KR101972291B1 - 생체적합성, 생흡수성 나노구를 사용하는 자가면역 질병의 치료방법 - Google Patents

생체적합성, 생흡수성 나노구를 사용하는 자가면역 질병의 치료방법 Download PDF

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Abstract

방법들에는 생체적합성, 생흡수성 나노구들을 사용하여 T 세포들의 항원성 특이성에 따라 T 세포들을 선택적으로 감소시키거나 또는 팽창시키는 것이 포함된다. 따라서, 본 발명은 베타 세포 특이성 T 세포들 등과 같은 자가 항원들을인식하는 병원성 T 세포들을 감소시키거나 또는 제거하는 데 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명은 당뇨병 감수성 장소 등과 같은 자가면역 질환들을 예방하거나, 치료하거나 또는 개선하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 항-병원성 T 세포들 등과 같은 바람직한 T 세포들을 확장시켜 자가면역 질환들을 예방하거나, 치료하거나 또는 개선하는 데 사용될 수 있다.

Description

생체적합성, 생흡수성 나노구를 사용하는 자가면역 질병의 치료방법{METHODS FOR TREATING AUTOIMMUNE DISEASE USING BIOCOMPATIBLE BIOABSORBABLE NANOSPHERES}
연관된 출원들의 교차 참조
본 출원은 미합중국 법전 특허법(35 U.S.C.) 제119(e)조 하에서 그 출원이 그의 전체로서 본 출원에서 참조로 포함되는 2010년 9월 29일자로 출원된 미합중국 가특허출원 제61/387,873호의 우선권을 주장한다.
발명의 분야
본 발명은 면역학(immunology) 및 약물(medicine)에 연관된 조성물들 및 방법들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자가면역 상태(autoimmune conditions)들, 특히 당뇨병의 진단(diagnosis) 및 치료(treatment)를 위한 진단학(diagnostics) 및 치료학(therapuetics)에 관한 것이다.
자가면역(autoimmune)에서의 T-세포 내성(tolerance)의 유도를 위하여 항원 접종(antigen vaccination)이 사용될 수 있다. 용액 내의 자가항원성 단백질(autoantigenic proteins) 또는 펩티드의 투여는 자가면역 질병의 실험 모델들에서의 자가면역의 개시 및/또는 진전을 둔화시킬 수 있다.(문헌 Wraith et al., 1989; Metzler and Wraith, 1993; Liu and Wraith, 1995; Anderton and Wraith, 1998; Karin et al., 1994 참조). 그러나, 유사한 전략을 사용하는 인간들에서의 제한된 임상시험들은 거의 언제나 실패로 끝났다(문헌 Weiner, 1993; Trentham et al., 1993; McKown et al., 1999; Pozzilli et al., 2000; Group, D.P. T.-T.D.S. 2002; Kappos et al., 2000; Bielekova et al., 2000 참조). 이는 치료의 선택 및 상태들을 안내하는 원리들이 형편없이 정의되고 그리고, 그 결과로서, 인간 적용에 대하여 부적절하다는 것을 암시한다.
자발적 기관-특이적 자가면역 장애들(organ-specific autoimmune disorders)은 확률적으로(stochastic) 그리고 종종 예측불가능한 순서로 동시적으로 일어나는 다중 항원들의 여러 에피토프들에 대한 복합 반응(complex responses)의 결과이다. 이러한 복합성(complexity)은 동일한 에피토프들을 인식하는 림프구 복제물(lymphocyte clones)들이 광범위한 범위의 결합활성(avidities)들로 항원/주조직 적합성 복합체 분자들(major histocompatibility complex molecules ; MHC molecules)에 연계되고, 그 세기가 병원성 잠재성(pathogenic potential)과 연관된다는 사실에 의해 결합된 것이다(문헌 Amrani et al., 2000; Santamaria, 2001; Liblau et al., 2002 참조). 따라서, 자가면역의 예방을 위한 임의의 면역화 전략(immunization strategy)의 결과는 자가항원(들), 투여량(dose), 치료의 주기성(periodity of treatment) 및 투여의 경로와 형태에 의해 영향을 받을 것이다.
생쥐들(mice)에서의 제1형 당뇨병(Type 1 Diabetes ; T1D)은 자가반응성(autoreactive) CD8+ T-세포들(CD ; 표면분화항원(Cluster of Differentiation))과 연관된다. 비(非) 비만성 당뇨병(Nonobese diabetic ; NOD) 생쥐들은 인간 제1형 당뇨병과 극히 유사한 제1형 당뇨병의 형태를 발달시키며, 이는 자가 항원들의 증가하는 목록을 인식하는 T-세포들에 의한 췌장 베타 세포(pancreatic β cells)의 선택적인 파괴로 야기된다(문헌 Lieberman and DiLorenzo, 2003 참조). 비록 제1형 당뇨병의 개시가 명백하게 CD4+ 세포들의 기여를 요구하기는 하나, 제1형 당뇨병이 CD8+ 세포-의존성이라는 설득력 있는 증거가 존재한다(문헌 Santamaria, 2001; Liblau et aI., 2002 참조). 비(非) 비만성 당뇨병 생쥐에서의 소섬(islet)-연관된 CD8+ 세포들의 상당한 분획(significant fraction)이 '8.3-T 세포 수용기-유사체(8.3-TCR-like)'라고 언급되는 CDR3-불변성 Vα17-Jα42+ T 세포 수용기(CDR3-invariant VuI7-Ju42+ TCRs)들을 사용한다는 것이 발견되었다(문헌 Santamaria et aI., 1995; Verdaguer et aI., 1996; Verdaguer et aI., 1997; DiLorenzo et aI., 1998 참조). 상기 주조직 적합성 복합체 분자 Kd의 정황에서 미모토프 NRP-A7(mimotope NRP-A7 ; 조합 펩티드 라이브러리(combinatorial peptide libraries)들을 사용하여 정의된)을 인식하는 이들 세포들은 이미 최초기 비 비만성 당뇨병 소섬 CD8+ 침윤물(earliest NOD islet CD8+ infiltrates)의 뚜렷한 구성성분이고(문헌 DiLorenzo et aI., 1998; Anderson et aI., 1999; Amrani et aI., 2001 참조), 그리고 당뇨병유발성(diabetogenic)이고(문헌 Verdaguer et aI., 1996; Verdaguer et aI., 1997 참조), 그리고 미지의 기능의 단백질(문헌 Arden et aI., 1999; Martin et aI., 2001 참조)인 소섬-특이적 글루코스-6-포스파타아제 촉매적 서브유닛-연관 단백질(islet-specific glucose-6-phosphatase catalytic subunit-related protein ; IGRP)로부터의 펩티드(문헌 Lieberman et aI., 2003 참조)를 표적한다. 이 펩티드(NRP-A7에 유사한 IGRP206-214)를 인식하는 상기 CD8+ 세포들은 상기 순환에서 비정상적으로 빈발한다(1/200 CD8+ 세포들 초과)(문헌 Lieberman et aI., 2003; Trudeau et aI., 2003 참조). 특히, 비 비만성 당뇨병 생쥐에서의 인슐린염(이자섬염, insulitis)의 당뇨병으로의 진전은 언제나 순환하는 IGRP206-214-반응성 CD8+ 풀(IGRP206-214)-reactive CD8+ pool)의 주기적 확장(cyclic expansion)(문헌 Trudeau et aI., 2003 참조)이 그리고 그의 소섬-연관 상대(islet-associated counterpart)의 결합활성 성숙(문헌 Amrani et al., 2000 참조)이 수반된다. 보다 최근에는, 비 비만성 당뇨병 생쥐들 내에서의 소섬-연관 CD8+ 세포들이 다중IGRP 에피토프들을 인지하여 IGRP가 적어도 쥣과의 제1형 당뇨병에서 CD8+ 세포들에 대한 우성의 자가항원이라는 것을 나타낸다는 것이 밝혀졌다(문헌 Han et aI., 2005 참조). 비 비만성 당뇨병 소섬-연관 CD8+ 세포들, 특히 질병 과정에서 초기에 발견되는 것들이 또한 인슐린 에피토프(insulin epitope)(Ins B15-23, 문헌 Wong et aI., 1999 참조))를 인식한다.
조직적합항원(histocompatibility antigen, human leukocyte antigen와 동의어 ; HLA) 클래스 I 대립유전자들(즉, HLA-A*0201)이 인간 제1형 당뇨병에 대한 감수성(susceptibility)를 제공한다는 것이 연합연구(association studies)들에서 제안되었다(문헌 Fennessy et aI., 1994; Honeyman et aI., 1995; Tait et aI., 1995; Nejentsev et aI., 1997; Nakanishi et aI., 1999; Robles et aI., 2002 참조). 신규하게 진단된 환자들의 인슐린염 병변(insulitis lesions)들이 대부분 (조직적합항원 클래스 I-제한) CD8+ T-세포들로 이루어진다는 것이 병리학(pathology) 연구들에서 밝혀졌다(문헌 Bottazzo et aI., 1985; Atkinson and Maclaren, 1990; Castano and Eisenbarth, 1990; Hanninen et aI., 1992; Itoh et al., 1993; Somoza et aI., 1994; Atkinson and Maclaren, 1994; Moriwaki et aI., 1999; Imagawa et aI., 2001 참조), 이들은 또한 췌장 동계이식물(pancreas isografts)(일란성 쌍생아(identical twins)들로부터의) 또는 이형이식물(allografts)(친척 공여자들(related donors)로부터의)로의 이식으로 치료된 환자들에서의 우성적인 세포 개체군이다(문헌 Sibley et aI., 1985; Santamaria et aI., 1992 참조).
인슐린은 인간과 쥣과 동물 제1형 당뇨병 둘 다에서의 항체 및 CD4+ 반응(CD4+ response)의 핵심 표적(key target)이다(문헌 Wong et aI., 1999; Palmer et aI., 1983; Chentoufi and Polychronakos, 2002; Toma et aI., 2005; Nakayama et aI., 2005; Kent et aI., 2005 참조). 인간 인슐린 B쇄(B chain) 에피토프 hInsBlO-18은 둘 다 소섬 이식 수령인들(islet transplant recipients) 내의(문헌 Pinkse et aI., 2005 참조) 그리고 자발적인 질병(spontaneous disease)의 과정에서의(문헌 Toma et aI., 2005 참조) 자가반응성 CD8+ 세포들에 대하여 HLA-A*0201에 의하여 제공된다. 게다가, HLA-A*0201의 정황에서의 HLA-A*0201-형질전환 생쥐로부터의 소섬-연관 CD8+ T-세포들에 의해 인식되는 4개의 별도의 펩티드들이 생쥐 프로인슐린 전구물질(mouse pre-pro insulin) 1 또는 2로부터 동정되었다.
제1형 당뇨병 감수성 장소(T1D susceptibility locus, IDDM7(2q31)(문헌 Pociot and McDermott, 2002; Owerbach, 2000 참조)를 중첩하는 유전자(크로모좀 2q28-32 상에 위치하는(문헌 Martin et aI., 2001 참조))에 의해 암호화되는 IGRP가 또한 최근 잠재적 연관성(potential relevance) 인간 제1형 당뇨병에서 베타-세포 자가항원으로서 동정되었다(문헌 Takaki et al., 2006 참조). 인간 IGRP의 2개의 HLA-A*0201-결합 에피토프들(hIGRP228-236 및 hIGRP265-273)이 HLA-A*0201 전이유전자(transgene)를 발현하는 쥣과의 동물 주조직 적합성 복합체 클래스 I-결핍 비 비만성 당뇨병 생쥐로부터의 소섬-연관 CD8+ 세포들에 의해 인식된다(문헌 Takaki et aI., 2006 참조). 명백하게도, 이들 '인간화된(humanized)' HLA-A*0201-형질전환 생쥐들의 상기 소섬-연관 CD8 T-세포들은 HLA-A*0201-양성 인간 소섬들에 세포독성이다(문헌 Takaki et aI., 2006 참조).
비 비만성 당뇨병 생쥐들에서의 제1형 당뇨병은 낮은 결합활성 자가반응성 CD8+ T-세포들의 확장에 의하여 방지될 수 있다. 가용성 펩티드(soluble peptides)들(보조제(adjuvant) 없이)의 투여가 항원-특이적 T-세포 내성을 유도하는 효과적인 방법이다(문헌 Aichele et aI., 1994; Toes et aI., 1996 참조). 앞서, 가용성 NRP-A7으로의 당뇨전증 비 비만성 당뇨병 생쥐(pre-diabetic NOD mice)의 치료가 펩티드/주조직 적합성 복합체에 대한 가장 높은 친화성(affinity)을 갖는 T 세포 수용기들을 발현하는 클론형(clonetypes)들을 선택적으로 제거시키는 것에 의하여 상기 IGRP206-214-반응성 CD8+ 서브셋(subset)의 결합활성 성숙(avidity maturation)을 둔화시켰다는 것이 밝혀졌다(문헌 Amrani et aI., 2000 참조). 이들 관측들은 NRP-A7의 항-제1형 당뇨병 활성이 또한 '높은 결합활성 클론형 자리(high avidity clonotype niche)'(NRP-A7 치료에 의해 비워진)의 점유(occupation)를 '낮은 결합활성(low avidity)'(및 잠재적으로 항-당뇨병유발성(anti-diabetogenic)인) 복제물들로 발전시키는 것에 의하여 매개된다는 가능성이 제기되었다. 이러한 가설을 시험하기 위하여, IGRP206-214-반응성 CD8+ T-세포들에 대한 부분 작동활성, 완전 작동활성 또는 초작동활성(partial, full or super agonistic activity)로 변형된 펩티드 리간드들(altered peptide ligands ; APLs)들을 동정하고 그리고 넓은 투여량-범위(wide dose-range)에 걸쳐 그들의 항-제1형 당뇨병 활성을 비교하였다.
중간 친화성 APL(intermediate affinity APL)(NRP-A7)의 중투여량(moderate doses) 또는 낮은 친화성 APL(NRP-I4)의 고투여량(high doses)으로의 장기 치료(chronic treatment)가 제1형 당뇨병 보호를 제공하였다. 이는 삭제된 그들의 높은 친화성의 상대들의 희생으로 낮은 친화성의 IGRP206-214-반응성 CD8+ T-세포들의 국부적 누적과 연관되었다. 예기치 못하게, 높은 친화성의 APL(NRP-V7)의 고투여량 또는 천연의 리간드(IGRP206-214)로의 장기 치료는 단지 미미한 보호를 제공하였다. 놀랍게도, 이들 생쥐들의 상기 소섬들은 IGRP206-214-반응성 CD8+ T-세포들을 거의 포함하지 않았으나, 그러나 다른 IGRP 에피토프들을 인식하는 CD8+ 세포들의 증가된 개체군들을 포함하였다. 이로부터 본 발명자들은 비-병원성, 낮은 친화도의 복제물들(문헌 Han et al., 2005 참조), 수학적 모델링(mathematical modeling)(문헌 Maree et al., 2006 참조)에 의한 지지되는 예측에 의하여 표적 기관 림프구 자리(target organ lymphocyte niche)의 점유를 둔화시키는 경우에 자가면역에서의 펩티드 요법(peptide therapy)이 가장 효과적일 수 있다고 결론하였다. 불행히도, 이러한 결과는 단지 좁은 범위의 APL 투여량 및 결합활성(TCR들을 표적하기 위하여) 내에서만 일어나서 펩티드 요법이 제1형 당뇨병을 예방하거나 또는 치료하기에는 부적당하다.
따라서, 다른 자가면역 장애(autoimmune disorders)들과 마찬가지로 당뇨병의 치료를 위한 별도의 조성물들 및 연관된 방법들에 대한 요구는 여전히 존재하고 있다.
IGRP의 경우에서와 마찬가지로 투여량 당 수 밀리그램(㎎)의 펩티드를 필요로 하기 때문에 환자를 펩티드로 치료하는 것은 어려울 수 있다. 본 출원에서는 생체적합성, 생분해성 나노구들 상에의 항원/주조직 적합성 복합체 복합체들, 예를 들면, 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체들(공동자극 분자(costimulatory molecules)들 없이)의 전달이 제공된다. 이들 복합체들이 펩티드 단독 또는 비-생흡수성 나노구 복합체들에 비해 보다 면역관용성(tolerogenic)일 것이라는 것이 고려된다.
본 출원의 관점들 및 구체예들은 자가면역의 치료에서의 새로운 패러다임(paradigm)의 발견을 포함한다. 전통적으로, 병원체(pathogens) 또는 암에 대한 보호를 제공할 수 있는 T-세포들을 확장시키거나 또는 자가면역을 야기할 수 있는 T-세포들을 삭제하는 데 백신(vaccines)들이 사용되어 왔다. 본 발명의 관점들은 둘 다 T 세포들의 항원성 특이성에 따라 항-자가면역 특성들을 갖는 자가반응성 CD8+ 세포들의 확장 및 동시에 병원성(자가면역) 특성들을 갖는 자가반응성 CD8+ 세포들의 제거를 선택적으로 유도하는 '백신(vaccine)'의 신규한 형태에 관한 것이다. 상기 항-자가면역 자가반응성 CD8+ T-세포들(항-병원성 CD8+ 세포들)은 조직-특이적(표적 조직에 대한 자발적인 보충에 의하여)이나 그러나 항원-비-특이적인 방법(예를 들면, 다른 자가반응성 T-세포 반응들을 국부적으로 억제하는)에서의 자가반응성 T-세포 반응들을 억제한다. 그 결과, 이러한 형태의 백신으로의 치료는 고혈당증(hyperglycemic)의 비 비만성 당뇨병 생쥐에서 일반적인 면역억제를 야기함이 없이 정상혈당(normoglycemia)을 회복하거나 또는 당수치(glucose levels)를 감소시키는 것과 마찬가지로 제1형 당뇨병을 방지 및/또는 개선할 수 있다. 이러한 전략은 다른 T-세포 매개 자가면역 질병들의 치료에 적용될 수 있으며 또한 소섬 이식에 의한 제1형 당뇨병의 재발을 방지할 수 있을 것이다.
본 발명의 특정의 구체예들은 상기 T 세포들의 상기 항원성 특이성(antigenic specificity)에 따라 T 세포들을 선택적으로 감소 또는 확장시키는 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명이 P 세포 특이적 T 세포 등과 같은 자가항원을 인식하는 T 세포들을 감소시키거나 또는 제거하는 데 사용될 수 있다고 여겨진다. 마찬가지로, 본 발명은 IDDM(Insulin dependent diabtets mellitus ; 인슐린 의존형 당뇨병) 등과 같은 자가면역 질병들의 예방, 치료 또는 완화시키는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명은 종양 항원들을 인식하는 T 세포 등과 같은 바람직한 T 세포들을 확장하고, 이들 T 세포들에 의해 투쟁되는 질병들을 예방하거나, 치료하거나 및/또는 완화하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 구체예들은 항원/주조직 적합성 복합체/생체적합성, 생흡수성 나노구 복합체를 대상체에 항병원성 자가반응성 T 세포들을 확장시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 자가면역 장애를 진단, 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 기질(substrate)에 결합된 주조직 적합성 복합체(MHC) 또는 주조직 적합성 복합체-유사 분자(MHC-like molecule)의 맥락에서 볼 때, T 세포들의 활성 또는 T 세포들의 개체군들을 조절할 수 있는 펩티드(peptide), 핵산(nucleic acid), 탄수화물(carbohydrate), 지질(lipid) 또는 다른 분자 또는 화합물의 전부 또는 일부를 포함하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 상기 나노구 복합체의 생흡수가능성(bioabsorbability)은 이것이 그로부터 야기되는 임의의 수반되는 독성 없이 생체 내에서 상기 나노구들의 장기간 축적을 방지하기 때문에 본 발명에서 절대적이다.
본 발명의 구체예들은 항원-주조직 적합성 복합체에 결합되는 생체적합성, 생흡수성 나노구를 포함하는 면역관용성 나노구들을 포함한다. 상기 항원-주조직 적합성 복합체는 이러한 나노구에 직접적으로 또는 연결자(linker)를 경유ㅎ여 결합될 수 있다. 바람직한 나노구는 생체적합성, 생흡수성 금속 코어(metal core) 및 생분해성, 생흡수성 코팅(coating)을 더 포함할 수 있다. 상기 나노구는 상기 항원-주조직 적합성 복합체에 쉽게 결합될 수 있는 다른 분자들(예를 들면, 스트렙타비딘(streptavidin) 또는 아비딘(avidin) 또는 나노구에 부분(moieties)들을 부착시키는 데 사용되는 다른 공지된 분자들)의 피복(covering) 또는 쉘(shell)을 더 포함할 수 있다. 특정의 관점들에 있어서, 생체적합성, 생흡수성 나노구는 예를 들면 PGLA, PLLA, PGA, PDLLA, PCL, PDLGA, PLDLA, PLC (이들 전부는 미합중국 29118 사우스캐롤라이나주 오렌지버그 인더스트리얼 블러바드 3737(3737 Industrial Blvd, Orangeburg, SC, 29118 USA)에 소재하는 제우스사(Zeus)로부터 상품명 업솔브™(Absorv™)으로 획득가능함) 등과 같은 생체적합성(biocompatible), 생흡수성 중합체들, 히알루론산(hylaurinic acid), 알지네이트(alginate), 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoates) 등과 같은 생체적합성, 생흡수성 중합체들과 마찬가지로 산화철(iron III oxide), 인산삼칼슘(tricalcium phosphate), 크롬(chromium), 갈륨(gallium)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질을 포함한다. 다른 관점들에 있어서, 생체적합성, 생흡수성 나노구는 금속 또는 자화가능(magnetizable)하거나 또는 초상자성(superparamagnetic) 나노구를 포함한다. 상기 생체적합성, 생흡수성 나노구는 덱스트란(dextran); 폴리(에틸렌글리콜)(poly(ethylene glycol)); 폴리(에틸렌옥사이드)(poly(ethylene oxide)); 만니톨(mannitol); 폴리-3-하이드록시부티레이트/폴리-3-하이드록시발러레이트급(poly-3-hydroxybutyrate/poly-3-hydroxyvalerate class ; PHB/PHV class)의 폴리(하이드록시알카노에이트류)(poly(hydroxalkanoate)s); 및 녹말(starch), 셀룰로오스(cellulose) 및 키토산(chitosan) 등과 같은 다른 변성된 폴리(사카라이드)(modified poly(saccharides)) 들로부터 형성되는 생분해성(biodegradable) 피복을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 특정의 관점들은 일반적으로 항원들로 언급되는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 및 항원 또는 면역 반응을 유발하거나(provoke) 또는 유도하는(induce) 다른 분자들의 분절(segments), 단편(fragments) 또는 에피토프(epitopes)들을 포함하는 항원 조성물(antigenic compositions)에 연관되는 방법 및 조성물을 포함한다. 특정의 관점들에 있어서, 상기 항원은 자가반응성 항원 및/또는 이들의 복합체들로부터 유도되거나, 자가반응성 항원 및/또는 이들의 복합체들의 모방체(mimic)이거나 또는 자가반응성 항원 및/또는 이들의 복합체들이다.
펩티드 항원들에는 본 출원에 그의 전체로서 참조로 포함되는 미합중국 공개특허 제20050202032호에서 기술된 펩티드 및 단백질들과 마찬가지로 hInsBlO-18(HLVEALYLV(시퀀스 동정번호(시퀀스 동정번호):l)), hIGRP228-236(LNIDLLWSV(시퀀스 동정번호:2)), hIGRP265-273(VLFGLGFAI(시퀀스 동정번호:3)), IGRP206-214(VYLKTNVFL(시퀀스 동정번호:4)), NRP-A7(KYNKANAFL(시퀀스 동정번호:6)), NRP-14(KYNIANVFL(시퀀스 동정번호:7)), NRP-V7(KYNKANVFL(시퀀스 동정번호:8)), YAI/Db(FQDENYLYL(시퀀스 동정번호:9)) 및/또는 INS B15-23(LYLVCGERG(시퀀스 동정번호: 10))들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
특정의 관점들에 있어서, 제1형 당뇨병의 치료를 위한 펩티드 항원은 GAD65114-123, VMNILLQYVV(시퀀스 동정번호:14); GAD65536-545, RMMEYGTTMV(시퀀스 동정번호:15); GFAP143-151, NLAQTDLATV(시퀀스 동정번호:16); GFAP214-222, QLARQQVHV(시퀀스 동정번호:17); IA-2172-180, SLSPLQAEL (시퀀스 동정번호:18); IA-2482-490, SLAAGVKLL(시퀀스 동정번호:19); IA-2805-813, VIVMLTPLV(시퀀스 동정번호:20); ppIAPP5-13, KLQVFLIVL(시퀀스 동정번호:21); ppIAPP9-17, FLIVLSVAL(시퀀스 동정번호:22); IGRP152-160, FLWSVFMLI(시퀀스 동정번호:23); IGRP211-219, NLFLFLFAV(시퀀스 동정번호:24); IGRP215-223, FLFAVGFYL(시퀀스 동정번호:25); IGRP222-230, YLLLRVLNI(시퀀스 동정번호:26); IGRP228-236, LNIDLLWSV(시퀀스 동정번호:2); IGRP265-273, VLFGLGFAI(시퀀스 동정번호:3); IGRP293-301, RLLCALTSL(시퀀스 동정번호:27); 프로-인슐린L2-lO(Pro-insulinL2-lO), ALWMRLLPL(시퀀스 동정번호:28); 프로-인슐린L3-11, LWMRLLPLL(시퀀스 동정번호:29); 프로-인슐린L6-14, RLLPLLALL(시퀀스 동정번호:30); 프로-인슐린B5-14, HLCGSHLVEA(시퀀스 동정번호:31); 프로-인슐린BlO-18, HLVEALYLV(시퀀스 동정번호: 1); 프로-인슐린Bl4-22, ALYLVCGER(시퀀스 동정번호:32); 프로-인슐린Bl5-24, LYLVCGERGF(시퀀스 동정번호:33); 프로-인슐린Bl7-25, LVCGERGFF(시퀀스 동정번호:34); 프로-인슐린Bl8-27, VCGERGFFYT(시퀀스 동정번호:35); 프로-인슐린B20-27, GERGFFYT(시퀀스 동정번호:36); 프로-인슐린B21-29, ERGFFYTPK(시퀀스 동정번호:37); 프로-인슐린B25-Cl, FYTPKTRRE(시퀀스 동정번호:38); 프로-인슐린B27-C5, TPKTRREAEDL(시퀀스 동정번호:39); 프로-인슐린C20-28, SLQPLALEG(시퀀스 동정번호:40); 프로-인슐린C25-33, ALEGSLQKR(시퀀스 동정번호:41); 프로-인슐린C29-A5, SLQKRGIVEQ(시퀀스 동정번호:42); 프로-인슐린A1-1O, GIVEQCCTSI(시퀀스 동정번호:43); 프로-인슐린A2-1O, IVEQCCTSI(시퀀스 동정번호:44); 프로-인슐린A12-20, SLYQLENYC(시퀀스 동정번호:45) 또는 이들의 조합들이다.
또 다른 관점들에 있어서, 다발성 경화증(multiple sclerosis ; MS)에 연관된 펩티드 항원들은 MAG287-295, SLLLELEEV (시퀀스 동정번호:46); MAG509-517, LMWAKIGPV (시퀀스 동정번호:47); MAG556-564, VLFSSDFRI(시퀀스 동정번호:48); MBPI110-118, SLSRFSWGA (시퀀스 동정번호:49); MOG114-122, KVEDPFYWV(시퀀스 동정번호:50); MOG166-175, RTFDPHFLRV (시퀀스 동정번호:51); MOG172-180, FLRVPCWKI (시퀀스 동정번호:52); MOG179-188, KITLFVIVPV(시퀀스 동정번호:53); MOG188-196, VLGPLVALI(시퀀스 동정번호:54); MOGl8l-189, TLFVIVPVL(시퀀스 동정번호: 55); MOG205-214, RLAGQFLEEL(시퀀스 동정번호:56); PLP80-88, FLYGALLLA(시퀀스 동정번호: 57) 또는 이들의 조합들이 사용될 수 있고 그리고 포함된다.
특정의 관점들에 있어서, 상기 항원-주조직 적합성 복합체 복합체는 본 출원에서 기술되는 상기 나노구들에 가교화(crosslinked)(공액화(conjugated))될 수 있다. 나노구를 항원-주조직 적합성 복합체에 공액화시키는 하나의 비-제한적인 방법에는 (a) 항원-주조직 적합성 복합체 복합체를 공액화제(conjugating agent)와 반응시키고 그에 의하여 항원-주조직 적합성 복합체-복합체를 형성하고; 그리고 (b) 생체적합성, 생분해성 나노구를 단계 (a)의 상기 복합체에 반응시키는 것이 포함된다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 방법은 단계 (b)를 수행하기에 앞서 단계 (a)의 상기 복합체를 농축시키는 것을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 상기 공액화제는 다른 구체예에 있어서, 상기 공액화제에는 이종이중작용제(heterobifunctional agent)가 포함된다. 또 다른 구체예에 있어서, 상기 공액화제에는 DOTA-말레이미드(DOTA-maleimide)(4-말레이미도부티르아미도벤질-DOTA(4-maleimidobutyramidobenzyl-DOTA)), SMPT(4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜디티오)톨루엔-(4-succinimidyloxycarbonyl-α-methyl-α-(2-pyridylditio)toluene-), 술포-LC-SMPT(sulfo-LC-SMPT)(술포숙신이미딜-6-(알파-메틸-알파-(2-피리딜티오)톨루아미도)헥사노에이트(sulfosuccinimidyl-6-(a-methyl-a-(2-pyridylthio)toluamido)hexanoate)), 트라우트 시약(Traut's reagent)(2-이미노티올란-염산염(2-Iminothiolane-HCl)) 또는 이들의 임의의 조합이 포함된다. 마이크로입자(microparticles) 또는 나노입자에의 복합체들의 공액화의 상세에 대해서는 미합중국 공개특허 제20070059775호; 미합중국 특허 제4,671,958호, 동 제4,659,839호, 동 제4,414,148호, 동 제4,699,784호; 동 제4,680,338호; 동 제4,569,789호; 동 제4,589,071호; 동 제7,186,814호 및 동 제5543391호 유럽 특허출원 제188,256호를 참조하고, 이들의 상세한 설명은 본 출원에 참조로 포함된다.
자가면역 장애에는 진성 당뇨병(diabetes melitus), 이식 거부(transplantation rejection), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 조기 난소 부전(premature ovarian failure), 강피증(scleroderm), 쇼그렌병(Sjogren's disease), 낭창(lupus), 빌레레고(vilelego), 탈모증(alopecia ; 대머리(baldness)), 다선상 부전(polyglandular failure), 그레이브병(Grave's disease), 갑상선 기능 저하증(hypothyroidism), 다발성 근염(polymyosititis), 천포창(pemphigus), 크론병(Crohn's disease), 대장염(colititis), 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis), 뇌하수체 기능 저하증(hypopituitarism), 심근염(myocardititis), 에디슨병(Addison's disease), 자가면역성 피부병(autoimmune skin diseases), 포도막염(uveititis), 악성 빈혈(pernicious anemia), 부갑상선 기능 저하증(hypoparathyroidism) 및/또는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 특정의 관점들에 있어서, 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 펩티드성분은 자가항원 또는 자가항원 에피토프 또는 이들의 모방체로부터 유도되거나 또는 디자인되거나, 조사되어야 할 자가면역 반응에 포함되거나, 상기 치료에 의해 변성되거나 또는 둔화된다. 특정의 관점들에 있어서, 상기 자가항원은 펩티드, 탄수화물 또는 지질이다. 특정의 관점들에 있어서, 자가항원은 췌장 베타 세포 등과 같이 대상체의 특정의 세포들에 의해 발현되는 단백질, 탄수화물 또는 지질의 단편, 에피토프 또는 펩티드이며, IGRP, 인슐린, GAD 또는 IA-2 단백질의 단편이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 여러 이러한 단백질들 또는 에피토프들이 다양한 자가면역 상태들에 대하여 동정되었다. 상기 자가항원은 소섬-주변 슈반 세포(peri-islet Schwann cell) 등과 같은 제2의 내분비(endocrine) 또는 신경분비(neurocrine) 성분으로부터 유도되는 펩티드, 탄수화물, 지질 등이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점들에 있어서, 상기 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 상기 주조직 적합성 복합체 성분은 전통적이거나 또는 비-전통적인 주조직 적합성 복합체 클래스 I 또는 주조직 적합성 복합체 클래스 II 폴리펩티드 성분이다. 상기 주조직 적합성 복합체 클래스 I 성분에는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 분자의 전부 또는 일부, 특히 HLA-A*0201 주조직 적합성 복합체 클래스 I 분자 등과 같은 HLA-A 분자의 전부 또는 일부가 포함된다. 상기 비-전통적인 주조직 적합성 복합체 클래스 I 성분에는 CD1-유사 분자(CD1-like molecules)가 포함될 수 있다. 주조직 적합성 복합체 클래스 II 성분에는 HLA-DR, HLA-DQ 또는 HLA-DP의 전부 또는 일부가 포함될 수 있다. 특정의 관점들에 있어서, 상기 항원/주조직 적합성 복합체 복합체는 기질에 공유적으로(covalently) 또는 비-공유적으로(non-covalently) 결합되거나 또는 부착된다(항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체). 상기 기질은 전형적으로는 생체적합성 흡수성 나노구이다. 하나의 구체예에 있어서, 상기 나노구는 철 또는 철 산화물 등과 같은 금속을 포함한다. 다른 구체예에 있어서, 상기 나노구는 생체적합성, 생흡수성 중합체를 포함한다. 어느 경우에나, 상기 나노구는 생체 내에서의 상기 나노입자들의 축적이 제한되도록 생체 내에서 생흡수를 수행한다. 본 발명의 펩티드들은 기질에 화학적으로 결합될 수 있고, 특히 화학적 연결자 또는 펩티드 연결자를 경유하여 결합될 수 있다. CD1 분자들은 비전통적인 주조직 적합성 복합체 분자의 하나의 예이다. 비-전통적인 주조직 적합성 복합체 분자들은 비-전통적인 주조직 적합성 복합체 분자들은 종(species)들 중에서 비-다형성(non-polymorphic)의 보존된 그리고 좁고, 깊고, 소수성인 리간드 결합 포켓(ligand binding pockets)들을 소유하는 것으로서 특정된다. 이들 결합 포켓들은 자연살해 T(NKT) 세포들에 당지질(glycolipids) 및 인지질(phospholipids)을 제공할 수 있다. 자연살해 T 세포들은 자연살해 세포 마커(NK cell markers) 및 반-불변(semi-invariant) T 세포 수용기(T cell receptor ; TCR)를 공동-발현하는 독특한 림프구 개체군(lymphocyte population)을 나타낸다. 이들은 광대역의 질병들과 연관되는 면역 반응들의 조절에 연관된다.
특정의 구체예들에 있어서, 상기 치료에 의하여 확장된 상기 T 세포들은 상기 질병 과정에 의하여 사전-활성화(pre-activated)되고 그리고 기억 표현형(memory phenotype)을 갖는다. 하나의 관점에 있어서, T 세포들은 낮은 결합활성을 갖는 표적 에피토프를 인식하는 자가반응성 전구체들로부터 발생된다. 결합활성은 사량체 결합측정(tetramer binding assay) 등에 의해 결정될 수 있다. 다른 관점에 있어서, 상기 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체는 대상의 상기 자가면역 질병의 임상적인 증후군들의 발병(onset) 이전, 이후 또는 전후 모두에서 투여된다. 또 다른 관점에 있어서, 상기 방법은 치료 전 및/또는 후의 대상체의 혈당 수준(blood sugar levels) 등과 같은 자가면역 상태들의 생물학적 매개변수들을평가하는 것을 포함하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법들은 또한 임의의 자가반응성 면역 반응들의 평가를 포함하여 대상체의 자가면역 상태를 평가하는 것을 포함할 수 있다. 특정의 관점들에 있어서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포 또는 자연살해 T(NKT) 세포이다.
본 발명의 다른 구체예들에는 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체를 항-병원성 자가반응성 T 세포의 확장을 자극하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는 항-병원성 자가반응성 T 세포들을 확장하는 방법들이 포함된다. 특정의 관점들에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 또는 자연살해 T 세포이다.
또 다른 구체예들에 있어서, 본 발명은 대상체에 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체를 세포들 또는 상기 세포들을 포함하는 조직들의 파괴를 억제하기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하며, 여기에서 그로부터 유도되는 향원 또는 항원성 분자가 세포들과 연관된 자가항원으로부터 유도되는 것인 자가면역 반응, 특히 병원성 자가면역 반응으로부터 췌장 소섬 세포(pancreatic islet cells)들 등과 같은 대상체의 세포들을 보호하는 방법들을 포함한다.
또 다른 구체예에 있어서, 본 발명은 활성 자가면역성의 지표로서 항-병원성 CD8+ 또는 CD4+ T 세포 반응들의 치료-유발 확장(treatment-induced expansion)을 평가하는 것을 포함하는 자가면역성을 진단하는 방법들을 포함한다.
본 발명의 구체예들은 기질에 작동가능하게 결합된 항원/주조직 적합성 복합체 복합체(즉, 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체)를 대상체에 항병원성 자가반응성 T 세포들을 확장시키거나 또는 이식된 조직들 또는 기관들에 의해 발현된 동종항원(alloantigens)들 또는 자가항원들을 인식하는 항-병원성 세포들의 확장을 유도하기에 충분한 양으로 투여하는 것에 의하여 동종항원성 또는 자가면역 반응들에 의해 이식된 조직들의 거부를 예방, 완화 또는 치료하는 방법들을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예들은 세포 사멸 또는 자살을 예방하거나 또는 억제하는 것에 의하여 포유동물에서 예정된 형태의 기능 세포들, 예를 들면, 소섬 세포(islet cells)들의수를 증가시키거나 또는 유지하는 방법들을 제공한다. 특정의 구체예들에 있어서, 이 방법은 내인성 세포 및/또는 조직 재생이 요구되는 자가면역 질병을 치료하는 데 사용된다. 이러한 자가면역 질병들에는 비제한적으로
진성 당뇨병, 다발성 경화증, 조기 난소 부전, 강피증, 쇼그렌병, 낭창, 바이텔레고(vitelego), 탈모증(대머리), 다선상 부전, 그레이브병, 갑상선 기능 저하증, 다발성 근염, 천포창, 크론병, 대장염, 자가면역성 간염, 뇌하수체 기능 저하증, 심근염, 에디슨병, 자가면역성 피부병, 포도막염, 악성 빈혈, 부갑상선 기능 저하증, 류마티스성 관절염 등이 포함된다. 본 발명의 하나의 관점은 현존하는 자가면역성을 제거하는 한편으로 면역계(immune system)를 재교육(re-educating)시키는 신규한 2부(two-part)의 치료학적 접근법(therapeutic approach)을 제공한다.
특정의 관점들에 있어서, 상기 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체는 면역 반응, 예를 들면, 항체 반응(antibody response)을 유도하기 위하여 부형제(adjuvant)와 함께 투여될 필요는 없다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 조성물은 감소된 부형제(들)을 사용하거나 또는 부형제(들) 없이 항체를 생성하는 잘 알려진 폴리클로날(polyclonal) 및 단클론성(monoclonal) 항체와 함께 사용될 수 있다.
하기의 도면들은 본 상세한 설명의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정의 관점들을 더욱 입증하는 데 포함된다. 본 발명은 본 출원에서 제공되는 특정의 구체예들의 상세한 설명과 함께 이들 도면들 중의 하나 또는 그 이상을 참조하는 것에 의하여 더욱 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 1c. 낮은 결합활성의 자가반응성 17.6α/8.3β CD8+ T세포들은 항당뇨유발성이다. 도 1a, 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병(n=95) 대 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병(n=598)에서의 당뇨병의 빈도. 도 1b, 형질전환(Tg) 생쥐들에서의 인슐린염 점수(insulitis score)(17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병에 대하여는 n=6, 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병에 대하여는 n=3). 도 1c, 비 비만성 당뇨병(n=56) 대 림프구성맥락수막염바이러스-비 비만성 당뇨병(LCMV-NOD)(n=10)에서의 당뇨병의 빈도.
도 2a 내지 2b. 17.6α/8.3β T 세포 수용기의 발생생물학(developmental biology). 도 2a, 형질전환 생쥐들에서의 17.6α/8.3β 대 17.4α/8.3β T 세포 수용기의 발생생물학. 상부 패널(upper panels)들은 비장세포(splenocytes)들의 CD4 대 CD8 돗트플롯(dot plots)들을 나타내고 있다. 하부 패널(lower panel)은 NRP-V7/Kd 사량체로 염색한 CD8+ T 세포의 비교이다. 도 2b, RAG-2-/- 형질전환 생쥐들에서의 17.6α/8.30β 대 17.4α/8.3β T 세포 수용기들의 발생생물학. 상부 패널들은 비장세포들의 CD4 대 CD8 돗트플롯들을 나타내고 있다. 하부 패널은 NRP-V7/Kd 사량체로 염색한 CD8+ T 세포의 비교이다.
도 3. 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.RAG-2-/-(n=13) 대 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.RAG-2-/- 생쥐(n=106)에서의 당뇨병의 빈도.
도 4a 내지 4b. TCRa-/- 형질전환 생쥐들에서의 17.6α/8.3β 대 17.4α/8.3β TCR의 발생생물학. 도 4a, 상부 패널들은 비장세포들의 CD4 대 CD8 돗트플롯들을 나타내고 있다. 하부 패널은 NRP-V7/Kd 사량체로 염색한 CD8+ T 세포의 비교이다. 도 4b, 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-(n=14) 대 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐(n=28)에서의 당뇨병의 빈도. 돗트플롯 유세포분석기(fluorescense activated cell sorter ; FACS) 패널들 내의 값들은 각 사분의(quadrant) 내의 세포들의 백분율에 대응하고, 그리고 막대그래프(histogram) 패널들 내의 값들은 양성으로 염색된 세포들의 백분율(평균±표준오차(mean±SE)에 대응한다.
도 5a 내지 5j. 조절 기능(regulatory function)을 갖는 기억 T 세포들 내로의 17.6α/8.3β CD8+ T 세포들의 자발적 분화. 도 5a, 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/- 대 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 비장 CD8+ T 세포들의 대표적인 유세포분석기 프로파일(FACS profiles)들. 도 5b, 비장(17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-에 대하여는 n=12, 그리고 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-에 대하여는 n=9), 췌장림프절(pancreatic lymph nodes ; PLN)(17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-에 대하여는 n=9, 그리고 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-에 대하여는 n=6) 및 골수(BM)(17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-에 대하여는 n=4, 그리고 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-에 대하여는 n=3) 내에서의 CD44hi CD122+ CD8+ T 세포들의 백분율(평균±표준오차). 생쥐들은 9 내지 18주령이었다. 도 5c, NRP-V7/Kd 사량체 대 항-CD 122 Ab로 염색된 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 비장 CD8+ T 세포들의 대표적인 유세포분석기 프로파일들. 값들은 5개의 서로 다른 실험들의 평균±표준오차이다. 도 5d, 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 미접촉 대 기억 비장 CD8+ T 세포들의 표현형 분석(phenotypic analysis). 데이터들은 각 표지자(markcer)에 대하여 적어도 2개의 실험들의 대표들이다. 도 5e, TCRa-/- 형질전환 생쥐들로부터의 CD8+CD4+ 흉선세포(thymocytes)들 대 CD8+ 비장세포들 내에서의 CD122 염색의 비교. 데이터들은 4개의 실험들의 대표들이다. 도 5f, TCRa-/- 형질전환 생쥐들로부터의 비장 CD8+ T 세포에 의한 5'-브로모-2'-디옥시우리딘(5'-bromo-2'-deoxyuridine ; BrdU) 섭취. 도 5g, 상부 패널: 사이토카인 인터류킨-2(IL-2) 및 인터류킨-5(IL-5)(둘 다 100ng/㎖)에 대한 반응에서의 형질전환 생쥐들로부터의 비장 CD8+ T 세포의 증식의 대표적인 유세포분석기 프로파일. 하부 패널: 인터류킨-2 및 인터류킨-5의 서로 다른 농도에 대한 반응에서의 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 미접촉 대 기억 CD8+ T 세포들의 배확장(fold expansion). 데이터들은 적어도 3개의 실험들의 대표들이다. 도 5h, 24시간 및 48시간 후의 1㎍/㎖ NRP-A7로 펄스시킨 수지상 세포(DCs)들에 대한 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 비장의 미접촉 CD8+ T 세포들 대 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 미접촉의 그리고 기억 CD8+ T 세포들에 의한 감마-인터페론(IFN-γ)의 생산. 도 5i, 6시간 후의 1㎍/㎖ NRP-A7로 펄스시킨 직류전류에 대한 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 비장의 미접촉 CD8+ T 세포들 대 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 미접촉의 그리고 기억 CD8+ T 세포들로부터의 세포내(intra-cellular) 감마-인터페론 염색. 도 5j, 서로 다른 시점(time-points)들에서의 1㎍/㎖ NRP-A7로 펄스시킨 수지상 세포들에 대한 인터류킨-2의 생산 및 증식. 도 5h 및 5j 내에서의 데이터들은 4개의 실험들의 대표이며, 도 5i 내에서의 데이터들은 3개의 실험들의 대표이다.
도 6은 CFSE(carboxyfluorescin diacetate succinimidyl ester ; 카르복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르)-표지된 17.4α/8.3β CD8+ T 세포들의 증식. 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 미접촉 대 기억 CD8+ T 세포들(상부 패널) 또는 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병 대 림프구성맥락수막염바이러스-비 비만성 당뇨병 생쥐들로부터의 미접촉 CD8 T 세포들(하부 패널)의 존재 중에서의 직류전류 펄스시킨 NRP-A7에 대한 CFSE-표지된 17.4α/8.3β CD8+ T 세포들의 증식. 데이터들은 적어도 5개의 실험들의 대표이다.
도 7a 내지 7b. 기억 17.6α/8.3β CD8+ T 세포들이 항원-펄스시킨 항원제공세포(antigen-pulsed APCs)들을 사멸시킨다. 도 7a, NRP-A7 및 TUM-펄스시킨 골수 수지상 세포(TUM-pulsed BM DCs)들에 대한 17.4α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 새로이 단리된 미접촉 CD8+ T세포들 대 17.6α/8.3β-비 비만성 당뇨병.TCRa-/-생쥐들로부터의 미접촉의 그리고 기억 CD8+ T 세포들의 시험관 내 세포독성(cytotoxicity). 데이터들은 3개의 실험들의 대표이다. 정제된 골수 수지상 세포들을 1㎍/㎖ NRP-A7 또는 TUM으로 펄스시키고 그리고 [51Cr]-크롬산나트륨([51Cr]-sodium chromate)로 표지시켰다. 효과기:표적의 비 = 8:1(40000 효과기들:5000 표적 세포들). 8시간 후에 상청액(supernatant)을 수확하였다. 도 7b, 생체 내 세포독성 분석: NRP-A7-펄스시킨(CFSElo) 또는 TUM-펄스시킨(CFSEhi) B-세포(상부 패널들) 또는 새로이 단리된 비장 및 림프절(LN) 수지상 세포들(하부 패널들)을 1:1의 비율로 형질전환된 숙주(Tg hosts)들 내로 주입시켰다. B 세포들 또는 신선한 수지상 세포들(비장 및 림프절들로부터의)을 항-B220 또는 항-CD11c MACS(Magnetic-activated cell sorting ; 자력-활성화 세포 분류) 비드들을 사용하여 단리시키고, 10㎍/㎖의 펩티드들로 2시간 동안 펄스시키고, 세척하고, 37℃에서 CFSE(TUM: 3μM CFSE, NRP-A7: 0.33μM CFSE)로 3분 동안 표지시키고, 3회 세척하고 그리고 각 개체군으로부터 4 내지 5*106 세포들을 상기 숙주들 내로 주입시켰다. 18시간 후, 생쥐들을 희생시키고 그리고 비장세포들을 FACS 분석하였다.
도 8은 pMHC 공액화 PLGA(폴리(D,L-락타이드-공-글리콜리드(Poly(D,L-lactide-coglycolide)) 나노구들의 확대된 이미지를 묘사하고 있다.
도 9는 지시된 나노입자들/웰 농도에서의 IGRP/Kd-PLGA 나노구 복합체들에 대한 CD8+ T 세포들의 감마-인터페론 반응들을 묘사하고 있다.
본 발명이 기술된 특정의 구체예들로 제한되는 것은 아니며, 마찬가지로, 물론 변할 수 있다는 것은 이해되어야 한다. 또한 본 발명의 관점이 단지 첨부된 특허청구범위들에 의해서 제한될 것이기 때문에 본 출원에서 사용된 용어들이 단지 특정의 구체예들을 기술하는 것을 목적으로 하며, 제한되는 것을 의도하는 것은 아니다.
본 출원에서 사용된 바와 같이 그리고 첨부된 특허청구범위들에서, 정황에서 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태 "어느(a)", "어느(an)" 및 "그(the)"는 복수의 지시체(plural referents)들을 포함한다는 것을 주의하여야 한다. 따라서, 예를 들면, "하나의 첨가제(an excipient)"에 대한 언급은 복수의 첨가제들을 포함한다.
I. 정의들
달리 한정하지 않는 한, 본 출원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, 하기의 용어들은 하기의 의미들을 갖는다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)" 또는 "포함한다(comprises)"는 조성물 및 방법들이 언급된 성분들을 포함하나 그러나 다른 것들을 배제하지 않는다는 것으로 의도된다. "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은, 조성물 및 방법들을 한정하는 데 사용되는 경우, 언급된 목적에 대한 조합에 대한 임의의 필수적인 중요한 다른 요소들을 배제하는 것을 의미한다. 따라서, 본 출원에서 정의된 대로의 요소들로 필수적으로 이루어지는 조성물은 청구된 발명의 기본적이고 그리고 신규한 특성(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 다른 물질들 또는 단계들을 배제하지 않는다. "이루어지는(consisting of)"은 다른 구성성분(ingredients)들의 흔적요소(trace elements)들 및 실질적인 방법 단계들 이상을 배제하는 것을 의미한다. 이들 전환 용어(transition terms)들 각각에 의하여 한정되는 구체예들은 본 발명의 관점 내에 속한다.
"생체적합성(biocompatible)"에 대하여는, 전달시스템(delivery system)의 성분들이 조직 손상(tissue injury) 또는 인간의 생물학적 체계(human biological system)에 대한 손상을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 생체적합성을 부여하기 위해서는, 인간들에서의 안전한 사용의 역사를 갖거나 또는 GRAS(Generally Accepted As Safe ; 일반적으로 안전한 것으로 인정되는) 상태를 갖는 중합체들 및 첨가제들이 우선적으로 사용될 수 있다. 생체적합성에 대하여는, 상기 조성물에서 사용되는 상기 구성성분들 및 첨가제들이 극단적으로는 "생흡수되거나(bioabsorbed)" 또는 신체에 대하여 역효과(adverse effects)들을 갖지 않고 신체에 의하여 제거될 수 있는 것을 의미한다. 조성물이 생체적합성이 되고 그리고 비-독성인 것으로 고려되기 위해서는, 세포들에 대하여 독성을 야기하지 않아야 한다. 유사하게, 용어 "생흡수성(bioabsorbable)"은 환자 내에서의 장기간 축적(long term accumulation)이 회피되도록 시간의 일정한 기간에 걸쳐 생체 내에서 생흡수(bioabsorption)을 수행하는 물질로 만들어진 나노입자들을 의미한다. 바람직한 구체예에 있어서, 상기 생체적합성 나노입자는 2년 이하, 바람직하게는 1년 이하 그리고 심지어 보다 바람직하게는 6개월 이하의 기간에 걸쳐 생흡수된다. 생흡수의 속도는 상기 입자의 크기, 사용된 물질 및 숙련된 기술자(skilled artisan)에 의하여 잘 인식되는 다른 인자들에 연관된다. 생흡수성, 생체적합성 물질들의 혼합물이 본 발명에서 사용되는 상기 나노구들을 형성하는 데 사용될 수 있다. 하나의 구체예에 있어서, 철(III) 산화물 및 생체적합성, 생흡수성 중합체가 결합될 수 있다. 예를 들면, 철(III) 산화물 및 PGLA(폴리(글리콜리드-공-엘-락타이드(poly(glycolide-co-L-lactide))가 결합되어 나노입자를 형성할 수 있다.
항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체는 생체적합성, 생분해성 나노구 등과 같은 표면 상에의 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 다른 항원 분자 또는 단백질의 항원의 분절, 단편, 또는 에피토프(즉, 자가 펩티드(self peptide) 또는 자가항원(autoantigen))의 제공을 의미한다. 본 출원에서 사용된 바와 같은 "항원(antigen)"은 대상체 내에서 면역 반응 또는 항-병원성 세포들의 확장을 유도할 수 있는 분자의 전부, 일부, 단편 또는 분절을 의미한다.
용어 "약(about)"은, 수치적인 표시, 예를 들면, 범위를 포함하여 온도, 시간, 양 및 농도의 앞에서 사용되는 경우, (+) 또는 (-) 10%, 5% 또는 1%로 변할 수 있는 근사치(approximations)들을 나타낸다.
"살해(killing)" 또는 "살해한다(kills)"에 대하여는, 세포자멸사(apoptosis) 또는 "괴사(necrosis)"에 의한 세포 사멸(cell death)을 야기하는 것을 의미한다. 세포자멸사 또는 괴사는 임의의 세포 사멸 경로(cell death pathway)에 의하여 매개(mediated)될 수 있다.
"자가면역 세포(autoimmune cells)"에는, 예를 들면, 그로부터 상기 면역 세포가 유도되는 유기체 쪽으로 활성을 갖는 포유동물의 결손 항원 제공 세포(defective antigen presenting cells) 등과 같은 성인 비장세포(adult splenocytes), T 림프구(T lymphocytes), B 림프구(B lymphocytes) 및 골수 유래(bone marrow origin)의 세포들이 포함된다.
"모방체(mimic)"는 주어진 리간드 또는 펩티드의 상사체(analog)이며, 여기에서 상기 상사체는 상기 리간드에 대하여 실질적으로 유사하다. "실질적으로 유사(substantially similar)"는 상기 모방체가 총체적으로 상기 리간드의 분자량의 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하 또는 약 5% 이하로 계수되는 하나 또는 그 이상의 관능기(functional groups) 또는 변형(modifications)들을 갖는 것을 제외하고는 상기 리간드에 유사한 결합 프로파일(binding profile)을 갖는다는 것을 의미한다.
"유효량(effective amount)"은 의도하는 목적, 예를 들면, T 세포 활성 또는 T 세포 개체군들의 조절(modulation)을 달성하기에 충분한 양이다. 본 출원에서 상세하게 기술되는 바와 같이, 상기 유효량, 또는 투여량은 상기 목적 및 상기 항원에 의존적이며, 본 상세한 설명에 따라 결정될 수 있다.
"자가-반응성 T 세포(auto-reactive T cell)"는 "자가-항원(auto-antigen)"을 인식하는 T 세포이며, 이는 상기 T 세포를 포함하는 동일한 개체에 의해 생산되고 그리고 포함되는 분자이다. 자가반응성 T 세포는 CD8+ T 세포 또는 CD4+ T 세포가 될 수 있다. 더욱이, 상기 CD4+ T 세포는 T 조절 1(T Regulatory 1) 세포로 분류될 수 있다.
"병원성 T 세포(pathogenic T cell)"는 상기 T 세포를 포함하는 대상체에 해로운 T 세포이다. 반면에, 비-병원성 T 세포는 실질적으로 대상체에 해롭지 않으며, 항-병원성 T 세포들은 병원성 T 세포의 해로움(harm)을 감소시키거나, 완화시키거나, 억제시키거나 또는 무효화시킨다.
용어 "저해(inhibiting)", "감소(reducing)" 또는 "예방(prevention)" 또는 이들 용어들의 임의의 변형들은, 특허청구범위들 및/또는 상세한 설명에서 사용되는 경우, 임의의 측정가능한 감소 또는 소정의 결과를 달성하기 위한 완전한 억제를 포함한다.
특허청구범위 및/또는 상세한 설명에서 용어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우에 단어 "어느(a)", "어느(an)"의 사용은 "하나(one)"를 의미할 수 있으나, 그러나 이는 또한 "하나 또는 그 이상(one or more)", "적어도 하나(at least one)" 및 "하나 또는 하나 이상(one or more than one)"의 의미와 일치한다.
용어 "항-병원성(anti-pathogenic)"은 원인이 되는 질병에 대한 보호 효과를 갖는 세포들을 의미한다. 예를 들면, "항-병원성 자가반응성 CD8+ T 세포들(anti-pathogenic autoreactive CD8+ T cells)"은 제1형 당뇨병에 대하여 보호 효과를 갖는 세포들을 의미한다. "항-병원성 자가반응성 CD8+ T 세포들"은 또한 진단 및 치료적인 목표들(DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC TARGETS)로 표제된 세부항목 V.에 나열된 것들과 같은 다른 자가면역 질병들에 대하여 보호 효과를 갖는 세포들을 의미한다.
본 출원의 "나노구(nanosphere)"에 대하여는 이는 대상체에 투여가 가능한 작은 이산입자(discrete particles)들을 의미한다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 나노구들은 형상에 있어서 실질적으로 구형(spherical)이다. 본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 구형(substantially spherical)"은 상기 입자들의 상기 형상이 구형으로부터 약 10% 이상 벗어나지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 여러 공지된 항원 또는 펩티드 복합체들이 상기 입자들에 적용될 수 있다. 본 발명의 상기 나노구들은 크기에 있어서 약 10㎚ 내지 약 150㎚, 그리고 바람직하게는 약 10㎚ 내지 약 1㎛에 걸친다. 예를 들면, 그에 의하여 보다 큰 입자들이 수성 용액(aqueous solution) 내에서 침강되는 것을 허용하는 분획(fractionation)으로 보다 작은 나노크기의 입자들이 수득될 수 있다. 계속해서 상기 용액의 상층부(upper solution)는 회수된다. 이 상층부는 보다 작은 크기의 입자들로 풍부화(enriched)된다. 상기 공정은 소정의 평균 크기가 생성될 때까지 반복될 수 있다.
본 출원을 통하여, 용어 "약(about)"은 하나의 값이 값을 결정하기 위하여 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차(error)의 표준편차(standard deviation)를 포함하는 것을 나타내는 데 사용된다.
비록 상세한 설명이 단지 대체(alternatives) 만을 그리고 "및/또는(and/or)"을 의미하는 정의를 지지하고 있기는 하나, 명료하게 대체 만을 의미하도록 표시되거나 또는 대체들이 상호배타적(mutually exclusive)이지 않는 한, 특허청구범위들에서 용어 "또는(or)"의 사용은 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
본 출원 및 특허청구범위들 내에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체(antibody)" 또는 "면역글로블린(immunoglobulin)"은 상호호환적으로(interchangeably) 사용되며, 동물 또는 수령인(recipient)의 면역 반응의 일부로서 기능하는 임의의 여러 부류의 구조적으로 연관된 단백질들을 의미하며, 이러한 단백질들에는 면역글로블린 지(IgG), 면역글로블린 디(IgD), 면역글로블린 이(IgE), 면역글로블린 에이(IgA), 면역글로블린 엠(IgM) 및 연관된 단백질들이 포함된다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "면역원성제(immunogenic agent)" 또는 "면역원(immunogen)" 또는 "항원"들은 단독으로 또는 부형제와 함께 또는 전개 비히클(display vehicle) 상에 제공되어 수령인(recipient)에의 투여에 의하여 그 자체에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 분자를 기술하는 데 상호호환적으로(interchangeably) 사용된다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, "아미노 분자(amino molecule)"는 임의의 아미노산, 아미노산 유도체 또는 당해 기술분야에서 공지된 아미노산 모방체를 의미한다. 특정의 구체예들에 있어서, 단백질성 분자(proteinaceous molecule)의 잔기(residues)들은 아미노 분자 잔기들(amino molecule residues)의 시퀀스를 중단시키는(interrupting) 임의의 비-아미노 분자(non-amino molecule) 없이 순차적이다. 다른 구체예들에 있어서, 상기 시퀀스는 하나 또는 그 이상의 비-아미노 분자 부분들(non-amino molecule moieties)을 포함할 수 있다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 단백질성 분자의 잔기들의 상기 시퀀스는 하나 또는 그 이상의 비-아미노 분자 부분들에 의하여 중단될 수 있다.
따라서, 용어 "단백질성 조성물(proteinaceous composition)"은 천연적으로 합성된 단백질들 내의 20개의 공통 아미노산들 중의 적어도 하나 또는 적어도 하나의 변성되거나 특이한 아미노산(unusual amino acid)을 포함하는 아미노 분자 시퀀스들을 포함한다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은
＊ 질병 또는 상태를 방지하거나 또는 이들에 대하여 보호하는 것, 즉, 예를 들면, 이러한 질병 또는 상태로부터 고통받을 위험에 있는 대상체에서의 임상적 증후군들이 발달하지 않도록 하고, 그에 의하여 실질적으로 상기 질병 또는 상태의 발병을 회피하는 것,
* 질병 또는 상태를 억제하는 것, 즉, 임상적 증후군들의 발달을 포획하거나(arresting) 또는 억압하는 것(suppressing); 및/또는
＊ 질병 또는 상태를 완화시키는 것(relieving), 즉, 임상적인 증후군들의 퇴행(regression)을 야기하는 것
을 포함하여, 환자 내에서 질병 또는 상태(condition)의 임의의 치료를 의미한다.
본 발명의 다른 목적들, 특징들 및 잇점들은 이하의 상세한 설명으로부터 명백하게 될 것이다. 그러나, 비록 본 발명의 특정의 구체예들을 나타내기는 하나, 이 상세한 설명으로부터 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 본 발명의 정신 및 관점 내에서 여러 변화들 및 변경들이 명백할 수 있기 때문에, 상세한 설명 및 특정의 실시예들은 단지 설명의 방법으로만 주어진다.
지금까지의 관측들(문헌 Han et aI., 2005 참조)이 자가면역성에서 효과적인 것으로 펩티드 요법(peptide therapy)이 표적 다중 에피토프 특이성(target multiple epitope specificities)을 가질 것이라는 것을 암시하고 있다. 가용성 펩티드(soluble peptides)들이 펩티드-특이적 T-세포 내성(peptide-specific T-cell tolerance)을 유도할 수 있으나, 그러나 다중-특이성 자가면역 반응(poly-specific autoimmune responses)들을 둔화시킬 수는 없다. IGRP 단독의 경우에 있어서, 투여량 당 수 밀리그램(㎎)의 펩티드를 필요로 하기 때문에 이를 펩티드로 수행하는 것은 고도로 비현실적일 수 있다고 본 발명자들은 추론하였다. 항원제공세포들 상에 고정된 주조직 적합성 복합체 분자들에 결합되는 경우에 펩티드들이 훨씬 더 면역관용성(즉, 보다 낮은 양들에서)이기 때문에(문헌 Miller et aI., 1979 참조), 나노구들 상의 항원/주조직 적합성 복합체 복합체들, 예를 들면, 펩티드/주조직 적합성 복합체 복합체들(공동자극 분자들 없이)의 전신적 전달(systemic delivery)이 펩티드들 단독에 비하여 보다 더 면역관성이 될 수 있다. 이러한 생각은 초기에 소섬 염증(islet inflammation)을 이미지화하는 데 고려된 시약의 이용가능성(availability)으로부터 발달하였다. 본 발명자들은 자기공명(magnetic resonance ; MR) 이미지화에 적용가능한 탐침(probe)을 순환하는 8.3-형 CD8+ T 세포들에 특이적으로 전달할 것을 고려하였다(NRP-V7/Kd 복합체들로 코팅된 철 산화물 나노구들)(문헌 Moore et aI., 2004 참조). 특히, 본 발명자들은 제1형 당뇨병 발달에 요구되는 문턱값(threshold) 이하의 다중 T-세포 특이성들의 동시적 탈락을 유도하기 위한 방법으로서 이들 나노구들을 여러 서로 다른 항원/주조직 적합성 복합체 복합체들로 코팅하는 것을 고려하였다. 가장 놀랍게도, 고체에 부착된 pMHC 복합체들이 에피토프-특이적 방법으로 다른 자가항원 특이성들의 요구를 억제하는 자가항원-경험 자가반응성 CD8+ 세포들을 확장시키는 것에 의하여 기능한다는 것이 발견되었다. 이러한 치료방향(therapeutic avenue)은 이러한 장애들의 치료에 있어서의 숙원인 전신적 면역을 손상시킴이 없이 자가면역을 무디게 할 수 있는 질병-특이적 '나노백신(nanovaccines)'의 합리적인 디자인을 가능하게 하는 만성 자가면역 반응들의 진행에서의 새로운 패러다임(new paradigm)을 개척한다. 상기한 패러다임에 따르면, 나노입자들(NPs) 상에 리간드로서 코팅되는 경우에 상기 질병(수백개들 중에서)에 포함되는 임의의 단일의 에피토프(pMHC) 특이성이 사용되어 복합 자가면역 반응(complex autoimmune responses)들을 무디게 할 수 있다. 다량체성 가용성 pMHC들(multimeric soluble pMHCs)이 그들의 나노입자-결합된 상대(NP-coupled counterparts)들에 의해 유도되는 면역 반응들의 형태를 이끌어낼 수 없기 때문에 상기 입자/고체 지지체 성분은 필수적이다. 상기 입자는 pMHC의 월등한 다량체화(multimerization)를 가능하게 한다. 따라서, 그의 발견을 가능하게 한 이러한 패러다임 및 상기 치료적 접근법은 자가면역에서의 새로운 부류의 치료법들에 대한 플랫폼(platform)을 제공한다.
항원/주조직 적합성 복합체 복합체들로 코팅된 나노입자들(항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체)가 APL(acute promyelocytic leukemia ; 급성 전골수성 백혈병)-처치된 생쥐에서의 제1형 당뇨병의 보호를 제공하는 저-결합활성(low-avidity), 항-병원성, 자가반응성 CD8+ 세포들의 형태를 확장시킬 수 있다는 것이 고려된다(문헌 Han et al., 2005; Maree et al., 2006 참조). 이들 나노구들이 기억 자가반응성 CD8+ T-세포들의 사전-존재하는 풀(pre-existing pool)을 확장할 수 있다는 것 또한 고려된다(즉, 이들은 기억 T 세포들을 새로이 유도하지는 않는다). 이들 사전-존재하는 풀들이 우성적으로(배타적이지 않은 경우) 낮은 결합활성(항-병원성) 자가반응성 CD8+ 클로노타입(clonotypes)들로 구성된다고 여겨진다. 이들 T-세포들이 그들의 내생적인 표적 베타 세포 자가항원(endogenous target beta cell autoantigen)에의 만성적인 노출에 의하여 활성화-유도 세포 사멸(activation-induced cell death)을 수행하기 때문에 이들 T-세포들의 고-결합활성 상대들(high-avidity counterparts)(병원성 활성을 갖는)은 아마도 기억 세포들로서 생체 내에서 생존하지는 못할 것이나, 그러나 본 발명을 임의의 특정한 이론으로 제한되지는 않는다. 이들 나노구들이 자가반응성 CD8+ T-세포들의 만연하는 개체군이 유효하게 되도록 표적할 필요가 없다고 여겨지며; 버금우세적인(subdominant) 펩티드/주조직 적합성 복합체 복합체로 코팅된 나노구들에 대하여 유사한 결과들이 수득되었다. 게다가, 이러한 기술이 정의된 결합활성의 변형된 펩티드 리간드들의 디자인을 필요로 하지 않는 것으로 여겨지며(펩티드들에 대한 경우와는 달리), 따라서 임의의 표적 항원 또는 펩티드/주조직 적합성 복합체 표적을 수용할 수 있는 가능성을 갖는다. 이러한 기술이 임상시험(clinical trials)들에서 어느 정도 가능성을 보여준 비-항원특이적 접근법인 항-CD3 mAb 치료에 대하여 수득된 것에 비해 더 낫지는 않을지라도 적어도 필적하는 속도로 새로이 진단된 제1형 당뇨병을 앓는 비 비만성 당뇨병 생쥐에서의 정상혈당을 회복할 수 있다고 고려된다(문헌 Herold et al., 2002; Keymeulenet al., 2005 참조).
본 발명의 상기 조성물들이 기억 자가반응성 CD8+ T-세포들의 사전-존재하는 풀을 확장시키는 데 사용될 수 있다고 여겨진다(즉, 이들이 기억 T 세포들을 새로이 유도할 수 있을 것으로는 여겨지지 않는다). 이들 사전-존재하는 풀들이 우성적으로(배타적이지 않은 경우) 낮은 결합활성(항-병원성) 자가반응성 CD8+ 클로노타입들로 구성된다고 여겨진다. 이들 T-세포들의 고-결합활성 상대들(병원성 활성을 갖는)은 기억 세포들로서 생체 내에서 생존하지는 못할 것이며, 미접촉 T 세포들로서 우성적으로 존재한다. 또한 공동자극(costimulation)의 부재 중에서의 자가항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체들의 연계에 의하여 미접촉 T 세포들이 세포 사멸을 수행하는 것으로 여겨지며, 따라서 본 발명은 미접촉 병원성 T 세포들을 탈락시키고 그리고 항-당뇨병유발성 기억 T 세포들을 확장시킬 수 있다. 기술된 상기 조성물들이 자가반응성 CD8+ T-세포들의 만연하는 개체군이 유효하게 되도록 표적할 필요가 없다. 특정의 구체예들에 있어서, 상기 조성물들 및 방법들은 자가반응성 T 세포 내성을 유도하는 데 사용될 수 있다.
상기 생분해성, 생흡수성 나노구들이 비생분해성, 비-생흡수성 고체 지지체 상에 코팅된 pMHC/항원 복합체들과 비교하여 놀랍고도 예기치 못한 결과들을 가질 수 있다는 것이 고려된다. 이들 예기치 못한 결과들에는 감소된 독성이 포함된다. 감소된 독성은 신체 전체를 통하여 기관들 및/또는 조직들 내에의 상기 나노구의 축적에서의 감소를 의미할 수 있다. 감소된 독성은 또한 신체 전체를 통하여 기간들의 염증의 감소 또는 조직 손상의 감소 등과 같은 원치 않는 생물학적 반응에서의 감소를 의미할 수 있다. 염증 및 조직 손상들은 숙련된 기술자(artisan)에 의해 공지된 방법들로 쉽게 결정될 수 있는 평가들이다. 상기 생분해성, 생흡수성 나노구들이 신체에 의해 보다 관용될 수 있을 것이라는 것 또한 고려된다. 이는 치료학적 투여량(therapeutic dose)에서의 감소 또는 증가 또는 보다 효율적인 치료학적 반응(therapeutic response)를 야기할 수 있다. 상기 자가면역에 관한 한 상기 치료학적 반응은 실시예들에서 기술된 분석법들에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에 있어서, 상기 생분해성, 생흡수성 물질은 상기 나노구의 예견된 생체 내 반감기(predicted in vivo half-life)에 기초하여 숙련된 임상의(clinician)에 의해 선택된다. 상기 반감기는 사용된 물질 및 상기 나노구의 크기 등과 같은 상기 나노구의 물리적인 특성들에 기초하여 쉽게 결정될 수 있다. 바람직한 구체예에 있어서, 분해의 속도는 임상의가 최대 치료학적 효과가 달성되는 것으로 결정하는 시간틀(time frame)에 대응된다. 따라서, 예견된 시간틀 내에서 분해되고 그리고 최소한의 불리한 부작용(adverse side-effects)들을 가질 수 있는 물질의 선택으로 인하여 상기 생분해성, 생흡수성 나노구들이 개선된 그리고 우월한 치료학적 능력을 가질 수 있다는 것이 고려된다.
II. 약제학적 조성물들 및 투여(PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND ADMINISTRATION)
본 발명은 자가반응성 상태(autoreactive condition)를 예방하거나 또는 완화하는 방법을 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 여러 구체예들에서 사용하기 위한 "백신(vaccines)" 또는 면역계 조절제(immune system modifiers)들을 고려한다. 백신으로서 사용하기에 적절할 것으로 제안되는 조성물들이 자가반응성 단백질들 및 이들의 단편들을 포함하여 자가반응성 분자들로부터 제조될 수 있다. 본 발명에는 자가반응성 항원, 예를 들면, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자 또는 분자성 단편(molecular fragment)에 대하여 그리고 이러한 자가면역 반응에 의해 야기되는 상태 또는 질병의 발달에 대한 면역 반응을 유도하거나 또는 변성시키기 위한 조성물들이 포함된다.
본 발명의 조성물들은 통상적으로 비경구적으로(parenterally), 예를 들면, 주사에 의하여 정맥내로(intravenously), 피하로(subcutaneously) 또는 근육내로(intramuscularly) 투여될 수 있다. 다른 투여의 모드들에 적절한 별도의 제제들에는 경구 제제(oral formulations)들이 포함된다. 경구 제제들에는, 예를 들면, 약제학적 등급(pharmaceutical grades)의 만니톨(mannitol), 락토오스(lactose), 녹말(starch), 스테아린산마그네슘(magnesium stearate), 사카린나트륨(sodium saccharine), 셀룰로오스(cellulose), 탄산마그네슘(magnesium carbonate) 등과 같이 통상적으로 사용되는 첨가제들이 포함된다. 이들 조성물들은 용액(solutions), 현탁액(suspensions), 정제(tablets), 알약(pills), 캡슐(capsules), 서방제(sustained release formulations) 또는 분말(powders)의 형태를 취할 수 있으며, 약 10% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성성분(active ingredient)을 포함한다.
전형적으로, 본 발명의 조성물들은 투여량 제제(dosage formulation)에 적합한 방법으로 그리고 치료학적으로 유효하고 그리고 면역을 조절할 수 있는 양으로 투여된다. 투여되어야 하는 양은 치료되어야 하는 대상체에 의존한다. 투여되어야할 것으로 요구되는 활성성분의 정확한 양들은 의사(practitioner)의 판단에 의존한다. 그러나, 적절한 투여량 범위들은 매 투여 당 10 내지 수백 나노그램(ng) 또는 마이크로그램(㎍)의 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 크기이다. 초기 투여 및 촉진제(boosters)들에 대한 적절한 체제들이 또한 가변적이나, 그러나 초기 투여에 후속하여 후속 투여가 전형적이다.
적용의 방법은 폭넓게 변화될 수 있다. 백신의 투여를 위한 임의의 통상적인 방법들이 적용가능하다. 이들에는 고형의 생리학적으로 수용가능한 베이스(base) 상의 또는 생리학적으로 수용가능한 분산 내의 경구 적용(oral application), 비경구적으로, 주사에 의하여 등이 포함되는 것으로 여겨진다. 상기 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 투여량은 투여의 경로에 의존할 수 있으며, 대상체의 크기 및 건강에 따라 변할 수 있다.
많은 경우들에 있어서, 대략 최대로 약 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 다중 투여(multiple administrations)들이 바람직할 수 있다. 상기 투여들은 정상적으로는 2일 내지 12주의 간격, 보다 일반적으로는 1 내지 2주의 간격에 걸칠 수 있다. 0.5 내지 5년, 대개는 2년의 간격들에서의 주기적인 촉진제들이 상기 면역계의 상태를 유지하는 데 바람직할 수 있다. 상기 투여들의 과정에는 치료법 및 치료를 감시하기 위한 면역 반응 및 T 세포 활성에 대한 분석들이 후속될 수 있다.
A. 조합요법(Combination Therapy)
본 발명의 상기 조성물들 및 연관된 방법들, 특히 항원/주조직 적합성 복합체/공동-자극 분자/나노입자 복합체의 투여는 또한 전통적인 요법들의 투여와 결합되어 사용될 수 있다. 이들에는 면역억제(immunosuppressive) 또는 조절 요법제들 또는 치료드제들의 투여가 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
하나의 관점에 있어서, 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체가 사이토카인 치료(cytokine treatment)와 함께 사용된다는 것이 고려된다. 달리, 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체 투여가 선행되거나 또는 수 분 내지 수 주의 범위의 간격들로 다른 치료에 후속할 수 있다. 다른 약제(agents)들 및/또는 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체들이 개별적으로 투여되는 구체예들에 있어서, 상기 약제와 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체가 여전히 상기 대상체에 대하여 유리하도록 결합된 효과를 발휘하는 것이 가능하도록 하여 각 전달의 시간 사이에서 명백한 시간의 기간이 만료되지 않는다는 것이 일반적으로 확신된다. 이러한 경우들에서, 서로의 약 12 내지 24시간 이내에 그리고 보다 바람직하게는 서로의 약 6 내지 12시간 이내에 두 양상들(both modalities) 모두가 투여될 수 있다는 것이 고려된다. 그러나, 일부 상황들에서, 투여를 위한 시간 기간(time period)을 명백하게 연장하는 것이 바람직하며, 여기에서 개개 투여들 사이에서 수 일(2, 3, 4, 5, 6 또는 7일) 내지 수 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주)가 경과한다.
여러 조합들이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체 투여가 "A"이고, 그리고 상기 별도의 약제가 "B"이며:
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인 여러 조합들이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 펩티드-주조직 적합성 복합체-복합체 조성물들의 환자/대상체에의 투여는 만일 있다면 독성을 고려하여 이러한 화합물들의 투여를 위한 일반적인 프로토콜(protocols)들을 따를 수 있다. 필요에 따라 치료 주기(treatment cycles)들이 반복될 수 있다는 것이 기대된다. 수화(hydration) 등과 같은 여러 표준 치료법(standard therapies)들이 상기 기술된 치료법과 조합하여 적용될 수 있다는 것이 고려된다.
B. 약제학적 조성물(Pharmaceutical Compositions)
일부 구체예들에 있어서, 약제학적 조성물들이 대상체에 투여된다. 본 발명의 다른 관점들에는 유효량의 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체 조성물을 환자에 투여하는 것이 포함된다. 부가적으로, 이러한 조성물은 상기 면역계의 조절제(modifiers)들과 함께 투여될 수 있다. 이러한 조성물들은 일반적으로 약제학적으로 수용가능한 담체(carrier) 또는 수성 매질(aqueous medium) 내에 용해되거나 또는 분산될 수 있다.
문구 "약제학적으로 수용가능한(pharmaceutically acceptable)" 또는 "약물학적으로 수용가능한(pharmacologically acceptable)"은 동물 또는 인간에 투여되는 경우에 부작용(adverse reaction), 알러지 반응(allergic reaction) 또는 다른 부반응(untoward reaction)을 생성하지 않는 분자 실체들(molecular entities) 및 조성물들을 의미한다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, "약제학적으로 수용가능한 담체"에는 임의의 그리고 전체 용매(solvents), 분산 매질(dispersion media), 코팅(coatings), 항생제 및 항진균제(antibacterial and antifungal agents), 등장 및 흡수지연제(isotonic and absorption delaying agents) 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질들(pharmaceutical active substances)에 대한 이러한 매질 및 약제들의 사용은 당해 기술분야에서는 잘 알려져 있다. 임의의 통상의 매질 또는 약제가 상기 활성 성분들과 함께 쓸 수 없는(incompatible) 것이 아닌 한에서는 면역원성 및 치료학적 조성물(immunogenic and therapeutic compositions)들에서의 그의 사용이 고려된다.
본 발명의 활성 화합물(active compounds)들은 비경구 투여를 위하여, 즉 정맥내, 근육내, 피하 또는 심지어 복강내 경로들을 경유하는 주사용으로 제형화될 수 있다. 대상체의 면역상태를 조절하는 항원/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체를 포함하는 수성 조성물의 제조는 본 상세한 설명에 비추어 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 이해될 수 있을 것이다. 전형적으로 이러한 조성물들은 액체 용액 또는 현탁액으로서의 주사가능물질(injectables)로 제조될 수 있거나; 주사에 앞서 액체의 첨가에 의하여 용액 또는 현탁액을 제조하기에 적절한 고체 형태들로도 제조될 수 있으며; 또한, 상기 제제들은 또한 에멀젼화될 수 있다.
주사가능한 용도에 적절한 약제학적 형태들에는 멸균 수용액 또는 현탁액; 참기름(sesame oil), 땅콩유(peanut oil) 또는 수성 프로필렌글리콜(aqueous propylene glycol)을 포함하는 제제들; 및 멸균의 주사가능한 용액 또는 현탁액의 즉시 제조(extemporaneous preparation)를 위한 멸균 분말(sterile powders)들이 포함된다. 모든 경우들에 있어서 상기 형태는 멸균이어야 하고 그리고 쉽게 주사될 수 있을 정도의 액체이어야 한다. 이는 또한 제조 및 저장의 조건들 하에서 안정적이어야 하며 또한 박테리아(bacteria) 및 균류(fungi) 등과 같은 미생물의 오염 작용(contaminating action)에 대하여 보존되어야 한다.
상기 조성물들은 중성 또는 염의 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 수용가능한 염들에는 산부가염들(acid addition salts)(단백질의 유리 아미노기들로 형성된)이 포함되며, 이들은 예를 들면 염산 또는 인산 등과 같은 무기산 또는 초산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산들로 형성된다. 유리 카르복실기들로 형성된 염들이 또한 예를 들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 철수산화물(ferric hydroxides) 등과 같은 무기 염기(inorganic bases) 및 이소프로필아민(isopropyl amine), 트리메틸아민(trimethylamine), 히스티딘(histidine), 프로케인(procaine) 등과 같은 유기 염기(organic bases)들로부터 유도될 수 있다.
상기 담체는 또한 예를 들면 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리(에틸렌글리콜) 등), 이들의 적절한 혼합물들 및 식물성 오일(vegetable oils)을 포함하는 용매 또는 분산 매질이 될 수 있다. 적절한 유동성(proper fluidity)은 예를 들면 레시친(lecithin) 등과 같은 코팅의 사용에 의하여, 분산의 경우에서 요구되는 입자 크기의 유지에 의하여 그리고 계면활성제의 사용에 의하여 유지될 수 있다. 예를 들면, 파라벤(parabens), 클로로부탄올(chlorobutanol), 페놀(phenol), 소르빈산(sorbic acid), 티메로살(thimerosal) 등의 여러 항균제 및 항진균제들에 의하여 미생물들의 작용의 방지가 이루어질 수 있다. 많은 경우들에 있어서, 등장화제(isotonic agents), 예를 들면, 설탕 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 조성물 내에서의 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 스테아린산알루미늄(aluminum monostearate) 및 젤라틴의 사용에 의하여 상기 주사가능한 조성물들의 연장된 흡수가 이루어질 수 있다.
필요에 따라 여러 앞서 열거된 다른 성분들과 함께 적절한 용매 내에 요구되는 양으로의 상기 활성 화합물들을 포함시키고 후속하여 멸균하는 것에 의하여 멸균의 주사가능한 용액들이 제조된다. 상기 용액의 멸균은 상기 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구의 항-병원 특성(anti-pathogenic properties)을 감소시키지 않는 방법으로 수행될 수 있다. 일반적으로, 기본 현탁 매질(basic dispersion medium) 및 상기 열거된 것들로부터의 요구되는 다른 성분들을 포함하는 멸균 비히클(sterile vehicle) 내로 여러 멸균된 활성 성분들을 포함시키는 것에 의하여 현탁액이 제조된다. 멸균의 주사가능한 용액들의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에 있어서, 바람직한 제조방법은 진공-건조(vacuum-drying) 및 동결-건조(freeze-drying) 기술들이며, 이들은 상기 활성 성분 더하기 앞서의 그의 멸균된 용액으로부터의 임의의 부가의 요구되는 성분의 분말을 수득한다. 이러한 용액의 멸균의 하나의 방법은 멸균 여과(sterile filtration)이나, 그러나, 본 발명은 상기 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체들의 항-병원 특성들을 명백하게 감소시키지 않는 임의의 멸균 방법을 포함하는 것으로 의도된다. 고압살균(autoclaving) 등과 같은 강한 열 및 압력을 포함하는 멸균의 방법들은 상기 복합체의 3차원 구조를 위태롭게 하고, 그에 따라 상기 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 항-병원 특성을 명백하게 감소시킬 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물들의 투여는 전형적으로는 임의의 통상 경로(common route)를 경유할 수 있다. 이에는 정상위치 내(orthotopic), 피내(intradermal), 피하, 근육내, 복강내(intraperitoneal), 비강내(intranasal) 또는 정맥내 주사가 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 특정의 구체예들에 있어서, 백신 조성물은 흡입될 수 있다(예를 들면, 그의 전체로서 참조로 특별히 포함되는 미합중국 특허 제6,651,655호).
치료학적 또는 예방학적 조성물의 유효량은 의도하는 목표에 기초하여 결정된다. 용어 "단위 투여량(unit dosage)"은 각 단위가 그의 투여 즉, 적절한 경로 및 체제와 연관하여 앞서 논의된 소정의 반응들을 생성하도록 계산된 상기 조성물의 사전설정된 양을 포함하는, 대상체에서 사용하기 적절한, 물리적으로 이산된 단위들을 의미한다. 치료의 횟수 및 단위 투여량 둘 다에 따라 투여되어야 할 양은 요구되는 결과 및/또는 보호에 의존적이다. 상기 조성물의 정확한 양들은 또한 의사의 판단에 의존적이며, 각 개체에 특유하다. 투여량에 영향을 주는 매개변수들에는 대상체의 물리적 및 임상적인 상태, 투여의 경로, 치료의 의도하는 목표(증후근들의 완화 대 치유), 그리고 특정의 조성물의 효능(potency), 안정성 및 독성이 포함된다. 제형화에 의하여, 투여량 제형(dosage formulation)에 적합한 방법으로 그리고 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 양으로 용액이 투여될 수 있다. 상기 제형들은 앞서 기술된 주사가능한 용액들의 형태 등과 같은 다양한 투여 형태들로 쉽게 투여된다.
C. 시험관 내 또는 생체 외 투여(In Vitro or Ex Vivo Administration)
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 시험관 내 투여(in vitro administration)는 배양 중의 세포들을 포함하나 이들에 제한되지 않는 대상체로부터 또는 대상체의 외부로 제거된 세포들에 대하여 수행되는 조작들을 의미한다. 용어 생체 외 투여(ex vivo administration)는 시험관 내에서 조작되고 그리고 후속하여 대상체에 투입되는 세포들을 의미한다. 용어 생체 내 투여(in vivo administration)는 투여를 포함하여 대상체 내에서 수행되는 모든 조잘들을 포함한다.
본 발명의 특정의 관점들에 있어서, 상기 조성물들은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에 투여될 수 있다. 특정의 시험관 내 구체예들에 있어서, 자가유래의 T 세포들(autologous T cells)이 본 발명의 조성물들과 함께 배양된다. 계속해서 상기 세포들이 시험관 내 분석을 위하여 또는 달리 생체 외 투여를 위하여 사용될 수 있다.
III. 항원/주조직 적합성 복합체 복합체들(MHC COMPLEXES)
본 발명의 전통적 및 비-전통적인 주조직 적합성 복합체 분자들에 의하여 제공되는 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 다른 분자들을 포함하나 이들에 제한되지 않는 항원성 종(antigenic species)들로부터 유래되는 분절, 단편 및 다른 분자들을 포함하는 항원들이 전형적으로 주조직 적합성 복합체 분자 또는 그의 유도체에 복합체화(complexed)되거나 또는 작동가능하게 결합된다. T 림프구들에 의한 항원 인식이 주조직 적합성 복합체(MHC)-제한적이다. 주어진 T 림프구는 단지 이것이 특정의 주조직 적합성 복합체 분자에 결합되는 경우에만 항원을 인식할 것이다. 일반적으로, T 림프구들은 단지 자체 주조직 적합성 복합체 분자(self MHC molecules)들의 존재에서만 자극되고, 그리고 항원은 자체 주조직 적합성 복합체 분자들에 결합된 항원의 단편들로서 인식된다. 주조직 적합성 복합체 제한(MHC restriction)은 인식된 항원의 면에서 그리고 그의 항원성 단편(들)에 결합되는 상기 주조직 적합성 복합체 분자의 면에서 T 림프구 특이성(T lymphocyte specificity)을 의미한다. 특정의 관점들에서 특정의 항원들이 특정의 주조직 적합성 복합체 분자들 또는 그들로부터 유도되는 폴리펩티드들과 짝지워질 것이다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "작동가능하게 결합된(operatively coupled)" 또는 "코팅된(coated)"은 개개 폴리펩티드(예를 들면, 주조직 적합성 복합체) 및 항원성(예를 들면, 펩티드) 화합물들이 결합되어 표적 부위(target site), 예를 들면, 면역세포에 결합하기에 앞서 상기 활성 복합체를 형성하는 상황을 의미한다. 여기에는 대상체에의 투여에 앞서 상기 개개 폴리펩티드 복합체 화합물들이 시험관 내에서 합성되거나 또는 재조합적으로 발현되고 그리고 후속하여 단리되고 결합되어 복합체를 형성하는 상황; 키메라 또는 융합 폴리펩티드(chimeric or fusion polypeptide)(즉, 상기 복합체의 각 이산된 단백질 성분이 단일의 폴리펩티드 쇄(polypeptide chain) 내에 포함되는)가 합성되거나 또는 온전한 복합체(intact complex)로서 재조합적으로 발현(recombinantly expressed)되는 상황;이 포함된다. 전형적으로는, 폴리펩티드 복합체들이 상기 나노구들에 첨가되어 분자들의 수 : 나노구들의 비들의 비가 약, 적어도 약 또는 최대로 약 0.1, 0.5, 1, 10, 100, 500, 1000 또는 그 이상 : 1, 보다 전형적으로는 0.1: 1 내지 50 : 1을 갖는 흡수되거나 또는 결합된 폴리펩티드 복합체들을 갖는 나노구들이 수득된다. 상기 나노구들의 상기 폴리펩티드 함량은 표준 기술들을 사용하여 결정될 수 있다.
A. 주조직 적합성 복합체 복합체(MHC Molecules)
세포 내(intracellular) 및 세포 외(extracellular) 항원들은 인식과 적절한 반응의 관점들에서 둘 다 상기 면역계에 대하여 상당히 서로 다른 난관(challenges)들을 제공한다. T 세포들에 대한 항원들의 제공은 분자 주조직 적합성 복합체 클래스 I(MHC-I) 및 주조직 적합성 복합체 클래스 II(MHC-II)의 두 가지 구별되는 클래스들에 의해 매개되며, 이들은 구별되는 항원 제공 경로들을 활용한다. 세포 내 항원들로부터 유도되는 펩티드들은 주조직 적합성 복합체 클래스 I 분자들에 의해 CD8+ T 세포들에 제공되며, 이들은 실제로 모든 세포들에 대하여 발현되는 한편으로, 세포 외 항원-유도 펩티드들은 주조직 적합성 복합체-II 분자들에 의해 CD4+ T 세포들에 제공된다. 그러나, 이러한 이분(dichotomy)에 대해서는 특정의 예외들이 존재한다. 내포작용된 입자(endocytosed particulate) 또는 가용성 단백질(soluble proteins)들로부터 생성된 펩티드들이 수지상 세포(dendritic cells)들에서와 마찬가지로 마크로파지(macrophages)들에서도 주조직 적합성 복합체-I에 대하여 제공된다는 것이 여러 연구들에서 밝혀졌다. 본 발명의 특정의 구체예들에 있어서, 자가항원으로부터 유도된 특정의 펩티드가 적절한 주조직 적합성 복합체 클래스 I 또는 II 폴리펩티드라는 맥락에서 상기 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체 내에서 동정되고 그리고 제공된다. 특정의 관점들에 있어서, 대상체의 유전자 구성(genetic makeup)이 평가되어 어느 주조직 적합성 복합체 폴리펩티드가 특정의 환자에 대하여 그리고 특정의 펩티드들의 세트(set)가 사용될 수 있는 지를 결정할 수 있다.
비-전통적인 주조직 적합성 복합체 분자들이 본 발명의 주조직 적합성 복합체 복합체들에서 사용되는 것이 또한 고려된다. 비-전통적인 주조직 적합성 복합체 분자들은 비-다형성의 보존된 그리고 좁고, 깊고, 소수성인 리간드 결합 포켓들을 소유하는 것이다. 이들 결합 포켓들은 자연 살해 T(NKT) 세포들에 당지질(glycolipids) 및 인지질(phospholipids)을 제공할 수 있다. 자연 살해 T 세포들은 자연살해 세포 마커 및 반-불변 T 세포 수용기(TCR)를 공동-발현하는 독특한 림프구 개체군을 나타낸다. 이들은 광대역의 질병들과 연관되는 면역 반응들의 조절에 관여된다.
B. 항원성 화합물들(Antigenic Components)
본 발명의 특정의 관점들에는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 및 일반적으로 항원들로 언급되는 항원성 반응을 유발하거나 또는 유도하는 다른 분자들의 분절, 단편 또는 에피토프들을 포함하는 항원성 조성물들과 연관되는 방법들 및 조성물들이 포함된다. 특히, 자가면역 반응을 경유하여 세포의 파괴를 야기하는 자가항원 또는 이러한 자가항원들의 항원성 분절 또는 단편들이 동정되고 그리고 본 출원에서 기술되는 주조직 적합성 복합체/나노구 복합체를 제조하는 데 사용될 수 있다. 이러한 자가항원들은 췌장 소섬들 또는 췌장 소섬 세포들을 지지하는 세포 상에 제공될 수 있다. 본 발명의 구체예들에는 특정의 생리적 기능(physiologic function)을 수행하는 특정의 세포 또는 세포들의 집단(set)에 대한 면역 반응의 조절을 위한 조성물들 및 방법들이 포함된다.
1. 펩티드 성분들 및 단백질성 조성물들(Peptide Components and Proteinaceous Compositions)
본 발명의 폴리펩티드 및 펩티드들은 여러 아미노산 결실(deletions), 삽입(insertions) 및/또는 치환(substitutions)들에 의하여 변성될 수 있다. 특정의 구체예들에 있어서, 변성된 폴리펩티드 및/또는 펩티드들은 대상체 내에서 면역 반응을 조절할 수 있다. 본 출원에서 사용된 바와 같이, "단백질(protein)" 또는 "폴리펩티드(polypeptide)" 또는 "펩티드(peptide)"는 적어도 5개의 아미노산 잔기들을 포함하는 분자를 의미한다. 일부 구체예들에 있어서, 단백질 또는 펩티드의 야생형 버전(wild-type version)이 사용되나, 그러나, 본 발명의 많은 구체예들에 있어서는, 변성된 단백질 또는 폴리펩티드가 사용되어 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체를 생성한다. 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체는 면역 반응을 생성하거나 및/또는 면역계의 상기 T 세포 개체군을 조절(즉, 상기 면역계를 재교육시킴(re-educate))하는 데 사용될 수 있다. 상기 기술된 용어들은 본 출원에서는 상호호환적으로 사용될 수 있다. "변성된 단백질(modified protein)" 또는 "변성된 폴리펩티드(modified polypeptide)" 또는 "변성된 펩티드(modified peptide)"는 야생형 단백질 또는 폴리펩티드에 대하여 그의 화학적 구조, 특히 그의 아미노산 시퀀스가 변경된 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 구체예들에 있어서, 변성된 단백질 또는 폴리펩티드 또는 펩티드는 적어도 하나의 변성된 활성 또는 기능을 갖는다(단백질들 또는 폴리펩티드들 또는 펩티드들은 다중의 활성들 또는 기능들을 가질 수 있음을 인식할 것). 주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 맥락에서 면역원성 또는 상기 면역계의 다른 세포들과 상호작용하는 능력 등과 같은 다른 관점들에서 변성된 다낵질 또는 폴리펩티드 또는 펩티드는 야생형 활성 또는 기능을 보유하는 한편으로 하나의 활성 또는 기능에 대하여 변경될 수 있다.
본 발명의 펩티드들에는 임의의 자가반응성 펩티드가 포함된다. 자가반응성 펩티드들에는 본 출원에 그의 전체로서 참조로 포함되는 미합중국 공개특허 제20050202032호에 기술된 펩티드들 및 단백질들과 마찬가지로 hInsBlO-18(HLVEALYLV(시퀀스 동정번호:l)), hIGRP228-236(LNIDLLWSV(시퀀스 동정번호:2)), hIGRP265-273(VLFGLGFAI (시퀀스 동정번호:3)), IGRP206-214(VYLKTNVFL(시퀀스 동정번호:4)), hIGRP206-214(VYLKTNLFL(시퀀스 동정번호:5)), NRP-A7(KYNKANAFL(시퀀스 동정번호:6)), NRP-I4(KYNIANVFL(시퀀스 동정번호:7)), NRP-V7(KYNKANVFL(시퀀스 동정번호:8)), YAI/Db(FQDENYLYL(시퀀스 동정번호:9)) 및/또는 INS B15-23(LYLVCGERG(시퀀스 동정번호: 10))들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 자가반응성 펩티드들로서 또는 대조 펩티드들로서 본 발명과 함께 사용될 수 있는 다른 펩티드들에는 INS-I9(LYLVCGERI(시퀀스 동정번호:11)), TUM(KYQAVTTTL(시퀀스 동정번호:12)) 및 G6Pase(KYCLITIFL(시퀀스 동정번호:13))들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 특정의 관점들에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 펩티드들이 사용될 수 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 펩티드들의 예들에는 표 1에 제공된 것들이 포함된다. 이들 펩티드들이 특정의 나노구/주조직 적합성 복합체 분자들과 연관될 수 있거나 또는 다중 펩티드들이 공통의 나노구 및 하나 또는 그 이상의 주조직 적합성 복합체 분자와 연관될 수 있다. 이들 펩티드들의 조합들의 투여에는 각각이 부착된 특정의 펩티드 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 나노구들에 부착된 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 펩티드들을 갖는 나노구들을 포함하는 그러한 나노구들의 조합인 부착된 다중 펩티드들을 갖는 나노구들의 개체군을 투여하는 것 및/또는 다중 나노구 개체군을 투여하는 것이 포함된다.
[표 1a] 제1형 당뇨병에 대한 HLA 클래스 I-제한 에피토프들
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Figure 112018072069131-pat00003
Figure 112018072069131-pat00004
GAD65: 65킬로달톤(kDa) 글루타민산 디카르복실라아제(Glutamic acid decarboxylase), GFAP: 신경교섬유질산성단백질(glial fibrillary acidic protein), IA-2: 인슐린종-연관 항원2(insulinoma-associated antigen 2), ppIAPP: 소섬 아밀로이드 폴리펩티드 전구체 단백질(Islet amyloid polypeptide precursor protein), IGRP: 소섬-특이적 글루코스 6-포스파타아제 촉매 서브유닛-연관 단백질(Islet-specific glucose 6-phosphatase catalytic subunit-related protein)
[표 1b] 다발경화증(MS)에 대한 HLA 클래스 I-제한 에피토프
Figure 112018072069131-pat00005
Figure 112018072069131-pat00006
MBP: 수초 염기성 단백질(myelin basic protein), MAG: 수초-연관 당단백질(myelin-associated glycoprotein), MOG: 수초 희소돌기아교세포 당단백질(myelin oligodendrocyte glycoprotein), PLP: 단백지방질 단백질(proteolipid protein)
(상기 표들에서 'SEQ ID NO'는 '시퀀스 동정번호'임)
특정의 구체예들에 있어서, 특히 특정의 주조직 적합성 복합체/펩티드 융합물 내에서 대상의 단백질 또는 펩티드의 임의의 복합체를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드(야생형 또는 변성된)의 크기는 그 안에서 미분가능한 임의의 범위 및 값들 또는 이들의 유도체를 포함하여 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500개의 아미노 분자들(amino molecules) 또는 그 이상이 포함될 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 특정의 관점들에 있어서, 이들의 유도체들을 포함하여 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 인접하는 아미노산들, 그들의 아미노산 시퀀스들이 본 출원에서 기술되고 그리고 참조된 것과 같은 항원의 단편들이 항원들로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드들이 절두(truncation)에 의하여 돌연변이되어 그들의 대응하는 야생형 형태(wild-type form) 보다 더 짧게 할 수 있으나, 그러나 또한 이들은 특정의 기능(예를 들면, 단백질 복합체로서 제공을 위한, 증가된 면역원성을 위한 등)을 갖는 이종기원의 단백질 시퀀스의 융합(fusing) 또는 공액화(conjugating)에 의하여 변경될 수 있다.
(i) 표준 분자 생물학적 기술(standard molecular biological techniques)들을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, (ii) 천연 공급원(natural sources)들로부터의 단백질성 화합물들의 단리(isolation) 또는 (iii) 단백질성 물질의 화학적 합성을 포함하여 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 알려진 임의의 기술에 의하여 단백질성 조성물들이 만들어질 수 있다. 여러 유전자들에 대한 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 시퀀스들과 마찬가지로 뉴클레오티드가 이미 개시되었으며, 알려진 컴퓨터화된 데이터베이스(computerized databases)들에서 찾을 수 있다. 이러한 데이터베이스의 하나는 미국 국가생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information)의 (ncbi.nlm.nih.gov/의 주소의 월드와이드웹(World Wide Web) 상의) 젠뱅크(GenBank) 및 젠펩트(GenPept) 데이터베이스이다. 이들 유전자들에 대한 암호 영역(coding regions)들의 전부 또는 일부는 본 출원에서 기술되거나 또는 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 알려진 것과 같은 기술들을 사용하여 증폭되거나 및/또는 발현될 수 있다.
이들 조성물들의 자가항원 에피토프들 및 다른 폴리펩티드들의 아미노산 시퀀스 변종들(amino acid sequence variants)은 치환 변종들(substitutional variants), 삽입 변종들(insertional variants) 또는 결실 변종들(deletion variants)이 될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 내에서의 변성은 야생형과 비교하여 펩티드 또는 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 1ll, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500개 또는 그 이상의 비-인접하거나 또는 인접하는 아미노산들에 영향을 줄 수 있다. 자가면역 반응의, 특히 병원성 자가면역 반응의 결과를 가져오는 펩티드 또는 폴리펩티드가 본 발명의 방법들에서의 사용이 고려된다.
결실 변종들은 전형적으로 천연의 또는 야생형 아미노산 시퀀스의 하나 또는 그 이상의 잔기들을 결여한다. 개개 잔기들이 결실되거나 또는 다수의 인접하는 아미노산들이 결실될 수 있다. 정지암호(stop codon)이 암호화 핵산 시퀀스(encoding nucleic acid sequence) 내로 (치환 또는 삽입에 의하여) 도입되어 절두된 단백질을 생성할 수 있다. 삽입 변종들은 전형적으로 상기 폴리펩티드 내의 비-말단점(non-terminal point)에서의 물질의 첨가를 포함한다. 이는 하나 또는 그 이상의 잔기들의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질들로 불리우는 말단 첨가들이 또한 생성될 수 있다.
치환 변종들은 전형적으로 상기 단백질 내에서의 하나 또는 그 이상의 부위(sites)들에서의 하나의 아미노산의 다른 것으로의 교체를 포함하며, 다른 기능들 또는 특성들의 손실을 가져오거나 또는 손실 없이 상기 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상의 특성들을 변성시키도록 설계될 수 있다. 치환들은 보존적(conservative)일 수 있으며, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형태 및 하전(charge)의 다른 것으로 교체된다. 보존적 치환들은 당해 기술분야에서는 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 알라닌(alanine)의 세린(serine)으로의; 아르기닌(arginine)의 리신(lysine)으로의; 아스파라긴(asparagine)의 글루타민(glutamine) 또는 히스티딘(histidine)으로의; 아스파르테이트(aspartate)의 글루타메이트(glutamate)로의; 시스테인(cysteine)의 세린으로의; 글루타민의 아스파라긴으로의; 글루타메이트의 아스파르테이트로의; 글리신(glycine)의 프롤린(proline)으로의; 히스티딘의 아스파라긴 또는 글루타민으로의; 이소류신(isoleucine)의 류신(leucine) 또는 발린(valine)으로의; 류신의 발린 또는 이소류신으로의;; 리신의 아르기닌으로의; 메티오닌(methionine)의 류신 또는 이소류신으로의; 페닐알라닌(phenylalanine)의 티로신(tyrosine), 류신 또는 메티오닌으로의; 세린의 트레오닌(threonine)으로의; 트레오닌의 세린으로의; 트립토판(tryptophan)의 티로신으로의; 티로신의 트립토판 또는 페닐알라닌으로의; 그리고 발린의 이소류신 또는 류신으로의 교체가 포함된다. 달리, 치환들은 세포상 수용기(들)(celuular receptor(s))에 대한 결합활성(avidity) 또는 친화성(affinity) 등과 같은 폴리펩티드 또는 펩티드의 기능 또는 활성이 영향을 받도록 비-보존적(non-conservative)일 수 있다. 비-보존적 변화들에는 전형적으로 하나의 잔기의 비극성 또는 하전되지 않은 아미노산에 대한 극성 또는 하전된 아미노산 또는 그 반대 등과 같은 화학적으로 유사하지 않은 잔기로의 치환이 포함된다.
본 발명의 단백질들은 재조합의 또는 시험관 내 합성된 것이 될 수 있다. 달리, 재조합 단백질(recombinant protein)은 박테리아 또는 다른 숙주 세포로부터 단리될 수 있다.
용어 "기능적으로 등가인 암호(functionally equivalent codon)"는 본 출원에서는 아르기닌 또는 세린에 대한 6개의 암호들 등과 같은 동일한 아미노산을 암호화하는 암호들을 의미하는 데 사용되며, 또한 생물학적으로 등가인 아미노산들을 암호화하는 암호들을 의미한다(하기 표 2를 참조하시오).
[표 2] 암호 테이블(Codon Table)
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아미노산 및 핵산 시퀀스들이 각각 부가의 N- 또는 C- 말단 아미노산들 또는 5' 또는 3' 핵산 시퀀스들 등과 같은 부가의 잔기들을 포함할 수 있으며, 여전히 상기 시퀀스가 생물학적 단백질 활성(예를 들면, 면역원성)의 유지를 포함하여 앞서 규정한 기준에 부합하는 한, 본 출원에서 기술된 시퀀스들 중의 하나로 규정된 바와 같이 필수적일 수 있다는 것 또한 이해될 수 있을 것이다. 말단 시퀀스들의 첨가는 특히 예를 들어 상기 암호 영역의 상기 5' 또는 3' 부분들의 둘 중 하나에 곁붙는(flanking) 여러 비-암호화 시퀀스들을 포함할 수 있는 핵산 시퀀스들에 적용된다.
본 발명의 조성물들에 있어서, ㎖ 당 약 0.001㎎ 내지 약 10㎎의 총 단백질이 존재하는 것이 고려된다. 따라서, 조성물 내에서의 단백질의 농도는 약, 적어도 약 또는 최대로 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 50, 100㎍/㎖ 또는 ㎎/㎖ 또는 그 이상(또는 그 안에서 유도될 수 있는 임의의 범위)이 될 수 있다. 이에 대해, 약, 적어도 약 또는 최대로 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%의 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체가 될 수 있다.
본 발명은 자가면역 반응들에 연관되는 질병 또는 상태의 발달에 대한 진단, 치료 또는 예방 요법에 영향을 주기 위한 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체의 투여를 고려한다.
게다가, 본 출원에 참조로 포함되는 미합중국 특허 제4,554,101호(호프(Hopp))는 친수성을 반으로 하는 1차 아미노산 시퀀스(primary amino acid sequences)들로부터의 에피토프들의 동정 및 제조를 교시하고 있다. 상기 호프의 특허에서 기술된 방법들을 통하여, 당해 기술분야에서 숙련된 자는 아미노산 시퀀스 내로부터 잠재적인 에피토프들을 동정하고 그리고 그들의 면역원성을 확인할 수 있을 것이다. 여러 과학 문헌들이 또한 아미노산 시퀀스들의 분석으로부터 에피토프들의 2차 구조의 예측 및 동정에 기여하여 왔다(문헌 Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979 참조). 필요한 경우, 이들 중 임의의 것이 사용되어 미합중국 특허 제4,554,101호에서의 호프의 교시들을 보충할 수 있다.
2. 다른 항원성 화합물들(Other Antigenic Components)
펩티드들 이외의 다른 분자들이 항원들 또는 항원성 단편들로서 복합체 내에서 주조직 적합성 복합체 분자들과 함께 사용될 수 있으며, 이러한 분자들에는 탄수화물, 지질, 소분자(small molecules) 등이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 탄수화물들은 다양한 세포들의 외측 표면의 주요 구성성분들이다. 특정의 탄수화물들은 분화의 서로 다른 단계들의 특징이며, 종종 이들 탄수화물들은 특정의 항체들로 인식된다. 구별되는 탄수화물들의 발현은 특정의 세포 형태들로 제한될 수 있다. 자궁내막(endometrial) 및 혈청 항원들에 대한 자가항체 반응(autoantibody responses)들이 자궁내막증(endometriosis)의 공통 특지인 것으로 나타났다. 탄수화물 에피토프에 대하여 특이적인 2-헤르만 슈미트 당단백질 및 탄산무수화효소(carbonic anhydrase)를 포함하여 다수의 앞서 동정된 항원들에 대한 자궁내막증에서의 혈청 자가항체 반응이 기술되었다(문헌 Yeaman et al., 2002 참조).
D. 기질/나노구(Substrates/Nanospheres)
특정의 관점에 있어서, 항원/주조직 적합성 복합체 복합체들은 기질에 작동가능하게 결합된다. 기질은 생체적합성, 생흡수성 물질을 포함하는 나노입자의 형태가 될 수 있다. 기질은 또한 본 출원에 그의 전체로서 참조로 포함되는 미합중국 특허출원 제12/044,435호에서 이미 기술된 것과 같은 나노입자의 형태가 될 수 있다. 나노입자들은 가변적인 크기(variable dimension) 및 나노구 또는 생체적합성 생분해성 나노구로서 다양하게 공지된 구조를 가질 수 있다. 항원/주조직 적합성 복합체 복합체를 포함하는 이러한 입자 제형들(particulate formulations)은 상기 복합체의 상기 나노구에의 공유적 또는 비-공유적 결합에 의하여 형성될 수 있다.
상기 나노구들은 전형적으로 실질적으로 구형인 코어(spherical core) 및 선택적으로 하나 또는 그 이상의 층(layers)들로 이루어진다. 상기 코어는 크기 및 조성에 있어서 가변적일 수 있다. 상기 코어에 더하여, 상기 나노구는 하나 또는 그 이상의 층들을 가져 대상의 적용예들에 적절하는 기능성들을 제공할 수 있다. 만일 존재하는 경우, 층들의 두께들은 특정의 적용예들의 요구점들에 따라 가변될 수 있다. 예를 들면, 층들은 유용한 광학적 특성들을 부여할 수 있다.
층들은 또한 화학적 및 생물학적 기능들을 부여할 수 있으며, 이들 기능들을 위하여, 상기 층 또는 층들은 전형적으로는 두께에 있어서 약 0.001마이크로미터(㎛ ; 1나노미터(㎚) 내지 약 10㎛ 또는 그 이상(원하는 나노구 직경에 따라)이 될 수 있으며, 이들 층들은 전형적으로는 상기 나노구의 외측 표면 상에 적용된다.
바람직하게는, 상기 나노구들이 생체적합성이고 그리고 생흡수성이라는 것이 가정된다면 상기 코어 및 층들의 조성들은 가변적일 수 있다. 상기 코어는 요구되는 특성들에 따라 동종의 조성물 또는 둘 또는 그 이상의 물질들의 분류(classes)들의 합성물이 될 수 있다. 특정의 관점들에 있어서, 금속 나노구가 사용될 수 있다. 이들 금속 나노구들은 철, 칼슘, 가돌리늄 등으로부터 형성될 수 있다.
앞서 언급한 바와 같이, 상기 나노구는 상기 코어에 더해 하나 또는 그 이상의 층들을 포함할 수 있다. 상기 나노구는 생분해성 당(sugar) 또는 다른 중합체로 이루어지는 층을 포함할 수 있다. 생분해성 층(biodegradable layers)들의 예들에는 덱스트란(dextran); 폴리(에틸렌글리콜)(poly(ethylene glycol)); 폴리(에틸렌옥사이드(poly(ethylene oxide)); 만니톨(mannitol); 폴리락타이드(polylactide ; PLA), 폴리글리콜리드(polyglycolide ; PGA), 폴리카프로락톤(polycaprolactone ; PCL))에 기초하는 폴리에스테르(poly(esters)); PHB-PHV(폴리하이드록시부티레이트(polyhydroxybutyrate(PHB)-폴리하이드록시발러레이트(polyhydroxyvalerate(PHV)) 클래스의 폴리(하이드록시알카노에이트)류(poly(hydroxalkanoate)s); 및 녹말(starch), 셀룰로오스(cellulose) 및 키토산(chitosan) 등과 같은 다른 변성된 폴리(사카라이드)(modified poly(saccharides))들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 게다가, 상기 나노구들은 화학적 결합(chemical binding) 또는 결합 부위(coupling sites)들에 대하여 화학적 기능성(chemical functionalities)들을 부착하기에 적절한 표면들을 갖는 층을 포함할 수 있다.
층들은 당해 기술분야에서 공지된 다양한 방법들로 상기 나노구들 상에 생성될 수 있다. 예들에는 문헌 Iler (1979); Brinker 및 Scherer (1990)에 기술된 바와 같은 졸-겔 화학기술(sol-gel chemistry techniques)들이 포함된다. 나노구들 상에 층들을 생성하는 다른 접근법들에는 문헌 Partch and Brown (1998); Pekarek et al. (1994); Hanprasopwattana (1996); Davies (1998); 및 이들 내의 참조들에 기술된 바와 같은 표면화학(surface chemistry) 및 캡슐화 기술(encapsulation techniques)들이 포함된다. 증기퇴적 기술(vapor deposition techniques)들이 또한 사용될 수 있다; 예를 들면, 문헌 Golman and Shinohara (2000); 및 미합중국 특허 제6,387,498호를 참조하시오. 또 다른 접근법들에는 문헌 Sukhorukov et al. (1998); Caruso et al. (1998); Caruso et al. (1999); 미합중국 특허 제6,103,379호 및 이들 내에 언급된 참조문헌들에 기술된 바와 같은 층-대-층 자가-조립 기술(layer-by-layer self-assembly techniques)들이 포함된다.
나노구들은 미합중국 특허 제4,589,330호 또는 동 제4,818,542호에서 교시된 바와 같이 상기 항원/주조직 적합성 복합체 복합체를 포함하는 수성상(aqueous phase)과 중합체 및 비수성상(nonaqueous phase)를 접촉시키고 후속하여 상기 비수성상을 증발시켜 상기 수성상으로부터의 입자들의 융합(coalescence)을 야기시키는 것에 의하여 형성될 수 있다. 이러한 제조들을 위한 바람직한 중합체들은 젤라틴 아가(gleatin agar), 녹말, 아라비노갈락틴(arabinogalactan), 알부민(albumin), 콜라겐(collagen), 폴리글리콜산(polyglycolic acid), 폴리락트산(polylactic acid), 글리콜리드-L-(-) 락타이드 폴리(엡실론-카프로락톤(glycolide-L(-) lactide poly(episilon-caprolactone), 폴리(엡실론-카프로락톤-공-락트산)(poly(epsilon-caprolactone-CO-lactic acid)), 폴리(엡실론-카프로락톤-공-글리콜산(poly(epsilon-caprolactone-CO-glycolic acid)), 폴리(베타-하이드록시부티르산(poly(β-hydroxy butyric acid)), 폴리(에틸렌옥사이드)(poly(ethylene oxide)), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리(알킬-2-시아노아크릴레이트(poly(alkyl-2-cyanoacrylate)), 폴리(하이드록시에틸메타크릴레이트(poly(hydroxyethyl methacrylate)), 폴리아미드(polyamides), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 폴리(2-하이드록시에틸 DL-아스파르트아미드)(poly(2-hydroxyethyl DL-aspartamide)), 폴리(에스테르우레아)(poly(ester urea)), 폴리(L-페닐알라닌/에틸렌글리콜/1,6-디이소시아나토헥산(poly(L-phenylalanine/ethylene glyco1/1,6-diisocyanatohexane)) 및 폴리(메틸메타크릴레이트)(poly(methyl methacrylate))들로 이루어지는 군으로부터 선택되는 천연 또는 합성의 공중합체들 또는 중합체들이다. 폴리글리콜산, 폴리락트산, 글리콜리드-L-(-) 락타이드 폴리(엡실론-카프로락톤, 폴리(엡실론-카프로락톤-공-락트산) 및 폴리(엡실론-카프로락톤-공-글리콜산 등과 같은 폴리에스테르들이 특히 바람직한 중합체들이다. 상기 중합체를 용해시키기에 유용한 용제들에는: 물, 헥사플루오로이소프로판올(hexafluoroisopropanol), 메틸렌클로라이드(methylenechloride), 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran), 헥산(hexane), 벤젠(benzene) 또는 헥사플루오로아세톤세스퀴하이드레이트(hexafluoroacetone sesquihydrate)들이 포함된다.
D. 항원-주조직 적합성 복합체와 나노구들의 결합(Coupling Antigen-MHC with the Nanosphere)
상기 기질 또는 나노구를 상기 항원-주조직 적합성 복합체 복합체들에 결합시키기 위해서는 하기의 기술들이 적용될 수 있다.
상기 결합은 전형적으로 표면 상에 항원-주조직 적합성 복합체에 결합할 수 있거나 및/또는 선택적으로 상기 기질 또는 나노입자의 화학적으로 변성된 표면을 소위 "연결 분자(linking molecules)"들에 공유적으로 또는 비공유적으로 연결할 수 있는 "기능기(functional groups)"들의 생성을 포함하는 상기 기질 또는 나노구를 화학적으로 변성시키고, 후속하여 상기 항원-주조직 적합성 복합체 복합체를 상기 수득된 나노구들과 반응시키는 것에 의해 생성될 수 있다.
용어 "연결 분자(linking molecule)"는 상기 기질 또는 나노입자와 연결할 수 있고 그리고 또한 항원-주조직 적합성 복합체 복합체와 연결할 수 있는 물질을 의미한다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "기능기(functional groups)"들은 공유결합들을 형성하는 반응성 화학기(chemical groups)들에 제한되는 것은 아니나, 그러나 또한 상기 항원-주조직 적합성 복합체 복합체와의 이온성 상호작용(ionic interaction) 또는 수소결합들을 유도하는 화학기들을 포함한다. 더욱이, 때때로 상기 표면의 변성이 에틸렌글리콜(ethylene glycol) 등과 같은 작은 연결 분자들의 상기 나노구 표면과의 반응을 필요로 하기 때문에 상기 표면에 생성된 "기능기"들과 "기능기"들을 갖는 연결 분자들 사이의 엄격한 구분은 가능하지 않다는 것을 주의하여야 한다.
기능기들 또는 이들을 포함하는 연결 분자들은 아미노기(amino groups), 카르본산기(carbonic acid groups), 티올(thiols), 티오에테르(thioethers), 디설파이드(disulfides), 구아니디노(guanidino), 하이드록실기(hydroxyl groups), 아민기(amine groups), 인접 디올(vicinal dioles), 알데히드(aldehydes), 알파-할로아세틸기(alpha-haloacetyl groups), 머큐리오르가닐(mercury organyles), 에스테르기(ester groups), 산할로겐화물(acid halide), 산티오에스테르(acid thioester), 산무수물(acid anhydride), 이소시아네이트(isocyanates), 이소티오시아네이트(isothiocyanates), 설폰산할로겐화물(sulfonic acid halides), 이미도에스테르(imidoesters), 디아조아세테이트(diazoacetates), 디아조늄염(diazonium salts), 1,2-디케톤(1,2-diketones), 포스폰산(phosphonic acids), 인산에스테르(phosphoric acid esters), 설폰산(sulfonic acids), 아졸리드(azolides), 이미다졸(imidazoles), 인돌(indoles), N-말레이미드(N-maleimides), 알파-베타-불포화 카르보닐 화합물(alpha-beta-unsaturated carbonyl compounds), 아릴할로겐화물(arylhalogenides) 또는 이들의 유도체들로부터 선택될 수 있다.
보다 높은 분자량을 갖는 다른 연결 분자들의 비-제한적인 예들은 핵산 분자(nucleic acid molecules), 중합체, 공중합체, 중합가능한 결합제(polymerizable coupling agents), 실리카, 단백질 및 상기 기질 또는 나노구에 대해 대향되는 극성(opposed polarity)를 갖는 표면을 갖는 쇄-형 분자(chain-like molecules)들이다. 비록 상기 연결 분자에 대하여 상보적 시퀀스(complementary sequence)를 갖기는 하나, 핵산들은 핵산 분자들 자체를 포함하는 친화성 분자들에 연결(link)을 제공할 수 있다.
중합가능한 결합제들의 예들로서는 디아세틸렌(diacetylene), 스티렌부타디엔(styrene butadiene), 비닐아세테이트(vinyl acetate), 아크릴레이트(acrylate), 아크릴아미드(acrylamide), 비닐화합물(vinyl compounds), 스티렌(styrene), 실리콘 산화물(silicone oxide), 붕소 산화물(boron oxide), 인 산화물(phosphorous oxide), 붕산염(borates), 피롤(pyrrole), 폴리피롤(polypyrrole) 및 인산염(phosphates)들이 언급될 수 있다.
상기 기질 또는 나노구의 상기 표면은 예를 들면 기능성 반응기(functional reactive groups)들을 갖는 포스폰산 유도체들의 결합에 의하여 화학적으로 변성될 수 있다. 이들 포스폰산 또는 포스폰산에스테르 유도체들의 하나의 예는 "마니히-모에드리처(Mannich-Moedritzer)" 반응에 따라 합성될 수 있는 이미노-비스(메틸렌포스포노)카르본산(imino-bis(methylenphosphono) carbonic acid)이다. 이 결합 반응은 상기 제조 공정 또는 전-처리(pre-treatment)(예를 들면 트리메틸실릴브로마이드(trimethylsilyl bromide)로)로부터 직접적으로 수득되는 기질 또는 나노구들에 대하여 수행될 수 있다. 첫 번째 경우에 있어서, 상기 포스폰산(에스테르) 유도체는 예를 들면 상기 표면에 여전히 결합된 반응 매질의 구성성분들을 치환할 수 있다. 이러한 치환은 보다 높은 온도에서 향상될 수 있다. 반면에, 트리메틸실릴브로마이드는 알킬기-함유 인산-기반 착화제(alkyl group-containing phosphorous-based complexing agent)는 탈알킬화(dealkylate)하고 그에 의하여 상기 포스폰산(에스테르) 유도체에 대한 새로운 결합 부위들을 생성하는 것으로 여겨진다. 상기 포스폰산(에스테르) 유도체 또는 그에 결합된 연결 분자들은 앞서 주어진 바와 동일한 기능기들을 나타낼 수 있다. 상기 기질 또는 나노구의 상기 표면 처리의 다른 예에는 에틸렌글리콜 등과 같은 디올 내에서의 가열을 포함한다. 상기 합성이 이미 디올 내에서 진행되는 경우, 이러한 처리는 불필요할 수 있다는 것에 주의하여야 한다. 이들 환경들 하에서 직접적으로 수득된 상기 합성 생성물은 필요한 기능기들을 나타낼 것이다. 그러나 이러한 처리는 N- 또는 P-함유 착화제들 내에서 생성된 기질 또는 나노입자에 적용가능하다. 이러한 기질 또는 입자가 에틸렌글리콜 처리-후에 적용되는 경우, 상기 표면에 여전히 결합되는 상기 반응매질의 성분들(예를 들면, 착화제)은 상기 디올에 의하여 교체되거나 및/또는 탈알킬화될 수 있다.
상기 입자 표면에 여전히 부착된 N-함유 착화제들을 2차 기능기(second functional group)을 갖는 1차 아민(primary amine)으로 교체하는 것 또한 가능하다. 상기 기질 또는 나노구의 상기 표면은 또한 실리카로 코팅될 수 있다. 실리카가 트리에톡시실란 또는 클로로실란 등과 같은 유기 연결자들과 쉽게 반응하기 때문에 실리카는 유기 분자들의 상대적으로 간단한 화학적 공액화(chemical conjugation)를 허용한다. 상기 나노구 표면은 또한 호모중합체 또는 공중합체로 코팅될 수 있다. 중합가능한 결합제들의 예들은 N-(3-아미노프로필)-3-머캅토벤즈아미딘(N-(3-aminopropyl)-3-mercaptobenzamidine), 3-(트리메톡시실릴)프로필하이드라지드(3-(trimethoxysilyl)propylhydrazide) 및 3-트리메톡시실릴)프로필말레이미드(3-trimethoxysilyl)propylmaleimide)이다. 중합가능한 결합제들의 다른 비-제한적인 예들이 본 출원에서 언급된다. 이들 결합제들은 단독으로 또는 코팅으로서 생성되어야 할 공중합체의 형태에 따라서는 조합으로 사용될 수 있다.
산화성 전이금속 화합물(oxidic transition metal compounds)들을 포함하는 기질 또는 나노구에 대하여 사용될 수 있는 다른 표면 변성 기술은 상기 산화성 전이금속 화합물의 염소 가스 또는 대응하는 산염화물(oxychlorides)에 대한 유기 염소화제(organic chlorination agents)로의 전환이다. 이들 산염화물들은 생체분자(biomolecules) 내에서 종종 발견되는 히드록시기 또는 아미노기들 등과 같은 친핵체(nucleophiles)과 반응할 수 있다. 이러한 기술은 예를 들면 리신 측쇄(lysine side chains)들의 아미노기를 경유하여 단백질들과 직접적인 공액화를 생성하는 것을 허용한다. 산염화물들로의 표면 변성 후의 단백질들과의 공액화는 또한 말레이미도프로피온산하이드라지드(maleimidopropionic acid hydrazide) 등과 같은 이-관능성 연결자(bi-functional linker)를 사용하는 것에 의하여 영향을 받을 수 있다.
비-공유적 연결 기술들에 대하여는, 상기 기질 또는 나노구 표면의 그것에 대향되는 극성 또는 하전을 갖는 쇄-형 분자들이 특히 적절하다. 코어/쉘 나노구에 비-공유적으로 연결될 수 있는 연결 분자들에 대한 예들에는 음이온성, 양이온성 또는 양성-이온성 계면활성제들(anionic, cationic or zwitter-ionic surfactants), 산 또는 염기성 단백질들(acid or basic proteins), 폴리아민(polyamines), 폴리아미드(polyamides), 폴리설폰(poly sulfone) 또는 폴리카르복실산(polycarboxylic acid)이 포함된다. 기질 또는 나노구와 기능성 반응기를 갖는 친양쪽성 시약(amphiphilic reagent) 사이의 소수성 상호작용이 필요한 연결을 생성할 수 있다. 특히, 인지질 또는 유도체화된 폴리사카라이드(derivatised polysaccharides) 등과 같이 서로 가교화될 수 있는 친양쪽성 특성을 갖는 쇄-형 분자들이 유용하다. 상기 표면 상에서의 이들 분자들의 흡수는 공동배양(coincubation)에 의하여 달성될 수 있다. 친화성 분자와 기질 또는 나노구 사이의 결합은 또한 비-공유적, 자기-조직화 결합(self-organising bonds)들에 기초할 수 있다. 이들의 하나의 예에는 연결 분자로서 비오틴(biotin) 및 아비딘- 또는 스트렙타비딘-결합 분자(avidin- or strepdavidin-coupled molecules)들을 갖는 간단한 검출 탐침(detection probes)들이 포함된다.
기능기들의 생물학적 분자들에의 결합 반응들에 대한 프로토콜들은 문헌, 예를 들면, 문헌 "Bioconjugate Techniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996)에서 찾을 수 있을 것이다. 상기 생물학적 분자(예를 들면, 주조직 적합성 복합체 분자 또는 그의 유도체)는 산화(oxidation), 할로겐화(halogenation), 알킬화(alkylation), 아실화(acylation), 첨가(addition), 치환(substitution) 또는 아미드화(amidation) 등과 같은 유기화학의 표준 절차들에 따라 공유적으로 또는 비-공유적으로 상기 연결 분자에 결합될 수 있다. 결합된 연결 분자를 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합시키기 위한 이들 방법들은 상기 기질 또는 나노구에 상기 연결 분자를 결합시키기 이전 또는 이후에 적용될 수 있다. 더욱이, 배양(incubation)의 수단에 의하여, 그에 대응하여 전-처리된 기질 또는 나노구들에의 분자들의 직접적인 결합(예를 들면 트리메틸실릴브로마이드에 의하여)을 유효하게 하는 것이 가능하며, 이는 이러한 전-처리(예를 들면, 보다 높은 하전 또는 극성 표면)로 인하여 변성된 표면을 나타낸다.
E. 단백질 생산(Protein Production)
본 발명은 본 발명의 여러 구체예들에서의 사용을 위한 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질들을 기술한다. 예를 들면, 면역 반응을 유도하거나 또는 조절하는 능력들에 대하여 특정의 펩티드들 및 그들의 복합체들을 분석하였다. 특정의 구체예들에 있어서, 본 발명의 상기 펩티드들 또는 단백질들의 전부 또는 일부는 또한 통상적인 기술에 따라 용액 내에서 또는 고체 지지체 상에서 합성될 수 있다. 여러 자동합성장치(automatic synthesizers)들이 상용적으로 획득가능하며, 공지된 프로토콜들에 따라 사용될 수 있다. 예를 들면, 각각이 본 출원에 참조로 포함되는 문헌 Stewart and Young (1984); Tam et al. (1983); Merrifield (1986); 및 Barany and Merrifield (1979)을 참조하시오. 달리, 재조합 DNA 기술이 사용될 수 있으며 여기에서 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 시퀀스가 발현벡터(expression vector) 내로 삽입되고, 적절한 숙주 세포 내로 형질전환(transformed) 또는 형질감염(transfected)되고 그리고 발현에 적절한 조건들 하에서 배양된다.
본 발명의 하나의 구체예에는 단백질들의 생산을 위하여 미생물들을 포함하여 세포들에로의 유전자 도입(gene transfer)의 사용이 포함된다. 대상의 단백질에 대한 상기 유전자는 적절한 숙주 세포들 내로 도입되고 후속하여 적절한 조건들 하에서의 세포들이 배양된다. 실제적으로 임의의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 사용될 수 있다. 재조합 발현 벡터들 및 그 안에 포함되는 요소들의 생성은 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 공지되어 있으며, 본 출원에서 간단히 논의된다. 포유동물 숙주 세포주(mammalian host cell lines)들의 예들에는 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포들과 마찬가지로 Vero 및 HeLa 세포들, CEM, 721.221, H9, 유르카트(Jurkat), 라지(Raji) 등과 같은 다른 B-세포 및 T-세포주들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 게다가, 상기 삽입된 시퀀스들의 발현을 조절하거나 또는 원하는 방법으로 상기 유전자 생성물을 변성시키고 그리고 처리하는 숙주 세포 균주(host cell strain)가 선택될 수 있다. 이러한 단백질 생성물들의 변성(예를 들면, 글리코실화(glycosylation)) 및 가공(예를 들면, 개열(cleavage))은 상기 단백질의 기능에 대하여 중요할 수 있다. 서로 다른 숙주 세포들은 단백질들의 번역-후 가공 및 변성을 위한 특징적이고 그리고 특이적인 메카니즘들을 갖는다. 발현된 외래 단백질의 정확한 변성 및 가공을 확실하게 하기 위한 적절한 세포주들 또는 숙주계(host systems)들이 선택될 수 있다.
각각 티미딘 키나아제-(tk-), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제-(hgprt-) 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(aprt-) 세포들 내의 헤르페스단순포진(herpes simplex virus ; HSV) 티미딘 키나아제(HSV thymidine kinase), 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자들을 포함하는 다수의 선별 시스템(selection systems)들이 사용될 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 선별의 기준으로서 대사길항물질 저항성(anti-metabolite resistance)이 사용될 수 있다: 트리메토프림(trimethoprim) 및 메토트렉세이트(methotrexate)에 대하여 저항성을 부여하는 디하이드로엽산 레덕타아제(dihydrofolate reductase, DHFR); 마이코페놀산(mycophenolic acid)에 대하여 저항성을 부여하는 글루탐산-피루브산아미노기 전달효소(glutamic-pyruvic transaminase ; gpt); 아미노글리코시드 지418(aminoglycoside G418)에 대하여 저항성을 부여하는 네오(neo); 및 하이그로마이신(hygromycin)에 대하여 저항성을 부여하는 하이그로(hygro).
F. 핵산(Nucleic Acids)
본 발명은 본 발명의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 자가항원들을 제공하기 위한 자가항원 및 주조직 적합성 복합체 분자들에 대한 상기 핵산 시퀀스들이 포함되고 그리고 펩티드/주조직 적합성 복합체 복합체를 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 재조합이거나 또는 단리되어 총 유전체 핵산(genomic nucleic acid)이 제거된 핵산 분자를 의미한다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 내에는 예를 들면 플라스미드(plasmids), 코스미드(cosmids), 파지(phage), 바이러스(viruses) 등을 포함하여 올리고뉴클레오티드(길이에 있어서 아미노산 100개 또는 그 이하의 잔기들), 재조합 벡터(recombinant vectors)가 포함된다. 특정의 관점들에 있어서, 폴리뉴클레오티드들에는 그들의 천연적으로 발생하는 유전자들 또는 단백질 암호화 시퀀스들로부터 실질적으로 단리된 조절 시퀀스(regulatory sequences)들이 포함된다. 폴리뉴클레오티드들은 RNA, DNA, 이들의 유사체들(analogs) 또는 이들의 조합이 될 수 있다.
이 점에서는, 용어 "유전자(gene)", "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드(적절한 전사(transcription), 번역-후 변성 또는 국부화(localization)를 위하여 요구되는 임의의 시퀀스들을 포함하여)를 암호화하는 핵산을 의미하는 데 사용된다. 당해 기술분야에 속한 자들에게는 이해될 수 있는 바와 같이, 이러한 용어는 단백질, 폴리펩티드, 도메인(domains), 펩티드, 융합 단백질 및 돌연변이(mutants)들을 발현하거나 또는 발현하도록 적용될 수 있는 유전체 시퀀스들, 발현 카셋트(expression cassettes), cDNA 시퀀스들 및 보다 작은 유전자조작된 핵산 분절(smaller engineered nucleic acid segments)들을 포함한다. 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산은 하기의 길이: 즉, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기쌍들의 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 인접하는 핵산 시퀀스를 포함할 수 있다. 주어진 종(species)들로부터의 특정한 폴리펩티드가 약간 다른 핵산 시퀀스들을 가지나, 그러나, 그럼에도 불구하고 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 천연의 변이(natural variations)들을 포함하는 핵산들에 의해 암호화될 수 있다는 것 또한 고려된다.
특정의 구체예들에 있어서, 본 발명은 종양-특이적 항원 및/또는 주조직 적합성 복합체 분자를 암호화하는 핵산 시퀀스들을 내포하는 단리된 핵산 분절들 및 재조합 벡터들에 관련된다. 용어 "재조합(recombinant)"은 폴리펩티드 또는 특정의 폴리펩티드의 이름과 함께 사용될 수 있으며, 이는 일반적으로 시험관 내에서 조작되거나 또는 이러한 분자의 복제 생산물인 핵산 분자로부터 생산된 폴리펩티드를 의미한다.
상기 암호화 시퀀스 자체의 길이에 불구하고, 본 발명에서 사용되는 상기 핵산 분절들은 그들의 전체 길이가 상당히 변화될 수 있도록 하여 프로모터(promoters), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signals), 부가의 제한 효소 부위(additional restriction enzyme sites), 다중 복제 부위(multiple cloning sites), 다른 암호화 분절 등과 같은 다른 다른 핵산 시퀀스들과 결합될 수 있다. 따라서 바람직하게는 목적하는 재조합 핵산 프로토콜에서의 용이한 제조 및 사용으로 제한되는 총 길이를 갖는 거의 모든 길이의 핵산 분절이 사용될 수 있다는 것이 고려된다. 일부 경우들에 있어서, 핵산 시퀀스는 예를 들면 폴리펩티드의 정제, 전달, 분비, 전사-후 변성을 위하거나 또는 표적화(targeting) 또는 효험(efficacy) 등과 같은 치료학적 잇점(therapeutic benefits)을 허용하도록 별도의 이종기원의 암호화 시퀀스(heterologous coding sequences)들을 갖는 폴리펩티드 시퀀스를 암호화할 수 있다. 태그(tag) 또는 다른 이종기원의 폴리펩티드가 상기 변성된 폴리펩티드-암호화 시퀀스에 첨가될 수 있으며, 여기에서 "이종기원(heterologous)"은 상기 변성된 폴리펩티드와 동일하지 않은 폴리펩티드를 의미한다.
IV. 진단 및 치료방법
A. 면역 반응 및 분석
앞서 언급한 바와 같이, 본 발명은 대상체 내에서 자가항원에 대한 면역 반응을 야기하거나 또는 변성시키는 것에 관한 것이다. 하나의 구체예에 있어서, 그 결과의 면역 반응 또는 상태는 자가면역 반응에 연관된 질병 또는 증후군을 앓고 있거나, 앓고 있을 것으로 의심되거나 또는 발달할 위험이 있는 대상체에 대하여 보호하거나 또는 치료할 수 있다.
1. 면역분석
본 발명은 펩티드/주조직 적합성 복합체/나노구 복합체에 의해 면역 반응이 존재하는 지, 유도되는지, 야기되는 지 또는 변성되는 지의 여부 및 어느 정도까지인지를 평가하기 위한 혈청학적 분석(serological assays)의 실행을 포함한다. 실행될 수 있는 많은 형태들의 면역분석법들이 존재한다. 본 발명에 포함되는 면역분석법들에는 미합중국 특허 제4,367,110호(이중 단클로성 항체 샌드위치 분석(double monoclonal antibody sandwich assay)) 및 미합중국 특허 제4,452,901호(웨스턴블럿((western blot))들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 다른 분석법들에는 둘 다 시험관 내 및 생체 내에서의 표지된 리간드의 면역침강법(immunoprecipitation of labeled ligands) 및 면역세포화학법(immunocytochemistry)이 포함된다.
순환하는 항원-특이적 CD8+ T 세포들의 수를 정량화하기 위한 하나의 방법은 사량체 분석법(tetramer assay)이다. 이 분석에 있어서, 특정의 에피토프가 형광표지된 주조직 적합성 복합체 클래스 I 분자(fluorescently labeled MHC Class I molecules)의 합성 사량체 형태(synthetic tetrameric forms)에 결합된다. CD8+ T 세포들이 클래스 I 분자들에 결합된 짧은 펩티드 형태의 항원을 인식하고, 적절한 T 세포 수용기(T cell receptor)를 갖는 세포가 표지된 사량체들에 결합될 수 있고 그리고 유세포분석기(flow cytometry)로 정량화될 수 있다. 비록 이 방법이 엘리스폿 분석(ELISPOT assay) 보다 덜 시간-소모적이기는 하나, 상기 사량체 분석법은 기능이 아닌 단지 결합만 측정한다. 특정의 항원에 결합하는 모든 세포들이 필수적으로 활성화되는 것은 아니다. 그러나, 엘리스폿, 사량체 및 세포독성 분석(cytotoxicity assays) 간의 상관관계(correlation)가 입증되었다(문헌 Goulder et aI., 2000 참조).
면역분석법은 대체로 결합측정법들이다. 특정의 바람직한 면역분석법들은 여러 형태들의 효소결합면역흡수분석법(enzyme linked immunosorbent assays(ELlSAs)), 방사면역측정법(radioimmunoassay(RIA)) 또는 루미넥스.알티엠 기술(Luminex.RTM. technology) 등과 같은 비드기반분석법(bead based assays)들이며, 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 조직 절편(tissue sections)들을 이용하는 면역조직화학 검출(immunohistochemical detection)이 또한 특히 유용하다.
효소결합면역흡수분석법의 하나의 실시예에 있어서, 항체들 또는 항원들은 폴리스티렌 마이크로필터 플레이트(polystyrene microtiter plate) 내의 웰(well) 등과 같은 선택된 표면 상에 부동화된다. 계속해서, 임상샘플(clinical sample) 등과 같이 소정의 항원 또는 항체를 포함하는 것으로 의심되는 시험 조성물(test composition)이 상기 웰들에 첨가된다. 결합 및 비 특이적으로 결합된 면역 복합체(immune complexes)들을 제거하기 위하여 세척한 후, 결합된 항원 또는 항체가 검출될 수 있다. 검출은 일반적으로 검출가능한 표지에 연결된, 소정의 항원 또는 항체에 특이적인 다른 항체의 첨가에 의해 달성된다. 이러한 형태의 효소결합면역흡수분석법이 "샌드위치 효소결합면역흡수분석법(sandwich ELISA)"로 알려져 있다. 검출은 또한 상기 소정의 항원에 특이적인 제2 항체의 첨가 및 후속하여 상기 제2 항체에 대하여 결합 친화성(binding affinity)을 갖는 제3 항체의 첨가에 의하여 달성될 수 있으며, 상기 제3 항체는 검출가능한 표지에 연결되어 있다. 효소결합면역흡수분석법 기술들에 대한 변형들이 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 공지되어 있다.
경쟁적 효소결합면역흡수분석법(competition ELISAs)이 또한 가능하며, 여기에서는 시험 샘플이 알려진 양들의 표지된 항원들 또는 항체들과 결합을 경쟁한다. 미확인의 샘플(unknown sample) 내의 반응종(reactive species)의 양은 상기 샘플을 코팅된 웰들과 함께의 배양 이전 또는 배양 동안에 알려진 표지된 종들과 혼합하는 것에 의하여 결정된다. 상기 샘플 내의 반응종들의 존재는 상기 웰에 결합될 수 있는 표지된 종들의 양을 감소시키고, 따라서 근본적인 신호(ultimate signal)를 감소시킨다.
사용된 구성(format)과 무관하게, 효소결합면역흡수분석법은 공통적으로 코팅, 배양 또는 결합, 비 특이적으로 결합된 종들을 제거하기 위한 세척 및 결합된 면역 복합체들의 검출 등과 같은 특정한 특징들을 갖는다.
항원 또는 항체들은 또한 플레이트(plate), 비드(beads), 딥스틱(dipstick), 막(membrane) 또는 컬럼매트릭스(column matrix)의 형태 등과 같은 고체 지지체에 연결될 수 있으며, 분석될 샘플이 부동화된 항원 또는 항체에 적용된다. 항원 또는 항체로 플레이트를 코팅함에 있어서, 일반적으로는 상기 플레이트의 웰들을 상기 항원 또는 항체의 용액과 함께 밤새도록(overnight) 또는 특정의 기간 동안 배양한다. 계속해서 상기 플레이트의 상기 웰들을 세척하여 불완전하게 흡수된 물질을 제거할 수 있다. 계속해서, 상기 웰들의 임의의 잔류하는 가용한 표면들을 시험 항혈청에 관하여 항원과 관련하여 중성(antigenically neutral)인 비특이적 단백질로 "코팅"한다. 이들에는 소혈청알부민(bovine serum albumin ; BSA), 카제인(casein) 및 분유(milk powder)의 용액들이 포함된다. 상기 코팅은 상기 부동화 표면 상의 비특이적 흡수 위치(nonspecific adsorption sites)들의 차단을 허용하고, 그에 따라 상기 표면 상으로의 항혈청의 비특이적 결합에 의해 야기되는 배경(background)을 감소시킨다.
효소결합면역흡수분석법에 있어서, 직접적인 절차 보다는 오히려 2차 또는 3차 검출 수단들을 사용하는 것이 더 관습적이다. 따라서, 상기 웰에의 상기 항원 또는 항체의 결합, 배경을 감소시키기 위한 비 반응성 물질로의 코팅 및 미결합된 물질의 제거를 위한 세척 이후, 면역 복합체(항원/항체) 형성을 허용하기에 유효한 조건들 하에서 상기 부동화 표면을 시험될 임상적 또는 생물학적 샘플과 접촉시킨다. 계속해서 상기 면역 복합체의 검출은 표지된 2차 결합 리간드 또는 항체 또는 표지된 3차 항체 또는 3차 결합 리간드와 함께 2차 결합 리간드를 필요로 한다.
B. 자가면역 반응 또는 상태의 평가(Assessing an Autoimmune Response or Condition)
자가면역 상태를 치료하거나 또는 예방하기 위한 단백질, 폴리펩티드 및/또는 펩티드의 사용에 더하여, 본 발명은 특정의 자가반응성 세포 개체군들 또는 상태들의 존재를 진단하기 위한 자가항원들 또는 자가면역 상태의 검출을 포함하여 다양한 방법들로의 이들 폴리펩티드, 단백질 및/또는 펩티드의 사용을 고려한다. 본 발명에 따르면, 자가반응의 존재를 검출하는 방법은 개체로부터, 예를 들면, 혈액, 침(saliva), 조직, 뼈, 근육, 연골(cartilage) 또는 피부로부터의 샘플을 수득하는 단계를 포함한다. 상기 샘플의 단리(isolation)에 후속하여, 본 발명의 상기 폴리펩티드, 단백질 및/또는 펩티드를 활용하는 진단 분석(diagnostic assays)들이 수행되어 자가반응의 존재를 검출할 수 있으며, 샘플 내의 이러한 검출을 위한 이러한 분석 기술들은 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게는 잘 알려져 있으며 사량체 분석법, 면역분석법, 웨스턴블럿 분석(western blot analysis) 및/또는 효소결합면역흡수분석법 등과 같은 방법들이 포함된다.
본 출원에서 사용된 바와 같이, 문구 "면역 반응(immune response)" 또는 그의 등가물인 "면역학적 반응(immunological response)"은 자가항원 또는 자가항원의 연관된 에피토프에 대향하는 세포의 발달(항원-특이적 T 세포들 또는 그들의 분비 생성물들로 매개되는)을 의미한다. 세포상 면역 반응은 클래스 I 또는 클래스 II 주조직 적합성 복합체 분자와 연관되는 폴리펩티드 에피토프의 제공에 의하여 유발되어 항원-특이적 CD4+ T 도움 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포를 활성화시킨다. 상기 반응은 또한 다른 구성성분들의 활성화를 포함할 수 있다.
본 상세한 설명 및 첨부되는 특허청구의 범위의 목적들에 대하여, 용어 "에피토프(epitope)" 및 "항원결정자(antigenic determinant)"들은 상호호환적으로 사용되어 B 및/또는 T 세포들이 반응하거나 또는 인식하는 항원 상의 위치를 언급한다. B-세포 에피토프들은 인접하는 아미노산들 또는 단백질의 3차원 구조의 접힘(tertiary folding)에 의하여 병치되는 인접하지 않는 아미노산들 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접하는 아미노산들로부터 형성된 에피토프들은 전형적으로 변성 용제(denaturing solvents)들에의 노출에 대하여도 유지되는 반면에 3차원 구조의 접힘에 의하여 형성된 에피토프들은 전형적으로 변성 용제들로의 처리에 대하여 상실된다. 에피토프는 독특한 공간적 구조(spatial conformation) 내에 전형적으로 적어도 3개, 그리고 보다 일반적으로는, 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산들을 포함한다. 에피토프들의 공간적 구조를 결정하는 방법에는, 예를 들면, x-선 결정학(x-ray crystallography) 및 2-차원 핵자기공명(2-dimensional nuclear magnetic resonance)이 포함된다. 예를 들면, 문헌 Epitope Mapping Protocols (1996)을 참조하시오. T-세포들은 CD8 세포들에 대하여는 약 9개의 아미노산들 또는 CD4 세포들에 대하여는 약 13 내지 15개의 아미노산들의 연속적인 에피토프들을 인식한다. 상기 에피토프를 인식하는 T 세포들은 에피토프에 대한 반응에서 프라이밍된(primed) T 세포들에 의한 3H-티미딘 혼입(3H-thymidine incorporation)에 의하여(문헌 Burke et al., 1994 참조), 항원-의존적 살해(antigen-dependent killing)에 의하여(문헌 cytotoxic T lymphocyte assay, Tigges et al., 1996 참조) 또는 사이토카인 분비(cytokine secretion)에 의하여 결정된 바와 같이 항원-의존적 증식(antigen-dependent proliferation)을 측정하는 시험관 내 분석(in vitro assays)에 의하여 동정될 수 있다. 세포-매개 면역학적 반응의 존재는 증식 분석(proliferation assays ; CD4+ T 세포들) 또는 세포독성 T 림프구 분석(CTL(cytotoxic T lymphocyte) assays)에 의하여 결정될 수 있다.
본 출원에서 그리고 특허청구범위들 내에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체(antibody)" 또는 "면역글로블린(immunoglobulin)"은 상호호환적으로 사용되며, 동물 또는 수령인의 면역 반응의 일부로서 기능한 구조적으로 연관된 단백질들의 여러 클래스들 중의 임의의 것을 의미하며, 이 단백질들에는 면역글로블린 지(IgG), 면역글로블린 디(IgD), 면역글로블린 이(IgE), 면역글로블린 에이(IgA), 면역글로블린 엠(IgM) 및 연관된 단백질들이 포함된다.
선택적으로, 자가항원 또는 바람직하게는 자가항원의 에피토프는 주조직 적합성 복합체 및 주조직 적합성 복합체 연관 단백질 등과 같은 다른 단백질들과의 융합 단백질에 화학적으로 공액화되거나 또는 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
본 출원에서 사용된 바와 같은 용어 "면역원성제(immunogenic agent)" 또는 "면역원(immunogen)" 또는 "항원"들은 단독으로 또는 부형제와 함께 또는 전개 비히클(display vehicle) 상에 제공되어 수령인(recipient)에의 투여에 의하여 그 자체에 대하여 면역 반응을 유도할 수 있는 분자를 기술하는 데 상호호환적으로(interchangeably) 사용된다.
C. 치료방법(Treatment Methods)
본 발명의 방법은 하나 또는 그 이상의 자가항원들에 의하여 야기되는 질병 또는 상태에 대한 치료를 포함한다. 본 발명의 면역원성 폴리펩티드는 자가면역 상태 또는 질병을 앓고 있거나, 앓고 있는 것으로 의심되거나 또는 발달할 위험이 있는 개인에서의 면역 반응을 유도하거나 또는 변성하도록 주어질 수 있다. 방법들은 자가반응에 대하여 양성으로 시험되거나 또는 이러한 상태 또는 연관된 상태로 발전하는 위험이 있을 것으로 여겨지는 개인들에 대하여 사용될 수 있다.
V. 진단 및 치료 표적(DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC TARGETS)
본 발명의 구체예들은 다수의 면역매개되거나 또는 자가면역 질병, 예를 들면, 당뇨병, 이식 거부 등을 치료하거나 또는 개선하는 데 사용될 수 있다. "자가면역 질병(autoimmune disease)"에는 개인 자신의 조직들 또는 기관들로부터 야기되고 그리고 지향되는 질병들 또는 장애들 또는 그의 징후 또는 그로부터 야기되는 상태들이 포함된다. 하나의 구체예에 있어서, 정상 신체 조직들 및 항원들에 대하여 반응성인 T 세포들에 의한 생산으로부터 야기되거나 또는 그에 의하여 악화되는 것이 상태(condition)를 의미한다. 자가면역 질병들 또는 장애들의 예들에는 관절염(arthritis)(급성 관절염(acute arthritis), 만성 류마티스 관절염(chronic rheumatoid arthritis), 통풍(gout or gouty arthritis), 급성 통풍(acute gouty arthritis), 급성 면역학적 관절염(acute immunological arthritis), 만성 염증성 관절염(chronic inflammatory arthritis), 퇴행성 관절염(degenerative arthritis), II형 콜라겐-유발성 관절염(type II collagen-induced arthritis), 감염성 관절염(infectious arthritis), 라임 관절염(Lyme arthritis), 증식성 관절염(proliferative arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 스틸병(Still's disease), 척추 관절염(vertebral arthritis) 및 유년성 류마티스 관절염(juvenile-onset rheumatoid arthritis), 골관절염(osteoarthritis), 만성 진행성 관절염(arthritis chronica progrediente), 변형성 관절염(arthritis deformans), 만성 원발성 다발관절염(polyarthritis chronica primaria), 반응성 관절염(reactive arthritis) 및 강직성 척추염(ankylosing spondylitis) 등과 같은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)), 염증성 과증식성 피부병(inflammatory hyperproliferative skin diseases), 판상형 건선(plaque psoriasis), 적상 건선(gutatte psoriasis), 농포성 건선(pustular psoriasis) 및 손톱 건선(psoriasis of the nails) 등과 같은 건선(psoriasis), 건초열(hay fever) 및 죠브증후군(Job's syndrome) 등과 같은 아토피 질병(atopic diseases)을 포함하는 아토피(atopy), 접촉 피부염(contact dermatitis), 만성 접촉 피부염(chronic contact dermatitis), 박리성 피부염(exfoliative dermatitis), 알러지 피부염(allergic dermatitis), 알러지 접촉 피부염(allergic contact dermatitis), 포진상 피부염(dermatitis herpetiformis), 화폐상 피부염(nummular dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 비-특이적 피부염(non-specific dermatitis), 원발성 자극접촉 피부염(primary irritant contact dermatitis) 및 아토피 피부염(atopic dermatitis)을 포함하는 피부염(dermatitis), x-연성 과 면역글로블린 엠 증후군(x-linked hyper IgM syndrome), 알러지성 안내 염증성 질병(allergic intraocular inflammatory diseases), 만성 자가면역 심마진(chronic autoimmune urticaria)을 포함하여 만성 알러지성 심마진(chronic allergic urticaria) 및 만성 특발성 심마진(chronic idiopathic urticaria) 등과 같은 심마진(urticaria ; 두드러기), 근염(myositis), 다발성 근염/피부근염(polymyositis/dermatomyositis), 유년성 피부근염(juvenile dermatomyositis), 중독성 표피 박리증(toxic epidermal necrolysis), 강피증(scleroderma)(전신성 강피증(systemic scleroderma)을 포함하여), 전신성 경화증(systemic sclerosis) 등과 같은 경화증(sclerosis), 스피로-광학적 다발성 경화증(spino-optical MS), 원발성 진행성 다발성 경화증(primary progressive MS ; PPMS) 및 재발-이장성 다발성 경화증(relapsing remitting MS ; RRMS) 등과 같은 다발성 경화증(multiple sclerosis ; MS), 진행성 전신성 경화증(progressive systemic sclerosis), 아테롬성 경화증(atherosclerosis ; 죽상동맥경화증), 확산성 경화증(sclerosis disseminata), 실조성 경화증(ataxic sclerosis), 시신경척수염(neuromyelitis optica ; NMO), 염증성 장질환(inflammatory bowel disease ; IBD)(예를 들면, 크론병(Crohn's disease), 자가면역-매개 위장병(autoimmune-mediated gastrointestinal diseases), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 만성적 궤양성 장염(colitis ulcerosa), 미세형 대장염(microscopic colitis), 교원성 대장염(collagenous colitis), 콜리티스 포릴포사(colitis polyposa), 괴사성 장염(necrotizing enterocolitis) 및 통벽성 대장염(transmural colitis) 등과 같은 대장염(colitis), 자가면역 염증성 장질환(autoimmune inflammatory bowel disease), 장염(bowel inflammation), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 결절성 홍반(erythema nodosum), 원발성경화성담관염(primary sclerosing cholangitis), 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군(adult or acute respiratory distress syndrome ; ARDS)을 포함하여 호흡 곤란 증후군(respiratory distress syndrome), 뇌수막염(meningitis), 포도막(uvea)의 전체 또는 일부의 염증, 홍채염(iritis), 맥락막염(choroiditis), 자가면역 혈액 장애(autoimmune hematological disorder), 류마토이드 척추염(강직척추염, rheumatoid spondylitis), 류마티스 활막염(rheumatoid synovitis), 유전성 혈관부종(hereditary angioedema), 뇌수막염에서와 같은 대뇌신경 손상(cranial nerve damage), 임신포진(herpes gestationis), 천포창양 임신(pemphigoid gestationis), 음낭 가려움증(pruritis scroti), 자가면역 조기 난소 부전(autoimmune premature ovarian failure), 자가면역 상태로 인한 돌발성 청각상실(sudden hearing loss), 과민증(anaphylaxis) 및 알러지성 비염 및 아토피성 비염(rhinitis) 등과 같은 면역글로블린 E-매개 질병(IgE-mediated diseases), 라스무센 뇌염(Rasmussen's encephalitis) 및 대뇌변연계(limbic) 및/또는 뇌간(brainstem) 뇌염 등과 같은 뇌염(encephalitis), 전부 포도염(anterior uveitis), 급성 전부 포도염(acute anterior uveitis), 육아종 포도막염(granulomatous uveitis), 비육아종 포도막염(nongranulomatous uveitis), 파코안티제닉 포도막염(phacoantigenic uveitis), 후부 포도염(posterior uveitis) 또는 자가면역 포도막염(autoimmune uveitis) 등과 같은 포도막염(uveitis), 원발헝 사구체신염(primary GN), 면역-매개 사구체신염(immune-mediated GN), 막성 사구체신염(membranous GN)(막성 신장병(membranous nephropathy)), 특발성 막성 사구체신염(idiopathic membranous GN) 또는 특발성 막성 신장병(idiopathic membranous nephropathy), I형 및 II형을 포함하여 막 또는 막성 증식성 사구체신염(membrano- or membranous proliferative GN ; MPGN) 및 급속 진행 사구체신염(rapidly progressive GN) 등과 같은 만성 또는 급성 사구체신염 등과 같이 신증후군(nephrotic syndrome)을 수반하거나 수반하지 않는 사구체신염(glomerulonephritis ; GN), 증식성 신염(proliferative nephritis), 자가면역성 다선상 내분비 부전(autoimmune polyglandular endocrine failure), 발라니티스 서컴스크립타 플라스마셀룰라리스(balanitis circumscripta plasmacellularis)를 포함하여 귀두염(balanitis), 귀두포피염(balanoposthitis), 중심 원심성 윤상 홍반(erythema annulare centrifugum), 고정 이색소성 홍반(erythema dyschromicum perstans), 다형 홍반(eythema multiform), 고리육아종(granuloma annulare), 광택태선(lichen nitidus), 경화성 위축선조 태선(lichen sclerosus et atrophicus), 만성 단순 태선(lichen simplex chronicus), 극상태선(lichen spinulosus), 편평태선(lichen planus), 층판상 어린선(lamellar ichthyosis), 표피박리성각화증(epidermolytic hyperkeratosis), 전암성 각화증(premalignant keratosis), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 알러지 상태(allergic conditions) 및 반응, 알레르기 반응(allergic reaction), 알러지 습진 또는 아토피 습진, 무피지선 습진(asteatotic eczema), 한포진(dyshidrotic eczema) 및 수포성 손발바닥 습진(vesicular palmoplantar eczema)을 포함하여 습진(eczema), 기관지 천식(asthma bronchiale), 기관지 천식(bronchial asthma) 및 자가-면역 천식(auto-immune asthma) 등과 같은 천식(asthma), T 세포들의 침윤(infiltration of T cells) 및 만성 염증 반응(chronic inflammatory responses)을 포함하는 상태들, 임신 중 태아 A-B-O 혈액군 등과 같은 외래 항원들에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환(chronic pulmonary inflammatory disease), 자가면역성 심근염(autoimmune myocarditis), 백혈구부착결핍증(leukocyte adhesion deficiency), 낭창성 신염(lupus nephritis), 중추신경계 낭창(lupus cerebritis), 소아 낭창(pediatric lupus), 비(菲)-신성 낭창(non-renal lupus), 신외 낭창(extra-renal lupus), 원판상 낭창(discoid lupus) 및 and 원판상 홍반성 낭창(discoid lupus erythematosus), 탈모성 낭창(alopecia lupus)을 포함하여 낭창(lupus), 피부 전신성 홍반성 낭창(cutaneous SLE) 또는 아급성 피부 전신성 홍반성 낭창(subacute cutaneous SLE), 신생아 낭창 증후군(neonatal lupus syndrome ; NLE) 및 파종성 홍반성 낭창(lupus erythematosus disseminatus) 등과 같은 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus ; SLE), 소아기 인슐린-의존형 진성 당뇨병(pediatric insulin-dependent diabetes mellitus ; IDDM)을 포함하여 유아기 발증(I형) 진성 당뇨병(juvenile onset (Type I) diabetes mellitus) 및 성년기 발증 진성 당뇨병(adult onset diabetes mellitus)(제2형 당뇨병(Type II diabetes))이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다. 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증(hypersensitivity), 유육종증(sarcoidosis), 림프종양 육아종증(lymphomatoid granulomatosis), 베게너 육아종증(Wegener's granulomatosis)을 포함하여 육아종증(granulomatosis), 무과립구증(agranulocytosis), 혈관염(vasculitis), 대혈관 혈관염(large-vessel vasculitis ; 류마티스성 다발근통(polymyalgia rheumatica) 및 거대세포(타카야수) 동맥염(arteritis)(gianT cell (Takayasu's) arteritis)을 포함하여), 중혈관 혈관염(medium-vessel vasculitis ; 가와사키병(Kawasaki's disease) 및 결절성 다발동맥염/결절동맥주위염(polyarteritis nodosa/periarteritis nodosa)을 포함하여), 현미경적 다발동맥염(microscopic polyarteritis), 면역혈관염(immunovasculitis), 중추신경계 혈관염(CNS vasculitis), 피부혈관염(cutaneous vasculitis), 과민성 혈관염(hypersensitivity vasculitis), 전신성 괴사성 혈관염(systemic necrotizing vasculitis) 등과 같은 괴사성 혈관염(necrotizing vasculitis) 및 척-스트라우스 혈관염(Churg-Strauss vasculitis) 또는 증후군(Churg-Strauss vasculitis or syndrome ; CSS) 및 항중성구세포질항체 연관 소혈관 혈관염(ANCA-associated small-vessel vasculitis) 등과 같은 항중성구세포질항체 연관 혈관염(ANCA(antineutrophil cytoplasmic antibody)-associated vasculitis)을 포함하여 맥관염(vasculitides), 측두동맥염(temporal arteritis), 재생불량성 빈혈(aplastic anemia), 자가면역성 재생불량성 빈혈(autoimmune aplastic anemia), 굼부스 양성 빈혈(Coombs positive anemia), 다이아몬드 블랙판 빈혈(Diamond Blackfan anemia), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia ; AIHA)을 포함하여 용혈성 빈혈(hemolytic anemia) 또는 면역 용혈성 빈혈(immune hemolytic anemia), 에디슨병(Addison's disease), 자가면역성 호중구감소증(autoimmune neutropenia), 범혈구감소증(pancytopenia), 백혈구감소증(leukopenia), 백혈구 삼출(leukocyte diapedesis)을 포함하는 질병, 중추신경계 염증 장애(CNS inflammatory disorders), 알쯔하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 패혈증(septicemia), 외상(trauma) 또는 출혈(hemorrhage)에 2차적인 것과 같은 다중 기관 손상 증후군(multiple organ injury syndrome), 항원-항체 복합체-매개 질환(antigen-antibody complex-mediated diseases), 항-사구체 기저막 질환(anti-glomerular basement membrane disease), 항-인지질 항체 증후군(anti-phospholipid antibody syndrome), 알레르기성 신경염(allergic neuritis), 베체트병/증후군(Behcet's disease/syndrome), 캐슬만 증후군(Castleman's syndrome), 굿파스츄어 증후군(Goodpasture's syndrome), 레이노드 증후군(Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 스티븐스-존슨 증후군(Stevens-Johnson syndrome), 수포성 류천포창(pemphigoid bullous) 및 피부 류천포창(skin pemphigoid) 등과 같은 류천포창(pemphigoid), 천포창(pemphigus ; 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 낙엽성 천포창(pemphigus foliaceus), 천포창 점막 류천포창(pemphigus mucus-membrane pemphigoid) 및 홍반성 천포창(pemphigus erythematosus)을 포함하여), 자가면역 다중 내분비계 질환(autoimmune poly endocrinopathies), 라이터 질병 또는 증후군(Reiter's disease or syndrome), 열상(thermal injury), 임신 중독증(preeclampsia), 면역 복합체 신장염(immune complex nephritis) 등과 같은 면역 복합체 장애, 항체-매개 신장염(antibody-mediated nephritis), 다발성 신경병증(polyneuropathies), 면역글로블린 엠 다발성 신경병증(IgM polyneuropathies) 또는 면역글로블린 엠-매개 신경병증(IgM-mediated neuropathy) 등과 같은 만성 신경병증, 만성 또는 급성 특발성 혈소판 감소성 자반증을 포함하여 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura ; ITP) 등과 같은 자가면역성 또는 면역-매개 혈소판 감소증(thrombocytopenia), 특발성 각-공막염(idiopathic cerato-scleritis) 등과 같은 공막염(scleritis), 상공막염(episcleritis), 자가면역성 고환염(orchitis) 및 난소염(oophoritis)을 포함하여 고환(testis) 및 난소(ovary)의 자가면역성 질병, 원발성 갑상선 기능 저하증(primary hypothyroidism), 부갑상선 기능 저하증(hypoparathyroidism), 자가면역성 갑상선염(autoimmune thyroiditis) 등과 같은 갑상선염(thyroiditis)을 포함하여 자가면역성 내분비 질병, 하시모토병(Hashimoto's disease), 만성 갑상선염(하시모토 질병) 또는 아급성 갑상선염, 자가면역성 갑상선 질병(autoimmune thyroid disease), 특발성 갑상선 기능 저하증(idiopathic hypothyroidism), 그레이브씨병(Grave's disease), 자가면역성 다선 증후군(autoimmune polyglandular syndromes)(또는 다선 내분비계 질환 증후군(polyglandular endocrinopathy syndromes)) 등과 같은 다선 증후군(polyglandular syndromes), 람베르트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome) 또는 이튼-람베르트 증후군(Eaton-Lambert syndrome) 등과 같은 신경 부종양 증후군(neurologic paraneoplastic syndromes)을 포함하여 부종양 증후군, 스티프-맨 또는 스티프-퍼슨 증후군(stiff-man or stiff-person syndrome), 알러지성 뇌척수염(allergic encephalomyelitis) 또는 엔케팔로마이엘리티스 알레지카(encephalomyelitis allergica) 및 실험 알러지성 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis ; EAE) 등과 같은 뇌척수염(encephalomyelitis), 흉선종-연관 중증 근무력증(thymoma-associated myasthenia gravis) 등과 같은 중증 근무력증(myasthenia gravis), 소뇌 변성(cerebellar degeneration), 신경근긴장증(neuromyotonia), 안구간대경련(opsoclonus) 또는 안구간대경련 근육간대경련 증후군(opsoclonus myoclonus syndrome ; OMS) 및 감각성 신경병증(sensory neuropathy), 다초점성 운동신경병증(multifocal motor neuropathy), 시한증후군(Sheehan's syndrome), 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis), 만성 간염(chronic hepatitis), 루푸스양 간염(lupoid hepatitis), 거대세포 간염(gianT cell hepatitis), 만성 활동 간염(chronic active hepatitis) 또는 자가면역성 만성 활동 간염(autoimmune chronic active hepatitis), 림프양 사이질 폐렴(lymphoid interstitial pneumonitis ; LIP), 기관지 폐색증(비-이식) 대 비특이성 간질성 폐렴(non-specific interstitial pneumonia ; NSIP), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome ; 급성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(acute inflammatory demyelinating polyneuropathy ; AIDP)), 버거씨병(Berger's disease ; 면역글로블린 에이 신경병증(IgA nephropathy)), 특발성 면역글로블린 에이 신경병증(idiopathic IgA nephropathy), 선상 면역글로블린 에이 피부종(linear IgA dermatosis), 급성 발열성 호중구성 피부염(acute febrile neutrophilic dermatosis), 각질하 농포성 피부염(subcorneal pustular dermatosis), 일과성 극세포해리성 피부병(transient acantholytic dermatosis), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis) 및 폐경변(pneumonocirrhosis) 등과 같은 간경변(cirrhosis), 자가면역 장증 증후군(autoimmune enteropathy syndrome), 셀리악병 또는 세리악병(Celiac or Coeliac disease ; 만성 흡수불량증), 셀리악 스프루(celiac sprue ; 글루텐 장증(gluten enteropathy)), 난치성 흡수불량증(refractory sprue), 특발성 흡수불량증(idiopathic sprue), 한랭글로블린혈증(cryoglobulinemia), 근위축성 측삭 경화증(amylotrophic lateral sclerosis ; ALS ; 루게릭병(Lou Gehrig's disease)), 관상동맥질환(coronary artery disease), 자가면역성내이질환(autoimmune inner ear disease ; AIED) 등과 같은 자가면역성이질환(autoimmune ear disease), 자가면역성 청각상실(autoimmune hearing loss), 난치성 또는 재발성 다발연골염 등과 같은 다발연골염(polychondritis), 폐포단백증(pulmonary alveolar proteinosis), 코간증후군/비매독성 각막실질염(Cogan's syndrome/nonsyphilitic interstitial keratitis), 안면마비(Bell's palsy), 스위트병/증후군(Sweet's disease/syndrome), 자가면역 장미증(rosacea autoimmune), 대상포진-연관 통증(zoster-associated pain), 유전분증(amyloidosis), 비-암성 림프구증가증(non-cancerous lymphocytosis), 단클론성 B 세포 림프구증가증(예를 들면, 양성 단클론성 감마병증(benign monoclonal gammopathy) 및 의미불명의 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy of undetermined significance ; MGUS))을 포함하는 원발성 림프구증가증(primary lymphocytosis), 말초신경병증(peripheral neuropathy), 부종양증후군(paraneoplastic syndrome), 뇌전증(epilepsy), 편두통(migraine), 부정맥(arrhythmia), 근질환(muscular disorders), 난청(deafness), 맹목(blindness), 주기성 근육마비(periodic paralysis) 및 중추신경계(CNS)의 채널병(channelopathies) 등과 같은 채널병(channelopathies), 자폐증(autism), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 국소 또는 분절 또는 국소분절사구체경화증(focal or segmental or focal segmental glomerulosclerosis ; FSGS), 내분비 안병증(endocrine opthalmopathy), 포도막망막염(uveoretinitis), 맥락망막염(chorioretinitis), 자가면역성 간장 장애(autoimmune hepatological disorder), 섬유근육통(fibromyalgia), 다발성 내분비 부전(multiple endocrine failure), 슈미트증후군(Schmidt's syndrome), 부신염(adrenalitis), 위선위축(gastric atrophy), 초로성 치매(presenile dementia), 자가면역성 탈수초성 질환(autoimmune demyelinating diseases) 및 만성 염증성 탈수초성 다발신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy) 등과 같은 탈수초성 질환(demyelinating diseases), 드레슬러 증후군(Dressler's syndrome), 원형탈모증(alopecia greata), 전두탈모증(alopecia totalis), 크레스트 증후군(CREST syndrome ; 석회증, 레이노드 현상, 식도운동장애, 수지경화성) 및 모세혈관확장증((calcinosis, Raynaud's phenomenon, esophageal dysmotility, sclerodactyl), and telangiectasia)), 예를 들면, 항-정자 항체(anti-spermatozoan antibodies)들로 인한 수컷 및 암컷 자가면역성 불임(male and female autoimmune infertility), 혼합 결합조직병(mixed connective tissue disease), 샤가스병(Chagas' disease), 류마티스성 열(rheumatic fever), 반복유산(recurrent abortion), 농부폐병(farmer's lung), 다형 홍반(erythema multi forme), 심장절개후 증후군(post-cardiotomy syndrome), 쿠싱증후군(Cushing's syndrome), 새-사육가 폐(bird-fancier's lung), 알러지성 육아성 혈관염(allergic granulomatous angiitis), 양성 림프구 혈관염(benign lymphocytic angiitis), 알포트증후군(Alport's syndrome), 알러지성 폐포염(allergic alveolitis) 및 섬유화 폐포염(fibrosing alveolitis) 등과 같은 폐포염(alveolitis), 간질성 폐 질환(interstitial lung disease), 수혈 부작용(transfusion reaction), 한센병(leprosy), 말라리아(malaria), 리슈만편모충증(leishmaniasis), 카이파노소미아시스(kypanosomiasis), 주혈흡충증(schistosomiasis), 회충증(ascariasis), 국균증(aspergillosis) 등과 같은 기생충성 질병증(parasitic diseases), 샘프터증후군(Sampter's syndrome), 카플란증후군(Caplan's syndrome), 뎅그열(dengue), 심내막염(endocarditis), 심내막심근섬유증(endomyocardial fibrosis), 미만간질폐섬유증(diffuse interstitial pulmonary fibrosis), 간질성폐섬유증(interstitial lung fibrosis), 폐섬유증(pulmonary fibrosis), 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 낭포성섬유증(cystic fibrosis), 내안구염(endophthalmitis), 장기 융기성 홍반(erythema elevatum et diutinum), 태아성적아구증(erythroblastosis fetalis), 호산구성 근막염(eosinophilic faciitis), 슐만증후군(Shulman's syndrome), 펠티증후군(Felty's syndrome), 플라리아시스(flariasis), 만성 모양체염(chronic cyclitis), 비동시성 모양체염(heterochronic cyclitis), 홍채모양체염(iridocyclitis ; 급성 또는 만성) 또는 퓨크스 모양체염(Fuch's cyclitis) 등과 같은 모양체염(cyclitis), 헤노호-쉔라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 인간 면역결핍 바이러스(mV) 감염증(human immunodeficiency virus (mV) infection), 중증합병면역결핍증(SCID ; severe combined immunodeficiency), 후천성면역결핍증(acquired immune deficiency syndrome ; AIDS), 에코바이러스 감염증(echovirus infection), 패혈증(sepsis), 내독소혈증(endotoxemia), 췌장염(pancreatitis), 갑상선중독증(thyroxicosis), 파보바이러스감염증(parvovirus infection), 풍진바이러스감염증(rubella virus infection), 예방접종-후 증후군(post-vaccination syndromes), 선천성 풍진 감염증(congenital rubella infection), 엡스타인-바르바이러스 감염증(Epstein-Barr virus infection), 볼거리(mumps), 에반스증후군(Evan's syndrome), 자가면역성 성선부전증(autoimmune gonadal failure), 시든햄 무도증(Sydenham's chorea), 연쇄상구균감염후 신염(post-streptococcal nephritis), 혈전맥관염(thromboangitis ubiterans), 갑상선중독증(thyrotoxicosis), 척수로(tabes dorsalis), 맥락막염(chorioiditis), 거대세포 다발성근육통(gianT cell polymyalgia), 만성 과민성 폐렴(chronic hypersensitivity pneumonitis), 건성각결막염(keratoconjunctivitis sicca), 유행성각결막염(epidemic keratoconjunctivitis), 특발성 신염 증후군(idiopathic nephritic syndrome), 미세변화 신증(minimal change nephropathy), 양성 가족성 및 허혈성재관규 손상(benign familial and ischemiareperfusion injury), 이식기관 재관류(transplant organ reperfusion), 망막 자가면역(retinal autoimmunity), 관절염(joint inflammation), 기관지염(bronchitis), 만성기도폐쇄/폐질환(chronic obstructive airway/pulmonary disease), 규폐증(silicosis), 구내염(aphthae), 아프타성 구내염(aphthous stomatitis), 동맥경화장애(arteriosclerotic disorders), 아스퍼니오게네스(asperniogenese), 자가면역성 용혈(autoimmune hemolysis), 베크병(Boeck's disease), 한랭글로블린혈증(cryoglobulinemia), 듀프이트렌구축(Dupuytren's contracture), 엔도프탈미아 파코아나필락티카(endophthalmia phacoanaphylactica), 알러지성 장염(enteritis allergica), 나병성결절성홍반(erythema nodosum leprosum), 특발성 안면마비(idiopathic facial paralysis), 만성피로증후군(chronic fatigue syndrome), 류마티스성 열(febris rheumatica), 함만-리치병(Hamman-Rich's disease), 감각신경형 청각상실(sensoneural hearing loss), 헤모글로비누리아 파록시마티카(haemoglobinuria paroxysmatica), 성선기능저하증(hypogonadism), 일레이티스 레기오날리스(ileitis regionalis), 백혈구감소증(leucopenia), 모노뉴클레오시스 인펙티오사(mononucleosis infectiosa), 횡단척수염(traverse myelitis), 원발성 특발성 점액수종(primary idiopathic myxedema), 신증(nephrosis), 오프탈미아 심파티카(ophthalmia symphatica), 오르치티스 그라뉼로마토사(orchitis granulomatosa), 췌장염(pancreatitis), 폴리라디큘리티스 아큐타(polyradiculitis acuta), 괴저성 농피증(pyoderma gangrenosum), 퀘르바인 갑상생염(Quervain's thyreoiditis), 후천성 비장 아트로피(acquired spenic atrophy), 비-악성 흉선종(non-malignant thymoma), 백반증(vitiligo), 독소충격증후군(toxic-shock syndrome), 식중독(food poisoning), T 세포의 침윤을 포함하는 상태, 백혈구-부착결핍증(leukocyte-adhesion deficiency), 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민증과 연관되는 면역 반응, 백혈구 누출(leukocyte diapedesis)을 포함하는 질환, 다중 기관 손상 증후군, 항원-항체 복합체-매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역성 다중내분비계질환(autoimmune polyendocrinopathies), 난소암, 원발성 점액수종, 자가면역성 아트로피성 위염(autoimmune atrophic gastritis), 교감성 안염(sympathetic ophthalmia), 류마티스성 질환(rheumatic diseases), 혼합 결합조직병, 신증후군(nephrotic syndrome), 인슐린염, 다중내분비 부전(polyendocrine failure), 자가면역성 다선증후군 I형(autoimmune polyglandular syndrome type I), 성인-발병 특발성 부갑상선 기능저하증(adult-onset idiopathic hypoparathyroidism ; AOIH), 확장성 심근병증(dilated cardiomyopathy) 등과 같은 심근병증(cardiomyopathy), 에피데몰리시스 불로사 액퀴시타(epidermolisis bullosa acquisita ; EBA), 혈색소침착증(hemochromatosis), 심근염(myocarditis), 신증후군(nephrotic syndrome), 원발성 경화성 담관염(primary sclerosing cholangitis), 화농성 또는 비화농성 부비동염(sinusitis), 급성 또는 만성 부비동염, 사골동염(ethmoid sinusitis), 전두동염(frontal sinusitis), 상악동염(maxillary sinusitis), 접형동염(sphenoid sinusitis), 호산구 증가증(eosinophilia) 등과 같은 호산구-연관 장애(eosinophil-related disorder), 폐침윤 호산구 증가증(pulmonary infiltration eosinophilia), 호산구근육통증후군(eosinophilia-myalgia syndrome), 뢰플러증후군(Loffler's syndrome), 만성 호산구성 폐렴(chronic eosinophilic pneumonia), 열대성 폐호산구증(tropical pulmonary eosinophilia), 기관지폐렴성 국균증(bronchopneumonic aspergillosis), 국균종(aspergilloma) 또는 호산구 함유 육아종(granulomas containing eosinophils), 과민증, 혈청음성 척추관절염(seronegative spondyloarthritides), 다내분비 자가면역성 질환(polyendocrine autoimmune disease), 경화성 담관염, 공막염(sclera), 상공막염(episclera), 만성 점막피부 칸디다증(chronic mucocutaneous candidiasis), 브루톤증후군(Bruton's syndrome), 유아기의 일과성저감마글로블린혈증(transient hypogammaglobulinemia of infancy), 비스코트-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 모세혈관확장 운동실조 증후군(ataxia telangiectasia syndrome), 혈관확장증(angiectasis), 교원병(collagen disease)과 연관되는 자가면역성 장애(autoimmune disorders), 류마티즘(rheumatism), 신경계 질환(neurological disease), 임파선염(lymphadenitis), 혈압 반응에서의 감소(reduction in blood pressure response), 맥관부전(vascular dysfunction), 조직 손상(tissue injury), 심혈관 허혈증(cardiovascular ischemia), 통각과민(hyperalgesia), 신허혈증(renal ischemia), 뇌허혈증(cerebral ischemia) 및 혈관신생(vascularization)을 수반하는 질환, 알러지성 과민증 장애(allergic hypersensitivity disorders), 사구체신염(glomerulonephritides), 재관류 손상(reperfusion injury), 허혈성 재관류 장애(ischemic re-perfusion disorder), 심근 조직 또는 다른 조직들의 재관류 손상, 림프종 기관기관지염(lymphomatous tracheobronchitis), 염증성 피부질환(inflammatory dermatoses), 급성 염증성 성분을 갖는 피부질환(dermatoses with acute inflammatory components), 복합 장기 부전(multiple organ failure), 수포성 질환(bullous diseases), 신피질괴사(renal cortical necrosis), 급성 화농성 뇌막염(acute purulent meningitis) 또는 다른 중추신경계 염증성 장애(central nervous system inflammatory disorders), 안구 및 안와 염증성 장애(ocular and orbital inflammatory disorders), 과립구 수혈-연관 증후군(granulocyte transfusion-associated syndromes), 사이토카인-유발 중독(cytokine-induced toxicity), 기면증(narcolepsy), 급성 중증 염증(acute serious inflammation), 만성 난치성 염증(chronic intractable inflammation), 신우염(pyelitis), 동맥내막 이상증식증(endarterial hyperplasia), 소화성 궤양(peptic ulcer), 판막염(valvulitis) 및 자궁내막증(endometriosis)에 연관된 면역 반응들이 또한 고려된다.
VI. 실시예
하기의 실시예들은 본 발명의 여러 구체예들을 설명하는 목적으로 주어졌으며, 어떠한 방법으로도 본 발명을 제한하는 것을 의미하지는 않는다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 본 발명이 언급된 대상들을 실행하고 그리고 목표들 및 잇점들을 수득하는 것과 마찬가지로 본 출원에서 고유한 대상들, 목표들 및 잇점들을 실행하는 데 적용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 본 실시예들은 본 출원에서 기술된 상기 방법들과 함께 바로 바람직한 구체예들을 대표하며, 예시적이고, 그리고 본 발명의 관점에 대한 제한으로 의도되는 것은 아니다. 그 안에서의 변화들 및 특허청구범위들의 관점에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 정신 내에 포함되는 다른 용도들이 당해 기술분야에서 숙련된 자들에게 일어날 수 있다.
실시예 1
펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅 나노구들로의 치료에 의한 제1형 당뇨병 보호
NRP-V7/Kd 단량체로 코팅된 초상자성 나노구들로의 치료에 의한 당뇨병 보호. NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들이 생체 내에서 관용원성인지의 여부를 연구하기 위하여, 8.3-TCR-형질전환 비 비만성 당뇨병 생쥐(8.3-TCR-transgenic NOD mice)(또한 이하에서는 8.3-NOD 또는 Vα17.4+TCR-TG 생쥐로도 언급됨)들이 소용적의 나노구(5㎕, 0.6㎍의 NRP-V7을 수반함, 매 3일마다 1회)의 수 회 정맥 내 주사들로 치료될 것이다. 이들 생쥐들의 상기 형질전환된 고-결합활성 IGRP206-214-반응성 비장 CD8+ T-세포 풀들이 명백하게도 감소될 것이라는 것이 고려된다. 감소되지 않은 CD8+ T 세포들이 상기 치료에 의하여 비활성화(anergized) 될 것이라는 것이 또한 고려된다.
"다중화(multiplexing)"의 실효성(effectiveness)을 연구하기 위하여, 나노구들을 6가지의 서로 다른 펩티드/주조직 적합성 단량체(peptide/MHC monomers)로 코팅시킬 것이다. 야생형(wild-type) 비 비만성 당뇨병 생쥐들의 집단(cohorts)들을 이들 나노구들의 풀로, 대조 펩티드 (TUM)/Kd로 코팅된 나노구들로 또는 NRP-V7/Kd로 코팅된 나노구들로 치료될 것이다. NRP-V7/Kd로 코팅된 나노구들(매 2 내지 3주마다 1회)로 치료된 비 비만성 당뇨병 생쥐들이 제1형 당뇨병으로부터 더 높게 보호될 것인 반면에 미코팅된 나노구들, 아비딘 비오틴 코팅된 나노구들, TUM/Kd로 코팅된 나노구들 또는 NRP V7 펩티드 단독으로 치료된 생쥐들은 제1형 당뇨병으로부터 보호되지 않을 것이라는 것이 고려된다.
NRP-V7/Kd 단량체들로 코팅된 나노구들로의 치료에 의한 낮은-결합활성 클론형들의 전신적 확장. 이들 조직 분포를 결정하기 위하여 방사성-표지된 나노구들을 사용하는 연구들이 수행될 것이다. 검사된 생쥐들의 전 연령들에서 전신적 조직 분포가 존재할 것이라는 것이 고려된다. 상기 생쥐들의 상기 나노구들로의 치료가 NRP-V7-반응성 CD8+ T-세포들을 포함하여 다양한 면역세포형들의 자극으로부터 야기되는 사이토카인들의 증가된 혈청 수준들을 야기하지 않을 것이라는 것이 또한 고려된다.
NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐들이 대조 나노구들로 치료된 연령이 통일된(age-matched) 비-당뇨병 동물들의 그것에 비하여 추가조사 기간(follow-up period)(32주)의 말기에서 순환하는 그리고 소섬-내(intra-islet) NRP-V7/Kd 사량체+ CD8+ 세포들의 명백하게 증가된 풀들을 가질 것으로 여겨진다. 상기 NRP-V7/Kd-나노구-처리된 생쥐들의 소섬-내 CD8+ T-세포들이 대조 생쥐들의 소섬들에서 발견되는 것들에 비해 명백하게 더 낮은 결합활성(보다 높은 Kd)으로 NRP-V7/Kd 사량체들을 결합하여 상기 나노구 처리가 이들의 병원성 고-결합활성의 상대를 투여량-의존적인 방법으로의 희생으로 항-병원성 저-결합활성 클론형들의 확장을 조성할 것이라는 것을 암시한다는 것이 또한 고려된다.
NRP V7/K/Kd-코팅된 나노구들의 인식 및 섭취를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 야생형, 비-형질전환된 비 비만성 당뇨병 생쥐들과 마찬가지로 형질전환 NRP-V7-반응성 TCR을 발현하는 비 비만성 당뇨병 생쥐들의 서로 다른 비장세포 아개체군(subpopulations)들에서의 녹색형광(green fluorescence)(상기 펩티드-주조직 적합성 나노입자 복합체의 아비딘 분자에 결합된)의 존재를 평가할 것이다. NRP-V7/Kd 나노구 주사 녹색형광만이 TCR-형질전환 생쥐들의 CD8+ T-세포 아군(subset)에서 검출될 것이고, 비-형질전환된 생쥐들의 CD8+ T-세포 아군에서 훨씬 더 적은 정도로 검출될 것이 고려된다. 또한 두 형태의 생쥐들의 비장 CD4+ T, B, CD11b+ 또는 CD11c+ 세포들에서 녹색형광의 축적이 검출되지 않을 것이라고 여겨진다.
버금우세적인 자가항원성 펩티드/주조직 적합성 복합체(DMK138-146/Db) 복합체로 코팅된 나노구들의 항-당뇨병유발성 특성들. 본 발명자들은 상기 치료방향의 보호 효과들이 NRP-V7-반응성 CD8+ T-세포들(비 비만성 당뇨병 생쥐들에서의 만연하는 자가반응성 T-세포 아군)의 특이함인지 또는 다른 덜 우세적인 자가항원성 특수성에 적용가능한 현상인지의 여부를 조사할 것이다. 이를 위하여, 생쥐들을 Db로 나타나고 그리고 당뇨병유발성 자가반응성 CD8+ T-세포들의 훨씬 작은 풀에 의해 표적화되는 다른 자가항원으로부터 유도되는 펩티드로 코팅된 비드들로 치료할 것이다(근긴장성 이영양증 활성화효소(Dystrophia Myotonica Kinase; DMK)의 잔기 138-146, 본 출원에서는 "DMK138-146/Db"라 언급함)(문헌 Lieberman et al., 2004 참조). DMK138-146/Db로의 비 비만성 당뇨병 생쥐들의 치료가 순환하는 비장 및 소섬-내 DMK138-146/Db-반응성 CD8+ T 세포들의 명백한 확장을 야기하고 그리고 명백한 당뇨병 보호를 제공할 것이라는 것이 고려된다. 또한 DMK138-146/Db-코팅된 나노구들이 NRPV7-반응성 CD8+ T 세포들을 확장시키지 않을 것이고 그리고 NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들이 DMK138-146/Db-반응성 T 세포들을 확장시키지 않을 것이기 때문에 생체 내 T 세포 확장이 항원-특이적일 것이라는 것이 고려된다.
NRP-V7/Kd- 또는 DMK138-146/Db-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐들의 소섬들에 대한 다른 IGRP-자가반응성 CD8+ T-세포 특이성의 불완전 보충. 본 발명자들은 나노구-확장 저-결합활성 NRP-V7- 및/또는 DMK138-146/Db-반응성 CD8+ T 세포들의 보충이 소섬들에 대한 다른 베타 세포 자가반응성 T 세포 특이성들의 보충을 손상시키는 지의 여부를 조사할 것이다. 이는 DMK138-146과 마찬가지로 76가지의 서로 다른 IGRP 에피토프들의 패널(panel)에 대하여 대조, NRP-V7/Kd- 또는 DMK138-146/Db-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐들의 소섬-연관 CD8+ T 세포들의 민감성(responsiveness)을 비교하는 것에 의하여 수행될 것이다. NRP-V7/Kd-코팅된 그리고 DMK138-146/Db-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐들의 소섬-연관 CD8+ T 세포들이 NRP-V7 and DMK138-146에 대한 반응에서 대조 생쥐들로부터 단리된 것들보다 명백하게 보다 더 감마-인터페론을 생산할 것이라는 것이 기대된다. 대조 나노구들로 치료된 생쥐들로부터의 에피토프들에 비하여, NRP-V7/Kd 또는 DMK138-146/Db-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐들의 소섬-연관 CD8+ T 세포들에 의한 명백한 감마-인터페론 반응들을 유도할 수 있는 에피토프들의 수에서 명백한 감소가 있을 수 있어 불완전 보충 및/또는 축적을 암시한다는 것이 고려된다.
NRP-V7/Kd- 및 DMK138-146/Db-코팅된 나노구들이 비 비만성 당뇨병 생쥐들의 새로운 당뇨병에서 높은 비율의 당뇨병의 차도(remission)을 유도할 것으로 여겨진다. 새로이 진단된 당뇨병 생쥐들에서 정상혈당을 회복하기 위한 나노구 요법의 능력을 조사하기 위한 연구가 수행될 것이다. 혈당 수준들에 대하여 생쥐들의 집단들이 매주 2회 모니터링될 것이며, 10.5mM이상(≥10.5mM)의 혈당에서 고혈당증으로 고려하였다. 생쥐들을TUM/Kd-코팅된 나노구들 또는 NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들을 수령하는 생쥐들로 무작위로 할 것이다(2주 1회로). 당뇨(glycosuria)를 나타내는 생쥐들에게는 또한 1/2 단위의 피하 인슐린이 주어져서 베타 세포 스트레스를 감소시키고 그리고 베타 세포 재생을 조성하도록 할 것이다. 별도의 집단들의 생쥐들은 DMK138-146/Db-코팅된 나노구들을 수령할 것이다. 서로 다른 연구들에서 다양한 백분율의 동물들에서 안정한 차도를 유발한 것으로 나타난 단클론 항-CD3 항체로의 치료(5일간 20㎍/일)가 양성 대조로서 사용될 것이다. NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐들의 대부분이 치료의 5 내지 12주 내에 정상혈당이 될 것으로 고려된다. 유사하게, DMK138-146/Db-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐들의 대부분이 정상혈당이 될 것으로 또한 고려된다. 대조 TUM/Kd-코팅된 나노구들을 수령하는 생쥐들의 대부분은 명확한 고혈당증으로 진전될 것이라고 기대된다.
당뇨병 생쥐들에서의 치료의 효과가 오래 지속되는 지의 여부를 조사하기 위하여, 정상혈당의 4연속주들 이후에 치료를 중단할 것이고 그리고 당뇨병 재발에 대하여 생쥐들을 모니터링 할 것이다. 치료 중단 4주 후 그리고 고혈당증 재발의 시점에서 순환하는 사량체-양성 풀의 크기에 대한 치료의 효과를 평가할 것이다. 치료의 중단 4주 후 순환하는 사량체-반응성 T 세포 풀의 크기에서 감소가 있을 것이라고 고려된다. 이 경우에 있어서, 내인성 자가항원(즉, 당뇨전증 동물들에서)에 의하거나 또는 나노구들의 촉진 주사(booster injections)(즉, 심각하게 감소된 베타 세포 덩어리를 갖는 당뇨병 동물들에서)에 의한 확장된 저-결합활성 자가반응성 T-세포 풀의 재활성화는 장기간의 보호를 필요로 할 것이다.
치료된 생쥐 대 당뇨병의 그리고 비-당뇨병의 미치료된 생쥐들에서의 복강내 당부하 검사(intraperitoneal glucose tolerance tests ; IPGTTs)는 전자가 비-당뇨병의 미처리 동물들에 의해 나타내는 내당능 곡선과 거의 동일하고 그리고 대응하는 당뇨병 생쥐들의 내당능 곡선 보다 명백하게 더 나은 내당능 곡선(glucose tolerance curves)을 갖는다는 것을 나타낼 것으로 고려된다. 더욱이, 상기 치료된 동물들이 비-당뇨병의 미치료된 생쥐에서 식후 혈청 인슐린 수준에 통계적으로 필적하고 그리고 대응하는 당뇨병의 미치료된 동물들의 식후 혈청 인슐린 수준 보다 명확하게 더 높은 식후 혈청 인슐린 수준(postprandial serum insulin levels)을 가질 것이라고 여겨진다.
펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅된 나노구들이 고-결합활성 및 저-결합활성 자가반응성 CD8+ T-세포들 사이를 효과적으로 차별할 수 있는 지의 여부의 조사. 대부분의 IGRP206-214-반응성 CD8+ 세포들이 CDR3-불변성 Vα17-Jα42쇄(CDR3-invariant Vα17-Jα42 chains)를 수용하나 그러나 이질성 VDJβ쇄는 수용하지 않는다. 당뇨병유발(diabetogenesis) 동안의 이 T 세포 아군의 '결합활성 성숙'이 3가지의 서로 다른 Vα17 성분들의 사용에서의 변화들과 연관된다. 이들 3가지 서로 다른 Vα 성분들이 리간드-결합 결합활성에서의 차이(Vα17.5>Vα17.4>Vα17.6)들을 제공한다는 것이 단일 TCRβ의 정황에서의 3가지의 서로 다른 CDR3-불변성 Vα17-Jα42쇄들을 발현하는 TCRαβ-형질감염물(transfectants)의 연구들에서 확인되었다(문헌 Han et aI., 2005 참조). 펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅된 나노구들이 실제로 서로 다른 활성을 갖는 리간드를 인식하는 T 세포들을 차별적으로 표적할 수 있는 지의 여부를 조사하기 위하여, 이들 형질감염물들에 대한 CD8 분자들의 '캡핑(capping)'을 유도하는 NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들의 능력이 평가될 것이다. NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들과 함께의 5분의 배양에 의하여 Vα17.4+ 또는 Vα17.6+ 세포들 보다 Vα17.5+ 세포들이 더 캡(caps)들을 형성할 것으로 고려된다. 이러한 결과는 NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들이 실제로 높은 그리고 낮은 결합활성 T 세포들 사이를 차별할 수 있다는 것을 나타내고 그리고 이들 나노구들이 선호적으로 미접촉의 고 결합활성 클론형들을 탈락시키는 지의 이유로서의 설명을 제공할 수 있다.
저-친화성 Vα17.6/8.3β TCR을 발현하는 CD8+ 세포들은 항-당뇨병유발성이다. 저-결합활성 자가반응성 CD8+ T-세포들이 생체 내에서 항-당뇨병유발성 특성들을 갖는 지의 여부를 조사하기 위하여, IGRP206-214-반응성 Vα17.6/8.3β TCR을 비 비만성 당뇨병 생쥐들 내에서 형질전환적으로 발현시켰다(본 출원에서는 'Vα17.6+라 칭함; 이는 상기 8.3-TCR(Vα17.4+); Teyton 및 Santamaria의 미공개된 데이터) 보다 약 10배 더 낮은 친화성을 가짐). 이 TCR이 CD8+ 세포들의 양성 선택(positive selection)을 발전시키나, 그러나 8.3-TCR(Vα17.4+) 보다 명백하게 낮다(문헌 Han et aI., 2005 참조). 그 결과, Vα17.6+ TCR-형질전환 생쥐(TCR-TG mice)는 Vα17.4+ TCR-TG 생쥐들에 비해 더 적은 NRP-V7 사량체-반응성 CD8+ 흉선세포들 및 비장세포들을 포함한다. 더욱이, 상기 Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들로부터의 사량체+(고 및 저) CD8+ 세포들은 시험관 내 펩티드 자극(in vitro peptide stimulation)에 의하여 Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들로부터 유도된 것들에 비해 덜 감마-인터페론(및 인터류킨-2)를 분비하고, 그리고 리간드에 대한 이들의 저 결합활성에 상당하게 NRP-V7-펄스시킨 RMA-SKd 표적들의 비효과적인 살해자들(inefficient killers)이다(문헌 (Han et al., 2005; 또한 데이터는 나타내지 않음). 가장 중요하게는, 이들 생쥐들은 당뇨병(단지 70개체의 암컷들 중 2개체만이 제1형 당뇨병으로 발전함) 및 인슐린염[Vα17.6+ 대 Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들에서 각각 0.4미만(<0.4) 대 3초과(>3)(4의 최대치를 넘어)의 점수들(P<0.012)]으로부터 거의 완전하게 보호되었다(도 1a 및 도 1b).
이는 LCMV 에피토프를 인식하는 무관한 비-자가반응성 TCR을 발현하는 비 비만성 당뇨병 생쥐들(LCMV TCR-TG NOD 생쥐들)에서 발생하는 것과는 극명하게 대조된다. 이미 문헌 Serreze et al. (2001)에 의해 보고되고 그리고 본 출원에서의 사용에 의하여 확인된 바와 같이, 이들 생쥐들은 야생형 비 비만성 당뇨병 생쥐들과 필수적으로 유사하게 제1형 당뇨병으로 발전하고 그리고 소섬들에 내인성 IGRP206-214-반응성 CD8+ 세포들을 보충한다(Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들의 소섬들에서는 완전히 부재)(도 1c). 따라서, Vα17.4+ 및 LCMV TCRs(각각 당뇨병유발-이전 및 중성(neutral))와는 달리, Vα17.6+ TCR은 항-당뇨병유발 특성들을 갖는 것으로 나타난다.
이들 Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들의 대부분의 형질전환 T 세포들이 사량체들을 약하게 결합하거나 또는 전혀 결합하지 않는다는 사실에도 불구하고, 흉선을 빠져나가는 상기 세포들의 분획(fraction)이 명백하게 높은 결합활성(즉, 높은 mfi로)으로 사량체를 결합한다(도 2a). 본 발명자들은 이들 생쥐들의 상기 사량체-저(tetramer-low(lo) 및 사량체-음성(tetramer-negative) CD8+ T 세포들이 TG TCR을 발현하나 그러나 내인성 TCR들(즉, TCRα쇄들)에 대하여 양성 선택을 수행하는 CD4+CD8+ 흉선세포들로부터 유래된다고 의심하였다. 반면에, 사량체-고(tetramer-high) 세포들은 단지 TG TCRαβ쇄들만을 발현하고 그리고 펩티드/주조직 적합성 복합체에 대한 이들의 낮은 친화성으로 인하여 만일 이들이 정상 보다 높은 수준의 TG TCR을 발현하는 경우 단지 양성 선택만을 수행할 수 있는 CD4+CD8+ 흉선세포들로부터 유래될 것이다. 이러한 해석은 RAG-2-/- 배경 내에서 Vα17.6+ TCR을 발현하는 생쥐들에 있어서 숙성하는 유일한 세포들은 높은 결합활성을 갖는 사량체를 결합하는 것들이라는 관측에 의하여 지지된다(도 2b). 중요하게도, 이들 2가지 형태들의 RAG-2-/- TCR-TG 생쥐들은 유사한 정도로 당뇨병으로 발전한다(도 3). 따라서, 본 발명자들은 RAG-2+Vα17.6 TCR-TG 생쥐들 내에서 성숙하는 상기 사량체-저 및 사량체-CD8+ T 세포들이 이들 사량체-고 상대들(이들은 RAG-/- TCR-TG 생쥐에서 당뇨병을 야기함)의 당뇨병유발 잠재성(diabetogenic potential)을 억제하는 것으로 의심하였다. 이들 결과들을 내인성(즉, 비-형질전환) TCRα쇄들의 발현을 재개(recludes)하는 내인성 TCR-Cα 결핍(deficiency)을 수반하는 Vα17.6 TCR TG 생쥐들의 저량(stocks)들에서 재생산하였다.
Vα17.6+(그러나 Vα17.4+는 아님) TCR-TG 생쥐들이 자발적으로 면역억제 활성을 갖는 기억 CD8+ 세포들의 풀을 생성한다. Vα17.6+ TCR-TG 생쥐 및 TCR-Cα-결핍 Vα17.6 TCR-TG 생쥐들의 서로 다른 림프구 기관들 내에 포함된 사량체-양성 CD8+ T-세포들의 유세포분석 연구(cytofluorometric studies)가 비장, 림프절 및 특히 기억 T-세포들의 공지된 저장소(reservoir)인 골수 내에서 Vα17.4+ TCR-TG 생쥐들에 비하여 CD44hi 및 CD44hiCD122+ CD8+ 세포들의 확대된 풀(enlarged pools)들의 존재를 밝혀내었다(도 5a 및 5b). 중요하게도, 이는 상기 사량체-저 내에서 원발적으로 발생하나, 그러나 CD122+ 세포들을 포함하지 않는 사량체-고 아군에서는 그렇지 않다(도 5c). 이들 세포들은 중심(central) 및 효과기(effector) 기억 림프구들(도 5d) 둘 다에서 기술되는 마커들을 발현하고, 그리고 말초림프계 기관들(peripheral lymphoid organs) 내에서 우세적으로 발견되나, 그러나 흉선에서는 그렇지 않아 말초 유래(peripheral origin) 임을 암시한다(도 5e).
더욱이, BrdU 혼합 분석(5-브로모-2'-디옥시우리딘(5-bromo-2'-deoxyunridine ; BrdU) 혼합 분석)은 이들이 생체 내에서 증식한다는 것을 암시하였다(도 5f). 정제된 비장 Vα17.6+(그러나 Vα17.4+는 아님) TCR-TG CD8+ 세포들이 항원제공세포들 및 항원의 부재 중에서 인터류킨-2 또는 인터류킨-15에 격렬하게 반응하여 증식하는 것과 마찬가지로, 기능적으로, 이들 기억-유사 세포(memory-like cells)들은 명확하게 '기억' T-세포로서 행동한다(도 5g). 더욱이, 이들은 시험관 내에서의 항원으로의 자극에 의하여 신속하게 감마-인터페론을 생산한다(도 5h 및 5i). 그러나, 이들은 시험관 내에서의 항원성 자극에 대하여는 증식하지도 않고 인터류킨-2를 생산하지도 않는다(도 5j). 이러한 기능상 프로파일(functional profile)은 조절(억제) CD4+CD25+ T 세포 아군의 기능상 프로파일을 고도로 연상시킨다. 전체적으로 보아, 이들 데이터는 Vα17.6+(그러나 Vα17.4+는 아님) TCR-TG CD8+ 세포들이 장기-생존하는 기억 T 세포들(long-lived memory T cells)(하나 또는 그 이상의 항원 상대들에 의하여)이 되는 증가된 능력을 가지며, 아마도, 심지어 항원의 부재 중에서도, 항상성 신호들(homeostatic cue)에 대한 반응에서 무기한으로 생존할 수 있다는 것을 암시한다.
이들 관측들은 본 발명자들이 이들 기억 저-결합활성 T 세포들의 뛰어난 항상성 '적합성'(homeostatic 'fitness'), 달리 베타 세포들을 사멸시키지 못하는 것이 이들의 항당뇨병유발 활성(즉, 이들의 보다 높은-결합활성에 대한 경쟁적 잇점을 제공하나, 그러나 대부분 미접촉의, 베타 세포 살해자 클론형들을 제공하는 것에 의하여 및/또는 이들의 활성화를 억제하는 것에 의하여)에 기여한다는 것을 추측하도록 한다. 후자를 평가하기 위하여, Vα17.4+ TCR-TG NOD 생쥐들로부터의 CFSE-표지된 비장 CD8+ T 세포들의 증식을 억제하는 능력에 대하여 정제된 CD122+ 및 CD122-Vα17.6+ TCR-TG CD8+ T 세포들의 능력을 평가하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, CD122+ (그러나 CD122는 아님) Vα17.6+ TCR-TG CD8+ T 세포들은 이들의 보다 높은 결합활성 미접촉 T 세포 상대들의 증식을 거의 완전히 억제하였다.
Vα17.6+ TCR-TG NOD 생쥐들 내에서의 mice기억 (CD122+) 저-결합활성 자가반응성 CD8+ T 세포들의 자발적으로 확장된 풀이 항-당뇨병유발성이라는 사상과 일치하여, CD40에 대하여 작동성 mAb(agonistic mAb) 또는 4-1BB에 대하여 작동성 mAb인 NRP-V7-펄스시킨 수지상 세포들로의 Vα17.6+ 및 Vα17.4+ TCR-TG 생쥐들의 전신적(정맥 내) 치료는(CD8+ T 세포 활성화/생존을 향상시키기 위한) Vα17.4+ TCR-TG NOD 생쥐들 내에서 당뇨병의 빠른 발병을 유도하나, 그러나 Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들에서의 질병을 유발시킬 수는 없었다(표 4).
17.4α/8.3β-TG NOD 생쥐들 내에서 기억 T-세포 발달 및 확장을 촉진하고 당뇨병의 급속한 발병을 촉진하나, 그러나 17.6α/8.3β-TG NOD 생쥐들에서는 그러하지 않은 치료들
치료 숙주 당뇨병 발생 당뇨병 발병일
(표준오차)
작동성 항-CD40
mAB		 17.4 비 비만성 당뇨병
17.6 비 비만성 당뇨병		 4/4
0/3		 10.5 (4.6)
--
작동성 항-4-IBB
mAB		 17.4 비 비만성 당뇨병
17.6 비 비만성 당뇨병		 3/3
0/2		 2.3 (1.5)
--
NRP-V7 펄스시킨 수지상 세포 17.4 비 비만성 당뇨병
17.6 비 비만성 당뇨병		 해당없음(N.A.)
0.3		 --
--
100㎕/㎖ NRP-V7 생쥐들로 펄스시킨 106 LPS-활성화 골수-유래 수지상 세포들의 3 내지 4일 간격의 2회의 주사들과 함께 항-CD40 mAb 또는 항-4-IBB mAb 100㎍의 3회의 주사들이 적어도 최종 주사 8주 후 당뇨병으로 추적되었다.
동족 및 비동족의 당뇨병유발 T 세포 반응(즉, 이들 억제 T-세포들-IGRP206 -214-의 표적 자가항원성 펩티드 이외의 자가항원성 펩티드들에 대하여 지향되는)을 억제하는 CD122+ Vα17.6+ TCR-TG CD8+ T 세포들의 능력은 본 발명자들로 하여금 이들이 항원-제공 세포들(APCs)을 표적하는 것에 의하여 이들의 억제 활성 효과를 초래할 것이라고 추측하도록 한다. 표적 세포들로서 펩티드-펄스시킨 수지상 세포들 및 효과기들로서 CD122+ 또는 CD122-Vα17.6+ 및 CD122-Vα17.4+ TCR-TG CD8+ T 세포들을 사용하는 세포독성(51크롬-방출(51Chromium-release)) 분석은 후자는 아닌 전자가 특이적으로 시험관 내에서 NRP-V7-펄스시킨 수지상 세포들을 용해(lyse)시킬 수 있다는 것을 나타내었다(도 7a).
본 발명자들은 이것이 생체 내에서도 또한 사실이라는 것을 확인하였다. 이들은 같은 수의 NRP-V7-펄스시킨 그리고 TUM-펄스시킨 B-세포들(각각 염료 CFSE의 저농도 및 고농도로 표지시킨)을 Vα17.6+ TCR-TG 및 Vα17.4+ TCR-TG 생쥐들 내로 수혈시키고 그리고 1일 후 숙주(hosts)들을 희생시켜 어느 세포들이 수혈 후 생존하였는 가를 조사하였다. 도 7b에 나타난 바와 같이, NRP-V7-펄스시킨 B-세포들이 단지 Vα17.4+ TCR-TG 생쥐들 내에서만 생존된 반면에, 상기 음성 대조 펩티드 TUM으로 펄스시킨 B-세포들은 TCR-TG 균주(strains)들 둘 다에서 생존하였다. B-세포들 보다는 오히려 DCsm을 항원제공세포들로 사용한 경우에서 실제로 동일한 결과들이 수득되었다(도 7b). 이들 데이터는 저-결합활성 CD122+ Vα17.6+ TCR-TG CD8+ T 세포들이 자가항원-적재 항원제공세포들(autoantigen-loaded APCs)을 사멸시키는 것에 의하여 동족 및 비동족 당뇨병유발 T 세포 반응들을 억제한다는 것을 암시한다.
NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들이 야생형 비 비만성 당뇨병 생쥐들에서 저 결합활성(사량체-매개(tetramer-intermediate) 기억 자가반응성 CD8+ 세포들의 확장을 유도하는 지의 여부의 조사. 비 비만성 당뇨병 생쥐들을 펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅된 나노구들로 치료하는 것이 고 결합활성 클론형들의 소멸 및 저-결합활성 CD8+ T 세포들의 확장 및 보충, 소섬들에 대한 다른 IGRP 에피토프-반응성 특이성들의 불완전 보충 및 당뇨병으로부터의 보호의 결과를 가져올 것이라고 고려된다.
야생형 비 비만성 당뇨병 생쥐들 내의 상기 비드-확장 CD8+ T 세포들이 장기-생존하는 저 결합활성 기억 T 세포들인 지의 여부를 평가하기 위하여, 본 발명자들은 NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들로 치료된 생쥐의 비장 골수 내에 포함되는 NRP-V7/Kd 사량체-양성 CD8+ T-세포들 내의 기억 마커(memory markers)(CD44 및 CD122)의 존재를 분석할 것이다. 이들 생쥐들의 비장 및 골수 내에 포함된 사량체-양성 세포들의 확장된 개체군들이 증가된 백분율의 CD44hi 및 CD44hiCD122+ CD8+ T-세포들을 포함하여 NRP-V7/Kd 나노구 치료가 상기 사량체 +CD44hi 및 사량체 +CD44hiCD 122+ T 세포 풀의 크기를 증가시킨다는 것을 암시한다는 것이 고려된다.
NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들로의 생체 내 치료에 의해 확장된 상기 기억-유사 T-세포들이 Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들 내에 자발적으로 축적되는 기억 CD122+ Vα17.6+ TCR-TG CD8+ T 세포들처럼 행동할 것이고: 이들은 인터류킨-2를 생산하지도 않고 증식하지도 않으나, 그러나 시험관 내 항원성 자극에 대하여 높은 수준의 감마-인터페론을 생산한다는 것이 고려된다. 항-CD3 mAb 및 인터류킨-2로의 활성화에 의하여, 이들 기억-유사 T-세포들이 시험관 내에서 CFSE-표지된 응답기(responder) Vα17.4+ TCR-TG CD8+ T-세포들의 증식을 효과적으로 억제할 것이라는 것이 또한 고려된다.
펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅된 나노구들이 사전-존재하는 저-결합활성 기억 T 세포들을 확장시킨다. 펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅된 나노구들이 기억 T-세포들을 새로이(de novo) 생성하지는 않을 것이나 그러나 오히려 기억 T 세포들의 사전-존재하는 풀들을 확장시킬 것이다. TUM/Kd-코팅된 나노구들로의 비 비만성 당뇨병 생쥐들의 치료는 TUM 반응성 CD8+ T 세포들의 전신적 확장을 유도하지는 않을 것이라는 것이 고려된다. NRP-V7/Kd-코팅된 나노구들로의 B 10.H2g7 생쥐들의 치료가 모든 림프계 기관들 내에서의 NRP-V7/Kd 사량체 +CD8+ T-세포 아군의 명백한 확장을 유도하지는 않을 것이고 그리고 당뇨전증 단계(pre-diabetic stage)에서 보다 당뇨병 발병에서 개시되는 경우에 나노구-치료된 비 비만성 당뇨병 생쥐들에서의 사량체-반응성 CD8+ T-세포들의 전신적 확장이 명백하게 보다 효과적일 것이라는 것이 또한 고려된다. 공동자극(costimulation)의 부재 중에서의 TCR 결찰(ligation)에 의하여 세포자살(apoptosis)을 수행하는 경향인 미접촉의 CD8+ T 세포들과는 달리, 기억 CD8+ T 세포들은 성장에 대하여 공동자극-비의존성(costimulation-independent)이다.
상기 가설을 형식적으로 조사하기 위하여, 본 발명자들은 IGRP206-214의 2가지 TCR-접촉 잔기들을 알라닌으로 치환시킨(K209A 및 F213A) IGRP의 돌연변이 형태(mutant form)를 발현하는 유전자-표적화된(gene-targeted) 비 비만성 당뇨병 균주 내의 IGRP206-214/Kd-반응성 CD8+ T-세포들을 확장시킬 수 있는 지의 여부를 결정할 것이다. 표적화된 대립유전자들(alleles)(본 출원에서는 FLEX1 또는 NOD.IGRPK209A/F213A KI/KI로 칭함)을 신속-유사유전자 접근법(speed-congenic approach)을 사용하여 상기 비 비만성 당뇨병 배경 상으로(129로부터) 역교배(backcross)시켜 전체 IDD 좌위(Idd loci)들에서 비 비만성 당뇨병 대립유전자들의 동형접합성(homozygosity)을 확실하게 하였다. 이들 유전자-표적화된 생쥐들 내에서 성숙하는 상기 CD8+ T-세포들이 생체 내에서 IGRP206-214에 전혀 노출되지 않기 때문에, 이들 생쥐들은 자발적으로 기억 IGRP206-214/Kd-반응성 CD8+ T-세포들을 생성하지는 않을 것이다. 이들 생쥐들이 당뇨병 및 인슐린염 둘 다로 발전하지 않는다는 사실에도 불구하고(나타내지는 않음), 이들의 소섬-연관 CD8+ T-세포들은 IFRP 내의 에피토프들을 인식하나, 그러나 IGRP206-214-반응성 CD8+ 클론형들을 완전히 없애지는 못한다. 적절한 투여량의 IGRP206-214/Kd-코팅된 나노구들로 치료된 FLEX1-동형접합 비 비만성 당뇨병 생쥐들이 그들의 림프계 기관들 내에 IGRP206-214/Kd-반응성 CD8+ T-세포들의 확장된 풀들을 포함하지는 않을 것이라는 것이 고려된다. 이는 펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅된 나노구들이 억제 특성을 갖는 기억 T 세포들의 사전-존재하는 풀들을 확장시키고 그리고 기억 T-세포들을 새로이 생성하지는 않는다는 것을 암시한다.
당뇨병유발 동안에 저-결합활성 클론형들(즉, Vα17.6+ TCR-TG 생쥐들 내의)이 기억 T-세포 자손(progeny)을 생성하는 것에서 그들의 고-결합활성 상대들(즉, Vα17.4+ TCR-TG 생쥐들 내의) 보다 더 효율적인 것으로 나타나기 때문에, 펩티드/주조직 적합성 복합체-코팅된 나노구들이 미접촉의 고-결합활성 클론형들의 탈락(deletion) 및 사전-존재하는 기억 저-결합활성 클론형들의 작은 풀들의 확장을 유도하는 것에 의하여 작동한다고 여겨진다.
실시예 2
인간 제1형 당뇨병 연관 펩티드/조직적합항원 복합체들로 코팅된 철 산화물의 정상혈당 회복의 능력을 시험
조직적합항원 전이유전자를 발현하는 "인간화된" 생쥐 및 제안된 연구들을 위한 펩티드/조직적합항원 복합체들. 앞서 언급한 바와 같이, 인슐린 및 IGRP로부터 유도된 펩티드들이 야생형 비 비만성 당뇨병 생쥐들 내의 CD8+ T 세포들의 일차적인 표적(primary targets)들이다. 당뇨병유발 동안 이들 두 자가항원들로부터 유도되는 펩티드를 제공하는 인간 주조직 적합성 복합체 분자들(인간 류코사이트 항원(Human Leukocyte Antigens ; HLA)의 평가가 '인간화된' HLA-형질전환 비 비만성 당뇨병 생쥐들에서 조사되었다. 연구들은 초기에 특정의 종족(ethnic groups)의 거의 50%로 발현되는 주조직 적합성 복합체 분자인 HLAA*0201에 집중되었다. 이 연구는 NOD.β2mnul1.HHD로 명명된 균주를 사용하며, 이는 쥣과의 β2 마크로글로블린 유전자(murine β2 macroglobulin gene)를 결여하고 그리고 키메라 단쇄 구조물 HHD(chimeric monochain construct)를 발현한다(문헌 (Pascolo et al., 1997). 이 구조물은 인간 HLA-A*0201의 α1 및 α2 도메인들 및 막관통영역(transmembrane)인 α3 및 쥣과의 H-2Db(murine H-2Db)의 세포질 도메인(cytoplasmic domains)들에 공유적으로 결합되는 인간 β2m을 암호화한다. 상기 균주가 단지 HLA-A*020l를 발현하고 그리고 내인성의 쥣과의 클래스 I 주조직 적합성 복합체 분자들을 발현하지 않음에도 불구하고, 이는 30주령에서 55%의 암컷들에 대하여 당뇨병-감수성이다(문헌 Takaki et al., 2006 참조). HLA-A*0201에 결합하는 인간 IGRP의 2가지 에피토프들(hIGRP228-236 및 hIGRP265-273)이 이들 생쥐들의 소섬-연관 CD8+ T 세포들에 의해 인식되고 그리고 NOD.β2mnul1.HHD 생쥐의 소섬들로부터 단리된 CD8+ T 세포들은 인간 HLA-A*0201-양성 소섬들에 대하여 세포독성이다(문헌 Takaki et al., 2006 참조). 이들 펩티드들 중의 하나를 이용하여 펩티드/HLA-A*0201 사량체들을 제조하였다. 쥣과의 CD8 분자들에 의하여 이들 사량체들의 결합을 용이하게 하기 위하여, 상기 HLA-A*0201 복합체의 상기 α3(CD8-결합) 도메인을 상기 쥣과의 H-2Kb 분자의 도메인으로 교체하였다. 이들 연구들로부터의 결과들은 HLA-A*0201-제한 T 세포들 및 인간 제1형 당뇨병에 잠재적인 연관성(potential relevance)의 베타 세포 자가항원들의 동정에 대한 이들 생쥐들의 유용성을 구축하였다(문헌 Takaki et al. 2006 참조). 본 상세한 설명에 기초하여, 제1형 당뇨병 환자들로부터의 HLA-A*0201-제한 T 세포들로 표적화되는 인간 펩티드들을 동정할 수 있다. 게다가, 본 발명자들은 HLA-A*1101, HLA-B*0702 또는 HLA-Cw* 0304를 발현하는 비 비만성 당뇨병 생쥐를 생성시켰다. 이들 생쥐들은 또한 이들을 NOD.β2mnull.hβ2m과 교잡시키는 것에 의하여 쥣과의 β2m을 인간 β2m으로 교체시켰다(문헌 Hamilton-Williams et al., 2001 참조). 3가지 HLA 전이유전자들 모두 잘 발현되고, 그리고 상기 HLA-형질전환 균주들 모두 당뇨병-감수성이었다. 이들 "인간화된" 동물들로부터의 조직적합항원들과 함께 각각 4가지 서로 다른 조직적합항원 상위유형(HLA supertypes)들 HLA-A2, HLA-A3, HLA-B7 및 HLA-Cl들을 대표로 고려하였다(문헌 Sidney et al., 1996; Doytchinova et al., 2004 참조). HLA-A*1101, HLA-B*0702 또는 HLA-Cw*0304 대립유전자들의 유전자 빈도(gene frequencies)들은 시험된 종족에 따라 각각 23%, 11% 또는 10%만큼 높아질 수 있다(문헌 Cao et al., 2001 참조). 4개의 상위유형들 모두가 표적화되는 경우 개체군의 범위는 고려되는 종족에 따라 90% 이상이 될 수 있다(문헌 Sidney et al., 1996; Doytchinova et al., 2004; Cao et al., 2001 참조). 이러한 고찰은 이들 연구들의 인간에로의 번역과 관련하여 명백하다. 앞서 기술된 NOD.β2mnull.HHD 균주와 마찬가지로 이들 동물들은 장래의 연구들에 대하여 사용가능하다.
이 실시예에서 본 발명자들은 야생형 비 비만성 당뇨병 생쥐들에서의 이들 관측들을 어떻게 '인간화된' HLA-형질전환 비 비만성 당뇨병 생쥐들로 번역하는 지에 대한 디자인을 제안한다. 상기 목표는 인간 제1형 당뇨병에 관련있는 자가반응성 CD8+ T 세포들의 풀들을 표적하는 여러 서로 다른 펩티드/조직적합항원 복합체들로 코팅된 나노구들로의 치료가 그들의 새로이 진단된 상대들에서 정상혈당을 회복하는 것과 마찬가지로 상기 생쥐들을 당뇨병으로부터 보호할 수 있는 지를 조사하기 위한 것이다. 여기에서 본 발명자들은 인간 제1형 당뇨병에서 사용하기 위한 제1형 당뇨병-연관 펩티드/조직적합항원 조합들을 동정하기 위한 번역 접근법(translational approach)을 제공한다. 특히, 본 발명자들은 서로 다른 제1형 당뇨병-연관 자가항원성 펩티드/HLA-A*0201 복합체들로 코팅된 나노구들이 NOD.β2mnull.HHD 생쥐들(HLA-A*0201를 발현하는)에서 당뇨병 보호를 제공하고 그리고 제1형 당뇨병을 치료할 수 있을 것임을 고려한다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 다른 조성물들 및 방법들을 포함하여 '인간화된' HLA-형질전환 생쥐들 내에서의 다른 HLA 분자들에 의하여 소섬-연관 CD8+ T 세포들에로 제공되는 인슐린 및/또는 IGRP 에피토프들에 대하여 사용된 것들과 유사한 조성물들 및 방법들을 사용하여 이러한 상세한 설명을 다른 자가면역 질병들에 연관된 다른 에피토프들에 대한 용도로 사용할 수 있을 것이다. 당해 기술분야에서 숙련된 자는 기억 저-결합활성 CD8+ T 세포들의 치료-전 존재(pre-therapeutic existence)에 대한 치료적인 성공(therapeutic success)를 위한 요건들 및 서로 다른 종족들에서의 가능한 한 많은 개체들을 커버하는(covering) 별도의 펩티드/조직적합항원의 동정과 마찬가지로 최대 치료 잇점(maximum therapeutic benefits)들을 제공하는 펩티드/조직적합항원의 최소 치료 조건(minimal treatment conditions)들 및 형태를 동정할 수 있을 것이다.
나노구 합성. 앞서 기술된 바와 같은(문헌 Moore et al., 2004 참조) 물리적 및 화학적 수준들에서 그러나 비오티닐화 펩티드/HLA-A*0201 단량체(biotinylated peptide/HLA-A*0201 monomers)들을 사용하지 않는 나노구들을 합성하고 그리고 특정화되었다. 상기 복합체의 상기 주조직 적합성 복합체 분자는 인간 β2 마이크로글로블린(human β2 microglobulin) 및 그의 α1 및 α2 도메인들이 쥣과의 H-2Kb의 α3에 융합된(상기 쥣과의 CD8 분자에 의한 인식을 용이하게 하기 위하여) 인간 HLA-A*0201의 키메라 형태로 이루어진다. 자가항원성 펩티드들로서 HLA-A*0201의 정황에서 소섬-연관 CD8+ T 세포들에 의해 인식되는 것으로 밝혀진 여러 서로 다른 인슐린 및 IGRP 유도체들(예를 들면, hInsB10-18, hIGRP228-236 및 hIGRP265-273 등과 같은)이 사용되었다. 비오티닐화 펩티드/HLA-A*0201 단량체들이 아비딘 1몰 당 4몰의 비오틴의 몰비(molar ratio)에서 첨가될 것이다. 24시간에 걸쳐서 4℃에서 느린 교반(10rpm)을 수반하면서 비오티닐화 단백질들이 다중의 비율들(아비딘 당 약 0.4몰의 비오틴)로 첨가될 것이다. 그 결과의 탐침들을 자력분리컬럼(magnetic separation column, 밀트니 바이오텍(Milteny Biotec)) 상에서 정제시켰다. 음성 대조 탐침(negative control probe)의 합성을 위해서는 HLA-A*0201 분자들에 복합화된 무관한 HLA-A*0201-결합 펩티드로 이루어진 단량체를 사용하였다. 나노구 크기, 이완성(relaxivity ; mM 당 이완 속도에서의 변화(change in relaxation rate per mM)), 비오틴 결합 위치(biotin binding sites)들의 갯수 및 철 및 단백질 함량이 측정되었다.
나노구들의 투여. 10 내지 15개체의 암컷 NOD.β2mnull.HHD 생쥐들의 집단들이 앞서 언급된 서로 다른 펩티드/조직적합항원 복합체들 각각 또는 음성 대조 펩티드(인플루엔자(influenza))IHLA 복합체(0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1㎍ 펩티드 등가물, 4 내지 30주령에서 매 3주 마다 1 투여량 또는 10주령에서 5연속주 동안 2 투여량/주)로 코팅된 나노구들로 치료될 것이다. 항원-특이적 CD8+ T 세포들의 말초 확장(peripheral expansion)이 혈액단핵구들(blood mononuclear cells)을 항-CD8 mAb 및 펩티드/주조직 적합성 복합체 사량체들로 염색(치료의 개시 이전 및 치료 중단에서)하는 것에 의하여 기록될 것이다. 생쥐들을 고혈당증의 발병 시 또는 연구의 종결시에서 희생시킬 것이다. 서로 다른 림프계 기관들(비장, 림프절), 골수(기억 T 세포들의 공지된 저장소), 간, 폐 및 소섬들 내의 중심 및/또는 효과기 기억(CD69-, CD44hi, CD62Lhi 또는 CD62Llo , CD122+, Ly6C+) 사량체+ CD8+ T 세포들의 존재에 대하여 다색유세포분석(multi color flow cytometry)에 의해 개개 생쥐들이 연구될 것이다. 사량체-결합 결합활성(tetramer-binding avidity)이 기술된 바와 같이 측정될 것이다(문헌 Han et al., 2005; Amrani et al., 2000 참조). 본 발명자들은 치료가 저-결합활성 중심 및 효과기 기억 사량체+ CD8+ 세포들의 전신적 확장 및 골수, 췌장림프절(pancreatic lymph nodes ; PLNs) 및 소섬들 내에서의 이들 T 세포들의 선호적인(그러나 배타적이 아닌) 축적을 유도한다고 고려한다.
펩티드/주조직 적합성 복합체 복합체의 다중 투여량의 투여. 다른 연구에서, 유효 투여량(effective dose)의 1회, 2회, 3회 또는 4회 주사들로 생쥐들의 집단들이 치료될 것이며, 본 발명자들은 이것이 다른 연구들에서(4주, 7주, 10주 및 13주) 치료 효능을 나타내는 복합체들 모두에 대하여 유사할 것이라고 고려한다. 보호는 (보호 문턱값(protective threshold) 이상으로 상기 기억 저-결합활성 T 세포 풀을 확장시키기 위하여) 1 투여량 또는 1 투여량 이상이 요구될 것이라는 것과 확장된 사량체+ CD8+ 기억 T 세포 개체군이 점진적으로 순환으로부터 사라져서 골수, 췌장림프절 및 소섬들에 축적된다는 것이 기대된다.
고혈당증의 발병 시에서의 펩티드/주조직 적합성 복합체 복합체의 투여. 보다 공격적인 나노구 치료 프로토콜(aggressive nanosphere treatment protocol)(1 내지 5㎍ 펩티드 등가물, 5주간 주당 2회)로 고혈당증의 발병 시(>10.5mM/ℓ)에서 생쥐들이 치료될 것이다. 음성 및 양성 대조들은 각각 무관한 펩티드/조직적합항원 복합체 또는 항-CD3mAb(5일간 20㎍의 매일의 정맥 내 주사(문헌 Haller, 2005 참조))로 코팅된 나노구들을 수령하게 될 것이다. 순환 중의 사량체-양성 CD8+ T 세포들의 기저선 백분율(baseline percentages)을 평가하기 위하여 치료의 개시 이전에 즉각적으로 생쥐들을 출혈시킬 것이다. 혈당값(blood glucose values)들이 치료가 중단된 시점에서 적어도 4주 동안 <10mM/ℓ로 안정화되는 경우에 제1형 당뇨병의 반전(reversal)으로 고려될 것이다. 순환하는 사량체-양성 CD8+ T 세포들의 명백하게 확장된 풀들의 존재를 확인하기 위하여 생쥐들이 다시 출혈시킬 것이다. 동물들은 적어도 별도의 8 내지 12주 동안 추적되어 안정한 차도를 확인할 것이다. 관측 기간의 종점에서 생쥐들을 희생시켜 서로 다른 림프계 및 비-림프계 기관들 내의 기억 사량체-양성 CD8+ T 세포들의 확장된 풀들의 장기간 지속성을 구축하도록 한다. 조직학적 분석(histological analysis)을 위하여 비장 조직이 또한 수확될 것이다. 장기간 차도가 단핵세포 침윤이 없는 다수의 작은 소섬들의 존재와 관련이 있다고 기대된다. 즉, 상기 치료가 보호성 기억 T 세포들에 의해 감염된 소섬들의 점령을 조성할 것으로 기대되는 당뇨전증 생쥐들에서의 상황과는 달리, 당뇨병 생쥐들에서의 치료는 소섬들(아마도 염증 잠재성(inflammatory potential)을 결여한 신생의 소섬들) 내에서가 아닌 췌장림프절들(기억 T 세포들의 다른 저장소들에 더해) 내의 보호성 기억 T 세포들의 축적을 촉진하는 것으로 기대된다.
펩티드/조직적합항원-코팅된 나노구들은 미접촉의 고결합활성 클론형들의 탈락을 유도하는 것에 의하여 작동한다. 본 발명자들은 저결합활성 자가반응성 CD8+ T 세포들이 제1형 당뇨병 진전 동안 기억 세포들로서(적은 수로) 축적하는 경향이 있고 그리고 펩티드/조직적합항원-코팅된 나노구들이 미접촉의 고-결합활성 클론형들(공동자극 없이 TCR 촉발(triggering)로 인하여) 및 사전 존재하는 기억 저-결합활성 클론형들(공동자극-비의존성)의 작은 풀들의 확장을 유도하는 것에 의하여 작동한다는 것으로 고려된다. 부분적으로, 이는 무관한 펩티드(종양 항원성인 (TUM/H-2Kd로부터) 복합체로의 생쥐의 치료가 배경 이상의 TUM/Kd 사량체-반응성 CD8+ T 세포들의 말초 확장을 유도하지 않는다는 관측으로부터 생겨난다(상기 참조). 계속해서 이들 기억 저-결합활성 자가반응성 CD8+ 세포들은 자극 공급원들(stimulatory resources)(즉, 수지상 세포 상의 항원/주조직 적합성 복합체, 사이토카인 등)에 대한 경쟁에 의한 이들의 미접촉의 고-결합활성(아마도 덜-적합한(less-fitter)) 상대들의 활성화를 억제한다. 실제로, 기억 세포들이 항상성 신호들(즉, 인터류킨-15)에 대하여 미접촉의 T 세포들과 효과적으로 경쟁할 수 있는 다른 계들에서 증거가 존재한다(문헌 Tan et al., 2002 참조). 췌장림프절 내에서의 자가항원 적재 수지상 세포들과 안정한 접촉들을 이루는 것에 의하여, 이들 만연하는 기억 저-결합활성 클론형들이 또한 다른 자가반응성 T 세포 특이성들의 활성화를 억제할 것이다.
펩티드/조직적합항원-코팅 나노구들의 T 세포 확장(및 항-당뇨병유발 활성)의 징후는 베타 세포들 내에서의 내인성 표적 자가항원의 발현을 필요로 한다. 내인성 표적 자가항원들의 발현은 상기 나노구 치료에 의하여 후속적으로 확장되는 기억 저 결합활성 자가반응성 CD8+ T 세포 풀들의 형성을 유도하는 자극의 원천인 것으로 여겨진다. IGRP 결핍이 NOD.β2mnull.HHD 생쥐들 내로 도입될 것이다. 이들 생쥐들이 hIGRP228-236(mIGRP228-236와 교차반응) 및 hIGRP265-273(identical to mIGRP265-273와 동일)/HLA-A*0201-코팅 나노구들로 치료될 것이다(문헌 Takaki et al., 2006 참조). NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD 생쥐들이 적정 투여량의 2개의 IGRP/HLA 복합체들로 코팅된 나노구들로 치료될 것이다. 본 발명자들은 상기 치료가 대응하는 hIGRP 펩티드/HLA-반응성 CD8+ 세포들의 확장/보충을 유도하지는 못할 것으로 고려된다.
만일 IGRP 발현이 당뇨병 발달(이는 집쥐들이 이를 발현하지 않기 때문에, IGRP 발현의 결여가 치명적이지는 않은 것으로 알려짐)에 대하여 불필요하고 그리고 생쥐가 자발적으로 당뇨병으로 발달하지 않는 경우, 상기 나노구 치료가 상기 생쥐들을 제1형 당뇨병으로부터 보호되지 않을 것이라는 것이 또한 예견된다(기억 IGRP-반응성 CD8+ T 세포들이 없을 것임). 대조적으로, 생쥐들이 인슐린을 발현하는 것을 지속함에 따라 HLA-A*0201 및 인슐린 에피토프들의 복합체들로 코팅된 나노구들로의 치료가 대응하는 기억 T 세포 풀들의 확장을 유도하고 그리고 보호가 될 것으로 기대된다.
본 출원에서 시험될 나노구 형태들이 상기 생쥐들 모두에서 명백한 T 세포 확장을 유도할 수는 없다는 것이 가능하다. 이는 아마도 대응하는 T 세포 개체군이 이미 치료의 개시에 앞서 생체 내에서의 프라이밍(priming)을 수행하는 지의 여부에 의존적일 것이다. 여러 서로 다른 나노구 형태들의 조합들로 치료된 생쥐들의 별도의 집단들을 연구하는 것이 유용하고/필수적일 것이다. 명백하게, 본 발명자들의 예견과는 반대로, 나노구 치료가 기억 저-결합활성 T 세포 풀들의 새로운 형성을 유도할 수 있을 것이라는 것이 예견된다. 그러나, 이 경우에 있어서, 이들이 치료된 NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD 생쥐들에서 수지상 세포들 상에 내인성 IGRP/HLA-A*0201 복합체들이 결합하지 못할 것이기 때문에 본 발명자들에게는 이들 세포들이 보호적이지 못할 것이라는 것이 고려된다.
hIGRP 발현 생쥐(hIGRP expressing mice). 본 발명자들은 집쥐 인슐린 촉진-구동 인간 IGRP 전이유전자(rat insulin promoter-driven human IGRP transgene)를 발현하는 여러 계열들의 생쥐를 생성하고 그리고 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)에 의해 이들 계열들 각각에서의 상기 인간 전이유전자의 발현의 수준들을 내인성 mIGRP 암호화 장소(endogenous mIGRPencoding locus)의 수준들과 비교하였다. 상기 전이유전자의 발현의 수준들이 계열 대 계열에서 크게 가변적이었음에도 불구하고, 발현의 수준들은 개개 계열들 내에서의 서로 다른 개체들 간에서 일정하였다. 이들 계열들 중의 하나에 있어서(#1114) hIGRP의 발현의 수준들은 mIGRP의 수준들과 등가이었다.
본 발명자들은 이러한 RIP-hIGRP 전이유전자를 NOD.β2mnull.IGRPnull.HHD 생쥐들 및 hβ2m/HLA-A*1101, HLA-B*0702 또는 HLA-Cw*0304-형질전환 NOD.β2mnull.IGRPnull 생쥐들 내로 도입시켜 이들 4가지 서로 다른 HLA 대립유전자들의 정황에서 CD8+ T 세포 반응들의 표적들인 hIGRP 내의 별도의 에피토프들을 동정할 수 있다. 이들 생쥐들의 상기 소섬-연관 CD8+ T 세포들은 HLA-A*0201, HLA-A*1101, HLA-B*0702 및 HLA-Cw*0304-결합 hIGRP 펩티드들의 라이브러리(libraries)들에 대한 반응성에 대하여 스크리닝(screened)될 것이다.
계속해서 대응하는 hβ2 m/HLA-A*1101, HLA-B*0702 또는 HLA-Cw*0304-형질전환 NOD.β2mnull.IGRPnull 생쥐들에서의 항-당뇨병유발 효능에 대하여 대응하는 펩티드/조직적합항원 복합체-코팅된 나노구들이 시험될 것이다. 이 실험의 전체 목적은 가능한 한 많은 환자들을 치료하는 데 사용될 수 있는 펩티드/조직적합항원 조합들의 레퍼토리(repertoire)를 확장시키는 것이다.
나노입자 치료 특성들 및 pMHC 공액화의 최적화(Optimization ofNP therapeutic properties and pMHC conjugation). pMHC 클래스 I을 사용하는 진행중인 연구들이 수행되어 pMHC 원자가와 마찬가지로 상기 나노입자 크기 및 밀도를 최적화시켰다. 이는 금 나노입자들이 철 산화물에 비해 이러한 형태의 연구들에 대하여 더 취급하기 용이하기 때문에 금 나노입자(gold NP)를 사용하여 수행되었다. 이는 또한 자가조절 T-세포 기억을 확장시키는 pMHC-NP의 능력이 상기 나노입자 코어(철 산화물 대 금)의 화학적 조성과 무관하다는 것을 보여주어 본 발명자들에게 도움이 되었다. 서로 다른 직경들의 금 나노입자들에 대하여 집중적인 연구가 수행되었으며, 그 데이터는 더 작은 것이 최적의 나노입자 크기가 되는 것임을 지적하는 경향에 따라 직경에 있어서 14㎚ 미만(<14㎚)의 나노입자들이 유리하다는 것을 암시한다. 상기 나노입자들의 단분산 또는 안정성에 대하여 절충함이 없이 그들의 카르복시 말단들(carboxy termini)을 경유하는 상기 나노입자 표면에의 다중 pMHC들의 지향성 결합(directional binding)(50 내지 200/나노입자 초과) 및 높은 입자 밀도(1010/㎕ 초과)로의 농도를 허용하는 코팅된 나노입자들의 적절한 안정화(stabilization). 당뇨전증의 비 비만성 당뇨병 생쥐들(pre-diabetic NOD mice)에서의 이들 클래스 I 나노백신들을 시험하는 것에 의하여, 본 발명자들은 생체 내에서의 동족의 자가조절성 CD8+ T-세포들의 명확한 확장을 가능하게 하는 나노입자 투여량 및 pMHC 원자가의 작업가능한 범위를 완성하였다(약 10 내지 20배). 본 발명자들은 pMHC의 총 투여량이 핵심이고, 그리고 (동일한 양의 총 pMHC에 대하여) 더 높은 pMHC 원자가들에서 코팅된 더 적은 수의 보다 큰 나노입자들에 비하여 더 적은 pMHC들로 코팅된 더 많은 수의 작은 나노입자들로 주어지는 경우에 가장 우수한 결과들이 수득되었다는 것을 완성하였다. 이들 조건들은 또한 조직 축적을 감소시키고 그리고 금속의 가장 적은 가능한 투여량에서 pMHC의 치료적인 수준의 전달을 가능하게 한다.
하나의 바람직한 구체예에 있어서, 하기의 추정들에 기초하는 투여량 체제(dosing regimens)들이 사용되었다:
추정: 투여량 당 단백질의 총량이 약 1㎍ 내지 25㎍인 것이 충분한 밀도에서 pMHC 항원으로 코팅된 4㎚ 철-산화물 나노입자.
예를 들면, 투여량 당 총 pMHC(1㎍ 내지 25㎍) = (1.34 x 1013 pMHC/투여량 내지 3.33 x 1014 pMHC/투여량)
투여량 당 총 철(4㎚) 나노입자들(1㎍ 내지 15㎍) = (3.73 x 1012 나노입자/투여량 내지 5.60 x 1013 나노입자/투여량)
투여량 당 pMHC의 양이 가능한 한 낮게 0.1㎍ 내지 500㎍의 범위가 될 수 있다는 것이 이해된다.
하나의 실시예로서, 60㎏의 인간 환자에 있어서, 투여량 당 pMHC의 양은 0.24 내지 6.08㎎의 범위가 될 수 있으며, 이는 앞서 언급한 1㎍ 내지 25㎍에 대응한다는 것은 이해될 수 있다. 또한 앞서와 마찬가지로, 이러한 투여량은 0.1㎍ 내지 500㎍에 대응하도록 변화될 수 있다.
앞서 기술된 상기 4㎚ 철 산화물 입자들이 14㎚의 직경을 갖는 금 나노입자들에 비해 향상된 효능을 제공하여 보다 작은 입자들이 개선된 효용을 갖는다는 것을 암시한다. 용어 "철 산화물(iron oxide)"은 당해 기술분야에서 획득가능하거나 또는 공지된 모든 철 산화물들을 포함하는 것을 의미하며, 예로서는 아이언 옥시하이드록사이드(iron oxyhydroxides)를 포함한다.
실시예 3
단특이성 펩티드-주조직 적합성 복합체 클래스 II-코팅 나노구들(MONO SPECIFIC PEPTIDE-MHC CLASS II-COATED NANOSPHERES)
제1형 당뇨병-연관 pMHC 클래스 II 복합체들의 생산. 제1형 당뇨병-연관 펩티드/I-Ag7 복합체들로 코팅된 나노구들이 또한 제1형 당뇨병 보호를 제공하고 그리고 비 비만성 당뇨병 생쥐들에서 제1형 당뇨병을 치료한다는 가설을 시험하기 위하여, 하기의 5가지의 제1형 당뇨병-연관 및 대조 펩티드 시퀀스들 즉, BDC2.5 미모토프(BDC2.5 mimotope): AHHPIWARMDA(시퀀스 동정번호. 59); IGRP128-145: TAALSYTISRMEESSVTL(시퀀스 동정번호. 60); IGRP4-22: LHRSGVLIIHHLQEDYRTY(시퀀스 동정번호. 61); IGRP195-214: HTPGVHMASLSVYLKTNVFL(시퀀스 동정번호. 62); 및 인슐린 B9-23: SHLVEALYLVAGERG(시퀀스 동정번호. 63) 들로부터 여러 서로 다른 펩티드/I-Ag7 복합체들이 구축되었다. 음성대조로서, G6P 이성질화효소 펩티드(LSIALHVGFDH; 시퀀스 동정번호. 64)/I-Ag7 복합체(자가 pMHC 대조) 및 2가지 계란 라이소자임(hen egg lysozyme)(HEL14-22-RHGLDNYRG; 시퀀스 동정번호. 65- 및 HELl1-25-AMKRHGLDNYRGYSL; 시퀀스 동정번호. 66-)/I-Ag7 복합체(외래 pMHC 대조)들이 사용될 수 있다. 재조합 I-Ag7 단량체들이 앞서 기술된 바 대로 생성되었다. 간단하게, 천연의 선도 시퀀스들에 대한 벡터 pRMHa3 암호(code) 내의 최종 구조물들에 각각 앞서 기술된 상기 펩티드 시퀀스들 및 I-Ag7 a 및 btho들의 세포질외 도메인들(extracytoplasmatic domains)이 후속된다. 두 쇄들은 연결자 시퀀스(linker sequence ; SSAD), 트롬빈 개열 자리(thrombin cleavage site ; LVPRGS) 및 상기 a 및 b쇄 각각에 대하여 산성 또는 염기성 류신 지퍼 시퀀스(leucine zipper sequence) 내로 확장되고 6개의 연속적인 히스티딘 잔기(histidine residues)들이 후속된다. 비오티닐화 시퀀스 #85(biotinylation sequence #85)가 상기 a쇄 상의상기 산성 지퍼에 후속한다. 상기 DNA 구조물들은 안정한 세포주들을 생성하기 위한 퓨로마이신 저항성 유전자(puromycine resistance gene)와 함께 드로소필라 멜라노개스터 에스씨2(Drosophila melanogaster SC2) 세포 내로 공동-형질감염(co-transfected)되었다. 대-규모의 제조(12ℓ)를 위하여, 재조합 단백질들을 CuS04-유도 세포 상청액(supernatants)으로부터 접선 흐름(tangential flow)에 의하여 수확하고 그리고 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)와 마찬가지로 금속 킬레이트 친화력 크로마토그래피(metal chelate affinity chromatography), 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography)에 의해 정제하였다. BirA 효소(BirA enzyme)를 사용하여 정제된 분자들의 비오티닐화(biotinylation)가 수행되었다. 스트렙타비딘-아가로스 비드(streptavidin-agarose beads) 상에서의 면역소모(immunodepletion) 및 후속하는 전기영동(SDS-PAGE ; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 비오티닐화를 측정하였다. 이들 복합체들은 생흡수성, 생분해성 나노구들에 공액화될 수 있다. 이들 단량체들은 또한 pMHC-코팅된 나노구들로의 처리 이전 또는 이후 둘 다에서 동족 자가반응성 CD4+ T-세포들을 나열하기 위한 형광색소-공액화 사량체(fluorochrome-conjugated tetramers)들을 생산하는 데 사용될 수 있다. 계속해서 정제된 비오티닐화 pMHC 복합체들은 상기 나노구들 상으로 코팅될 수 있다. 본 출원에서 제안된 연구들을 위하여, 본 발명자들은 앞서와 같은 파리 세포(fly cell)들에서 그러나 상기 IgG2a Fc에 융합된 개개 나노구들:이량체(nanospheres: dimers)들 상으로 코팅될 수 있는 pMHC들의 총 원자가를 증가시키지 않는 다른 구조물 설계(construct design)를 사용하지 않고 상기 재조합 pMHC 복합체들을 생산할 수 있다.
나노구 치료특성 및 pMHC 공액화의 최적화. pMHC 원자가와 마찬가지로 나노구 크기 및 밀도를 최적하기 위하여 pMHC 클래스 I 복합체들을 사용하는 연구들이 수행될 수 있다. 상기 나노구들의 크기, 밀도, 하전(charge) 및 단분산성(monodispersity)은 분광광도법(spectrophotometry), 투과전자현미경(transmission electron microscopy ; TEM) 및 동적 광산란법(dynamic light scattering)에 의하여 측정될 수 있다. 상기 나노구 샘플들은 단분산성을 희생시킴이 없이 농축되고, 3.4kD 티올-PEG-NH2-pMHCs와 공액화되고, 세척되고 그리고 고밀도(약 1014/㎖)로 농축될 수 있다.
직경에 있어서 5 내지 15㎚의 나노구들이 최적이라는 것이 고려된다. 새로운 합성 프로토콜이 이들의 카르복시 말단들을 경유하는 나노구 표면에의 다중 pMHC들의 지향성 결합(예를 들면, 200/나노구 까지) 및 단분산성 또는 안정성을 희생시킴이 없이 고입자밀도(1010/㎕ 초과)로 농축되는 것을 허용하도록 적절한 안정화를 가능하게 할 것이다. 이들 클래스 I 나노백신들이 당뇨전증 비 비만성 당뇨병 생쥐들에서 시험되어 생체 내 동족 자가조절성 CD8+ T-세포들의 거대한 확장을 가능하게 하는 나노구 투여량 및 pMHC 원자가의 작업가능한 범위를 구축하도록 할 수 있다. 새로이 진단된 당뇨병 생쥐의 이들 pMHC-나노구들로의 치료는 정상혈당을 회복함에 있이서 고도로 효율적일 것이다. (동일한 양의 총 pMHC에 대하여) 보다 높은 pMHC 원자가들에서 코팅된 보다 적은 수의 보다 큰 나노구들에 비해 보다 적은 pMHC들로 코팅된 보다 많은 수의 작은 나노구들이 주어지는 경우에 가장 우수한 결과들이 얻어질 것이라고 고려된다. 이들 조건들 및 상기 나노구들의 생흡수성, 생분해성 특성들이 조직 축적을 감소시키고 그리고 가장 낮은 가능한 투여량에서 치료 수준의 pMHC의 전달을 가능하게 한다는 것이 또한 고려된다.
제1형 당뇨병-연관 pMHC 클래스 II-코팅 나노구들로의 치료에 의한 비 비만성 당뇨병 생쥐들에서의 고혈당증의 반전. 필수적으로 pMHC 클래스 I-코팅 나노구들에 대하여 기술된 바와 같이 pMHC 클래스 II-코팅 생분해성, 생흡수성 나노구들이 새로이 진단된 당뇨병 비 비만성 당뇨병 생쥐에서 고혈당증을 반전시킬 수 있다는 것이 고려된다. 당뇨병 비 비만성 당뇨병 생쥐는 매 주 2회 7.5㎍의 나노구들로 치료될 수 있다. 생쥐들이 4연속주 동안 정상혈당을 유지하는 경우에 생쥐들이 치료된 것으로 고려되었다. 2.5mi/I-Ag7-나노구들이 거의 모든 시험된 생쥐들에서 고혈당증을 반전시킬 것이 고려된다. 고혈당증은, 예를 들면, 복강내 당부하 검사(IPGTTs)에 의하여 측정될 수 있다. IGRP128-145/I-Ag7-나노구, B9-23/I-Ag7-나노구 및 IGRP4-22/I-Ag7-나노구들로 치료된 고혈당증 생쥐들의 전부는 아닐지라도 대부분은 정상혈당이 될 것이 고려된다. 대조로서, GPI282-292/I-Ag7(제1형 당뇨병-연관 자가 항원) 및 HEL14-22/I-Ag7(외래 항원으로 코팅된 나노구들이 사용될 수 있다. 이들 실험들이 여러 서로 다른 제1형 당뇨병-연관 pMHC 클래스 II-복합체들로 코팅된 '단일특이적(monospecific)' 나노구들이 제1형 당뇨병 반전을 유도하는 것에서 적어도 pMHC 클래스 I-코팅 나노구들로서 유효할 수 있다는 것을 입증할 것이 고려된다. 일부 경우들에 있어서, 정상혈당의 일정하고 보편적인 장기간의 유지를 위해서는 촉진(boosting)이 필요할 것으로 여겨진다.
제1형 당뇨병-연관 pMHC 클래스 II-코팅 나노구들 및 동족 Tr1-유사 및 기억-표현형 자가조절성 CD4+ T-세포들의 확장. 2.5mi/I-Ag7-나노구들로의 치료에 의하여 정상혈당으로 되는 50주령의 당뇨병 생쥐들의 혈액, 비장, 췌장림프절(PLNs), 장간막림프절(mesenteric lymph nodes ; MLNs) 및 골수가 당뇨병 발병 시 즉각적으로 또는 연령이 통일된 비-당뇨병의, 미치료된 동물들과 비교하여 장간막림프절을 제외한 검사된 모든 기관들에서 2.5mi/I-Ag7 사량체+ CD4+ T-세포들의 명백하게 증가된 백분율을 나타낼 것이 고려된다.
CD4+ T-세포 확장이 항원-특이적이고, 그리고 비-동족의 자가 반응성 CD4+ T-세포들의 풀들의 확장이 검출되지 않을 것이 고려된다. 정상혈당의 지속적인 유지를 위해서는 자가조절성 T-세포 확장의 유지가 필요할 것이 고려된다. 이들 나노입자-확장된 2.5mi/I-Ag7 사량체+ 세포들 대 2.5mi/I-Ag7 사량체-세포들의 표현형 분석이 기억-유사 표현형(CD621ow, CD44high 및 중간의 CD69 상향조절(upregulation))을 밝힐 것이다. 이들 세포들은 CD25- 및 FoxP3-일 수 있다. 이는 FoxP3-eGFP를 발현하는 비 비만성 당뇨병 생쥐 내에서 확인될 수 있으며, 여기에서 Treg 세포들이 본질적으로 eGFP를 발현한다. 10주령에서의 이들 생쥐들의 2.5mi/I-Ag7-나노구들로의 치료가 eGFP-2.5mi 사량체+ CD4+ T-세포들을 확장시킬 수 있다. FACS-분류 2.5mi/I-Ag7 사량체+ T-세포들의 기능상 시험관 내 연구(functional in vitro studies)들은 이들이 동족의, 그러나 비-동족이 아닌, 펩티드로 펄스시킨 수지상 세포들에 반응하여 증식할 수 있는 지 그리고 이들이 인터류킨-10 및 감마-인터페론을 분비하는 지의 여부를 결정할 수 있다. 이들 연구들은 효소결합면역흡수분석법 및 루미넥스 기술(luminex technology)을 이용하여 수행될 수 있다. 이들 Tr1-유사 CD4+ T-세포들이 높은 수준의 세포 표면 TGFβ를 발현할 것이 고려된다.
pMHC 클래스 II-나노구-확장 사량체+ 세포들, 그러나 이들의 사량체-상대가 아닌,은 Gp33 및 2.5mi 펩티드-펄스시킨 수지상 세포들(각각 상기 응답기 및 사량체+ Trl CD4+ 세포들에 의해 인식된)에 대하여 효과적으로 미접촉의 LCMV Gp33-특이적 CD8+ 세포들의 증식을 억제할 것이 고려된다. 또한 상기 배양물(cultures)에의 항-인터류킨 10의 첨가는 대조 집쥐-면역글로블린 지(rat-IgG)를 수령하는 배양물에 비하여 이러한 억제 활성을 부분적으로 억제한다는 것으로 여겨진다. 퍼포린-결핍 비 비만성 당뇨병(perforin-deficient NOD) 생쥐에서의 실험들과 마찬가지로 IGRP4- 22/I-Ag7-나노구들로 치료되고 그리고 항-인터류킨 10 또는 집쥐-면역글로블린 지(대조로서)를 차단하는 당뇨병 생쥐에서의 실험들이 pMHC 클래스 II-나노구들에 의한 정상혈당의 회복(restoration)이 인터류킨-10 및 퍼포린-의존성(perforin-dependent)이라는 것을 보여줄 것이다. pMHC-나노구들이 확장할 수 있으나, 그러나 그들의 억제 활성은 아닌, Trl 세포들의 발달에 감마-인터페론이 필요하다는 것이 또한 고려된다. 감마-인터페론-/- 생쥐에서의 pMHC-나노구에 반응하여 확장될 수 있는 동족의 자가반응성 T-세포들이 Th2 표현형(생체 외에서의 펩티드 도전(peptide challenge)에 대응하여 인터류킨-4 및 인터류킨-10을 생산하는)을 가질 수 있는 반면에 인터페론-10-/- 생쥐에서 확장되는 것들은 감마-인터페론 및 인터류킨-10이 아닌 인터류킨-4를 생산할 수 있다. 이들 결과들은 당뇨병 반전이 Trl-유사 세포들에 의해 매개된다는 것을 나타낼 수 있다.
실시예 4
IGRP/Kd-PLGA 나노구를 사용하는 T-세포 확장
IGRP206-214/Kd-PLGA 나노구들이 시험관 내에서 동족의 CD8+ T-세포들의 활성화를 유도한다. 이 분석은 필수적으로 문헌 Tsai et al., Immunity (2010) 32, 568-680에 기술된 바와 같이 수행되었으며, 이는 본 출원에서 참조로 포함된다. 간단하게, 8.3-NOD 생쥐들로부터의 정제된 미접촉의 IGRP206-214/Kd-특이적 T 세포 수용기(TCR)-형질전환 CD8+ T-세포들을 IGRP206-214/Kd-PLGA 나노구들과 함께 48시간 동안 배양시켰다. 상청액을 감마-인터페론에 대하여 분석하였다. 상기 세포들을 [3H]-티미딘의 1μCi로 펄스시키고 그리고 수확하였다.
웰 당 나노구들의 수에 대한 관계에서 CPM 및 감마-인터페론이 측정되었다. 이를 도 9에 묘사하였다. 도 8은 PLGA 입자들에 공액화된 IGRP/Kd의 확대된 이미지를 묘사하고 있다. 상기 PLGA 입자들은 다음과 같이 제조되었다: 농도:100㎚(PLGA: 1.5㎖ 내의 20㎎/㎖).
DLS 크기: 154.72㎚
pMHC 공액화: 2㎖ PLGA 입자들에 5㎎ IGRP/Kd 공액화
최종 용적: 2㎖
참조문헌
하기의 참조문헌들은 본 출원에서 규정하는 것들을 보충하는 예시적인 절차상 또는 다른 상세들을 제공하는 한에서는 그들의 전체로서 본 출원에 특별히 포함된다.
Figure 112018072069131-pat00008
Figure 112018072069131-pat00009
Figure 112018072069131-pat00010
Figure 112018072069131-pat00011
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Claims (22)

  1. 4㎚ 내지 15㎚의 직경을 갖는 생체적합성 생흡수성 나노구에 대해 50 내지 200보다 큰 비율로 결합된 항원-MHC(주조직 적합성 복합체) 복합체를 포함하는, 항-병원성 자가반응성 T 세포들을 확장시키기 위해 대상체에 투여될 때 자가면역 장애를 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한 고입자밀도 나노입자의 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 복수의 자가-항원 에피토프들이 상기 항원-MHC 복합체 내에 포함되는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 복수의 자가-항원 에피토프들이 단일의 자가-항원 또는 복수의 자가-항원들로부터 유래되는 것인 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 항-병원성 자가반응성 T-세포들의 확장된 개체군은 항원 특이적이지만 비-항원 특이적인 방법으로 억제하는 것인 조성물.
  6. 제3항에 있어서, 상기 생체적합성 생흡수성 나노구의 투여가 동족 또는 비-동족의 병원성 자가반응성 T-세포들의 개체군을 고갈시키는 것인 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제3항에 있어서, 상기 결합은 연결자(linker)를 추가로 포함하고, 상기 연결자는 에틸렌글리콜인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 MHC는 MHC 클래스 II 분자를 포함하는 것인 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 자가반응성 T 세포가 CD4+ TR1 세포이고, 상기 CD4+ TR1 세포는 인터류킨-10 및 감마-인터페론 발현이 특징인 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항원-MHC 복합체는 생체적합성 생흡수성 나노구에 공유적으로 결합되며, 상기 MHC는 MHC 클래스 II 분자를 포함하고, 상기 항-병원성 자가반응성 T 세포는 인터류킨-10을 발현하는 TR1 세포인 조성물.
  14. 제3항에 있어서, 상기 MHC는 MHC I 또는 MHC II 또는 이의 조합이며, 상기 결합은 연결자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  15. 제3항에 있어서,
    상기 자가면역 장애는 당뇨전증(pre-diabetes), 당뇨병(diabetes), 제1형 당뇨병(type I diabetes), 제2형 당뇨병(type II diabetes), 알러지 천식(allergic asthma), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 원발성 담즙성 간경변(primary biliary cirrhosis), 시신경 척수염(neuromyelitis optica), 심상성 천포창(pemphigus vulgaris), 과민성 장 질환(irritable bowel disease), 크론병(Crohn's disease), 대장염(colitis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 건선성 관절염(psoriatic arthritis), 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 셀리악병(Celiac disease), 건선(psoriasis), 심근병증(cardiomyopathy), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 포도막염(uveitis), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 그레이브병(Grave's disease), 염증성 근육병(inflammatory myopathy), 또는 항-인지질 항체 증후군(anti-phospholipid antibody syndrome)이며, 상기 결합은 연결자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  16. 제3항에 있어서, 복수의 자가-항원 에피토프들은 단일의 자가-항원 또는 복수의 자가-항원들로부터 유래되는 상기 항원-MHC 복합체 내에 포함되고, 상기 결합은 연결자를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  17. 제1항, 제3항 또는 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 상기 자가면역 장애는 제1형 당뇨병이고, 상기 항원은 PPI, IGRP, GAD 또는 프로-인슐린(pro-insulin)으로 이루어진 군에서 선택된 항원으로부터 유래된 것이고, 상기 MHC는 HLA-DR의 일부 또는 전부를 포함하거나;
    b) 상기 자가면역 장애는 다발성 경화증이고, 상기 항원은 MOG, MBP, 또는 PLP로 이루어진 군으로부터 선택된 항원으로부터 유래된 것이고, 상기 MHC는 HLA-DR의 일부 또는 전부를 포함하는 것인 조성물.
  18. 투여량 당 항원-MHC 복합체의 양이 0.024 내지 121.6 mg인, 제1항, 제3항 또는 제11항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 투여 제제.
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
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