JP2013541532A - 生体適合性生体吸収性ナノスフェアを用いて自己免疫疾患を処置するための方法 - Google Patents
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- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
Abstract
Description
本出願は、2010年9月29日に出願された米国特許仮出願第61/387,873号に対する35 U.S.C. § 119(e)による優先権を主張し、その出願は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、免疫学および医学に関する組成物および方法を対象とする。特に、本発明は、自己免疫状態、特に糖尿病の診断および治療のための診断学および治療学に関する。
自己免疫におけるT細胞寛容を誘導するために、抗原ワクチン接種を使用することができる。溶液での自己抗原性タンパク質またはペプチドの投与は、自己免疫疾患の実験モデルにおいて自己免疫の開始および/または進行を鈍らせることができる(Wraith et al., 1989;Metzler and Wraith, 1993;Liu and Wraith, 1995;Anderton and Wraith, 1998;Karin et al, 1994)。しかしながら、同様の戦略を使用したヒトにおける限られた臨床試験は、ほぼ必ず失敗に終わった(Weiner, 1993;Trentham et al., 1993;McKown et al., 1999;Pozzilli et al., 2000;Group, D.P.T.-T.D.S. 2002;Kappos et al., 2000;Bielekova et al,, 2000)。このことから、処置の選択および状態を導く原理が十分に定義されておらず、その結果としてヒトへの適用に不適切であることが示唆される。
本発明は記載される特定の態様に限定されず、したがって当然のことながら変わり得ることが理解されるべきである。本明細書で用いられる専門用語は特定の態様を説明する目的のためのみのものであって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定する意図はないこともまた理解されるべきである。
特記しない限り、本明細書で用いられる専門用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書において用いられる場合、以下の用語は以下の意味を有する。
・例えば疾患もしくは病態に罹患するリスクがある対象において、そのような疾患もしくは病態を予防するかもしくは防御し、すなわち臨床症状を発症しないようにし、それによって該疾患または病態の発現を実質的に防ぐこと;
・該疾患もしくは病態を阻害すること、すなわち臨床症状の発症を停止させるかもしくは抑制すること;および/または
・該疾患もしくは病態を軽減すること、すなわち臨床症状の退行を招くこと
を含む、患者における疾患または病態の任意の処置を意味する。
本発明は、自己反応性状態を予防または改善するための方法を含む。したがって、本発明は、様々な態様において用いるための「ワクチン」または免疫系改変因子を企図する。ワクチンとしての使用に適していると提案される組成物は、自己反応性タンパク質およびそれらの断片を含む自己反応性分子から調製され得る。本発明は、自己反応性抗原、例えば、ポリペプチド、ペプチド、糖質、脂質、または他の分子もしくは分子断片に対する、およびこのような自己免疫応答によって引き起こされる状態または疾患を発症することに対する免疫応答を誘導または改変するために使用され得る組成物を含む。
本発明の組成物および関連方法、特に抗原/MHC/ナノスフェア複合体の投与はまた、従来の治療法の施行と併用してもよい。これらには、免疫抑制または調節療法または処置の施行が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの態様では、薬学的組成物が対象に投与される。本発明の異なる局面は、抗原/MHC/ナノスフェア複合体組成物の有効量を対象に投与することを含む。さらに、このような組成物は、免疫系の改変因子と組み合わせて投与することができる。このような組成物は一般的に、薬学的に許容される担体または水性媒体中に溶解または分散される。
本明細書において用いられる場合、インビトロ投与という用語は、培養下の細胞を含むがこれに限定されない、対象から取り出されたまたは対象の外部の細胞において行われる操作を指す。エクスビボ投与という用語は、インビトロで操作され、続いて対象に投与される細胞を指す。インビボ投与という用語は、投与を含む、対象内で行われるすべての操作を含む。
本発明の古典的および非古典的MHC分子によって提示される、ペプチド、糖質、脂質、または他の分子を含むがこれらに限定されない、抗原性種に由来するセグメント、断片、および他の分子を含む抗原は、典型的に、MHC分子またはその誘導体に複合体化されるかまたは機能的に結合される。Tリンパ球による抗原認識は、主要組織適合遺伝子複合体(MHC)拘束性である。所与のTリンパ球は、抗原が特定のMHC分子に結合している場合にのみこれを認識する。一般的に、Tリンパ球は自己MHC分子の存在下においてのみ刺激され、抗原は、自己MHC分子に結合している抗原の断片として認識される。MHC拘束は、認識される抗原に関して、およびその抗原性断片と結合するMHC分子に関して、Tリンパ球特異性を規定する。特定の局面において、ある種の抗原は、ある種のMHC分子またはそれに由来するポリペプチドと対形成される。
細胞内抗原および細胞外抗原は、認識および適切な応答の両方に関して、免疫系に対して全く異なる攻撃を示す。T細胞への抗原の提示は、2つの異なるクラスの分子、MHCクラスI(MHC-I)およびMHCクラスII(MHC-II)によって媒介され、これらは異なる抗原プロセッシング経路を使用する。細胞内抗原に由来するペプチドが、事実上すべての細胞上に発現されるMHCクラスI分子によってCD8+ T細胞に提示されるのに対して、細胞外抗原由来ペプチドはMHC-II分子によってCD4+ T細胞に提示される。しかしながら、この二分にはある例外がある。いくつかの研究により、エンドサイトーシスされた粒子状または可溶性タンパク質から生成されたペプチドが、マクロファージおよび樹状細胞においてMHC-I分子上に提示されることが示された。本発明のある態様において、自己抗原由来の特定のペプチドは、適切なMHCクラスIまたはIIポリペプチドとの関連において、ペプチド/MHC/ナノスフェア複合体において同定および提示される。ある局面においては、特定の患者および特定のペプチドセットについてどのMHCポリペプチドを使用すべきかを決定するために、対象の遺伝的構造が評価され得る。
本発明のある局面は、一般的に抗原と称される、抗原応答を誘発または誘導するポリペプチド、ペプチド、核酸、糖質、脂質、および他の分子のセグメント、断片、またはエピトープを含む抗原性組成物に関する方法および組成物を含む。特に、自己免疫応答を介して細胞の破壊をもたらす自己抗原またはこのような自己抗原の抗原性セグメントもしくは断片を、本明細書に記載されるMHC/ナノスフェア複合体の作製において同定および使用することができる。このような自己抗原は、膵島、または膵島細胞を支持する細胞上に提示され得る。本発明の態様は、特定の生理学的機能を果たす特定の細胞または細胞セットに対する免疫応答を調節するための組成物および方法を含む。
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、様々なアミノ酸の欠失、挿入、および/または置換によって改変され得る。特定の態様において、改変されたポリペプチドおよび/またはペプチドは、対象において免疫応答を調節することができる。本明細書において用いられる場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」または「ペプチド」とは、少なくとも5つのアミノ酸残基を含む分子を指す。いくつかの態様では、タンパク質またはペプチドの野生型が使用されるが、本発明の多くの態様では、改変されたタンパク質またはポリペプチドがペプチド/MHC/ナノスフェア複合体を作製するために使用される。ペプチド/MHC/ナノスフェア複合体を用いて、免疫応答を生じさせる、および/または免疫系のT細胞集団を改変する(すなわち、免疫系を再教育する)ことができる。上記の用語は、本明細書において互換的に使用され得る。「改変されたタンパク質」または「改変されたポリペプチド」または「改変されたペプチド」とは、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が、野生型タンパク質またはポリペプチドに対して変化しているタンパク質またはポリペプチドを指す。いくつかの態様において、改変されたタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、少なくとも1つの改変された活性または機能を有する(タンパク質またはポリペプチドまたはペプチドが複数の活性または機能を有し得ることを認識した場合)。具体的には、MHC/ナノスフェア複合体との関連における場合、改変されたタンパク質またはポリペプチドまたはペプチドは、1つの活性または機能に関して変化しているが、他の点、例えば免疫原性または免疫系の他の細胞と相互作用する能力においては、野生型の活性または機能を保持している場合があることが企図される。
ならびに全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20050202032号に開示されているペプチドおよびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。自己反応性ペプチドとしてまたは対照ペプチドとして本発明と共に使用され得る他のペプチドには、
が含まれるが、これらに限定されない。ある局面においては、1、2、3、4、5、6種、またはそれ以上のペプチドが使用され得る。本発明と共に使用され得るペプチドの例にはまた、表1に提供されるものが含まれる。これらのペプチドは、特定のナノスフェア/MHC分子と会合させることができ、または複数種のペプチドを、共通のナノスフェアおよび1種または複数種のMHC分子と会合させることもできる。これらのペプチドの組み合わせの投与は、複数種のペプチドを付着させたナノスフェアの集団を投与すること、および/またはそれぞれ特定のペプチドを付着させた複数のナノスフェア集団、または1、2、3、4、5、6種、もしくはそれ以上のペプチドが1、2、3、4、5、6種、もしくはそれ以上のナノスフェアに付着しているナノスフェアを含むようなナノスフェアの組み合わせを投与することを含む。
GAD65:65 kDaグルタミン酸脱炭酸酵素、GFAP:グリア線維酸性タンパク質、IA-2:インスリノーマ関連抗原2、ppIAPP:膵島アミロイドポリペプチド前駆体タンパク質、IGRP:膵島特異的グルコース6-ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質
MBP:ミエリン塩基性タンパク質、MAG:ミエリン関連糖タンパク質、MOG:ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質、PLP:プロテオリピドタンパク質
MHC分子との複合体における抗原または抗原性断片として、ペプチド以外の分子を使用することができ、このような分子には、糖質、脂質、小分子等が含まれるが、これらに限定されない。糖質は、種々の細胞の外表面の主成分である。ある種の糖質は分化の異なる段階に特有であり、非常に多くの場合、これらの糖質は特異的抗体によって認識される。異なる糖質の発現は、特定の細胞型に限定され得る。子宮内膜および血清抗原に対する自己抗体応答は、子宮内膜症の一般的な特徴であることが示されている。糖質エピトープに特異的である、2-Heremans Schmidt糖タンパク質および炭酸脱水酵素を含むいくつかの以前に同定された抗原に対する、子宮内膜症における血清自己抗体応答が記載されている(Yeaman et al., 2002)。
ある局面において、抗原/MHC複合体は基材に機能的に結合している。基材は、生体適合性生体吸収性材料を含むナノ粒子の形態であってよい。基材はまた、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願第12/044,435号に以前に記載されたようなナノ粒子の形態であってもよい。ナノ粒子は、ナノスフェアまたは生体適合性生分解性ナノ粒子として様々に公知の、可変寸法の構造を有し得る。抗原/MHC複合体を含むこのような微粒子製剤は、該複合体のナノスフェアへの共有結合または非共有結合によって形成され得る。
基材またはナノスフェアを抗原-MHC複合体に結合させるために、以下の技法が適用され得る。
本発明は、本発明の様々な態様において用いるためのポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質について記載する。例えば、特異的ペプチドおよびそれらの複合体は、免疫応答を誘発または調節するそれらの能力についてアッセイされる。特定の態様において、本発明のペプチドまたはタンパク質のすべてまたは一部は、従来技法に従って溶液中でまたは固体支持体上で合成することもできる。様々な自動合成機が市販されており、公知のプロトコールに従って使用することができる。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、Stewart and Young (1984);Tam et al. (1983);Merrifield (1986);およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたい。あるいは、組換えDNA技術を使用してもよく、この場合、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトし、発現に適した条件下で培養する。
本発明は、本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含み得る。自己抗原および自己抗原を提示させるためのMHC分子の核酸配列が含まれ、ペプチド/MHC複合体を調製するために使用され得る。
A. 免疫応答およびアッセイ
上記のように、本発明は、対象において自己抗原に対する免疫応答を惹起または改変することに関する。1つの態様において、結果として生じる免疫応答または状態は、自己免疫応答に関連する疾患もしくは症状を有するか、有する疑いがあるか、または発症するリスクがある対象を防御または処置し得る。
本発明は、ペプチド/MHC/ナノスフェア複合体によって免疫応答が存在するか、誘導されるか、惹起されるか、または改変されるかどうか、およびどの程度まで存在するか、誘導されるか、惹起されるか、または改変されるかを評価するための血清学的アッセイの実施を含む。実施され得る多くの種類の免疫アッセイが存在する。本発明によって包含される免疫アッセイには、米国特許第4,367,110号(二重モノクローナル抗体サンドイッチアッセイ)および米国特許第4,452,901号(ウェスタンブロット)に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。他のアッセイには、インビトロおよびインビボの両方での、標識リガンドの免疫沈降および免疫細胞化学が含まれる。
自己免疫状態を処置または予防するためのタンパク質、ポリペプチド、および/またはペプチドの使用に加えて、本発明は、特定の自己反応性細胞集団または自己反応性状態の存在を診断するための自己抗原または自己免疫状態の存在の検出を含む種々の方法での、これらのポリペプチド、タンパク質、および/またはペプチドの使用を企図する。本発明によれば、自己反応性の存在を検出する方法は、個体から、例えば個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨、または皮膚から、試料を採取する段階を含む。試料の単離に続いて、本発明のポリペプチド、タンパク質、および/またはペプチドを使用する診断アッセイを行って、自己反応性の存在を検出するすることができ、試料中でそのような存在を判定するためのそのようなアッセイ技法は当業者に周知であり、四量体アッセイ、免疫アッセイ、ウェスタンブロット解析、および/またはELISAアッセイなどの方法が含まれる。
本発明の方法は、1つまたは複数の自己抗原によって引き起こされる疾患または状態の処置を含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、自己免疫状態もしくは疾患を有するか、有する疑いがあるか、または発症するリスクがある人において免疫応答を誘導または改変するために与えることができる。自己反応性について陽性と判定された個体、またはこのような状態もしくは関連状態を発症するリスクがあると見なされる個体に対して、これらの方法を使用することができる。
本発明の態様は、いくつかの免疫介在性疾患または自己免疫疾患、例えば、糖尿病、移植片拒絶等を処置または改善するために用いることができる。「自己免疫疾患」には、個体自身の組織もしくは器官から生じこれらに向けられた疾患もしくは障害、またはそれらの症状発現、またはそれらから生じる状態が含まれる。1つの態様において、それは、正常な体組織および抗原と反応するT細胞による産生から生じるか、またはこれによって悪化する状態を指す。自己免疫疾患または障害の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない:関節炎(関節リウマチ、例えば、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風または痛風関節炎、急性痛風関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節炎、II型コラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病、脊椎関節炎、および若年発症関節リウマチ、変形性関節症、進行性慢性関節炎、変形関節炎、原発性慢性多発性関節炎、反応性関節炎、ならびに強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、例えば、尋常性乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬、および爪の乾癬、アトピー、例えば、アトピー性疾患、例えば、枯草熱およびヨブ症候群、皮膚炎、例えば、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎、x連鎖性高IgM症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、蕁麻疹、例えば、慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹、例えば、慢性自己免疫性蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症(全身性強皮症を含む)、硬化症、例えば、全身性硬化症、多発性硬化症(MS)、例えば、脊髄-眼MS、原発性進行性MS(PPMS)、および再発寛解型MS(RRMS)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、播種性硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎(NMO)、炎症性腸疾患(IBD)(例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、大腸炎、例えば、潰瘍性大腸炎(ulcerative colitis)、潰瘍性大腸炎(colitis ulcerosa)、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン蓄積大腸炎、ポリープ性大腸炎、壊死性全腸炎、および貫壁性大腸炎、ならびに自己免疫性炎症性腸疾患)、腸炎、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、呼吸窮迫症候群、例えば、成人または急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、髄膜炎、ブドウ膜の全体または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液障害、リウマチ性脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎におけるような脳神経損傷、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒症、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫状態に起因する突発性難聴、IgE媒介性疾患、例えば、アナフィラキシーならびにアレルギー性およびアトピー性鼻炎、脳炎、例えば、ラスムッセン脳炎ならびに辺縁系および/または脳幹脳炎、ぶどう膜炎、例えば、前部ブドウ膜炎、急性前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有するまたは有さない糸球体腎炎(GN)、例えば、慢性または急性糸球体腎炎、例えば、原発性GN、免疫媒介性GN、膜性GN(膜性腎症)、特発性膜性GNまたは特発性膜性腎症、I型およびII型を含む膜または膜性増殖性GN(MPGN)、ならびに急速進行性GN、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、亀頭炎、例えば、形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、葉状魚鱗癬、表皮剥離性角質増殖症、前悪性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー状態および応答、アレルギー反応、湿疹、例えば、アレルギー性またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、汗疱状湿疹、および水疱性掌蹠湿疹、喘息、例えば、気管支喘息(asthma bronchiale)、気管支喘息(bronchial asthma)、および自己免疫性喘息、T細胞の浸潤を伴う状態および慢性炎症反応、妊娠中の胎児A-B-O血液型などの外来抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、ループス、例えば、ループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、円板状ループスおよび円板状エリテマトーデス、脱毛症ループス、全身性エリテマトーデス(SLE)、例えば、皮膚SLEまたは亜急性皮膚SLE、新生児ループス症候群(NLE)、ならびに播種性紅斑性狼瘡、若年発症(I型)糖尿病、例えば、小児インスリン依存性糖尿病(IDDM)、および成人発症型糖尿病(II型糖尿病)。以下もまた企図される:サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅延型過敏症と関連する免疫応答、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えば、リンパ腫様肉芽腫症、ウェゲナー肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎、例えば、血管炎、大血管血管炎(リウマチ性多発性筋痛および巨細胞性(高安)動脈炎を含む)、中型血管血管炎(川崎病および結節性多発動脈炎/結節性動脈周囲炎を含む)、顕微鏡的多発動脈炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、壊死性血管炎、例えば、全身性壊死性血管炎、ならびにANCA関連血管炎、例えば、チャーグストラウス血管炎または症候群(CSS)およびANCA関連小血管血管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス陽性貧血、ダイアモンドブラックファン貧血、溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、例えば、自己免疫性溶血性貧血(AIHA)、アジソン病、自己免疫性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球漏出を伴う疾患、CNS炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多臓器損傷症候群、例えば、敗血症、外傷、または出血に続発するもの、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病/症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンスジョンソン症候群、類天疱瘡、例えば、水疱性類天疱瘡および皮膚類天疱瘡、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘膜類天疱瘡、および紅斑性天疱瘡を含む)、自己免疫性多発性内分泌障害、ライター病または症候群、熱傷、子癇前症、免疫複合体障害、例えば、免疫複合体腎炎、抗体媒介性腎炎、多発ニューロパチー、慢性神経障害、例えば、IgM多発ニューロパチーまたはIgM媒介性神経障害、自己免疫性または免疫媒介性血小板減少症、例えば、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、例えば、慢性または急性ITP、強膜炎、例えば、特発性角強膜炎、上強膜炎、精巣および卵巣の自己免疫疾患、例えば、自己免疫性精巣炎および卵巣炎、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性内分泌疾患、例えば、甲状腺炎、例えば、自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)、または亜急性甲状腺炎、自己免疫性甲状腺疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、多腺性症候群、例えば、自己免疫性多腺性症候群(または多腺性内分泌障害症候群)、腫瘍随伴症候群、例えば、神経性腫瘍随伴症候群、例えば、ランバートイートン筋無力症症候群またはイートンランバート症候群、スティッフマンまたはスティッフパーソン症候群、脳脊髄炎、例えば、アレルギー性脳脊髄炎(allergic encephalomyelitis)またはアレルギー性脳脊髄炎(encephalomyelitis allergica)および実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)、重症筋無力症、例えば、胸腺腫関連重症筋無力症、小脳変性症、神経性筋強直症、眼球クローヌスまたは眼球クローヌスミオクローヌス症候群(OMS)、および感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨細胞性肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫性慢性活動性肝炎、リンパ球性間質性肺炎(LIP)、閉塞性細気管支炎(非移植)対NSIP、ギランバレー症候群、ベルガー病(IgA腎症)、特発性IgA腎症、線状IgA皮膚症、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、肝硬変、例えば、原発性胆汁性肝硬変および肺硬変、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック(Celiac)またはセリアック(Coeliac)病、セリアックスプルー(グルテン性腸症)、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症(ALS;ルーゲーリック病)、冠動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例えば、自己免疫性内耳疾患(AIED)、自己免疫性難聴、多発性軟骨炎、例えば、難治性または再発または再発性多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群/非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病/症候群、酒さ性自己免疫、帯状疱疹関連疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、原発性リンパ球増加症、例えば、単クローン性B細胞リンパ球増加症(例えば、良性単クローン性γグロブリン血症および意義不明の単クローン性γグロブリン血症、MGUS)、末梢神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例えば、てんかん、片頭痛、不整脈、筋障害、聴覚消失、視覚消失、周期性四肢麻痺、およびCNSのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパチー、巣状もしくは分節状または巣状分節状糸球体硬化症(FSGS)、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性血液障害、線維筋痛症、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮症、初老期認認知症、脱髄疾患、例えば、自己免疫性脱髄疾患および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、ドレスラー症候群、円形脱毛症、全脱毛症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、強指症)、および毛細血管拡張症)、例えば抗精子抗体に起因する男性および女性の自己免疫性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、開心術後症候群、クッシング症候群、鳥愛好者肺、アレルギー性肉芽腫性血管炎、良性リンパ球性血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えば、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、寄生虫病、例えば、リーシュマニア症、トリパノソーマ症、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸球性筋膜炎、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア症、毛様体炎、例えば、慢性毛様体炎、異時性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性または慢性)、またはフックス毛様体炎、ヘノッホシェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症、SCID、後天性免疫不全症候群(エイズ)、エコーウイルス感染症、セプシス、内毒素血症、膵炎、甲状腺中毒症、パルボウイルス感染症、風疹ウイルス感染症、予防接種後症候群、先天性風疹感染症、エプスタインバーウイルス感染症、流行性耳下腺炎、エヴァンス症候群、自己免疫性性腺機能不全、シデナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞性多発筋痛、慢性過敏性肺炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小変化型ネフローゼ、良性家族性および虚血再灌流障害、移植臓器再灌流、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道/肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化性障害、精子形成欠如(asperniogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュプュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、アレルギー性腸炎、癩性結節性紅斑、特発性顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感音難聴、発作性ヘモグロビン尿症、性腺機能低下症、限局性回腸炎、白血球減少症、伝染性単核球症、横断性脊髄炎、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発性神経根炎、壊疽性膿皮症、ケルバン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑症、毒素性ショック症候群、食中毒、T細胞の浸潤を伴う状態、白血球接着不全症、サイトカインおよびTリンパ球によって媒介される急性および遅発型過敏症と関連する免疫応答、白血球漏出を伴う疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患
、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、多腺性自己免疫症候群I型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、心筋症、例えば、拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(EBA)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨洞炎、前頭洞炎、上顎洞炎、または蝶形骨洞炎、好酸球関連障害、例えば、好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増多筋痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性肺好酸球増多症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギルス腫、または好酸球を含む肉芽腫、アナフィラキシー、血清陰性脊椎関節炎、多内分泌性自己免疫疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ブルートン症候群、乳児一過性低γグロブリン血症、ウィスコットアルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病と関連する自己免疫障害、リウマチ、神経系疾患、リンパ節炎、血圧反応の低下、血管機能不全、組織損傷、心血管虚血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、および血管新生を伴う疾患、アレルギー性過敏性障害、糸球体腎炎、再灌流障害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流障害、リンパ腫性気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を有する皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎またはその他の中枢神経系炎症性障害、眼球および眼窩の炎症性障害、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘発毒性、ナルコレプシー、急性の重篤な炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、ならびに子宮内膜症。
以下の実施例は、本発明の様々な態様を説明する目的で提供され、本発明を限定することは決して意図されていない。当業者は、目標を達成し、かつ記載される目的および利点、ならびに本明細書に固有の目標、目的、および利点が得られるように、本発明が十分に適合化されることを容易に認識するであろう。本明細書に記載される方法と共に本実施例は、目下、好ましい態様を代表するものであり、例示的であって、本発明の範囲に対する限定として意図されない。特許請求の範囲によって規定される本発明の精神内に包含される、その中での変更および他の使用が、当業者に想起されるであろう。
ペプチド/MHCコーティングされたナノスフェアでの処置によるT1Dの防御
NRP-V7/Kd単量体でコーティングされた超常磁性ナノスフェアでの処置による糖尿病の防御。NRP-V7/Kdコーティングされたナノスフェアがインビボで寛容誘発性であるかどうかを研究するため、8.3-TCRトランスジェニックNODマウス(さらに以下では8.3-NODまたはVα17.4+ TCR-TGマウスとも称される)を、少量のナノスフェアの数回のi.v.注射で処置する(3日ごとに1回、0.6μgのNRP-V7を保有する5μl)。これらのマウスのトランスジェニック高結合力IGRP206〜214反応性脾臓CD8+ T細胞プールが有意に枯渇することが企図される。除去されなかったCD8+ T細胞がこの処置によってアネルギー化されることもまた企図される。
ナノスフェア療法が、新たに診断された糖尿病マウスにおいて正常血糖を回復する能力を調べるための研究を行う。マウスのコホートを血糖値について週に2回モニターし、≧10.5 mM血糖で高血糖と見なす。マウスを、TUM/KdコーティングされたナノスフェアまたはNRP-V7/Kdコーティングされたナノスフェアを受容するマウス(週に2回注射)にランダムに割り付ける。β細胞ストレスを減少させ、β細胞再生を促進するために、糖尿を示すマウスに半単位の皮下インスリンもまた毎日1回投与する。マウスのさらなるコホートには、DMK138〜146/Dbコーティングされたナノスフェアを受容させる。異なる研究において、変動する割合の動物で安定した寛解を誘導することが示されている、モノクローナル抗CD3抗体による処置(5日間にわたり20μg/日)を、陽性対照として使用する。NRP-V7/Kdコーティングされたナノスフェアで処置したマウスの大部分が、処置の5〜12週間以内に正常血糖となることが企図される。同様に、DMK138〜146/Dbコーティングされたナノスフェアで処置したマウスの大部分が正常血糖となることもさらに企図される。対照TUM/Kdコーティングされたナノスフェアを受容するマウスの大部分は、明白な高血糖に進行すると予測される。
大部分のIGRP206〜214反応性CD8+細胞はCDR3不変Vα17-Jα42鎖を使用し、異種VDJβ鎖を使用しない。糖尿病発症中のこのT細胞サブセットの「結合力成熟」は、3つの異なるVα17エレメントの使用の変化と関連している。これらの3つの異なるVαエレメントがリガンド結合の結合力の差(Vα17.5>Vα17.4>Vα17.6)を提供することが、単一TCRβ鎖との関連において3つの異なるCDR3不変Vα17-Jα42鎖を発現するTCRαβトランスフェクタントの研究において確認された(Han et al., 2005)。ペプチド/MHCコーティングされたナノスフェアが実際に、異なる結合力でリガンドを認識するT細胞を差次的に標的化し得るかどうかを調べるため、NRP-V7/Kdコーティングされたナノスフェアが、これらのトランスフェクタント上のCD8分子の「キャッピング」を誘導する能力を評価する。NRP-V7/Kdコーティングされたナノスフェアとの5分間のインキュベーションによって、Vα17.4+細胞またはVα17.6+細胞よりも多くのVα17.5+細胞がキャップを形成することが企図される。この結果は、NRP-V7/Kdコーティングされたナノスフェアが実際に高結合力T細胞と低結合力T細胞を識別し得ることを示し、これらのナノスフェアがナイーブ高結合力クローン型を優先的に除去する理由ついての説明を提供する。
低結合力自己反応性CD8+ T細胞がインビボで抗糖尿病誘発性特性を有するかどうかを調べるため、低親和性IGRP206〜214反応性Vα17.6/8.3β TCRを、NODマウスにおいて遺伝子導入により発現させた(本明細書において「Vα17.6+」と称される;これは8.3-TCR(Vα17.4+)よりも約10倍低い親和性を有する;Teyton and Santamaria、未公開データ)。このTCRはCD8+細胞の正の選択を促進するが、8.3-TCR(Vα17.4+)よりも明らかにより少なく促進することが示された(Han et al., 2005)。結果として、Vα17.6+ TCR-TGマウスは、Vα17.4+ TCR-TGマウスよりも少ないNRP-V7四量体反応性CD8+胸腺細胞および脾細胞を含む。さらに、Vα17.6+ TCR-TGマウス由来の四量体+(高および低)CD8+細胞は、インビトロでのペプチド刺激に際して、Vα17.4+ TCR-TGマウス由来のものよりも少ないIFN-γ(およびIL-2)を分泌し、リガンドに対するそれらの低結合力と適合して、NRP-V7パルスされたRMA-SKd標的の非効率的なキラーである(Han et al., 2005;データは表示せず)。最も重要なことには、これらのマウスは、糖尿病(雌70匹のうち2匹のみがT1Dを発症した)および膵島炎[Vα17.6+対Vα17.4+ TCR-TGマウスそれぞれにおいて<0.4対>3のスコア(最大値4のうち)(P<0.012)]からほぼ完全に防御される(図1Aおよび図1B)。
Vα17.6+ TCR-TGマウスおよびTCR-Cα欠損Vα17.6 TCR-TGマウスの種々のリンパ系器官中に含まれる四量体陽性CD8+ T細胞の細胞蛍光測定研究により、脾臓、リンパ節、および特に免疫記憶T細胞の公知の貯蔵所である骨髄における、Vα17.4+ TCR-TGマウスと比較した、CD44hiおよびCD44hiCD122+ CD8+細胞の拡大されたプールの存在が明らかになった(図5Aおよび5B)。重要なことには、これは、CD122+細胞を含まない四量体-高サブセットではなく、主に四量体-低サブセット内で起こる(図5C)。これらの細胞は、中枢およびエフェクター免疫記憶リンパ球の両方において示されるマーカーを発現し(図5D)、胸腺ではなく末梢リンパ系器官において主として見出され、このことは末梢起源を示唆している(図5E)。さらに、BrdU取り込みアッセイから、それらがインビボで増殖することが示唆された(図5F)。精製された脾臓 Vα17.6+(しかしVα17.4+ではない) TCR-TG CD8+細胞は、APCおよび抗原の非存在下でIL-2またはIL-15に応答して活発に増殖することから(図5G)、機能的に、これらの免疫記憶様細胞は明らかに「免疫記憶」T細胞として振る舞う。さらに、それらは、インビトロでの抗原による刺激に際してIFN-γを迅速に産生する(図5Hおよび5I)。しかしながら、それらは、インビトロでの抗原刺激に際して増殖することも、インターロイキン-2を産生することもない(図5J)。この機能的プロファイルは、調節性(抑制性)CD4+CD25+ T細胞サブセットのものと非常に似ている。総合すると、これらのデータから、Vα17.6+(しかしVα17.4+ではない) TCR-TG CD8+細胞は、抗原の非存在下であってさえ、恒常性維持の指示に応答しておそらく無限に生存することができる、(1回または複数回の抗原遭遇時に)寿命の長い免疫記憶T細胞となる増加した能力を有することが示唆される。
3〜4日間隔での、抗CD40 mAbまたは抗4-1BB mAb 100μgのi.pへの3回注射、 100μg/ml NRP-V7でパルスされた106個のLPS活性化骨髄由来DCの2回注射、最終注射後少なくとも8週間、糖尿病についてマウスを追跡した。
NODマウスをペプチド/MHCコーティングされたナノスフェアで処置すると、高結合力クローン型の消失、ならびに低結合力CD8+ T細胞の増殖および動員、膵島への他のIGRPエピトープ反応性特異性の動員の低下、ならびに糖尿病からの防御が起こることが企図される。
ペプチド/MHCコーティングされたナノスフェアは、免疫記憶T細胞を新たに生じるのではなく、免疫記憶T細胞の既存のプールを増大させると考えられる。TUM/KdコーティングされたナノスフェアでNODマウスを処置しても、TUM反応性CD8+T細胞の全身的な増殖は誘導されないことが企図される。NRP-V7/KdコーティングされたナノスフェアでB 10.H2g7マウスを処置しても、すべてのリンパ系器官においてNRP-V7/Kd四量体+CD8+ T細胞サブセットの有意な増大は誘導されず、ナノスフェア処置したNODマウスにおける四量体反応性CD8+ T細胞の全身的な増殖は、糖尿病の前段階よりも糖尿病発症時に開始した場合に、有意により効果的であることがさらに企図される。また、共刺激の非存在下ではTCR連結時にアポトーシスを起こす傾向があるナイーブCD8+ T細胞とは異なり、免疫記憶CD8+ T細胞は、増殖について共刺激とは無関係であると考えられる。
ヒト1型糖尿病関連ペプチド/HLA複合体でコーティングされた酸化鉄ナノスフェアが正常血糖を回復する能力の試験
提案される研究に利用可能な、HLA導入遺伝子を発現する「ヒト化」マウスおよびペプチド/HLA複合体。
上記したように、インスリンおよびIGRPに由来するペプチドは、野生型NODマウスにおけるCD8+ T細胞の主要な標的である。糖尿病発症中の、ヒトMHC分子(ヒト白血球抗原、HLA)提示されたこれら2つの自己抗原由来のペプチドの評価を、「ヒト化」HLAトランスジェニックNODマウスにおいて調べている。研究では、最初に、ある民族のほぼ50%によって発現されるMHC分子であるHLAA*0201に着目した。この研究ではNOD.β2mnull.HHDと命名された株を使用するが、これはマウスβ2マクログロブリン遺伝子を欠いており、キメラ単鎖構築物HHDを発現する(Pascolo et al., 1997)。この構築物は、ヒトHLA-A*0201のα1およびα2ドメインに共有結合しているヒトβ2m、ならびにマウスH-2Dbのα3、膜貫通、および細胞質ドメインをコードする。この株はHLA-A*0201のみを発現し、内因性マウスクラスI MHC分子を発現しないが、糖尿病感受性であり、雌の55%が30週齢までに罹患する(Takaki et al., 2006)。HLA-A*0201に結合するヒトIGRPの2つのエピトープ(hIGRP228〜236およびhIGRP265〜273)は、これらのマウスの膵島関連CD8+ T細胞によって認識され、NOD.β2mnull.HHDマウスの膵島から単離されたCD8+ T細胞は、ヒトHLA-A*0201陽性膵島に対して細胞傷害性である(Takaki et al., 2006)。これらのペプチドのうちの1つを用いて、ペプチド/HLA-A*0201四量体を作製した。マウスCD8分子によるこれら四量体の結合を促進するため、HLA-A*0201複合体のα3(CD8結合)ドメインを、マウスH-2Kb分子のドメインで置換した。これらの研究による結果から、ヒトT1Dに潜在的に関連するHLA-A*0201拘束性T細胞およびβ細胞自己抗原の同定のためのこれらのマウスの有用性が確立された(Takaki et al., 2006)。現在の開示に基づいて、T1D患者由来のHLA-A*0201拘束性T細胞によって標的化されるヒトペプチドを同定することができる。加えて、本発明者らは、HLA-A*1101、HLA-B*0702、またはHLA-Cw*0304を発現するNODマウスを作製した。これらのマウスもまた、それらとNOD.β2mnull.hβ2m株(Hamilton-Williams et al., 2001)を交配することにより、マウスβ2mがヒトβ2mで置換されている。3つのHLA導入遺伝子はすべて十分に発現し、HLAトランスジェニック株の3つはすべて糖尿病感受性である。まとめると、これらの「ヒト化」動物由来のHLAは、4つの異なるHLAスーパータイプ、それぞれHLA-A2、HLA-A3、HLA-B7、およびHLA-C1を代表する(Sidney et al., 1996;Doytchinova et al., 2004)。HLA-A*1101、HLA-B*0702、またはHLA-Cw*0304対立遺伝子の遺伝子頻度は、調べた民族に応じて、それぞれ23%、11%、または10%ほどの高さであり得る(Cao et al., 2001)。集団のカバー度は、4つのスーパータイプがすべて標的化される場合、検討した民族に応じて90%を超え得る(Sidney et al., 1996;Doytchinova et al., 2004;Caoe et al., 2001)。この検討は、これらの研究のヒトへの置き換えに関して意義がある。これらの動物および前述のNOD.β2mnull.HHD株は、さらなる研究に利用可能である。
ナノスフェアは、ビオチン化ペプチド/HLA-A*0201単量体を用いることを除き、本質的には以前に記載されたように(Moore et al., 2004)合成され、物理的および化学的レベルで特徴づけられる。複合体のMHC分子は、ヒトβ2ミクログロブリン、およびそのα1およびα2ドメインがマウスH-2Kbのα3ドメインに融合されている(マウスCD8分子による認識を促進するため)ヒトHLA-A*0201のキメラ型から構成される。自己抗原性ペプチドとして、HLA-A*0201との関連において膵島関連CD8+ T細胞によって認識されることが示されている、いくつかの異なるインスリンおよびIGRP誘導体(例えば、hInsB10〜18、hIGRP228〜236、およびhIGRP265〜273など)を用いる。ビオチン化ペプチド/HLA-A*0201単量体を、アビジン1モル当たりビオチン4モルのモル比で添加する。ビオチン化タンパク質を、ゆっくりと撹拌しながら(10 rpm)4℃で24時間にわたって複数に分けて添加する(1アビジン当たりビオチン約0.4モル)。得られたプローブを磁気分離カラム(Milteny Biotec)で精製する。HLA-A*0201分子と複合体化された非関連のHLA-A*0201結合ペプチドからなる単量体を、陰性対照プローブの合成に使用する。ナノスフェアサイズ、緩和能(1 mM当たりの緩和率の変化)、ビオチン結合部位数、ならびに鉄およびタンパク質含有量を測定する。
10〜15匹の雌性NOD.β2mnull.HHDマウスのコホートを、上記の種々のペプチド/HLA複合体のそれぞれまたは陰性対照ペプチド(インフルエンザ)/HLA複合体でコーティングされたナノスフェアで処置する(0.01、0.05、0.1、0.5、および1μgペプチド等価物、4〜30週齢から3週間ごとに1用量、または10週齢で開始して連続5週間にわたって2用量/週)。抗原特異的CD8+ T細胞の末梢増殖は、抗CD8 mAbおよびペプチド/MHC四量体で血液単核細胞を染色することによって実証される(処置開始前および処置中止時)。高血糖の発症時または研究の終了時に、マウスを屠殺する。種々のリンパ系器官(脾臓、リンパ節)、骨髄(免疫記憶T細胞の公知の貯蔵所)、肝臓、肺、および膵島における中枢および/またはエフェクター免疫記憶(CD69-、CD44hi、CD62LhiまたはCD62Llo、CD122+、Ly6C+)四量体+ CD8+ T細胞の存在について、個々のマウスをマルチカラーフローサイトメトリーにより研究する。四量体結合の結合力を、記載されるように(Han et al., 2005;Amrani et al., 2000)測定する。本発明者らは、処置が、低結合力の中枢およびエフェクター免疫記憶四量体+ CD8+細胞の全身的増殖、ならびに骨髄、膵リンパ節(PLN)、および膵島におけるこれらのT細胞の優先的な(しかし排他的でない)蓄積を誘導することを企図する。
別の研究において、マウスのコホートを、他の研究において治療有効性を示すすべての複合体について同様であると本発明者らが企図する有効用量の1、2、3、または4回注射で処置する(4、7、10、および13週時)。防御は1つまたは2つ以上の用量を必要とすること(防御閾値を超えて免疫記憶低結合力T細胞プールを増大させるため)、ならびに増殖した四量体+ CD8+免疫記憶T細胞集団は血中から次第に消失して、骨髄、PLN、および膵島中に蓄積することが予測される。
マウスを、より積極的なナノスフェア処置プロトコール(5週間にわたって週2回の1〜5μgペプチド等価物)で高血糖(>10.5 mM/l)の発症時に処置する。陰性対照および陽性対照には、それぞれ無関係のペプチド/HLA複合体または抗CD3 mAbでコーティングされたナノスフェアを受容させる(5日間にわたって20μgの毎日のi.v.注射(Haller, 2005))。処置の開始直前にマウスから採血して、血中の四量体陽性CD8+ T細胞のベースライン割合を評価する。少なくとも4週間にわたって血糖値が<10 mM/lで安定する場合に、T1Dの回復が考えられ、この時点で処置を中止する。マウスから再度採血して、血中の四量体陽性CD8+ T細胞の有意に増大したプールの存在を確認する。動物を少なくともさらに8〜12週間追跡して、安定した寛解を確認する。観察期間の終了時にマウスを屠殺して、種々のリンパ系および非リンパ系器官における免疫記憶四量体陽性CD8+ T細胞の増大したプールの長期持続を確証する。組織学的解析のために、膵臓組織もまた摘出する。長期寛解は、単核細胞浸潤を欠いている多数の小さな膵島の存在と関連すると予測される。すなわち、処置が防御的免疫記憶T細胞による炎症膵島の占有を促進すると予測される前糖尿病マウスにおける状況とは異なり、糖尿病マウスにおける処置は、膵島(おそらく、新生膵島は炎症能を欠いている)ではなく、膵リンパ節(免疫記憶T細胞の他の貯蔵所に加えて)における防御的免疫記憶T細胞の蓄積を促進すると予測される。
本発明者らは、低結合力自己反応性CD8+ T細胞がT1D進行中に(少数で)免疫記憶細胞として蓄積する傾向があること、ならびにペプチド/HLAコーティングされたナノスフェアが、ナイーブ高結合力クローン型の除去(共刺激なしでのTCR誘発による)および既存の免疫記憶低結合力クローン型の小さなプールの増大(共刺激非依存的)を誘導することによって働くことを企図する。一つには、これは、無関係のペプチド(腫瘍抗原性由来、(TUM/H-2Kd)複合体によるマウスの処置が、バックグラウンドを超えるTUM/Kd四量体反応性CD8+ T細胞の末梢増殖を誘導しなかったという知見(上記を参照されたい)に由来する。次いで、これらの免疫記憶低結合力自己反応性CD8+細胞は、刺激性供給源(すなわち、DC上の抗原/MHC、サイトカイン等)において競合することにより、それらのナイーブ高結合力(おそらく、より適切でない)対応物の活性化を阻害する。実際、免疫記憶細胞が恒常性維持の指示(すなわち、IL-15)においてナイーブT細胞と効率的に競合し得る他の系における証拠が存在する(Tan et al., 2002)。PLNにおいて自己抗原が負荷されたDCと安定に接触することにより、これらの広く行き渡った免疫記憶低結合力クローン型はまた、他の自己反応性T細胞特異性の活性化を阻害する。
内因性標的自己抗原の発現は、ナノスフェア処置によってその後増大する免疫記憶低結合力自己反応性CD8+ T細胞プールの形成を誘導する刺激の供給源であると考えられる。IGRP欠損をNOD.β2mnull.HHDマウスに導入する。これらのマウスを、hIGRP228〜236(mIGRP228〜236と交差反応性)およびhIGRP265〜273(mIGRP265〜273と同一)/HLA-A*0201コーティングされたナノスフェア(Takaki et al., 2006)で処置する。NOD.β2mnull.IGRPnull.HHDマウスを、2種類のIGRP/HLA複合体でコーティングされた最適用量のナノスフェアで処置する。本発明者らは、この処置が、対応するhIGRPペプチド/HLA反応性CD8+細胞の増殖/動員を誘導しないことを企図する。
本発明者らは、ラットインスリンプロモータ駆動性のヒトIGRP導入遺伝子を発現するいくつかのマウスの系統を作製し、リアルタイムRT-PCRにより、これらの系統のそれぞれにおける該ヒト導入遺伝子の発現レベルを、内因性mIGRPコード遺伝子座のものと比較した。導入遺伝子の発現レベルは系統によって非常に可変的であったが、発現レベルは個々の系統内の異なる個体間で一貫していた。これらの系統のうちの1つ(#1114)において、hIGRPの発現レベルはmIGRPのものと同等であった。
前提:1用量当たりのタンパク質の全量が約1μg〜25μgとなるのに十分な密度のpMHC抗原でコーティングされた4 nm酸化鉄ナノ粒子。
例: 1用量当たりの全pMHC(1μg〜25μg)=(1.34×1013個pMHC/用量〜3.33×1014個pMHC/用量)
1用量当たりの全鉄 (4 nm) NP
(1μg〜15μg)=(3.73×1012個Np/用量〜5.60×1013個Np/用量)
単一特異性のペプチド-MHCクラスIIコーティングされたナノスフェア
T1D関連pMHCクラスII複合体の生成。
T1D関連ペプチド/I-Ag7複合体でコーティングされたナノスフェアもまた、NODマウスにおいてT1D防御を提供し、T1Dを治癒させ得るという仮説を試験するため、以下の5つのT1D関連および対照ペプチド配列から、いくつかの異なるペプチド/I-Ag7複合体を構築することができる:BDC2.5ミモトープ:
。陰性対照として、G6Pイソメラーゼペプチド
/I-Ag7複合体(自己pMHC対照)、および2つのニワトリ卵白リゾチーム
/I-Ag7複合体(外来pMHC対照)を用いることができる。組換えI-Ag7単量体は、以前に記載されたように作製する。簡潔に説明すると、ベクターpRMHa3中の最終構築物は、天然リーダー配列に続き、上記のペプチド配列、ならびにI-Ag7 a鎖およびb鎖それぞれの細胞質外ドメインをコードする。いずれの鎖も、リンカー配列(SSAD)、トロンビン切断部位(LVPRGS)、ならびにa鎖およびb鎖それぞれのための酸性または塩基性ロイシンジッパー配列に及び、その後6個の連続したヒスチジン残基が続く。ビオチン化配列#85が、a鎖上の酸性ジッパーの後に続く。安定した細胞株を作製するためにピューロマイシン耐性遺伝子と共に、このDNA構築物をキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)SC2細胞に同時トランスフェクトする。大規模調製(12リットル)については、CuSO4誘導した細胞上清から接線流により組換えタンパク質を回収し、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。birA酵素を用いて、精製分子のビオチン化を行う。ストレプトアビジン-アガロースビーズ上での免疫除去、およびSDS-PAGEによるその後の解析により、ビオチン化を測定する。これらの複合体を、生体吸収性生分解性ナノスフェアに結合させることができる。これらの単量体を用いて蛍光色素結合四量体を生成して、pMHCコーティングされたナノスフェアによる処置の前および後の両方に、同族自己反応性CD4+ T細胞を数え挙げることもできる。次に、精製ビオチン化pMHC複合体をナノスフェア上にコーティングすることができる。本明細書において提案される研究のために、本発明者らは、個々のナノスフェア上にコーティングされ得るpMHCの全結合価を増加させる異なる構築物設計を用いること以外は上記のようにして、ハエ細胞において組換えpMHC複合体を生成することができる:IgG2a Fcに融合させたpMHCの二量体。
pMHCクラスI複合体を用いる研究を行って、ナノスフェアのサイズおよび密度ならびにpMHC結合価を最適化することができる。ナノスフェアのサイズ、密度、電荷、および単分散度は、分光光度法、透過型電子顕微鏡法(TEM)、および動的光散乱法によって測定することができる。ナノスフェア試料を濃縮し、3.4 kDチオール-PEG-NH2-pMHCと結合させ、洗浄し、単分散を損なうことなく高密度(約1014個/ml)で濃縮することができる。
pMHCクラスIIコーティングされた生分解性生体吸収性ナノスフェアは、本質的にはpMHCクラスIコーティングされたナノスフェアについて記載されたように、新たに診断された糖尿病NODマウスにおいて高血糖を回復させることができることが企図される。糖尿病NODマウスを7.5μgのNPで週に2回処置することができる。マウスが連続4週間にわたって正常血糖のままである場合に、マウスを治癒されたと見なす。2.5mi/I-Ag7ナノスフェアが、調べたマウスのほぼすべてにおいて高血糖を回復させることが企図される。高血糖は、例えば腹腔内ブドウ糖負荷試験(IPGTT)によって測定することができる。IGRP128〜145/I-Ag7ナノスフェア、B9〜23/I-Ag7ナノスフェア、およびIGRP4〜22/I-Ag7ナノスフェアで処置した高血糖マウスの全部ではないが大部分が正常血糖になることが企図される。対照として、GPI282〜292/I-Ag7(T1Dと無関係の自己抗原)およびHEL14〜22/I-Ag7(外来抗原でコーティングされたナノスフェアを用いることができる。これらの実験から、いくつかの異なるT1D関連pMHCクラスII複合体でコーティングされた「単一特異性」ナノスフェアが、T1D回復の誘導において、少なくともpMHCクラスIコーティングされたナノスフェアと同程度に有効であり得ることが実証されることが企図される。場合によっては、正常血糖の一貫したかつ普遍的な長期的維持には、追加免疫が必要であり得ると考えられる。
2.5mi/I-Ag7ナノスフェアでの処置によって正常血糖になり得る50週齢糖尿病マウスの血液、脾臓、膵リンパ節(PLN)、腸間膜リンパ節(MLN)、および骨髄は、糖尿病発症時に直ちに研究したマウスまたは同齢の非糖尿病未処置動物と比較して、MLNを除く調べたすべての器官において、2.5mi/I-Ag7四量体+ CD4+ T細胞の有意に増加した割合を示すことが企図される。CD4+ T細胞の増殖は抗原特異的であり、非同族自己反応性CD4+ T細胞のプールの増大は検出されないと考えられる。自己調節性T細胞増殖の維持は、正常血糖の持続的な維持に必要であることが企図される。NPによって増殖したこれらの2.5mi/I-Ag7四量体+細胞対2.5mi/I-Ag7四量体-細胞の表現型解析から、免疫記憶様表現型(CD62低、CD44高、および中程度のCD69上方制御)が示され得る。これらの細胞は、CD25-およびFoxP3-であってよい。このことは、FOXP3-eGFPを発現するNODマウスにおいて確認することができ、このマウスではTreg細胞がeGFPを構成的に発現する。10週齢のこれらのマウスを2.5mi/I-Ag7ナノスフェアで処置すると、eGFP- 2.5mi四量体+ CD4+ T細胞が増殖し得る。FACS選別された2.5mi/I-Ag7四量体+ CD4+ T細胞の機能的インビトロ研究により、それらが非同族ペプチドではなく同族ペプチドでパルスされたDCに応答して増殖するかどうか、ならびにそれらがIL-10およびIFNγを分泌するかどうかを判定することができる。これらの研究は、ELISAおよびルミネックス技術を用いて行うことができる。これらのTr1様CD4+ T細胞は高レベルの細胞表面TGFβを発現することが企図される。
IGRP/Kd-PLGAナノスフェアを用いたT細胞増殖。
IGRP206-214/Kd-PLGAナノスフェアは、インビトロで同族CD8+ T細胞の活性化を誘導する。このアッセイは、本質的には、参照により本明細書に組み入れられるTsai et al., Immunity (2010) 32, 568-680に記載されているように行った。簡潔に説明すると、8.3-NODマウスから精製されたナイーブなIGRP206〜214/Kd特異的T細胞受容体(TCR)トランスジェニックCD8+ T細胞を、IGRP206〜214/Kd-PLGAナノスフェアと共に48時間培養した。上清をIFN-γについてアッセイした。細胞を1μCiの[3H]-チミジンでパルスし、回収した。1ウェル当たりのナノスフェア数に関して、CPMおよびIFN-γを測定した。これを図9に示す。図8は、IGRP/Kd結合PLGA粒子の拡大像を示す。PLGA粒子は以下に従って作製した:濃度:100 nm(PLGA:1.5 mL中に20 mg/mL)。
DLSサイズ:154.72 nm
pMHC結合:5 mg IGRP/Kdを2 mL PLGA粒子と結合
最終量:2 mL
Claims (22)
- 対象に、抗病原性自己反応性T細胞を増殖させるのに十分な量の、生体適合性生体吸収性ナノスフェアに機能的に結合している抗原-MHC複合体を対象に投与する段階を含む、自己免疫障害を診断するか、予防するか、または処置する方法。
- 自己抗原エピトープ-MHC-生体適合性生分解性ナノスフェア複合体を対象に投与する段階を含む、対象において抗病原性自己反応性T細胞の集団を増大させるおよび/または発育させるための方法であって、該複合体が該集団を増大させるのに十分な量および頻度で投与される、方法。
- 複数の自己抗原エピトープが、自己抗原エピトープ-MHC生体適合性生分解性ナノスフェア複合体中に含まれる、請求項2記載の方法。
- 複数の自己抗原エピトープが単一の自己抗原に由来する、請求項3記載の方法。
- 複数の自己抗原エピトープが複数の自己抗原に由来する、請求項3記載の方法。
- 抗病原性自己反応性T細胞の増大した集団が、抗原特異的であるが、非抗原特異的様式で抑制する、請求項5記載の方法。
- 生体適合性生体吸収性ナノスフェア複合体の投与が、同族病原性自己反応性T細胞の集団を枯渇させる、請求項2、4、または5のいずれか一項記載の方法。
- 生体適合性生体吸収性ナノスフェア複合体の投与が、非同族病原性自己反応性T細胞の集団を枯渇させる、請求項2、4、または5のいずれか一項記載の方法。
- 生体適合性コアと該コアの外表面上の生分解性コーティングとを含む、自己抗原エピトープ-MHC-生体適合性生体吸収性ナノスフェア複合体。
- 生体適合性コアが酸化鉄(III)から構成される、請求項9記載の自己抗原エピトープ-MHC生体適合性生体吸収性ナノスフェア複合体。
- 生体吸収性コーティングが、デキストラン、マンニトール、およびポリ(エチレングリコール)より選択される、請求項9記載の自己抗原エピトープ-MHC生体適合性生体吸収性ナノスフェア複合体。
- ナノスフェアが自己抗原エピトープ-MHC複合体のMHC基に共有結合しており、該結合がリンカーを介していてもよい、請求項9記載の自己抗原エピトープ-MHC生体適合性生体吸収性ナノスフェア複合体。
- 対象に、抗病原性自己反応性T細胞を増殖させるのに十分な量の、生体適合性ナノスフェアに機能的に結合している抗原-MHC複合体を対象に投与する段階を含む、自己免疫疾患の発症を阻害するための方法であって、該MHC分子がMHCクラスII分子を含む、方法。
- 自己反応性T細胞がCD4+ TR1細胞である、請求項13記載の方法。
- CD4+ TR1細胞が、IL-10およびIFNγの発現によって特徴づけられる、請求項14記載の方法。
- 以下の段階を含む、自己免疫疾患の炎症成分を処置するための方法:
炎症成分を有する自己免疫疾患に罹患している対象に、生体適合性ナノスフェアに機能的に結合している抗原-MHC複合体を投与する段階であって、該MHC分子がMHCクラスII分子を含み、かつ該抗原が該自己免疫疾患に特異的であり、さらに該複合体の該投与が、IL-10を発現する抗病原性自己反応性TR1細胞の集団を増大させるのに十分な量で行われる、段階;
該TR1細胞が該自己免疫疾患の部位に蓄積できるようにし、それによって、該自己免疫疾患の炎症成分の減少をもたらす条件下でIL-10が該部位に蓄積することが可能になる、段階。 - MHC分子がMHCクラスII分子である、請求項16記載の方法。
- 自己反応性T細胞がCD4+ TR1細胞である、請求項16記載の方法。
- CD4+ TR1細胞が、IL-10およびIFNγの発現によって特徴づけられる、請求項18記載の方法。
- ナノスフェアが1種または複数種の生体適合性生体吸収性材料から形成される、請求項13または16いずれか記載の方法。
- 抗病原性自己反応性T細胞を増殖させるのに十分な量の、生体適合性ナノスフェアに機能的に結合している抗原-MHC複合体を患者に投与することによって、患者における自己免疫疾患を処置するための方法であって、該MHC分子がMHCクラスIおよびMHCクラスII分子の両方を含む、方法。
- 自己免疫疾患がI型糖尿病である、請求項21記載の方法。
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