CN105497883A - 使用生物相容性的生物可吸收纳米球治疗自身免疫病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及使用生物相容性的生物可吸收纳米球治疗自身免疫病的方法。特别地，本发明方法包括使用生物相容性的生物可吸收纳米球根据T细胞的抗原特异性选择性减少或扩增T细胞。因此，本发明可用于减少或清除识别自身抗原的致病性T细胞，例如β细胞特异性T细胞。这样，本发明可用于预防、治疗或减轻自身免疫病例如IDDM。另外，本发明可用于扩增期望的T细胞，例如抗致病性T细胞，以预防、治疗和/或减轻自身免疫病。

Description

使用生物相容性的生物可吸收纳米球治疗自身免疫病的方法
本申请是申请号为201180047463.8的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/EP2011/066994的中国国家阶段申请。
相关申请的交叉引用
根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2010年9月29日提交的美国临时专利申请号61/387,873的优先权，所述申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明涉及免疫和医药相关组合物及方法。具体地，本发明涉及用于诊断和治疗自身免疫病特别是糖尿病的诊断及治疗方法。
背景技术
抗原免疫接种可用于在自身免疫作用中诱导T细胞耐受。施用自身抗原性蛋白或肽的溶液在自身免疫病实验模型中可减轻自身免疫作用的发生和/或发展(Wraith等，1989；Metzler和Wraith，1993；Liu和Wraith，1995；Anderton和Wraith，1998；Karin等，1994)。但是，利用相似策略的有限的人临床试验几乎毫无例外的遭遇失败(Weiner，1993；Trentham等，1993；McKown等，1999；Pozzilli等，2000；Group，D.P.T.-T.D.S.2002；Kappos等，2000；Bielekova等，2000)。这表明对治疗选择和条件的指导原则尚不完善，因此不适用于人体。
自发器官特异性自身免疫病是由针对多种抗原中众多表位的复杂应答所引起的，其以随机且经常是无法预测的顺序自发出现。下述情况增加了这一复杂性：识别相同表位的淋巴细胞克隆在宽的亲合力范围内结合抗原/主要组织相容性复合物(MHC)分子，其强度与致病潜力相关(Amrani等，2000；Santamaria，2001；Liblau等，2002)。因此，任何预防自身免疫病的免疫接种策略的结局都有可能受到所选自身抗原、剂量、治疗周期以及施用途径及形式的影响。
小鼠中的I型糖尿病(T1D)与自身反应性CD8+T细胞有关。非肥胖糖尿病(nonobesediabetic，NOD)小鼠发生非常类似于人T1D的T1D形式，这是由于识别越来越多自身抗原的T细胞对胰腺β细胞的选择性破坏造成的(Lieberman和DiLorenzo，2003)。尽管T1D的发生明显需要CD4+细胞的参与，但是有强有力的证据证明T1D是CD8+T细胞依赖性的(Santamaria，2001；Liblau等，2002)。已经发现NOD小鼠中的相当一部分胰岛相关CD8+细胞利用CDR3恒定的Vα17-Jα42+TCR，被称为“8.3-TCR样”(Santamaria等，1995；Verdaguer等，1996；Verdaguer等，1997；DiLorenzo等，1998)。这些识别MHC分子Kd情况中模拟表位NRP-A7(使用组合肽文库确定)的细胞(Anderson等，1999)已经是最早的NOD胰岛CD8+浸润物的重要成分(DiLorenzo等，1998；Anderson等，1999；Amrani等，2001)，是致糖尿病的(Verdaguer等，1996；Verdaguer等，1997)，并且靶向来自胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(islet-specificglucose-6-phosphatasecatalyticsubunit-relatedprotein，IGRP)的肽(Lieberman等，2003)——一种功能未知的蛋白质(Arden等，1999；Martin等，2001)。识别该肽(IGRP206-214，类似于NRP-A7)的CD8+细胞在循环中非常常见(＞1/200CD8+cells)(Lieberman等，2003；Trudeau等，2003)。值得注意的是，在NOD小鼠中从胰岛炎发展到糖尿病总是伴随着循环中IGRP206-214-反应性CD8+群体的周期性扩增(Trudeau等，2003)，还伴随着其胰岛相关对应物的亲合力成熟(Amrani等，2000)。最近，有报道称NOD小鼠中胰岛相关CD8+细胞识别多个IGRP表位，表明IGRP是CD8+细胞的主要自身抗原，至少在小鼠T1D中如此(Han等，2005)。NOD胰岛相关CD8+细胞，特别是在疾病过程中早期发现的那些细胞也识别胰岛素表位(InsB15-23(Wong等，1999))。
相关研究已经提示，某些I类HLA等位基因(即HLA-A＊0201)提供了对人T1D的易感性(Fennessy等，1994；Honeyman等，1995；Tait等，1995；Nejentsev等，1997；Nakanishi等，1999；Robles等，2002)。病理研究显示，新近诊断患者的胰岛炎病变主要由(I类HLA限制的)CD8+T细胞组成(Bottazzo等，1985；Atkinson和Maclaren，1990；Castano和Eisenbarth，1990；Hanninen等，1992；Itoh等，1993；Somoza等，1994；Atkinson和Maclaren，1994；Moriwaki等，1999；Imagawa等，2001)，这也是通过胰腺同系移植(来自同卵双胞胎)或同种移植(来自相关供体)治疗的患者中的主要细胞类群(Sibley等，1985；Santamaria等，1992)。
在人和小鼠T1D中，胰岛素都是抗体和CD4+应答的关键靶标(Wong等，1999；Palmer等，1983；ChentoufiandPolychronakos，2002；Toma等，2005；Nakayama等，2005；Kent等，2005)。在胰岛移植受体(Pinkse等，2005)和自发疾病病程(Toma等，2005)中，人胰岛素B链表位hInsB10-18都被HLA-A＊0201呈递给自身反应性CD8+细胞。另外，从小鼠前胰岛素原1或2中已鉴定出四种另外的肽，其被来自HLA-A＊0201背景下的HLA-A＊0201转基因小鼠的胰岛相关CD8+T细胞所识别。
由与T1D易感性基因座IDDM7(2q31)重叠基因(位于染色体2q28-32(Martin等，2001))所编码的IGRP(Pociot和McDermott，2002；Owerbach，2000)最近也已经被鉴定为人T1D中可能相关的β细胞自身抗原(Takaki等，2006)。人IGRP的两个HLA-A＊0201结合表位(hIGRP228-236和hIGRP265-273)被来自表达HLA-A＊0201转基因的小鼠I类MHC缺陷型NOD小鼠的胰岛相关CD8+细胞所识别(Takaki等，2006)。值得注意的是，这些“人源化”HLA-A＊0201转基因小鼠的胰岛相关CD8+T细胞对于HLA-A＊0201阳性人胰岛来说具有细胞毒性(Takaki等，2006)。
可通过扩增低亲合力自身反应性CD8+T细胞来预防NOD小鼠中的T1D。施用可溶性肽(不含佐剂)是诱导抗原特异性T细胞耐受的有效方式(Aichele等，1994；Toes等，1996)。之前，有报道显示使用可溶性NRP-A7治疗前糖尿病NOD小鼠通过选择性缺失表达对肽/MHC具有最高亲合力的TCR克隆型而减弱了IGRP206-214反应性CD8+亚群的亲合力成熟(Amrani等，2000)。这些结果增加以下可能性：即NRP-A7的抗T1D活性也是通过激发“低亲合力”(有可能是抗糖尿病发病的)克隆代替“高亲合力克隆型位置(niche)”(NRP-A7治疗使该位置空出来)所介导。为了检验这一猜想，鉴定了对IGRP206-214反应性CD8+T细胞具有部分、全部或超级拮抗活性的改变的肽配体(alteredpeptideligand，APL)，并且在宽剂量范围内对其抗T1D活性进行比较。
使用中等剂量中等亲合力APL(NRP-A7)或高剂量低亲合力APL(NRP-I4)进行的长期处理提供了针对T1D的保护。这与低亲合力IGRP206-214反应性CD8+T细胞的局部积累(以牺牲其缺失的高亲合力对应物为代价)相关。意外地，使用高剂量高亲合力APL(NRP-V7)或天然配体(IGRP206-214)进行的长期处理仅仅提供部分保护。令人惊奇的是，这些小鼠的胰岛几乎不含IGRP206-214反应性CD8+细胞，而识别其他IGRP表位的CD8+细胞群却有所增加。这使我们推断，当其促使靶器官淋巴细胞位置被非致病低亲合力克隆占据时，自身免疫病的肽疗法可能是最为有效的(Han等，2005)，该预测得到了数学模型的支持(Maree等，2006)。令人遗憾的是，仅在很窄的APL剂量和亲合力(针对靶标TCR)范围内具有此结局，表明肽疗法不适合于预防或治疗T1D。
因此，仍然需要用于治疗糖尿病以及其他自身免疫病的其他组合物和相关方法。
发明内容
用肽来治疗患者是困难的，因为对于IGRP来说，需要每剂数毫克的肽。本文提供了在生物相容性的生物可吸收纳米球上递送抗原/MHC复合物(例如肽/MHC/纳米球复合物，无共刺激分子)。考虑这些复合物比单独的肽或不可生物吸收的纳米球复合物更具有致耐受性。
本申请的一些方面和实施方案包括发现治疗自身免疫作用的新模式。传统上，已使用疫苗来扩增能提供针对病原体或癌症的保护的T细胞，或者清除能够造成自身免疫作用的T细胞。本发明的一些方面涉及新型“疫苗”，其选择性诱导具有抗自身免疫性质的自身反应性CD8+细胞扩增，同时清除具有致病(自身免疫性)性质的自身反应性CD8+细胞，以上两者均根据T细胞的抗原特异性来实现。抗自身免疫自身反应性CD8+T细胞(抗致病性CD8+细胞)以组织特异性(在自发募集到靶组织之后)但是非抗原特异性(例如局部抑制其他自身免疫性T细胞应答)的方式抑制自身反应性T细胞应答。结果，使用此类疫苗进行的治疗既可以预防和/或减轻T1D，也可以使高血糖NOD小鼠恢复到正常血糖水平或降低其血糖水平，而不造成普遍性免疫抑制。此策略可用于治疗其他T细胞介导的自身免疫病，并且可能能够预防胰岛移植后的T1D复发。
本发明的一些实施方案涉及根据T细胞的抗原特异性选择性减少或扩增T细胞。因此，认为本发明可用于减少或消除识别自身抗原的T细胞(例如P细胞特异性T细胞)。由此，本发明可用于预防、治疗或减轻自身免疫病例如IDDM。另外，本发明可用于扩增期望的T细胞，例如识别肿瘤抗原的T细胞，以预防、治疗和/或减轻这些T细胞所对抗的疾病。
本发明的一些实施方案涉及诊断、预防或治疗自身免疫病的方法，其包括以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量将抗原/MHC/生物相容性的生物可吸收纳米球复合物施用给对象。对于与基质偶联的MHC或MHC样分子的情况，抗原包括但不限于全部或部分的肽、核酸、碳水化合物、脂类或者可调节T细胞或T细胞群体活性的其他分子或化合物。因为纳米球复合物的生物可吸收性防止纳米球在体内的长期积累以及从其中产生的任何伴随毒性，所以其生物可吸收性对于本发明来说至关重要。
本发明的一些实施方案包括致耐受性纳米球，其包含偶联到抗原-MHC复合物的生物相容性的生物可吸收纳米球。抗原-MHC复合物可直接或通过接头与这样的纳米球相连。优选的纳米球还可包含生物相容性的生物可吸收金属芯核和生物可降解的生物可吸收包衣。所述纳米球还可包含可易于偶联到抗原-MHC复合物的其他分子(例如链霉亲和素或亲和素或其他已知用于将部分(moiety)附着在纳米球上的分子)的涂层或壳。在一些方面中，生物相容性的生物可吸收纳米球包含选自下列的材料：例如铁III氧化物，磷酸三钙，铬，镓和生物相容性的生物可吸收聚合物，如PGLA、PLLA、PGA、PDLLA、PCL、PDLGA、PLDLA、PLC(其所有都可得自于Zeus，3737IndustrialBlvd，Orangeburg，SC，29118USA，商标名为AbsorvTM)，透明质酸，藻酸盐，聚羟基烷酸酯等。在另一些方面中，生物相容性的生物可吸收纳米球是金属或者可磁化或超顺磁性纳米球。生物相容性的生物可吸收纳米球还可包含由以下形成的生物可降解包衣：葡聚糖，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，甘露醇，PHB-PHV类的聚(羟基烷酸酯)和其他改性多(糖)，如淀粉、纤维素和壳聚糖。
本发明的一些方面包括涉及抗原性组合物的方法和组合物，所述抗原性组合物包含多肽、肽、核酸、碳水化合物、脂类和其他引起或诱导抗原性应答或免疫应答之分子(通常称为抗原)的部分、片段或表位。在一些具体方面中，所述抗原来源于自身反应性抗原和/或其复合物，是自身反应性抗原和/或其复合物，或者是自身反应性抗原和/或其复合物的模拟物。
肽抗原包括但不限于：hInsB10-18(HLVEALYLV(SEQIDNO：1))、hIGRP228-236(LNIDLLWSV(SEQIDNO：2))、hIGRP265-273(VLFGLGFAI(SEQIDNO：3))、IGRP206-214(VYLKTNVFL(SEQIDNO：4))、NRP-A7(KYNKANAFL(SEQIDNO：6))、NRP-I4(KYNIANVFL(SEQIDNO：7))、NRP-V7(KYNKANVFL(SEQIDNO：8))、YAI/Db(FQDENYLYL(SEQIDNO：9))和/或INSB15-23(LYLVCGERG(SEQIDNO：10))，以及美国专利公开20050202032中公开的肽和蛋白质，其通过引用整体并入本文。
在一些方面中，用于治疗T1D的肽抗原是GAD65114-123，VMNILLQYVV(SEQIDNO：14)；GAD65536-545，RMMEYGTTMV(SEQIDNO：15)；GFAP143-151，NLAQTDLATV(SEQIDNO：16)；GFAP214-222，QLARQQVHV(SEQIDNO：17)；IA-2172-180，SLSPLQAEL(SEQIDNO：18)；IA-2482-490，SLAAGVKLL(SEQIDNO：19)；IA-2805-813，VIVMLTPLV(SEQIDNO：20)；ppIAPP5-13，KLQVFLIVL(SEQIDNO：21)；ppIAPP9-17，FLIVLSVAL(SEQIDNO：22)；IGRP152-160，FLWSVFMLI(SEQIDNO：23)；IGRP211-219，NLFLFLFAV(SEQIDNO：24)；IGRP215-223，FLFAVGFYL(SEQIDNO：25)；IGRP222-230，YLLLRVLNI(SEQIDNO：26)；IGRP228-236，LNIDLLWSV(SEQIDNO：2)；IGRP265-273，VLFGLGFAI(SEQIDNO：3)；IGRP293-301，RLLCALTSL(SEQIDNO：27)；胰岛素原L2-10，ALWMRLLPL(SEQIDNO：28)；胰岛素原L3-11，LWMRLLPLL(SEQIDNO：29)；胰岛素原L6-14，RLLPLLALL(SEQIDNO：30)；胰岛素原B5-14，HLCGSHLVEA(SEQIDNO：31)；胰岛素原B10-18，HLVEALYLV(SEQIDNO：1)；胰岛素原B14-22，ALYLVCGER(SEQIDNO：32)；胰岛素原B15-24，LYLVCGERGF(SEQIDNO：33)；胰岛素原B17-25，LVCGERGFF(SEQIDNO：34)；胰岛素原B18-27，VCGERGFFYT(SEQIDNO：35)；胰岛素原B20-27，GERGFFYT(SEQIDNO：36)；胰岛素原B21-29，ERGFFYTPK(SEQIDNO：37)；胰岛素原B25-C1，FYTPKTRRE(SEQIDNO：38)；胰岛素原B27-C5，TPKTRREAEDL(SEQIDNO：39)；胰岛素原C20-28，SLQPLALEG(SEQIDNO：40)；胰岛素原C25-33，ALEGSLQKR(SEQIDNO：41)；胰岛素原C29-A5，SLQKRGIVEQ(SEQIDNO：42)；胰岛素原A1-10，GIVEQCCTSI(SEQIDNO：43)；胰岛素原A2-10，IVEQCCTSI(SEQIDNO：44)；胰岛素原A12-20，SLYQLENYC(SEQIDNO：45)或其组合。
在另一些方面中，可以使用与多发性硬化(multiplesclerosis，MS)有关的肽抗原，其包括：MAG287-295，SLLLELEEV(SEQIDNO：46)；MAG509-517，LMWAKIGPV(SEQIDNO：47)；MAG556-564，VLFSSDFRI(SEQIDNO：48)；MBP110-118，SLSRFSWGA(SEQIDNO：49)；MOG114-122，KVEDPFYWV(SEQIDNO：50)；MOG166-175，RTFDPHFLRV(SEQIDNO：51)；MOG172-180，FLRVPCWKI(SEQIDNO：52)；MOG179-188，KITLFVIVPV(SEQIDNO：53)；MOG188-196，VLGPLVALI(SEQIDNO：54)；MOG181-189，TLFVIVPVL(SEQIDNO：55)；MOG205-214，RLAGQFLEEL(SEQIDNO：56)；PLP80-88，FLYGALLLA(SEQIDNO：57)或其组合。
在一些方面中，抗原-MHC复合物可以交联(缀合)到本文所述的纳米球上。将纳米球缀合到抗原-MHC复合物上的一种非限制性方法包括(a)使抗原-MHC复合物与缀合剂(conjugatingagent)反应，由此形成抗原-MHC-复合物，以及(b)使生物相容性的生物可吸收纳米球与步骤(a)的复合物反应。在一个实施方案中，所述方法包括在进行步骤(b)之前将步骤(a)的复合物浓缩。在另一个实施方案中，所述缀合剂包括异双功能剂(heterobifunctionalagent)。在又一个实施方案中，所述缀合剂包括DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚胺基丁酰胺基苄基-DOTA)、SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧羰基-α-甲基-α-(2-吡啶二硫代)甲苯-)、磺基-LC-SMPT(磺基琥珀酰亚胺基-6-(α-甲基-α-(2-吡啶巯基)苯乙酰胺)己酸酯、Traut试剂(2-亚氨基硫烷盐酸盐)或其任意组合。对将复合物与微米颗粒或纳米颗粒缀合的讨论，请参见美国专利公开20070059775；美国专利No.4,671,958、4,659,839、4,414,148、4,699,784；4,680,338；4,569,789；4,589,071；7,186,814和5543391，欧洲专利申请No.188,256。
自身免疫病可包括但不限于：糖尿病、移植排斥、多发性硬化、卵巢早衰、硬皮病、口眼干燥综合征(Sjogren’sdisease)、狼疮、白癜风(vilelego)、秃头症(脱发)、多腺性衰竭、格雷夫斯氏病(Grave’sdisease)、甲状腺功能减退、多肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体机能减退、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退和/或类风湿性关节炎。在一些方面中，抗原/MHC/纳米球复合物的肽组分来自或者设计自要检测、通过治疗来调节或减轻的自身免疫应答中所涉及的自身抗原或自身抗原表位或者其模拟物。在某些方面，所述自身抗原是肽、碳水化合物或脂类。在一些方面中，所述自身抗原是对象的某些细胞(例如胰腺β细胞)所表达的蛋白质、碳水化合物或者脂类的片段、表位或肽，包括但不限于IGRP、胰岛素、GAD或IA-2蛋白的片段。已经鉴定了针对多种自身免疫病的多种这样的蛋白质或表位。所述自身抗原可以是来源于第二内分泌或神经分泌组分(例如胰岛周围施旺氏细胞等)的肽、碳水化合物、脂类等。
在本发明的另一些方面中，抗原/MHC/纳米球复合物的MHC组分是经典的或非经典的I类MHC或II类MHC多肽组分。所述I类MHC可包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G分子的全部或一部分，特别是HLA-A分子的全部或一部分，例如HLA-A＊0201I类MHC分子。非经典I类MHC组分可包括CD1样分子。II类MHC组分可包括HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分。在一些方面中，抗原/MHC复合物与基质共价或非共价偶联或结合(抗原/MHC/纳米球复合物)。所述基质通常是生物相容性的生物可吸收纳米球。在一个实施方案中，所述纳米球包含金属，例如铁或铁氧化物。在另一个实施方案中，所述纳米球包含生物相容性的生物可吸收聚合物。在任何一种情况下，所述纳米球在体内发生生物吸收，从而限制了纳米颗粒在体内的积累。本发明的肽可以与基质化学偶联，特别是通过化学或肽接头连接。CD1分子是非经典MHC分子的一个实例。非经典MHC分子的特征在于物种之间是非多态性的、保守的，并具有窄且深的疏水配体结合口袋。这些结合口袋能够将糖脂和磷脂呈递给自然杀伤T(NKT)细胞。NKT细胞代表了共表达NK细胞标志物和半恒定T细胞受体(TCR)的一个独特的淋巴细胞群体。它们参与与许多种疾病有关的免疫应答的调控。
在一些实施方案中，通过该治疗扩增的T细胞已被疾病过程预先活化，并且具有记忆表型。在一个方面中，T细胞来自以低亲合力识别靶表位的自身反应性前体。可以通过四聚体结合测定等来测定亲合力。在另一个方面中，抗原/MHC/纳米球复合物在目的自身免疫性疾病的临床症状出现之前、之后或者之前和之后施用。在又一个方面中，所述方法可包括这样的步骤，其包括在治疗之前和/或之后评估自身免疫病的生物学参数，例如对象血糖水平。本发明的方法还可包括评估对象的自身免疫状态，包括评估任何自身反应性免疫应答。在一些方面中，T细胞是CD4+或CD8+T细胞或NKT(NKT)细胞。
本发明的另一些实施方案包括扩增抗致病性自身反应性T细胞的方法，其包括以足以刺激抗致病性自身反应性T细胞扩增的量施用抗原/MHC/纳米球复合物。在一些方面中，T细胞是CD8+或CD4+T细胞或NKT细胞。
在又一些实施方案中，本发明包括为对象细胞(例如胰岛细胞)提供针对自身免疫应答(特别是致病性自身免疫应答)之保护的方法，其包括以足以抑制对细胞或包含该细胞之组织的破坏的量向对象施用抗原/MHC/纳米球复合物，其中所述抗原或其所来源的抗原性分子来自与细胞相关的自身抗原。
在又一个实施方案中，本发明包括诊断自身免疫作用的方法，其包括评估作为活跃自身免疫作用指示的抗致病性CD8+或CD4+T细胞应答的治疗诱导扩增。
本发明的一些实施方案可包括预防、减轻或治疗同种异体或自身免疫应答对移植组织的排斥，这通过以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量或者足以诱导识别移植组织或器官所表达同种抗原或自身抗原的抗致病性细胞发生扩增的量向对象施用与基质有效偶联的抗原/MHC复合物(即抗原/MHC/纳米球复合物)。
本发明的一些实施方案提供了通过防止或抑制细胞死亡或杀伤来增加或维持哺乳动物中预定类型的功能性细胞(例如胰岛细胞)数量的方法。在一些实施方案中，该方法用于治疗期望发生内源性细胞和/或组织再生的自身免疫病。这些自身免疫病包括但不限于糖尿病、多发性硬化、卵巢早衰、硬皮病、口眼干燥综合征(Sjogren’sdisease)、狼疮、白斑病、秃头症(脱发)、多腺性衰竭、格雷夫斯氏病(Grave’sdisease)、甲状腺功能减退、多肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体机能减退、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退、类风湿性关节炎等。本发明的一个方面提供了新的两组分治疗方法，以消除已有的自身免疫反应，同时重新建立(re-educating)免疫系统。
在某些方面中，抗原/MHC/纳米球复合物不需要与佐剂一起施用就能诱导免疫应答，例如抗体应答。在某些实施方案中，抗原/MHC/纳米球复合物可以与公知的多克隆和单克隆抗体技术联合使用，以在较少使用或不使用佐剂的情况下产生抗体。
附图说明
下述附图构成本说明书的一部分，其用于进一步说明本发明的某些方面。可通过参考这些附图中的一幅或多幅结合本文所述的具体实施方案的详细描述而更好地理解本发明。
图1A-C.低亲合力自身反应性17.6α/8.3βCD8+T细胞是抗致糖尿病的。图1A，17.6α/8.3β-NOD(n＝95)与17.4α/8.3β-NOD小鼠(n＝598)的糖尿病频率。图1B，Tg小鼠中的胰岛炎得分(17.6α/8.3β-NODn＝6，17.4α/8.3β-NODn＝3)。图1C，NOD(n＝56)与LCMV-NOD(n＝10)中的糖尿病频率。
图2A-2B.17.6α/8.3βTCR的发育生物学。图2A，在Tg小鼠中，17.6α/8.3β与17.4α/8.3βTCR的发育生物学。上图是代表性的脾细胞CD4和CD8点状图。下图是用NRP-V7/Kd四聚体染色的CD8+T细胞的比较。图2B，RAG-2-/-Tg小鼠中17.6α/8.30β和17.4α/8.3βTCR的发育生物学。上图是代表性的脾细胞CD4和CD8点状图。下图是用NRP-V7/Kd四聚体染色的CD8+T细胞的比较。
图3.17.6α/8.3β-NOD.RAG-2-/-(n＝13)和17.4α/8.3β-NOD.RAG-2-/-小鼠(n＝106)中的糖尿病频率。
图4A-4B.在TCRα-/-Tg小鼠中17.6α/8.3β和17.4α/8.3βTCR的发育生物学。图4A，上图是代表性的脾细胞CD4和CD8点状图。下图是用NRP-V7/Kd四聚体染色的CD8+T细胞的比较。图4B，17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-(n＝14)和17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠(n＝28)中的糖尿病频率。点状图FACS图中的值对应于每个象限中的细胞百分比，柱状图中的值对应于染色阳性的细胞百分比(平均值±SE)。
图5A-5J.17.6α/8.3βCD8+T细胞自发分化为具有调控功能的记忆T细胞。图5A，来自17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-对17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠的脾CD8+T细胞的代表性FACS谱。图5B，TCRα-/-Tg小鼠的脾(对于17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-，n＝12；对于17.4α/8.30β-NOD.TCRα-/-，n＝9)、PLN(对于17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-，n＝9；对于17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-，n＝6)和BM(对于17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-，n＝4；对于17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-，n＝3)中CD44hiCD122+CD8+T细胞的百分比(平均值±SE)。小鼠是9-18周龄。图5C，来自用NRP-V7/Kd四聚体相对于抗CD122抗体染色的17.6α/8.30β-NOD.TCRα-/-小鼠的脾CD8+T细胞的代表性FACS谱。值是5次不同实验的平均值±SE。图5D，来自17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠的未刺激脾CD8+T细胞和记忆脾CD8+T细胞的表型分析。数据代表针对每个标志物的至少两次实验。图5E，来自TCRα-/-Tg小鼠的CD8+CD4-胸腺细胞和CD8+脾细胞中CD122染色的比较。数据代表四次实验。图5F，来自TCRα-/-Tg小鼠的脾CD8+T细胞对BrdU的摄入。图5G，上图：来自Tg小鼠的脾CD8+T细胞应答于细胞因子IL-2和IL-15(均为100ng/ml)增殖的代表性FACS谱。下图：来自17.6α/8.30β-NOD.TCRα-/-小鼠的未刺激CD8+T细胞和记忆CD8+T细胞应答于不同浓度IL-2和IL-15的扩增倍数。数据代表至少三次实验。图5H，来自17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠的脾未刺激CD8+T细胞以及来自17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠的未刺激及记忆CD8+T细胞应答于1μg/mlNRP-A7DC脉冲刺激的DC的24和48小时后IFN-γ产生。图5I，应答于以1μg/mlNRP-A7脉冲刺激的DC，6小时后，来自17.4α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠的脾未刺激CD8+T细胞相对于来自17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠的未刺激CD8+T细胞和记忆CD8+T细胞的细胞内IFN-γ染色。图5J，在不同时间点，应答于1μg/mlNRP-A7脉冲刺激的DC，IL-2产生和增殖。图5H和图5J中的数据代表四次实验，图5I中的数据代表三次实验。
图6.CFSE标记的17.4α/8.3βCD8+T细胞的增殖。存在来自于17.6α/8.3β-NOD.TCRα-/-小鼠的未刺激CD8+T细胞和记忆CD8+T细胞时(上图)，或者来自17.4α/8.3β-NOD和LCMV-NOD小鼠的未刺激CD8+T细胞时(下图)，CFSE标记的17.4α/8.3βCD8+T细胞响应于NRP-A7脉冲刺激的DC的增殖。数据代表至少五次实验。
图7A-7B.记忆17.6α/8.3βCD8+T细胞杀伤抗原脉冲刺激的APC。图7A，来自17.4α/8.30β-NOD.TCRα-/-小鼠的新分离未刺激CD8+T细胞和来自17.6α/8.30β-NOD.TCRα-/-小鼠的未刺激CD8+T和记忆CD8+T细胞抗NRP-A7和TUM脉冲刺激的BMDC的体外细胞毒性。数据代表三次实验。用1μg/mlNRP-A7或TUM脉冲刺激并用[51Cr]-铬酸钠标记的纯化BMDC。效应细胞∶靶标细胞的比例＝8∶1(40000效应细胞∶5000靶细胞)。8小时后收获上清液。图7B，体内细胞毒性测定：以1∶1的比例将NRP-A7脉冲刺激的(CFSElo)或TUM脉冲刺激的(CFSEhi)B细胞(上图)或新分离的脾和LNDC(下图)注射进Tg宿主。使用抗B220或抗CD11cMACS珠分离B细胞或新DC(来自脾和LN)，用10μg/ml肽脉冲刺激2小时，洗涤，用CFSE(TUM：3μMCFSE、NRP-A7：0.3μMCFSE)在37℃标记3分钟，洗涤三次，将来自每个群体的4-5×106个细胞注射进宿主。18小时后，处死小鼠，对脾细胞进行FACS分析。
图8描述了与pMHC缀合的PLGA(聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯))纳米球的放大图像。
图9描述了CD8+T细胞对指示纳米颗粒/孔浓度下的IGRP/Kd-PLGA纳米球复合物的IFNγ应答。
具体实施方式
应理解，本发明不限于描述的一些具体实施方案，由此，其当然可以改变。还应理解，本文使用的术语仅为了描述具体实施方案，而不旨在限制，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限制。
必须注意，除非上下文明确规定，否则本文和所附权利要求书中没有数量词修饰的指示物包括复数的指示物。因此，例如，提到“赋形剂”包括多种赋形剂。
I.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域技术人员通常理解的含义相同。本文使用的以下术语具有以下含义。
本文使用的词语“包含/含有”旨在指组合物和方法包括所列举要素，但不排除其他要素。当“基本上由......组成”用于限定组合物和方法时，将意指排除关于阐明目的对组合有任何重要意义的其他要素。因此，如本文定义的基本上由一些要素组成的组合物将不排除实质上不影响所要求保护发明的基本特征和新特征的其他材料或步骤。“由......组成”将指排除多于痕量的其他成分和实质性方法步骤的要素。由这些连接术语中的每一个定义的实施方案都在本发明范围内。
“生物相容性”意指递送系统的组分不引起组织损伤或对人生物系统的损伤。为了赋予生物相容性，将优先使用在人体中具有安全使用历史或者具有GRAS(一般认为安全)状态的聚合物和赋形剂。生物相容性意指用于组合物的成分和赋形剂将最终“被生物吸收”或被身体清除，并且对身体没有不利影响。对于生物相容性的并且被认为无毒的组合物，其不可以对细胞产生毒性。类似地，术语“生物可吸收”指由经某一时间段在体内发生生物吸收的材料制得的纳米颗粒，从而避免所述材料在患者中长期积累。在一个优选实施方案中，所述生物相容性纳米颗粒经小于两年，优选小于1年并且甚至更优选小于6个月的时间被吸收。生物吸收的速率与颗粒尺寸、所用材料和本领域技术人员公知的其他因素有关。生物可吸收的生物相容性材料的混合物可用于形成用于本发明的纳米球。在一个实施方案中，可将铁(III)氧化物与生物相容性的生物可吸收聚合物组合。例如，铁(III)氧化物与PGLA可组合形成纳米颗粒。
抗原/MHC/纳米球复合物指在表面(如生物相容性的生物可降解纳米球)上呈递肽、碳水化合物、脂质、或者抗原分子或蛋白质(即，自身肽或自身抗原)的其他抗原性区段、片段或表位。本文使用的“抗原”指可在对象中诱导免疫应答或抗致病性细胞扩增的分子的全部、部分、片段或区段。
当术语“约”用于数字指示物(例如温度、时间、量和浓度)，包括范围之前时指可有(+)或(-)10％、5％或1％变化的近似值。
“杀伤”意为通过凋亡或坏死使得细胞死亡。凋亡或坏死可通过任何细胞死亡途径介导。
“自身免疫细胞”包括例如成体脾细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞和骨髓来源的细胞，例如哺乳动物的缺陷型抗原呈递细胞，所述细胞针对该自身免疫细胞所来源的生物体具有活性。
“模拟物”是给定配体或肽的类似物，其中所述类似物与所述配体基本上类似。“基本上类似”意为所述类似物具有类似于所述配体的结合谱，只是该模拟物具有一个或更多个官能团或修饰，总计占所述配体分子量的少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％或少于约5％。
“有效量”是足够达到预期目的(例如对T细胞活性或T细胞群的调节)的量。如本文详细所述，有效量或剂量取决于目的和所述抗原，并且其可根据本公开内容来确定。
“自身反应性T细胞”是识别“自身抗原”(含有该T细胞的同一个体所产生并含有的分子)的T细胞。自身反应性T细胞可以是CD8+T细胞或CD4+T细胞。另外，CD4+T细胞可被归类为TR1(1型调节性T)细胞。
“致病性T细胞”是对含有该T细胞的对象有害的T细胞。而非致病性T细胞对对象无显著危害，抗致病性T细胞减少、减轻、抑制或消除致病性T细胞的危害。
在权利要求书和/或说明书中使用时，术语“抑制”、“减少”或“防止”或者这些术语的任何变化包括任何可测量的降低或完全抑制，以达到预期结果。
在权利要求书和/或说明书中与术语“包括/包含”一起使用时，没有数词修饰的名词可表示“一个”，但是也与“一个或更多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”的意思相同。
术语“抗致病性”指对引起疾病具有保护作用的细胞。例如，“抗致病性自身反应性CD8+T细胞”指对T1D具有保护作用的细胞。“抗致病性的自体反应CD8+T细胞”也指对其他自身免疫病(例如名为DIAGNOSTICANDTHERAPEUTICTARGETS的第V章中列举的那些)具有保护作用的细胞。
本文中，“纳米球”意指可施用于对象的小离散颗粒。在一些实施方案中，所述纳米球的形状基本上为球形。本文使用的术语“基本上为球形”意指颗粒的形状不偏离球形大于约10％。本发明的多种已知抗原或肽复合物可用于所述颗粒。本发明纳米球的尺寸为约10nm至约150μm，优选约10nm至约1μm。可通过例如分级分离从而使得较大颗粒在水溶液中沉淀来得到较小纳米尺寸的颗粒。然后回收溶液上层。该上层富含较小尺寸的颗粒。可重复该过程直至产生期望的平均尺寸。
本申请通篇中，术语“约”用于表示数值包括用于测定该值的设备或方法之误差的标准差。
权利要求书中术语“或”用于表示“和/或”，除非明确说明表示仅仅择一选择或者所述择一选择彼此互斥，尽管本公开内容支持表示仅仅择一选择以及“和/或”的定义。
如本文和权利要求中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，来表示数类结构上相关蛋白中的任意种类，其起到动物或受体的免疫应答之一部分的功能，所述蛋白质包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白。
本文使用的术语“免疫原性物质”或“免疫原”或“抗原”可互换使用，以描述能够在单独或者与佐剂联合或者在展示载体上施用给受体后诱导针对其自身的免疫应答的分子。
本文所使用的“氨基分子”是指本领域中已知的任何氨基酸、氨基酸衍生物或氨基酸模拟物。在一些实施方案中，蛋白性分子的残基是连贯的，没有任何非氨基分子插入在氨基分子残基的序列中。在另一些实施方案中，所述序列可包括一个或更多个非氨基分子部分。在一些具体实施方案中，所述蛋白性分子的残基序列中可插入一个或更多个非氨基分子部分。
因此，术语“蛋白性组分”涵盖了包含天然合成蛋白质中20种常见氨基酸中至少之一或者包含至少一个经修饰或非常见氨基酸的氨基分子序列。
如本文使用的，术语“治疗”意指患者疾病或病症的任何治疗，其包括：
■预防或保护免受疾病或病症，即例如在具有患这种疾病或病症风险的对象中使临床症状不发生，从而基本上避免疾病或病症发病；
■抑制疾病或病症，即阻止或抑制临床症状的发展；和/或
■减轻疾病或病症，即引起临床症状的消退。
下述详细说明将进一步明确本发明的其他目的、特征和优点。但是，应理解，所述详细说明和具体实施例尽管给出了本发明的一些具体实施方案，但是仅以举例形式给出，这是因为通过此详细说明本发明的精神和范围之内的多种变化和修饰对于本领域技术人员来说是很明显的。
目前的观察结论(Han等，2005)认为，想要在自身免疫反应中有效，肽疗法必须靶向多种表位特异性。可溶性肽可诱导肽特异性T细胞耐受，但是不能削弱多特异性自身免疫应答。本发明人认为用肽完成这一任务是非常不实际的，因为仅IGRP就需要每个剂量数毫克的肽。由于在与固定在APC上的MHC分子连接时，肽的致耐受性高得多(即在较低的量时)(Miller等1979)，所以认为全身性递送纳米球上的抗原/MHC复合物例如肽/MHC复合物(不含共刺激分子)可能比单独的肽有更高的致耐受性。这一想法是从最初用于对胰岛炎症进行成像的试剂的可用性演化而来。本发明人寻求特异性递送适于对循环8.3样CD8+T细胞进行磁共振(MR)成像的探针(由NRP-V7/Kd复合物包被的铁氧化物纳米球)(Moore等，2004)。具体地，本发明人考虑将这些纳米球用几种不同的抗原/MHC复合物包被，作为诱导将多种T细胞特异类型的同时清除至T1D发生所需阈值之下的方式。最出乎意料地，发现结合到固相支持物的pMHC复合物通过以表位特异性方式扩增作用于经历自身抗原(autoantigen-experienced)的自身反应性CD8+细胞，从而抑制其他自身抗原特异性的募集。在慢性自身免疫应答的进展中这种治疗途径开发了新模式，该模式能够合理设计能够削弱自身免疫作用并且不影响全身免疫的疾病特异性“纳米疫苗(nanovaccine)”，这是这些疾病治疗中长久以来广受欢迎的目标。根据上述模式，可以使用疾病中涉及的(数百种中的)任何一种单一表位(pMHC)特异性，当将其作为配体包被到NP上时削弱了复合物自身免疫应答。颗粒/固相支持物组分是必不可少的，原因是多聚体可溶性pMHC不能引发由其NP偶联的对应物诱导的免疫应答类型。颗粒能够使pMHC优先多聚化并且向这些pMHC提供强有力的受体交联特性。因此，能够实现该发现的该模式和治疗途径提供了新一类自身免疫作用治疗的平台。
考虑包被有抗原/MHC复合物的纳米球(抗原/MHC/纳米球复合物)将扩增在APL处理小鼠中提供T1D保护的低亲合力抗致病性自身反应性CD8+细胞类型(Han等，2005；Maree等，2006)。还考虑这些纳米颗粒将扩增之前已存在的记忆自身反应性CD8+T细胞池(即它们不从头诱导记忆T细胞)。认为这些之前已存在的细胞池主要(如果不是全部)由低亲合力(非致病性/抗致病性)自身免疫性CD8+克隆型构成。这些T细胞的高亲合力对应物(具有致病活性)在体内不以记忆细胞形式存活，可能(但是不将本发明限于任何特定理论)是因为它们在长期暴露于它们的内源靶标β细胞自身抗原后，发生活化诱导的细胞死亡。认为这些纳米球不需要一定靶向到自身反应性CD8+T细胞的优势群体才能有效：用包被有次要肽/MHC复合物的纳米球获得类似结果。另外，认为此技术不需要设计具有确定亲合力的APL(与使用肽时不同)，因此有可能容纳任何靶抗原或肽/MHC靶标。考虑此技术将使新诊断出T1D的NOD小鼠恢复正常血糖水平，其恢复速率至少相当于(如果不是更好的话)用抗CD3mAb治疗所获得的结果，所述抗CD3mAb治疗是在临床试验中显示出一些前景的非抗原特异性方法(Herold等，2002；Keymeulen等，2005)。
认为本发明的组合物可用于扩增之前已存在的记忆自身反应性CD8+T细胞池(即，它们看来不能够从头诱导记忆T细胞)。这些之前存在的细胞池主要(如果不是全部的话)由低亲合力(抗致病性)自身反应性CD8+克隆型构成。这些T细胞的高亲合力对应物(具有致病活性)在体内不以记忆细胞形式存活，而主要以未刺激T细胞形式存在。还考虑未刺激T细胞没有共刺激的情况下接触自身抗原/MHC/纳米球复合物后，发生细胞死亡，因此本发明既清除未刺激的致病T细胞，又扩增抗致糖尿病记忆T细胞。所述组合物不需要靶向自身反应性CD8+T细胞优势群体才能有效。在某些实施方案中，所述组合物和方法可用于诱导自身反应性T细胞耐受。
考虑与包被在不可生物降解的生物不可吸收的固相支持物上的pMHC/抗原复合物相比，生物可降解的生物可吸收纳米球将具有出乎意料且意想不到的结果。这些意想不到的结果包括毒性降低。毒性降低可指纳米球在整个身体的器官和/或组织中的积累减少。毒性降低还可指不期望的生物应答降低，例如炎症降低或整个身体器官的组织损伤降低。炎症和组织损伤是可易于通过已知方法由技术人员测定的评估。还考虑所述生物可降解的生物可吸收纳米球对于身体将更加耐受。这可导致治疗剂量减少或治疗效果增加或更有效。因为治疗效果与自身免疫作用有关，所以其可通过实施例中描述的测定来确定。
在本发明的一个实施方案中，生物可降解的生物可吸收材料由专业的临床医生根据预测的纳米球体内半衰期来选择。半衰期可容易地根据纳米球的物理特性(例如所使用材料和纳米球的大小)确定。在一个优选实施方案中，降解速率对应于临床医生测定的实现最大治疗作用的时间范围。因此，考虑所述生物可降解的生物可吸收纳米球将具有改善的且优秀的治疗潜力，原因是选择了将在预测时间范围内降解并且具有最小不利副作用的材料。
II.药物组合物和施用
本发明包括预防或减轻自身反应性疾病的方法。由此，本发明考虑在多个实施方案中使用“疫苗”或免疫系统调节剂。提出适用于疫苗的组合物可以由自身反应性分子(包括自身反应性蛋白及其片段)制备。本发明包括可用于诱导或调节针对自身反应性抗原(例如多肽、肽、碳水化合物、脂类或其他分子或分子片段)以及针对这些自身免疫应答所致疾病或病症的免疫应答的组合物。
本发明的组合物通常可通过注射胃肠外施用，例如，静脉内、皮下或肌内。适用于其他施用模式的其他制剂包括口服制剂。口服制剂包含通常所用的赋形剂，例如药用级甘露糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放制剂或粉剂的形式，并含有约10％至约95％的活性成分，优选约25％至约70％。
通常，本发明的组合物在具有治疗有效性和免疫调节性的量，以相容于给药制剂的形式施用。待施用的量取决于待治疗对象。需要施用的活性成分的精确剂量取决于执业医师的判断。但是，合适的剂量从每次施用10纳克至数百纳克级别或者微克级别的抗原/MHC/纳米球复合物。合适的初次施用和加强方案也是多样的，但是通常为初次施用，然后是后续施用。
应用的方式可以多种多样。任何施用疫苗的常规方法都可以应用。认为这些包括在固体生理可接受基质上或者在生理可接受分散体系中经口施用，通过注射胃肠外施用，等等。抗原/MHC/纳米球复合物的剂量取决于施用途径，并且可以根据对象的体型大小和健康状况而改变。
在许多情况下，会期望多次施用肽/MHC/纳米球复合物，最多约或者最少约3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。所述施用通常间隔2天至12周，更通常间隔1周至2周。间隔0.5-5年定期加强免疫(通常2年)对于维持免疫系统的状况来说是理想的。施用过程之后可以是对自身反应性免疫应答和T细胞活性的测定。
A.组合疗法
本发明的组合物和相关方法(特别是抗原/MHC/纳米球复合物的施用)还可联合传统疗法的施用一起应用。它们包括但不限于施用免疫抑制或调节疗法或治疗。
在一个方面中，考虑抗原/MHC/纳米球复合物与细胞因子治疗联合使用。或者，抗原/MHC/纳米球复合物施用可以在其他治疗之前或之后进行，其间间隔数分钟到数周。在一些实施方案中，其他药剂和/或抗原/MHC/纳米球复合物分别施用，一般可以确保每次递送之间不会超过一定的间隔，使得所述药剂和抗原/MHC/纳米球复合物仍能够发挥对所述对象的有利联合作用。在这些实例中，设想可以将两种形式彼此在约12-24小时之内施用，更优选地，彼此在约6-12小时之内施用。在一些情况下，可能期望将施用时间段显著延长，但是各次施用间间隔数天(2、3、4、5、6或7)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8)。
可以利用多种组合，例如抗原/MHC/纳米球复合物施用是“A”，另一药剂是“B”：
本发明的肽-MHC复合物组合物将按照此类化合物的一般方案施用给患者/对象，并考虑其毒性(如果有的话)。预计按照需要来重复治疗周期。还考虑可以将多种标准疗法例如水化疗法(hydration)与所述疗法联合应用。
B.药物组合物
在一些实施方案中，将药物组合物施用给对象。本发明的不同方面包括将有效量的抗原/MHC/纳米球复合物组合物施用给对象。另外，这些组合物可以与免疫系统调节剂联合施用。这些组合物一般溶解或分散在可药用载体或水介质中。
短语“可药用”指在施用给动物或人时不产生有害的、变应性的或其他不良的反应的分子实体和组合物。如本文所用的，“可药用载体”包括任何及所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。用于药物活性物质的这些介质和试剂是本领域公知的。除了与所述活性成分不相容的常规介质或试剂之外，均考虑将其用于免疫原性和治疗组合物。
本发明的活性化合物可配制成用于胃肠外施用，例如配制成用于通过静脉内、肌内、皮下或者甚至腹膜内途径的注射。在本发明公开的教导下，含有调节对象免疫疾病的抗原/MHC/纳米球复合物的含水组合物的制备是本领域技术人员已知的。通常，这些组合物可被制备成注射剂：液体溶液或混悬液；也可以制备成适用于注射之前通过加入液体而制备溶液或混悬液的固体形式；所述制剂还可以是乳化剂。
适用于注射应用的药物形式包括：无菌水溶液或分散系；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；以及用于临时制备无菌注射溶液或混悬液的无菌粉剂。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是易于注射程度的流体。其还应该是在制备和储存条件下稳定的，并且必须被保护以抵抗微生物例如细菌和真菌的污染作用。
所述组合物可被配制成中性或盐形式。可药用盐包括酸加成盐(与所述蛋白质的游离氨基形成)，它是与无机酸形成的，例如盐酸或磷酸，或者有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。与游离羧基形成的盐可以来自于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，例如异丙基胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等等。
载体还可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适混合物，以及植物油。可通过例如使用包衣(例如卵磷脂)、通过维持所需粒径(对于分散体系的情况)，以及通过使用表面活性剂，来保持合适的流动性。可以通过多种抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等)来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可通过使用吸收吸附剂的组合物例如单硬脂酸铝和明胶来得到注射用组合物的延长吸收。
可如下制备无菌注射液：将所需量的活性化合物掺入按照需要具有多种其他上文所列成分的合适溶剂，然后除菌。进行溶液的除菌，以此方式使肽/MHC/纳米球的抗致病性不减少。一般来说，通过将多种已灭菌活性成分加入到含有基础分散介质和选自上文所列的所需其他成分的无菌载体来制备分散体系。若是用于制备无菌注射用溶液的无菌粉剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其产生所述活性成分的粉末，加上来自其之前除菌溶液的任何其他所需成分。溶液除菌的一种此类方法是无菌过滤，但是，本发明意在包括不显著降低肽/MHC/纳米球复合物的抗致病性的任何除菌方法。涉及强热和压力的除菌方法(例如高压蒸汽灭菌)可破坏复合物的三级结构，进而显著降低肽/MHC/纳米球复合物的抗致病性。
本发明组合物的施用通常通过任何常用途径来实现。其包括但不限于正位、皮内、皮下、肌内、腹膜内、鼻内或者静脉内注射。在一些实施方案中，疫苗组合物可以被吸入(例如美国专利No.6,651,655，其通过引用整体并入本文)。
根据预定目的确定治疗或预防组合物的有效量。术语“单位剂量”或“剂量”指适用于对象的物理上的分散单位，每个单位含有预定量的组合物，其经计算产生上文在论及施用时(即合适的途径和方案)所述的所需作用。由治疗次数和单位剂量决定的待施用量取决于期望的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于执业医师的判断，对于每个个体来说都是特有的。影响剂量的因素包括对象的身体和临床状态、施用途径、预定治疗目标(是减轻症状还是治愈)，以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在制备后，溶液以与给药制剂相容的形式以治疗或预防有效量施用。所述制剂以多种给药形式容易地施用，例如上文所述的注射用溶液类型。
C.体外或离体施用
如本文所述，术语“体外施用”指对从对象中取出的细胞或者位于对象之外的细胞进行操作，包括但不限于培养细胞。术语“离体施用”指已在体外进行过操作的细胞接着被施用给对象。术语“体内施用”包括所有在对象体内进行的操作，包括施用。
在本发明的一些方面中，所述组合物可以体外、离体或体内施用。在一些体外实施方案中，自体T细胞与本发明组合物一起孵育。然后所述细胞用于体外分析，或者用于离体施用。
III.MHC复合物
抗原，包括来源于抗原性物质(包括但不限于肽、碳水化合物、脂类或本发明的经典和非经典MHC分子所呈递的其他分子)的区段、片段或其他分子，通常与MHC分子或其衍生物复合或有效偶联。T淋巴细胞对抗原的识别是主要组织相容性复合物(MHC)限制性的。给定T淋巴细胞仅识别与特定MHC分子结合的抗原。一般地，T淋巴细胞仅在自身MHC分子存在时被激活，抗原以与自身MHC分子相结合的抗原片段的形式被识别。MHC限制性在所识别抗原方面以及与其抗原性片段结合的MHC分子方面限定了T淋巴细胞的特异性。在一些具体方面，一些抗原会与特定MHC分子或来源于其的多肽配对。
本文所用的术语“有效连接”或“包被”指在与靶位点(例如免疫细胞)结合之前，各个多肽组分(例如MHC)和抗原性组分(例如肽)组分相结合形成活性复合物。这包括以下情况：在施用给对象之前，在体外合成或重组表达各个多肽复合物组分，然后分离并结合以形成复合物；嵌合或融合多肽(即所述复合物每个独立的蛋白质组分包含在单个多肽链中)合成或重组表达成完整复合物。通常，将多肽复合物添加到纳米球，以形成吸附有或连接有多肽复合物的纳米球，其分子数∶纳米球数比约为约、至少约或至多约0.1、0.5、1、10、100、500、1000或更多比1，更常见0.1∶1至50∶1。可以使用标准技术测定所述纳米球的多肽成分含量。
A.MHC分子
细胞内和细胞外抗原在识别和合适应答方面都给免疫系统带来完全不同的挑战。抗原呈递到T细胞是由两类不同的分子介导的：I类MHC(MHC-I)和II类MHC(MHC-II)，它们利用不同的抗原加工途径。来自胞内抗原的肽被在几乎所有细胞上表达的I类MHC分子呈递给CD8+T细胞，而来自胞外抗原的肽被II类MHC分子呈递给CD4+T细胞。但是，此二分法有一些例外情况。一些研究显示，从被胞吞的颗粒或可溶蛋白产生的肽在巨噬细胞和树突细胞中的MHC-I分子上呈递。在本发明的一些实施方案中，鉴定了来源于自身抗原的特定肽，其在合适的I类或II类MHC多肽背景下在肽/MHC/纳米球复合物中呈递。在一些方面中，可评估对象的遗传组成，以确定将哪种MHC多肽用于特定患者和特定的肽集合。
还考虑将非经典MHC分子用于本发明的MHC复合物。非经典MHC分子是在物种之间非多态性的、保守的，并具有窄且深的疏水配体结合口袋。这些结合口袋能够将糖脂和磷脂呈递给自然杀伤T(NKT)细胞。NKT细胞代表一类独特的淋巴细胞群体，其共表达NK细胞标志物和半恒定T细胞受体(TCR)。它们参与与许多种疾病相关的免疫应答的调控。
B.抗原性组分
本发明的一些方面包括涉及抗原性组合物的方法和组合物，所述抗原性组合物包括多肽、肽、核酸、碳水化合物、脂类和其他引起或诱导抗原应答之分子的区段、片段或表位，一般称其为抗原。特别的，可鉴定通过自身免疫应答导致细胞破坏的自身抗原或这些自身抗原的抗原性区段或片段，并将其用于产生本文所述的MHC/纳米球复合物。这些自身抗原可传递于胰岛或支持胰岛细胞的细胞上。本发明的一些实施方案包括调节针对发挥特定生理功能之特定细胞或细胞群的免疫应答的组合物和方法。
1.肽组分和蛋白性组分
可以通过多种氨基酸缺失、插入和/或替换来修饰本发明的多肽和肽。在一些特定实施方案中，经修饰的多肽和/或肽能够调节对象中的免疫应答。如本文所述，“蛋白质”或“多肽”或“肽”指包含至少5个氨基酸残基的分子。在一些实施方案中，利用野生型形式的蛋白质或肽，但是，在本发明的许多实施方案中，利用经修饰的蛋白质或多肽来产生肽/MHC/纳米球复合物。可使用肽/MHC/纳米球复合物来产生免疫应答和/或修饰免疫系统的T细胞群(即重新训练(re-educate)免疫系统)。上文所述术语在本文中可互换使用。“经修饰蛋白质”或“经修饰多肽”或“经修饰肽”指化学结构特别是氨基酸序列相对于野生型蛋白质或多肽发生改变的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，经修饰蛋白质或多肽或肽具有至少一种经修饰的活性或功能(在认可蛋白质或多肽或肽可具有多种活性或功能的情况下)。特别地，考虑在MHC/纳米球复合物的背景下，经修饰的蛋白质或多肽或肽可以在一种活性或功能方面发生变化，但是保留其他方面的野生型活性或功能，例如免疫原性或与免疫系统的其他细胞相互作用的能力。
本发明的肽包括任何自身反应性肽。自身反应性肽包括但不限于hInsB10-18(HLVEALYLV(SEQIDNO：1))、hIGRP228-236(LNIDLLWSV(SEQIDNO：2))、hIGRP265-273(VLFGLGFAI(SEQIDNO：3))、IGRP206-214(VYLKTNVFL(SEQIDNO：4))、hIGRP206-214(VYLKTNLFL(SEQIDNO：5))、NRP-A7(KYNKANAFL(SEQIDNO：6))、NRP-I4(KYNIANVFL(SEQIDNO：7))、NRP-V7(KYNKANVFL(SEQIDNO：8))、YAI/Db(FQDENYLYL(SEQIDNO：9))和/或INSB15-23(LYLVCGERG(SEQIDNO：10))以及美国专利公开20050202032中公开的肽和蛋白质，其通过引用整体并入本文。其他可在本发明中作为自身反应性肽或作为对照肽的肽包括但不限于INS-I9(LYLVCGERI(SEQIDNO：11))、TUM(KYQAVTTTL(SEQIDNO：12))和G6Pase(KYCLITIFL(SEQIDNO：13))。在一些方面中，可使用1、2、3、4、5、6或更多种肽。可用于本发明的肽实例还包括表1中给出的那些。这些肽可以与特定的纳米球/MHC分子相结合，或者多个肽可以与共同的纳米球和一个或更多个MHC分子相结合。这些肽组合的施用包括施用一组附着有多种肽的纳米球和/或施用各自附着有一种特定肽的多个纳米球的组，或者这些纳米球的组合，其包括1、2、3、4、5、6或更多种纳米球，其附着有1、2、3、4、5、6或更多种肽。
表1AT1D的I类HLA局限性表位
GAD65：65kDa谷氨酸脱羧酶，GFAP：胶质原纤维酸性蛋白，IA-2：胰岛瘤相关抗原2，ppIAPP：胰岛淀粉样多肽前体蛋白，IGRP：胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白
表1BMS的I类HLA限制性表位
MBP：髓磷脂碱性蛋白，MAG：髓磷脂相关糖蛋白，MOG：髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白，PLP：蛋白脂质蛋白
在一些实施方案中，蛋白质或多肽(野生型或经修饰的)(包括目的蛋白质或肽的任何复合物，特别是MHC/肽融合物)的大小可包含但不限于5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500个氨基分子或更多(包括其中可推导出的任何范围或值)，或其衍生物。在一些方面中，可使用自身抗原中5、6、7、8、9、10或更多个连续氨基酸(包括其衍生物)和片段(例如本文公开和参考的那些氨基酸序列)作为抗原。考虑可以通过截短对多肽进行突变，使得其比相应野生型更短，但是也可以通过融合或缀合具有特定功能(例如以蛋白复合物的形式呈递，以增强免疫原性，等等)的异源蛋白质序列而使其改变。
可通过本领域技术人员已知的任何技术制备蛋白性组合物，所述技术包括(i)通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，(ii)从天然来源分离蛋白性化合物，或(iii)化学合成蛋白性材料。多个基因的核苷酸以及蛋白质、多肽和肽序列之前已经公开，并且可以在公认的计算机化数据库中找到。一个这样的数据库是NationalCenterforBiotechnologyInformation的GenBank和GenPept数据库(互联网地址是ncbi.nlm.nih.gov/)。可以使用本文公开的技术或本领域技术人员已知的技术扩增和/或表达这些基因的编码区的全部或一部分。
这些组合物中自身抗原性表位和其他多肽的氨基酸序列变体可以是替换、插入或缺失变体。相比于野生型，本发明多肽中的修饰可以影响肽或多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500个或更多个非连续或连续氨基酸。考虑将导致自身免疫应答特别是致病性自身免疫应答的肽或多肽用于本发明方法。
缺失变体通常缺少天然或野生型氨基酸序列中的一个或更多个残基。可以缺失单个残基或缺失数个连续氨基酸。可以将终止密码子(通过替换或插入)引入编码核酸序列中，以产生截短蛋白质。插入突变体通常包括在多肽的非终止位点加入材料。这可以包括插入一个或更多个残基。还可以产生被称为融合蛋白的末端添加。
替换变体通常包含在所述蛋白质中的一个或更多个位点用一个氨基酸替换另一个，并可设计成调节所述多肽的一个或更多个特性，而同时丧失或不丧失其他功能或特性。替换可以是保守的，也就是说，一个氨基酸被形状和电荷相似的另一个氨基酸所替换。保守替换是本领域公知的，包括如以下替换：丙氨酸替换成丝氨酸，精氨酸替换成赖氨酸，天冬酰胺替换成谷氨酰胺或组氨酸，天冬氨酸替换成谷氨酸，半胱氨酸替换成丝氨酸，谷氨酰胺替换成天冬酰胺，谷氨酸替换成天冬氨酸，甘氨酸替换成脯氨酸，组氨酸替换成天冬酰胺或谷氨酰胺，异亮氨酸替换成亮氨酸或缬氨酸，亮氨酸替换成缬氨酸或异亮氨酸，赖氨酸替换成精氨酸、甲硫氨酸替换成亮氨酸或异亮氨酸，苯丙氨酸替换成酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，丝氨酸替换成苏氨酸，苏氨酸替换成丝氨酸，色氨酸替换成酪氨酸，酪氨酸替换成色氨酸或苯丙氨酸，以及缬氨酸替换成异亮氨酸或亮氨酸。或者，替换可以是非保守的，使得多肽或肽的功能或活性(例如对细胞受体的亲合力或亲和性)受到影响。非保守改变通常包括将残基替换为化学上不相似的残基，例如用极性或带电氨基酸替换非极性或不带电氨基酸，反之亦然。
本发明的蛋白质可以是重组的，或者体外合成的。或者，重组蛋白可以分离自细菌或其他宿主细胞。
本文使用的术语“功能等价密码子”指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的6个密码子，也意为编码生物学等价氨基酸的密码子(参见表2，下文)。
表2密码子表
还应理解，氨基酸和核酸序列可包含额外残基，例如分别包含额外的N端或C端氨基酸，或者5’或3’核酸序列，但仍然基本如本文所公开的序列之一，只要所述序列满足上文给出的标准(包括保持蛋白质生物活性(例如免疫原性))即可。末端序列的添加特别适用于核酸序列，例如包含位于编码序列5’或3’部分任一侧翼的多种非编码序列。
考虑在本发明组合物中，每毫升中有约0.001mg至约10mg总蛋白。因此，组合物中蛋白浓度可以约为、至少约为或至多约为0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100μg/ml或mg/ml或更多(或其中衍生的任何范围)。其中约、至少约或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％可以是肽/MHC/纳米球复合物。
本发明考虑施用肽/MHC/纳米球复合物，以实现对自身免疫应答相关疾病或病症的诊断、治疗或预防性疗法。
另外，美国专利No.4,554,101(Hopp)教导了以亲水性为基础从一级氨基酸序列中鉴定和制备表位，其通过引用并入本文。通过Hopp中公开的方法，本领域技术人员能够从氨基酸序列中鉴定可能的表位，并确定它们的免疫原性。但是，许多科学出版物也致力于从氨基酸序列分析中预测二级结构，并鉴定表位(Chou&Fasman，1974a，b；1978a，b；1979)。如果需要，可以使用这些技术中的任意技术来补充Hopp在美国专利No.4,554,101中的教导。
2.其他抗原性组分
可以使用除肽以外的分子作为与MHC分子复合的抗原或抗原性片段，此类分子包括但不限于碳水化合物、脂类、小分子等。碳水化合物是多种细胞外表面的主要组分。某些碳水化合物是不同分化阶段的特征，并且这些碳水化合物经常被特异性抗体所识别。不同碳水化合物的表达可局限在特定的细胞类型中。针对子宫内膜和血清抗原的自身抗体应答已显示为子宫内膜易位的常见特征。已描述了子宫内膜易位中针对数种之前所鉴定抗原(包括2-HS糖蛋白(2-HeremansSchmidtglycoprotein)和碳酸酐酶)的血清自身抗体应答，它们对碳水化合物表位具有特异性(Yeaman等，2002)。
C.基质/纳米球
在一些方面中，抗原/MHC复合物与基质有效连接。基质可以是包含生物相容性生物可吸收材料的纳米颗粒形式。基质也可以是纳米颗粒(例如美国申请12/044,435(通过引用整体并入本文)之前描述的那些)的形式。纳米颗粒可具有多种尺寸的结构，已知有例如纳米球或生物相容性的生物可降解纳米球。这些含有抗原/MHC复合物的颗粒化制剂可以通过所述复合物与所述纳米球的共价或非共价偶联而形成。
所述纳米球通常由基本为球形的芯核和任选的一个或更多个层组成。所述芯核可为多种尺寸和组成。除了芯核之外，所述纳米球可以具有一个或更多个层，以提供适于目的应用的功能部分。层(如果存在)的厚度可以根据特定应用的需要有所不同。例如，层可以赋予有用的光学特性。
层还可以赋予化学或生物功能，本文称为化学活性或生物学活性层，就这些功能而言，所述层的厚度通常可以是约0.001微米(1纳米)至约10微米或更大(取决于所需纳米球直径)，这些层通常施加在所述纳米球的外表面。
优选地，所述芯核和层的组成可以有所不同，前提是所述纳米球是生物相容的并且生物可吸收的。所述芯核可以为均质组成，或者根据所需性质为两种或更多种材料的复合材料。在某些方面中，会使用金属纳米球。这些金属纳米球可以由Fe、Ca、Ga等形成。
如上所述，所述纳米球中除了芯核之外还可包括一个或更多个层。所述纳米球可包含由生物可降解糖或其他聚合物组成的层。生物可降解层的实例包括但不限于葡聚糖，聚(乙二醇)，聚(环氧乙烷)，甘露醇，PHB-PHV类的聚(羟基烷酸酯)和其他改性多(糖)，如淀粉、纤维素和壳聚糖。另外，所述纳米球可包含具有合适表面的层，以用于附着化学官能部分，用作化学结合或偶联位点。
层可以在纳米球上以本领域技术人员已知的多种方式产生。实例包括溶液-凝胶化学技术，例如Iler(1979)；Brinker和Scherer(1990)所描述的。其他在纳米球上产生层的方法包括表面化学和包封技术，例如Partch和Brown(1998)；Pekarek等(1994)；Hanprasopwattana(1996)；Davies(1998)及其中的参考文献所描述的。还可以使用气相沉积技术，参见例如Golman和Shinohara(2000)；和美国专利No.6,387,498。其他一些方法包括层-层自组装技术，例如Sukhorukov等(1998)；Caruso等(1998)；Caruso等(1999)；美国专利No.6,103,379及其中的参考文献所描述的。
可通过下述步骤形成纳米球：将含有抗原/MHC复合物及聚合物的水相与非水相相接触，然后蒸发非水相，以使水相中的颗粒发生聚并，如美国专利No.4,589,330或4,818,542中所教导的。用于此制备方法的优选聚合物是选自以下的天然或合成的共聚物或聚合物：明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)-丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-CO-乳酸)共聚物、聚(ε-己内酯-CO-乙醇酸)共聚物、聚(β-羟基丁酸)、聚(环氧乙烷)、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚氨基酸、聚(2-羟乙基DL-天冬酰胺)、聚酯脲、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1，6-己二异氰酸酯)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特别优选的聚合物是聚酯，例如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)-丙交酯聚(ε-己内酯、聚(ε-己内酯-CO-乳酸)共聚物和聚(ε-己内酯-CO-乙醇酸)共聚物。用于溶解所述聚合物的溶剂包括：水、六氟异丙醇、亚甲基氯、四氢呋喃、己烷、苯或者六氟丙酮倍半水合物。
D.将抗原-MHC复合物与纳米球偶联
为了将所述基质或纳米球与抗原-MHC复合物偶联，采用了下列技术。
可通过对基质或纳米球进行化学修饰来产生结合，通常包括在表面上产生“官能团”，所述官能团能够与抗原-MHC复合物结合，和/或将所述基质或纳米颗粒的经任选化学修饰的表面与共价或非共价结合的所谓“连接分子”相连，然后使所述抗原-MHC复合物与所获得纳米球反应。
术语“连接分子”意为能够与所述基质或纳米球连接并且还能够与抗原-MHC复合物相连的物质。
本文此前所用的术语“官能团”不仅限于形成共价键的反应性化学基团，还包括导致与所述抗原-MHC复合物形成离子相互作用或氢键的化学基团。另外，应注意，严格区分表面上产生的“官能团”与带有“官能团”的连接分子是不可能的，因为对表面的修饰有时需要较小的连接分子(例如乙二醇)与所述纳米球表面的反应。
官能团或带有它们的连接分子可选自：氨基、羧酸基、巯基、硫醚、二硫化物、胍基、羟基、胺基、邻二醇、醛、α-卤代乙酰基、汞有机物、酯基、酰卤、硫酯、酸酐、异氰酸酯、异硫代氰酸酯、磺酰卤、亚胺酯、重氮乙酸酯、重氮盐、1，2-二酮、磷酸、磷酸酯、磺酸、氮杂内酯(azolide)、咪唑、吲哚、N-马来酰亚胺、α-β-不饱和羰基化合物、芳基卤化物或其衍生物。
其他更高分子量的连接分子的非限制性实例有核酸分子、聚合物、共聚物、可聚合偶联剂、二氧化硅、蛋白质，以及表面具有与所述基质或纳米球相反极性的链状分子。核酸可提供与自身含有核酸分子的亲和分子的连接，通过所述连接分子的互补序列来实现。
可举出的可聚合偶联剂的实例有：联乙炔、苯乙烯丁二烯、乙酸乙烯酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙烯基化合物、苯乙烯、硅氧化物、硼氧化物、磷氧化物、硼酸酯、吡咯、聚吡咯和磷酸酯。
所述基质或纳米球的表面可进行化学修饰，例如通过结合带有功能性反应基团的膦酸衍生物来修饰。这些膦酸或膦酸酯衍生物的一个实例是亚氨基-双(甲叉膦酸基)碳酸，其可以通过“Mannich-Moedritzer”反应合成。这一结合反应可以用从制备过程直接获得的或者预处理(例如用三甲基硅烷基溴化物)之后的基质或纳米球来进行。在第一种情况下，膦酸(酯)衍生物例如可以替换反应介质中仍与所述表面相连的组分。在较高温度下可增强此替换。另一方面，认为三甲基溴硅烷使得含有烷基的基于膦酸的络合剂脱烷基化，由此产生新的膦酸(酯)衍生物的结合位点。所述膦酸(酯)衍生物或者与其相连的连接分子可以显示与如上所述相同的官能团。对基质或纳米球进行表面处理的另一个实例包括在二醇(例如乙二醇)中加热。应注意，如果已在二醇中进行合成，那么这一处理可能是多余的。在这些情况下，直接获得的合成产物很可能显示必要的官能团。但是，此处理适用于在含N或P的络合剂中产生的基质或纳米球。如果对这些基质或纳米球进行乙二醇的后续处理，那么反应介质中仍与所述表面相连接的成分(例如络合剂)可以被二醇所替换和/或被脱烷基化。
还可以用带有第二官能团的伯胺衍生物替换仍与所述颗粒表面连接的含N络合剂。所述基质或纳米球的表面还可由二氧化硅包被。二氧化硅允许进行相对简单的有机分子化学缀合，因为二氧化硅易于与有机接头(例如三乙氧基硅烷或氯硅烷)发生反应。所述纳米球表面还可以由同聚物或共聚物包被。可聚合偶联剂的实例有：N-(3-氨基丙基)-3-巯基苯甲酰胺、3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基酰肼和3-三甲氧基甲硅烷基)丙基马来酰亚胺。另一些可聚合偶联剂的非限制实例在本文中给出。这些偶联剂可根据要生成的包衣共聚物类型单独或组合使用。
可用于含有过渡金属氧化物的基质或纳米球的另一种表面修饰技术是通过氯气或有机氯化剂将过渡金属氧化物转变成相应的氯氧化物。这些氯氧化物能够与生物分子中常见的亲核试剂(例如羟基或氨基)反应。这一技术允许产生与蛋白质(例如通过赖氨酸侧链的氨基)的直接缀合。在用氯氧化物表面修饰后，与该蛋白质的缀合还可以用双功能接头(例如马来酰亚胺丙酸酰肼)来实现。
对于非共价连接技术，具有与所述基质或纳米球表面相反之极性或电荷的链状分子是特别合适的。可以非共价连接到芯核/壳纳米球的连接分子的实例包括阴离子、阳离子或两性离子型表面活性剂；酸性或碱性蛋白质；聚胺、聚酰胺、聚砜或者聚羧酸。基质或纳米球与带有功能性反应基团的两亲性试剂之间的疏水相互作用可产生所需连接。具体地，可以使用可彼此交联的有两亲特性的链状分子(例如磷脂或衍生多糖)。可通过共孵育将这些分子吸附在所述表面。亲和分子与基质或纳米球之间的结合还可以基于非共价自组织键。其中一个实例包括带有生物素作为连接分子的简单检测探针，以及亲和素或链霉亲和素偶联分子。
用于官能团与生物分子偶联的方案可以在文献中找到，例如在″BioconjugateTechniques″(GregT.Hermanson，AcademicPress1996)中。所述生物分子(例如MHC分子或其衍生物)可以按照有机化学的标准步骤(例如氧化、卤化、烷基化、酰基化、加成、取代或酰胺化)与所述连接分子共价或非共价偶联。可以在将连接分子与基质或纳米球偶联之前或之后应用这些用于偶联共价或非共价结合的连接分子的方法。另外，可以通过孵育的方式将分子与相应预处理(例如通过三甲硅烷基溴化物)的基质或纳米球直接结合，其由于此预处理而显示出经修饰的表面(例如具有更高电荷或极性的表面)。
E.蛋白质产生
本发明描述了用于本发明多个实施方案的多肽、肽和蛋白质。例如，测定了特定肽及其复合物引发或调节免疫应答的能力。在一些具体实施方案中，还可以根据常规技术在溶液中或固相支持物上合成本发明肽或蛋白质的全部或一部分。有多种市售自动化合成仪，其可以根据已知方案使用。参见，例如Stewart和Young(1984)；Tam等(1983)；Merrifield(1986)；以及Barany和Merrifield(1979)，其均通过引用并入本文。或者，可使用重组DNA技术，其中将编码本发明肽的核苷酸序列插入到表达载体中，转化或转染进合适的宿主细胞，并且在适于表达的条件下培养。
本发明的一个实施方案包括将基因转移入细胞(包括微生物)用于生产蛋白质。可以将目的蛋白质的基因转移进合适的宿主细胞，然后在合适条件下进行培养。可以使用编码几乎任何多肽的核酸。重组表达载体的产生及其中所包含的元件是本领域技术人员已知的，并且在本文中有简要的讨论。哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于Vero和HeLa细胞，其他B细胞和T细胞系，例如CEM、721.221、H9，Jurkat、Raji以及中国仓鼠卵巢细胞系、W138，BHK，COS-7，293，HepG2，3T3，RIN和MDCK细胞。另外，可选择这样的宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或者以所需的方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这些修饰(例如糖基化)和加工(例如切割)对于所述蛋白质的功能来说可能是重要的。不同的宿主细胞具有特征性且特定的蛋白质翻译后加工和修饰机制。可以选择合适的细胞系或宿主系统，以确保所表达外源蛋白质的正确修饰和加工。
可以使用许多选择系统，包括但不限于分别用于tk、hgprt或aprt细胞中的HSV胸苷激酶、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。另外，可以使用抗代谢物抗性作为选择基础：dhfr，其赋予对甲氧苄啶和甲氨蝶呤的抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷G418的抗性；以及hygro，其赋予对潮霉素的抗性。
F.核酸
本发明可包括编码本发明蛋白质、多肽、肽的重组多核苷酸。包括编码自身抗原及呈递自身抗原的MHC分子的核酸序列，其可用于制备肽/MHC复合物。
本申请中所使用的术语“多核苷酸”指重组的或者分离的不含全部基因组核酸的核酸分子。术语“多核苷酸”中包括寡核苷酸(100个残基或更短的核酸)、重组载体，其包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在一些方面中，多核苷酸包括与其天然基因或蛋白质编码序列基本分离的调节序列。多核苷酸可以是RNA、DNA、其类似物或其组合。
在这一方面中，使用术语“基因”、“多核苷酸”或“核酸”来表示编码蛋白质、多肽或肽的核酸(包括正确转录、翻译后修饰或定位所需的任何序列)。本领域技术人员会理解，该术语涵盖了基因组序列、表达盒、cDNA序列以及较小的经改造核酸片段，其表达或者可适于表达蛋白质、多肽、结构域、肽、融合蛋白和突变体。编码多肽全部或一部分的核酸可含有长度为10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000或更多个核苷酸、核苷或碱基对的编码这些多肽之全部或一部分的连续核酸序列。还考虑来自给定物种的特定多肽可由含有天然变异的核酸编码，其具有略微不同的核酸序列，但是仍编码相同或基本相似的蛋白质、多肽或肽。
在一些具体实施方案中，本发明涉及含有编码自身抗原和/或MHC分子的核酸序列的分离的核酸片段和重组载体。术语“重组”可以与多肽或特定多肽的名称一起使用，这通常指由已进行过体外操作的核酸分子或这些分子的复制产物所产生的多肽。
本发明中使用的核酸片段，不论其自身编码序列的长度如何，都可与其他核酸序列(例如启动子、多腺苷酸化信号、额外的限制性酶位点、多克隆位点、其他编码片段等)相连，使得它们的总长可以有显著的不同。因此，考虑可以使用几乎任何长度的核酸片段，其总长优选受到制备便利性和在预定重组核酸方案中用途的限制。在一些情况下，核酸序列可编码具有额外异源编码序列的多肽序列，例如用于多肽的纯化、转运、分泌、翻译后修饰，或者用于治疗益处，例如靶向或效力。可以将标签或其他异源多肽添加到经修饰的多肽编码序列上，其中“异源”指与所述经修饰多肽不同的多肽。
IV.诊断和治疗方法
A.免疫应答和测定
如上所述，本发明涉及引发或调节对象针对自身抗原的免疫应答。在一个实施方案中，所致免疫应答或病症可为对象提供针对自身免疫应答相关疾病或症状的保护，或者对患有、怀疑患有与自身免疫应答有关的疾病或症状或者具有发生其风险的对象进行治疗。
1.免疫测定
本发明包括实施血清学测定，以评价免疫应答是否存在、是否被肽/MHC/纳米球复合物诱导、引发或者调节，以及评价其程度。可应用许多种免疫测定。本发明涵盖的免疫测定包括但不限于美国专利No.4,367,110(双单克隆抗体夹心测定)和美国专利No.4,452,901(western印迹)中所述的。其他测定包括体内和体外的标记配体免疫沉淀和免疫细胞化学。
一种用于对循环中抗原特异性CD8+T细胞数进行定量的方法是四聚体测定。在此测定中，特异性表位与合成四聚体形式的荧光标记I类MHC分子结合。因为，CD8+T细胞识别与I类分子结合的短肽形式抗原，因此带有合适T细胞受体的细胞会与所述带标记的四聚体结合，并且可通过流式细胞术进行定量。尽管此方法比ELISPOT测定节省时间，但是四聚体测定仅测量结合，而不测量功能。并不是所有与特定抗原结合的细胞都一定被活化。但是，已经证明了ELISPOT、四聚体与细胞毒性测定之间的相关性(Goulder等，2000)。
免疫测定一般是结合测定。一些优选的免疫测定是多种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或者基于珠的测定，例如Luminex.RTM.技术，它们是本领域已知的。使用组织切片的免疫组化检测也是特别有用的。
在一个ELISA实例中，抗体或抗原被固定在选定的表面上，例如聚丙烯微滴定板的孔、试纸或者柱填料。然后，将怀疑含有预期抗原或抗体的测试组合物(例如临床样品)添加到所述孔中。在结合并洗涤以除去非特异性结合免疫复合物之后，可检测所结合的抗原或抗体。检测一般通过加入对预期抗原或抗体有特异性的连接有可检测标记的另一种抗体来实现。此类ELISA称为“夹心法ELISA(sandwichELISA)”。检测还可以通过加入对预期抗原具有特异性的第二种抗体，然后加入对所述第二种抗体有结合亲和力的第三种抗体来实现，所述第三抗体与可检测标记相连。对ELISA技术的修改是本领域技术人员已知的。
竞争性ELISA也是可用的，其中测试样品与已知量的带标记抗原或抗体竞争结合。如下测定未知样品中反应物的量：在与已包被的孔一起孵育之前或过程中，将所述样品与已知的标记物质相混合。所述样品中反应物的存在减少了可用于与孔结合的标记物质的量，因此降低了最终的信号。
不论采用什么样的形式，ELISA都具有一些共同特征，例如包被、孵育或结合，清洗以除去非特异性结合的物质，和检测所结合的免疫复合物。
抗原或抗体还可以与固体支持物相连，例如以板、珠子、试纸、膜或者柱基质的形式，然后将待分析样品应用于已固定的抗原或抗体。在用抗原或抗体包被板时，一般将所述板的孔与所述抗原或抗体的溶液一起孵育过夜或一段时间。然后洗涤该板的孔，以除去不完全吸附的物质。然后用非特异性蛋白质“包被”孔剩余的可用表面，所述非特异性蛋白质相对于测试抗血清是抗原中性的。它们包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。所述包被使得该固定表面的非特异性吸附位点被封闭，因此减少了由抗血清非特异性结合到所述表面上造成的背景。
在ELISA中，更习惯使用第二或第三种检测方式，而不是直接检测。因此，在所述抗原或抗体与孔结合之后，用非反应性材料包被以减少背景，然后洗涤以除去未结合材料，在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下，所述固定表面与待检测的临床或生物样品接触。然后，对所述免疫复合物的检测需要带标记的第二种结合配体或抗体，或者与带标记的第三种抗体或第三种结合配体相连的第二种结合配体或抗体。
B.评估自身免疫应答或病症
除了使用蛋白质、多肽和/或肽来治疗或预防自身免疫病之外，本发明还考虑以多种方式使用这些多肽、蛋白质和/或肽，其包括检测自身抗原或自身免疫病症的存在，以诊断某些自身反应性细胞群体或病症的存在。根据本发明，检测自身反应性存在的方法包括从个体(例如从其血液、唾液、组织、骨、肌肉、软骨或皮肤)中获得样品的步骤。在分离样品之后，可实施利用本发明多肽、蛋白质和/或肽进行的诊断测定，以检测自身反应性的存在，用于在样品中测定这些物质的此类测定技术是本领域技术人员公知的，其包括例如四聚体测定、免疫测定、western印迹分析和/或ELISA测定的方法。
本文使用的短语“免疫应答”或其等同形式“免疫学应答”指发生针对自身抗原或自身抗原相关表位的细胞免疫应答(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)。细胞免疫应答由与I类或II类MHC分子相关的多肽表位呈递引发，其激活抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒T细胞。所述应答还可涉及其他组分的激活。
对于本说明书及所附权利要求而言，术语“表位”和“抗原决定簇”可互换使用，表示抗原上被B和/或T细胞应答或识别的位点。B细胞表位可由连续氨基酸或者由于蛋白质三级折叠而靠近的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂后仍保持存在，而由三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理后丧失。表位通常包括至少3个(更常见至少5个或8-10个)呈独特空间构象的氨基酸。确定表位空间构象的方法包括如X射线晶体学和二维核磁共振。参见，例如EpitopeMappingProtocols(1996)。CD8T细胞识别约9个氨基酸的连续表位，而CD4T细胞识别约13-15个氨基酸。可通过如下方法鉴定识别所述表位的T细胞：通过检测抗原依赖性增殖(如通过应答于表位而引发的T细胞的3H-胸苷掺入所确定的(Burke等，1994))的体外测定，通过抗原依赖性杀伤(细胞毒T淋巴细胞测定，Tigges等，1996)或者通过细胞因子分泌。可通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒T淋巴细胞)测定来确定细胞介导的免疫应答的存在情况。
如本文和权利要求中所使用的，术语“抗体”或“免疫球蛋白”可互换使用，来表示数类结构上相关蛋白中的任意种类，其起到动物或受体的免疫应答之一部分的功能，所述蛋白质包括IgG、IgD、IgE、IgA、IgM和相关蛋白。
任选地，自身抗原(或优选的自身抗原表位)可以与其他蛋白(例如MHC和MHC相关蛋白)化学缀合或表达成为融合蛋白。
本文使用的术语“免疫原性物质”或“免疫原”或“抗原”可互换使用，以描述能够在单独或者与佐剂联合或者在展示载体上施用给受体后诱导针对其自身的免疫应答的分子。
C.治疗方法
本发明的方法包括治疗由一种或多种自身抗原引起的疾病或病症。可给予本发明的免疫原性多肽，以在患有、怀疑患有自身免疫病症或疾病或者具有发生自身免疫病症或疾病风险的人中诱导或调节免疫应答。对于测试为自身免疫性阳性或者被认为具有发生此类病症或相关病症风险的个体，可应用该方法。
V.诊断和治疗靶标
本发明的实施方案可用于治疗或减轻多种免疫介导的疾病或自身免疫病，例如糖尿病、移植排斥等。“自身免疫病”包括由于针对个体自身的组织或器官而引起的疾病或病症，或者其表现或由其引起的病症。在一个实施方案中，它指由于产生对正常机体组织和抗原具有反应性的T细胞而导致或者加重的状况。自身免疫病或病症的实例包括但不限于：关节炎(类风湿性关节炎例如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎症性关节炎、退行性关节炎、II类胶原诱导的关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增殖性关节炎、银屑病关节炎、斯蒂尔病(Still’sdisease)、脊椎关节炎和青少年发病的类风湿性关节炎、骨关节炎、进行性慢性关节炎、关节炎变形、原发性慢性多发性关节炎(polyarthritischronicaprimaria)、反应性关节炎和僵硬性脊椎炎)，炎症性高增殖皮肤病，银屑病如斑块型银屑病、gutatte银屑病、脓疱型银屑病和指甲银屑病，遗传性过敏症(atopy)包括特应性过敏疾病例如花粉热和乔布综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、国民接触性皮炎、皮炎疱疹、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，X连锁高IgM综合征，变应性眼内炎性疾病，风疹例如慢性变应性风疹和慢性先天性风疹、包括慢性自身免疫性风疹，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年皮肌炎，毒性表皮坏死松解，硬皮病(包括全身性硬皮病)，硬化症例如全身性硬化、多发性硬化(MS)例如脊椎-眼部多发性硬化(spino-opticalMS)、原发进展型MS(PPMS)和复发缓解型MS(RRMS)、进展型全身性硬化、动脉硬化、动脉硬化、播散型硬化、共济失调型硬化、视神经脊髓炎(NMO)、炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病、自身免疫介导胃肠病、结肠炎例如溃疡性结肠炎、结肠炎溃疡、微小性结肠炎、胶原性结肠炎、结肠炎息肉、坏死性小肠结肠炎和透皮性结肠炎，以及自身免疫性炎性肠病)，肠炎症，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征包括成年或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎，葡萄膜全部或部分的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液病，类风湿性脊椎炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，如脑膜炎中的颅神经损伤，妊娠疱疹，阴囊瘙痒病，自身免疫性卵巢早衰，由于自身免疫状况导致的突发性听觉丧失，IgE介导的疾病例如过敏反应以及变应性及特应性鼻炎、脑炎例如拉斯马森脑炎(Rasmussen′sencephalitis)和边缘系统和/或脑干脑炎，葡萄膜炎例如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，带有和不带有肾病变综合征的肾小球肾炎(glomerulonephritis，GN)例如慢性或急性肾小球肾炎如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、先天性膜性GN或先天性膜性肾病、膜性或膜性增生性GN(membranousproliferativeGN，MPGN)包括I类和II类、以及快速进展型GN、增生性肾炎、自身免疫性多腺体内分泌衰竭、龟头炎包括浆细胞性局限性龟头炎、包皮龟头炎，离心性环形红斑，持久性色素异常性红斑，多形红斑，光泽苔藓，硬化萎缩性苔癣，慢性单纯性苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，板层状鱼鳞病，表皮松解性角化过度，癌前角化，坏疽性脓皮病，过敏性状况和应答，过敏反应，湿疹包括过敏性或遗传过敏性湿疹、干性湿疹、出汗障碍性湿疹和囊泡型掌跖湿疹，哮喘例如哮喘性支气管炎、支气管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的状况，抗外源抗原的免疫应答例如怀孕期间的胎儿A-B-O血型，慢性肺炎症性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼疮性肾炎、狼疮性脑炎、小儿狼疮、非肾源性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(systemiclupuserythematosus，SLE)例如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(neonatallupussyndrome，NLE)，和散播型红斑狼疮，青少年发病的(I型)糖尿病包括小儿胰岛素依赖型糖尿病(insulin-dependentdiabetesmellitus，IDDM)，以及成人发病的糖尿病(II型糖尿病)。还考虑了与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和延迟性超敏反应相关的免疫应答，结节病，肉芽肿包括淋巴瘤样肉芽肿、韦格纳肉芽肿(Wegener′sgranulomatosis)，粒细胞缺乏症，血管炎包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayashu)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎/结节性外周动脉炎)、微小多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、超敏血管炎、坏死性血管炎例如全身坏死性血管炎和ANCA相关性血管炎例如变应性肉芽肿血管炎或综合征(Churg-Strausssyndrome，CSS)和ANCA相关性小血管血管炎、颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，Coombs试验阳性贫血，先天性纯红细胞再生障碍性贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehemolyticanemia，AIHA)，艾迪生病，自身免疫性嗜中性白细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少症，与白细胞渗出有关的疾病，CNS炎性疾病，阿尔茨海默病，帕金森病，多器官损伤综合征例如继发于败血症、外伤或出血的那些，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基质膜病，抗磷脂抗体综合征，变应性神经炎，白塞病/综合征，Castleman综合征，Goodpasture综合征，Reynaud综合征，Sjogren综合征，史-约综合征，类天疱疮例如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、pemphigusmucus-membranepemphigoid和红斑型天疱疮)，自身免疫性多内分泌疾病，赖特尔病或综合征，热损伤，子痫前期，免疫复合物疾病例如免疫复合物性肾炎、抗体介导性肾炎，多发性神经病，慢性神经病例如IgM多发性神经病或IgM介导的神经病，自身免疫性或免疫介导的血小板减少例如先天性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura，ITP)包括慢性或急性ITP，巩膜炎例如先天性cerato-巩膜炎、表层巩膜炎，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退症，自身免疫性内分泌病包括甲状腺炎例如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或者亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺病，先天性甲状腺机能减退，格氏眼病，多腺体综合征例如自身免疫性多腺体综合征(或多腺体内分泌病综合征)，副癌综合征包括神经副癌综合征例如莱-伊二氏肌无力综合征或类重症肌无力综合征，僵人综合征，脑脊髓炎例如过敏性脑脊髓炎或脑脊髓炎过敏症和实验性变态反应性脑脊髓炎(experimentalallergicencephalomyelitis，EAE)，重症肌无力例如胸腺瘤相关重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，眼阵挛-肌阵挛综合征(opsoclonusoropsoclonusmyoclonussyndrome，OMS)，和感觉神经病，多病灶运动神经病，席汉氏症，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，巨细胞肝炎，慢性活跃性肝炎或自身免疫性慢性活跃性肝炎，淋巴细胞性间质性肺炎(lymphoidinterstitialpneumonitis，LIP)，闭塞性细支气管炎(非移植)vsNSIP，格林-巴利综合征，伯格氏病(IgA肾病)，先天性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性发热性嗜中性皮肤病，角层下脓疱病，暂时性棘层松解性皮肤病，肝硬化例如原发性胆汁性肝硬化和肝硬变，自身免疫性肠病综合征，腹腔病，口炎性腹泻(麸质肠病)，顽固性口炎性腹泻，先天性口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩恻索硬化(amylotrophiclateralsclerosis，ALS)(洛盖赫里格病)，冠状动脉疾病，自身免疫性耳病例如自身免疫性内耳病(autoimmuneinnereardisease，AIED)，自身免疫性听觉丧失，多软骨炎例如顽固性或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，科干综合征/非梅毒性角膜间质炎，面神经麻痹，Sweet病/综合征，自身免疫性酒糟鼻，带状疱疹相关疼痛，淀粉样变性病，非癌症淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞增多(例如温和性单克隆丙种球蛋白病和意义未明单克隆丙种球蛋白病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，MGUS))，外周神经病，副癌综合征，离子通道病例如癫痫、偏头痛、心律不齐、肌肉病、耳聋、盲、周期性麻痹和CNS的离子通道病，孤独症，炎症性肌病，局灶性或节段性或局灶节段性肾小球硬化症(focalsegmentalglomerulosclerosis，FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝病，纤维肌痛，多内分泌衰竭，施密特氏综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘疾病例如自身免疫性脱髓鞘疾病和慢性炎症性脱髓鞘多神经病，心肌梗塞后综合征，严重脱发(alopeciagreata)，完全脱发(alopeciatotalis)，CREST(calcinosis，Raynaud′sphenomenon，esophagealdysmotility，sclerodactylyandtelangiectasia)综合征(钙质沉着、雷诺现象、食道运动功能障碍、指端硬化)和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫性不育例如由于抗精子抗体所导致的，混合型结缔组织病，查格斯病，风湿热，习惯性流产，农民肺，多形红斑，心脏术后综合征，Cushing综合征，养鸟人肺，变应性肉芽肿性血管炎，良性淋巴脉管炎，奥尔波特综合征，肺泡炎例如过敏性肺泡炎和纤维性肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风病，疟疾，寄生虫病，例如利什曼病，kypanosomiasis，血吸虫病，蛔虫病，曲霉菌病，Sampter综合征，Caplan综合征，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维炎，弥漫性肺间质纤维化，肺间质纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久性隆起性红斑，胎儿有核红细胞增多症，嗜酸性筋膜炎，Shulman综合征，Felty综合征，丝虫病，睫状体炎例如变应性睫状体炎，异时性睫状体炎，虹膜睫状体炎(急性或慢性)，或Fuch睫状体炎，过敏性紫癜，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，埃可病毒感染，败血症，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症，细小病毒感染，风疹病毒感染，免疫接种后综合征，先天性风疹病毒感染，EB病毒感染，流行性腮腺炎，Evan综合征，自身免疫性性腺失效，Sydenham舞蹈症，链球菌感染后肾炎，血栓闭塞性脉管炎，甲亢，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞多肌疼，慢性过敏性肺炎，干燥性角结膜炎，流行性角结膜炎，原发性肾病综合征，微小病变肾病，良性家族病和缺血再灌注损伤，移植器官再灌注损伤，视网膜自身免疫性疾病，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气管/肺病，矽肺，口疮，口疮性口腔炎，动脉硬化，asperniogenese，自身免疫性溶血，Boeck病，冷球蛋白血症，掌腱膜挛缩症，endophthalmiaphacoanaphylactica，变应性肠炎，麻风结节性红斑，特发性面神经麻痹，慢性疲劳综合征，风湿热，Hamman-Rich病，感觉神经性听觉丧失，血红蛋白尿paroxysmatica，性腺机能减退，局限性回肠炎，白细胞减少症，感染性单核细胞增多，横贯性脊髓炎，原发性特发性粘液水肿，肾病，ophthalmiasymphatica，肉芽肿性睾丸炎，胰腺炎，急性多发性神经根炎，坏疽性脓皮病，亚急性甲状腺炎，获得性脾萎缩，良性胸肿瘤，白癜风，毒性休克综合征，食物中毒，与T细胞浸润有关的病症，白细胞黏附缺陷症，与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和延迟超敏相关的免疫应答，与白细胞浸润相关的病症，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基质膜病，变态反应性神经炎，自身免疫性多内分泌腺疾病，卵巢炎，原发性粘液水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌腺衰竭，I型自身免疫性多腺体综合征，成年特发性甲状旁腺功能减退症(AOIH)，心肌病例如扩张性心肌病，后天性大疱性表皮松解(epidermolisisbullosaacquisita，EBA)，血色素沉着症，病毒性心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛窦炎，额窦、颌窦或蝶窦鼻窦炎，嗜酸性粒细胞相关疾病例如嗜酸性粒细胞增多，肺浸润嗜酸性粒细胞增多，嗜酸性粒细胞增多肌疼综合征，Loffler综合征，慢性嗜酸性粒细胞肺炎，热带嗜酸粒细胞增多症，支气管肺炎曲霉病，曲霉肿，或含嗜酸性粒细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊柱关节病，多内分泌腺自身免疫性疾病，硬化性胆管炎，巩膜，巩膜外层，慢性粘膜皮肤念珠菌病，Bruton综合征，婴儿暂时性丙种球蛋白血症，Wiskott-Aldrich综合征，共济失调毛细血管扩张综合征，血管扩张，与胶原疾病相关的自身免疫病，风湿病，神经病，淋巴腺炎，血压应答降低，血管功能障碍，组织损伤，心血管缺血，痛觉过敏，肾缺血，脑缺血，和血管形成有关的疾病，过敏超敏疾病，肾小球肾炎(glomerulonephritides)，再灌注损伤，缺血性再灌注疾病，心肌或其他组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎症性皮肤病，具有急性炎症性组分的皮肤病，多器官衰竭，大疱性疾病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎症疾病，眼或眼眶炎症性疾病，粒细胞输注相关综合征，细胞因子诱导毒性，发作性睡病，急性重症炎症，慢性顽固性炎症，肾盂肾炎，动脉内增生，胃溃疡，心脏瓣膜炎和子宫内膜异位。
VI.实施例
为说明本发明的多种实施方案，给出了下述实施例，其不意为以任何方式限制本发明。本领域技术人员容易理解，本发明非常适于实现所述目的，获得所述结果和优点及其固有的目的、结果和优点。本实施例与其中所述的方法代表目前优选的实施方案，其为示例性的，不意为对本发明范围的限制。如权利要求书范围限定的本发明构思所涵盖的其改变和其他用途对本领域技术人员来说是很明显的。
实施例1
通过用肽/MHC包被的纳米球进行处理实现的T1D保护
通过用NRP-V7/Kd单体包被的超顺磁性纳米球进行处理来实现的糖尿病保护。为了研究NRP-V7/Kd包被的纳米球是否在体内致耐受，通过数次静脉内注射小体积纳米球(5μL，带有0.6μg的NRP-V7，每3天1次)来处理8.3-TCR-转基因NOD小鼠(下文也被称为8.3-NOD或Vα17.4+TCR-TG小鼠)。设想这些小鼠的转基因高亲合力IGRP206-214反应性脾CD8+T细胞群会被显著清除。还设想所述处理会使得未清除的CD8+T细胞不应答。
为了研究“多重化”的有效性，用6种不同的肽/MHC单体包被纳米球。用这些纳米球、以对照肽(TUM)/Kd包被的纳米球或以NRP-V7/Kd包被的纳米球处理野生型NOD小鼠群体。设想以NRP-V7/Kd包被的纳米球处理的NOD小鼠(每2-3周一次)将得到对T1D的高度保护，而用未包被的纳米球、亲合素-生物素包被的纳米球、TUM/Kd-包被的纳米球或仅以NRP-V7肽(Han等2005)处理的小鼠没有得到对T1D的保护。
通过用NRP-V7/Kd单体包被的纳米球处理来全身性扩增低亲合力克隆型。使用放射性标记的纳米球进行研究以确定它们的组织分布。设想在所检测小鼠的所有年龄下都将具有全身组织分布性。还设想用纳米球处理小鼠不导致由刺激多种免疫细胞类型(包括NRP-V7反应性CD8+T细胞)所导致的细胞因子血清水平提高。
认为在随访期(32周)结束时，与用对照纳米球处理的年龄匹配非糖尿病动物相比，用NRP-V7/Kd包被的纳米球处理的小鼠中循环及胰岛内NRP-V7/Kd四聚体+CD8+细胞群将显著提高。还设想NRP-V7/Kd纳米球处理小鼠的胰岛内CD8+T细胞结合NRP-V7/Kd四聚体的亲合力比对照小鼠胰岛中所存在的那些低得多(更高的Kd)，表明所述纳米球处理以剂量依赖性方式通过牺牲其致病性高亲合力对应物为代价刺激抗致病性低亲合力克隆型的扩增。
为了研究NRP-V7/K/Kd包被纳米球的识别和摄入，本发明人评估了表达转基因NRP-V7反应性TCR的NOD小鼠及野生型非转基因NOD小鼠中不同脾细胞亚群中绿色荧光的存在情况(与所述肽-MHCnp复合物中的亲合素分子结合)。设想在NRP-V7/Kd纳米球注射后，仅在TCR转基因小鼠的CD8+T细胞亚群中检测到绿色荧光，并在非转基因小鼠的CD8+T细胞亚群中检测到程度低得多的绿色荧光。还认为在任一类型小鼠的脾CD4+T、B、CD11b+或CD11c+细胞亚群中均未检测到可检出的绿色荧光积累。
由次要自身抗原性肽/MHC(DMK138-146/Db)复合物包被的纳米球的抗致糖尿病特性。本发明人将研究，上述处理途径的保护作用是NRP-V7反应性CD8+T细胞(NOD小鼠中占优势的自身反应性T细胞亚群)的独特性质，还是也适用于其他次要自身抗原性特异类型的现象。为此，用来源于另一种自身抗原的肽包被的珠子处理小鼠，所述自身抗原通过Db呈递，并被小得多的致糖尿病自身反应性CD8+T细胞群所靶向(强直性肌营养不良激酶(DystrophiaMyotonicaKinase，DMK)残基138-146；本文称其为“DMK138-146/Db”)(Lieberman等，2004)。设想用DMK138-146/Db包被的纳米球处理NOD小鼠将导致循环中、脾和胰岛内的DMK138-146/Db反应性CD8+T细胞显著扩增，并提供显著的糖尿病保护。还设想体内的T细胞扩增是抗原特异性的，因为DMK138-146/Db包被的纳米球可能不扩增NRP-V7反应性CD8+T细胞，并且NRP-V7/Kd包被的纳米球可能不扩增DMK138-146/Db反应性T细胞。
在用NRP-V7/Kd或DMK138-146/Db包被的纳米球处理的小鼠中其他IGRP自身反应性CD8+T细胞特异性募集到胰岛的情况削弱。本发明人将研究纳米球所扩增低亲合力NRP-V7和/或DMK138-146/Db反应性CD8+T细胞的募集是否削弱其他β细胞自身反应性T细胞特异性募集到胰岛。这通过比较用对照、NRP-V7/Kd或DMK138-146/Db包被的纳米球处理小鼠的胰岛相关CD8+T细胞与一组76种不同IGRP表位以及DMK138-146的应答来进行。预期用NRP-V7/Kd包被的和DMK138-146/Db包被的纳米球处理的小鼠胰岛相关CD8+T细胞应答于NRP-V7和DMK138-146分别比从对照小鼠中所分离细胞产生明显更多的IFN-γ。设想与用对照纳米球处理的小鼠相比，用NRP-V7/Kd或DMK138-146/Db包被纳米球处理的小鼠的胰岛相关CD8+T细胞能够引发显著IFN-γ应答的表位数量显著减少，表明募集和/或积累受损。
认为NRP-V7/Kd和DMK138-146/Db包被的纳米球在新发病糖尿病NOD小鼠中诱导高比例的糖尿病好转。进行研究以调查纳米球治疗在新诊断的糖尿病小鼠中恢复正常血糖的能力。每周两次监测小鼠群体的血糖水平，判定≥10.5mM血糖为高血糖。使小鼠随机接受TUM/Kd包被的纳米球或NRP-V7/Kd包被的纳米球(每周注射一次，共两次)。每天一次对出现糖尿的小鼠皮下施用半个单位的胰岛素，以减少β细胞应激，并促进β细胞再生。另外的小鼠群体接受DMK138-146/Db包被的纳米球。用单克隆抗CD3抗体(20μg/天，共5天)处理作为阳性对照，其已在不同研究中显示出诱导不同比例动物的稳定好转。设想用NRP-V7/Kd包被的纳米球处理的小鼠中有大多数在处理5-12周之内将变为正常血糖。类似地，还设想用DMK138-146/Db包被的纳米球处理的小鼠中有大多数将变为正常血糖。还预期接受对照TUM/Kd-包被的纳米球的小鼠中有大多数将发展成明显的高血糖
为了研究在糖尿病小鼠中治疗的作用是否是长效的，在连续4周正常血糖后撤除处理，并对小鼠的糖尿病复发进行监测。在治疗撤除时、4周后以及高血糖复发时，评估该处理对循环中四聚体阳性群体规模的作用。设想在处理停止4周后，循环中四聚体反应性T细胞群规模减小。在这种情况下，内源性自身抗原(即在糖尿病前动物中)或者由纳米球加强注射(即在β细胞量严重减少的糖尿病动物中)对所扩增低亲合力自身反应性T细胞群的再激活可能是长期保护所必需的。
设想在治愈小鼠以及糖尿病小鼠和非糖尿病的未处理小鼠中进行的腹膜内葡萄糖耐量测试(Intraperitonealglucosetolerancetests，IPGTT)将显示前者具有与非糖尿病未处理动物中所示基本上相同的葡萄糖耐受曲线，并且显著优于糖尿病小鼠中的相应曲线。另外，认为治愈动物的餐后血清胰岛素水平与非糖尿病未处理小鼠中所见的水平是统计学相当的，并显著高于糖尿病未处理动物中的水平。
研究肽/MHC包被的纳米球是否可有效“区分”高亲合力和低亲合力自身反应性CD8+T细胞。大多数IGRP206-214反应性CD8+细胞利用CDR3恒定的Vα17-Jα42链，而不是异源VDJβ链。糖尿病发病过程中此T细胞亚群的“亲合力成熟”与三种不同Vα17元件使用的改变有关。这3种不同的Vα元件提供了不同的配体结合亲合力(Vα17.5＞Vα17.4＞Vα17.6)，其在单TCRβ链背景下表达3种不同CDR3恒定Vα17-Jα42链的TCRαβ-转染体研究中得到确认(Han等，2005)。为了研究肽/MHC包被的纳米球是否确实可以差异靶向以不同亲合力识别配体的T细胞，评估NRP-V7/Kd包被纳米球诱导CD8分子在这些转染体上“加帽”的能力。设想与Vα17.4+或Vα17.6+细胞相比更多的Vα17.5+细胞在与NRP-V7/Kd包被的纳米球一起孵育5分钟后形成帽。这些结果表明，NRP-V7/Kd包被的纳米球确实可以区分高亲合力和低亲合力T细胞，并为这些纳米球为何优先清除未刺激的高亲合力克隆型提供了解释。
表达低亲合力Vα17.6/8.3βTCR的CD8+细胞是抗致糖尿病的。为了研究低亲合力自身反应性CD8+T细胞是否具有体内抗致糖尿病性质，将低亲合力IGRP206-214反应性Vα17.6/8.3βTCR在NOD小鼠中转基因表达(本文中称其为“Vα17.6+”，其亲合力比8.3-TCR(Vα17.4+)低～10倍，Teyton和Santamaria，未发表数据)。已显示，此TCR促进CD8+细胞的正选择，但是明显少于8.3-TCR(Vα17.4+)(Han等，2005)。结果，Vα17.6+TCR-TG小鼠含有比Vα17.4+TCR-TG小鼠少的NRP-V7四聚体反应性CD8+胸腺细胞和脾细胞。另外，在体外肽刺激后，来自Vα17.6+TCR-TG小鼠的所述四聚体+(高和低)CD8+细胞比来自Vα17.4+TCR-TG小鼠的那些细胞分泌的IFN-γ(和IL-2)少，并且其低效地杀伤NRP-V7脉冲刺激的RMA-SKd靶标，这与它们对配体的低亲合力相一致(Han等，2005，数据未显示)。最重要的是，这些小鼠几乎完全得到针对糖尿病(70只雌鼠中仅有2只发生T1D)和胰岛炎的保护[在Vα17.6+和Vα17.4+TCR-TG小鼠中得分分别是＜0.4和＞3(最大值是4)(P＜0.012)](图1A和图1B)。
这与表达无关非自身反应性TCR的NOD小鼠完全相反，所述TCR识别LCMV表位(LCMVTCR-TGNOD小鼠)。如之前Serreze等(2001)所报道的，并且由本文确认，这些小鼠基本上如野生型NOD小鼠一样发生T1D，将内源性IGRP206-214反应性CD8+细胞募集到胰岛(在Vα17.6+TCR-TG小鼠胰岛中完全不存在)(图1C)。因此，与Vα17.4+和LCMVTCR(分别为前致糖尿病性和神经性)不同，Vα17.6+TCR看来具有抗致糖尿病性质。
尽管这些Vα17.6+TCR-TG小鼠的大多数TGT细胞微弱结合四聚体或者根本不结合，但是一部分离开胸腺的所述细胞以明显高的亲合力(即高mfi)结合四聚体(图2A)。本发明人怀疑这些小鼠的四聚体-低(lo)和四聚体-阴性CD8+T细胞来源于表达TGTCR但发生了对内源TCR(即TCRα链)的正选择的CD4+CD8+胸腺细胞。另一方面，所述四聚体-高(hi)细胞来源于仅表达TGTCRαβ链的CD4+CD8+胸腺细胞，因为它们对肽/MHC的低亲合力，如果它们表达比正常水平高的TGTCR，那么其仅可发生正选择。该解释得到了下述结果的支持：在RAG-2-/-背景中表达Vα17.6+TCR的小鼠中，成熟的唯一细胞是以高亲合力与四聚体结合的细胞(图2B)。重要的是，这两种类型的RAG-2-/-TCR-TG小鼠以类似的发病率发生糖尿病(图3)。因此，本发明人怀疑，在RAG-2+Vα17.6TCR-TG小鼠中成熟的四聚体-低和四聚体-CD8+T细胞显示抑制其四聚体-高(其在RAG-/-TCR-TG小鼠中造成糖尿病)对应物的致糖尿病潜力。这些结果在带有内源TCR-Cα缺陷的Vα17.6TCR-TG小鼠群中重现，所述缺陷阻止了内源(即非转基因)TCRα链的表达(图4A和4B)。
Vα17.6+(非Vα17.4+)TCR-TG小鼠自发产生具有免疫抑制活性的记忆CD8+细胞群。对Vα17.6+TCR-TG小鼠和TCR-Cα-缺陷型Vα17.6TCR-TG小鼠的不同淋巴器官中所含四聚体阳性CD8+T细胞的细胞荧光测量研究表明，在脾、淋巴结以及尤其在骨髓(已知记忆T细胞储库)中，CD44hi和CD44hiCD122+CD8+细胞群体相比于Vα17.4+TCR-TG小鼠增大(图5A和5B)。重要的，这主要发生在四聚体-低中，却不发生在不含有CD122+细胞的四聚体-高亚群中(图5C)。这些细胞表达中央记忆淋巴细胞和效应子记忆淋巴细胞上的所述标志物(图5D)，其位于且主要发现于外周淋巴器官而不是胸腺中，表明其外周来源(图5E)。另外，BrdU掺入测定表明它们体内增殖(图5F)。这些记忆样细胞在功能上明显表现为“记忆”T细胞，如纯化的脾Vα17.6+(非Vα17.4+)TCR-TGCD8+细胞在APC和抗原不存在时应答于IL-2或IL-15而剧烈增殖(图5G)。另外，在体外用抗原刺激后，它们快速产生IFN-γ(图5H和5I)。但是，在体外抗原刺激后，它们既不增殖也不产生白介素-2(图5J)。此功能谱非常类似于调节性(抑制性)CD4+CD25+T细胞亚群。综上，这些数据表明，Vα17.6+(非Vα17.4+)TCR-TGCD8+细胞变成长寿命记忆T细胞(遇到一种或多种抗原后)的能力增加，推测能够应答于动态平衡信号而不定期存活，甚至是在抗原不存在时也是如此。
这些结果使本发明人怀疑，这些记忆低亲合力T细胞的优秀的动态平衡“适应性”(否则无法杀伤β细胞)为它们带来抗致糖尿病活性(即通过提供相对于其较高亲合力但大部分为未刺激β细胞杀伤克隆型的竞争优势，和/或通过抑制它们的活化)。为了评估后者，评估纯化CD122+和CD122-Vα17.6+TCR-TGCD8+T细胞抑制来自Vα17.4+TCR-TGNOD小鼠的CFSE标记的脾CD8+T细胞增殖的能力。如图6所示，CD122+(非CD122-)Vα17.6+TCR-TGCD8+T细胞几乎完全抑制其较高亲合力未刺激T细胞对应物的增殖。
与Vα17.6+TCR-TGNOD小鼠中自发扩增的记忆(CD122+)低亲合力自身反应性CD8+T细胞群为抗糖尿病的想法相一致，用NRP-V7脉冲刺激的DC、抗CD40的拮抗型mAb或者抗4-1BB的拮抗型mAb全身性(静脉内)处理Vα17.6+和Vα17.4+TCR-TG小鼠(以增强CD8+T细胞活化/存活)在Vα17.4+TCR-TGNOD小鼠中诱导糖尿病快速发病，但是不能在Vα17.6+TCR-TG小鼠中引发疾病(表4)。
表4、在17.4α/8.3β-TGNOD小鼠中促进记忆T细胞发育和扩增的处理促使糖尿病急性发病，但在17.6α/8.3β-TGNOD小鼠中则不然。
以3-4天间隔腹膜内注射3次抗CD40mAb或抗4-1BBmAb100μg
2次注射100μg/mlNRP-V7脉冲刺激的106LPS-活化的骨髓来源DC
在最后一次注射后跟踪观察小鼠至少8周以监测糖尿病
CD122+Vα17.6+TCR-TGCD8+T细胞抑制同源和非同源致糖尿病T细胞应答的能力(即针对自身抗原性肽，而不是这些抑制性T细胞的靶标自身抗原性肽——IGRP206-214-)使得本发明人怀疑它们可能是通过靶向抗原呈递细胞(APC)实现其抑制活性。细胞毒性(51铬-释放)测定利用肽脉冲刺激的DC作为靶细胞，CD122+或CD122-Vα17.6+和CD122-Vα17.4+TCR-TGCD8+T细胞作为效应细胞，显示前者能够体外特异性裂解NRP-V7脉冲刺激的DC(图7A)，而后者不能。本发明人确认，在体内也是这样的。它们将相同量的NRP-V7脉冲刺激的和TUM脉冲刺激的B细胞(分别带有高浓度或低浓度染料CFSE标记)注入Vα17.6+TCR-TG和Vα17.4+TCR-TG小鼠中，一天后处死宿主，以研究哪种细胞在转移后存活。如图7B所示，NRP-V7脉冲刺激的B细胞仅仅在Vα17.4+TCR-TG小鼠中存活，而用阴性对照肽TUM脉冲刺激的B细胞在两种TCR-TG小鼠中都存活。在使用DC而不是B细胞作为APC时，得到基本上相同的结果(图7B)。这些数据表明，低亲合力CD122+Vα17.6+TCR-TGCD8+T细胞通过杀伤载有自身抗原的APC来抑制同源和非同源致糖尿病T细胞应答。
研究在野生型NOD小鼠中NRP-V7/Kd包被的纳米球是否诱导低亲合力(四聚体-中等)记忆自身反应性CD8+细胞的扩增。设想用肽/MHC包被的纳米球处理NOD小鼠将导致高亲合力克隆型消失，低亲合力CD8+T细胞扩增并募集，其他IGRP表位反应性特异性向胰岛的募集减少，以及保护免受糖尿病。
为了评估野生型NOD小鼠中珠子扩增的CD8+T细胞是否是长寿命低亲合力记忆T细胞，本发明人分析了用NRP-V7/Kd包被的纳米球处理的小鼠脾和骨髓中NRP-V7/Kd四聚体阳性CD8+T细胞中记忆标志物(CD44和CD122)的存在情况。设想这些小鼠的脾和骨髓中所含四聚体阳性细胞的扩增群体含有百分比增加的CD44hi和CD44hiCD122+CD8+T细胞，表明NRP-V7/Kd纳米球处理增加了四聚体+CD44hi和四聚体+CD44hiCD122+T细胞群的大小。
设想通过用NRP-V7/Kd包被纳米球的体内治疗扩增的记忆样T细胞的表现类似于在Vα17.6+TCR-TG小鼠中自发积累的记忆CD122+Vα17.6+TCR-TGCD8+T细胞：它们都不产生IL-2也不增殖，但是应答于体外抗原刺激产生高水平的IFN-γ。还考虑在用抗CD3mAb和IL-2激活后，这些记忆样T细胞在体外有效抑制CFSE标记的应答Vα17.4+TCR-TGCD8+T细胞的增殖。
肽/MHC包被的纳米球扩增之前存在的低亲合力记忆T细胞。认为肽/MHC包被的纳米球不从头产生记忆T细胞，而是扩增之前存在的记忆T细胞群。设想用TUM/Kd包被的纳米球处理NOD小鼠将不诱导TUM反应性CD8+T细胞的全身性扩增。还设想用NRP-V7/Kd包被的纳米球处理B10.H2g7小鼠在所有淋巴器官中将不诱导NRP-V7/Kd四聚体+CD8+T细胞亚群的显著扩增，并且纳米球处理的NOD小鼠中四聚体反应性CD8+T细胞的全身性扩增在糖尿病发病时开始比在糖尿病前阶段开始明显更加有效。还认为，不像未刺激CD8+T细胞(在共刺激不存在时，TCR连接后通常发生凋亡)，记忆CD8+T细胞对生长来说与共刺激无关。
为了正式研究上述假说，本发明人确定了IGRP206-214/Kd包被的纳米球是否可在表达突变体形式IGRP的基因靶向NOD小鼠中扩增IGRP206-214/Kd反应性CD8+T细胞，在所述突变体形式IGRP中IGRP206-214的两个TCR接触残基被丙氨酸所替换(K209A和F213A)。使用快速同源法(speed-congenic)将靶向等位基因(本文称之为FLEX1或NOD.IGRPK209A/F213A KI/KI)与NOD背景(从129)回交，以确保NOD等位基因在所有Idd基因座的纯合性。因为在这些基因靶向小鼠中成熟的CD8+T细胞从未在体内暴露于IGRP206-214，所以这些小鼠无法自发产生记忆IGRP206-214/Kd反应性CD8+T细胞。尽管这些小鼠发生糖尿病和胰岛炎(未显示)，它们的胰岛相关CD8+T细胞识别IGRP中的表位，但是它们完全不含有IGRP206-214反应性CD8+克隆型。考虑用优化剂量IGRP206-214/Kd包被纳米球处理的FLEX1-纯合NOD小鼠在其淋巴器官中不含有扩增的IGRP206-214/Kd反应性CD8+T细胞群。这表明肽/MHC包被的纳米球扩增之前存在的具有抑制性能的记忆T细胞群，而不能从头产生记忆T细胞。
因为低亲合力克隆型(即在Vα17.6+TCR-TG小鼠中)显得相比于其高亲合力对应物(即在Vα17.4+TCR-TG小鼠中)在糖尿病发病过程中更有效地产生记忆T细胞后代，所以认为肽/MHC包被的纳米球通过诱导清除未刺激高亲合力克隆型和扩增之前存在的记忆低亲合力克隆型小群体来发挥作用。
实施例2测试用人I型糖尿病相关肽/HLA复合物包被的铁氧化物纳米球恢复正常血糖的能力
可用于预定研究的表达HLA转基因的“人源化”小鼠和肽/HLA复合物。如上所述，来源于胰岛素和IGRP的肽是野生型NOD小鼠中CD8+T细胞的主要靶标。在“人源化”HLA-转基因NOD小鼠中评估在糖尿病发生过程中人MHC分子(人白细胞抗原(HumanLeukocyteAntigen，HLA))对来源于这两种自身抗原的肽的呈递。研究开始集中于HLAA＊0201，它是在某些种族内几乎50％的人表达的MHC分子。此研究利用了称为NOD.β2mnull.HHD的小鼠，其缺少小鼠β2巨球蛋白基因且表达嵌合单链构建体HHD(Pascolo等，1997)。此构建体编码人β2m，其与人HLA-A＊0201的α1和α2结构域以及小鼠H-2Db的α3、跨膜和胞质结构域共价连接。尽管该品系仅表达HLA-A＊0201而不表达内源小鼠I类MHC分子，但是其为糖尿病易感性的，30周龄时有55％的雌鼠患病(Takaki等，2006)。与HLA-A＊0201结合的人IGRP两个表位(hIGRP228-236和hIGRP265-273)被这些小鼠的胰岛相关CD8+T所识别，从NOD.β2mnull.HHD小鼠的胰岛分离的CD8+T细胞对人HLA-A＊0201阳性胰岛具有细胞毒性(Takaki等，2006)。使用这些肽之一制备肽/HLA-A＊0201四聚体。为了促进这些四聚体与小鼠CD8分子的结合，将HLA-A＊0201复合物的α3(CD8结合)结构域替换为小鼠H-2Kb分子的该结构域。这些研究的结果已经确认了这些小鼠用于鉴定HLA-A＊0201限制性T细胞以及可能与人T1D相关的β细胞自身抗原(Takaki等2006)的用途。根据目前的公开内容，可以从T1D患者中鉴定被HLA-A＊0201限制性T细胞靶向的人源肽。另外，本发明人制备了表达HLA-A＊1101，HLA-B＊0702或HLA-Cw＊0304的NOD小鼠。通过将这些小鼠与NOD.β2mnull.hβ2m品系杂交，也将它们的β2m替换成人β2m(Hamilton-Williams等，2001)。所有三种HLA转基因表达良好，所有三种HLA转基因品系都是糖尿病易感性的。综上，来自这些“人源化”动物的HLA代表四种不同HLA超型(分别为HLA-A2，HLA-A3，HLA-B7，和HLA-C1)(Sidney等，1996；Doytchinova等，2004)。根据所检测的种族，HLA-A＊1101、HLA-B＊0702或HLA-Cw＊0304等位基因的基因频率可以分别高达23％，11％，或10％(Cao等，2001)。根据考虑的种族，当靶向全部四种超型时，人群的覆盖率可以超过90％(Sidney等，1996；Doytchinova等，2004；Cao等，2001)。这一因素对于将这些研究应用于人类来说是非常重要的。这些动物以及上文所述NOD.β2mnull.HHD品系可用于进一步研究。
在此实施例中，本发明人设计了怎样将野生型NOD小鼠中的结果转移到“人源化”HLA-转基因NOD小鼠上。目标是研究由多种不同肽/HLA复合物包被的纳米球的处理是否可保护该小鼠免受糖尿病以及是否恢复新诊断患糖尿病对应小鼠的正常血糖水平，所述复合物靶向与人T1D相关的自身反应性CD8+T细胞群。在这里，本发明人提供了一种转移方法，以鉴定用在人T1D中的T1D相关肽/HLA组合。具体地，本发明人考虑，由不同T1D相关自身抗原肽/HLA-A＊0201复合物包被的纳米球会在NOD.β2mnull.HHD小鼠(表达HLA-A＊0201)中提供糖尿病保护，并治愈T1D。本领域技术人员可使用本公开内容，以用于与其他自身免疫病相关的其他表位，其中使用类似于在“人源化”HLA-转基因小鼠中由其他HLA分子呈递给胰岛相关CD8+T细胞的胰岛素和/或IGRP表位所用的组合物和方法，以包括其他组合物和方法。本领域技术人员能够鉴定最低治疗条件和将提供最大治疗益处的肽/HLA复合物类型，以及治疗前存在记忆低亲合力CD8+T细胞对治疗成功的必要性，和鉴定覆盖尽可能多的不同种族个体的其他肽/HLA组合。
纳米球的合成。基本如前所述(Moore等，2004)在物理和化学水平上合成并表征纳米球，不同在于使用生物素化肽/HLA-A＊0201单体。所述复合物中的MHC分子由人β2微球蛋白和嵌合形式人HLA-A＊0201构成，其中α1和α2结构域与小鼠H-2Kb的α3结构域融合(以促进小鼠CD8分子的识别)。作为自身抗原肽，可使用多种胰岛素和IGRP衍生物(例如hInsB10-18，hIGRP228-236和hIGRP265-273)，其已显示出在HLA-A＊0201背景下被胰岛相关CD8+T细胞识别。生物素化肽/HLA-A＊0201单体以4摩尔生物素/1摩尔亲合素的比例添加。在24小时中在4℃缓慢搅拌下(10rpm)分多次添加生物素化蛋白(约0.4摩尔生物素/亲合素)。所得探针在磁分离柱上纯化(MiltenyBiotec)。将由与HLA-A＊0201分子复合的无关HLA-A＊0201结合肽组成的单体用于合成阴性对照探针。测量纳米球尺寸、弛豫(每mM松弛速率的改变)、生物素结合位点数以及铁和蛋白含量。
纳米球的施用。用各种上文所述不同肽/HLA复合物或阴性对照肽(流感)/HLA复合物包被的纳米球处理一群10-15只雌性NOD.β2mnull.HHD小鼠(0.01，0.05，0.1，0.5和1μg肽当量，从4至30周龄每3周1剂，或者10周龄开始连续5周，2剂/周)。通过用抗CD8mAb和肽/MHC四聚体对血液单核细胞染色来记录抗原特异性CD8+T细胞的外周扩增(在治疗开始前和治疗撤除时)。在高血糖发生时或者在研究结束时处死小鼠。通过多色流式细胞术研究各个小鼠的不同淋巴器官(脾、淋巴结)、骨髓(记忆T细胞的已知储库)、肝脏、肺和胰岛中中央和/或效应记忆(CD69-，CD44hi，CD62Lhi或CD62Llo，CD122+，Ly6C+)四聚体+CD8+T细胞的存在情况。如(Han等，2005；Amrani等，2000)所述测定四聚体-结合亲合力。本发明人考虑，该处理诱导低亲合力中央和效应记忆四聚体+CD8+细胞的全身性扩增，并优先(但是不是专门的)在骨髓、胰腺淋巴结(PLN)和胰岛中积累这些T细胞。
多剂肽/MHC复合物的施用。在另一个研究中，用1、2、3或4次有效剂量注射来处理小鼠组，本发明人设想其类似于在其他研究中显示疗效的所有那些复合物(在4、7、10和13周时)。预计保护会需要一剂或多于一剂(以扩增所述记忆低亲合力T细胞群至高于保护阈值)，所扩增的四聚体+CD8+记忆T细胞群逐渐从循环中消失并积累在骨髓、PLN和胰岛中。
在高血糖发病时肽/MHC复合物的施用。在高血糖发病时(＞10.5mM/l)用更激进的纳米球处理方案(1-5μg肽当量，一周两次，5周)处理小鼠。阴性对照和阳性对照分别接受由无关肽/HLA复合物或抗CD3mAb包被的纳米球(每天静脉内注射20μg，5天(Haller，2005))。在处理临开始之前对小鼠取血，以评估循环中四聚体阳性CD8+T细胞的基线百分比。在血糖值稳定于＜10mM/l至少4周时，认为T1D好转，此时撤除处理。再次对小鼠取血，以确认存在循环中四聚体阳性CD8+T细胞群的显著扩增。跟踪观察动物至少另外8-12周，以确定稳定好转。在观察期结束时处死小鼠，以建立不同淋巴器官和非淋巴器官中扩增的四聚体阳性CD8+T细胞群的长期存留。还收获胰腺组织用于组织学分析。预计长期好转与不具有单核细胞浸润的许多小胰岛的存在有关。也就是说，与前糖尿病小鼠中所述处理预计促进保护性记忆T细胞进占炎症胰岛的情况不同，糖尿病小鼠中的处理预计促进保护性记忆T细胞在胰腺淋巴结(除了其他记忆T细胞储库之外)而不是胰岛中的积累(猜测新生胰岛缺乏炎性潜力)。
肽/HLA包被的纳米球通过诱导未刺激高亲合力克隆型的清除而发挥作用。本发明人设想，在T1D发展过程中低亲合力自身反应性CD8+T细胞倾向于以记忆细胞的形式积累(少量)，肽/HLA包被的颗粒通过诱导清除未刺激高亲合力克隆型(由于没有共刺激的TCR引发)以及扩增之前存在的记忆低亲合力克隆型小群体(与共刺激无关)而发挥作用。这部分地来自以下观察：用无关肽(来自肿瘤抗原TUM/H-2Kd)复合物处理小鼠不诱导TUM/Kd四聚体反应性CD8+T外周扩增至高于背景(参见上文)。然后，这些记忆低亲合力自身反应性CD8+细胞通过竞争刺激源(即DC上的抗原/MHC、细胞因子等)而抑制其未刺激高亲合力(猜测较不适应)对应细胞的活化。事实上，这在记忆细胞明显可有效地与未刺激T细胞竞争动态平衡信息(即IL-15)的其他系统中很明显(Tan等，2002)。通过稳定接触PLN中载有自身抗原的DC，这些优势记忆低亲合力克隆型还会抑制其他自身反应性T细胞类型特异性的活化。
肽/HLA包被纳米球对T细胞扩增(和抗致糖尿病活性)的实现需要内源靶标自身抗原在β细胞中表达。内源靶标自身抗原的表达被认为是诱导记忆低亲合力自身反应性CD8+T细胞群(其接着被纳米球处理所扩增)形成的刺激来源。IGRP缺陷将被引入NOD.β2mnull.HHD小鼠中。用hIGRP228-236(与mIGRP228-236交叉反应)和hIGRP265-273(同mIGRP265-273)/HLA-A＊0201包被的纳米球处理这些小鼠(Takaki等，2006)。用最优剂量的两种IGRP/HLA复合物包被的纳米球处理NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD小鼠。本发明人考虑所述治疗不会诱导相应hIGRP肽/HLA-反应性CD8+细胞的扩增/募集。
如果IGRP表达对于糖尿病发展来说不是必要的(已知缺少IGRP表达不致死，如大鼠就不表达它)并且小鼠自发发生糖尿病，那么还预计所述纳米球治疗不会保护小鼠免受T1D(将没有记忆IGRP反应性CD8+T细胞)。相反，认为用由HLA-A＊0201和胰岛素表位的复合物包被的纳米球进行处理会诱导相应记忆T细胞群的扩增，并且会具有保护性，因为所述小鼠会持续表达胰岛素。
待测试的纳米球类型可能不会在所有小鼠中诱导显著的T细胞扩增。这有可能取决于在治疗开始前相应T细胞群之前是否经过体内引发。研究用多种不同纳米球种类的组合处理的其他小鼠群可能是有用/必要的。显然，与我们的预测相反，可以想象纳米球处理可能能够诱导从头形成记忆低亲合力T细胞群。但是，在这种情况下，本发明人设想这些细胞不会是保护性的，因为它们将不能在所处理的NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD小鼠中将内源IGRP/HLA-A＊0201复合物结合到DC上。
表达hIGRP的小鼠。本发明人已经建立了数个表达由大鼠胰岛素启动子驱动的人IGRP转基因的小鼠品系，并且通过实时RT-PCR比较了每个品系中人转基因的表达水平与内源mIGRP编码基因座的表达水平。尽管所述转基因的表达水平在不同品系间差异很大，但是在同一品系的不同个体之间表达水平是一致的。在这些品系之一中(#1114)，hIGRP表达水平与mIGRP相当。
本发明人将此RIP-hIGRP转基因引入NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD小鼠和hβ2m/HLA-A＊1101、HLA-B＊0702或HLA-Cw＊0304转基因NOD.β2mnull.IGRPnull小鼠，以鉴定在这四个不同HLA等位基因背景下hIGRP中作为CD8+T细胞应答靶标的其他表位。对这些小鼠的胰岛相关CD8+T细胞筛选针对HLA-A＊0201、HLA-A＊1101、HLA-B＊0702和HLA-Cw＊0304结合hIGRP肽的反应性。
然后，在相应hβ2m/HLA-A＊1101、HLA-B＊0702或HLA-Cw＊0304转基因NOD.β2mnull.IGRPnull小鼠中，测试相应肽/HLA复合物包被的纳米球的抗致糖尿病效力。此工作的总目的是为了将可使用的肽/HLA组合的功能扩展到治疗尽可能多的患者。
NP治疗特性和pMHC缀合的优化。使用I类pMHC复合物进行不间断的研究以优化NP尺寸和密度，以及pMHC效价。使用金NP进行该研究，因为它们比铁氧化物更经得起这些类型的研究检验。该研究还帮助我们显示pMHC-NP扩增自身调节性T细胞记忆的能力不依赖于NP芯核的化学组成(铁氧化物与金)。用不同直径的金NP进行广泛的工作，数据表明沿着指出越小直径为优化NP直径的线，直径＜14nm的NP是有益的。多个pMHC与NP表面(＞50-200/NP)经其羧基端的直接结合和包被NP的充分除菌允许浓缩至高颗粒密度(＞10^10/μL)，并且不损害NP的单分散性或稳定性。通过测试糖尿病前NOD小鼠中的这些I类纳米疫苗，我们确定了在体内能够显著扩增同源自身调节CD8+T细胞(～10-20倍)的NP剂量可工作范围和pMHC效价。我们确定pMHC的总剂量是关键的，并且与较少数目的以较高pMHC效价包被的较大NP相比，当给予较高数目的用较少pMHC包被的小NP时(总pMHC的量相同)，得到最佳结果。这些条件还减少了组织积累并且能够以最低的金属可能剂量递送pMHC的治疗水平。
在一个优选实施方案中，使用基于以下设想的给药方案：
设想：用pMHC抗原包被的4nm铁氧化物纳米颗粒，其密度足以使得每剂的蛋白质总量为约1μg至25μg。
例如，每剂的总pMHC(1μg-25μg)＝(1.34×1013pMHC/剂至3.33×1014pMHC/剂)
每剂(4nm)NP(1μg-15μg)的总铁＝(3.73×1012Np/剂至5.60×1013Np/剂)
应理解，每剂pMHC的量可为低至0.1μg至500μg。
例如，在60kg的人患者中，每剂的pMHC量可为0.24至6.08mg，应理解其相当于以上讨论的1μg至25μg。另外，如上，可将该剂量变为0.1μg至500μg。
相对于直径14nm的金纳米颗粒，上述4nm铁氧化物颗粒提供了增强的效力，表明较小颗粒具有改善的功用。应理解，术语“铁氧化物”意指涵盖可使用的或本领域技术人员已知的所有金属氧化物，包括例如羟基氧化铁。
实施例3
单特异性肽-II类MHC包被的纳米球。
T1D相关II类pMHC复合物的生产。为了测试用T1D相关肽/I-Ag7复合物包被的纳米球在NOD小鼠中也可提供T1D保护并治疗T1D的假设，可由以下五种T1D相关和对照肽构建几种不同的肽/I-Ag7复合物：BDC2.5模拟表位：AHHPIWARMDA(SEQIDNo.59)、IGRP128-145：TAALSYTISRMEESSVTL(SEQIDNo.60)、IGRP4-22：LHRSGVLIIHHLQEDYRTY(SEQIDNo.61)、IGRP195-214：HTPGVHMASLSVYLKTNVFL(SEQIDNo.62)和胰岛素B9-23：SHLVEALYLVAGERG(SEQIDNo.63)。可以使用G6P异构酶肽(LSIALHVGFDH；SEQIDNo.64)/I-Ag7复合物(自身pMHC对照)，和两种鸡卵溶菌酶(HEL14-22-RHGLDNYRG；SEQIDNo.65-和HEL11-25-AMKRHGLDNYRGYSL；SEQIDNo.66-/I-Ag7复合物(外来pMHC对照)作为阴性对照。如前所述生产了重组I-Ag7单体。简言之，载体pRMHa3中的最终构建体编码天然前导序列，之后编码上述的肽序列，然后分别编码I-Ag7a和b链的胞外细胞质结构域。两条链都分别延伸到a和b链的连接序列(SSAD)、凝血酶切割位点(LVPRGS)和酸性或碱性亮氨酸拉链序列中，然后是六个连续组氨酸残基。生物素化序列#85接着a链上的酸性拉链。将DNA构建体与嘌呤霉素抗性基因一起共转染到黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)SC2细胞中以产生稳定细胞系。对于大规模制备(12升)，通过CuSO4诱导细胞上清液中的切向流收集重组蛋白质，并且通过金属螯合亲和色谱、阴离子交换色谱以及尺寸排阻色谱进行纯化。使用BirA酶进行纯化分子的生物素化。生物素化通过链霉亲和素-琼脂糖珠子上的免疫耗竭来测量，然后通过SDS-PAGE进行分析。这些复合物可缀合到生物可吸收的生物可降解纳米球。这些单体还可用于产生荧光染料缀合四聚体以对用pMHC包被纳米球处理之前和之后两种情况下的同源自体反应性CD4+T细胞进行计数。然后可将纯化的生物素化pMHC复合物包被到纳米球上。为了本文提出的研究，可如上所述，在苍蝇细胞中产生重组pMHC复合物：pMHC融合至IgG2aFc的二聚体，但是使用增加可包被到单独纳米球上的pMHC总效价的不同构建体设计。
纳米球治疗特性和pMHC缀合的优化。可使用I类pMHC复合物进行研究以优化纳米球尺寸和密度以及pMHC价(valency)。可通过分光光度法、透射电子显微镜法(TEM)和动态光散射法测量纳米球的尺寸、密度、电荷和单分散性。可将纳米球样品浓缩，与3.4kD硫醇-PEG-NH2-pMHC缀合，洗涤，并在高密度下浓缩(～1014/ml)而不破坏单分散性。
考虑直径5-15nm的纳米球是最优的。新合成方案能够使多个pMHC与纳米球表面(例如，多至200/纳米球)通过其羧基端直接结合并且使包被纳米球充分除菌，从而允许浓缩至高颗粒密度(＞1010/uL)而不破坏单分散性或稳定性。可在糖尿病前NOD小鼠中测试这些I类纳米疫苗以建立能够在体内大量扩增同源自身调节性CD8+T细胞的纳米球剂量可工作范围和pMHC价。考虑用这些pMHC-纳米球处理新诊断的糖尿病小鼠在恢复正常血糖方面非常有效。考虑与较少数目的以较高pMHC价包被的较大NP相比，当给予较高数目的用较少pMHC包被的小NP时(总pMHC的量相同)，得到最佳结果。还考虑这些条件和纳米球的生物可吸收和生物可降解特性将减少组织积累并且能够以最低的可能剂量递送pMHC的治疗水平。
通过用T1D相关II类pMHC包被的纳米小球处理NOD小鼠所实现的高血糖逆转。设想II类pMHC包被的生物可降解生物可吸收纳米球可逆转新诊断出的糖尿病NOD小鼠中的高血糖，基本上如I类pMHC包被纳米球所述。可用7.5μgNP处理糖尿病NOD小鼠，每周两次。当小鼠持续4周保持正常血糖水平时则认为它们被治愈。考虑2.5mi/I-Ag7-纳米球在几乎所有的测试小鼠中都会逆转高血糖。可以例如通过腹膜内葡萄糖耐量测试(IPGTT)测量高血糖。考虑用IGRP128-145/I-Ag7-纳米球、B9-23/I-Ag7-纳米球和IGRP4-22/I-Ag7-纳米球处理的大多数(如果不是所有)小鼠会变为正常血糖。可以使用用GPI282-292/I-Ag7(T1D不相关的自身抗原)和HEL14-22/I-Ag7(外来抗原)包被的纳米球作为对照。考虑这些实验证实，用不同T1D相关II类pMHC复合物包被的“单特异性”纳米球在诱导T1D逆转方面可至少与I类pMHC包被的纳米球一样有效。在一些情况下，认为加强免疫对正常血糖的持续和普遍的长期维持可能是必要的。
T1D相关II类pMHC包被的纳米球以及同源Tr1样和记忆表型自身调节性CD4+T细胞的扩增。考虑与在糖尿病发病时立即研究的小鼠或年龄匹配的非糖尿病未处理动物相比，通过用2.5mi/I-Ag7-纳米球处理使血糖正常的50周龄糖尿病小鼠中的血液、脾、胰淋巴结(PLN)、肠系膜淋巴结(MLN)和骨髓表明，检查的所有器官(除MLN之外)中的2.5mi/I-Ag7四聚体+CD4+T细胞的百分比显著增加。认为CD4+T细胞扩增是抗原特异性的并且未检测到非同源自身反应性CD4+T细胞群的扩增。考虑维持自身调节性CD4+T细胞对于持续维持正常血糖水平是必须的。这些经NP扩增的2.5mi/I-Ag7四聚体+T细胞与2.5mi/I-Ag7四聚体-T细胞的表型分析可表明记忆样表型(CD62low、CD44high和适度的CD69上调)。这些细胞可以是CD25-和FoxP3-。其可在表达FoxP3-eGFP的NOD小鼠(其中Treg细胞结构性地表达eGFP)中确定。用2.5mi/I-Ag7-纳米球处理10周龄的这些小鼠可扩增eGFP-2.5mi/I-Ag7四聚体+CD4+T细胞。FACS分选的2.5mi/I-Ag7四聚体+CD4+T细胞的功能性体外研究可确定它们是响应于同源肽，还是非同源肽脉冲刺激的DC而增殖，以及它们是否分泌IL-10和IFNγ。可使用ELISA和luminex技术进行这些研究。设想这些Tr1样CD4+T细胞将表达高水平的细胞表面TGFβ。
设想经II类pMHC-纳米球扩增的四聚体+细胞(而不是其四聚体-对应物)会有效抑制对抗Gp33和2.5mi脉冲刺激之DC的未刺激LCMVGp33特异性CD8+细胞(分别由效应物和四聚体+Tr1CD4+T细胞识别)。还认为与接受对照大鼠IgG的培养基相比，向培养基中添加抗IL10mAb将部分地抑制这种抑制活性。认为用IGRP4-22/I-Ag7-纳米球和阻断抗IL-10或大鼠IgG(作为对照)处理的糖尿病小鼠的实验，以及穿孔素缺陷型NOD小鼠的实验表明，通过II类pMHC-纳米球恢复正常血糖是IL-10和穿孔素依赖性的。还考虑IFNγ对于pMHC-纳米球可扩增的Tr1细胞的形成是必须的，但是对于其抑制活性并不如此。在IFNγ-/-小鼠中可响应于pMHC-纳米球治疗扩增的同源自身反应性T细胞将具有Th2表型(离体下响应于肽攻击产生IL-4和IL-10)，而在IL-10-/-小鼠中扩增的那些可产生IFNγ和IL-4，但不产生IL-10。这些结果表明糖尿病逆转由Tr1样细胞介导。
实施例4
使用IGRP/Kd-PLGA纳米球的T细胞扩增
IGRP206-214/Kd-PLGA纳米球在体内诱导同源CD8+T细胞的激活。基本上如Tsai等，Immunity(2010)32，568-680(通过引用并入本文)所述进行此测定。简言之，将来自8.3-NOD小鼠的纯化的未刺激IGRP206-214/Kd特异性T细胞受体(TCR)-转基因CD8+T细胞用IGRP206-214/Kd-PLGA纳米球培养48小时。评估上清液的IFNγ。用1μCi的[3H]-胸苷脉冲刺激细胞并收集。相对于纳米球数目/孔测量CPM和IFNγ。其在图9中进行描述。图8描述了IGRP/Kd缀合的PLGA颗粒的放大图像。根据以下制备PLGA颗粒：浓度：100nm(PLGA：1.5mL中20mg/mL)。
DLS大小：154.72nm
pMHC缀合：与2mLPLGA颗粒缀合的5mgIGRP/Kd
最终体积：2mL
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Claims (22)

1.诊断、预防或治疗自身免疫病的方法，其包括以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量向对象施用有效偶联到生物相容性生物可吸收纳米球的抗原-MHC复合物。
2.用于在对象中扩增和/或产生抗致病性自身反应性T细胞群体的方法，所述方法包括向所述对象施用自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可降解纳米球复合物，其中所述复合物以足以扩增所述群体的量和频率施用。
3.权利要求2的方法，其中所述自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可降解纳米球复合物中包含多个自身抗原表位。
4.权利要求3的方法，其中所述多个自身抗原表位来源于单个自身抗原。
5.权利要求3的方法，其中所述多个自身抗原表位来源于多个自身抗原。
6.权利要求5的方法，其中所述扩增的抗致病性自身反应性T细胞群体是抗原特异性的，但是以非抗原特异性方式抑制。
7.权利要求2、4或5中任一项的方法，其中所述生物相容性生物可吸收纳米球复合物的施用清除所述同源致病性自身反应性T细胞群体。
8.权利要求2、4或5中任一项的方法，其中所述生物相容性生物可吸收纳米球复合物的施用清除所述非同源致病性自身反应性T细胞群体。
9.自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其包含生物相容性芯核和所述芯核外表面上的生物可降解包衣。
10.权利要求9的自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其中所述生物相容性芯核由铁(III)氧化物构成。
11.权利要求9的自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其中所述生物可降解包衣选自葡聚糖、甘露醇和聚(乙二醇)。
12.权利要求9的自身抗原表位-MHC-生物相容性生物可吸收纳米球复合物，其中所述纳米球共价结合到所述自身抗原表位-MHC复合物的MHC基团，其中所述结合任选地通过接头。
13.抑制自身免疫病发病的方法，其中所述方法包括以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量向对象施用有效偶联到生物相容性纳米球的抗原-MHC复合物，其中所述MHC分子包括II类MHC分子。
14.权利要求13的方法，其中所述自身反应性T细胞是CD4+TR1细胞。
15.权利要求14的方法，其中所述CD4+TR1细胞的特征在于IL-10和IFNγ表达。
16.用于治疗自身免疫病之炎症性组分的方法，其中所述方法包括：
向患具有炎症性组分之自身免疫病的对象施用有效偶联到生物相容性纳米球的抗原-MHC复合物，其中所述MHC分子包括II类MHC分子并且所述抗原对所述自身免疫病具有特异性，并且其中所述复合物的所述施用的量足以扩增表达IL-10的抗致病性自身反应性TR1细胞群体；
在引起所述自身免疫病之所述炎症性组分减少的条件下，使所述TR1细胞在所述自身免疫病的部位积累，从而使得IL-10在所述部位积累。
17.权利要求16的方法，其中所述MHC分子是II类MHC分子。
18.权利要求16的方法，其中所述自身反应性T细胞是CD4+TR1细胞。
19.权利要求18的方法，其中所述CD4+TR1细胞的特征在于IL-10和IFNγ表达。
20.权利要求13或16中任一项的方法，其中所述纳米球由一种或更多种生物相容性生物可吸收材料形成。
21.用于在患者中治疗自身免疫病的方法，所述方法以足以扩增抗致病性自身反应性T细胞的量向所述患者施用有效偶联到生物相容性纳米球的抗原-MHC复合物，其中所述MHC分子包括I类MHC和II类MHC分子二者。
22.权利要求21的方法，其中所述自身免疫病是I型糖尿病。
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