JPS6193131A - 放射性標識された抗体断片用のカツプリング剤 - Google Patents

放射性標識された抗体断片用のカツプリング剤

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JPS6193131A
JPS6193131A JP60223860A JP22386085A JPS6193131A JP S6193131 A JPS6193131 A JP S6193131A JP 60223860 A JP60223860 A JP 60223860A JP 22386085 A JP22386085 A JP 22386085A JP S6193131 A JPS6193131 A JP S6193131A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は金属イオンで標識された生物学的に有用な分子
の生産に有効なカップリング剤に関する。
このイオンは放射性核種又は常磁性イオンのどちらでも
よい。本発明のカップリング剤を結合している放射性標
識された抗体断片は治療的及び生体内診断の用途で有用
である。本発明のカップリング剤を結合している常磁性
の標識された生物学的に有用な分子は生体内診断の用途
で有用である。
画像を強調するためにＮＭＲの緩和性に影響を及ぼすこ
とができる常磁性金属は以前から知られており、例えば
、Ｇｄ　（Ｉ［ｌ）　、Ｍｇ　（ＩＩ）　、Ｆｅ　（Ｉ
Ｉ）及びＣｒ（ＩＩ）がある。
生体内診断の用途における常磁性金属イオンの効力は目
標部位にその金属を届ける能力によって決まり、その金
属にＮＭＲ撮像実験におけるその部位での水の緩和に影
響を及ぼす。
治療的及び生体内診断の用途における放射性核種金属イ
オンの使用は以前から行われてきた。例えば、インジウ
ム−１１１、ガリウム−６７、及びテクネチウム−９９
のようなガンマ線放射放射性核種金属イオンが腫瘍の発
見のために診断用のシンチグラフィーで使用されてきた
。レニウム１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８
９、サマリウム−１５’３イツトリウム−９０及び銅−
６７のようなベータ線放射同位元素が腫瘍の処置におい
て治療学的に使用することができる。
生体内診断及び治療的用途における放射性核種の効能は
目標細胞の部位にこの放射性核種を届ける能力によって
決まる。目標細胞の部位に放射性核種を届けるにあたっ
てのある方法は、目標細胞を選択的に確認し、目標細胞
に含まれる特異な部位子と結合する抗体のような生物学
的に有用な分子に放射性核種金属イオンをカップリング
することを必要とする。例えば、悪性腫瘍細胞によって
産生され、又はその細胞に結合していることが知られて
いる抗原は、診断用の撮像のために又は腫瘍に放射線を
当てて腫瘍を崩壊するために放射性核種を結合した抗体
によって結合される。
ゴールデンベルグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）等は公知の
腫瘍に結合した抗原〔ゴールド（Ｇｏｌｄ）等、「実験
医学ジャーナル（Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、）　Ｊ　１
２１　、４３９〜４６２ページ（１９６５）　）である
発癌生抗原（ＣＥＡ）に対する抗体ヨウ素−１３１で標
識し、次いでそれを癌細胞を有する患者に注射する実験
を開示している［ニュー・イングリッシュ・ジャーナル
・オン・メデイシン（Ｎ、　Ｅｎ　１．　Ｊ　、Ｍｅｄ
、）　Ｊ　２９８　、　１３８４〜１３８８ページ（１
９７Ｂ）　）。４８時間後、患者をガンマシンチレーシ
ョンカメラで走査し、腫瘍をガンマ線放射パターンによ
って局在化した。同様に、英国特許出願番号筒ＧＢ２．
１０９．４０７号は、生体内で腫瘍を発見及び局在化す
るために金属性放射性核種で標識された。腫瘍に結合し
た抗原に対するモノクローン抗体の使用を開示している
。
抗体断片が所望の目標部位に浸透でき、かつその抗体断
片が完全な抗体に関連する免疫原性及び交差反応性の問
題を少なくすることができるので、放射性標識された完
全な抗体よりもむしろ放射性標識された抗体断片の方が
生体内診断及び治療の用途のために使用されることが示
唆された〔例えば、英国特許第４，０３６，９４５号；
「ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）　Ｊ　１７巻、８０８７
号、４６２ページ（１９７８）　；及びベリトスキー（
Ｂｅｌ　ｉ　ｔｓｋｙ）　　等の「核医学ジャーナル（
Ｊ、　Ｎｕｃｌ、　Ｍｅｄ、）Ｊ　１９　．４２９ペー
ジ（１９７８）参照）。抗体断片はいろいろな方法で生
産することができる。抗体分子は酵素的に処理されて、
二価のＦ（ａｄ’）ｚ断片、即ち、重鎮を結合する一個
以上のジスルフィド結合によって結合された二個のＦａ
ｂ　’部分をそのままにして、重鎖のカルボキシル末端
（Ｆｃ断片）を除去される。次いで、Ｆ（ａｂ’）ｚ断
片は二個の重鎮を結合するジスルフィド結合で選択的に
還元され、その結果それぞれが単一の抗原結合部位を有
する二個の一個Ｆａｂ　’断片を生産することになる。
抗体分子はこの抗体に放射性核種イオンを結合するため
の取付は部位として使用することのできる沢山の反応性
側鎖を有している。例えば、放射性核種は、アスパラギ
ン酸もしくはグルタミン酸残基のカルボキシル基、リシ
ン残基のアミノ基又はチロシンもしくはヒスチジンの芳
香族基と反応するリンカ−分子によって抗体に結合する
ことができる。具合が悪いことに、これらの残基は抗体
分子全体にばらばらに分散している。従って、これらの
反応性基への放射性核種の取付けは抗体分子のあらゆる
点で起りうる。抗体分子上の抗原結合部位又はその近く
に放射性核種を持つ基が取付けられる゛と、抗体の抗原
への結合力を抑制し、診断剤又は治療剤としての抗体−
放射性核種結合体の効力を喪失又は減少する結果となる
。抗体の免疫反応性に重大な悪影響を与えない抗体への
放射性核種の取付は方法が必要である。
本発明は、常磁性又は放射性核種金属イオンと結合する
ことができ、生体内診断及び治療の用途に有用な物質を
与えることができる抗体のような生物学的に有用な分子
と結合体を形成するのに有効な二官能価のカップリング
剤を提供する。本発明の二官能価カップリング剤を抗体
のＦａｂ　’断片の遊離ＳＨ基と反応させることによっ
て生産される抗体結合体は抗原結合活性、即ち、それら
が誘導される完全な抗体の免疫反応性を保持している。
この二官能価カップリング剤はＦａｂ　’断片の遊離Ｓ
Ｈ基又はｐｋａ　’≦８を有するアミンとｐＨ６〜８で
特異的に反応するマレイミド基及び常磁性又は放射性核
種金属イオンとキレート２８体を形成することができる
基を含んでいる。代案としては、より塩基性のｐＨで、
マレイミド基を生物学的に有用な分子のアミノ基と反応
させることができる。
本発明のカップリング剤を含む抗体結合体は次の一般式 （式中、ＡｂはＰｃ断片の酸素反応的除去及び重鎮を結
合するジスルフィド結合の還元的分裂の結果得られる抗
体−結合活性を保持する抗体のＦａｂ　’断片の残基で
あり、Ｒは二価有機リンカ−であり、Ｒ′は常磁性イオ
ン又は放射性核種金属イオンをキレート化することがで
きる基である）によって示すことができる。
式Ｉの抗体結合体はキレート形成基によって常磁性イオ
ン又は放射性核種と錯体を形成し、治療・用として、例
えば、悪性腫瘍の処置に又は生体内診断用撮像剤として
使用することができる抗体−放射性核種結合体を形成す
る。
式Ｉの抗体結合体は本発明の二官能性カップリング剤を
抗体のＦａｂ　’断片と反応させることによって生成さ
れる。使用されるＦａｂ　’断片は、完全な抗体を少な
くとも一個の遊離ＳＨ基を有するＦａｂ　’断片に転換
する酵素反応的及び化学的処理を行った後に抗原−結合
活性を保持することができる抗体から誘導される。完全
な抗体は二つの重鎮の部位特異分裂を行う酵素でまず処
理され、重鎮のカルボキシル末端でＦｃ部分が除去され
る。その結果得られたＦ（ａｂ’）ｚ抗体断片は、附随
する鎖内ジスルフィド結合の分裂なしに、二個の重鎮を
結合する鎖間ジスルフィド結合を選択的に分裂させるゆ
るい還元条件におかれる。このようにして各々が重鎮か
ら垂れ下っている少なくとも一個の遊離ＳＨ基を有する
二個のＦａｂ　’断片が生産される。Ｓｌ＋基は抗体結
合体を生成するためにＦａｂ　’断片をカフブリング剤
に結合する反応性部位として作用する。
この部位は抗原結合部位から離れて置かれているので、
結合されたカップリング剤は抗原結合を邪魔しない。
上記したように、遊離基を有するＦａｂ　’断片は完全
な抗体めＦｃ部分の酵素反応的除去、次いで得られたＦ
（ａｂ’）ｚ二量体の還元によって生産される。
二個の重鎮間の鎖間ジスルフィド結合を選択的に還元す
る比較的ゆるい化学条件化で還元を行うことによって軽
−重鎖の附随する分裂を防止することが望ましい。使用
される抗体は、Ｐｃ部の除去が一個のジスルフィド結合
によって結合されたＦ（ａｂ’）ｚ二量体の二個の単量
体部分を残すように置かれている酵素反応的分裂部位を
有しているのが好ましい。−個のジスルフィド結合は、
軽−重鎖結合を分断しないゆるやかな還元条件下で優先
的に分裂させることができる。例えば、ペプシン又はパ
パインによって酵素反応的に分裂され、二個の単量体部
分が多くのジスルフィド結合によって結合されているＦ
（ａｂ’）ｚを産生する抗体は、重鎮間の多くの結合を
分裂させるために必要である比較的過酷な化学条件が軽
−重鎖結合もまた分裂させるようなので、本発明に使用
するには一般に好ましくない。
チオール活性化剤の存在下にパパインで酵素反応的に分
裂される抗体は、得られた抗体断片がカップリングに必
要である遊離ＳＨｉを欠いているので、本発明に有用で
ないＦａｂ断片を産生ずる。
本発明の実施に有効な抗体は、発癌性抗体、アルファー
フェート蛋白質、ヒト絨毛ゴナドトロピン又はそのベー
タサブユニット、結腸特異抗原−Ｐ、腫瘍特異糖蛋白質
等のような生体内腫瘍標識として有効であると知られて
いるいかなる抗原に対する抗体も含む。
サブクラスｒｇｃ、は本発明の実施に使用するのに好、
ましい。抗体のこのサブクラスは、ハイブリドーマ細胞
によって産生されたモノクローン抗体の優位サブクラス
である。モノクローン抗体を産生ずるハイブリドーマ細
胞は、骨髄腫細胞と抗体を産生ずるリンパ球とを融合す
ることによって産生される〔ジー・コラ−（Ｇ、　Ｋｏ
ｈｌｅｒ）及びシー・ミルスティン（Ｃ，Ｍｉｌｌｓｔ
ｅｉｎ　ｒネーチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）　Ｊロンドン
、％■−１４９５〜４９７ページ（１９７５）　］。本
発明の実施にあたって使用されるＦａｂ　’断片を生産
するのに使用するための抗体の一例としては、腫瘍関連
抗原（ＣＥ＾）に対するＩｇＧ、型モノクローン抗体が
ある。このマウスモノクローン抗−ＣＥ＾抗体（サブク
ラスＩｇＧ＋）は、重鎮を結合する一個のジスルフィド
結合を有するＦ（ａｂ’）ｚを生産するためにバラーム
（Ｐａｔｈａｍ）等［免疫法ジャーナル（Ｊ。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　Ｊ　５３．１３
３〜１７３ページ、（１９８２）　Ｊの方法を用いて、
予め活性化したチオールを有しないパパインで分裂させ
ることができる。
次いで、この断片は、各々が一個の垂れ下がったＳＲ基
を有する二個のＦａｂ　’を生産するために重鎮を結合
する鎖間ジスルフィド結合を選択的に分裂する温和な還
元条件化で２−メルカプトエタノール又はシスティンの
ような還元剤を使用して、還元される。還元は、中性又
はその付近のｐＨに調節された溶液中で培養することに
よって行なわれるのが便利である。培養の温度は重要で
はないが、室温が適当である。培養は一般に約１〜２時
間行なわれる。システィンは、重鎮を結合する鎖間ジス
ルフィド結合の選択的な分裂を行うのに好ましい還元剤
である。還元反応におけるシスティンの濃度は約２．５
から約４０ｍＭ、好ましくは５から２０ｍＭであり得る
。これより低いシスティンの濃度でも、Ｐ（ａｂ　’　
Ｌの実質的量は減少しないが、これより高い濃度では重
鎖と軽鎖を結合するジスルフィド結合の望ましからざる
分裂を生じる。
式Ｉの抗体結合体はＦａｂ　’を次式 によって示される本発明のカップリング剤と反応させる
ことによって生産される。
式■において、Ｒはマレイミド基をＲ′基に結合するた
めに作用する二価有機ラジカルである。
抗体分子の側鎖と非反応性であるいかなる二価の有機ラ
ジカルも使用することができる。Ｒは−（ＣＪ）　ｎ−
（ｎ　壁１〜２０の整数）又はフェニレンであるのが好
ましい。実例としては、Ｒはｎが５又は７の−（ＣＨ２
）ｎ−である。
Ｒ′は常磁性又は放射性核種金属イオンをキレート化す
ることができる基である。適切なキレート化基を選択す
るには、多くの基準が考慮される。
キレート化基は常磁性イオン又は放射性核種の循環して
いるトランスフェリンとの交換を最小にする非常に高い
安定係数を有しているべきである。
キレート錯体は生理学的条件下で熱力学的に安定である
べきである。これは、宿主に無害であるキレート化剤か
ら誘導されるべきである。さらに、分子が生物担体の分
解に際して細胞外に分割し、その後尿中に排出されるよ
うに、キレート化基は弱酸性であるべきである。
下記のものがＦａｂ　’断片に放射性核種を取り付ける
ために使用できるカップリング剤の例である。
式ＩＩａの化合物及びその類縁化合物は次の反応式に従
って製造できる。
ＮＣ（ＣＨｚ　）６Ｎ　（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）２式Ｉ
Ｉａの化合物及びその類縁化合物は次の反応系に従って
製造できる。
ＨｌＮ　（ＣＨｚ　）ＳＣＨＣＨ２Ｎ　（ＣＨ２ＣＨ２
Ｈ）　！式■のカップリング剤は抗体Ｆａｂ　’と反応
させられて式Ｉの抗体結合物を生成する。反応は次のよ
うに示すことができる。
（ｎ）　　　　　　　　　　　　　（１）（式中、Ａｂ
−５Ｈは抗体Ｆａｂ　’断片を示し、Ｒ及びＲ′は前に
定義した意味を有する。）。
反応は２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７，０）のような適当な
緩衝液中で行われる。反応温度はあまり問題ではないが
、はぼ室温が好ましい。室温において、反応は約１時間
で完了する。生成物はＤＥＡＥカラムでのクロマトグラ
フィーのような通常のクロマトグラフィ一手段によって
単離できる。
式Ｉの抗体結合体はキレート化条件下に常磁性又は放射
性各種金属イオンと錯体化される。治療又は生体内診断
技術に有用であり、かつ抗体断片に結合することを望む
常磁性又は放射性核種金属イオンはどれでも使用するこ
とができる。単に例示的ではあるが、ガドリニウム（■
）、鉄（ＩＩ［）、マンガン（ＩＩ）及びクロム（Ｉｆ
）のような常磁性イオン並びにインジウム−１１１、ガ
リウム−６７及びテクネツウム−９９ｍのような診断用
シンチグラフィーに有用なガンマ線放射性核種及びイツ
トリウム−９０、銅−６７、レニウム−１８６、レニウ
ム−１８８、レニウム−１８９及びサマリウム−１５３
のような治療用の用途に有用なベータ線放射核種のよう
な放射性核種金属イオンを挙げることができる。
放射性核種の他の有用な種類としては、アルファ線放射
、陽電子放射及びオージェ電子放射の各放射性核種があ
る。上記錯体は式Ｉの結合体を結合一体が生理学的に安
定である緩衝液中で上記の放射性核種と反応させること
によって形成することができる。必要ならば、上記の常
磁性イオン又は放射性核種は中間のキレート化剤、即ち
抗体結合体の生理的ｐＨで上記金属イオン又は放射性核
種を安定にするが、式Ｉの抗体結合体とで形成されるキ
レート錯体より熱力学的に不安定であるキレート錯体を
形成するキレート化剤、との錯体として溶液に加えるこ
とができる。例えば、インジウム−１１１は生理的ｐＨ
において抗体溶液中で塩素塩として不溶性である。生理
的ｐＨはインジウム−１１１を可溶性にするが、′抗体
結合体との安定なキレート錯体を形成するようにインジ
ウム−１１１を容易に転移する４、５−ジヒドロキシ−
１，３−ベンゼン−ジスルホン酸〔チロン＜Ｔｉｒｏｎ
）　）との中間錯体の形態でキレート反応にインジウム
−１１１を供給するのが好ましい。式■の抗体結合体に
常磁性イオン又は放射性核種をカップリングすると、次
式の抗体−放射性核種結合体 （式中、Ａｂ及びＲは前に記載した通りであり、Ｒ′は
常磁性又は放射性核種金属イオンと上記した基Ｒ′との
キレート錯体を表わす）を生成する。
式■の抗体−金属イオン結合体は治療又は診断用の用途
のために生理学的に許容しうる緩衝液中で形成すること
ができる。本発明の一実施態様において、ＣＥＡ　（サ
ブクラスＩｇＧ１）に対するマウスモノクローン抗体が
、Ｒが−（ＣＬ）７−であり、かつＲ′が基−Ｎ　（Ｃ
）１２Ｃ８２Ｎ（ＣＨ２Ｃ０□、１１）ｚ　）　２であ
る式■のカップリング剤に結合される。ＣＥＡ抗体結合
体はインジウム−１１１のようなガンマ線放射放射性核
種とキレート化されて、当業界で知られている光走査法
を用いる生体内腫瘍撮像剤として使用される。
ＣＥＡ抗体−放射性核種結合体は静脈内に投与され、引
続き検体が生体内でこの放射性核種結合体の取込み部位
を調べるために光走査される。
下記の実施例は本発明の実施をさらに説明するためのも
のであり、本発明の範囲をどのようにも限定するもので
はない。実施例において、次の用語及び略語は下記に示
す意味を有する。
カップリング剤・・・〔（（７−マレイミドヘプチル）
イミノ）ビス（エチレンニトリ ロ）〕四酢酸 Ｍａｂ　　　　　　・・・モノクローン抗体ＳＯ３・・
・ドデシル硫酸ナトリウム ＥＤＴＡ　　　　　　・・・エチレンジアミン四酢酸’
Ｈ−ＮＥＭ　　　　　・・・Ｎ−（エチル−２−’Ｈ）
−マレイミド ＭＥＳ　　　　　　　・・・２−Ｎ−モルホリノエタン
スルホン酸 チロン（Ｔｉｒｏｎ）−４，５−ジヒドロキシ−１，３
−ベンゼン−ジスルホン酸 ＩｇＧＳＯＲＢ　　　　・・・黄色ブドウ球菌、菌株。
ホルマリンで固定し、熱で死菌させた コーワン（Ｃｏｗａｎ）　Ｔ ■夏至旦立索囮 ＣＥＡをアイオードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ）法によって
放射性標識化した。５０ｇｇの抗原を２μｇのアイオー
ドゲンで被覆したマイクロフユージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇ
ｅ）管に加えた。１　ｍＣｉの）１ａ１２４を添加し、
４℃で１５分間培養した。培養時間の後、１０ｍｇ／ｍ
ｌの濃度のヒスチジン２０μｌを加えて遊離ヨウ素と反
応させた。ヨードヒスチジンをセファデックスＧ−２５
Ｍカラム〔ファーマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製、
ビスケータウェー、ニューシャーシー州〕でのゲル濾過
によって除去した。
ヒト′士腸腺癌細胞抽出物の調製 細胞抽出物を結腸腺癌から調製した。組織を１０ｍＭの
トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，２）及び０．２　ｍＭのＣ
ａＣ１”中で３分間４℃で微細、均質化し、次いで１，
０００　ｇ　（重力加速度）で１０分間遠心分離した。
ペレットをリン酸塩調節された食塩水中に再懸濁し、１
５秒間隔で１分間４℃で超音波処理した。処理物を１０
、０００　ｇで１５分間遠心分離し、上澄み物を固相放
射線免疫検定法（実施例Ｖ）に使用した。
イミドエチル）アミンの一１′告。ＤＭＦ　（１２０ｍ
ｌ）中に６−ブロモヘキシルシアニド（１３，８８ｇ　
、　０．０７３モル）、ビス（２−フタルイミドエチル
）アミン（２６，５２ｇ　。
０．０７３モル）及びトリエチルアミン（７，３７ｇ−
０，０７３モル）を含む混合物を１００℃で２０時間加
熱した。冷却後、形成した沈澱物を濾過によって除去し
、濾液を氷水（１０００ｍｌ）の中に入れた。その水溶
液をジクロロメタン２００ｍ１ずつで３回抽出した。
−緒にした有機相抽出液をブラインで洗浄し、Ｎａ、Ｓ
Ｏ，上で乾燥した。減圧下で溶媒を除去し、シリカゲル
（ヘキサン−３０％酢酸エチル／ヘキサン勾配溶離）ク
ロマトグラフィーによって粗製物を得た。不純物画分を
再度クロマトグラフィーにかけ、油状物として合計１４
．１　ｇ　（４１％）の（６−ジアツヘキシル）ビス（
２−フタルイミドエチル）アミンを得た。ＩＲスペクト
ルは上記の構造に一致した。
（６−ジアツヘキシル）ビス（２−フタルイミドエチル
）アミン（１３，８ｇ　、　０．０２９モル）及びヒド
ラジン（２，１５ｇ　、　　０．０６７モル）のメタノ
ール（１５０ｍｌ）溶液を１．５時間還流し、−晩装置
した。溶媒を減圧下で除去し、それから残留物を水中に
入れ、ＨＣＩでｐＨ２に、した。沈澱物を濾過によって
除去し、濾液を固体Ｎ　ａ　ＯＨで塩基性にした。次い
で、この溶液を減圧下で濃縮し、ジクロロメタン５０ｍ
１ずつで４回抽出した。−緒にした有機相抽出液をＮａ
ｚＳＯ４上で乾燥し、減圧下に蒸発した。残留物をキュ
ーゲラ−（Ｋｕｇｅｌｒｏ、ｈｒ）蒸留することによっ
て、０、Ｏ７ｍｍＨｇ　　において１２０〜１４０℃（
油浴温度）の範囲で集めたウォーターホワイトの液体と
して精製された（６−ジアツヘキシル）ビス（２−アミ
ノエチル）アミン（４，１ｇ、６７％）を得た。ＩＲス
ペクトルは上記の構造と一致し、同様に元素分析も一致
した。
（７，０ｇ、０．０７４モル）水（２０ｍ１）溶液を水
酸化ナトリウム（５，９２ｇ、Ｏ，１４８モル）水（３
０ｍ１）溶液の必要量を添加することによって中和した
。（６−ジアツヘキシル）ビス（２−アミノエチル）ア
ミン（３，７２ｇ　、　０．０１７５モル）を添加し、
この溶液を４５℃で７時間加熱した。この加熱期間中、
溶液のｐＨを残りのＮａＯＨ溶液を添加することによっ
て１０〜１１に維持した。室温で三日間攪拌した後、溶
液をｔＭ　ＨＣ１でｐＨ７にし、それから溶媒を減圧下
で除去した。残留物をホットメタノール（３００ｍｌ）
中に取出し、濾過した。減圧下でメタノールを除去して
、粗製〔（（６−ジアツヘキシル）イミノ）ビス（エチ
レンニトリロ）〕四酢酸を得た。この物質を蟻酸塩型の
Ｂｉｏ　Ｒａｄ　ＡＧ　７　Ｘ　８イオン交換樹脂（勾
配溶離、０〜１モル蟻間）の２Ｘ３０ｃｍカラムでバッ
チ式に２ｇずつクロマトグラフィーにかけ、合計４．３
ｇ（５５％）の表記四酢酸を得た。精製物は薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）　（エタノール、７％ＮＨ３水
溶液、４：１、シリカプレート）で１スポツトであった
。炭素ＮＭＩ？スペクトルは上記の構造に一致した。
アノヘキシル）イミノ）ビス（エチレンニトリロ）酢酸
酸（０，８５ｂ　、　０．００１９モル）の酢酸（５０
ｍ１）溶液を酸化白金（０，１５ｇ）で処理し、−晩４
５ｐｓｆで水素化した。触媒をセライトで濾過すること
によって除去し、フィルターのセライト受けを水で洗浄
した。溶媒を減圧下で除去して粗製物を得た。
この粗製物を蟻酸塩型のＢｉｏ　Ｒａｄ　ＡＧ　Ｉ　Ｘ
　８イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーにかけた
。水で溶離して、精製された〔（（７−アミノヘプチル
）イミノ）ビス（エチレンニトリロ））酢酸酸（０，７
０ｇ、８２％）を得た。精製物はＴＬＣで１スポツトで
あった。プロトン及び炭素ＮＭＲは上記の構造に一致し
た。
ナトリウム飽和水溶液（１５ｍｌ）中に〔（（７−アミ
ンヘプチル）イミノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四酢
酸（０，７２ｇ、１．６ミリモル）を含む溶液を水浴中
で冷却し、１ｅｌｖ、　Ｃｈｉｍ、　ＡｃｔａＸ５８−
、５３１ペー、ジ（１９７５）に従って製造したＮ−カ
ルボキシメトキシマレイミド（０，２５ｇ、１．６ミリ
モル）を一度に加えた。２０分間攪拌した後、水浴を取
外し、攪拌を３０分間続行した。溶液をＩＮ）ＩｃＩで
ｐＨ６にし、それから減圧下で濃縮した。残留物を蟻酸
塩型のＢｉｏ−Ｒａｄ　ＡＧ　ｌｘ　８イオン交換樹脂
（勾配溶離、０〜１モル蟻酸）の２Ｘ３０ｃｍカラムで
クロマトグラフィーにかけ、わずかに不純物がある生成
物０．６１ｇを得た。この物質を上記のように再度クロ
マトグラフィーにかけて、精製された〔（（７−マレイ
ミドヘプチル）イミノ）ビス（エチレンニトリロ）〕四
酢酸（０，４２ｇ　、　５０％）を得た。
この精製物はＴＬＣ（エタノール、７％　ＮＨ３水溶液
、４：１、シリカゲルプレート）で１スポツトを示した
。
このマレイミドは試薬Ａ１次いで試薬Ｂをスプレーする
ことによって明るい黄色の背景に白いスポットとしてＴ
ＬＣで検知できる。
試薬Ａ・・・エタノール／トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８，２）　１　：　１中の０．１％５．５−ジチオ−ビ
ス−２−ニトロ安息香酸 試薬Ｂ・・・８０％エタノール水溶液中の２％２−メル
カプトエタンスルホン酸ナトリウム ＩＧ１）からＦ（ａｂ’）ｚの調１１．マウス抗−ＣＥ
Ａモノクローン抗体（サブクラスＩｇＧ＋）を（ＮＨ４
）　！ＳＯ４沈降及びイオン交換クロマトグラフィーに
よって腹水から精製した。Ｆ（ａｂ’）ｚを得るために
完全な抗体ＩｇＧ、の酵素反応による分断を、パラーム
（Ｐａｒｈａｍ）等の「免疫法ジャーナル（Ｊ、　ｒｍ
ｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、鼓、１３３〜１７３
ページ（１９８２）に従ってチオールのない予め活性化
されたパパインを使用することによって達成した。精製
されたＦ（ａｂ’）ｚ断片をワットマン（Ｗｈａｔｍａ
ｎ）ＤＨ−５２及びセファデックスＧ−１００樹脂上で
連続カラムクロマトグラフィーによって得た。変性ゲル
電気泳動（ＳＯ５−ＰＡＧＥ）は単離された蛋白質が９
５％以上の純度であることを示した。
（ｂｌ　　Ｆ（ａｂ’）ｚ断片中の鎖間ジスルフィド結
合の玖■叢淀−Ｉ　ｇ　Ｇ　＋　抗ＣＥ　Ａモノクロー
ン抗体のパパイン分裂によって産生したＦ（ａｂ’）ｚ
が二個の重鎮を結合する一個の鎖間ジスルフィド結合を
存することを調べた。この測定を、二個の重鎮を結合す
る鎖間ジスルフィド結合並びに重鎮と軽鎖とを結合する
ジスルフィド結合を分断するが、鎖内ジスルフィド結合
を完全にそのままにするために、ゆるやかな還元条件下
にジチオトレイトールでＦ（ａｂ　’　）２抗体断片を
還元することによって行なった。次いで、還元された断
片を遊離ＳＨ基において反応する’Ｈ−ＮＥＭで反応さ
せ、それから５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに通した
。その結果、各々が三重水素で標識された遊離ＳＮ基を
有する重鎮と軽鎖に対応するハンドを得た。ゲルを蛋白
質で染色し、蛍光団に浸漬し、乾燥し、それからＸ線フ
ィルムに当てて、重鎮と軽鎖の結合の相対的強度を測定
した。
蛍光浸漬されたバンドを切り取り、シンチレーションカ
ウンター中に入れた。−個のＳＨＩの尺度として軽鎖バ
ンドに関して１分間当たりの係数値を用いて、重鎮が二
個のＳＮ基を含み、その内の一個が軽鎖との鎖間ジスル
フィド結合に相当することがわかった。従って、一方の
ＳＮ基は、完全なＣＥＡ抗体のパパイン分裂によって産
生じたＦ（ａｂ’）ｇ断片の重鎮間の一個の鎖内ジスル
フィド結合に相当する。
（ｃｌ　　ｔ＝　　ＣＥＡ　　Ｆａｂ’断片の調製。二
個の重鎮を結合する一個の鎖間ジスルフィド結合を有す
る抗ＣＥＡ　Ｆ（ａｂ　’　）ｚ断片を蛋白質濃度１〜
１０ｍｇ／ｍｌでＮ２雰囲気下にシスティンで還元した
。８５％以上のＦ（ａｂ’）、がＦａｂ　’に還元され
、かつ１５％未満が別個の軽鎖及び重鎮に還元されるよ
うに還元剤の最適濃度及び培養時間を決定した。最適反
応条件は次の通りに決定した。
完全な抗体のパパイン分裂によって産生じたモノクロー
ン抗−ＣＥＡ　（サブクラスＩｇＧ＋）のＦ（ａｂ’）
ｚ断片を、０．２．５．５、ｌ０１１５．２０．２５．
３０．３５及び４０ｍＭの最終濃度のシスティンを用い
て、約７．４のｐＨの緩衝液中室温で２時間還元した。
得られた還元断片をＮＥＭで反応させた。このＮＥＭは
遊離ＳＮ基をアルキル化する、いわば本発明のカップリ
ング剤〔（（７−マレイミドヘプチル）イミノ）ビス（
エチレンニトリロ）〕四酢酸に類縁のものである。種々
の濃度のシスティンで産生した還元断片を対照としての
完全抗体及びＦ（ａｂ　’　）ｚとともに５ＯＳ−ポリ
アクリルアミドゲルの別々のレーンに通し、それからゲ
ルを蛋白質で染色した。染色されたゲルを観測すると、
システィンの濃度が増加するにしたがい、Ｆ（ａｂ’）
ｚのバンドが徐々に見えな（なり、Ｆａｂ　’断片に分
子量で相当するバンドが見えるのがわかった。システィ
ン濃度を連続して増加した結果Ｆａｂ　’のバンドが見
えなくなり、それに附随して別個の重鎮及び軽鎖に相当
する二個のより低い分子量のバンドが見えた。最も望ま
しいシスティンの濃度、即ちＦ（ａｂ　’　）ｚのバン
ドが見えなくなるが、別々の重鎮及び軽鎖のバンドがま
だ見えない濃度は１０ｍＭであるのがわかった。
同様の実験の結果、下記のＮ２噴出緩衝液中で、（Ｆ（
ａｂ　’　）２をＦａｂ　’に最適に還元するために）
代表的なシスティンの濃度は５ｍＭから１５ｍＭであり
、培養時間は２時間から４時間であった。
２５ｍＭ　ＮａＰＯイ２ｍＭ　Ｎａｚ　ＥＤＴＡ　、　
０．０２％　ｗ／ｖＮａＮ：＋　ｐＨ７，４；　５７．
４ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯａ　、１７．６ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ
４，５ｍＭ　　Ｎａｚ　　ＥＤＴＡ　　１，０．０２％
　　ｗ／ｖ　　ＮａＮ３、　ｐＨ７，２（ＰＴＡ緩衝？
＆）；又は２５ｍＭ　トリス、２１ＴＩＭＮａ２εＤＴ
Ａ　、　０．０２％ｈ／ｖ　ＮａＮ＋、ｐＨ８，０゜ （ｄｌ　　結合反応。上記の方法によって生産された還
元抗−ＣＥＡ　　Ｆａｂ　’蛋白質の過剰チオール試薬
を、ＰＭＩＯ隔膜を用いる透析濾過を使用してＮ２雰囲
気下に５０ｍＭ　ＭＥＳ、　２ｍＭ　Ｎａ２ＥＤＴＡ　
、　ｐＨ６，５〜６．８に完全に緩衝液を交換すること
によって除去した。得られた溶液の画分画を公知の比活
性の”ＩＩ−ＮＥＭ　　で滴定して、還元法によって生
産された一Ｆａｂ　’当たりの遊離ＳＮ基の数を測定し
た。残りの溶液を実施例■のカップリング剤、即ち、〔
（（７−マレイミドヘプチル）イミノ）ビス（エチレン
ニトリロ）〕四四散１０〜２５ｍＭと室温で２〜４時間
、次いで４℃で一晩反応させた。
抗体−放射性核種結合体を５μｌの１０ｍ１チロン、４
ｍＭ　　ＨＣＩ　、、ｐＨ２，４に５０ｍＭ　ＨＣＩ　
　中の１０．ｃｒｌ′″ＩｎＣ１５（約５０〜１００μ
Ｃ１）〔ランド−パーム社（Ｒａｄ−Ｐｈａｒｍ）製〕
を添加し、室温で５分間培養することによって調製した
。次いで、１０μｍの２００ｍＭＭＥＳ　、　ｐＨ６，
０及び２〜１５ｍｇ／ｍ＋の抗−ＣＥＡ　　Ｆａｂ　’
と実施例■の方法によって製造したカップリング剤との
結合体１０μｌを添加した。反応混合物を室温で１時間
培養した後、その２〜５μｌを電気泳動分析のために酢
酸セルロース用土にスポットさせた。電気泳動を電極緩
衝液として５０ｍＭのＨＥＰＥＳ　。
ｐｉｆ７．０を使用して行なった。電気泳動電場におい
て、″′Ｉｎキレートジー−ＣＥＡ　　Ｆａｂ　’結合
体は元のままであり、未反応のインジウム−１１１は別
のピークとして移動した。別の電気泳動において、電気
泳動の前に、７μｍのキレート結合体反応混合物をまず
２μｌの２００ｍＭ　Ｎａｚ　ＥＤＴＡ、　ｐＨ６，０
で培養した。このＥＤＴＡの添加は未反応のインジウム
−１１１のピークに移動を生じるが、キレート−結合体
のピークには影響を与えない。このことはこのキレート
化抗体結合体が′″ＩｎＩｎ−チロンキレート定である
ことを示す。
この抗−ＣＥＡ　　Ｐａｂ　’　／インジウム結合体は
、腫瘍の盪像剤として、例えば、公知の光走査技術を使
用して結腸の腫瘍の撮像に使用するために生理学的に許
容しうる緩衝液の形態で静脈内に投与することができる
。
紡入体の免　親和力 実施例Ｈの方法によって製造したモノクローン抗−ＣＥ
Ａ　　Ｆａｂ　’　／カップリング剤結合体の免疫親和
力をＣＥＡ抗原による放射性免疫検定法によって測定し
た。ラット抗−マウスカッパーで被覆したＩｇＧＳＯＲ
Ｂ（黄色ブドウ球菌、エンザイム・センター、ボストン
、マサチューセソツ州）（３００μｇラット抗−マウス
カッパー／１ｍｌ黄色ブドウ球菌）を使用して、標識し
た抗原を遊離抗原から分離した。
一連の希釈量−ＣＥＡ　　Ｆａｂ　’　／カップリング
剤結合体（蛋白質濃度３．７　Ｘｌ０−８１１）を一定
量の＋′Ｉ−標識されたＣＥＡ抗体（２１８ｎｇ）及び
種々の量の非標識ＣＥ＾抗体を用いて室温で一晩培養し
た。培養に引き続き、２０μｌの被覆１ｇＧ５０ＲＢを
各くぼみに添加し、その内容物を３時間培養した。この
ＩｇＧＳＯＲＢを遠心分離とＲＩＡ−緩衝液中への再懸
濁に反復することによって三回洗浄した。最終のベレッ
トをガンマカウンターに入れ、ガンマ線を測定した。
対照として、完全なモノクローン抗−ＣＥＡ　ＴｇＧ及
びＦ（ａｂ’）ｚ断片を使用して同様な方法で放射性免
疫検定法を行なった。
結合曲線（１分間当たりの係数−抗体希釈量）をそれぞ
れの抗体及び断片に対して並びに非標識抗原の各濃度に
対して作成した。それぞれの場合において、非標識ＣＥ
Ａを追加すると結合活性を減少した。モノクローン抗−
ＣＥＡ　ＩｇＧに対する最大結合力は３０　、０００ｃ
ｐｍであり、抗−ＣＥＡ　Ｆ（ａｂ　’　）ｚに対する
最大結合力は２５．０００ｃｐｍであり、モノクローン
抗ＣＥＡ　　Ｆａｂ’／カップリング剤結合体定結合体
最大結合力は１９．ＯＯＯｃｐｍであった。二重逆数結
合プロット（１）結合対１／遊離）を種々の抗体希釈量
において抗体及び断片に対して作成した。傾斜及び切片
から結合親和力をそれぞれの抗体及び断片並びにそれぞ
れの希釈量に対して測定した。
その結果を表■に示す。これはモノクローン抗−ＣＥＡ
　　Ｆａｂ　’　／カップリング剤結合体の平均結合親
和力がモノクローン抗−ＣＥＡ　ＩｇＧ及び抗−ＣＥＡ
　Ｆ（ａｂ’）ｚの親和力とほぼ同じであったことを示
す。
基４■粗！ ５０μＩのヒト結腸腺癌細胞抽出物をそれぞれのポリビ
ニル板のくぼみに添加し、オービタル攪拌板で乾燥させ
た。次いで、リン酸塩緩衝食塩中の２００　μｌの１％
ウシ血清アルブミン（ＢＳへ）を添加し、室温で１時間
培養した。培養時間の経過後、１５０　μｌの抗体（モ
ノクローン抗−ＣＥＡ　ＩｇＧ　、　Ｆぐａｂ’）２断
片又は抗−ＣＥＡ　　Ｆａｂ　’　／カップリング剤結
合体）を種々の希釈量で添加し、室温でさらに１時間培
養した。各くぼみを３回洗浄し、放射性ｉつ素化したラ
ット抗−マウスカッパーを添加し、１時間培養した。各
（ぼみをリン酸塩緩衝液で５回洗浄し、次いでガンマ線
を測定した。
結合曲線（１分間当たりの計数、抗体希釈量）をそれぞ
れの抗体又は断片に対して作成した。二重曲線を図に示
す。この図から、モノクローン抗−ＣＥＡ　　Ｆａｂ　
’　／カップリング剤結合体がモノクローン抗−ＣＥＡ
　ＩｇＧ及び抗−ＣＥＡ　Ｆ（ａｈ　’　）ｚのものと
本質的に同等の結合曲線を示しているのがわかる。
ヌ妻１汁■ 雌の異系交配Ｈｓｂ無胸腺ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）
をバーリン・スプラギュー・ダウレイ社（Ｈａｒｌｉｎ
Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ、　Ｉｎｃ、、インディ
アナポリス、インディアナ州）から入手し、ヒト腫瘍細
胞を生産する１０７のＬＳ　１７４　ＣＥＡを皮下に接
種した。３週間後、腫瘍が約６グラムになった時、二重
の動物それぞれに実施例■において説明したように調製
した抗−ＣＥＡ七ツクツクローン抗体レート標識され゛
たＦａｂ　’断片及び非特異的抗体に対応するアイソタ
イプｌ−１２５標識されたＦａｂ　’断片のどちらがを
注射した。動物の各グループは１ｍｌリン酸塩緩衝食塩
水につき１２．５μＣｉを受は入れた。２４時間後、そ
れぞれの動物を犠牲にし、器官及び血液をガンマシンチ
グラフィーによって測定した。表■はＩｎ−１１１標識
された特異的抗体断片及びｌ−１２５標識された非特異
的抗体断片の生体内分布を示す。
表■かられかるように、特異的標識抗体断片は非特異的
抗体より５．２倍腫瘍部に局在化した（局在化係数）。
腎臓及び肝臓におけるＩｎ−１１１の高い思量は、肝臓
及び腎臓の取込み並びにクリアランスの速度論（データ
は示していない）から明らかなように、差のある取込み
というよりもむしろこれらの器官からのｌ−１２５のＩ
ｎ　−１１１より急速なりリアランスに原因がある。
表■ 思量／ガンマ腺 ％ Ｉｎ　　４１１　　　　　　Ｉ　−１２５腫瘍　　　１
．９　　　．６２ 腎臓　　７２．０　　　２８．０ 肝臓　　　４．３　　　．５３ 肺　　　　　　　　　　４．０　　　　　　　　４．０
心臓　　　、３２　　　．２１ 血液　　　、２６　　　．４５ 腫瘍／血液　　　　７．３　　　　　　１．４局在化係
数　　　　　　　　５．２
【図面の簡単な説明】

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒは二価有機ラジカルであり、Ｒ′は放射性核
    種金属イオンをキレート化することができる基である）
    の化合物から成ることを特徴とする常磁性又は放射性核
    種金属イオンと生物学的に有用な分子とを結合するため
    のカップリング剤。
  2. （２）Ｒが−（ＣＨ＿２）＿ｎ−（ｎは１〜２０の整数
    ）及びフェニレンから選択される特許請求の範囲第１項
    記載のカップリング剤。
  3. （３）Ｒが−Ｃ＿７Ｈ＿１＿４−又は−Ｃ＿５Ｈ＿１＿
    ０−である特許請求の範囲第１項記載のカップリング剤
    。
  4. （４）Ｒ′が−Ｎ〔ＣＨ＿２ＣＨ＿２Ｎ（ＣＨ＿２ＣＯ
    ＿２Ｈ）＿２〕＿２及び−ＣＨ〔Ｎ（ＣＨ＿２ＣＯ＿２
    Ｈ）＿２〕ＣＨ＿２Ｎ（ＣＨ＿２ＣＯ＿２Ｈ）＿２から
    選択される特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記
    載のカップリング剤。
  5. （５）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IIａ） の化合物から成ることを特徴とする常磁性又は放射性核
    種金属イオンと抗体Ｆａｂ′断片とを結合するためのカ
    ップリング剤。
  6. （６）次式 ▲数式、化学式、表等があります▼（IIｂ） の化合物から成ることを特徴とする常磁性又は放射性核
    種金属イオンと抗体Ｆａｂ′断片とを結合するためのカ
    ップリング剤。
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