KR20160077202A - 지속적 면역요법을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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페드로 산타마리아
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Abstract

본 명세는 TR1 세포 및/또는 Breg 세포의 형성, 확대 및 모집을 항원-특이적인 방식으로 촉진하고 상기 촉진이 필요한 피험자에서 자가면역 질병 및 질환을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.

Description

지속적 면역요법을 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR SUSTAINED IMMUNOTHERAPY}
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에서 2013년 11월 4일자로 출원된 미국 가 특허 출원 제 61/899,826 호에 대한 우선권을 청구하며, 상기 출원의 내용 전체가 본 명세에 참고로 인용된다.
기술 분야
본 명세는 면역요법 및 약물과 관련된 조성물 및 방법에 관한 것이다.
본 명세 전체를 통해서 식별 인용구 또는 아라비아 숫자에 의해 참조된 기술 및 특허 간행물들이 존재한다. 상기 아라비아 숫자에 상응하는 전체 서지 인용이 청구범위에 선행된 명세서에서 발견된다. 본 발명에 인용된 모든 참고문헌들의 명세는 본 발명이 속하는 기술 수준을 보다 충분히 개시하기 위해 본 출원에 참고로 인용된다.
자가면역 질병은 면역계에 의한 자기-조직의 공격에 의해 유발된다. 이상적인 치료법은 전신 면역성(외래 항원에 대한 면역 반응)을 손상시키지 않으면서 (상기 질병에서 표적화된 모든 항원성 에피토프에 대한)자가면역 반응을 선택적으로 둔화시킬 수 있는 것일 것이다. 불행하게도, 임의의 하나의 자가면역 질환에 관련된 림프구 특이성은 다수이며 불완전하게 정의되어 있고, 이는 상기를 도전 목표로 만든다.
당해 분야에서의 상기 필요성에 응답하여, 본 발명은 자가면역 질환의 치료에 유용한 치료 조성물을 개시한다. 하나의 태양은 피험자에서 항-병원성 자가반응성 T 세포 및/또는 B-세포의 집단을 확대 및/또는 발달시키는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 상기 확대 및/또는 발달이 필요한 피험자에게 항원-MHC 부류 II-나노입자("NP") 복합체("NP-복합체")를 투여함을 포함하거나, 또는 상기 투여로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기 투여로 이루어지며, 여기에서 상기 항원은 자가면역성 관련 항원 또는 자가항원이다. 일부 태양에서 상기 특정 NP상의 항원들은 모두 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 또 다른 태양에서, 상기 NP상의 항원들은 상이한 아미노산 서열을 갖지만 동일한 항원 단백질로부터 단리된다. 추가의 태양에서, 상기 NP상의 항원들은 상이한 항원들로부터의 것이다. 또 다른 태양에서, 상기 MHCII는 동일하거나 상이하다.
하나의 태양에서, 본 명세는 피험자에서 B-조절 세포 및 TR1 세포(예를 들어 TR1 및 CD4+ 세포)의 하나 이상의 집단을 확대 및/또는 발달시키는데 사용하기 위한, 나노입자; 항원/MHCII 복합체의 형태로 존재할 수 있는 MHC 부류 II 단백질 및 질병-관련 항원을 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나 또는 더욱 추가로 상기로 이루어지는 NP-복합체를 제공하며, 여기에서 상기 나노입자는 약 1 ㎚ 내지 약 100 ㎚ 직경; 약 1 ㎚ 내지 약 50 ㎚ 직경 또는 약 1 ㎚ 내지 약 20 ㎚ 직경 또는 약 5 ㎚ 내지 약 20 ㎚ 직경의 그룹 중에서 선택된 직경을 갖고 나노입자에 대한 항원-MHCII 복합체 수의 비는 약 10:1 내지 약 1000:1이다. 하나의 태양에서, 상기 복합체는 약 0.05 pMHCII/100 ㎚2 NP 표면적(코팅층 포함) 내지 약 25 pMHCII/100 ㎚2 NP 표면적(코팅층 포함)의 MHC 부류 II 밀도를 갖는다. 상기 항원은, 자가면역 반응, 또는 예를 들어 전-당뇨병, 당뇨병, 다발성 경화증("MS") 또는 다발성 경화증-관련 질환과 같은 그의 모사체에 관련된 자가항원이며, 임의로 상기 질병이 전-당뇨병 또는 당뇨병일 때 상기 자가항원은 췌장 베타 세포에 의해 발현된 항원으로부터의 에피토프 또는 자가항원 IGRP, 인슐린, GAD 또는 IA-2 단백질이다. 또 다른 태양에서, 상기 MHC 부류 II 성분은 HLA-DR, HLA-DQ 또는 HLA-DP 모두 또는 일부를 포함한다. 상기 항원-MHC 부류 II 복합체는 상기 나노입자에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된다. 상기 나노입자는 생체흡수성 및/또는 생분해성일 수 있다.
추가의 태양에서, 상기 나노입자는 비-리포솜이고/이거나 고체 코어, 바람직하게는 금 또는 산화철 코어를 갖는다. 공유 결합시, 상기 항원-MHC 부류 II 복합체는 5 kD 크기 미만의 링커를 통해 상기 나노입자에 공유 결합된다. 하나의 태양에서, 상기 링커는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다. 상기 pMHC는 임의의 구조물, 예를 들어 비제한적으로 링커에 의해 또는 가교결합에 의해 상기 나노입자 또는 나노입자 코팅층에 결합될 수 있다. 하나의 태양에서, 상기 MHC는 직접 C-말단을 통해 상기 나노입자 또는 코팅층에 결합된다.
출원인은 상기 나노입자상의 항원-MHC 부류 II 복합체의 밀도가 치료 이익에 기여함을 발견하였다. 따라서 본 발명에 개시된 바와 같이, 상기 항원-MHCII 나노입자 복합체는 상기 나노입자 표면적 100 ㎚2당 약 0.05 MHC 분자 범위의 한정된 밀도를 가질 수 있으며 (임의의 코팅제를 포함하도록 측정된 표면적), 이는 상기 나노입자에 적어도 2개의 MHCII, 또는 한편으로 적어도 8개, 또는 한편으로 적어도 9개, 또는 한편으로 적어도 10개, 또는 한편으로 적어도 11개, 또는 한편으로 적어도 12개의 MHCII가 복합체화되는 것으로 추정된다. 하나의 태양에서, 상기 복합체는 약 0.01 MHCII/100 ㎚2 (0.05 MHCII/100 ㎚2) 내지 약 30 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 0.1 MHCII/100 ㎚2 내지 약 25 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 0.3 MHCII/100 ㎚2 내지 약 25 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 0.4 MHCII/100 ㎚2 내지 약 25 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 0.5 MHCII/100 ㎚2 내지 약 20 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 0.6 MHCII/100 ㎚2 내지 약 20 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 1.0 MHCII/100 ㎚2 내지 약 20 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 5.0 MHCII/100 ㎚2 내지 약 20 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 10.0 MHCII/100 ㎚2 내지 약 20 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 15 MHCII/100 ㎚2 내지 약 20 MHCII/100 ㎚2, 또는 한편으로 적어도 약 0.5, 또는 한편으로 적어도 약 1.0, 또는 한편으로 적어도 약 5.0, 또는 한편으로 적어도 약 10.0, 또는 한편으로 적어도 약 15.0 MHCII/100 ㎚2의 MHCII 밀도를 가지며, 상기 나노입자의 ㎚2 표면적은 임의의 코팅층을 포함한다. 하나의 태양에서, 9 또는 적어도 9개의 MHCII가 나노입자에 복합체화되는 경우, 상기 밀도 범위는 약 0.3 MHCII/100 ㎚2 내지 약 20 MHCII/100 ㎚2이다.
본 명세는 또한 치료 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 NP-복합체 및 담체, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다. 하나의 태양에서, 상기 조성물 중의 모든 NP-복합체들은 동일하다. 또 다른 태양에서, 상기 조성물의 NP-복합체는 다양하거나 상이한 MHC-항원 복합체를 포함한다.
상기 복합체 및 조성물의 제조 방법을 본 발명에 추가로 제공한다. 상기 방법은 항원-MHC 복합체(예를 들어 MHCII 복합체)를 나노입자상에 비-공유적으로 코팅하거나 또는 공유적으로 복합체화함을 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어질 수 있다.
의학적 및 진단학적 방법을 또한 제공한다. 하나의 태양에서, 피험자에서 항원-특이적인 방식으로 B-조절 세포 및/또는 TR1 세포(예를 들어 TR1 및 CD4+ 세포)의 형성, 확대 및 모집 (recruitment)을 촉진하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 촉진이 필요한 피험자에게 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 NP-복합체 또는 조성물을 투여함을 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어진다.
또 다른 태양에서, 피험자에서 본 발명에 개시된 바와 같은 자가면역 질병 또는 질환, 예를 들어 MS, MS-관련 질환, 당뇨병 또는 전-당뇨병의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방이 필요한 피험자에게 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 NP-복합체 또는 조성물을 투여함을 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어지며, 여기에서 상기 자가항원은 치료하려는 질병에 대해 질병-관련되며, 예를 들어 당뇨병의 예방 또는 치료의 경우 상기 항원은 당뇨병-관련 항원이다. 추가의 태양에서, 상기 자가면역 질병은 MS 또는 MS-관련 질환이며 상기 항원은 MS-관련된다.
키트를 또한 제공한다. 상기 키트는 본 발명에 개시된 바와 같은 NP-복합체 또는 조성물 및 사용 설명서를 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어진다.
하나의 태양에서, 본 발명은 나노입자 전구체를 열분해시키거나 또는 가열함을 포함하는 나노입자의 제조 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 나노입자는 금속 또는 산화금속 나노입자이다. 하나의 실시태양에서, 상기 나노입자는 산화철 나노입자이다. 하나의 실시태양에서, 상기 나노입자는 금 나노입자이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 기술에 따라 제조된 나노입자를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명은 철 아세틸 아세토네이트의 열분해 반응을 포함하는 산화철 나노입자의 제조 방법을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 상기 수득된 산화철 나노입자는 수용성이다. 하나의 태양에서, 산화철 나노입자는 단백질 접합에 적합하다. 하나의 실시태양에서, 상기 방법은 단일-단계 열분해 반응을 포함한다.
하나의 태양에서, 상기 열분해는 기능화된 PEG 분자의 존재하에서 발생한다. 기능화된 PEG 링커의 몇몇 비제한적인 예를 표 1에 나타낸다.
하나의 태양에서, 상기 열분해는 철 아세틸 아세토네이트를 가열함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 열분해는 기능화된 PEG 분자의 존재하에서 철 아세틸 아세토네이트를 가열함을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 상기 열분해는 벤질 에테르 및 기능화된 PEG 분자의 존재하에서 철 아세틸 아세토네이트를 가열함을 포함한다.
이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 하나의 실시태양에서, 기능화된 PEG 분자를 환원 시약으로서 및 계면활성제로서 사용한다. 본 발명에서 제공된 나노입자의 제조 방법은, 대체하기 곤란하거나 또는 완전히 대체되지 않는 계면활성제를 사용하는 통상적인 방법을, 상기 입자를 수용성으로 만드는 PEG 분자에 의해 단순화하고 개선시킨다. 통상적으로, 계면활성제는 비용이 비싸거나(예를 들어 인지질) 또는 독성(예를 들어 올레산 또는 올레일아민)일 수 있다. 또 다른 태양에서, 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 상기 나노입자의 제조 방법은 통상적인 계면활성제의 사용 요구를 없애고, 이에 의해 고도의 분자 순도 및 수용해도를 성취한다.
하나의 실시태양에서, 상기 열분해는 본 발명에 사용되는 것들 외의 통상적인 계면활성제의 부재하에서 철 아세틸 아세토네이트 및 벤질 에테르를 수반한다.
하나의 실시태양에서, 상기 열분해 온도는 약 80 내지 약 300 ℃, 또는 약 80 내지 약 200 ℃, 또는 약 80 내지 약 150 ℃, 또는 약 100 내지 약 250 ℃, 또는 약 100 내지 약 200 ℃, 또는 약 150 내지 약 250 ℃, 또는 약 150 내지 약 250 ℃이다. 하나의 실시태양에서, 상기 열분해는 약 1 내지 약 2시간의 시간 동안 발생한다.
하나의 실시태양에서, 상기 산화철 나노입자의 제조 방법은 정제 단계, 예를 들어 밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec) LS 자석 컬럼의 사용에 의한 정제를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 상기 나노입자는 포스페이트 완충된 염수(PBS) 중에서 약 4 ℃에서 어떠한 검출 가능한 분해나 응집 없이 안정하다. 하나의 실시태양에서, 상기 나노입자는 적어도 6개월 동안 안정하다.
하나의 태양에서, 본 발명은 pMHC를 본 발명에서 제공된 산화철 나노입자와 접촉시킴을 포함하는 나노입자 복합체의 제조 방법을 제공한다. 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, pMHC는 그의 카복시말단 단부에서 시스테인을 암호화하며, 상기는 약 12 내지 약 14시간 동안 약 pH 6.2 내지 약 pH 6.5에서 기능화된 PEG 중의 말레이미드기와 반응할 수 있다.
하나의 태양에서, 나노입자 복합체의 제조 방법은 정제 단계, 예를 들어 밀테니 바이오텍 LS 자석 컬럼의 사용에 의한 정제를 포함한다.
하기의 도면들은 본 명세서의 부분을 형성하며 본 발명의 몇몇 태양들을 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제공된 구체적인 실시태양의 상세한 개시와 함께 이들 도면 중 하나 이상을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1A - 1C는 NP-복합체의 개략도를 도시한다. 도 1A는 단쇄 pMHC-부류 I 발현 구조물의 개략도(상부) 및 동족 CD8+ T-세포에의 상응하는 pMHC 사량체(형광색소-표지된)의 결합의 전형적인 유식 세포측정 프로파일이다. 도 1B는 NP-복합체의 링커 및 2차원 구조를 도시하는 개략도이다. 볼 수 있는 바와 같이, 하나의 NP는 다양한 화학 링커를 통해 나노입자 코어에 복합체화된 동일한 항원을 함유할 수 있다. 도 1C는 NP에 접합된 말레이미드-기능화된 NP를 도시한다.
도 2는 전형적인 pMHC 부류 II 단량체의 구조(상부) 및 상응하는 pMHC 사량체로 염색되거나 또는 염색되지 않은 채로 남은 동족 CD4+ T-세포의 전형적인 FACS 프로파일을 도시한다.
도 3A - 3B는 새로운 당뇨병 NOD 마우스에서 상이한 T1D-관련된 pMHC 부류 II-NP가 고혈당증을 역전시킴을 도시한다. 도 3A는 개별적인 마우스 혈당 곡선을 도시한다. 마우스는 4주 동안 안정하게 정상혈당성인 경우 '치유된' 것으로 간주되었으며, 그 후에 처리는 철회되었다. 외래 항원, HEL14 - 22이 대조용으로서 사용되었다. 도 3B는 질병 역전의 발생률을 도시한다.
도 4는 장기간 치유된 마우스에서 복강내 글루코스-부하 검사(IPTGTT) 및 인슐린-생산 능력을 도시한다. IDDM, 당뇨병 치료되지 않은 마우스; 치유된, 50주령째 정상혈당을 갖는 마우스(처리 철회 후 >30주); 대조용, 연령-합치된 비-당뇨성의 치료되지 않은 마우스(50주령).
도 5는 T1D-관련된 pMHC 부류 II-NP가 동족 자가반응성 CD4+ T-세포를 확대시킴을 도시한다. 데이터는 2.5 mi/I-Ag7-NP로 처리된 마우스에 해당한다. 기부 우측, 확대는 2.5 mi/I-Ag7-NP로 처리된 마우스가 2개의 다른 자가반응성 CD4+ T-세포 특이성의 증가된 비율을 나타내지 않았기 때문에, 상기 NP상의 pMHC에 특이적이다. PLN, 췌장 림프절; MN, 장간막 림프절; BM, 골수(기억 T-세포의 저장소).
도 6은 T1D-관련된 pMHC 부류 II-NP가 동족 자가반응성 CD4+ T-세포를 확대시킴을 도시한다. 확대는 비장에 대해서 도시되었지만 유사한 패턴들이 췌장 림프절, 혈액 및 골수에서 보인다. "발병"은 전-처리값에 상응하고; "치유됨"은 pMHC-NP에 의해 정상혈당으로 된 마우스이고(처리 철회 >30주째에 분석됨); "IDDM"은 처리 철회시 재발된 마우스(~25%)이고; "50주령"은 연령-합치된 처리되지 않은 비-당뇨성 대조용에 상응한다.
도 7은 T1D-관련된 pMHC 부류 II-NP가 동족 기억-형 T-조절성-1("Tr1 또는 TR1") 세포를 확대시킴을 도시한다.
도 8은 pMHC 부류 II-NP에 의해 확대된 자가반응성 CD4+ T-세포가 IL-10 생산자임을 도시한다. IGRP126 -145/I-Ag7-NP 또는 대조용 NP로 처리된 마우스로부터의 IGRP126-145/I-Ag7 사량체+ 세포들이 분류되었고, 동족 및 비-동족 펩티드로 공격되었으며, 상부는 루미넥스(luminex) 기술에 의해 사이토킨 함량에 대해 분석되었다.
도 9는 pMHC 부류 II-NP가 IL-10 및 TGFb-의존적인 방식으로 고혈당증을 역전시킴을 도시한다. 도 9는 사이토킨 차단 항체("Ab")에 의해 처리된 마우스에서 정상혈당을 회복시키고(상부), 동족 Tr1 세포를 확대시키며(기부 좌측) PLN에서 자가항원 제공(IGRP206 -214-반응성 CD8+ T세포에; 기부 우측)을 억제하는 IGRP4 -22/I-Ag7-NP의 능력을 도시한다. 항-IL10 및 항-TGFβ Ab는 Tr1 세포 확대를 손상시키지 않으면서 자가항원 제공을 부분적으로 회복시키고 pMHC-NP의 치료 효과를 억제한다.
도 10A - 10B는 pMHC 부류 II-NP 요법이 전신 면역성을 손상시키지 않음을 도시한다. 도 10A는 pMHC-NP-처리된 NOD 마우스가 자가조절성 Tr1 CD4+ T-세포의 전신 확대에도 불구하고 급성 바이러스(우두 바이러스) 감염(기부, 감염 후 4일 대 14일 비교)을 쉽게 제거할 수 있음을 도시한다. 도 10B는 pMHC-NP-처리된 마우스(10회 용량)가 처리되지 않고 백신접종되지 않은 마우스에 비해, CFA에서 면역화시 KLH-DNP에 대해 항체 반응을 증가시킬 수 있음을 도시한다.
도 11은 pMHC 부류 II-NP 요법이 C57BL/6 마우스에서 확립된 EAE의 중증도를 감소시킴을 도시한다. B6 마우스를 CFA에서 pMOG35-55로 면역시키고 백일해 독소로 i.v 처리하였다. 마우스를 15-점 등급에 걸쳐 확립된 기준을 사용하여 EAE의 징후에 대해 채점하였다. 병든 마우스를 면역화 후 21일째에 시작하여, 7.5 내지 22.5 ug의 pMOG38-49/IAb-코팅된 NP의 2회의 매주 용량으로 처리하였다.
도 12A - 12C는 pMHC 부류 II-NP의 구조 및 성질을 도시한다. 도 12A는 기능화된, 생체적합성 산화철 NP상에 pMHC를 공유적으로 코팅시키는데 사용될 수 있는 상이한 화학들을 묘사하는 밑그림이다. 도 12B는 pMHC-코팅된 NP의 투과형 전자 현미경사진이다. 도 12C는 pMHC-코팅된 대 코팅되지 않은 NP의 동적 광 산란 프로파일을 도시한다.
도 13A - 13C는 pMHC 부류 II-NP-처리된 마우스에서 동족 B-세포의 Breg 세포로의 확대 및 분화를 도시한다. 도 13A에서, PKH26-표지된/2.5 mi 펩티드 펄스화된 B-세포(기부)(또는 수지상 세포, 상부) + CFSE-표지된/GPI 펩티드-펄스화된 B-세포(기부)(또는 수지상 세포, 상부)의 1:1 혼합물을 2.5 mi/IAg7-NP-처리된 NOD 마우스에 주사하였다. 7일 후에, 숙주들을 B-세포(기부) 또는 수지상 세포(상부)의 두 부분집합 모두의 존재에 대해서 분석하였다. 좌측 패널은 전형적인 결과를 도시하고 우측 막대그래프는 다수의 실험에 걸쳐 수득된 결과들의 요약을 도시한다. 상기 데이터는 2.5 mi-펩티드-펄스화된 B-세포(그러나 DC는 아닌)가 2.5 mi/IAg7-NP-처리된 NOD 마우스에서 확대됨을 가리킨다. B(좌측 패널)에서, 출원인은 2.5 mi/IAg7-NP 대 대조용(당뇨병-무관한) pMHC-NP로 코팅된 NP로 처리된 NOD 마우스의 췌장(PLN) 및 장간막(MLN) 림프절 중 B-세포 함량을 비교하였다. 데이터는 전자의 B-세포의 증가된 모집을 도시한다. B(우측 패널)에서, 출원인은 Tr1 세포 모집의 함수로서 PLN으로의 B-세포의 모집을 비교하였다. 데이터를 다수의 상이한 pMHC-NP 제제를 사용하여 획득하였다. 데이터는 pMHC-NP-확대된 TR1 세포의 모집과 PLN으로의 B-세포 모집간의 통계학적 유의수준의 상관성을 도시한다. 도 13B에서 출원인은 2.5 mi 또는 대조용 펩티드로 펄스화시킨 B-세포를 IL10-eGFP 녹-인 NOD 마우스로부터 다수의 상이한 공여 마우스 유형들(상부 패널)내로 전달하였다. 7일 후에, 비장을 상기 주입된 B-세포의, 높은 수준의 CD1d 및 CD5를 발현하는 IL10-생산(eGFP+) B-세포(B-조절성 세포)로의 전환에 대해 분석하였다. 데이터는 오직 2.5 mi/IAg7-NP-처리된 숙주에서만 동족(2.5 mi-부하된) B-세포의 B-reg 세포로의 확고한 확대 및 전환을 도시한다.
도 14는 철 아세틸아세토네이트의 열분해 및 생물접합에 의한 표면 기능화된 산화철 나노입자의 합성을 도시한다.
본 발명은 개시된 특정한 실시태양으로 제한되지 않으며, 그 자체가 다양할 수 있음은 물론이다. 또한 여기에 사용된 용어는 단지 특정한 실시태양을 개시하기 위한 것일 뿐이며, 제한하고자 하는 것은 아니고, 따라서 본 발명의 범위는 오직 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이다.
본 발명 및 첨부된 청구범위에 사용되는 바와 같이, 단수형 "하나의" 및 "상기"는 문맥상 달리 명백히 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "부형제"에 대한 언급은 복수 개의 부형제를 포함한다.
I. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 모든 기술과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 통상적인 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에 사용되는 바와 같이 하기의 용어들은 하기의 의미를 갖는다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "포함하는" 또는 "포함하다"란 용어는 상기 조성물 및 방법이 인용된 요소들을 포함하지만, 다른 것들을 제외하지는 않음을 의미하고자 한다. "로 필수적으로 이루어지는"은 조성물 및 방법을 한정하는데 사용될 때 서술된 목적을 위한 조합에 임의의 필수적인 중요성을 갖는 다른 요소들은 제외함을 의미할 것이다. 따라서 본 발명에 정의된 바와 같은 요소들로 필수적으로 이루어지는 조성물은 특허청구된 발명의 기본적인 및 신규의 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계들, 예를 들어 다발성 경화증을 치료 또는 예방하기 위한 조성물을 제외하지 않을 것이다. "로 이루어지는"은 미량 원소보다 많은 다른 성분들 및 실질적인 방법 단계들을 제외함을 의미할 것이다. 이러한 각각의 이행 용어들에 의해 정의되는 실시태양들은 본 발명의 범위내에 있다.
"자가-반응성 T 세포"는, 분자 생산되고 상기 T 세포를 함유하는 동일한 개체에 의해 함유되는 "자가-항원"을 인식하는 T 세포이다.
"병원성 T 세포"는 상기 T 세포를 함유하는 피험자에게 유해한 T 세포이다. 반면에, 비-병원성 T 세포는 피험자에게 실질적으로 유해하지 않으며 항-병원성 T 세포는 병원성 T 세포의 해를 감소시키거나, 개선시키거나, 억제하거나, 또는 무효화한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 조절성 B-세포 또는 B-조절성 세포("B-reg")란 용어는 CD1d, CD5의 발현 및 IL-10의 분비를 특징으로 하는 항염증 효과에 책임이 있는 세포들을 의미한다. B-reg는 또한 Tim-1의 발현에 의해 확인되며 Tim-1 결찰을 통해 유도되어 내성을 촉진할 수 있다. B-reg가 되는 능력은 톨형 수용체, CD40-리간드 등과 같은 다수의 자극 인자들에 의해 구동되는 것으로 나타났다. 그러나, B-reg의 완전한 특성화는 진행중이다. B-reg는 또한 높은 수준의 CD25, CD86 및 TGF-β를 발현한다. B 세포의 상기 부분집합은 Th1 증식을 억제할 수 있으며, 따라서 자체-내성의 유지에 기여할 수 있다. 상기 B-reg 기능의 강화는 다수의 면역조절 약물의 목적이 될 것이며, 이는 자가면역 질병의 양호한 조절에 기여할 것이다. 예를 들어 ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23707422(2013년 10월 31일에 최종 접근됨)를 참조하시오.
T 조절성 1 세포(Tr1)는, 조절 성질을 가지며 시험관내 및 생체내에서 항원-특이성 면역 반응을 억제할 수 있는 CD4+ T 세포의 부분집합이다. 상기 T-조절성 1(Tr1) 세포는 그의 독특한 사이토킨 생산 프로파일에 의해 한정되며 높은 수준의 IL-10 및 TGF-베타를 만들지만 IL-4 또는 IL-2는 만들지 않는다. 상기 세포에 의해 생산된 IL-10 및 TGF-베타는 시험관내에서 1차적인 미경험(naive) T 세포의 억제를 매개한다. Tr1 세포가 생체내에 존재하는 증거가 또한 존재하며, 동종이계 줄기세포 이식을 받은 중증 복합 면역결핍 환자에서 높은 IL-10-생산 CD4(+) T 세포의 존재가 입증되었다. Tr1 세포는 말초 내성의 조절에 관련되며 생체내에서 면역 반응을 조절하기 위한 세포 요법으로서 잠재적으로 사용될 수 있다. 예를 들어 ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10887343(2013년 10월 31일에 최종 접근됨)을 참조하시오.
1형 T 조절성(Tr1) 세포는 높은 수준의 IL-10 및 TGF-베타를 생산하는 그의 능력에 의해 한정된다. 다양한 항원들에 특이적인 Tr1 세포는 생체내에서 발생하지만, 시험관내에서 IL-10의 존재하에서 미경험 CD4+ T 세포와 또한 구별될 수 있다. Tr1 세포는 낮은 증식능력을 가지며, 이는 IL-15에 의해 극복될 수 있다. Tr1 세포는 IL-10 및 TGF-베타의 생산을 통해 미경험 및 기억 T 헬퍼 1 또는 2형 반응을 억제한다. 분자 수준에서 Tr1 세포의 추가적인 특성화는 상기 세포의 작용 기전을 한정할 것이며 Tr 세포의 다른 부분집합들과의 관계를 명료하게 할 것이다. 신규 치료제의 개발을 위해 신규 표적을 확인하는 Tr1 세포의 용도 및 말초 내성을 조절하기 위한 세포 요법으로서의 상기의 용도를 예견할 수 있다. 예를 들어 ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11722624(2013년 10월 31일에 최종 접근됨)을 참조하시오.
"억제하는", "감소시키는", 또는 "예방", 또는 이들 용어의 임의의 변형들은 청구범위 및/또는 명세서에 사용될 때 목적하는 결과를 성취하기 위한 임의의 측정 가능한 감소 또는 완전한 억제를 포함한다.
본 출원 전체를 통해서, "약"이란 용어는 하나의 값이 상기 값을 측정하기 위해 사용되는 장치 또는 방법에 대한 오차의 표준 편차를 포함함을 가리키는데 사용된다. "약"이란 용어는 범위를 포함하여 숫자 명칭, 예를 들어 온도, 시간, 양 및 농도 앞에 사용될 때 (+) 또는 (-) 10%, 5% 또는 1%까지 변할 수 있는 근사값을 가리킨다.
"생체적합성"이란 전달 시스템의 성분이 조직 손상 또는 인간 생물계에 대한 손상을 유발시키지 않을 것임을 의미한다. 생체적합성을 부여하기 위해서, 인간에서 안전한 사용의 역사를 갖고 있거나 또는 GRAS(일반적으로 안전하다고 인정되는) 상태인 중합체 및 부형제가 우세하게 사용될 것이다. 생체적합성은 조성물 중에 사용되는 성분 및 부형제가 최종적으로 신체에 의해 "생체흡수되거나" 또는 상기 신체에 대한 부작용 없이 제거될 수 있을 것임을 의미한다. 생체적합성이고 무독성으로 간주되는 조성물의 경우, 상기 조성물은 세포에 독성을 유발시키지 않아야 한다. 유사하게, "생체흡수성"이란 용어는 환자에서 물질의 장기간 축적을 피하도록 일정 기간에 걸쳐 생체내에서 생체흡수를 겪는 상기 물질로부터 제조된 나노입자를 지칭한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 생체적합성 나노입자는 2년 미만, 바람직하게는 1년 미만 및 훨씬 더 바람직하게는 6개월 미만의 기간에 걸쳐 생체흡수된다. 생체흡수율은 상기 입자의 크기, 사용되는 물질, 및 숙련가에 의해 충분히 인정된 다른 인자들과 관련된다. 생체흡수성, 생체적합성 물질들의 혼합물을 사용하여 본 발명에 사용되는 나노입자를 형성시킬 수 있다. 하나의 실시태양에서, 산화철 및 생체적합성, 생체흡수성 중합체를 병용할 수 있다. 예를 들어 산화철 및 PGLA를 병용하여 나노입자를 형성시킬 수 있다.
항원-MHC-나노입자 복합체("NP-복합체")는 표면, 예를 들어 생체적합성 생분해성 나노구상의 펩티드, 탄수화물, 지질, 또는 항원성 분자 또는 단백질(즉 자기펩티드 또는 자가항원)의 다른 항원 분절, 단편 또는 에피토프의 표출을 지칭한다. 본 발명에 사용되는 바와 같은 "항원"은 피험자에서 면역 반응 또는 항-병원성 세포의 확대를 유도할 수 있는 분자의 전체, 부분, 단편 또는 분절을 지칭한다.
"모사체"는 주어진 리간드 또는 펩티드의 유사체이며, 여기에서 상기 유사체는 상기 리간드와 실질적으로 유사하다. "실질적으로 유사한"은 상기 모사체가 집합적으로 상리 리간드의 분자량의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만을 차지하는 하나 이상의 작용기 또는 변형을 가짐을 제외하고, 상기 유사체가 상기 리간드와 유사한 결합 프로파일을 가짐을 의미한다.
"항-병원성 자가반응성 T 세포"란 용어는 항-병원성 성질을 갖는 T 세포(즉 MS, MS-관련 질병 또는 질환, 또는 전-당뇨병과 같은 자가면역 질병을 방해하는 T 세포)를 지칭한다. 이들 T 세포는 항염증성 T 세포, 효과기 T 세포, 기억 T 세포, 저-결합활성 T 세포, T 헬퍼 세포, 자가조절성 T 세포, 세포독성 T 세포, 천연 살해 T 세포, TR1 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등을 포함할 수 있다.
"항염증성 T 세포"란 용어는 항염증 반응을 촉진하는 T 세포를 지칭한다. 상기 T 세포의 항염증 기능은 항염증성 단백질, 사이토킨, 케모킨 등의 생산 및/또는 분비를 통해 성취될 수 있다. 항염증성 단백질은 또한 면역 반응을 억제하는 증식억제성 신호를 포함하도록 되어 있다. 항염증성 단백질은 IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, IL-23, IL-27, IFN-α, TGF-β, IL-1ra, G-CSF, 및 TNF 및 IL-6에 대한 용해성 수용체를 포함한다. 상응하게, 본 명세의 태양들은 환자에서 MS, MS-관련 질환, 당뇨병 또는 전-당뇨병과 같은 자가면역 질환을 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 환자에게 항원-MHCII-나노입자 복합체를 투여함을 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나 또는 더욱 또한 상기로 이루어지고, 여기에서 상기 항원은 질병-관련 항원이다.
"IL-10" 또는 "인터류킨-10"이란 용어는 IL-10 유전자에 의해 암호화된 사이토킨을 지칭한다. 상기 IL-10 서열을 진뱅크(GenBank) 수탁 번호: NM_000572.2(mRNA) 및 NP_000563.1(단백질)에 의해 나타낸다.
"TGF-β" 또는 "형질전환 성장인자 베타"란 용어는 항염증 효과를 가질 수 있는 단백질을 지칭한다. TGF-β는 TGF-β1, TGF-β2 및 TGF-β3라 칭하는 적어도 3개의 동형으로 존재하는 분비 단백질이다. 상기는 또한 상기 과의 창립멤버(founding member)인 TGF-β1에 대한 원래 명칭이었다. 상기 TGF-β 과는 형질전환 성장인자 베타 상과로서 공지된 단백질 상과의 부분이며, 상기 상과는 인히빈, 액티빈, 항-뮐러리안 호르몬, 골 형태발생 단백질, 데카펜타플레직 및 Vg-1을 포함한다.
"유효량"은 의도하는 목적을 성취하기에 충분한 양이며, 상기 목적의 비제한적인 예는 면역반응의 개시, 면역반응의 조절, 염증반응의 억제 및 T 세포 활성 또는 T 세포 집단의 조절을 포함한다. 하나의 태양에서, 상기 유효량은 서술된 치료학적 목적을 성취하는 기능을 하는 양, 예를 들어 치료 유효량이다. 본 발명에 상세히 개시되는 바와 같이, 상기 유효량 또는 투여량은 목적 및 조성, 성분에 따라 변하며, 본 명세에 따라 측정될 수 있다.
"하나의"란 단어의 사용은 청구범위 및/또는 명세서에 "포함하는"이란 용어와 함께 사용될 때 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나", 및 "하나 또는 하나 초과"의 의미와 또한 일치한다.
본 발명에서 "나노구", "NP", 또는 "나노입자"는 피험자, 세포 표본 또는 조직 표본에 적합한 대로 1회 또는 수회 투여되는 작은 별개의 입자를 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 나노입자는 모양이 실질적으로 구형이다. 몇몇 실시태양에서, 상기 나노입자는 리포솜 또는 바이러스 입자가 아니다. 추가의 실시태양에서, 상기 나노입자는 고체이거나 또는 고체 코어를 갖는다. "실질적으로 구형"이란 용어는 본 발명에 사용되는 바와 같이 상기 입자의 모양이 구로부터 약 10% 초과까지 벗어나지 않음을 의미한다. 본 발명의 다양한 공지된 항원 또는 펩티드 복합체를 상기 입자에 적용시킬 수 있다. 본 발명의 나노입자는 크기 범위가 약 1 ㎚ 내지 약 1 ㎛, 바람직하게 약 1 ㎚ 내지 약 100 ㎚ 또는 한편으로 약 1 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 또는 한편으로 약 5 내지 50 ㎚ 또는 한편으로 약 5 ㎚ 내지 100 ㎚이며, 일부 태양에서 다수의 나노입자를 의도하는 경우 다수의 나노입자의 평균 또는 중간 직경을 지칭한다. 보다 작은 나노크기 입자를 예를 들어 분별 공정에 의해 수득할 수 있으며, 이때 보다 큰 입자는 수용액 중에 가라 앉는다. 이어서 상기 용액의 상부 부분을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 의해 회수한다. 상기 상부 부분에는 보다 작은 크기 입자들이 농축되어 있다. 상기 공정을 목적하는 평균 크기가 생성될 때까지 반복할 수 있다.
청구범위에서 "또는"이란 용어의 사용은 오직 양자택일 또는 상기 양자택일이 상호 배타적임을 지칭함을 명백히 가리키지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용되지만, 상기 명세는 오직 양자택일 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 "면역반응" 또는 "그의 균등한 "면역학적 반응"이란 어구는 세포-매개된 반응(항원-특이성 T 세포 또는 그의 분비 산물에 의해 매개됨)의 발생을 지칭한다. 세포 면역 반응은, 바이러스 감염을 치료 또는 예방하고, 항원-특이성 Breg 세포, TC1, CD4+ T 헬퍼 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포 및/또는 질병 생성된, 자가조절성 T 세포 및 B 세포 "기억" 세포를 확대시키기 위해 부류 I 또는 부류 II MHC 분자와 함께 폴리펩티드 에피토프의 제공에 의해 유도된다. 상기 반응은 또한 다른 성분들의 활성화를 수반할 수도 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "염증반응" 및 "염증"이란 용어는 유해 자극, 예를 들어 병원체, 손상된 세포, 자극제에의 개인의 관조직의 복잡한 생물학적 반응을 가리키며, 사이토킨 및 보다 특히 염증-전 사이토킨, 즉 활성화된 면역세포에 의해 우세하게 생산되고 염증반응의 증폭에 관련되는 사이토킨의 분비를 포함한다. 예시적인 염증전(pro-inflammatory) 사이토킨은 비제한적으로 IL-1, IL-6, IL-10, TNF-a, IL-17, IL21, IL23, IL27 및 TGF-β를 포함한다. 예시적인 염증은 급성 염증 및 만성 염증을 포함한다. 급성 염증은 혈장 및 백혈구에 의한 조직의 침윤에 기인한 고전적인 염증 징후(팽창, 적열상태, 통증, 발열 및 기능상실)를 특징으로 하는 단기간 과정을 가리킨다. 급성 염증은 전형적으로 유해 자극이 존재하는 만큼 오래 발생하며 일단 상기 자극이 제거되거나, 파괴되거나, 또는 흉터형성(섬유형성)에 의해 차단되면 멈춘다. 만성 염증은 동반되는 활성 염증, 조직 파괴 및 수복의 시도를 특징으로 하는 상태를 가리킨다. 만성 염증은 상기 나열된 고전적인 염증 징후를 특징으로 하지는 않는다. 대신에, 만성 염증 조직은 단핵 면역 세포(단핵세포, 대식세포, 림프구 및 형질 세포)의 침윤, 조직 파괴, 치유의 시도(혈관형성 및 섬유형성 포함)를 특징으로 한다. 염증은, 개인에서 염증과 관련된 복잡한 생물학적 반응을 형성하는 사건들 중 어느 하나에 영향을 미치고 특히 상기 사건을 억제함으로써 본 명세의 의미에서 억제될 수 있다.
자가면역 질환은 비제한적으로 당뇨병, 전-당뇨병, 이식 거부, 다발성 경화증, 다발성-경화증 관련 질환, 조기 난소 부전, 피부경화증, 쇼그렌병, 루푸스, 빌레레고(vilelego), 탈모증(대머리), 다선성 부전, 그레이브스병, 갑상선기능저하증, 다발성근염, 천포창, 크론병, 대장염, 자가면역 간염, 뇌하수체기능저하증, 심근염, 애디슨병, 자가면역 피부병, 포도막염, 악성빈혈, 부갑상선기능저하증 및/또는 류마티스성 관절염을 포함할 수 있다. 몇몇 태양에서, 항원/MHCII/입자 복합체의 펩티드 성분은 치료에 의해 시험되거나, 조절되거나, 둔화되도록 자가면역 반응에 관련된 자가항원 또는 자가항원 에피토프, 또는 그의 모사체로부터 유래되거나 디자인된다. 특정 태양에서, 상기 자가항원은 펩티드, 탄수화물 또는 지질이다. 몇몇 태양에서, 자가항원은 피험자의 몇몇 세포, 예를 들어 췌장 베타 세포에 의해 발현된 단백질, 탄수화물 또는 지질의 단편, 에피토프 또는 펩티드이며, 비제한적으로 IGRP, 인슐린, GAD 또는 IA-2 단백질의 단편을 포함한다. 다양한 상기와 같은 단백질 또는 에피토프가 다양한 자가면역 상태에 대해 확인되었다. 상기 자가항원은 2차 내분비 또는 신경분비 성분, 예를 들어 섬-주변(peri-islet) 슈반 세포 등으로부터 유래된 펩티드, 탄수화물, 지질 등일 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "질병-관련" 항원이란 용어는 선택된 질병을 치료하기 위해 선택된 항원 또는 그의 단편을 의도한다. 예를 들어, 당뇨병-관련 항원은 당뇨병을 치료할 항원 또는 그의 단편이다. MS-관련 항원은 MS를 치료하도록 선택된다. 당뇨병-관련 항원은 MS를 치료하도록 선택되지 않을 것이다. 유사하게, 자가면역 관련 항원은 자가면역 질병과 관련되는 항원이고 자가면역 이외의 질환 또는 질병, 예를 들어 암의 치료를 위해 선택되지 않을 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "당뇨병"이란 용어는 유전 및 환경 인자의 조합에 의해 유발된 탄수화물 대사의 가변적인 질환을 의미하며 대개는 인슐린의 부적합한 분비 또는 이용, 과도한 소변 생성, 과잉량의 혈액 및 뇨 중 당, 및 갈증, 배고픔 및 체중 손실을 특징으로 한다. 당뇨병은 1형 당뇨병 및 2형 당뇨병에 의해 특성화된다. 비비만성 당뇨병("NOD") 마우스는 당뇨병의 연구 및 치료에 승인된 동물 모델이다. 마우스에서 1형 당뇨병(T1D)은 자가반응성 CD8+ T-세포와 관련된다. 비비만성 당뇨병(NOD) 마우스는 점점 증가하는 자가항원 목록을 인식하는 T-세포에 의한 췌장 β 세포의 선택적 파괴로부터 생성되는 T1D의 한 형태를 나타내며, 인간 T1D와 밀접하게 유사하다. T1D의 개시는 CD4+ 세포의 기여를 필요로 하지만, T1D가 CD8+ T-세포-의존성이라는 강력한 증거가 존재한다. NOD 마우스에서 섬-관련된 CD8+ 세포의 상당한 분획이 '8.3-TCR-형'이라 지칭되는 CD3-불변 Vα17-Jα42+ TCR을 사용함이 발견되었다. 상기 MHC 분자 Kd와 관련하여 미모토프 NRP-A7(조합적 펩티드 라이브러리를 사용하여 한정됨)을 인식하는 상기 세포는 이미 가장 초기의 NOD 섬 CD8+ 침윤물의 중요한 성분이며, 당뇨병 유발성이고, 미지의 기능을 갖는 단백질인 섬-특이성 글루코스-6-포스파타제 촉매성 서브유닛-관련 단백질(IGRP)로부터의 펩티드를 표적화한다. 상기 펩티드(IGRP206 -214, NRP-A7과 유사함)를 인식하는 CD8+ 세포는 순환 중에 대단히 흔하다(>1/200 CD8+ 세포). 현저하게, NOD 마우스에서 인슐린염에서 당뇨병으로의 진행은 순환하는 IGRP206 -214-반응성 CD8+ 풀의 순환 확대 및 그의 섬-관련 대응물의 강한 성숙화를 변함없이 동반한다. 보다 최근에, NOD 마우스에서 섬-관련된 CD8+ 세포가 다수의 IGRP 에피토프를 인식함이 입증되었으며, 이는 IGRP가 적어도 뮤린 T1D에서 CD8+ 세포에 우세한 자가항원임을 암시한다. NOD 섬-관련된 CD8+ 세포, 특히 상기 질병 과정에서 초기에 발견되는 세포는 인슐린 에피토프(Ins B15-23)를 또한 인식한다.
연관성 연구는 몇몇 HLA 부류 I 대립유전자(즉 HLA-A*0201)가 인간 T1D에 감수성을 제공함을 제시하였다. 병리학 연구는 새로 진단된 환자의 췌도염 병변이 대개 (HLA 부류 I-제한된) CD8+ T-세포로 이루어짐을 입증하였으며, 상기 세포는 췌장 동계이식(동일한 쌍둥이로부터) 또는 동종이식(관련된 공여체로부터)에 의해 치료된 환자에서 또한 우세한 세포 집단이다.
인슐린은 인간 및 뮤린 T1D 모두에서 항체 및 CD4+ 반응의 핵심 표적이다. 인간 인슐린 B 쇄 에피토프 hInsB10 -18은 섬 이식 수용자 및 자발적인 질병 과정 모두에서 HLA-A*0201에 의해 자가반응성 CD8+ 세포로 제공된다. 또한, 4개의 추가적인 펩티드가 HLA-A*0201과 관련하여 HLA-A*0201-트랜스제닉 마우스로부터의 섬-관련된 CD8+ T-세포에 의해 인식되는 마우스 전-프로인슐린 1 또는 2로부터 확인되었다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "전-당뇨병"이란 용어는 무증상(subclinical) 베타세포 손상을 특징으로 하는 당뇨병 상태에 선행하는 무증상(asymptomatic) 기간을 의미하며 여기에서 상기 환자는 정상적인 혈당 수준을 나타낸다. 상기는 또한 섬 세포 자가항체(ICA)의 존재를 특징으로 하며, 임상 증상의 개시에 가까운 경우 글루코스 불내성을 동반할 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "다발성 경화증" 또는 "MS"란 용어는 신체의 면역계가 신경을 덮고 있는 보호 피막에서 멀리 떨어져 잠식되는 자가면역 질환을 의미한다. 상기는 뇌와 나머지 신체간의 연통을 방해한다. 최종적으로, 상기는 가역적이지 않은 과정인, 신경 자체의 열화를 생성시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "다발성 경화증-관련 질환"이란 용어는 MS에 대한 감수성 또는 MS를 동시에 나타내는 질환을 의미한다. 상기와 같은 질환의 비제한적인 예는 시신경척수염(NMO), 포도막염, 신경병성 통증 경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 경화증 전이성 전신 경화증, 척수-시각 MS, 원발성 진행성 MS(PPMS), 및 재발 이장성 MS(RRMS), 진행성 전신 경화증 및 실조성 경화증을 포함한다.
"에피토프" 및 "항원 결정인자"란 용어는 B 및/또는 T 세포가 반응하거나 인식하는 항원상 부위를 지칭하는데 호환적으로 사용된다. B-세포 에피토프는 연속 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓인 비연속 아미노산 모두로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매에 의한 처리시 전형적으로 상실된다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 배치의 적어도 3개 이상, 대개는 적어도 5개 또는 8 내지 20개 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간 배치를 측정하는 방법은 예를 들어 x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들어 문헌[참조: Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996)]을 참조하시오. T-세포는 CD8 세포의 경우 약 9개 아미노산 또는 CD4 세포의 경우 약 13 내지 15개 아미노산의 연속적인 에피토프를 인식한다. 상기 에피토프를 인식하는 T 세포는, 에피토프에 반응하여 초회항원자극된(primed) T 세포에 의한 3H-티미딘 결합에 의해서[참조: Burke et al., J. Inf. Dis., 170:1110-1119, 1994], 항원-의존성 살해에 의해서[세포독성 T 림프구 분석, (참조: Tigges et al., J. Immunol., 156(10):3901-3910, 1996)] 또는 사이토킨 분비에 의해서 측정되는 바와 같이, 항원-의존적인 증식을 측정하는 시험관내 분석에 의해 확인될 수 있다. 세포-매개된 면역학적 반응의 존재를 증식 분석(CD4+ T 세포) 또는 CTL(세포독성 T 림프구) 분석에 의해 측정할 수 있다.
임의로, 항원 또는 바람직하게는 항원의 에피토프를 다른 단백질, 예를 들어 MHC 및 MHC 관련 단백질에 화학적으로 접합시키거나, 또는 상기 단백질과의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "환자" 및 "피험자"란 용어는 동의어로 사용되며 포유동물을 지칭한다. 일부 실시태양에서 상기 환자는 인간이다. 다른 실시태양에서 상기 환자는 실험에 통상적으로 사용되는 포유동물, 예를 들어 마우스, 래트, 유인원, 개, 고양이, 소, 말 또는 양이다.
본 출원에 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"란 용어는 재조합체이거나 전체 게놈 핵산이 없이 단리된 핵산 분자를 지칭한다. "폴리뉴클레오티드"란 용어내에 올리고뉴클레오티드(100 잔기 이하 길이의 핵산), 재조합 벡터, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 파지, 바이러스 등이 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 몇몇 태양에서 그의 천연 유전자 또는 단백질 암호화 서열로부터 실질적으로 떨어져서 단리된 조절 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, 그의 유사체, 또는 그의 조합일 수 있다. 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산은 하기 길이의 상기와 같은 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 암호화하는 연속적인 핵산 서열을 함유할 수 있다: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 뉴클레오시드 또는 염기쌍. 주어진 종으로부터의 특정 폴리펩티드가, 약간 상이한 핵산 서열을 갖지만 그럼에도 불구하고 동일하거나 또는 실질적으로 유사한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 자연적인 변이를 함유하는 핵산에 의해 암호화될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 4개의 뉴클레오티드 염기: 아데닌(A); 시토신(C); 구아닌(G); 티민(T); 및 상기 폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 우라실(U)의 특이적인 서열로 구성된다. 따라서, "폴리뉴클레오티드 서열"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 분자의 알파벳 표현이다. 상기 알파벳 표현을 중앙 처리 유닛을 갖는 컴퓨터의 데이터베이스에 입력하여 생물정보학 용도에, 예를 들어 기능성 게놈학 및 상동성 탐색에 사용할 수 있다.
핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA에 관하여 본 발명에 사용되는 바와 같은 "단리된" 또는 "재조합"이란 용어는 폴리펩티드뿐만 아니라 거대분자의 천연 공급원 중에 존재하는, 각각 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 지칭한다. "단리된 또는 재조합 핵산"이란 용어는 단편으로서 자연적으로 존재하지 않고 자연 상태에서 발견되지 않는 핵산 단편을 포함함을 의미한다. "단리된"이란 용어는 또한 본 발명에서 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 단백질을 지칭하는데 사용되며, 정제 및 재조합 폴리펩티드 모두를 포함하고자 한다. 다른 실시태양에서, "단리된 또는 재조합"이란 용어는 통상적으로 자연적으로 관련된 구성성분들, 세포, 및 달리 통상적으로 자연에서 관련되는 세포, 조직, 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편(들)로부터 분리됨을 의미한다. 예를 들어 단리된 세포는 닮지않은 표현형 또는 유전자형의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 그의 고유 또는 천연 환경, 예를 들어 염색체상에서 통상적으로 관련된 3' 및 5' 연속 뉴클레오티드로부터 분리된다. 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 비-천연 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 항체 또는 그의 단편(들)은 그의 천연 대응물로부터 구별하기 위해 "단리"를 필요로 하지 않는다.
또 다른 서열에 대해 일정 비율(예를 들어 80%, 85%, 90% 또는 95%)의 "서열 일치성"을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 영역(또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 영역)은 정렬시 염기(또는 아미노산)의 비율이 2개의 서열을 비교할 때 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 상동성 퍼센트 또는 서열 일치성을 당해 분야에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 개시된 것들을 사용하여 측정할 수 있다. 바람직하게, 디폴트 매개변수가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수를 사용하는 BLAST이다. 특히 바람직한 프로그램은 하기의 디폴트 매개변수를 사용하는 BLASTN 및 BLASTP이다: 유전자 암호 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 둘 다; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술 = 50 서열; 분류 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + SwissProtein + SPupdate + PIR. 이들 프로그램의 상세한 내용은 하기 인터넷 주소에서 찾을 수 있다: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
본 발명이 항원, 폴리펩티드, 단백질, 폴리뉴클레오티드 또는 항체에 관한 것일 때 그의 균등물 또는 생물학적 균등물이 본 발명의 범위내에서 의도됨은 명백한 인용 없이, 달리 의도되지 않는 한 물론이다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "그의 생물학적 균등물"이란 용어는 기준 항원, 단백질, 항체, 단편, 폴리펩티드 또는 핵산을 언급할 때 "그의 균등물"과 동의어인 것을 의도하며, 목적하는 구조 또는 기능을 여전히 유지하면서 최소의 상동성을 갖는 것들을 의미한다. 본 발명에서 구체적으로 인용되지 않는 한, 본 발명에서 언급된 임의의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질은 또한 그의 균등물을 포함하는 것으로 생각된다. 하나의 태양에서, 균등한 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서 상기 개시된 방법에 사용하기 위해 본 발명에 개시된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 보체에 하이브리드화하는 것이다. 또 다른 태양에서, 균등한 항체 또는 항원 결합 폴리펩티드는 기준 항체 또는 항원 결합 단편에 적어도 70% 또는 한편으로 적어도 75%, 또는 한편으로 적어도 80%, 또는 한편으로 적어도 85%, 또는 한편으로 적어도 90%, 또는 한편으로 적어도 95%, 또는 그 이상의 친화성으로 결합하는 것을 의미한다. 또 다른 태양에서, 그의 균등물은 경쟁적인 ELISA 분석하에서 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 그의 항원에의 결합과 경쟁한다. 또 다른 태양에서, 균등물은 적어도 약 80% 상동성 또는 일치성 및 한편으로 적어도 약 85%, 또는 한편으로 적어도 90%, 또는 한편으로 적어도 95%, 또는 한편으로 적어도 98%의 상동성 또는 일치성을 의도하며 상기 기준 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산에 대해 실질적으로 균등한 생물 활성을 나타낸다.
"하이브리드화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 뉴클레오티드 잔기의 염기들간의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 상기 수소 결합은 와트슨-크리크 염기쌍, 후그스테인 결합에 의해서, 또는 임의의 다른 서열-특이적인 방식으로 존재할 수 있다. 상기 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일의 자기-하이브리드화 가닥, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 하이브리드화 반응은 보다 광범위한 과정 중 한 단계, 예를 들어 PC 반응의 개시, 또는 리보자임에 의한 폴리뉴클레오티드의 효소 절단을 구성할 수 있다.
엄격한 하이브리드화 조건의 예는 약 25 ℃ 내지 약 37 ℃의 항온처리 온도; 약 6xSSC 내지 약 10xSSC의 하이브리드화 완충제 농도; 약 0% 내지 약 25%의 포름아미드 농도; 및 약 4xSSC 내지 약 8xSSC의 세척 용액을 포함한다. 보통 하이브리드화 조건의 예는 약 40 ℃ 내지 약 50 ℃의 항온처리 온도; 약 9xSSC 내지 약 2xSSC의 완충제 농도; 약 30% 내지 약 50%의 포름아미드 농도; 및 약 5xSSC 내지 약 2xSSC의 세척 용액을 포함한다. 높은 엄격성 조건의 예는 약 55 ℃ 내지 약 68 ℃의 항온처리 온도; 약 1xSSC 내지 약 0.1xSSC의 완충제 농도; 약 55% 내지 약 75%의 포름아미드 농도; 및 약 1xSSC, 0.1xSSC, 또는 탈이온수의 세척 용액을 포함한다. 일반적으로, 하이브리드화 항온처리 시간은 1, 2회 이상의 세척 단계와 함께 5분 내지 24시간이며, 세척 항온처리 시간은 약 1, 2 또는 15분이다. SSC는 0.15M NaCl 및 15 mM 시트레이트 완충제이다. 다른 완충제 시스템을 사용하는 SSC의 균등물을 사용할 수 있는 것으로 생각된다.
"상동성" 또는 "일치성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 또는 2개의 핵산 분자간의 서열 유사성을 지칭한다. 상동성은 비교를 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열 중의 위치를 비교함으로써 측정될 수 있다. 상기 비교된 서열 중의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산에 의해 점유되는 경우, 상기 분자들은 상기 위치에서 상동성이다. 서열들간의 상동성의 정도는 상기 서열들에 의해 공유된 합치 또는 상동성 위치의 수의 함수이다. "관련되지 않은" 또는 "비-상동성" 서열은 본 발명의 서열들 중 하나와 40% 미만의 일치성 또는 한편으로 25% 미만의 일치성을 공유한다.
"상동성" 또는 "일치성" 또는 "유사성"은 또한 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 2개의 핵산 분자를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "치료하는", "치료" 등의 용어는 본 발명에서 목적하는 약물학적 및/또는 생리학적 효과를 획득함을 의미하는데 사용된다. 상기 효과는 질환 및/또는 상기 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적인 또는 완전한 치유에 관하여 치료학적일 수 있다. 하나의 태양에서, 치료는 확립된 규모를 사용하는 질병 징후의 감소를 가리킨다.
유전자[T1D 감수성 유전자좌에 중복되는 염색체 2q28-32상에 위치한, IDDM7(2q31)]에 의해 암호화되는 IGRP가 또한 최근에 인간 T1D에서 잠재적인 관련성을 갖는 베타-세포 자가항원으로서 확인되었다. 인간 IGRP의 2개의 HLA-A*0201-결합 에피토프(hIGRP228-236 및 hIGRP265 - 273)가 HLA-A*0201 트랜스유전자를 발현하는 뮤린 MHC 부류 I-결함 NOD 마우스로부터의 섬-관련된 CD8+ 세포에 의해 인식된다. 상기 뮤린 MHC 부류 II 분자(IAg7)에의 IGRP 항원 결합의 비제한적인 예는 예를 들어 IGRP206 -214(항원성 펩티드 VYLKTNVFL을 포함한다) 및 IGRP4 -22(항원성 펩티드 LHRSGVLIIHHLQEDYRTY 또는 그의 균등물을 포함한다), 및 IGRP128 -145(항원성 펩티드 TAALSYTISRMEESSVTL 또는 그의 균등물을 포함한다)을 포함한다.
"예방하기 위해서"는 질환 또는 영향에 소인이 있는 시스템 또는 피험자에서 시험관내에서 또는 생체내에서 상기 질환 또는 영향을 방지함을 의도한다.
"조성물"은 활성제 및 불활성(예를 들어 검출가능한 작용제 또는 표지) 또는 활성의 또 다른 화합물 또는 조성물, 예를 들어 항원보강제의 조합을 의미하고자 한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 조성물은 항원보강제를 함유하지 않는다.
"약학 조성물"은 활성제와, 조성물을 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 진단학적 또는 치료학적 용도에 적합하게 하는 불활성 또는 활성 담체와의 조합을 포함하고자 한다.
"기능상 균등한 코돈"이란 용어는 본 발명에서 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈, 예를 들어 아르기닌 또는 세린의 경우 6개 코돈을 지칭하는데 사용되며, 또한 생물학적으로 균등한 아미노산을 암호화하는 코돈들(하기 표 참조)을 지칭한다.
코돈 표
Figure pct00001
본 발명에 사용되는 바와 같이, "단백질" 또는 "폴리펩티드" 또는 "펩티드"는 적어도 5개의 아미노산 잔기를 포함하는 분자를 지칭한다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다. 그러나, 상기 상세한 설명 및 구체적인 실시예들은 본 발명의 특정한 실시태양들을 가리키지만 단지 예시로서 제공되며, 따라서 본 발명의 진의 및 범위로부터 다양한 변화 및 변경은 이들 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명해질 것임은 물론이다.
II. 기술적 실시태양
현재 전신 면역성의 손상 없이 다클론성 자가면역반응의 완전한 억제를 가능하게 하는 치료학적 플랫폼은 존재하지 않는다. 본 발명에 개시된 출원인의 명세는 자가반응성 질병-특이성 CD4+ T-세포 및 B-세포를, 미세한 항원 특이성과 관계없이 예민한 질병-특이성을 갖고 전신 면역성을 손상시키지 않으면서 숙주의 모든 다른 자가반응성 T 및 B-세포 반응을 대등하게 억제시키는 동족, 단일-특이성 조절성 CD4+ T-세포 및 B-세포로 변화시키는 자가면역 질병-특이성 약물의 디자인을 가능하게 한다.
1형 당뇨병( T1D )의 자가항원 복잡성
T1D는 췌장 베타-세포 덩어리를 점진적으로 미란케(erode) 하는 만성적인 자가면역 반응에 의해 유발된다. 인간 및 NOD 마우스 모두에서 B-세포 파괴는 다수의 자가항원을 인식하는 T-세포에 의해 수행된다[참조: Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol. 100:79-124; Lieberman, S. et al. (2003) Tissue Antigens 62:359-377]. 사건들의 정확한 시퀀스는 병을 한정된 채로 두지만, 현행 증거는 T1D가 CD4+ 및 CD8+ 세포를 필요로 하고; 자가반응성 T 세포가 국소적인 APC상의 B-세포 항원과 맞물림으로써 살해자로 분화되고; 상기 T-세포가 광범위한 자가항원 레퍼토리를 표적화함을 암시한다[참조: Tsai, S. et al. (2008) Adv. Immunol. 100:79-124; Santamaria, P. (2010) Immunity 32:437-445].
가용성 펩티드는 생체내에서 펩티드-특이성 T-세포 내성을 유도할 수 있지만, 다중-특이성 자가면역 반응을 둔화시킬 수 없는 것으로 입증되었다[참조: Han et al. (2005) Nature Medicine 11(6):645-652]. 뜻밖에도, 가용성 펩티드에 의한 치료법과 달리, 단일의 T1D-관련된 pMHC 부류 I(원래는 음성 대조용으로서 사용됨)로 코팅된 NP에 의한 치료법이 전-당뇨병 NOD 마우스에서 T1D의 진행을 둔화시키고 당뇨병 동물에서 정상혈당을 회복시키는 것으로 밝혀졌다[참조: Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32:568-580]. 후속 연구는 pMHC-NP 요법이 에피토프-특이적인 방식으로, 자가항원-부하된 APC를 억제하고 살해함으로써 다른 자가항원 T 세포 특이성의 모집을 억제한 자가항원-경험 자가반응성 CD8+ 세포를 확대시킴으로써 기능한다는 뜻밖의 발견에 이르렀다. 보다 최근에, 출원인은 이러한 치료학적 플랫폼이 자가반응성 T-조절성 CD4+ 세포의 생체내 확대에 활용될 수 있음을 발견하였다. 구체적으로, 출원인은 개별적인 T1D-관련된 pMHC 부류 II로 코팅된 NP가 질병-특이성 TR1 CD4+ T-세포를 확대시켜, 상기 TR1 마커 CD49b 및 LAG3을 발현하고[참조: Gagliani, N. et al. (2013) Nature Medicine 19:739-746] 사이토킨 IL10 및 TGF-β를 생성시킴(하기 참조)을 발견하였다.
집합적으로, 이러한 발견은 자가면역성의 진보에 새로운 패러다임을 지지하며, 이는 내인성 에피토프에 의한 미경험 자가반응성 CD8+ 또는 CD4+ T 세포의 만성적 자극이 상기 세포의 기억-형 자가반응성 조절성 T 세포로의 분화를 촉발하고; 이들 기억 자가반응성 조절 세포는 자가항원-부하된 APC를 억제하고/하거나 살해함으로써 동족 및 비-동족 고-결합활성 자가반응성 T 세포 특이성의 활성화를 억제함을 진술한다[참조: Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32:568-580]. 중요하게, 및 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 자가면역 질병(다수 중에서)에 관련된 임의의 단일 에피토프(pMHC) 특이성을 사용하여, NP상의 리간드로서 코팅될 때, 복잡한 자가면역 반응을 둔화시킬 수 있다. 출원인의 믿음은 이들 NP 제제가 핵심적인 동시-자극 분자, 예를 들어 CD80 및 CD86이 없기 때문에, 미경험 T-세포를 활성화시킬 수 없고, 따라서 효과기 T-세포 반응을 유도할 수 없다는 것이다. 실제로, 동족 미경험 및 효과기 자가반응성 세포는 상기 접근법에 의해 결실된다. 따라서, 상기의 발견을 가능하게 한 치료학적 접근법은 전신 면역성을 손상시키지 않으면서 질병- 및 기관-특이적인 방식으로 다클론 자가면역 반응을 잠재적으로 해결할 수 있는, 자가면역성에 있어서 새로운 부류의 치료학에 대한 플랫폼을 제공한다.
III. 방법
의학적 및 진단학적 방법을 또한 제공한다. 하나의 태양에서, 피험자에서 항원-특이적인 방식으로 B-조절성 세포 및/또는 TR1 세포(예를 들어 TR1 및 CD4+ 세포)의 형성, 확대 및 모집을 촉진하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로하는 피험자에게 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 NP-복합체 또는 조성물을 투여함을 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어진다.
또 다른 태양에서, 피험자에서 본 발명에 개시된 바와 같은 자가면역 질병 또는 질환, 예를 들어 MS, MS-관련 질환, 당뇨병 또는 전-당뇨병의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 치료 또는 예방이 필요한 피험자에게 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 NP-복합체 또는 조성물을 투여함을 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어지고, 여기에서 상기 자가항원은 치료하려는 질병에 대해 질병-관련되며, 예를 들어 당뇨병의 예방 또는 치료의 경우 상기 항원은 당뇨병-관련 항원이다. 추가의 태양에서, 상기 자가면역 질병은 다발성 경화증 또는 다발성 경화증-관련 질환이며 상기 항원은 MS-관련된다.
전-당뇨병 또는 당뇨병의 치료 또는 예방을 위한 펩티드 항원은 비제한적으로 hInsB10 -18 (HLVEALYLV), hIGRP228 -236 (LNIDLLWSV), hIGRP265 -273 (VLFGLGFAI), IGRP206-214 (VYLKTNVFL), NRP-A7 (KYNKANAFL), NRP-I4 (KYNIANVFL), NRP-V7 (KYNKANVFL), YAI/Db (FQDENYLYL) 및/또는 INS B15-23 (LYLVCGERG), GAD65114 -123, VMNILLQYVV; GAD65536 -545, RMMEYGTTMV; GFAP143 -151, NLAQTDLATV; GFAP214 -222, QLARQQVHV; IA-2172-180, SLSPLQAEL; IA-2482-490, SLAAGVKLL; IA-2805-813, VIVMLTPLV; ppIAPP5-13, KLQVFLIVL; ppIAPP9 -17, FLIVLSVAL; IGRP152 -160, FLWSVFMLI; IGRP211 -219, NLFLFLFAV; IGRP215 -223, FLFAVGFYL; IGRP222 -230, YLLLRVLNI; IGRP228 -236, LNIDLLWSV; IGRP265 -273, VLFGLGFAI; IGRP293 -301, RLLCALTSL; 프로-인슐린L2 -10, ALWMRLLPL; 프로-인슐린L3 -11, LWMRLLPLL; 프로-인슐린L6 -14, RLLPLLALL; 프로-인슐린B5 -14, HLCGSHLVEA; 프로-인슐린B10 -18, HLVEALYLV; 프로-인슐린B14 -22, ALYLVCGER; 프로-인슐린B15-24, LYLVCGERGF; 프로-인슐린B17 -25, LVCGERGFF; 프로-인슐린B18 -27, VCGERGFFYT; 프로-인슐린B20 -27, GERGFFYT; 프로-인슐린B21 -29, ERGFFYTPK; 프로-인슐린B25 -C1, FYTPKTRRE; 프로-인슐린B27-C5, TPKTRREAEDL; 프로-인슐린C20 -28, SLQPLALEG; 프로-인슐린C25 -33, ALEGSLQKR; 프로-인슐린C29 -A5, SLQKRGIVEQ; 프로-인슐린A1 -10, GIVEQCCTSI; 프로-인슐린A2-10, IVEQCCTSI; 프로-인슐린A12 -20, SLYQLENYC 또는 이들의 균등물 및/또는 조합을 포함한다. 추가의 예는 ProIns 76-90, SLQPLALEGSLQKRG, ProIns 79-89, PLALEGSLQKR, ProIns 90-109, GIVEQCCTSICSLYQLENYC, ProIns 94-105, QCCTSICSLYQL, GAD 247-266, NMYAMMIARFKMFPEVKEKG, GAD 255-265, RFKMFPEVKEK, GAD 555-567, NFFRMVISNPAAT, IGRP 13-25, QHLQKDYRAYYTF, IGRP 8-27, GVLIIQHLQKDYRAYYTFLN, ProIns B24-C36, FFYTPMSRREVED 및 이들 각각의 균등물을 포함한다.
상기 방법이 MS 또는 MS-관련 질환의 치료에 관한 것일 때, 상기 복합체는 다발성 경화증에 관련된 항원을 포함한다. 상기와 같은 항원은 예를 들어 미국특허 공보 제 2012/0077686 호에 개시된 것들, 및 마이엘린 염기성 단백질, 마이엘린 관련 당단백질, 마이엘린 올리고덴드로사이트 단백질, 단백지질 단백질, 올리고덴드로사이트 마이엘린 올리고단백질, 마이엘린 관련된 올리고덴드로사이트 염기성 단백질, 올리고덴드로사이트 특이성 단백질, 열충격 단백질, 올리고덴드로사이트 특이성 단백질 NOGO A, 당단백질 Po, 말초 마이엘린 단백질 22, 및 2'3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제로부터 유래된 항원을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원은 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG)로부터 유래된다. 비제한적인 예는 예를 들어 MAG287 -295, SLLLELEEV; MAG509 -517, LMWAKIGPV; MAG556 -564, VLFSSDFRI; MBP110 -118, SLSRFSWGA; MOG114 -122, KVEDPFYWV; MOG166 -175, RTFDPHFLRV; MOG172 -180, FLRVPCWKI; MOG179 -188, KITLFVIVPV; MOG188 -196, VLGPLVALI; MOG181-189, TLFVIVPVL; MOG205-214, RLAGQFLEEL; PLP80 -88, FLYGALLLA 또는 이들의 균등물 또는 조합을 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 항원의 추가의 비제한적인 예는 하기 그룹의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다: MOG35 -55, MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MOG36 - 55, EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287 -295, SLLLELEEV; MAG509 -517, LMWAKIGPV; MAG556 -564, VLFSSDFRI; MBPI110 -118, SLSRFSWGA; MOG114 -122, KVEDPFYWV; MOG166 -175, RTFDPHFLRV; MOG172 -180, FLRVPCWKI; MOG179 -188, KITLFVIVPV; MOG188-196, VLGPLVALI; MOG181 -189, TLFVIVPVL; MOG205 -214, RLAGQFLEEL; PLP80 -88, FLYGALLLA, 또는 이들 각각의 균등물 또는 조합을 포함한다.
상기 치료법을 결정하고 모니터하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 본 발명에 간단히 개시된다. 투여는 시험관내에서 전달될 때 상기 조성물을 임의의 적합한 방법에 의해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양물 배지에의 투여에 의해 상기 조직 또는 세포와 접촉시킴에 의하며, 상기 치료법이 개인에게 적합한지를 결정하기 위한 선별로서, 또는 또 다른 치료법이 개시된 조성물의 대용물로서 또는 상기 조성물과 함께 사용되는지를 선별하는데 유용하다. 생체내에서 투여시, 상기 투여는 전신 또는 국소 투여에 의한다. 생체내에서, 상기 방법은 인간 투여에 앞서 비-인간 동물상에서, 또 다른 치료법이 개시된 조성물의 대용물로서 또는 상기 조성물과 함께 사용되는지를 선별하기 위해 실행될 수 있다. 인간 또는 비-인간 포유동물에서, 상기는 또한 상기 질병 또는 질환의 치료에 유용하다.
상기 방법들은 유효량의 NP-복합체의 투여를 필요로 한다.
상기 항원-MHC-나노입자 복합체의 MHC는 MHC I, MHC II 또는 비-고전적인 MHC일 수 있으나, 바람직하게는 MHCII일 수 있다. MHC 단백질을 본 발명에 개시한다. 하나의 실시태양에서, 상기 항원-MHC-나노입자 복합체의 MHC는 MHC 부류 I이다. 또 다른 실시태양에서, 상기 MHC는 MHC 부류 II이다. 다른 실시태양에서, 상기 항원-MHC-나노입자 복합체의 MHC 성분은 본 발명에 개시된 바와 같은 MHC 부류 II 또는 비-고전적인 MHC 분자이다. 하나의 태양에서, 상기 항원은 폴리펩티드 GWYRSPFSRVVH 또는 GWYRSPFSRVVH의 균등물을 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어진다.
상기 나노입자의 크기는 약 1 ㎚ 내지 약 1 ㎛의 범위일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 나노입자는 직경이 약 1 ㎛ 미만이다. 다른 실시태양에서, 상기 나노입자는 직경이 약 500 ㎚ 미만, 약 400 ㎚ 미만, 약 300 ㎚ 미만, 약 200 ㎚ 미만, 약 100 ㎚ 미만, 또는 약 50 ㎚ 미만이다. 추가의 실시태양에서, 상기 나노입자는 직경이 약 1 ㎚ 내지 약 10 ㎚, 15 ㎚, 20 ㎚, 25 ㎚, 30 ㎚, 40 ㎚, 50 ㎚, 75 ㎚, 또는 100 ㎚ 이다. 특정한 실시태양에서, 상기 나노입자는 약 1 ㎚ 내지 약 100 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 20 ㎚, 또는 약 5 ㎚ 내지 약 20 ㎚이다.
상기 복합체의 크기는 약 5 ㎚ 내지 약 1 ㎛의 범위일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 복합체는 직경이 약 1 ㎛ 미만 또는 한편으로 100 ㎚ 미만이다. 다른 실시태양에서, 상기 복합체는 직경이 약 500 ㎚ 미만, 약 400 ㎚ 미만, 약 300 ㎚ 미만, 약 200 ㎚ 미만, 약 100 ㎚ 미만, 또는 약 50 ㎚ 미만이다. 추가의 실시태양에서, 상기 복합체는 약 5 ㎚ 또는 10 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 또는 약 5 ㎚ 내지 약 75 ㎚, 또는 약 5 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 또는 약 5 ㎚ 내지 약 60 ㎚, 또는 약 10 ㎚ 내지 약 60 ㎚, 또는 하나의 태양에서 약 55 ㎚이다.
출원인은 상기 나노입자상의 항원-MHC 복합체의 밀도가 치료학적 이점에 기여함을 발견하였다. 따라서, 본 발명에 개시되는 바와 같이 상기 항원-MHC 나노입자 복합체는 상기 복합체를 포함하여 상기 나노입자의 표면적 100 ㎚2당 약 0.05 MHC 분자 범위의 한정된 밀도를 가질 수 있으며, 상기 나노입자에 대해 적어도 2개의 MHC, 또는 한편으로 적어도 8개, 또는 한편으로 적어도 9개, 또는 한편으로 적어도 10개, 또는 한편으로 적어도 11개, 또는 한편으로 적어도 12개의 MHC가 복합체화되는 것으로 추정된다. 하나의 태양에서, 상기 복합체는 약 0.01 MHC/100 ㎚2 (0.05 MHC/100 ㎚2) 내지 약 30 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 0.1 MHC/100 ㎚2 내지 약 25 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 0.3 MHC/100 ㎚2 내지 약 25 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 0.4 MHC/100 ㎚2 내지 약 25 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 0.5 MHC/100 ㎚2 내지 약 20 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 0.6 MHC/100 ㎚2 내지 약 20 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 1.0 MHC/100 ㎚2 내지 약 20 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 5.0 MHC/100 ㎚2 내지 약 20 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 10.0 MHC/100 ㎚2 내지 약 20 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 약 15 MHC/100 ㎚2 내지 약 20 MHC/100 ㎚2, 또는 한편으로 적어도 약 0.5, 또는 한편으로 적어도 약 1.0, 또는 한편으로 적어도 약 5.0, 또는 한편으로 적어도 약 10.0, 또는 한편으로 적어도 약 15.0 MHC/100 ㎚2의 MHC 밀도를 갖는다. 하나의 태양에서, 9 또는 적어도 9개의 MHC가 나노입자에 복합체화되는 경우, 상기 밀도 범위는 약 0.3 MHC/100 ㎚2 내지 약 20 MHC/100 ㎚2이다.
본 발명의 방법 태양들 중 하나에서, 환자에서 B-조절성 세포 및/또는 항염증성 T 세포의 축적 방법을 제공한다. 추가의 실시태양에서, 상기 T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다. 관련 실시태양에서, 상기 T 세포는 IL-10 또는 TGFβ를 분비한다. 상기 방법은 상기 축적이 필요한 환자에게 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 항원-MHC 나노입자 복합체를 투여함을 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어진다.
하나의 실시태양에서, 본 발명에 개시된 조성물 및 방법은 자가면역 질환, 예를 들어 MS, MS-관련 질환, 당뇨병 또는 전-당뇨병의 치료를 위한 것이다. 상기 방법은 환자에게 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 항원-MHCII 나노입자 복합체를 투여함을 포함하거나, 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어진다.
시험관내 및 생체내 투여 방식에 관한 상세한 내용을 개시한다.
본 명세는 또한 본 발명에 개시된 바와 같은 질병 및 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 NP-복합체의 용도를 제공한다.
IV. 항원- MHC -나노입자 복합체
A. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드
추가의 태양은 본 발명에 개시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어지는 단리된 또는 정제된 폴리펩티드 항원, 또는 상기 항원의 아미노산 서열에 적어도 80% 서열 일치성, 또는 한편으로 적어도 85%, 또는 한편으로 적어도 90%, 또는 한편으로 적어도 95%, 또는 한편으로 적어도 98% 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드, 또는 상기 항원의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 약 80% 서열 일치성, 또는 한편으로 적어도 85%, 또는 한편으로 적어도 90%, 또는 한편으로 적어도 95%, 또는 한편으로 적어도 98% 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드 또는 그의 보체, 또는 보통 내지 높은 엄격성 조건하에서 상기 항원 또는 그의 보체의 아미노산 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한 본 발명에 개시된 항원 폴리펩티드를 암호화하는 단리되고 정제된 폴리뉴클레오티드, 또는 상기에 대해 적어도 약 80% 서열 일치성, 또는 한편으로 상기 개시된 서열에 적어도 85%, 또는 한편으로 적어도 90%, 또는 한편으로 적어도 95%, 또는 한편으로 적어도 98% 서열 일치성을 갖는 아미노산, 또는 균등물, 또는 엄격한 조건하에서 상기 폴리뉴클레오티드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드, 그의 균등물 또는 그의 보체 및 이들 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 단리된 또는 정제된 폴리펩티드를 제공한다. 상기 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 이들과 자연에서 관련되지 않은 비-천연 물질, 예를 들어 당해 분야에 공지되고 본 발명에 개시된 바와 같은 담체, 약학적으로 허용 가능한 담체, 벡터 및 MHC 분자, 나노입자와 병용할 수 있다.
항원 종으로부터 유래된 분절, 단편 및 다른 분자, 예를 들어 비제한적으로 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 본 발명의 고전적인 및 비-고전적인 MHC 분자에 의해 제공되는 다른 분자를 포함한 항원을 전형적으로 MHC 분자 또는 그의 유도체에 복합체화하거나 또는 작동적으로 커플링시킨다. T 림프구에 의한 항원 인식은 주 조직적합성 복합체(MHC)-제한된다. 주어진 T 림프구는 오직 상기가 특정 MHC 분자에 결합하는 경우에만 항원을 인식할 것이다. 일반적으로, T 림프구는 오직 자기-MHC 분자의 존재하에서만 자극되며, 항원은 자기 MHC 분자에 결합된 항원의 단편으로서 인식된다. MHC 제한은 인식된 항원에 관하여 및 항원 단편(들)에 결합하는 MHC 분자에 관하여 T 림프구 특이성을 한정한다. 특정한 태양에서 몇몇 항원은 몇몇 MHC 분자 또는 그로부터 유래된 폴리펩티드와 쌍을 이룰 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같은 "작동적으로 커플링된" 또는 "코팅된"이란 용어는 개별적인 폴리펩티드(예를 들어 MHC) 및 항원(예를 들어 펩티드) 성분이 결합되어 표적 부위, 예를 들어 면역세포에서 결합 전에 활성 복합체를 형성하는 상황을 지칭한다. 이는 상기 개별적인 폴리펩티드 복합체 성분이 합성되거나 또는 재조합적으로 발현되고 후속으로 단리되고 결합되어, 피험자에게 투여 전에 시험관내에서 복합체를 형성하는 상황; 키메릭 또는 융합 폴리펩티드(즉 상기 복합체의 각각의 별개의 단백질 성분이 단일 폴리펩티드 쇄 중에 함유된다)가 완전한 복합체로서 합성되거나 재조합적으로 발현되는 상황을 포함한다. 전형적으로, 폴리펩티드 복합체를 약, 적어도 약 또는 기껏해야 약 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 이상:1, 보다 전형적으로 0.1:1, 1:1 내지 50:1 또는 300:1의 분자수 대 나노입자수의 비를 갖는 흡착되거나 커플링된 폴리펩티드 복합체를 갖는 나노입자를 제공하도록 상기 나노입자에 가한다. 상기 나노입자의 폴리펩티드 함량을 표준 기법을 사용하여 측정할 수 있다.
B. MHC 분자
세포내 및 세포외 항원은 인식 및 적합한 반응 모두에 관하여, 상기 면역계에 매우 상이한 공격들을 제공한다. T 세포에의 항원의 제공은, 별개의 항원 가공 경로를 이용하는 분자 MHC 부류 I(MHC-I) 및 MHC 부류 II(MHC-II)(또한 본 발명에서 "pMHC"로서 확인됨)의 2개의 별개의 부류에 의해 매개된다. 세포내 항원으로부터 유래된 펩티드는 MHC 부류 I 분자(상기 분자는 실질적으로 모든 세포상에서 발현된다)에 의해 CD8+ T 세포에 제공되는 반면, 세포외 항원-유래된 펩티드는 MHC-II 분자에 의해 CD4+ T 세포에 제공된다. 그러나, 이러한 이분법에 몇몇 예외가 존재한다. 다수의 연구는 내포화된 미립자 또는 용해성 단백질로부터 생성된 펩티드가 수지상 세포뿐만 아니라 대식세포 중의 MHC-1 분자에 제공됨을 입증하였다. 본 발명의 몇몇 실시태양에서, 특정 항원이 확인되며 적합한 MHC 부류 I 또는 II 폴리펩티드와 관련하여 항원-MHC-나노입자 복합체 중에 제공된다. 몇몇 태양에서, 피험자의 유전자 구성을 평가하여 어느 MHC 폴리펩티드가 특정 환자 및 특정 펩티드 세트에 사용되어야 하는지를 결정할 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 MHC 1 부류 성분은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 또는 CD-1 분자 중 일부 또는 전부를 포함한다. 상기 MHC 성분이 MHC 부류 II 성분인 실시태양에서, 상기 MHC 부류 II 성분은 HLA-DR, HLA-DQ 또는 HLA-DP 중 일부 또는 전부를 포함할 수 있다.
비-고전적인 MHC 분자를 또한 본 발명의 MHC 복합체에의 사용에 고려한다. 비-고전적인 MHC 분자는 비-다형성이며, 종간 보존되고, 좁고, 깊고, 소수성인 리간드 결합 포켓을 갖는다. 이러한 결합 포켓은 당지질 및 인지질을 천연 살해 T(NKT) 세포 또는 CD8+ T-세포, 예를 들어 Qa1 또는 HLA-E-제한된 CD8+ T-세포의 몇몇 부분집합에 제공할 수 있다. NKT 세포는 NK 세포 마커 및 반-불변 T 세포 수용체(TCR)를 동시-발현하는 독특한 림프구 집단을 나타낸다. 상기 세포는 광범위한 질병과 관련된 면역반응의 조절에 관련된다.
C. 항원 성분
본 발명의 몇몇 태양은 항원 반응을 불러일으키거나 유도하는 폴리펩티드, 펩티드, 핵산, 탄수화물, 지질 및 다른 반자(일반적으로 항원이라 지칭된다)의 분절, 단편 또는 에피토프 를 포함하는 항원 조성물에 관한 방법 및 조성물을 포함한다. 특히, 자가면역 반응을 통해 세포의 파괴에 이르게 하는 항원 결정인자의 항원 분절 또는 단편을 확인할 수 있으며 본 발명에 개시된 항원-MHC-나노입자 복합체의 제조에 사용할 수 있다. 본 발명의 실시태양은 신체의 세포 또는 조직에서 면역반응의 조절을 위한 조성물 및 방법을 포함한다.
본 발명의 항원 폴리펩티드 및 펩티드를 다양한 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형시킬 수 있다. 특정 실시태양에서, 변형된 폴리펩티드 및/또는 펩티드는 피험자에서 면역반응을 조절할 수 있다. 일부 실시태양에서, 단백질 또는 펩티드의 야생형 버전을 사용하나, 본 발명의 다수의 실시태양들에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩티드가 항원-MHC-나노입자 복합체를 생성시키는데 사용된다. 항원-MHC-나노입자 복합체를 사용하여 항염증성 면역 반응을 생성시키고, 면역계의 T 세포 집단을 변형시키고(즉 상기 면역계를 다시 길들이고), 및/또는 특정 조직에의 항염증성 T 세포의 모집 및 축적을 촉진할 수 있다. 상술한 용어들은 본 발명에서 호환적으로 사용될 수 있다. "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드" 또는 "변형된 펩티드"는 화학 구조, 특히 아미노산 서열이 야생형 단백질 또는 폴리펩티드에 관하여 변경된 단백질 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 실시태양에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩티드 또는 펩티드는 적어도 하나의 변형된 활성 또는 기능을 갖는다(단백질 또는 폴리펩티드 또는 펩티드가 다수의 활성 또는 기능을 가질 수 있음이 인정된다). 변형된 단백질 또는 폴리펩티드 또는 펩티드는 하나의 활성 또는 기능에 관하여 변경될 수 있지만 다른 태양에서 야생형 활성 또는 기능, 예를 들어 MHC-나노입자 복합체와 관련하여 면역계의 다른 세포와 상호작용하는 능력 또는 면역원성은 유지한다.
펩티드 항원의 비제한적인 예는 비제한적으로 hInsB10 -18 (HLVEALYLV), hIGRP228-236 (LNIDLLWSV), hIGRP265 -273 (VLFGLGFAI), IGRP206 -214 (VYLKTNVFL), NRP-A7 (KYNKANAFL), NRP-I4 (KYNIANVFL), NRP-V7 (KYNKANVFL), YAI/Db (FQDENYLYL) 및/또는 INS B15-23 (LYLVCGERG)뿐만 아니라 미국 특허출원 공보 제 2005/0202032 호에 개시된 펩티드 및 단백질 및 이들의 균등물 및/또는 조합을 포함한다.
몇몇 태양에서, T1D의 치료를 위한 펩티드 항원은 GAD65114 -123, VMNILLQYVV; GAD65536 -545, RMMEYGTTMV; GFAP143 -151, NLAQTDLATV; GFAP214-222, QLARQQVHV; IA-2172-180, SLSPLQAEL; IA-2482-490, SLAAGVKLL; IA-2805-813, VIVMLTPLV; ppIAPP5-13, KLQVFLIVL; ppIAPP9 -17, FLIVLSVAL; IGRP152 -160, FLWSVFMLI; IGRP211 -219, NLFLFLFAV; IGRP215 -223, FLFAVGFYL; IGRP222 -230, YLLLRVLNI; IGRP228 -236, LNIDLLWSV; IGRP265 -273, VLFGLGFAI; IGRP293 -301, RLLCALTSL; 프로-인슐린L2 -10, ALWMRLLPL; 프로-인슐린L3 -11, LWMRLLPLL; 프로-인슐린L6-14, RLLPLLALL; 프로-인슐린B5 -14, HLCGSHLVEA; 프로-인슐린B10 -18, HLVEALYLV; 프로-인슐린B14 -22, ALYLVCGER; 프로-인슐린B15 -24, LYLVCGERGF; 프로-인슐린B17 -25, LVCGERGFF; 프로-인슐린B18 -27, VCGERGFFYT; 프로-인슐린B20 -27, GERGFFYT; 프로-인슐린B21 -29, ERGFFYTPK; 프로-인슐린B25-C1, FYTPKTRRE; 프로-인슐린B27 -C5, TPKTRREAEDL; 프로-인슐린C20 -28, SLQPLALEG; 프로-인슐린C25 -33, ALEGSLQKR; 프로-인슐린C29 -A5, SLQKRGIVEQ; 프로-인슐린A1-10, GIVEQCCTSI; 프로-인슐린A2 -10, IVEQCCTSI; 프로-인슐린A12-20, SLYQLENYC 또는 이들의 균등물 및/또는 조합이다.
항원의 추가적인 비제한적인 실시예는 본 발명에 사용될 수 있는 MS 및 MS-관련된 항원을 포함하며, 하기 그룹의 폴리펩티드를 포함하거나, 또는 한편으로 상기로 필수적으로 이루어지거나, 또는 더욱 추가로 상기로 이루어지는 폴리펩티드를 포함한다: MOG35 -55, MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MOG36 - 55, EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287 -295, SLLLELEEV; MAG509 -517, LMWAKIGPV; MAG556 -564, VLFSSDFRI; MBPI110 -118, SLSRFSWGA; MOG114 -122, KVEDPFYWV; MOG166 -175, RTFDPHFLRV; MOG172 -180, FLRVPCWKI; MOG179 -188, KITLFVIVPV; MOG188 -196, VLGPLVALI; MOG181 -189, TLFVIVPVL; MOG205 -214, RLAGQFLEEL; PLP80-88, FLYGALLLA, 또는 이들 각각의 균등물 또는 이들의 조합.
더욱 추가의 태양에서 MS 및 MS-관련된 질환의 치료를 위한 펩티드 항원은 비제한적으로 MOG35 -55, MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MOG36 - 55, EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-295, SLLLELEEV; MAG509 -517, LMWAKIGPV; MAG556 -564, VLFSSDFRI; MBP110 -118, SLSRFSWGA; MOG114 -122, KVEDPFYWV; MOG166 -175, RTFDPHFLRV; MOG172 -180, FLRVPCWKI; MOG179 -188, KITLFVIVPV; MOG188 -196, VLGPLVALI; MOG181 -189, TLFVIVPVL; MOG205 -214, RLAGQFLEEL; PLP80 -88, FLYGALLLA MAG287-295, SLLLELEEV; MAG509 -517, LMWAKIGPV; MAG556 -564, VLFSSDFRI, 및 이들의 균등물 및/또는 조합을 포함한다.
MS 및 MS-관련된 질환의 치료를 위한 항원은 미국특허 출원 공보 제 2012/0077686 호에 개시된 것들, 및 마이엘린 염기성 단백질, 마이엘린 관련 당단백질, 마이엘린 올리고덴드로사이트 단백질, 단백지질 단백질, 올리고덴드로사이트 마이엘린 올리고단백질, 마이엘린 관련된 올리고덴드로사이트 염기성 단백질, 올리고덴드로사이트 특이성 단백질, 열충격 단백질, 올리고덴드로사이트 특이성 단백질 NOGO A, 당단백질 Po, 말초 마이엘린 단백질 22, 및 2'3'-사이클릭 뉴클레오티드 3'-포스포디에스테라제로부터 유래된 항원을 포함한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원은 마이엘린 올리고덴드로사이트 당단백질(MOG)로부터 유래된다.
몇몇 실시태양에서, 관심 단백질 또는 펩티드의 임의의 복합체 및 특히 MHC-펩티드 융합을 포함한 단백질 또는 폴리펩티드(야생형 또는 변형된)의 크기는 비제한적으로 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 이상(상기 중에서 유래될 수 있는 임의의 범위 또는 값 포함)의 아미노산 분자 또는 이들의 유도체를 포함할 수 있다. 몇몇 태양에서, 항원의 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 연속적인 아미노산 및 그의 유도체 및 단편, 예를 들어 본 발명에 개시되고 참조된 아미노산 서열들이 항원으로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드를 절단(truncation)에 의해 돌연변이시켜, 상기 폴리펩티드를 그의 상응하는 야생형 형태보다 짧게 만들 수 있으며, 또한 특정 기능(예를 들어 단백질 복합체로서 표출, 증대된 면역원성 등을 위한)을 갖는 이종 단백질 서열을 융합시키거나 접합시킴으로써 변경시킬 수도 있음이 고려된다.
단백질 조성물을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 임의의 기법, 예를 들어 (i) 표준 분자 생물학 기법을 통한 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현, (ii) 천연 공급원으로부터 단백질 화합물의 단리, 또는 (iii) 단백질 물질의 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. 다양한 유전자들에 대한 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드 서열뿐만 아니라 뉴클레오티드가 앞서 개시되었으며, 이들을 승인된 컴퓨터화된 데이터베이스에서 찾을 수 있다. 하나의 상기와 같은 데이터베이스는 국립 생물공학 정보 센터의 진뱅크 및 진펩트(GenPept) 데이터베이스(www.ncbi.nlm.nih.gov/상에서)이다. 이들 유전자에 대한 암호화 영역의 일부 또는 전부를 본 발명에 개시된 기법을 사용하여 또는 당해 분야의 통상적인 숙련가들에게 공지된 바와 같이 증폭 및/또는 발현시킬 수 있다.
상기 조성물 중 자가항원성 에피토프 및 다른 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 치환, 삽입 또는 결실 변이체일 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에서 변형은 야생형에 비해, 펩티드 또는 폴리펩티드의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500개 이상의 비-연속적인 또는 연속적인 아미노산에 영향을 미칠 수 있다.
결실 변이체는 전형적으로 고유 또는 야생형 아미노산 서열 중 하나 이상의 잔기가 없다. 개별적인 잔기를 결실시키거나 또는 다수의 연속적인 아미노산을 결실시킬 수 있다. 정지 코돈을 암호화 핵산 서열에 도입시켜(치환 또는 삽입에 의해) 절두된 단백질을 생성시킬 수 있다. 삽입 돌연변이는 전형적으로 상기 폴리펩티드 중 비-말단점에서 물질의 첨가를 수반한다. 이는 하나 이상의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 융합 단백질이라 칭하는 말단 첨가를 또한 생성시킬 수 있다.
치환 변이체는 전형적으로 상기 단백질 내 하나 이상의 부위에서 하나의 아미노산의 또 다른 아미노산에 대한 교환을 함유하며, 다른 기능 또는 성질을 상실시키거나 상기 상실 없이 상기 폴리펩티드의 하나 이상의 성질을 조절하도록 디자인될 수 있다. 치환은 보존적일 수 있다, 즉 하나의 아미노산을 유사한 모양 및 전하 중 하나로 치환시킨다. 보존적 치환은 당해 분야에 주지되어 있으며, 예를 들어 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 리신으로; 아스파라진에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라진으로; 글루타메이트에서 아스파테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라진 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 리신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 쓰레오닌으로; 쓰레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다. 한편으로, 치환은 폴리펩티드 또는 펩티드의 기능 또는 활성, 예를 들어 세포 수용체(들)에 대한 결합활성 또는 친화성이 영향을 받도록 비-보존적일 수도 있다. 비-보존적 변화는 전형적으로 화학적으로 유사하지 않은 것에 의한 잔기의 치환, 예를 들어 비극성 또는 하전되지 않은 아미노산에 대한 극성 또는 하전된 아미노산에 의한 및 이와 역으로의 치환을 수반한다.
본 발명의 단백질은 재조합체이거나 또는 시험관내에서 합성될 수 있다. 한편으로, 재조합 단백질을 세균 또는 다른 숙주 세포로부터 단리시킬 수 있다.
아미노산 및 핵산 서열이 추가적인 잔기, 예를 들어 각각 추가적인 N- 또는 C-말단 아미노산, 또는 5' 또는 3' 핵산 서열을 포함할 수 있고, 상기 서열이 상기 제시된 기준, 예를 들어 생물학적 단백질 활성(예를 들어 면역원성)의 유지를 충족시키는 한, 여전히 필수적으로 본 발명에 개시된 서열들 중 하나에 제시된 바와 같을 수 있음을 알 것이다. 말단 서열의 첨가는 특히, 예를 들어 상기 암호화 영역의 5' 또는 3' 부분에 인접한 다양한 비-암호화 서열들을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.
본 발명의 조성물에서 ㎖당 약 0.001 ㎎ 내지 약 10 ㎎의 총 단백질이 존재한다. 따라서, 조성물 중의 단백질의 농도는 약, 적어도 약 또는 기껏해야 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 50, 100 ㎍/㎖ 또는 ㎎/㎖ 이상(또는 상기 중에서 유도될 수 있는 임의의 범위)일 수 있다. 이 중에서, 약, 적어도 약, 또는 기껏해야 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%가 항원-MHC-나노입자 복합체일 수 있다.
또한, 본 발명에 참고로 인용된 미국특허 제 4,554,101 호(호프(Hopp))는 친수성을 근거로 1차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인 및 제조함을 교시한다. 호프에 개시된 방법들을 통해서, 당해 분야의 숙련가는 아미노산 서열내에서 상기로부터 잠재적인 에피토프를 확인하고 그의 면역원성을 확인할 수 있을 것이다. 다수의 과학 간행물들이 또한 아미노산 서열 분석으로부터의 2차 구조의 예측 및 에피토프의 확인에 몰두하였다[참조: Chou & Fasman, Adv. Enzymol., 47:45-148, 1978; Chous and Fasman, Annu, Rev. Biochem., 47:251-276, 1978, Chou and Fasman, Biochemistry, 13(2):211-222, 1974; Chau and Fasman, Biochemistry, 13(2):222-245, 1974, Chou and Fasman, Biophys. J., 26(3):385-399, 1979]. 이들 중 어느 하나를, 경우에 따라, 미국특허 제 4,554,101 호의 호프의 교시를 모집하기 위해 사용할 수 있다.
임의의 주어진 자가면역 질병에 대해서 항원 MHC 복합체를 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 확인하고 사전-선택할 수 있다. 주어진 MHC 분자에 결합하는 것으로 공지된 정렬된 펩티드 세트로부터 유도된 연산이 존재하며, 이를 펩티드-MHC 결합 및 T-세포 에피토프 모두의 예측인자로서 사용할 수 있다. 예를 들어 문헌[참조: Reche and Reinherz (2007) Methods Mol. Biol. 409:185-200]을 참조하시오.
펩티드 외의 분자를 MHC 분자와의 복합체 중에 항원 또는 항원 단편으로서 사용할 수 있으며, 상기와 같은 분자는 비제한적으로 탄수화물, 지질, 소분자 등을 포함한다. 탄수화물은 다양한 세포의 외부 표면의 주성분이다. 몇몇 탄수화물은 상이한 분화 단계의 특징이며 매우 종종 이들 탄수화물은 특이적인 항체에 의해 인식된다. 별개의 탄수화물의 발현은 특정한 세포 유형으로 제한될 수 있다.
D. 기질/나노입자
몇몇 태양에서, 기질에 공유 또는 비-공유 결합할 수 있는 항원/MHC 복합체를 상기 기질에 작동적으로 커플링시킨다. 기질은 생체적합성 및/또는 생체흡수성 물질을 임의로 포함하는 나노입자의 형태일 수 있다. 상응하게, 하나의 실시태양에서, 상기 나노입자는 생체적합성 및/또는 생체흡수성이다. 또 다른 태양에서, 상기 나노입자는 고체 코어를 갖고/갖거나 리포솜이 아니다. 기질은 또한 앞서 미국특허 공보 제 2009/0155292 호에 개시된 것들과 같은 나노입자의 형태일 수 있다. 나노입자는 가변적인 치수의 구조를 가질 수 있으며 나노구, 나노입자 또는 생체적합성 생분해성 나노구 또는 생체적합성 생분해성 나노입자로서 다양하게 알려져 있다. 항원/MHC 복합체를 함유하는 상기와 같은 미립자 제형은 상기 나노입자에의 상기 복합체의 공유 또는 비-공유 커플링에 의해 형성될 수 있다.
나노입자는 전형적으로 실질적으로 구형인 코어 및 임의로 하나 이상의 층으로 이루어진다. 상기 코어는 크기 및 조성이 다양할 수 있다. 상기 코어 외에, 상기 나노입자는 관심 용도에 적합한 기능을 제공하기 위해 하나 이상의 층을 가질 수도 있다. 상기 층(존재하는 경우)의 두께는 특정 용도의 필요에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 층들은 유용한 광학 성질을 부여할 수 있다.
층들은 또한 화학적 또는 생물학적 기능(본 발명에서 화학 활성 또는 생물 활성층이라 지칭됨)을 부여할 수 있으며, 이러한 기능을 위해서 상기 층 또는 층들은 전형적으로 약 0.001 마이크로미터(1 나노미터) 내지 약 10 마이크로미터 이상의 두께 범위일 수 있고(목적하는 나노입자 직경에 따라), 이들 층을 전형적으로는 상기 나노입자의 외부 표면상에 적용한다.
상기 코어 및 층의 조성은 다양할 수 있다. 상기 입자 또는 코어에 적합한 물질은 비제한적으로 중합체, 세라믹, 유리, 광물질 등을 포함한다. 예로서 비제한적으로 표준 및 특수 유리, 실리카, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 아크릴 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 플루오로중합체, 실리콘, 셀룰로스, 규소, 금속(예를 들어 철, 금, 은), 광물질(예를 들어 루비), 나노입자(예를 들어 금 나노입자, 콜로이드 입자, 금속 산화물, 금속 황화물, 금속 셀레나이드, 및 자기 물질, 예를 들어 산화철), 및 이들의 합성물이 있다. 상기 코어는 목적하는 성질에 따라 균질한 조성을 갖거나, 또는 2개 이상 부류의 물질의 합성물일 수 있다. 몇몇 태양에서, 금속 나노입자가 사용될 것이다. 이들 금속 입자 또는 나노입자는 Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si, 및 In, 전구체, 이들의 2원 합금, 이들의 3원 합금 및 이들의 금속간 화합물로부터 형성될 수 있다. 미국특허 제 6,712,997 호를 참조하시오. 몇몇 실시태양에서, 상기 코어 및 층들의 조성은 상기 나노입자가 생체적합성이고 생체흡수성인 한 다양할 수 있다. 상기 코어는 목적하는 성질에 따라 균질한 조성을 갖거나, 또는 2개 이상 부류의 물질의 합성물일 수 있다. 몇몇 태양에서, 금속 나노구가 사용될 것이다. 이들 금속 나노입자는 Fe, Ca, Ga 등으로부터 형성될 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 나노입자는 금속 또는 산화금속, 예를 들어 금 또는 산화철을 포함하는 코어를 포함한다.
앞서 진술한 바와 같이, 상기 나노입자는 상기 코어 외에, 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 상기 나노입자는 생분해성 당 또는 다른 중합체로 이루어지는 층을 포함할 수 있다. 생분해성층의 예는 비제한적으로 덱스트란; 폴리(에틸렌 글리콜); 폴리(에틸렌 옥사이드); 만니톨; 폴리락티드(PLA), 폴리글리콜리드(PGA), 폴리카프로락톤(PCL) 기재 폴리(에스테르); PHB-PHV 부류의 폴리(하이드록스알카노에이트); 및 다른 변형된 폴리(사카라이드), 예를 들어 전분, 셀룰로스 및 키토산을 포함한다. 추가로, 상기 나노입자는 화학 결합 또는 커플링 부위에 화학 작용기를 부착시키기에 적합한 표면을 갖는 층을 포함할 수 있다.
층들을 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 다양한 방식으로 상기 나노입자상에 생성시킬 수 있다. 예로는 문헌[참조: Iler, Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979; Brinker and Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990)]에 개시된 바와 같은 졸-겔 화학 기법을 포함한다. 나노입자상의 층의 생성에 대한 추가적인 접근법은 하기의 문헌들에 개시된 바와 같은 표면 화학 및 캡슐화 기법을 포함한다: 문헌[참조: Partch and Brown, J. Adhesion, 67:259-276, 1998; Pekarek et al., Nature, 367:258, (1994); Hanprasopwattana, Langmuir, 12:3173-3179, (1996); Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270, (1998)]; 및 이들 문헌 중의 참고문헌들. 증착 기법을 또한 사용할 수 있다: 예를 들어 문헌[참조: Golman and Shinohara, Trends Chem. Engin., 6:1-6, (2000)]; 및 미국특허 제 6,387,498 호를 참조하시오. 더욱 다른 접근법은 예를 들어 문헌[Sukhorukov et al., Polymers Adv. Tech., 9(10-11):759-767, (1998)]; 문헌[Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, (1998)]; 문헌[Caruso et al., J.Amer. Chem. Soc., 121(25):6039-6046, (1999)]; 미국특허 제 6,103,379 호, 및 상기 문헌들 중에 인용된 참고문헌에 개시된 바와 같은 층 쌓기(layer-by-layer) 자기-조립 기법을 포함한다.
나노입자를 미국특허 제 4,589,330 호 또는 미국특허 제 4,818,542 호에 교시된 바와 같이 항원/MHC/공-자극 분자 복합체 및 중합체를 함유하는 수성 상을 비수성 상과 접촉시킨 다음 상기 비수성 상을 증발시켜 상기 수성 상으로부터 입자들을 유합시킴으로써 형성시킬 수 있다. 상기와 같은 제조에 바람직한 중합체는 젤라틴 한천, 전분, 아라비노갈락탄, 알부민, 콜라겐, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 글리콜리드-L(-)-락티드 폴리(엡실론-카프로락톤, 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-락트산), 폴리(엡실린-카프로락톤-CO-글리콜산), 폴리(β-하이드록시부티르산), 폴리(에틸렌 옥사이드), 폴리에틸렌, 폴리(알킬-2-시아노아크릴레이트), 폴리(하이드록시에틸 메트아크릴레이트), 폴리아미드, 폴리(아미노산), 폴리(2-하이드록시에틸 DL-아스파트아미드), 폴리(에스테르 우레아), 폴리(L-페닐알라닌/에틸렌 글리콜/1,6-디이소시아네이토헥산) 및 폴리(메틸 메트아크릴레이트)로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 천연 또는 합성 공중합체 또는 중합체이다. 특히 바람직한 중합체는 폴리에스테르, 예를 들어 폴리글리콜산, 폴리락트산, 글리콜리드-L(-) 락티드 폴리(엡실론-카프로락톤), 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-락트산) 및 폴리(엡실론-카프로락톤-CO-글리콜산)이다. 상기 중합체의 용해에 유용한 용매는 물, 헥사플루오로이소프로판올, 메틸렌클로라이드, 테트라하이드로푸란, 헥산, 벤젠 또는 헥사플루오로아세톤 세스퀴하이드레이트를 포함한다.
상기 나노입자의 크기는 약 1 ㎚ 내지 약 1 ㎛의 범위일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 나노입자는 직경이 약 1 ㎛ 미만이다. 다른 실시태양에서, 상기 나노입자는 직경이 약 500 ㎚ 미만, 약 400 ㎚ 미만, 약 300 ㎚ 미만, 약 200 ㎚ 미만, 약 100 ㎚ 미만, 또는 약 50 ㎚ 미만이다. 추가의 실시태양에서, 상기 나노입자는 직경이 약 1 ㎚ 내지 약 10 ㎚, 15 ㎚, 20 ㎚, 25 ㎚, 30 ㎚, 40 ㎚, 50 ㎚, 75 ㎚, 또는 100 ㎚ 이다. 특정한 실시태양에서, 상기 나노입자는 약 1 ㎚ 내지 약 100 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 약 1 ㎚ 내지 약 20 ㎚, 또는 약 5 ㎚ 내지 약 20 ㎚이다.
상기 복합체의 크기는 약 5 ㎚ 내지 약 1 ㎛의 범위일 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 상기 복합체는 직경이 약 1 ㎛ 미만 또는 한편으로 100 ㎚ 미만이다. 다른 실시태양에서, 상기 복합체는 직경이 약 500 ㎚ 미만, 약 400 ㎚ 미만, 약 300 ㎚ 미만, 약 200 ㎚ 미만, 약 100 ㎚ 미만, 또는 약 50 ㎚ 미만이다. 추가의 실시태양에서, 상기 복합체는 10 ㎚ 내지 약 50 ㎚, 또는 약 20 ㎚ 내지 약 75 ㎚, 또는 약 25 ㎚ 내지 약 60 ㎚, 또는 약 30 ㎚ 내지 약 60 ㎚, 또는 하나의 태양에서 약 55 ㎚이다.
E. 항원- MHC 복합체와 나노입자와의 커플링
기질 또는 나노구를 항원-MHC 복합체에 커플링시키기 위해서 하기의 기법들을 적용할 수 있다.
상기 결합을, 전형적으로 표면상에 "작용기"(상기 작용기는 항원-MHC 복합체에 결합할 수 있다)의 생성을 수반하는 기질 또는 나노입자의 화학적 변형에 의해, 및/또는 상기 기질 또는 나노입자의 임의로 화학적으로 변형된 표면을 공유 또는 비-공유 결합된 소위 "결합 분자"와 연결시킨 다음 상기 항원-MHC 복합체를 상기 수득된 나노입자와 반응시킴으로써 생성시킬 수 있다.
"결합 분자"란 용어는 기질 또는 나노입자와 결합할 수 있고 항원-MHC 복합체에 또한 결합할 수 있는 물질을 의미한다. 몇몇 실시태양에서, 상기 항원-MHC 복합체는 링커에 의해 상기 나노입자에 커플링된다. 적합한 링커의 비제한적인 예는 도파민(DPA)-폴리에틸렌 글리콜(PEG) 링커, 예를 들어 DPA-PEG-NHS 에스테르, DPA-PEG-오쏘피리딜-디설파이드(OPSS) 및/또는 DPA-PEG-아지드를 포함한다. 다른 링커는 펩티드 링커, 에틸렌 글리콜, 비오틴 및 스트렙트아비딘을 포함한다.
이전에 본 발명에 사용된 바와 같은 "작용기"란 용어는 공유 결합을 형성하는 반응성 화학 기로 제한되지 않고, 상기 항원-MHC 복합체와의 이온 상호작용 또는 수소 결합을 유도하는 화학 기를 포함한다. 더욱이, 표면에서 생성된 "작용기"와 "작용기"를 갖는 결합 분자간의 엄격한 구별은 가능하지 않은데, 그 이유는 때때로 상기 표면의 변형이 보다 작은 결합 분자들, 예를 들어 에틸렌 글리콜과 상기 나노구 표면과의 반응을 요구하기 때문임을 알아야 한다.
상기 작용기 또는 상기 작용기를 갖는 결합 분자는 아미노기, 카본산기, 티올, 티오에테르, 디설파이드, 구아니디노, 하이드록실기, 아민기, 인접하는 디올, 알데하이드, 알파-할로아세틸기, 수은 오가닐, 에스테르기, 산 할라이드, 산 티오에스테르, 산 무수물, 이소시아네이트, 이소티오시아네이트, 설폰산 할라이드, 이미도에스테르, 디아조아세테이트, 디아조늄염, 1,2-디케톤, 포스폰산, 인산 에스테르, 설폰산, 아졸리드, 이미다졸, 인돌, N-말레이미드, 알파-베타-불포화된 카보닐 화합물, 아릴할로게나이드 및 이들의 유도체 중에서 선택될 수 있다.
보다 고분자량의 다른 결합 분자에 대한 비제한적인 예는 핵산 분자, 중합체, 공중합체, 중합성 커플링제, 실리카, 단백질, 및 상기 기질 또는 나노입자에 대해 상반된 극성을 갖는 표면을 갖는 쇄-형 분자이다. 핵산은, 결합 분자에 대해 상보성 서열이 있다 하더라도, 상기 핵산 분자 자체를 함유하는 친화성 분자에 결합을 제공할 수 있다.
공유 링커의 구체적인 예는 폴리(에틸렌)글리콜(PEG), 예를 들어 기능화된 PEG를 포함한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "기능화된 PEG"는 말단 작용기를 포함하는 PEG 부분을 지칭하며, 상기 작용기의 비제한적인 예는 아미노, 머캅토, 티오에테르, 카복실 등을 포함한다. 다양한 나노입자 코어상의 기능화된 PEG 링커의 비제한적인 예를 첨부된 표 1 및 2에 제공하며, 예를 들어 PEG 링커 티올-PEG-NH2 링커가 있다.
몇몇 실시태양에서, 본 발명에 개시된 바와 같은 링커는 한정된 크기를 갖는다. 일부 실시태양에서, 상기 링커는 약 10 kD 미만, 약 5 kD 미만, 약 4.5 kD 미만, 약 4 kD 미만, 약 3.5 kD 미만, 약 3 kD 미만, 약 2.5 kD 미만, 약 2 kD 미만, 또는 약 1 kD 미만이다. 추가의 실시태양에서, 상기 링커는 약 0.5 kD 내지 약 5, 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2, 1.5 또는 1 kD이다. 더욱 추가의 실시태양에서, 상기 링커는 약 1 내지 약 4.5, 4, 3.5, 3, 2.5, 2 또는 1.5 kD이다.
중합성 커플링제의 예로서, 디아세틸렌, 스티렌 부타디엔, 비닐아세테이트, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 비닐 화합물, 스티렌, 실리콘 옥사이드, 산화붕소, 산화인, 보레이트, 피롤, 폴리피롤 및 포스페이트를 인용할 수 있다.
상기 기질 또는 나노입자의 표면을 예를 들어 반응성 작용기를 갖는 포스폰산 유도체의 결합에 의해 화학적으로 변형시킬 수 있다. 이러한 포스폰산 또는 포스폰산 에스테르 유도체의 일례는 "만니히-모에드리처(Mannich-Moedritzer)" 반응에 따라 합성될 수 있는 이미노-비스(메틸렌포스포노)카본산이다. 상기 결합 반응을 상기 제조 과정으로부터 또는 전처리(예를 들어 트리메틸실릴 브로마이드에 의한) 후에 직접 수득되는 바와 같은 기질 또는 나노구로 수행할 수 있다. 첫 번째 경우에 상기 포스폰산(에스테르) 유도체는 예를 들어 여전히 상기 표면에 결합되어 있는 반응 매질의 성분들을 치환시킬 수 있다. 이러한 치환은 보다 높은 온도에서 증대될 수 있다. 다른 한편으로, 트리메틸실릴 브로마이드는 알킬기-함유 인-기재 착화제를 데알킬화시켜, 상기 포스폰산(에스테르) 유도체에 새로운 결합 부위를 생성시키는 것으로 여겨진다. 상기 포스폰산(에스테르) 유도체, 또는 상기에 결합된 결합 분자는 상기에 제공된 바와 동일한 작용기를 나타낼 수 있다. 상기 기질 또는 나노구의 표면 처리의 추가의 예는 에틸렌 글리콜과 같은 디올 중에서의 가열을 수반한다. 상기 처리는 이미 디올 중에서 합성이 진행된 경우 잉여일 수 있음을 알아야 한다. 이러한 상황하에서 상기 직접 수득된 합성 생성물은 필요한 작용기를 나타내는 듯하다. 그러나 상기 처리를 N- 또는 P-함유 착화제 중에서 생성된 기질 또는 나노입자에 적용할 수 있다. 상기와 같은 기질 또는 입자에 에틸렌 글리콜에 의한 후처리가 가해지는 경우, 상기 표면에 여전히 결합하고 있는 반응 매질의 성분들(예를 들어 착화제)은 상기 디올에 의해 치환되고/되거나 데알킬화될 수 있다.
상기 입자 표면에 여전히 결합된 N-함유 착화제를 제2 작용기를 갖는 1차 아민 유도체로 치환시키는 것이 또한 가능하다. 상기 기질 또는 나노입자의 표면을 또한 실리카로 코팅시킬 수 있다. 실리카는 유기 링커, 예를 들어 트리에톡시실란 또는 클로로실란과 쉽게 반응하기 때문에 유기 분자의 비교적 간단한 화학적 접합을 허용한다. 상기 나노입자 표면을 또한 단독- 또는 공중합체에 의해 코팅시킬 수 있다. 중합성 커플링제의 예는 N-(3-아미노프로필)-3-머캅토벤즈아미딘, 3-(트리메톡시실릴)프로필히드라지드 및 3-트리메톡시실릴)프로필말레이미드이다. 중합성 커플링제의 다른 비제한적인 예는 본 발명에 언급되어 있다. 이들 커플링제를 코팅층으로서 생성되는 공중합체의 유형에 따라 단독으로 또는 함께 사용할 수 있다.
산화성 전이금속 화합물을 함유하는 기질 또는 나노입자와 함께 사용될 수 있는 또 다른 표면 변형 기법은 염소 기체 또는 유기 염소화제에 의해 상기 산화성 전이금속 화합물을 상응하는 옥시클로라이드로 전환시키는 것이다. 이들 옥시클로라이드는 친핵체, 예를 들어 생물분자에서 종종 발견되는 바와 같은 하이드록시 또는 아미노기와 반응할 수 있다. 상기 기법은 예를 들어 리신 측쇄의 아미노기를 통한 단백질과의 직접 접합이 생성될 수 있게 한다. 옥시클로라이드에 의한 표면 변형 후 단백질과의 접합은 또한 2기능성 링커, 예를 들어 말레이미도프로피온산 히드라지드의 사용에 의해 수행될 수 있다.
비공유 결합 기법의 경우, 상기 기질 또는 나노구 표면의 경우와 상반되는 극성 또는 전하를 갖는 쇄-형 분자가 특히 적합하다. 코어/쉘 나노구에 비-공유 결합될 수 있는 결합 분자의 예는 음이온성, 양이온성 또는 쯔비터이온성 계면활성제, 산성 또는 염기성 단백질, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리설폰 또는 폴리카복실산을 포함한다. 기질 또는 나노구와 반응성 작용기를 갖는 양친성 시약간의 소수성 상호작용은 필요한 결합을 생성시킬 수 있다. 특히, 서로 가교결합될 수 있는 양친성 특징을 갖는 쇄-형 분자, 예를 들어 인지질 또는 유도체화된 폴리사카라이드가 유용하다. 상기 표면상의 이들 분자의 흡수는 공-항온처리에 의해 성취될 수 있다. 친화성 분자와 기질 또는 나노입자간의 결합은 또한 비공유성, 자기-조직화 결합에 기반할 수 있다. 그의 일례는 결합 분자로서 비오틴을 갖는 단순한 검출 탐침 및 아비딘- 또는 스트렙트아비딘-커플링된 분자를 포함한다.
생물 분자에의 작용기의 커플링 반응에 대한 프로토콜을 예를 들어 문헌[참조: Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press 1996]에서 찾을 수 있다. 상기 생물 분자(예를 들어 MHC 분자 또는 그의 유도체)를 산화, 할로겐화, 알킬화, 아실화, 부가, 치환 또는 아미드화와 같은 유기 화학의 표준 과정에 따라, 상기 결합 분자에 공유 또는 비공유적으로 커플링시킬 수 있다. 이러한 상기 공유 또는 비공유 결합된 결합 분자의 커플링 방법을, 상기 결합 분자를 상기 기질 또는 나노구에 커플링시키기 전에 또는 그 후에 적용할 수 있다. 더욱이, 배양에 의해, 상응하게 전-처리된 기질 또는 나노입자(예를 들어 트리메틸실릴 브로마이드에 의해)(상기 입자는 상기 전처리에 기인하여 변형된 표면(예를 들어 보다 높은 전하 또는 극성 표면)을 나타낸다)에 대한 분자의 직접적인 결합을 수행할 수 있다.
F. 단백질 생성
본 발명은 본 발명의 다양한 실시태양들에 사용하기 위한 폴리펩티드, 펩티드 및 단백질을 개시한다. 예를 들어, 특정한 펩티드 및 그의 복합체를 면역 반응을 이끌어내거나 조절하는 그의 능력에 대해 분석한다. 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 펩티드 또는 단백질 중 일부 또는 전부를 또한 통상적인 기법에 따라 용액 중에서 또는 고체 지지체상에서 합성할 수 있다. 다양한 자동 합성기를 상업적으로 입수할 수 있으며 공지된 프로토콜에 따라 사용할 수 있다. 예를 들어 하기의 문헌들을 참조하시오: 문헌[참조: Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Ed., Pierce Chemical Co.l, (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232(4748):341-347, (1986); and Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meinhofer (Eds.), Academic Press, NY, 1-284, (1979)](이들 문헌은 각각 본 발명에 참고로 인용된다). 한편으로, 재조합 DNA 기술을 사용할 수 있으며, 여기에서 본 발명의 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현 벡터에 삽입하거나, 적합한 숙주 세포내로 형질전환시키거나 형질감염시키고, 발현에 적합한 조건하에서 배양한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 단백질의 생성을 위한, 미생물을 포함한 세포로의 유전자 전달의 용도를 포함한다. 관심 단백질에 대한 유전자를 적합한 숙주 세포로 전달한 다음 세포를 적합한 조건하에서 배양할 수 있다. 실질적으로 임의의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 사용할 수 있다. 재조합 발현 벡터의 생성, 및 상기에 포함되는 요소들은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며 여기에서 짧게 논의한다. 포유동물 숙주 세포주의 예는 비제한적으로 ero 및 HeLa 세포, 다른 B- 및 T-세포주, 예를 들어 CEM, 721.221, H9, 주르캣(Jurkat), 라지(Raji)뿐만 아니라 중국 햄스터 난소(CHO), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포의 세포주를 포함한다. 또한, 숙주 세포 균주를, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 유전자 산물을 목적하는 방식으로 변형시키고 가공하도록 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 상기와 같은 변형(예를 들어 글리코실화) 및 가공(예를 들어 절단)은 상기 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질의 번역후 가공 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 갖는다. 적합한 세포주 또는 숙주 시스템을 발현되는 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공이 보장되도록 선택할 수 있다.
다수의 선택 시스템, 예를 들어 비제한적으로 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포 중에 HSV 티미딘 키나제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제, 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자를 사용할 수 있다. 또한, 대사길항물질 내성을 선택의 기준으로서 사용할 수 있다: dhfr의 경우, 트리메토프림 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하고; gpt는 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하고; neo는 아미노글리코시드 G418에 대한 내성을 부여하고; hygro는 하이그로마이신에 대한 내성을 부여한다.
G. 핵산
본 발명은 본 발명의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 항원 펩티드를 암호화하는 것들을 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명은 자가항원 및/또는 MHC 분자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산 분절 및 재조합 벡터에 관한 것이다. "재조합"이란 용어는 폴리펩티드 또는 특정한 폴리펩티드의 명칭과 함께 사용될 수 있으며, 일반적으로 시험관내에서 조작되었거나 핵산 분자의 복제 산물인 상기 핵산 분자로부터 생성된 폴리펩티드를 지칭한다.
본 발명에 사용된 핵산 분절은 그의 암호화 서열의 길이와 관계없이, 다른 핵산 서열, 예를 들어 프로모터, 폴리아데닐화 신호, 첨가 제한 효소 부위, 다수의 클로닝 부위, 다른 암호화 분절 등과 병용될 수 있으며, 따라서 그의 전체 길이는 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편을 사용할 수 있는 것으로 생각되며, 이때 전체 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 목적하는 재조합 핵산 프로토콜에서의 용도에 의해 제한된다. 일부의 경우에, 핵산 서열은 예를 들어 폴리펩티드의 정제, 수송, 분비, 번역후 변형, 또는 표적화 또는 효능과 같은 치료 이점이 허용되도록 추가적인 이종 암호화 서열과 함께 폴리펩티드 서열을 암호화할 수 있다. 태그 또는 다른 이종 폴리펩티드를 상기 변형된 폴리펩티드-암호화 서열에 가할 수 있으며, 여기에서 "이종"은 상기 변형된 폴리펩티드와 동일하지 않은 폴리펩티드를 지칭한다.
V. 약학 조성물 및 투여
본 발명에서 질병의 치료에 유용한 약학 조성물을 제공한다.
A. 약학 조성물
항원-MHC 나노입자 복합체를 단독으로, 또는 조성물 중에서 담체, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 투여할 수 있다. 본 발명의 조성물을 통상적으로는 비경구로, 주사에 의해, 예를 들어 정맥내, 피하, 또는 근육내로 투여할 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 추가적인 제형은 경구 제형을 포함한다. 경구 제형은 통상적으로 사용되는 부형제, 예를 들어 약제 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형 또는 분말의 형태를 취하며 약 10% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 함유한다. 피험자의 면역 상태를 변형시키는 항원-MHC-나노입자 복합체를 함유하는 수성 조성물 제제는 본 명세에 비추어 당해 분야의 숙련가들에게 공지될 것이다. 몇몇 실시태양에서, 조성물은 흡입될 수도 있다(예를 들어 내용 전체가 본 발명에 구체적으로 참고로 인용된 미국특허 제 6,651,655 호). 하나의 실시태양에서, 상기 항원-MHC-나노입자 복합체는 전신적으로 투여된다.
전형적으로, 본 발명의 조성물은 투여량 제형에 적합한 방식으로, 및 치료학적으로 유효하고 면역 변형되는 바와 같은 양으로 투여된다. 상기 투여되는 양은 치료하려는 피험자에 따라 변한다. 투여에 필요한 활성 성분의 정확한 양은 의사의 판단에 따라 변한다. 그러나, 적합한 투여량 범위는 투여당 10 내지 수백 나노그램 또는 마이크로그램 정도의 항원-MHC-나노입자 복합체이다. 초기 투여 및 추가투여에 적합한 섭생이 또한 가변적이나, 전형적으로는 초기 투여에 이어서 후속 투여된다.
다수의 경우에, 펩티드-MHC-나노입자 복합체를 약, 기껏해야 약 또는 적어도 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 이상 수회 투여하는 것이 바람직하다. 상기 투여 범위는 통상적으로 2일 내지 12주 간격, 보다 대개는 1 내지 2주 간격일 것이다. 0.25 내지 5년, 대개는 2년의 주기적인 추가투여가 상기 면역계의 상태를 유지시키는데 바람직할 수 있다. 상기 투여 과정에 이어서 염증성 면역 반응 및/또는 자가조절성 T 세포 활성에 대한 분석을 수행한다.
일부 실시태양에서, 약학 조성물을 피험자에게 투여한다. 본 발명의 상이한 태양은 유효량의 항원-MHC-나노입자 복합체 조성물을 피험자에게 투여함을 수반한다. 추가로, 상기와 같은 조성물을 면역계의 변형인자와 함께 투여할 수 있다. 상기와 같은 조성물을 일반적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에 용해시키거나 분산시킬 것이다.
"약학적으로 허용 가능한" 또는 "약물학적으로 허용 가능한"이란 어구는 동물 또는 인간에 투여될 때 부작용, 알러지 반응 또는 다른 부적합한 반응을 생성시키지 않는 분자 존재 및 조성물을 지칭한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 상기와 같은 매질 및 약학적으로 활성 물질의 작용제의 사용은 당해 분야에 주지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 상기 활성 성분과 배합 금기인 경우를 제외하고, 면역원성 및 치료학적 조성물에서의 그의 사용이 고려된다.
주사용으로 적합한 약제 형태는 멸균 수용액 또는 분산액; 참깨유, 땅콩유, 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사성 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 상기 형태는 멸균되어야 하며 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 상기는 또한 제조 및 보관 조건하에서 안정성이어야 하며 미생물, 예를 들어 세균 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
상기 조성물을 중성 또는 염 형태로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노기와 형성된)을 포함하며, 무기산, 예를 들어 염산 또는 인산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 형성된다. 유리 카복실기와 형성된 염이 또한 무기 염기, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화 제2철, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
상기 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리(에틸렌 글리콜) 등, 이들의 적합한 혼합물 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 일어날 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어 당 또는 염화 나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사성 조성물의 연장된 흡수는 상기 조성물 중에 흡수 지연제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 일어날 수 있다.
멸균 주사성 용액은 상기 활성 화합물을 필요에 따라 상기 열거한 다양한 다른 성분들과 함께 적합한 용매 중에서 필요한 양으로 혼입시킴으로써 제조한 다음 멸균시킨다. 상기 용액의 멸균은 상기 항원-MHC-나노입자 복합체의 치료학적 성질을 감소시키지 않도록 하는 방식으로 수행될 것이다. 일반적으로, 분산액은 상기 양한 멸균된 활성 성분들을, 염기성 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중에서 필요한 다른 성분들을 함유하는 멸균 비히클에 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사성 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조 방법은 앞서 멸균된 용액으로부터 임의의 추가적인 목적하는 성분들과 함께 상기 활성 성분의 분말을 제공하는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다. 상기 용액의 하나의 상기와 같은 멸균 방법은 멸균 여과이나, 본 발명은 상기 항원-MHC-나노입자 복합체의 치료학적 성질을 현저하게 감소시키지 않는 임의의 멸균 방법을 포함하고자 한다. 집중적인 열 및 압력을 수반하는 멸균 방법, 예를 들어 오토클레이빙은 상기 복합체의 3차 구조를 손상시킬 수 있으며, 따라서 상기 항원-MHC-나노입자 복합체의 치료학적 성질을 현저하게 감소시킬 수 있다.
치료 조성물의 유효량을 의도된 목적에 기반하여 결정한다. "단위 용량" 또는 "투여량"이란 용어는 피험자에 사용하기에 적합한 물리적으로 별개의 단위를 지칭하며, 각 단위는 조성물의 투여, 즉 적합한 경로 및 섭생과 관련하여 상기 논의된 목적하는 반응을 생성시키도록 계산된 소정량의 상기 조성물을 함유한다. 치료 회수 및 단위 용량 모두에 따른 상기 투여량은 목적하는 결과 및/또는 보호에 따라 변한다. 상기 조성물의 정확한 양은 또한 의사의 판단에 따라 변하며 각 개인에 따라 고유하다. 용량에 영향을 미치는 인자는 피험자의 신체 및 임상 상태, 투여 경로, 의도하는 치료 목적(증상의 경감 대 치유), 및 특정 조성물의 효능, 안정성, 및 독성을 포함한다. 제형화시, 용액을 상기 투여량 제형에 적합한 방식으로, 및 치료학적으로 또는 예방학적으로 유효한 바와 같은 양으로 투여할 것이다. 상기 제형을 다양한 투여형들로, 예를 들어 상술한 주사성 용액의 형태로 쉽게 투여한다.
B. 복합 요법
본 발명의 조성물 및 관련 방법, 특히 항원-MHC-나노입자 복합체의 투여를 또한 전통적인 치료법의 투여와 함께 사용할 수도 있다. 여기에는 비제한적으로 아보넥스(인터페론 베타-1a), 베타세론(인터페론 베타-1b), 코팍손(글라티라머 아세테이트), 노반트론(미톡산트론), 레비프(인터페론 베타-1a), 티사브리(나탈리주맵), 길렌야(핑고리모드), 글라티라머, 스테로이드, 사이톡산, 이뮤란, 바클로펜, 심부 뇌 자극, 암피라(달팜프리딘), 침술, 및 물리적 요법을 포함한다.
복합 요법을 사용하는 경우, 다양한 조합들을 사용할 수 있다, 예를 들어 항원-MHC-나노입자 복합체 투여는 "A"이고 추가적인 작용제는 "B"이다:
Figure pct00002
본 발명의 펩티드-MHC 복합체 조성물의 환자/피험자에의 투여는, 독성(존재하는 경우)을 고려하여, 상기와 같은 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜에 따를 것이다. 상기 치료 주기는 필요한대로 반복될 수 있을 것으로 예상된다. 또한 다양한 표준 치료법들, 예를 들어 수화를 상기 개시된 치료법과 함께 적용할 수 있음이 고려된다.
C. 시험관내 또는 생체외 투여
본 발명에 사용되는 바와 같이, 시험관내 투여란 용어는 피험자로부터 또는 상기 피험자의 외부에서 제거된 세포, 예를 들어 비제한적으로 배양물 중의 세포상에서 수행되는 조작을 지칭한다. 생체외 투여란 용어는 시험관내에서 조작되었고 후속으로 피험자에게 투여되는 세포를 지칭한다. 생체내 투여란 용어는 투여를 포함하여 모든 조작을 피험자 내부에서 수행함을 포함한다.
본 발명의 몇몇 태양에서, 상기 조성물을 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 투여할 수 있다. 몇몇 시험관내 실시태양에서, 자기조직 T 세포를 본 발명의 조성물과 항온처리한다. 이어서 상기 세포 또는 조직을 시험관내 분석, 또는 한편으로 생체외 투여에 사용할 수 있다.
VI. 실시예
하기의 실시예들을 본 발명의 다양한 실시태양을 예시하기 위해 제공하며 이들 실시예는 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하고자 하지 않는다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명이 상기 목적을 수행하고 언급된 결과 및 이점뿐만 아니라 본 발명 고유의 목적, 결과 및 이점을 획득하기에 매우 적합함을 쉽게 알 것이다. 본 실시예들은 본 발명에 개시된 방법들과 함께 현재의 실시태양들을 나타내고 예시적이며, 본 발명의 범위에 대한 제한을 의도하지 않는다. 상기 중의 변화 및 청구범위의 범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 진의내에 포함된 다른 용도들은 당해 분야의 숙련가들에게 떠오를 것이다.
실시예 1. pMHC 나노입자의 제조 및 분석
pMHC 생성
2가지 상이한 방법을 사용하여 재조합 pMHC 부류 I 복합체를 발현시켰다. 첫 번째는 펩티드의 존재하에서 세균 중에서 발현된 MHC 부류 I 중쇄 및 경쇄를 리-폴딩한 다음, 젤 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제시킴을 수반하였다(문헌[참조: Garboczi, D.N. et al. (1992) Proc Natl. Acad Sci USA 89:3429-3433; Altman, J.D. et al. (1996) Science 274:94-96]에 개시됨). 두 번째는 MHC 부류 I 복합체를, 펩티드-암호화 서열, MHC 부류 I 경쇄 및 중쇄가 가요성 GS 링커[참조: Yu, Y.Y. et al.(2002) J Immunol 168:3145-3149]에 이어서 BirA 부위를 암호화하는 카복시말단 링커, 유리 Cys로 끝나는 6xHis 태그로 연속적으로 속박된 단쇄 구조물로서 렌티바이러스-형질도입된 자유형 CHO 세포에서 고 수율로 발현시킴을 수반하였다. 상기 분비된 단백질을 니켈 컬럼 및 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 배양물 상등액으로부터 정제하고 NP 코팅에 바로 사용하거나 또는 형광색소-접합된 스트렙트아비딘을 사용하여 비오틴화시켜 pMHC 사량체를 생성시켰다. IGRP206 -214 자가항원 펩티드 또는 그의 모사체 NRP-V7을 암호화하는 전형적인 단쇄 pMHC 복합체를 사용하여 생성시킨 사량체는 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같이 동족 단클론 자가반응성 CD8+ T-세포에 효율적으로 결합하지만 그의 다클론 대응물(도시 안 됨)에는 결합하지 않는다.
재조합 pMHC 부류 II 단량체는 처음에는 앞서 개시된 바와 같이 각각 c-Jun 또는 c-Fos 류신 지퍼를 갖는 I-Aβ 및 I-Aα 쇄 및 BirA 및 6xHis 태그를 암호화하는 구조물로 형질감염된 드로소필라 SC2 세포로부터 정제되었다[참조: Stratmann, T. et al. (2000) J Immunol 165:3214-3225, Stratmann, T. et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:3214-3225]. 상기 접근법의 수율이 일반적으로 낮고 시간-소모적이었기 때문에, 출원인은 상기 복합체의 펩티드-IAβ 및 IAα 쇄가 리보솜 스키핑 P2A 서열[참조: Holst, J. et al. (2006) Nat Protoc 1:406-417]에 의해 분리되는 단일시스트론 전령을 암호화하는 렌티바이러스로 형질도입된 자유형 CHO 세포에서의 발현 시스템을 개발하였다. 상술한 단쇄 pMHC 부류 I 구조물의 경우와 같이, BirA 부위, 6xHis 태그 및 유리 Cys를 암호화하는 링커를 상기 구조물의 카복시말단 단부에 가하였다. 자기-조립된 pMHC 부류 II 복합체를 니켈 크로마토그래피에 이어서 음이온 교환에 의해 상기 세포 배양 상등액으로부터 정제하고 NP상의 코팅에 사용하거나 또는 상술한 바와 같이 비오틴화 및 사량체 형성을 위해 가공한다. 2.5 mi 자가항원 펩티드를 암호화하는 전형적인 pMHC 부류 II 복합체를 사용하여 생성시킨 pMHC 부류 II 사량체는 유식 세포측정에 의해 측정된 바와 같이, 동족 단클론 자가반응성 CD4+ T-세포에 의해 특이적이고 효율적으로 결합된다.
pMHC 사량체 염색
PE-접합된 TUM-H-2Kd, NRP-V7-H-2Kd, IGRP206 -214-H-2Kd, HEL14 -22/IAg7 및 BDC2.5mi/IAg7 사량체를 개시된 바와 같이 비오틴화된 pMHC 단량체를 사용하여 제조하였다[참조: Stratmann, T. et al. (2000) J Immunol 165:3214-3225; Stratmann, T. et al. (2003) J. Clin. Invest. 112:3214-3225; Amrani, A. et al. (2000) Nature 406:739-742]. 말초 혈액 단핵세포, 비장세포 및 림프절 CD8+ 또는 CD4+ T-세포를 4 ℃에서 1시간 동안 FACS 완충제(PBS 중의 0.1% 나트륨 아지드 및 1% FBS) 중의 사량체(5 ug/㎖)로 염색하고, 세척하고, 4 ℃에서 30분 동안 FITC-접합된 항-CD8α 또는 항-CD4(5 ㎍/㎖) 및 PerCP-접합된 항-B220(2 ㎍/㎖; '덤' 게이트로서)과 항온처리하였다. 세포를 세척하고, 1% PFA/PBS 중에 고정시키고 FACS에 의해 분석하였다.
NP 합성
금 나노입자(GNP)를 개시된 바와 같이 나트륨 시트레이트에 의한 염화금의 화학적 환원을 사용하여 합성하였다[참조: Perrault, S.D. et al. (2009) Nano Lett 9:1909-1915]. 간단히, 2 ㎖의 1% HAuCl4(시그마 알드리치)를 격렬한 교반하에 100 ㎖ H2O에 가하고 상기 용액을 오일욕에서 가열하였다. 6(14 ㎚ GNP의 경우) 또는 2 ㎖(40 ㎚ GNP의 경우)의 1% Na 시트레이트를 비등하는 HAuCl4 용액에 가하였으며, 이를 추가로 10분 동안 교반하고 이어서 실온으로 냉각시켰다. GNP를 pMHC의 수용체로서 -COOH 또는 -NH2 기로 기능화된 1 uMol의 티올-PEG 링커(Nanocs, MA)를 가하여 안정화시켰다(표 1 및 2). Peg화된 GNP를 물로 세척하여 유리 티올-PEG를 제거하고, 농축시키고 추가의 분석을 위해 수중에 보관하였다. NP 밀도를 분광광도측정을 통해 비어(Beer)의 법칙에 따라 계산하였다.
SFP 시리즈 산화철 NP(SFP IONP)를 계면활성제의 존재하에 유기 용매 중의 철 아세테이트의 열분해에 의해 생성시키고, 이어서 peg화에 의해 수성 완충제 중의 용매가 되게 하였다[참조: Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014; Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56:821-826]. 간단히, 2 mMol Fe(acac)3(시그마 알드리치, 캐나다 온타리오주 오크빌 소재)를 10 ㎖의 벤질 에테르 및 올레일아민의 혼합물에 용해시키고 1 시간 동안 100 ℃로 가열한 다음 질소 블랭킷의 보호하에 환류하에서 2시간 동안 300 ℃로 가열하였다. 합성된 NP를 에탄올의 첨가에 의해 침전시키고 헥산에 재현탁시켰다. 상기 IONP의 peg화를 위해서, 100 ㎎의 상이한 3.5 kDa DPA-PEG 링커(표 1에서 S1-S5; 젠켐 테크(Jenkem Tech) USA)를 CHCl3 및 HCON(CH3)2(DMF)의 혼합물에 용해시켰다. 이어서 상기 NP 용액(20 ㎎ Fe)을 상기 DPA-PEG 용액에 가하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다. peg화된 SFP NP를 헥산의 첨가에 의해 밤새 침전시키고 이어서 수중에 재현탁시켰다. 잔량의 응집체를 고속 원심분리(20,000xg, 30분)에 의해 제거하고, 단분산성 SFP NP를 추가의 특성화 및 pMHC 접합을 위해 수중에서 보관하였다. IONP 생성물 중의 철의 농도를 2N HCl 중에서 A410에서 분광광도측정에 의해 측정하였다. SFP NP의 분자 구조 및 직경(Fe3O4; 8+1 ㎚ 직경) (Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014)을 근거로, 출원인은 1 ㎎의 철을 함유하는 SFP 용액이 5 x 1014 NP를 함유함을 추정하였다.
출원인은 후속으로 계면활성제의 완벽한 부재하에서 또한 열분해에 의해, 그러나 단일 단계로, peg화된 IONP의 형성을 허용하는 새로운 IONP 디자인을 개발하였다(PF 시리즈 IONP). 상기 새로운 디자인에서, PEG 분자를 환원시약 및 계면활성제 모두로서 사용하였다. 전형적인 반응에서, 3 g PEG(2 kDa)를 100 ℃에서 50 ㎖ 환저 비등 플라스크 중에서 서서히 용융시키고 이어서 7 ㎖의 벤질 에테르 및 2 mMol Fe(acac)3와 혼합하였다. 상기 반응물을 1시간 동안 격렬히 교반하고 추가로 2시간 동안 환류하에 260 ℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 원심분리 튜브로 옮기고 30 ㎖의 물과 혼합하였다. 불용성 물질을 2,000xg에서 30분 동안 원심분리에 의해 제거하였다. 유리 PEG 분자를 아미콘(Amicon)-15 필터(MWCO 100 kDa, 밀리포어(Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카 소재)를 통한 한외여과에 의해 제거하였다. 출원인은 상기 시험된 PEG 분자의 대부분(전부는 아니지만)을 갖는 IONP를 생성시킬 수 있었다(표 1, P1-P5). 상기 IONP의 크기는 상기 열분해 반응에 사용된 PEG 링커의 작용기에 따라 변하였다(표 1 및 2). 상기 NP를 자기(MACS) 컬럼(밀테니 바이오텍(Milteny Biotec), 미국 캘리포니아주 어번 소재) 또는 IMag 세포 분리 시스템(BD 바이오사이언시즈, 캐나다 온타리오주 미시소가 소재)을 사용하여 쉽게 정제시킬 수 있었다. 상기 정제된 IONP를 임의의 검출 가능한 응집 없이 실온 또는 4 ℃에서 수중에 또는 다양한 완충제(pH 5 내지 10) 중에 보관하였다. NP 밀도를 SFP NP에 대해 상술한 바와 같이 계산하였다.
NP의 pMHC 접합
원위-NH2 또는 -COOH 기를 갖는 PEG 링커에 의해 생성된 NP에의 pMHC 접합을 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)의 존재하에서 아미드 결합의 형성을 통해 성취하였다. -COOH 기를 갖는 NP(GNP-C, SFP-C 및 PF-C, 표 2)를 먼저 20 mM MES 완충제, pH 5.5에 용해시켰다. N-하이드록시설포숙신이미드 나트륨 염(설파-NHS, 써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월썸 소재, 최종 농도 10 mM) 및 EDC(써모 사이언티픽, 미국 매사추세츠주 월썸 소재, 최종 농도 1 mM)를 상기 NP 용액에 가하였다. 실온에서 20분 교반 후에, 상기 NP 용액을 20 mM 보레이트 완충제(pH 8.2)에 용해된 pMHC 단량체를 함유하는 용액에 적가하였다. 혼합물을 추가로 4시간 동안 교반하였다. pMHC를 NH2-기능화된 NP(GNP-N, SFP-N 및 PF-N, 표 2)에 접합시키기 위해서, pMHC 복합체를 먼저 100 mM NaCl을 함유하는 20 mM MES 완충제, pH 5.5에 용해시켰다. 이어서 설파-NHS(10 mM) 및 EDC(5 mM)를 상기 pMHC 용액에 가하였다. 이어서 활성화된 pMHC 분자를 20 mM 보레이트 완충제(pH 8.2) 중의 NP 용액에 가하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
말레이미드-기능화된 NP(SFP-M 및 PF-M, 표 2 및 도 1C)에 pMHC를 접합시키기 위해서, pMHC 분자를 먼저 실온에서 4시간 동안 트리부틸포스핀(TBP, 1 MM)과 항온처리하였다. 이어서 유리 카복시말단 Cys 잔기를 암호화하도록 조작된 pMHC를 2 mM EDTA, 150 mM NaCl을 함유하는 40 mM 포스페이트 완충제, pH 6.0 중에서 NP와 혼합하고, 실온에서 밤새 항온처리하였다. pMHC를 말레이미드기와 Cys 잔기간의 탄소-설파이드 결합의 형성을 통해 NP와 공유 결합시켰다.
클릭 화학을 사용하여 pMHC 또는 아비딘을 아지드 기로 기능화된 NP에 접합시켰다(SFP-Z, 표 2). 상기 반응을 위해서, pMHC 또는 아비딘 분자를 먼저 실온에서 2시간 동안 디벤조사이클로옥틸[DBCO, 클릭 케미스트리 툴스(Click Chemistry Tools), 미국 애리조나주 스콧데일 소재] 시약과 함께 항온처리하였다. 유리 DBCO 분자를 밤새 투석에 의해 제거하였다. 이어서 pMHC- 또는 아비딘-DBCO 접합체를 2시간 동안 SFP-Z와 항온처리하여, pMHC 또는 아비딘 분자와 NP간의 트리아졸 결합을 형성시켰다.
상이한 pMHC-NP 접합 반응에서 접합되지 않은 pMHC 복합체를 300 kDa 분자량 컷오프 멤브레인[스펙트럼(Spectrum) 랩]을 통해 4 ℃에서 PBS, pH 7.4에 대한 광범위 투석에 의해 제거하였다. 한편으로, pMHC-접합된 IONP를 자기 분리에 의해 정제하였다. 상기 접합된 NP를 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-15 단위(100 kDa MWCO)를 통해 한외여과에 의해 농축시키고 PBS 중에서 보관하였다.
전자 현미경검사, 동적 광산란 , DLS 및 작은각 전자광선 회절
접합되지 않은 및 pMHC-접합된 NP의 코어 크기 및 분산도를 먼저 투과형 전자 현미경검사[TEM, 히타치(Hitachi) H7650]를 통해 평가하였다. 동적 광산란(DLS)을 사용하여 제타사이저(ZetaSizer) 장비(영국 몰번 소재)로 pMHC-NP의 유체역학적 크기, 제타 전위 및 단분산도를 측정하였다. PF 시리즈 NP의 산화철 코어의 화학적 성질을 작은각 전자광선 회절(SEBD)을 사용하여 평가하였다.
퓨리에 변환 적외선 분광법
상기 PF-시리즈 IONP 디자인의 표면 화학 성질을 퓨리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 사용하여 평가하였다. 대조용 PEG 및 상기 PF-NP 표면상에 고정된 PEG의 FTIR 스펙트럼을 ATR(약화된 총 반사) 모드상에서 니콜렛(Nicolet) FTIR 분광광도계를 사용하여 수득하였다. 상기 스펙트럼들을 각각 4 ㎝-1 스펙트럼 분해능으로 256 스캔의 평균으로서 기록하였다. 상기 PEG 주쇄 C-O-C 기 및 그의 원위 pMHC-수용체 작용기의 신장 진동 서명을 확인하였다.
아가로스겔 전기영동
peg화 또는 pMHC 코팅의 함수로서 상기 NP 전하에 대한 변화를 신속히 평가하기 위해서, NP를 0.8% 아가로스겔상에서 전기영동을 수행하였다. peg화된 NP는 전체 표면 전하에 따라 음극 또는 양극으로 이동하였다. 쿠마씨 블루 염색을 수행하여 상기 pMHC와 NP와의 동시-이동을 확인하였다.
고유 및 변성 폴리아크릴아미드겔 전기영동
pMHC 접합된 NP에 대해 고유-PAGE(10%) 및 SDS-PAGE(12%) 분석을 수행하여 상기 pMHC-NP 제제 중의 유리(접합되지 않은 pMHC)의 부재를 확인하고 상기 NP 표면상의 완전한 3분자 pMHC 복합체의 존재를 확인하였다.
pMHC 원자가 측정
개별적인 NP상에 접합된 pMHC 단량체의 수(pMHC 원자가)를 평가하기 위해서, 우리는 상이한 접근법, 예를 들어 브래드포드(Bradford) 분석[써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 아미노산 분석(가수분해된 pMHC-NP 제제 중의 17개의 상이한 아미노산의 HPLC-기반 정량분석)(토론토 대학), 도트-ELISA 및 질량 분광분석에 의한 서명 펩티드 분석] 및 pMHC 분자수 대 NP수의 비로 전환된 값을 사용하여 상기 pMHC-NP 제제의 pMHC 농도를 측정하였다. 간단히, 상기 "도트-ELISA" 접근법에서, pMHC-접합된 및 접합되지 않은 NP 및 pMHC 단량체 용액(표준으로서)을 PBS 중에 연속 희석하고 이어서 다중벽 필터 플레이트(PALL 코포레이션) 중의 PVDF 멤브레인에 흡수시켰다. 상기 플레이트를 실온에서 부분건조되게 하고 이어서 pMHC 특이성 1차 항체[즉 pMHC 부류 I-코팅된 NP, 클론 2M2 및 SF1-1.1에 대한 항-β2M 및 항-Kd 항체, 바이오레전드(BioLegend), 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재]에 이어서 HRP- 또는 AP-접합된 2차 항체와 항온처리시켰다. 상기 효소 색상 반응의 전개시, 상기 웰들의 내용물을 통상적인 ELISA 플레이트 중의 웰들로 옮기고 이들의 흡광도를 플레이트 판독기를 사용하여 450 ㎚에서 측정하였다. 상기 서명(signature) 펩티드 질량 분광분석 접근을 위해서, pMHC-특이성 트립신 펩티드(Kd 복합체의 경우 서명 펩티드 TWTAADTAALITR 및 I-Ag7 복합체의 경우 AQNSELASTANMLR)를 질량 분광분석을 통해 확인하였다. 상응하는 합성 펩티드를 안정한 동위원소(AQUA 펩티드 합성, 시그마 알드리치)로 표지하였다. 이어서 동위원소-표지된 펩티드를 한정된 농도로 연속 희석하고 트립신 절단을 위해서 pMHC-접합된 NP와 혼합하였다. 상기 혼합물에 질량 분광학[에이질런트(Agilent) QTOF6520]을 수행하여, pMHC 농도의 정보로서 동위원소-표지된 대 표지되지 않은 서명 펩티드의 비를 정량분석하였다. 이들 상이한 방법에 의해 생성된 값들은 유사하였기 때문에, 브래드포드 분석(블랭크로서 접합되지 않은 NP 사용)이 용이성 및 단순성을 위해 선택된 방법이 되었다.
시험관내에서 pMHC -NP의 작용물질 활성
TCR-TG 마우스로부터 FACS-분류된 비장 CD8+ 세포(2.5 x 105 세포/㎖)를 37 ℃에서 연속 희석된 pMHC 접합된 또는 대조용 NP와 함께 항온처리하였다. 상등액을 ELISA에 의해 IFNγ에 대해 분석하였다. 배양된 세포를 1 mCi의 [3H]-티미딘으로 펄스화하고 24시간 후에 수확하여 [3H] 통합을 측정하였다.
pMHC -NP 요법
10주된 암컷 NOD 마우스의 코호트에게 PBS 중의 pMHC-코팅된 NP를 5주 동안 1주일에 2회(총 10회 용량) i.v. 주사하였다. 혈액, 비장, 림프절 및/또는 골수 중의 사량체+ CD8+ 또는 CD4+ T-세포 풀의 크기의 증가뿐만 아니라 이들의 표현형 성질을 개시된 바와 같이 유식 세포측정에 의해 평가하였다[참조: Tsai, S. et al. (2010) Immunity 32:568-580) (및 제출된 Clemente-Casares et al.]. 다른 실험에서, 2일 동안 >11 mM의 혈당 수준을 나타내는 마우스를 1주일에 2회 pMHC-NP로 i.v. 처리하고 안정한 정상혈당까지(4주 동안) 고혈당증에 대해 모니터하였다. 동물들을 또한 당뇨에 대해서 매일 평가하고 3+인 경우 인간 인슐린 이소판(1 IU/일)을 s.c. 제공하였다.
통계학적 분석
데이터를 2-테일드 스튜던츠 t, 만-휘트니 U, 카이-제곱, 또는 2원 ANOVA 검정에 의해 비교하였다. 통계학적 유의수준을 P<0.05에서 추정하였다.
마우스
NOD/Lt 마우스는 잭슨 랩(미국 메인주 바 하버 소재)으로부터의 것이었다. 17.4α/8.3 (8.3-NOD), 17.6α/8.3α (17.6-NOD) 및 BDC2-5-NOD 마우스를 개시하였다[참조: Katz, J.D. et al. (1993) Cell 74:1089-1100; Verdaguer, J. et al. (1997) J Exp Med 186:1663-1676; Han, B. et al. (2005) J Clin Invest 115:1879-1887].
실시예 2. T1D -관련된 pMHC 부류 II의 생성
다수의 상이한 T1D-관련된 및 관련되지 않은(즉 음성 대조용) 펩티드/I-Ag7 복합체를 진핵생물(S2 또는 CHO 세포)에서 생성시켰다. 이들 단량체 제제로부터 생성된 사량체를 사용하는 연구는 이들 단량체가 적합하게 폴딩된 pMHC 복합체로서 상등액내로 분비됨을 입증한다. 도 2는 일례를 제공한다.
T1D -관련된 pMHC 부류 II-NP에 의한 처리에 의한 NOD 마우스에서의 고혈당증 의 역전
당뇨병 NOD 마우스를 1주일에 2회 7.5 ㎍의 pMHC 부류 II-코팅된-NP로 처리하였다. 마우스는 4주 동안 정상혈당인 경우 치유된 것으로 간주되었으며, 이 시점에서 처리는 철회되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 2.5 mi/I-Ag7-, IGRP128 -145/I-Ag7- 및 IGRP4 -22/I-Ag7-NP는 마우스의 90 내지 100%(n=29 마우스)에서 고혈당증을 역전시킨 반면, HEL14 -22/I-Ag7-NP(외래 pMHC)에 의한 처리는 효과가 없었다. 처리 철회 후 >30주째에 치유된 마우스에서 복강내 글루코스 부하 검사(IPGTT)는 연령-합치된 비-당뇨성의 처리되지 않은 대조용의 경우와 매우 유사하고 처리되지 않은 급성 당뇨병 NOD 마우스에서 획득된 경우와 현저하게 상이한 곡선을 제공하였다(도 4). 따라서, T1D-관련 pMHC 부류 II로 코팅된 NP는 당뇨병 마우스에서 글루코스 항상성을 회복시킨다.
T1D -관련 pMHC 부류 II-NP는 동족 기억 TR1 자가조절성 CD4+ T 세포를 확대시킨다
2.5 mi/I-Ag7-NP에 의한 처리에 의해 정상혈당으로 된 50주된 당뇨병 마우스의 혈액, 비장, 췌장 림프절(PLN), 장간막 림프절(MLN) 및 골수의 연구는 당뇨병 발병시 연구된 마우스 또는 연령-합치된 비-당뇨성의 처리되지 않은 동물에 비해, 2.5 mi/I-Ag7 사량체+ CD4+ 세포의 현저하게 증가된 비율을 밝혀내었다(도 5). CD4+ T-세포 확대는 항원-특이적이었다(도 5). 확대의 속도, 크기 및 분포는 시험된 3개의 T1D-관련 pMHC 부류 II-NP와 유사하였다(도 6). 이들 모든 코호트에서 NP-확대된 사량체+ 세포 대 사량체-세포의 표현형 분석은 최근에 개시된 TR1-특이성 마커들의 공발현[참조: Gagliani, N. et al. (2013) Nature Medicine 19:739-746](도 7, 기부): CD62low/CD44high/ ICOS+/CD25-/FoxP3-/표면 TGFβ+/ CD49b+/LAG3+과 함께 기억-형 TR1 표현형(도 7, 상부)을 밝혀내었다. 이들 세포가 FoxP3+가 아님은 FoxP3 프로모터-eGFP를 발현하는 NOD 마우스에서 입증되었으며, 여기에서 모든 pMHC-NP-확대된 세포는 eGFP-음성이었다(도시 안 됨).
이들 표현형 데이터와 일관되게, pMHC-NP-처리된 마우스로부터 분류된 사량체+ CD4+는 거의 독점적으로 IL-10을 분비하고, 보다 낮은 정도로 IFNγ를 분비함으로써 동족 펩티드로 펄스화된 DC에 응답하였다(도 8 및 도시 안 됨). 중요하게, pMHC-NP-처리된 공여체로부터 정제된 CD4+(그러나 CD8+는 아닌) T 세포는 당뇨병유발성 비장세포가 전달된 NOD.scid 마우스에서 T1D를 억제하였으며 pMHC 부류 II-NP로 처리된 숙주는 >100일 동안 100% 보호되었다(도시 안 됨).
이들 pMHC 부류 II-NP-확대된 사량체+ 세포는 그의 사량체-대응물과 달리, 비-동족 T-세포의 펩티드-펄스화된 DC(상기 응답자 및 사량체+ TR1 세포 모두에 의해 표적화된 펩티드를 제공한다)로의 증식을 억제하였다. 상기 배양물에의 항-IL-10 또는 항-TGFβ mAb의 첨가는 항-IFNγ 또는 래트-IgG를 수령하는 배양물에 대해, 상기 억제를 부분적으로 억제하였다(도시 안 됨). 가장 중요하게, IGRP4 -22 또는 2.5 mi/I-Ag8-NP로 처리되고 항-IL-10, 항-TGFβ 또는 항-IFNγ mAb 또는 래트-IgG를 차단하는 당뇨병 마우스의 연구(도 9)는 pMHC 부류 II-NP에 의한 정상혈당의 회복이 IL-10 및 TGFβ를 필요로 하지만 IFNγ는 필요로 하지 않음을 가리킨다. 그러나, 자발적 당뇨병 NOD.Il10 -/- 및 NOD.Ifng -/- 마우스에서의 연구는 IL-10 및 IFNγ 모두의 발현이 pMHC 부류 II-NP에 반응하여 확대되는 TR1 세포의 발생에 필요하고; 이들 마우스에서 pMHC-NP 요법은 Th2-형 세포(NOD.Ifng -/-) 또는 IFNγ+/IL-4+/IL10- 세포(NOD.Il10 -/- 마우스)를 확대시켰음을 암시한다. 당뇨병 IGRP-/- NOD 마우스(IGRP-반응성 T 세포를 항원초회자극할 수 없음)에서의 연구는 상기 마우스가 IGRP4 -22-초회항원자극된 세포가 없기 때문에 IGRP4 -22/I-Ag7-NP에 응답하지 않음(T 세포 확대 또는 정상혈당의 회복이 존재하지 않았다)을 보였다. 대조적으로, 2.5 mi/I-Ag7-NP로 처리된 모든 당뇨병 IGRP-/- NOD 마우스는 치유되었다(도시 안 됨). 따라서, pMHC 부류 II-NP는 pMHC 부류 I-NP와 같이, 질병-자극된(disease-primed) 조절 기억을 확대시킴으로써 작동하지만, 상기 NP는 동시-자극 신호가 없기 때문에 상기 반응을 드노보 자극할 수 없다.
최종적으로, 우두 바이러스(rVV)에 의한 연구는 pMHC 부류 II-NP-처리된 NOD 마우스가 급성 바이러스 감염을 쉽게 제거할 수 있음을 입증하였다(도 10A). 이와 일치하게, 처리된 마우스는 항원보강제 중의 모델 항원에 대해 항체 반응을 증가시킬 수 있다(도 10B).
실시예 3. 단일특이성 pMHC 부류 II-NP는 EAE의 중증도를 감소시킨다.
출원인은 이어서 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서 pMHC 부류 II-기반 나노약물의 치료학적 가능성을 시험하였다. 상기 모델을 pMHC-NP가 EAE의 발병을 예방하거나 둔화시키는 것과 상반되게 확립된 EAE를 역전시킬 수 있는지를 조사하기 위해서 가능한 가장 엄격한 시험에 사용하였다. 이는 사소한 문제는 아니다. EAE의 중재에 대한 최근의 리뷰는 400개가 넘는 연구의 <1%가 EAE 유도 후 21일째에 치료를 개시하였으며[참조: Holst, J. et al. (2006) Nat Protoc 1:406-417]; 보고된 데이터는 EAE 유도 후 21일째에 처리가 개시된 마우스에서 획득되었고 질병 점수를 용량-의존적인 방식으로 개선시켰음을 보인다(도 11).
실시예 4. pMHC 부류 II-코팅된 NP의 합성 및 품질 조절
출원인은 합성에 계면활성제를 사용하지 않고 최적의 pMHC 크기로 부하될 수 있는 매우 안정성인 단분산된 제제를 제공하는 최적화된 산화철 NP 디자인을 개발하였다. 다수의 상이한 pMHC-코팅 화학을 사용할 수 있지만(도 12A), 출원인은 카복시말단 단부에서 유리 Cys를 암호화하도록 조작된 높은 원자가의 pMHC(60 pMHC/NP 초과까지)를 수용하는, 말레이미드-접합된 PEG로 기능화된 NP를 정식으로 사용한다. 상기 pMHC 부류 II-NP를 NP당 pMHC 원자가(도트-ELISA, 아미노산 분석), NP 밀도, NP 전하 및 NP 크기(TEM에 의해 한정된 바와 같은 금속 코어; 및 동적 광산란(DLS)을 통해 한정된 바와 같은 유체역학적 직경)를 한정하기 위해 다수의 품질 조절 점검을 통해 가공하였다. 도 12B는 전형적인 TEM 영상을 도시하고 도 12C는 pMHC-코팅되지 않은 대 코팅된 NP의 DLS 프로파일을 도시한다. 전형적인 투여 섭생은 1 내지 50 ㎍의 총 pMHC(NP-코팅된)/용량(PBS 100 uL에 희석된 약 2 uL의 제제)의 투여를 수반한다.
실시예 5. pMHC 부류 II-코팅된 NP에 의한 처리
상기 데이터는 앞서 출원인이 pMHC 부류 I-NP로 처리한 마우스에서 획득한 데이터와 일치한다: pMHC 부류 II-NP는 국소 자가항원-부하된 APC에 의한 다른 자가항원 펩티드의 제공을 억제하는 동족 기억 조절성 T 세포(이 경우에 TR1)를 확대시킨다[참조: Amrani, A. et al. (2000) Nature 406:739-742].
인간 TR1 CD4+ T-세포 클론은 전문적인 APC, 예를 들어 수지상 세포(DC)의 몇몇 부분집합들을 살해하는 것으로 보고되었다[참조: Amrani, A. et al. (2000) Nature 406:739-742]. 따라서 출원인은 pMHC 부류 II-NP 요법에 반응하여 확대되는 항원-특이성 TR1 세포가 자가항원-부하된 APC를 살해함으로써 자가면역성을 억제하는지의 여부를 조사하였다. 이는 2.5 mi 또는 GPI 펩티드로 펄스화되고 PKH26(2.5 mi-펄스화된 DC) 또는 CFSE(GPI-펄스화된 DC)로 표지된 DC의 1:1 혼합물을, 앞선 5주 동안 10 회 용량의 2.5 mi/IAg7-NP를 수령한 NOD 마우스 또는 어떠한 처리도 수령하지 않은 NOD 마우스에게 주입함으로써 수행되었다. 상기 숙주를 7일 후에 죽여, 2개의 상이한 숙주에서의 PKH26+ 대 CFSE+ 세포의 비를 비교하였다. 도 13A(상부 패널)에 도시된 바와 같이, 차이는 관찰되지 않았으며, 이는 상기 pMHC-NP 요법에 반응하여 확대된 TR1 CD4+ T-세포가 항원-발현 DC를 살해하지 않음을 암시한다.
이것이 상기 사용된 APC(DC)의 유형의 특수성인지 또는 다른 APC 유형의 일반적인 특징인지를 조사하기 위해서, 상기 실험을 반복하였으나, 단 DC와 상반되게 비장 B-세포를 사용하였다. 뜻밖에도, 2.5 mi/IAg7-NP-코팅된 NP로 처리된 숙주에서 2.5 mi-펄스화된 B-세포의 수가 확대되었음(감소되기 보다는)을 발견하였다(도 13A, 기부 패널). 이는 최신의 기술 수준을 근거로 단지 상반되는 결과(GPI-펄스화된 대응물에 비해 2.5 mi-펄스화된 B-세포의 선택적이고 특이적인 감소)만이 예상되었기 때문에 뜻밖이었다.
이어서 출원인은 pMHC 부류 II-NP 처리의 상기와 같은 B-세포-확대 효과가 2.5 mi/IAg7-NP 처리된 대 처리되지 않은 대조용의 마우스들의 췌장-배액(PLN) 및 비-배액(MLN) 림프절에서 B-세포의 절대수 및 비율을 비교함으로써 기록될 수 있는지의 여부를 확인하였다. 도 13B에 도시된 바와 같이, pMHC 부류 II-NP-처리된 NOD 마우스는 MLN이 아닌 PLN에서 B-세포 비율의 현저한 증가를 가졌다. 상기와 같은 차이는 처리되지 않은 NOD 마우스의 PLN 대 MLN에서는 관찰되지 않았는데, 이는 상기 효과가 pMHC-NP 요법의 결과임을 암시하였다. 현저하게, 개별적인 마우스의 PLN 중의 2.5 mi-특이성 TR1 CD4+ T-세포의 빈도와 PLN-관련된 B-세포의 빈도간에 통계학적 유의수준의 상관성이 존재하였으며, 이는 상기 pMHC-NP-처리된 NOD 마우스의 PLN으로의 상기와 같은 B-세포의 증가된 모집이, MHC-NP 요법에 반응하여 확대된 상기 2.5 mi-특이성 TR1 CD4+ T-세포에 의해 구동됨을 암시하였다.
집합적으로, 이들 데이터는 MHC-NP 요법에 반응하여 확대된 B-세포가 B-조절성 세포일 수도 있을 가능성, 즉 상기 pMHC-NP-확대된 TR1 CD4+ T-세포와의 동족 상호작용에 반응하여 IL-10을 생산하는 능력을 획득하는 B-세포일 가능성을 제기하였다. 이러한 상황의 시나리오는 2.5 mi-특이성 TR1 CD4+ T-세포가 크로모그라닌 A를 포획하고 따라서 그의 표면상의 상응하는 2.5 mi/IAg7 pMHC 복합체를 IL-10-생산 Breg 세포에 제공하는 분화되지 않은 크로모그라닌 A-특이성 B-세포(크로모그라닌 A는 상기 2.5 mi 에피토프의 천연 항원 공급원이다)의 분화 및 확대를 유도할 것임을 지적한다.
상기 가설을 검정하기 위해서, 출원인은 2개의 IL10 유전자좌 중 하나가 정지 코돈과 엑손 5(11)의 폴리아데닐화 신호 사이의 IRES-eGFP 카세트의 표적화된 삽입을 갖는 NOD 마우스의 균주로부터 2.5 mi 또는 GPI-펄스화된 B-세포(PKH26으로 표지된)를 2.5 mi/IAg7-NP-처리된 또는 처리되지 않은 NOD 숙주내로 주입하였다.
전달 후 7일째에, 상기 숙주 중의 공여체 PKH26+ B-세포의 유식 세포측정 표현형(도 13C, 상부 패널)을 측정하였다. 도 13C(중간 및 기부 패널)에 도시된 바와 같이, 공여체 B-세포의 상당 분획은 IL10-암호화된 eGFP를 발현하였고 CD5+이고 CD1dhigh이었다. 이들은 Breg 세포의 3개의 핵심 마커들이다(Xie, J. et al. (2007) Adv Mater 19:3163; Xie, J. et al. (2006) Pure Appl. Chem. 78:1003-1014). 이는 오직, 음성 대조용 펩티드(GPI)로 펄스화된 B-세포가 아닌 2.5 mi로 펄스화된 B-세포에서만 관찰되었으며, pMHC-NP-처리된 마우스에서만 존재하였다. 중요하게, 상기 효과는 적어도 부분적으로, 상기 IL-10 pMHC-NP-확대된 TR1 CD4+ T-세포에 의해서 매개되었는데, 그 이유는 상기와 같은 반응이 IL-10-결손 NOD 숙주에서 관찰되지 않았기 때문이다.
하나로 합쳐서, 이들 데이터는 pMHC 부류 II-NP 요법이 항원-특이성 B-세포의 B-조절 세포로의 분화 및 확대를 유도함을 입증한다.
조절 성질을 갖는 B 림프구의 존재를 암시하는 데이터의 개시를 다시 1974년 문헌에서 찾을 수 있다. pMHC 부류 II-NP 요법에 반응하여 확대된 TR1 CD4+ T-세포와 유사하게, Breg 세포는 동족의, pMHC 부류 II-구동된 세포-세포 상호작용을 통해 IL-10 및 TGFb를 포함한 면역억제성 사이토킨뿐만 아니라 병원성 자가반응성 T- 및 B-세포를 항원-의존적이고 고도로 특이적인 방식으로 억제할 수 있는 다른 분자를 발현한다[참조; Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56:821-826]. 상이한 자극들이 시험관내에서 Breg 형성을 유도할 수 있고 생체내에서 훨씬 더 적은 정도로 유도할 수 있는 것으로 나타났지만, 출원인이 알고 있는 바로는 현재 생체내에서 항원-특이성 Breg 세포를 유도하고 확대시킬 수 있는 치료학적 접근법은 없다. 출원인은 고도로 질병-특이적인 TR1 CD4+ T-세포를 이끌어냄으로써, pMHC 부류 II-기반 나노약물이 질병-특이적인 Breg 세포를 또한 이끌어냄을 입증한다. Breg 세포는 또한 효과기의 TR1 CD4+ T-세포로의 분화를 촉진하기 때문에, pMHC 부류 II-기반 나노약물은, 매우 항원-특이적이고 따라서 전신 면역성을 손상시키지 않으면서 자가면역 반응을 선택적으로 억제할 수 있는 충분하고 지속적인 면역억제 반응을 촉발시킨다.
실시예 6. 철 아세틸아세토네이트의 열분해 및 그의 생물접합에 의해 표면 기능화된 산화철 나노입자의 합성
PEG를 용융시킨다. 벤질 에테르 및 철 아세틸 아세토네이트를 가한다. 105 ℃에서 1시간 가열 후에, 온도를 260 ℃로 증가시키고 환류시킨다. 2시간 후에, 철 나노입자가 형성되고 용액의 색상이 검게 변한다. 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고 약간의 물을 가하여 반응 용기로부터 나노입자를 추출한다. 상기 나노입자를 밀테니 바이오텍 LS 자석 컬럼에 의해 정제시킨다. 산화철 나노입자 단백질 접합체의 제조는 단백질 및 철 나노입자를 6.2 내지 6.5로 완충된 pH에서(0.15M NaCl 및 2 mM EDTA) 실온에서 12 내지 14시간 동안 교반하면서 가하고, 단백질 접합된 입자를 밀테니 바이오텍 LS 자석 컬럼에 의해 정제시킨다.
본 발명을 바람직한 실시태양 및 선택적인 특징에 의해 구체적으로 개시하였지만, 본 발명에서 구현된 발명의 변형, 개선 및 변화는 당해 분야의 숙련가들에 의해 재분류될 수 있으며, 상기와 같은 변형, 개선 및 변화는 본 발명의 범위내에 있는 것으로 간주됨은 물론이다. 본 발명에 개시된 물질, 방법 및 실시예들은 바람직한 실시태양을 나타내고, 예시적이며, 본 발명의 범위에 대한 제한을 의미하는 것은 아니다.
본 발명을 여기에서 광범위하고 일반적으로 개시하였다. 일반적인 개시 내에 있는 각각의 보다 좁은 개념 및 하위개념 그룹이 또한 본 발명의 부분을 형성한다. 이는 삭제된 요소가 구체적으로 인용되든 되지 않든 간에, 상기 개념으로부터 임의의 발명의 요지를 제거한다는 단서 또는 부정적인 제한과 함께 본 발명의 일반적인 개시를 포함한다.
또한, 본 발명의 특징 또는 태양을 마쿠시 그룹에 의해 개시하는 경우, 당해 분야의 숙련가들은 본 발명이 또한 상기 마쿠시 그룹의 임의의 개별적인 일원 또는 일원들의 하위그룹에 의해 개시됨을 알 것이다.
특허청구범위에서 "또는"이란 용어의 사용은 오직 양자택일 또는 상기 양자택일이 상호 배타적임을 지칭함을 명백히 가리키지 않는 한 "및/또는"을 의미하는데 사용되지만, 상기 명세는 양자택일 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다.
본 명세서 및 특허청구범위에 사용되는 바와 같이, "포함하는"(및 포함하는의 임의의 형태, 예를 들어 "포함하다"), "갖는"(및 갖는의 임의의 형태, 예를 들어 갖다"), "내포하는"(및 내포하는의 임의의 형태, 예를 들어 "내포하다") 또는 "함유하는"(및 함유하는의 임의의 형태, 예를 들어 함유하다)은 포괄적이고 개방형이며 추가적인, 인용되지 않은 요소 또는 방법 단계들을 제외시키지 않는다.
본 명세 전체를 통해, 다양한 공보, 특허 및 공개된 특허 명세서를 식별 인용구에 의해 참조한다. 본 발명에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌들은 명백히 내용 전체가, 각각이 개별적으로 참고로 인용되는 바와 동일한 정도로 참고로 인용된다. 대립의 경우에, 정의를 포함한 본 명세서가 좌우할 것이다.
Figure pct00003
Figure pct00004

Claims (31)

  1. 피험자에서 Tr1 세포 및/또는 B-조절성 세포의 집단을 확대 및/또는 발달시키는데 사용하기 위한 나노입자 및 질병-관련 항원-MHCII 복합체를 포함하는 복합체로, 상기 나노입자가 약 1 ㎚ 내지 약 100 ㎚ 직경; 약 1 ㎚ 내지 약 50 ㎚ 직경 또는 약 1 ㎚ 내지 약 20 ㎚ 직경 또는 약 5 ㎚ 내지 약 100 ㎚ 직경의 그룹 중에서 선택된 직경을 갖고 나노입자에 대한 항원-MHCII 복합체 수의 비가 약 10:1 내지 약 1000:1인 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    약 0.05 pMHC/100 ㎚2 나노입자 표면적 내지 약 25 pMHC/100 ㎚2 나노입자 표면적의 항원-MHCII 밀도를 갖는 복합체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항원이 자가면역 반응에 관련된 자가항원 또는 그의 모사체로부터 유래되고, 임의로 상기 자가항원이 췌장 베타 세포에 의해 발현된 항원으로부터의 에피토프, IGRP, 인슐린, GAD, IA-2 또는 마이엘린 올리고덴드로사이트 단백질(MOG)인 복합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노입자가 비-리포솜이고/이거나 고체 코어, 바람직하게는 금 또는 산화철 코어를 갖는 복합체.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-MHCII가 나노입자에 공유적으로 또는 비-공유적으로 결합된 복합체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-MHCII가 크기 5 kD 미만의 링커를 통해 나노입자에 공유적으로 결합된 복합체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노입자가 생체흡수성 및/또는 생분해성인 복합체.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노입자 복합체가 약 10:1 내지 약 100:1의 항원-MHCII 복합체 대 나노입자 비를 포함하는 복합체.
  9. 제5항에 있어서,
    링커가 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 복합체.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-MHCII 복합체가 동일하거나 상이한 복합체.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    링커가 동일하거나 상이한 복합체.
  12. 치료 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 복합체 및 담체를 포함하는 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    담체가 약학적으로 허용 가능한 담체인 조성물.
  14. 항원-MHCII 복합체를 나노입자상에 코팅하거나 복합체화함을 포함하는, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 복합체의 제조, 제작 또는 수득 방법.
  15. 피험자에서 항원-특이적인 방식으로 Tr1 세포 및/또는 B-조절성 세포의 형성, 확대 및 모집을 촉진하는 방법으로, 상기 피험자에게 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제12항 또는 제13항의 조성물을 투여함을 포함하는 방법.
  16. 피험자에서 바이러스 감염 또는 자가면역 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로, 상기 피험자에게 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제12항 또는 제13항의 조성물을 투여함을 포함하나, 단 항원이 자가면역-관련 자가항원인 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    피험자가 포유동물인 방법.
  18. 제15항 또는 제17항에 있어서,
    자가면역 질환이 당뇨병, 전-당뇨병, 다발성 경화증 또는 다발성 경화증-관련된 질환의 그룹 중에서 선택되나, 단 항원이 치료되는 자가면역 질환과 관련되는 방법.
  19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 복합체 또는 제11항 또는 제12항의 조성물 및 사용 설명서를 포함하는 키트.
  20. 철 아세틸 아세토네이트를 열분해시킴을 포함하는, 산화철 나노입자의 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    산화철 나노입자가 수용성인 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    열분해가 단일-단계 반응을 포함하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    열분해가 기능화된 PEG 분자의 존재하에서 발생하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    열분해를 벤질 에테르의 존재하에서 수행하는 방법.
  25. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    열분해 온도가 약 80 내지 약 300 ℃, 또는 약 80 내지 약 200 ℃, 또는 약 80 내지 약 150 ℃, 또는 약 100 내지 약 250 ℃, 또는 약 100 내지 약 200 ℃, 또는 약 150 내지 약 250 ℃, 또는 약 150 내지 약 250 ℃인 방법.
  26. 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    열분해를 약 1 내지 약 2시간 동안 수행하는 방법.
  27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노입자가 PBS 중에서 약 4 ℃에서 어떠한 검출 가능한 분해나 응집 없이 안정한 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    나노입자가 적어도 6개월 동안 안정한 방법.
  29. 제20항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    나노입자를 자기 컬럼으로 정제시킴을 추가로 포함하는 방법.
  30. pMHC를 제20항 내지 제29항 중 어느 한 항으로부터 수득되는 산화철 나노입자와 접촉시키고, 이에 의해 나노입자 복합체를 제공함을 포함하는, 나노입자 복합체의 제조 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    나노입자를 자기 컬럼으로 정제시킴을 추가로 포함하는 방법.
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