抗体Fab′断片を示し、Ｒ及びＲ′は前
に定義した意味を有する。）。
反応は20mMリン酸塩（pH７．０）のような適当な緩衝液
中で行われる。反応温度はあまり問題ではないが、ほぼ
室温が好ましい。室温において、反応は約１時間で完了
する。生成物はDEAEカラムでのクロマトグラフィーのよ
うな通常のクロマトグラフィー手段によって単離でき
る。
式Ｉの抗体結合体はキレート化条件下に常磁性又は放射
性各種金属イオンと錯体化される。治療又は生体内診断
技術に有用であり、かつ抗体断片に結合することを望む
常磁性又は放射性核種金属イオンはどれでも使用するこ
とができる。単に例示的ではあるが、ガドリニウム（II
I）、鉄（III）、マンガン（II）及びクロム（II）のよ
うな常磁性イオン並びにインジウム−111、ガリウム−6
7及びテクネツウム−99ｍのような診断用シンチグラフ
ィーに有用なガンマ線放射性核種及びイットリウム−9
0、銅−67、レニウム−186、レニウム−188、レニウム
−189及びサマリウム−153のような治療用の用途に有用
なベータ線放射核種のような放射性核種金属イオンを挙
げることができる。放射性核種の他の有用な種類として
は、アルファ線放射、陽電子放射及びオージェ電子放射
の各放射性核種がある。上記錯体は式Ｉの結合体を結合
体が生理学的に安定である緩衝液中で上記の放射性核種
と反応させることによって形成することができる。必要
ならば、上記の常磁性イオン又は放射性核種は中間のキ
レート化剤、即ち抗体結合体の生理的pHで上記金属イオ
ン又は放射性核種を安定にするが、式Ｉの抗体結合体と
で形成されるキレート錯体より熱力学的に不安定である
キレート錯体を形成するキレート化剤、との錯体として
溶液に加えることができる。例えば、インジウム−111
は生理的pHにおいて抗体溶液中で塩素塩として不溶性で
ある。生理的pHはインジウム−111を可溶性にするが、
抗体結合体との安定なキレート錯体を形成するようにイ
ンジウム−111を容易に転移する4,5−ジヒドロキシ−1,
3−ベンゼン−ジスルホン酸〔チロン(Tiron)〕との中間
錯体の形態でキレート反応にインジウム−111を供給す
るのが好ましい。式Ｉの抗体結合体に常磁性イオン又は
放射性核種をカップリングすると、次式の抗体−放射性
核種結合体 （式中、Ab及びＲは前に記載した通りであり、Ｒ′は常
磁性又は放射性核種金属イオンと上記した基Ｒ′とのキ
レート錯体を表わす）を生成する。
式IIIの抗体−金属イオン結合体は治療又は診断用の用
途のために生理学的に許容しうる緩衝液中で形成するこ
とができる。本発明の一実施態様において、CEA（サブ
クラスIgG1）に対するマウスモノクローン抗体が、Ｒが
-(CH2)7-であり、かつＲ′が基-N〔CH2CH2N(CH2CO
2H)2〕２である式IIのカップリング剤に結合される。CE
A抗体結合体はインジウム−111のようなガンマ線放射放
射性核種とキレート化されて、当業界で知られている光
走査法を用いる生体内腫瘍撮像剤として使用される。CE
A抗体−放射性核種結合体は静脈内に投与され、引続き
検体が生体内でこの放射性核種結合体の取込み部位を調
べるために光走査される。
下記の実施例は本発明の実施をさらに説明するためのも
のであり、本発明の範囲をどのようにも限定するもので
はない。実施例において、次の用語及び略語は下記に示
す意味を有する。
カップリング剤…〔（（７−マレイミドヘプチル）イミ
ノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸 Mab …モノクローン抗体 SDS …ドデシル硫酸ナトリウム EDTA …エチレンジアミン四酢酸3 H-NEM …Ｎ−〔エチル−２−3H〕−マレイミド MES …２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸 チロン(Tiron) …4,5−ジヒドロキシ−1,3−ベンゼン
−ジスルホン酸 IgGSORB …黄色ブドウ球菌、菌株。ホルマリンで固定
し、熱で死菌させたコーワン(Cowan)Ｉ 抗原のヨウ素化 CEAをアイオードゲン(Iodogen)法によって放射性標識化
した。50μｇの抗原を２μｇのアイオードゲンで被覆し
たマイクロフュージ(microfuge)管に加えた。１mCiのNa
125を添加し、４℃で15分間培養した。培養時間の後、1
0mg/mlの濃度のヒスチジン20μｌを加えて遊離ヨウ素と
反応させた。ヨードヒスチジンをセファデックスG-25M
カラム〔ファーマシア社(Phamacia)製、ピスケータウエ
ー、ニュージャージー州〕でのゲル濾過によって除去し
た。
ヒト結腸腺癌細胞抽出物の調製 細胞抽出物を結腸腺癌から調製した。組織を10mMのトリ
ス−HCl(pH7.2)及び0.2mMのCaCl2中で３分間４℃で微
細、均質化し、次いで1,000ｇ（重力加速度）で10分間
遠心分離した。ペレットをリン酸塩調節された食塩水中
に再懸濁し、15秒間隔で１分間４℃で超音波処理した。
処理物を10,000ｇで15分間遠心分離し、上澄み物を固相
放射線免疫検定法（実施例Ｖ）に使用した。
実施例Ｉ 〔（（７−マレイミドヘプチル）イミノ）ビス（エチレ
ンニトリロ）〕四酢酸の製造 (a)（６−シアノヘキシル）ビス（２−フタルイミドエ
チル）アミンの製造。DMF(120ml)中に６−ブロモヘキシ
ルシアニド(13.88ｇ、0.073モル）、ビス（２−フタル
イミドエチル）アミン(26.52ｇ、0.073モル）及びトリ
エチルアミン(7.37ｇ、0.073モル）を含む混合物を100
℃で20時間加熱した。冷却後、形成した沈澱物を濾過に
よって除去し、濾液を氷水(1000ml)の中に入れた。その
水溶液をジクロロメタン200mlずつで３回抽出した。一
緒にした有機相抽出液をブラインで洗浄し、Na2SO4上で
乾燥した。減圧下で溶媒を除去し、シリカゲル（ヘキサ
ン−30％酢酸エチル／ヘキサン勾配溶離）クロマトグラ
フィーによって粗製物を得た。不純物画分を再度クロマ
トグラフィーにかけ、油状物として合計１４．１ｇ(41
％）の（６−シアノヘキシル）ビス（２−フタルイミド
エチル）アミンを得た。IRスペクトルは上記の構造に一
致した。
(b)（６−シアノヘキシル）ビス（２−アミノエチル）
アミンの製造。
（６−シアノヘキシル）ビス（２−フタルイミドエチ
ル）アミン(13.8ｇ、0.029モル）及びヒドラジン(2.15
ｇ、0.067モル）のメタノール(150ml)溶液を1.5時間還
流し、一晩放置した。溶媒を減圧下で除去し、それから
残留物を水中に入れ、HClでpH２にした。沈澱物を濾過
によって除去し、濾液を固体NaOHで塩基性にした。次い
で、この溶液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン50mlず
つで４回抽出した。一緒にした有機相抽出液をNa2SO4上
で乾燥し、減圧下に蒸発した。残留物をキューゲラー(K
ugelrohr)蒸留することによって、0.07mmHgにおいて120
〜140℃（油浴温度）の範囲で集めたウォーターホワイ
トの液体として精製された（６−シアノヘキシル）ビス
（２−アミノエチル）アミン（４．１ｇ、67％）を得
た。IRスペクトルは上記の構造と一致し、同様に元素分
析も一致した。
(c)〔（（６−シアノヘキシル）イミノ）ビス（エチレ
ンニトリロ）〕四酢酸の製造。クロロ酢酸（７．０ｇ、
0.074モル）水(20ml)溶液を水酸化ナトリウム(5.92ｇ、
0.148モル）水(30ml)溶液の必要量を添加することによ
って中和した。（６−シアノヘキシル）ビス（２−アミ
ノエチル）アミン（3.72ｇ、0.0175モル）を添加し、こ
の溶液を45℃で７時間加熱した。その加熱期間中、溶液
のpHを残りのNaOH溶液を添加することによって10〜11に
維持した。室温で二日間撹拌した後、溶液を濃HClでpH
７にし、それから溶媒を減圧下で除去した。残留物をホ
ットメタノール(300ml)中に取出し、濾過した。減圧下
でメタノールを除去して、粗製〔（（６−シアノヘキシ
ル）イミノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸を得
た。この物質を蟻酸塩型のBio Rad AG７×８イオン交換
樹脂（勾配溶離、０〜１モル蟻間）の２〜30cmカラムで
バッチ式に２ｇずつクロマトグラフィーにかけ、合計
４．３ｇ（55％）の表記四酢酸を得た。精製物は薄層ク
ロマトグラフィー(TLC)（エタノール、７％NH3水溶液、
４：１、シリカプレート）で１スポットであった。炭素
NMRスペクトルは上記の構造に一致した。
(d)〔（（７−アミノヘプチル）イミノ）ビス（エチレ
ンニトリロ）〕四酢酸の製造。〔（（６−シアノヘキシ
ル）イミノ）ビス（エチレンニトリロ）四酢酸（0.85
ｂ、0.0019モル）の酢酸（50ml）溶液を酸化白金（0.15
ｇ）で処理し、一晩45psiで水素化した。触媒をセライ
トで濾過することによって除去し、フィルターのセライ
ト受けを水で洗浄した。溶媒を減圧下で除去して粗製物
を得た。この粗製物を蟻酸塩型のBio Rad AG１×８イオ
ン交換樹脂によるクロマトグラフィーにかけた。水で溶
離して、精製された〔（（７−アミノヘプチル）イミ
ノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸(0.70ｇ、82
％）を得た。精製物はTLCで１スポットであった。プロ
トン及び炭素NMRは上記の構造に一致した。
(e)〔（（７−マレイミドヘプチル）イミノ）ビス（エ
チレンニトリロ）〕四酢酸の製造。重炭酸ナトリウム飽
和水溶液(15ml)中に〔（（７−アミノヘプチル）イミ
ノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸(0.72ｇ、1.6ミ
リモル）を含む溶液を氷浴中で冷却し、Helv.Chim.Act
a 、58、531ページ(1975)に従って製造したＮ−カルボキシ
メトキシマレイミド(0.25ｇ、1.6ミリモル）を一度に加
えた。20分間撹拌した後、氷浴を取外し、撹拌を30分間
続行した。溶液を１Ｎ HClでpH６にし、それから減圧
下で濃縮した。残留物を蟻酸塩型のBio-Rad AG１×８イ
オン交換樹脂（勾配溶離、０〜１モル蟻酸）の２×30cm
カラムでクロマトグラフィーにかけ、わずかに不純物が
ある生成物0.61ｇを得た。この物質を上記のように再度
クロマトグラフィーにかけて、精製された〔（（７−マ
レイミドヘプチル）イミノ）ビス（エチレンニトリ
ロ）〕四酢酸(0.42ｇ、50％）を得た。
この精製物はTLC（エタノール、７％NH3水溶液、４：
１、シリカゲルプレート）で１スポットを示した。
このマレイミドは試薬Ａ、次いで試薬Ｂをスプレーする
ことによって明るい黄色の背景に白いスポットとしてTL
Cで検知できる。
試薬Ａ…エタノール／トリス−HCl緩衝液（pH8.2）１：
１中の0.1％、5,5−ジチオ−ビス−２−ニトロ安息香酸 試薬Ｂ…80％エタノール水溶液中の２％２−メルカプト
エタンスルホン酸ナトリウム 実施例II 抗−CEA Fab′と〔（（７−マレイミドヘプチル）イミ
ノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸との結合体の調
製 (a)抗−CEAモノクローン抗体（サブクラスIgG1からF(a
b′)2の調製。マウス抗−CEAモノクローン抗体（サブク
ラスIgG1）を(NH4)2SO4沈降及びイオン交換クロマトグ
ラフィーによって腹水から精製した。F(ab′)2を得るた
めに完全な抗体IgG1の酵素反応による分断を、パラーム
(Parham)等の「免疫法ジャーナル(J.Immunol.Method
s)、53、133〜173ページ(1982)に従ってチオールのない
予め活性化されたパパインを使用することによって達成
した。精製されたF(ab′)2断片をワットマン(Whatman)D
E-52及びセファデックスG-100樹脂上で連続カラムクロ
マトグラフィーによって得た。変性ゲル電気泳動(SDS-P
AGE)は単離された蛋白質が95％以上の純度であることを
示した。
(b)F(ab′)2断片中の鎖間ジスルフィド結合の数の測
定。IgG1抗−CEAモノクローン抗体のパパイン分裂によ
って産生したF(ab′)2が二個の重鎖を結合する一個の鎖
間ジスルフィド結合を有することを調べた。この測定
を、二個の重鎖を結合する鎖間ジスルフィド結合並びに
重鎖と軽鎖とを結合するジスルフィド結合を分断する
が、鎖内ジスルフィド結合を完全にそのままにするため
に、ゆるやかな還元条件下にジチオトレイトールでF(a
b′)2抗体断片を還元することによって行なった。次い
で、還元された断片を遊離SH基において反応する3H-NEM
で反応させ、それからSDS−ポリアクリルアミドゲルに
通した。その結果、各々が三重水素で標識された遊離SH
基を有する重鎖と軽鎖に対応するバンドを得た。ゲルを
蛋白質で染色し、蛍光団に浸漬し、乾燥し、それからＸ
線フィルムに当てて、重鎖と軽鎖の結合の相対的強度を
測定した。蛍光浸漬されたバンドを切り取り、シンチレ
ーションカウンター中に入れた。一個のSH基の尺度とし
て軽鎖バンドに関して１分間当たりの係数値を用いて、
重鎖が二個のSH基を含み、その内の一個が軽鎖との鎖間
ジスルフィド結合に相当することがわかった。従って、
一方のSH基は、完全なCEA抗体のパパイン分裂によって
産生したF(ab′)2断片の重鎖間の一個の鎖内ジスルフィ
ド結合に相当する。
(c)抗−CEA Fab′断片の調製。二個の重鎖を結合する一
個の鎖間ジスルフィド結合を有する抗−CEA F(ab′)2断
片を蛋白質濃度１〜10mg/mlでN2雰囲気下にシステイン
で還元した。85％以上のF(ab′)2がFab′に還元され、
かつ15％未満が別個の軽鎖及び重鎖に還元されるように
還元剤の最適濃度及び培養時間を決定した。最適反応条
件は次の通りに決定した。
完全な抗体のパパイン分裂によって産生したモノクロー
ン抗−CEA（サブクラスIgG1）のF(ab′)2断片を、０、
2.5、５、10、15、20、25、30、35及び40mMの最終濃度
のシステインを用いて、約7.4のpHの緩衝液中室温で２
時間還元した。得られた還元断片をNEMで反応させた。
このNEMは遊離SH基をアルキル化する、いわば本発明の
カップリング剤〔（（７−マレイミドヘプチル）イミ
ノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸に類縁のもので
ある。種々の濃度のシステインで産生した還元断片を対
照としての完全抗体及びF(ab′)2とともにSDS−ポリア
クリルアミドゲルの別々のレーンに通し、それからゲル
を蛋白質で染色した。染色されたゲルを観測すると、シ
ステインの濃度が増加するにしたがい、F(ab′)2のバン
ドが徐々に見えなくなり、Fab′断片に分子量で相当す
るバンドが見えるのがわかった。システイン濃度を連続
して増加した結果Fab′のバンドが見えなくなり、それ
に附随して別個の重鎖及び軽鎖に相当する二個のより低
い分子量のバンドが見えた。最も望ましいシステインの
濃度、即ちF(ab′)2のバンドが見えなくなるが、別々の
重鎖及び軽鎖のバンドがまだ見えない濃度は10mMである
のがわかった。
同様の実験の結果、下記のN2噴出緩衝液中で、（F(a
b′)2をFab′に最適に還元するために）代表的なシステ
インの濃度は５mMから15mMであり、培養時間は２時間か
ら４時間であった。
25mM NaPO4、２mM Na2 EDTA、0.02％ w/v NaN3pH7.4；
57.4mM Na2HPO4、17.6mM KH2PO4、5mM Na2EDTA、0.02％
w/v NaN3、pH7.2(RIA緩衝液）；又は25mMトリス、２mM N
a2EDTA、0.02％w/v NaN3、pH8.0。
(d)結合反応。上記の方法によって生産された還元抗−C
EA Fab′蛋白質の過剰チオール試薬を、PM10隔膜を用い
る透析濾過を使用してN2雰囲気下に50mM MES、2mM Na2ED
TA、pH6.5〜6.8に完全に緩衝液を交換することによって
除去した。得られた溶液の一分画を公知の比活性の3H-N
EMで滴定して、還元法によって生産された一Fab′当た
りの遊離SH基の数を測定した。残りの溶液を実施例Ｉの
カップリング剤、即ち、〔（（７−マレイミドヘプチ
ル）イミノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸10〜25
mMと室温で２〜４時間、次いで４℃で一晩反応させた。
実施例III インジウム−111と抗CEA Fab′結合体とのキレート錯体
の調製 抗体−放射性核種結合体を５μｌの10mlチロン、４mM H
Cl、pH2.4に50mM HCl中の10μｌInCl3（約50〜100μC
i）〔ラッド−パーム社(Rad-Pharm)製〕を添加し、室温
で５分間培養することによって調製した。次いで、10μ
ｌの200mM MES、pH6.0及び２〜15mg/mlの抗−CEA Fab′
と実施例IIの方法によって製造したカップリング剤との
結合体10μｌを添加した。反応混合物を室温で１時間培
養した後、その２〜５μｌを電気泳動分析のために酢酸
セルロース片上にスポットさせた。電気泳動を電極緩衝
液として50mMのHEPES、pH7.0を使用して行なった。電気
泳動電場において、Inキレート化抗−CEA Fab′結合
体は元のままであり、未反応のインジウム−111は別の
ピークとして移動した。別の電気泳動において、電気泳
動の前に、７μｌのキレート結合体反応混合物をまず２
μｌの200mM Na2EDTA、pH6.0で培養した。このEDTAの添
加は未反応のインジウム−111のピークに移動を生じる
が、キレート−結合体のピークには影響を与えない。こ
のことはこのキレート化抗体結合体がIn−チロンキレ
ートより安定であることを示す。
この抗−CEA Fab′／インジウム結合体は、腫瘍の撮像
剤として、例えば、公知の光走査技術を使用して結腸の
腫瘍の撮像に使用するために生理学的に許容しうる緩衝
液の形態で静脈内に投与することができる。
実施例IV 抗−CEA Fab′と〔（（７−マレイミドヘプチル）イミ
ノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢酸との結合体の免
疫親和力 実施例IIの方法によって製造したモノクローン抗−CEA
Fab′／カップリング剤結合体の免疫親和力をCEA抗原に
よる放射性免疫検定法によって測定した。ラット抗−マ
ウスカッパーで被覆したIgGSORB（黄色ブドウ球菌、エ
ンザイム・センター、ボストン、マサチューセッツ州）
（300μｇラット抗−マウスカッパー／１ml黄色ブドウ
球菌）を使用して、標識した抗原を遊離抗原から分離し
た。一連の希釈抗−CEA Fab′／カップリング剤結合体
（蛋白質濃度3.7×10-8M）を一定量の125I−標識された
CEA抗体(218ng)及び種々の量の非標識CEA抗体を用いて
室温で一晩培養した。培養に引き続き、20μｌの被覆Ig
GSORBを各くぼみに添加し、その内容物を３時間培養し
た。このIgGSORBを遠心分離とRIA−緩衝液中への再懸濁
に反復することによって三回洗浄した。最終のペレット
をガンマカウンターに入れ、ガンマ線を測定した。対照
として、完全なモノクローン抗−CEA IgG及びF(ab′)2
断片を使用して同様な方法で放射性免疫検定法を行なっ
た。
結合曲線（１分間当たりの係数−抗体希釈量）をそれぞ
れの抗体及び断片に対して並びに非標識抗原の各濃度に
対して作成した。それぞれの場合において、非標識CEA
を追加すると結合活性を減少した。モノクローン抗−CE
A IgGに対する最大結合力は30,000cpmであり、抗−CEA
F(ab′)2に対する最大結合力は25,000cpmであり、モノ
クローン抗−CEA Fab′／カップリング剤結合体に対す
る最大結合力は19,000cpmであった。二重逆数結合プロ
ット（１／結合対１／遊離）を種々の抗体希釈量におい
て抗体及び断片に対して作成した。傾斜及び切片から結
合親和力をそれぞれの抗体及び断片並びにそれぞれの希
釈量に対して測定した。その結果を表１に示す。これは
モノクローン抗−CEA Fab′／カップリング剤結合体の
平均結合親和力がモノクローン抗−CEA IgG及び抗−CEA
F(ab′)2の親和力とほぼ同じであったことを示す。
実施例Ｖ 固相放射性免疫検定法における結合プロフィル 50μｌのヒト結腸腺癌細胞抽出物をそれぞれのポリビニ
ル板のくぼみに添加し、オービタル撹拌で乾燥させた。
次いで、リン酸塩緩衝食塩中の200μｌの１％ウシ血清
アルブミン(BSA)を添加し、室温で１時間培養した。培
養時間の経過後、150μｌの抗体（モノクローン抗−CEA
IgG、F(ab′)2断片又は抗−CEA Fab′／カップリング剤
結合体）を種々の希釈量で添加し、室温でさらに１時間
培養した。各くぼみを３回洗浄し、放射性ヨウ素化した
ラット抗−マウスカッパーを添加し、１時間培養した。
各くぼみをリン酸塩緩衝液で５回洗浄し、次いでガンマ
線を測定した。
結合曲線（１分間当たりの計数、抗体希釈量）をそれぞ
れの抗体又は断片に対して作成した。二重曲線を図に示
す。この図から、モノクローン抗−CEA Fab′／カップ
リング剤結合体がモノクローン抗−CEA IgG及び抗−CEA
F(ab′)2のものと本質的に同等の結合曲線を示してい
るのがわかる。
実施例VI In-111／抗−CEA Fab′結合体及びＩ−125非特異的Fa
b′断片の生体内分布 雌の異系交配Hsb無胸腺ヌードマウス(nu/nu)をハーリン
・スプラギュー・ダウレイ社(Harlin Sprague Dawley、I
nc.、インディアナポリス、インディアナ州）から入手
し、ヒト腫瘍細胞を生産する107のLS 174 CEAを皮下に
接種した。３週間後、腫瘍が約６グラムになった時、二
匹の動物それぞれに実施例IIIにおいて説明したように
調製した抗−CEAモノクローン抗体のキレート標識され
たFab′断片及び非特異的抗体に対応するアイソタイプ
Ｉ−125標識されたFab′断片のどちらかを注射した。動
物の各グループは１mlリン酸塩緩衝食塩水につき12.5μ
Ciを受け入れた。24時間後、それぞれの動物を犠牲に
し、器官及び血液をガンマシンチグラフィーによって測
定した。表IIはIn-111標識された特異的抗体断片及びＩ
−125標識された非特異的抗体断片の生体内分布を示
す。表IIからわかるように、特異的標識抗体断片は非特
異的抗体より5.2倍腫瘍部に局在化した（局在化係
数）。腎臓及び肝臓におけるIn-111の高い服量は、肝臓
及び腎臓の取込み並びにクリアランスの速度論（データ
は示していない）から明らかなように、差のある取込み
というよりもむしろこれらの器官からのＩ−125のIn-11
1より急速なクリアランスに原因がある。
【図面の簡単な説明】
図は本発明の抗−CEA Fab′／カップリング剤結合体の
ヒト結腸腺癌細胞抽出物への結合を完全モノクローン抗
−CEA IgG及びF(ab′)2断片の結合と比較する一連の結
合曲線を示す図である。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次式 （式中、Ｒは−(CH2)n−（ｎは１〜２０の整数）及びフ
    ェニレンから選択され、そしてＲ′は −N[CH2CH2N(CH2CO2H)2]2及び−CH[N(CH2CO2H)2]CH2N(C
    H2CO2H)2から選択される）の化合物から成ることを特徴
    とする常磁性又は放射性核種金属イオンと抗体またはそ
    の断片とを結合するためのカップリング剤。
  2. 【請求項２】Ｒが−C7H14−又は−C5H10−である特許請
    求の範囲第１項記載のカップリング剤。
  3. 【請求項３】次式 の化合物から成ることを特徴とする常磁性又は放射性核
    種金属イオンと抗体Fab′断片とを結合するためのカッ
    プリング剤。
  4. 【請求項４】次式 の化合物から成ることを特徴とする常磁性又は放射性核
    種金属イオンと抗体Fab′断片とを結合するためのカッ
    プリング剤。
JP60223860A 1984-10-10 1985-10-09 放射性標識された抗体断片用のカツプリング剤 Expired - Lifetime JPH0647560B2 (ja)

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