BR112019018616A2

BR112019018616A2 - peptídeos e métodos para o tratamento de diabetes

Info

Publication number: BR112019018616A2
Application number: BR112019018616A
Authority: BR
Inventors: Saint-Remy Jean-Marie; Vander Elst Luc; Carlier Vincent
Original assignee: Imcyse Sa
Priority date: 2017-03-09
Filing date: 2018-03-06
Publication date: 2020-04-28
Also published as: US10808016B2; KR20190126798A; ZA201905851B; AU2018229741B2; CN110536898B; AU2018229741A1; PE20191529A1; NZ755744A; US20240092843A1; JP2020509067A; SA519410007B1; WO2018162498A1; IL268874B1; RU2761653C2; RU2019126232A3; CU20190078A7; IL268874B2; CU24596B1; EP3592765A1; US11760782B2

Abstract

a invenção refere-se a peptídeos tais como hcpycslqplalegslqkrg e seu uso no tratamento de diabetes tipo 1 e na geração de células t cd4+ citolíticas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: PEPTÍDEOS E MÉTODOS PARA O TRATAMENTO DE DIABETES ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0001] Várias estratégias foram descritas para prevenir a geração de uma resposta imune indesejada contra um antígeno. O documento W02008/017517 descreve uma nova estratégia usando peptídeos compreendendo um antígeno de MHC da classe II de uma dada proteína antigênica e um motivo de oxidorredutase. Estes peptídeos convertem células T CD4+ em um tipo de célula com propriedades citolíticas chamadas células T CD4+ citolíticas. Estas células têm a capacidade capazes de matar ao desencadearem apoptose daquelas células apresentadoras de antígenos (APC, do inglês antigen presenting cells), que apresentam o antígeno do qual o peptídeo é derivado. O documento W02008/017517 demonstra este conceito para alergias e doenças autoimunes, como diabetes tipo I. Aqui, a insulina pode atuar como um autoantígeno.

[0002] W02009101207 e Carlier et al. (2012) Pios one 7,10 e45366 descreve adicionalmente as células citolíticas antigeno-específicas com mais detalhes.

[0003] O documento W02009101206 descreve o uso de peptídeos com um motivo de oxidorredutase e um epítopo de MCH da classe II de um aloantígeno solúvel para prevenir uma resposta imune contra tal antígeno quando usado em

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2/67 terapias de substituição (por exemplo, resposta imune indesejada contra insulina injetada em patentes com diabetes).

[0004] O documento WO2016059236 divulga outros peptideos modificados em que uma Histidina adicional está presente na proximidade do motivo de oxidorredutase.

[0005] No desenho de um peptídeo contra diabetes tipo I, muitos fatores podem ser levados em consideração, como o tipo do autoantígeno (insulina, GAD 65,...), um domínio e epítopo específicos do autoantígeno, o motivo de oxidorredutase, o comprimento e a sequência de aminoácidos entre o motivo de oxidorredutase e a sequência do epítopo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] A presente invenção proporciona novos peptideos derivados de Insulina para o tratamento de diabetes tipo 1.

[0007] Os peptideos da presente invenção têm a vantagem de que as células T CD4+ citolíticas que foram geradas usando-se estes peptideos têm uma produção aumentada de IFN-gama e sFasL em comparação com peptideos da técnica anterior. Também se acredita que esteja aumentada a produção de Granzima B nas referidas células T CD4+ .

[0008] Os níveis de expressão aumentados destes marcadores são indicações de uma maior capacidade de os

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3/67 peptideos da presente invenção de gerarem células T CD4+ citoliticas em comparação com os peptideos da técnica anterior.

[0009] Um aspecto da invenção refere-se a peptideos com um comprimento entre 12 e 50 aminoácidos, compreendendo a sequência de tetrapeptideos CxxfCST] [SEQ ID NO: 1] ou [CST]xxC [SEQ ID NO: 2] (isto é, o motivo redox) e, separado deste tetrapeptideo por 0 a 5 aminoácidos, preferencialmente por 0 a 4 aminoácidos (isto é, por um ligante (linker) ) , a sequência

LALEGSLQK [SEQ ID NO:

(isto é, o epitopo).

Modalidades destes peptideos compreendem sequência Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID

NO:

ou [CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:5].

Outras modalidades destes peptideos compreendem sequencia

CxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ

ID

NO: 6].

[0012]

Outras modalidades destes peptideos compreendem a sequência HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID

NO:7] ou H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:8 ].

Outras modalidades destes peptideos compreendem sequencia

HCxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ

ID NO: 9].

Outras modalidades destes peptideos compreendem

Cxx[CST] [SEQ ID NO:

ou a sequência do motivo redox [CST]xxC [SEQ ID NO:

a sequencia

SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 20].

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4/67 [0015] Modalidades específicas destes peptídeos consistem na sequência

Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 4], [CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 5],

CxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:6],

HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:7],

H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:8], ou

HCxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:9].

[0016] Outras modalidades específicas destes peptídeos consistem na sequência

Cxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 10], [CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 11],

CxxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 12],

HCxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO:13],

H[CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ IDNO:14], ou

HCxxCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 15].

[0017] Em modalidades específicas destas sequências

SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 1] é CPYfCST] [SEQ ID NO: 16], [CST]xxC [SEQ ID NO: 2] é [CSTJPYC [SEQ ID NO: 17], CxxC [SEQ ID NO: 18] mais específica é CPYC [SEQ ID NO:19].

[0018] Uma modalidade específica é o peptídeo

HCPYCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 26] [0019] Nas modalidades acima, o motivo redox está no lado do N-terminal do epítopo.

[0020] Em um conjunto alternativo de modalidades,

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5/67 os peptideos têm o motivo redox no lado C-terminal do epitopo .

[0021] Um outro aspecto da invenção refere-se a qualquer um dos peptideos tais como descritos acima para uso como medicamento, especialmente no tratamento ou prevenção de diabetes tipo 1 ou para reduzir os sintomas de diabetes tipo 1.

[0022] Um outro aspecto refere-se a composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos peptideos tais como divulgados acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0023] Um outro aspecto refere-se a um método ín vitro para a geração de uma população de células T CD4 + citolíticas, contra APC que apresentam epítopos de insulina, compreendendo as etapas de:

- proporcionar células sanguíneas periféricas;

- colocar em contato as referidas células in vitro com qualquer um dos peptideos imunogênicos tais como divulgado acima; e

- expandir as referidas células na presença de IL-2.

[0024] Um outro aspecto refere-se a uma população de células T CD4+ citolíticas, contra insulina que apresenta APC obteníveis pelo método acima para uso como medicamento.

[0025] Um outro aspecto refere-se a uma população

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6/67 de células obteníveis pelo método acima para uso no tratamento ou prevenção de diabetes tipo 1.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0026] Figura 1 Liberação de sFasL em linhagens celulares geradas com pl7-003 ou pl7-001.

[0027] Células específicas para pl7-003 ou pl7-001 (células positivas para IL5; histogramas pretos) foram reestimuladas por 24h com células apresentadoras de antígenos carregadas com os peptídeos pl7-003 ou pl7-001, dependendo do peptídeo usado para sua geração, e o sobrenadante coletado após 24h de cocultura. As células negativas para IL-5 são para populações de PBMC controle (histogramas abertos). Os resultados representam média +/DP da concentração de sFasL corrigida por número de células.

[0028] Figura 2 Esta figura mostra a resposta das linhagens celulares à estimulação por pl7-003 ou pl7-001 em termos de produção de citocinas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0029] A presente invenção será descrita em relação a modalidades particulares, mas a invenção não está limitada às mesmas, mas apenas pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser interpretados como limitando o escopo. Os termos ou definições a seguir são fornecidos apenas para auxiliar no

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7/67 entendimento da invenção. Salvo especificamente aqui definido, todos os termos aqui usados têm o mesmo significado que teriam para um especialista na técnica da presente invenção. As definições aqui fornecidas não deverão ser interpretadas como tendo um escopo menor do que o entendido por especialista na técnica.

[0030] Salvo indicação em contrário, todos os métodos, etapas, técnicas e manipulações que não são especificamente descritas em detalhes podem ser executados e foram executados de uma maneira conhecida per se, como ficará claro para o especialista. É feita referência, por

exemplo, novamente aos	manuais	padrão,	à técnica geral
antecedente à qual se	refere	acima	e às	referências
adicionais aqui citadas.
[0031] Conforme	aqui usadas, as	formas	singulares

'um', 'uma', 'o' e 'a' incluem referentes singulares e plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Os termos qualquer e quaisquer, quando usados em relação a aspectos, reivindicações ou modalidades, conforme aqui usados, referem-se a qualquer um(a) (isto é, qualquer um), assim como a todas as combinações dos referidos aspectos, reivindicações ou modalidades aos quais se refere.

[0032] Os termos 'compreendendo', 'compreende' e 'composto de', conforme aqui usados, são sinônimos de

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8/67 'incluindo', 'inclui' ou 'contendo', 'contém', e são inclusivos ou abertos e não excluem membros, elementos ou etapas do método adicionais ou não enumerados. Os referidos termos também abrangem as modalidades consistindo essencialmente em e consistindo em.

[0033] A enumeração de intervalos numéricos por pontos finais inclui todos os números e frações subsumidos nos respectivos intervalos, assim como os pontos finais enumerados.

[0034] O termo 'cerca de', conforme como aqui usado, quando se refere a um valor mensurável, tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal e semelhantes, destina-se a abranger variações de +/- 10% ou

menos, preferencialmente + /-	5%	ou menos,	mais
preferencialmente	+ /- 1% ou	menos,	e ainda	mais
preferencialmente	+/- 0,1% ou	menos	do que o	valor
especificado, na	medida em que	tais	variações	se j am

apropriadas para serem realizadas na invenção divulgada. Deve-se entender que que o valor ao qual o modificador 'cerca de' se refere também é, ele próprio, específico e, preferencialmente, divulgado.

[0035] Como aqui usado, o termo para uso, conforme usado em composição para uso no tratamento de uma doença, também divulgará o método de tratamento correspondente e o uso correspondente de uma preparação

Petição 870190088446, de 06/09/2019, pág. 23/94 °>/6Ί para a fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença.

[0036] O termo peptídeo, conforme aqui usado, refere-se a uma molécula compreendendo uma sequência de aminoácidos entre 12 e 200 aminoácidos, conectada por ligações peptídicas, mas a qual pode compreender estruturas que não aminoácidos.

[0037] Os peptideos de acordo com a invenção podem conter qualquer um dos 20 aminoácidos convencionais ou versões modificadas dos mesmos, ou podem conter aminoácidos de ocorrência não natural incorporados por síntese química de peptideos ou por modificação química ou enzimática.

[0038] O termo antigeno, conforme aqui usado, refere-se a uma estrutura de uma macromolécula, tipicamente proteína (com ou sem polissacarídeos) ou feita de composição proteica compreendendo um ou mais hapteno(s) e compreendendo epítopos de células T.

[0039] O termo proteína antigênica, conforme aqui usado, refere-se a uma proteína compreendendo um ou mais epítopos de células T. Uma proteína autoantígeno ou autoantigênica, conforme aqui usado, refere-se a uma proteína humana ou animal presente no corpo, a qual provoca uma resposta imune no mesmo corpo humano ou animal.

[0040] O termo epítopo, refere-se a uma ou várias porções (a quais podem definir um epítopo conformacional)

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10/67 de uma proteína antigênica que é/ são especificamente reconhecidos e está/estão ligados por um anticorpo ou uma porção do mesmo (Fab', Fab2' etc.) ou um receptor apresentado na superfície celular de um linfócito célula B ou T, e que tem a capacidade, pela referida ligação, de induzir uma resposta imune.

[0041] O termo epitopo de células T, no contexto da presente invenção, refere-se a um epitopo de células T dominante, subdominante ou menor, isto é, uma parte de uma proteína antigênica que é especificamente reconhecida e ligada por um receptor na superfície celular de um linfócito T. Um epitopo ser dominante, subdominante ou menor depende da reação imune provocada contra o epitopo. A dominância depende da frequência com que esses epítopos são reconhecidos pelas células T e têm a capacidade de ativá-

los, dentre	todos	os possíveis	epítopos	de células	T de	uma
proteína.
[0042]	0	epitopo da	célula	T é um	epitopo
reconhecido	pelas	moléculas t	io MHC	da classe	II,	que
consiste em	uma	sequência de	+ /- 9	aminoácidos	que	se
encaixam no	sulco	da molécula	do MHC	11. Dentro	de	uma

sequência peptídica representando um epitopo de células T, os aminoácidos no epitopo são numerados Pl a P9, os aminoácidos N-terminais do epitopo são numerados P-l, P-2 e assim por diante, os aminoácidos C-terminais são numerados

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P+1, P+2 e assim por diante. Aos peptídeos reconhecidos pelas moléculas do MHC da classe II e não pelas moléculas do MHC da classe I, refere-se como epítopos de células T restritos ao MHC da classe II.

[0043] O termo MHC refere-se a antigeno de histocompatibilidade principal. Nos seres humanos, os genes do MHC são conhecidos como genes HLA (antigeno leucocitário humano, do inglês human leukocyte antigen). Embora não exista uma convenção consistentemente seguida, na literatura, usa-se HLA para se referir às moléculas de proteína HLA, e MHC para se referir aos genes que codificam as proteínas HLA. Como tais, os termos MHC e HLA são equivalentes quando aqui usados. O sistema HLA no homem tem seu equivalente no camundongo, isto é, o sistema H2. Os genes HLA mais intensamente estudados são os nove assim chamados genes clássicos do MHC: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLADPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLAs DQB1, HLA-DRA, e HLA-DRB1. Nos seres humanos, o MHC divide-se em três regiões: Classe I, II e III. Os genes A, B e C pertencem ao MHC da classe I, ao passo que os seis genes D pertencem à classe II. As moléculas do MHC da classe I são constituídas por uma única cadeia polimórfica contendo 3 domínios (alfa 1, 2 e 3), os quais se associam à beta 2 microglobulina na superfície celular. As moléculas da classe II são compostas de 2 cadeias polimórficas, cada uma contendo 2 cadeias (alfa 1 e

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2, e beta 1 e 2).

[0044] As moléculas do MHC da classe I são expressas em praticamente todas as células nucleadas.

[0045] Os fragmentos peptidicos apresentados no contexto das moléculas do MHC da classe I são reconhecidos pelos linfócitos T CD8+ (linfócitos T citoliticos ou CTLs). Os linfócitos T CD8+ frequentemente amadurecem-se em efetores citoliticos que podem lisar células contendo o antigeno estimulante. As moléculas do MHC da classe II são expressas principalmente em linfócitos ativados e células apresentadoras de antigenos. Os linfócitos T CD4+ (linfócitos T auxiliares ou Th) são ativados com o reconhecimento de um fragmento peptídico único apresentado por uma molécula do MHC da classe II, geralmente encontrada em uma célula apresentadora de antigenos como macrófagos ou células dendriticas. Os linfócitos T CD4+ proliferam-se e secretam citocinas, tais como IL-2, IFN-gama e IL-4, que dão suporte a respostas mediadas por anticorpos e mediadas por células.

[0046] Os HLAs funcionais são caracterizados por um sulco de ligação profundo, ao qual se ligam peptideos potencialmente antigênicos, endógenos e estranhos. O sulco caracteriza-se adicionalmente por uma forma bem definida e por propriedades fisico-quimicas. Os sítios de ligação do HLA da classe I estão fechados, de modo que os terminais

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13/67 dos peptídeos ficam fixados às extremidades do sulco. Eles também estão envolvidos em uma rede de ligações de hidrogênio com resíduos de HLA conservados. Levando em conta estas restrições, o comprimento dos peptídeos ligados está limitado a 8, 9 ou 10 resíduos. No entanto, foi demonstrado que peptídeos com até 12 resíduos de aminoácidos também têm a capacidade de se ligar a HLA da classe I. Uma comparação das estruturas de diferentes complexos de HLA confirmou um modo geral de ligação, em que os peptídeos adotam uma conformação estendida relativamente linear ou podem envolver resíduos centrais para formar uma protuberância que se projeta para fora do sulco.

[0047] Em contraste com os sítios de ligação de HLA da classe I, os sítios da classe II estão abertos nas duas extremidades. Isto permite que os peptídeos se estendam da região real de ligação, desse modo emergindo para fora em ambas as extremidades. Os HLAs da classe II podem, portanto, ligar-se a ligantes (ligands) peptídicos de comprimento variável, que variam de 9 a mais de 25 resíduos de aminoácidos. De modo similar a HLA da classe I, a afinidade de um ligante da classe II é determinada por um componente constante e por um variável. A parte constante resulta novamente de uma rede de ligações de hidrogênio formada entre resíduos conservados no sulco do HLA da classe II e a cadeia principal de um peptídeo

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14/67 ligado. No entanto, este padrão de ligações de hidrogênio não está confinado aos resíduos N- e C-terminais do peptideo, mas distribuído por toda a cadeia. Este último fator é importante porque restringe a conformação de peptídeos complexados a um modo de ligação estritamente linear. Isto é comum para todos os alotipos da classe II. 0 segundo componente que determina a afinidade de ligação de um peptideo é variável devido a certas posições de polimorfismo nos sítios de ligação da classe II. Diferentes alotipos formam diferentes bolsões complementares dentro do sulco, explicando, assim, a seleção subtipo-dependente de peptídeos, ou especificidade. É importante ressaltar que as restrições quanto aos resíduos de aminoácidos contidos nos bolsões da classe II são, em geral, mais moles do que para a classe I. Há muito mais reatividade cruzada de peptídeos entre diferentes alotipos de HLA da classe II. A sequência dos +/- 9 aminoácidos (isto é, 8, 9 ou 10) de um epítopo de células T de MHC da classe II que se encaixa no sulco da molécula de MHC II é geralmente numerada de Pl a P9. Os aminoácidos N-terminais adicionais do epítopo são numerados P-l, P-2 e assim por diante, os aminoácidos Cterminais do epítopo são numerados P+l, P+2 e assim por diante.

[0048] O termo homólogo, conforme aqui usado, com referência aos epítopos usados no contexto da invenção,

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15/67 refere-se a moléculas tendo pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% identidade da sequência de aminoácidos com o epítopo de ocorrência natural, mantendo-se, assim, a capacidade do epítopo de se ligar a um anticorpo ou a um receptor de superfície celular de uma célula B e/ou T. Homólogos particulares de um epítopo correspondem ao epítopo natural modificado em no máximo três, mais particularmente em no máximo 2, o mais particularmente em um aminoácido.

[0049] O termo derivado, conforme aqui usado, com referência aos peptídeos da invenção, refere-se a moléculas que contêm pelo menos a porção ativa do peptídeo (isto é, o motivo redox e o epítopo de MHC da classe II que tem a capacidade de provocar a atividade das células T CD4+ citolíticas) e, além disso, compreende um porção complementar que pode ter finalidades diferentes, tais como estabilizar os peptídeos ou alterar as propriedades farmacocinéticas ou farmacodinâmicas do peptídeo.

[0050] O termo identidade de sequência de duas sequências, conforme aqui usado, refere-se ao número de posições com nucleotideos ou aminoácidos idênticos dividido pelo número de nucleotideos ou aminoácidos na mais curta das sequências, quando as duas sequências estão alinhadas. Em particular, a identidade da sequência é de 70% a 80%, de

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81% a 85%, de 86% a 90%, de 91% a 95%, de 96% a 100%, ou 100% .

[0051] Os termos polinucleotideo (ou ácido nucleico) que codifica peptideos e polinucleotideo (ou ácido nucleico) que codifica peptideos, conforme aqui usados, referem-se a uma sequência nucleotídica que, quando expressa em um ambiente apropriado, resulta na geração da sequência peptídica relevante ou de um derivado ou homólogo da mesma. Tais polinucleotídeos ou ácidos nucleicos incluem as sequências normais que codificam o peptídeo, assim como derivados e fragmentos destes ácidos nucleicos que têm a capacidade de expressar um peptídeo com a atividade requerida. O ácido nucleico que codifica um peptídeo de acordo com a invenção ou fragmento do mesmo é uma sequência que codifica o peptídeo ou fragmento do mesmo, originário de um mamífero ou correspondendo a um mamífero, mais particularmente um fragmento de peptídeo humano.

[0052] Os termos transtornos imunes ou doenças imunes referem-se a doenças em que uma reação do sistema imune é responsável por ou sofre um mau funcionamento ou situação não fisiológica em um organismo. Entre os transtornos imunes estão incluídos, entre outros, transtornos alérgicos e doenças autoimunes.

[0053] Os termos doença autoimune ou transtorno autoimune referem-se a doenças que resultam de uma

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17/67 resposta imune aberrante de um organismo contra suas próprias células e tecidos devido a uma falha do organismo em reconhecer suas próprias partes constituintes (até o nivel submolecular) como sendo próprias (self) . 0 grupo de doenças pode ser dividido em duas categorias, doenças órgão-especificas e doenças sistêmicas. Um alérgeno é definido como uma substância, geralmente uma macromolécula ou uma composição proteica que provoca a produção de anticorpos IgE em indivíduos (atópicos) pacientes predispostos, particularmente dispostos geneticamente. Definições similares são apresentadas em Liebers et al. (1996) Clin. Exp. Allergy 26, 494-516.

[0054] O termo diabetes tipo 1 (T1D; também conhecida como diabetes mellitus tipo 1 ou diabetes mediada por imunidade ou anteriormente conhecida como diabetes de início juvenil ou diabetes dependente de insulina) é um transtorno autoimune que tipicamente se desenvolve em indivíduos suscetíveis durante a infância. Na base da patogênese de T1D, está a destruição da maioria das células beta pancreáticas produtoras de insulina por um mecanismo autoimune. Resumidamente, o organismo perde a tolerância imune às células beta pancreáticas responsáveis pela produção de insulina e induz uma resposta imune, principalmente mediada por células, associada à produção de autoanticorpos, o que leva à autodestruição das células

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18/67 beta .

[0055] O termo quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade do peptídeo da invenção ou derivado do mesmo que produz o efeito terapêutico ou preventivo desejado em um paciente. Por exemplo, com referência a uma doença ou transtorno, é a quantidade que reduz em certa medida um ou mais sintomas da doença ou transtorno e, mais particularmente, faz retornarem ao normal, parcial ou completamente, os parâmetros fisiológicos ou bioquímicos associados a ou causadores da doença ou transtorno. Tipicamente, a quantidade terapeuticamente eficaz é a quantidade do peptídeo da invenção ou derivado do mesmo que levará a uma melhora ou restauração da situação fisiológica normal. Por exemplo, quando usada para tratar terapeuticamente um mamífero afetado por um transtorno imunológico, é uma quantidade diária de peptídeo/kg de peso corporal do referido mamífero. Alternativamente, quando a administração é através de terapia gênica, a quantidade de DNA nu ou de vetores virais é ajustada para garantir a produção local da dosagem relevante do peptídeo da invenção, derivado ou homólogo do mesmo.

[0056] O termo natural, quando se refere a um peptídeo, diz respeito ao fato de que a sequência é idêntica a um fragmento de uma proteína de ocorrência

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19/67 natural (tipo selvagem ou mutante). Em contraste a isto, o termo artificial refere-se a uma seguência que, como tal, não ocorre na natureza. Uma sequência artificial é obtida a partir de uma sequência natural por modificações limitadas, tais como mudança/exclusão/inserção de um ou mais aminoácidos na sequência de ocorrência natural ou adição/remoção dos aminoácidos N- ou C-terminais de uma sequência de ocorrência natural.

[0057] Aqui, refere-se aos aminoácidos pelo seu nome completo, sua abreviação de três letras ou sua abreviação de uma letra.

[0058] Os motivos de sequências de aminoácidos são aqui escritos de acordo com o formato do Prosite. Motivos são usados para descrever uma certa variedade de sequências em partes específicas de uma sequência. O símbolo X é usado para uma posição em que é aceito qualquer aminoácido. As alternativas são indicadas listando-se os aminoácidos aceitáveis para uma determinada posição, entre colchetes ('[]'). Por exemplo: [CST] significa um aminoácido selecionado dentre Cys, Ser ou Thr. Os aminoácidos que são excluídos como alternativas são indicados listando-os entre colchetes ('{}'). Por exemplo: {AM} significa qualquer aminoácido, exceto Ala e Met. Os diferentes elementos em um motivo são opcionalmente separados um do outro por um hífen (-) . A repetição de um elemento idêntico dentro de um

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20/67 motivo pode ser indicada colocando-se, após esse elemento, um valor numérico ou um intervalo numérico entre parênteses. Por exemplo, X(2) corresponde a X-X ou a XX; X(2, 5) corresponde a 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos X, A(3) corresponde a A-A-A ou AAA.

[0059] Para distinguir entre os aminoácidos X, aqueles entre H e C são denominados aminoácidos X externos (sublinhados uma vez na sequência acima), aqueles dentro do motivo redox são denominados aminoácidos X internos (sublinhados duas vezes na sequência acima).

[0060] X representa qualquer aminoácido, particularmente um aminoácido L, mais particularmente um dos 20 L-aminoácidos de ocorrência natural.

[0061] Um peptideo, compreendendo um epitopo de células T e uma sequência peptidica de um motivo modificada, com atividade redutora, tem a capacidade de gerar uma população de células T CD4+ citoliticas antigenoespecificas em relação às células apresentadoras de antigenos.

[0062] Consequentemente, em seu sentido mais amplo, a invenção refere-se a peptideos que compreendem pelo menos um epitopo de células T de um antigeno (próprio (self) ou não próprio (non-self)) com potencial de desencadear uma reação imune, e um motivo de sequência de tiorredutase modificado e com atividade redutora sobre as ligações

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21/67 dissulfeto peptídicas. 0 epítopo de células Tea sequência do motivo redox modificado podem estar imediatamente adjacentes um ao outro no peptídeo ou opcionalmente separados por um ou mais aminoácidos (a chamada sequência de ligante (linker sequence)). Opcionalmente, o peptídeo compreende adicionalmente uma sequência de direcionamento para endossomo e/ou sequências flanqueadoras adicionais.

[0063] Os peptídeos da invenção compreendem um epítopo de células T do MHC da classe II de um antígeno (próprio (self) ou não próprio (non-self)) com potencial de desencadear uma reação imune e um motivo redox modificado. A atividade redutora da sequência do motivo no peptídeo pode ser ensaiada quanto à sua capacidade de reduzir um grupo sulfidrila, tal como no ensaio de solubilidade de insulina, em que a solubilidade da insulina é alterada após redução, ou com um substrato marcado fluorescentemente, tal como a insulina. Um exemplo de tal ensaio usa um peptídeo fluorescente e é descrito por Tomazzolli et al. (2006) Anal. Biochem. 350, 105-112. Dois peptídeos com um marcador de FITC tornam-se autoextinguíveis quando covalentemente ligados um ao outro através de uma ponte dissulfeto. Após redução por um peptídeo de acordo com a presente invenção, os peptídeos individuais reduzidos tornam-se novamente fluorescentes.

[0064] O motivo redox modificado pode ser

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22/67 posicionado no lado amino-terminal do epítopo de células T ou no carbóxi-terminal do epítopo de células T.

[0065] Fragmentos peptídicos com atividade redutora são encontrados em tiorredutases, que são pequenas enzimas redutoras de dissulfeto, incluindo glutarredoxinas, nucleorredoxinas, tiordedoxinas e outras oxidorredutases tiol/dissulfeto (Holmgren (2000) Antioxid. Redox Signal. 2, 811-820; Jacquot et al. (2002) Biochem. Pharm. 64, 10651069). São multifuncionais, ubíquos e encontrados em muitos procariotos e eucariotos. Exercem atividade redutora para ligações dissulfeto em proteínas (tais como enzimas) através de cisteínas ativas redox dentro de sequências consenso conservadas do domínio ativo: CXXC [SEQ ID NO:18], CXXS [SEQ ID NO:23], CXXT [SEQ ID NO:24], SXXC [SEQ ID NO:21], TXXC [SEQ ID NO:22] (Fomenko et al. (2003) Biochemistry 42, 11214-11225; Fomenko et al. (2 002) Prot. Science 11, 2285-2296), onde X significa qualquer aminoácido. Tais domínios também são encontrados em proteínas maiores, tais como a proteína dissulfeto isomerase (PDI) e a fosfolipase C fosfoinositídeoespecífica.

[0066] O motivo redox de 4 aminoácidos conhecido, por exemplo, de Fomenko e WQ2008/017517, compreende uma cisteína na posição 1 e/ou 4; assim, o motivo é ou CXX[CST] [SEQ ID NO: 1] ou [CST]XXC [SEQ ID NO: 2 ] . Referir-se-á a

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23/67 tal sequência tetrapeptídica como o motivo. O motivo em um peptídeo pode ser qualquer uma das alternativas CXXC [SEQ ID N0:18], SXXC [SEQ ID N0:21], TXXC [SEQ ID NO:22], CXXS [SEQ ID NO:23] ou CXXT [SEQ ID NO:24]. Em particular, os peptideos contêm o motivo de sequência CXXC [SEQ ID NO:18].

[0067] Como explicado em detalhes adiante, os peptideos da presente invenção podem ser produzidos por síntese química, o que permite a incorporação de aminoácidos não naturais. Consequentemente, C nos motivos redox modificados por redox enumerados acima representa cisteína ou um outro aminoácido com um grupo tiol, tal como mercaptovalina, homocisteína ou outros aminoácidos naturais ou não naturais com uma função tiol. Para terem atividade redutora, as cisteínas presentes em um motivo redox modificado não deverão ocorrer como parte de uma ponte dissulfeto de cistina. No entanto, um motivo redox

modificado por	redox	pode	compreender	cisteínas
modificadas, tais	como	cisteína	metilada,	a qual	é
convertida em cisteína com grupos	tiol livres	ín vivo.	X

pode ser qualquer um dos 20 aminoácidos naturais, incluindo S, C ou T, ou pode ser um aminoácido não natural. Em modalidades particulares, X é um aminoácido com uma cadeia lateral pequena, tais como Gly, Ala, Ser ou Thr. Em outras modalidades particulares, X não é um aminoácido com uma

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24/67 cadeia lateral volumosa, tal como Trp. Em outras modalidades particulares, X não é Cisteína. Em outras modalidades particulares, pelo menos um X no motivo redox modificado é His. Em outras modalidades particulares adicionais, pelo menos um X no redox modificado é Pro.

[0068] Os peptídeos podem ainda compreender modificações para aumentar a estabilidade ou solubilidade, tal como modificação do grupo NH2 do N-terminal ou o grupo COOH do C-terminal (por exemplo, modificação do COOH em um grupo CONH2) .

[0069] Nos peptídeos da presente invenção compreendendo um motivo redox modificado, o motivo está localizado de modo que, quando o epítopo se encaixa no sulco de MHC, o motivo permanece fora do sulco de ligação a MHC. O motivo redox modificado é colocado ou imediatamente adjacente à sequência do epítopo dentro do peptideo [em outras palavras, uma sequência de ligante (linker) de zero aminoácidos entre motivo e epítopo], ou é separado do epítopo de células T por um ligante (linker) compreendendo uma sequência de aminoácidos de 5 aminoácidos ou menos. Mais particularmente, o ligante (linker) compreende 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos. Modalidades específicas são peptídeos com um ligante (linker) de 0, 1 ou 2 aminoácidos entre a sequência do epítopo e a sequência do motivo redox modificado. Nos peptídeos em que a

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25/67 sequência do motivo redox modificado é adjacente à sequência do epítopo, isto é indicado como posição P-4 a P1 ou P+l a P+4 em comparação com a sequência do epítopo. Além de um ligante (linker) peptídico, outros compostos orgânicos podem ser usados como ligante (linker) para ligar as partes do peptídeo entre si (por exemplo, a sequência do motivo redox modificado em relação à sequência do epítopo de células T).

[0070] Os peptídeos da presente invenção podem adicionalmente compreender sequências adicionais curtas de aminoácidos em posição N- ou C-terminal em relação à sequência compreendendo o epítopo de células T e o motivo redox modificado. Em geral, refere-se aqui a tal sequência de aminoácidos como uma 'sequência flanqueadora'. Uma sequência flanqueadora pode ser posicionada entre o epítopo e uma sequência de direcionamento para endossomo e/ou entre o motivo redox modificado e uma sequência de direcionamento para endossomo. Em certos peptídeos, não compreendendo uma sequência de direcionamento para endossomo, uma sequência curta de aminoácidos pode estar presente em posição N- ou C-terminal em relação ao motivo redox modificado e/ou à sequência do epítopo no peptídeo. Mais particularmente, uma sequência flanqueadora é uma sequência entre 1 e 7 aminoácidos, mais particularmente uma sequência de 2 aminoácidos.

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26/67 [0071] O motivo redox modificado pode estar localizado no N-terminal do epítopo.

[0072] Em certas modalidades da presente invenção, os peptídeos são proporcionados compreendendo uma sequência de epítopo e uma sequência de motivo redox modificado. Em outras modalidades particulares, o motivo redox modificado ocorre várias vezes (1, 2, 3, 4 ou até mais vezes) no peptídeo, por exemplo, como repetições do motivo redox modificado que podem ser espaçadas entre si por um ou mais aminoácidos ou como repetições que estão imediatamente adjacentes umas às outras. Alternativamente, um ou mais motivos redox modificados são proporcionados no N- e Cterminal da sequência do epítopo de células T.

[0073] Outras variações previstas para os peptídeos da presente invenção incluem peptídeos que contêm repetições de uma sequência de epítopos de células T em que cada sequência de epítopo é precedida e/ou seguida pelo motivo redox modificado (por exemplo, repetições de motivo redox modificado-epítopo ou repetições de motivo redox modificado-epítopo-motivo redox modificado). Aqui, os motivos redox modificados podem ter todos a mesma sequência, mas isto não é obrigatório. Note-se que sequências repetidas de peptídeos que compreendem um epítopo que por si só compreende o motivo redox modificado também resultarão em uma sequência compreendendo o tanto o

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'epitopo'	quanto um '	motivo	redox modificado'. Em	tais
peptideos,	o	motivo	redox	modificado dentro de	uma
sequência	de	epitopo	funciona como um motivo	redox
modificado	fora	de uma	segunda	sequência de epitopo.

[0074] Tipicamente, os peptideos da presente invenção compreendem apenas um epitopo de células T. Como descrito abaixo, um epitopo de células T em uma sequência de proteínas pode ser identificado por ensaios funcionais e/ou um ou mais ensaios de prevdição in silica. Os aminoácidos em uma sequência de epitopo de células T são numerados de acordo com sua posição no sulco de ligação de proteínas MHC. Um epitopo de células T presente em um peptídeo consiste em 8 a 25 aminoácidos, ainda mais particularmente entre 8 e 16 aminoácidos, ainda o mais particularmente consiste em 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 aminoácidos.

[0075] Em uma modalidade mais particular, o epitopo de células T consiste em uma sequência de 9 aminoácidos. Em uma modalidade particular adicional, o epitopo de células T é um epitopo que é apresentado às células T por moléculas do MHC da classe II [epítopos de células T restritos ao MHC da classe II]. Tipicamente, a sequência do epitopo de células T refere-se à sequência do octapeptídeo ou, mais especificamente, à do nonapeptídeo que se encaixa na fenda de uma proteína do MHC II.

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28/67 [0076] O epitopo de células T dos peptideos da presente invenção pode corresponder ou a uma sequência de epitopo natural de uma proteína ou pode ser uma versão modificada da mesma, contanto que o epitopo de células T modificado retenha sua capacidade de se ligar dentro da fenda de MHC, similar à sequência de epitopo de células T natural. O epitopo de células T modificado pode ter a mesma afinidade de ligação pela proteína de MHC que o epitopo natural, mas também pode ter uma afinidade reduzida. Em particular, a afinidade de ligação do peptídeo modificado é não menos que 10 vezes menor que a do peptídeo original, mais particularmente não menos que 5 vezes menor. Os peptideos da presente invenção têm um efeito estabilizador sobre complexos proteicos. Consequentemente, o efeito estabilizador do complexo peptídeo-MHC compensa a afinidade reduzida do epitopo modificado pela molécula de MHC.

[0077] A sequência compreendendo o epitopo de células T e o composto redutor no peptídeo podem estar adicionalmente ligados a uma sequência de aminoácidos (ou a um outro composto orgânico) que facilite a absorção do peptídeo nos endossomos tardios para processamento e apresentação dentro dos determinantes do MHC da classe II. O direcionamento para endossomos tardios é mediado por sinais presentes na cauda citoplasmática das proteínas e corresponde a motivos peptídicos bem identificados. As

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29/67 sequências de direcionamento para endossomos tardios permitem o processamento e a apresentação eficiente do epitopo de células T derivado de antigenos por moléculas de MHC da classe II. Tais sequência de direcionamento para endossomos estão contidas, por exemplo, na proteína gp75 (Vijayasaradhi et al. (1995) J. Cell. Biol. 130, 807-820), a proteína gama de CD3 humana, o HLA-BM 11 (Copier et al. (1996) J. Immunol. 157, 1017-1027), a cauda citoplasmática do receptor DEC205 (Mahnke et al. (2000) J. Cell Biol. 151, 673-683). Outros exemplos de peptídeos que funcionam como sinais de classificação (sorting signals) para o endossomo são divulgados na revisão de Bonifacio e Traub

(2003) Annu.	Rev.	Biochem.	72,	395-447. Alternativamente,	a
sequência pode	ser	a	de	um epitopo	de células	T
subdominante	ou	menor	de	uma	proteína, o	que facilita	a
absorção no	endossomo	tardio	sem suplantar	a resposta	de
células T	em	relação	ao	antígeno. A	sequência	de
direcionamento	para	endossomos tardios	pode estar

localizada ou no amino-terminal ou no carbóxi-terminal do peptídeo derivado de antígeno para absorção e processamento eficientes e também pode ser acoplada através de uma sequência flanqueadora, tal como uma sequência peptídica de até 10 aminoácidos. Quando se usa um epitopo de células T menor para fins de direcionamento, este último está tipicamente localizado na extremidade amino-terminal do

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30/67 peptídeo derivado de antígeno.

[0078] Consequentemente, a presente invenção prevê peptideos de proteínas antigênicas e seu uso para provocar reações imunes específicas. Estes peptideos podem corresponder a fragmentos de proteínas que compreendem, na sua sequência, isto é, um composto redutor e um epítopo de células T separados por no máximo 10, preferencialmente 7 aminoácidos ou menos. Alternativamente, e para a maioria das proteínas antigênicas, os peptideos da invenção são gerados acoplando-se um composto redutor, mais particularmente um motivo redox modificado redutor, conforme aqui descrito, em posição N- ou C-terminal em relação a um epítopo de células T da proteína antigênica (ou diretamente adjacente ao mesmo, ou com um ligante (linker) de no máximo 10, mais particularmente de no máximo 7 aminoácidos) . Além disso, a sequência de epítopo de células T da proteína e/ou do motivo redox modificado pode ser modificada e/ou uma ou mais sequências flanqueadoras e/ou uma sequência de direcionamento podem ser introduzidas (ou modificadas), em comparação com a sequência de ocorrência natural. Assim, dependendo se as características da presente invenção podem ou não ser encontradas dentro da sequência da proteína antigênica de interesse, os peptideos da presente invenção podem compreender uma sequência que é 'artificial' ou 'de

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31/67 ocorrência natural'.

[0079] Os peptídeos da presente invenção podem variar substancialmente de comprimento. O comprimento dos peptídeos pode variar de 13 ou 14 aminoácidos, isto é, consistindo de um epítopo de 8 a 9 aminoácidos, adjacentes ao mesmo os 5 aminoácidos com a histidina do motivo redox modificado, até 20, 25, 30, 40 ou 50 aminoácidos. Por exemplo, um peptídeo pode compreender uma sequência de direcionamento a endossomo de 40 aminoácidos, uma sequência flanqueadora de cerca de 2 aminoácidos, um motivo como aqui descrito de 5 aminoácidos, um ligante (linker) de 4 aminoácidos e um peptídeo de epítopo de células T de 9 aminoácidos.

[0080] Consequentemente, em modalidades particulares, o peptídeo completo consiste em 13 aminoácidos até 20, 25, 30, 40, 50, 75 ou 100 aminoácidos. Mais particularmente, quando o composto redutor for um motivo redox modificado, conforme aqui descrito, é crítico o comprimento da sequência (artificial ou natural) compreendendo o epítopo e o motivo redox modificado opcionalmente conectado por um ligante (linker) (ao qual aqui se refere como sequência 'epitopo-motivo redox modificado'), sem a sequência de direcionamento para endossomo. A 'epitopo-motivo redox modificado' tem, mais particularmente, um comprimento de 13, 14, 15, 16, 17, 18

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32/67 ou 19 aminoácidos. Tais peptídeos de 13 ou 14 a 19 aminoácidos podem opcionalmente ser acoplados a sinal de direcionamento para endossomo cujo tamanho é menos crítico.

[0081] Como detalhado acima, em modalidades particulares, os peptídeos da presente invenção compreendem um motivo redox modificado redutor, como aqui descrito, ligado a uma sequência de epítopo de células T.

[0082] Em outras modalidades particulares, os peptídeos da invenção são peptídeos compreendendo epítopos de células T que não compreendem uma sequência de aminoácidos com propriedades redox dentro da sua sequência natural.

[0083] No entanto, em modalidades alternativas, o epítopo de células T pode compreender qualquer sequência de aminoácidos garantindo a ligação do epítopo à fenda de MHC. Quando um epítopo de interesse de uma proteína antigênica compreende um motivo redox modificado, tal como aqui descrito, dentro de sua sequência de epítopo, os peptídeos imunogênicos de acordo com a presente invenção compreendem a sequência de um motivo redox modificado, conforme aqui descrito, e/ou de uma outra sequência redutora acoplada em posição N- ou C-terminal em relação à sequência do epítopo, de modo que (ao contrário do motivo redox modificado presente no epítopo, que está enterrado na fenda) o motivo redox modificado anexado possa garantir a atividade

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33/67 redutora.

[0084] Consequentemente, o epitopo de células Teo motivo estão imediatamente adjacentes ou separados um do outro e não se sobrepõem. Para avaliar o conceito de imediatamente adjacente ou separado, são determinadas a sequência de 8 ou 9 aminoácidos que se encaixa na fenda de MHC e a distância entre esse octapeptídeo ou nonapeptideo e o tetrapeptideo de motivo redox ou pentapeptideo de motivo redox modificado incluindo histidina.

[0085] Em geral, os peptideos da presente invenção são não naturais (portanto, nenhum fragmento de proteínas como tais), mas peptideos artificiais que contêm, além de um epitopo de células T, um motivo redox modificado como aqui descrito, por meio de que o motivo redox modificado está imediatamente separado do epitopo de células T por um ligante (linker) consistindo em até sete, mais particularmente até quatro ou até 2 aminoácidos.

[0086] Foi demonstrado que, após administração (isto é, injeção) a um mamífero de um peptídeo de acordo com a invenção (ou uma composição compreendendo tal peptídeo), o peptídeo provoca a ativação de células T que reconhecem o epitopo de células T derivado de antigeno e proporciona um sinal adicional para a célula T através da redução do receptor de superfície. Esta ativação supraótima resulta em células T adquirindo propriedades citolíticas em

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34/67 relação à célula que apresenta o epítopo de células T, assim como propriedades supressoras em células T espectadoras. Desta maneira, os peptídeos ou composição compreendendo os peptídeos descritos na presente invenção, que contêm um epítopo de células T derivado de antígeno e, fora do epítopo, pode ser usado um motivo redox modificado para imunização direta de mamíferos, incluindo seres humanos. A invenção proporciona, assim, peptídeos da invenção ou derivados do mesmo para uso como medicamento. Consequentemente, a presente invenção proporciona métodos terapêuticos que compreendem administrar um ou mais peptídeos de acordo com a presente invenção a um paciente com necessidade dos mesmos.

[0087] A presente invenção oferece métodos pelos quais células T antígeno-específicas, dotadas de propriedades citolíticas, podem ser elicitadas por imunização com peptídeos pequenos. Verificou-se que peptídeos que contêm (i) uma sequência que codifica um epítopo de células T de um antígeno e (ii) uma sequência consenso com propriedades redox, adicional e opcionalmente também compreendendo uma sequência para facilitar a absorção do peptídeo em endossomos tardios para apresentação eficiente de MHC da classe II, induzem células T supressoras.

[0088] As propriedades imunogênicas dos peptídeos

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35/67 da presente invenção são de particular interesse no tratamento e prevenção de reações imunes.

[0089] Os peptídeos aqui descritos são usados como medicamento, mais particularmente usados na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de um transtorno imune em um mamífero, mais particularmente em um ser humano.

[0090] A presente invenção descreve métodos de tratamento ou prevenção de um transtorno imune de um mamífero com necessidade de tal tratamento ou prevenção, usando-se os peptídeos, homólogos ou derivados dos mesmos, da invenção, compreendendo os métodos a etapa de administrar ao referido mamífero, que sofre de ou que está em risco de um transtorno imune, uma quantidade terapeuticamente eficaz dos peptídeos, homólogos ou derivados dos mesmos, da invenção, de modo a reduzir os sintomas do transtorno imune. Está previsto o tratamento de seres humanos e animais, tais como animais de estimação e animais de fazenda. Em uma modalidade, o mamífero a ser tratado é um humano. Os transtornos imunes aos quais se refere acima estão em uma modalidade particular selecionada a partir de doenças alérgicas e doenças autoimunes.

[0091] Os peptídeos da invenção ou a composição farmacêutica que os compreende, tal como aqui definido, são preferencialmente administrados através de administração

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36/67 subcutânea ou intramuscular. Preferencialmente, os peptídeos ou composições farmacêuticas que os compreendem podem ser injetados subcutaneamente (SC) na região da parte lateral do braço, a meio caminho entre o cotovelo e o ombro. Quando são necessárias duas ou mais injeções separadas, elas podem ser administradas concomitantemente em ambos os braços.

[0092] O peptideo de acordo com a invenção ou a composição farmacêutica que os compreende é administrado em uma dose terapeuticamente eficaz. Exemplos não limitantes de regimes de dosagem estão entre 50 e 1500 pg, preferencialmente entre 100 e 1200 pg. Esquemas de dosagem mais específicos podem estar entre 50 e 250 pg, entre 250 e 450 pg ou entre 850 e 1300 pg, dependendo da condição do paciente e da gravidade da doença. O regime de dosagem pode compreender a administração em uma dose única ou em 2, 3, 4, 5 ou mais doses, simultânea ou consecutivamente. Exemplos não limitantes de esquemas de administração são os seguintes:

Um esquema de doses baixas compreendendo a administração SC de 50 pg de peptideo em duas injeções separadas de 25 pg cada (100 pL cada), seguidas de três injeções consecutivas de 25 pg de peptideo como duas injeções separadas de 12,5 pg cada (50 pL cada).

Um esquema de doses médias compreendendo a

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37/67 administração SC de 150 pg de peptídeo em duas injeções separadas de 75 pg cada (300 pL cada), seguidas de três administrações consecutivas de 75 pg de peptídeo como duas injeções separadas de 37,5 pg cada (150 pL cada).

Um esquema de doses altas compreendendo a administração SC de 450 pg de peptídeo em duas injeções separadas de 225 pg cada (900 pL cada), seguidas de três administrações consecutivas de 225 pg de peptídeo como duas injeções separadas de 112,5 pg cada (450 pL cada).

[0093] Para todos os peptideos acima, estão previstas variantes adicionais, nas quais, entre Histidina e Cisteína, estão presentes um ou dois aminoácidos X Tipicamente, este(s) aminoácido(s) externo(s) X não é(são) His, Cys, Ser ou Thr.

[0094] Os peptideos da presente invenção também podem ser usados em métodos de diagnóstico in vitro para detectar células T CD4+ restritas à classe II em uma amostra. Neste método, uma amostra é colocada em contato com um complexo de uma molécula de MHC da classe II e um peptídeo de acordo com a presente invenção. As células T CD4+ são detectadas medindo-se a ligação do complexo às células da amostra, em que a ligação do complexo a uma célula é indicativa da presença de células T CD4+ na amostra.

[0095] O complexo pode ser uma proteína de fusão do

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38/67 peptídeo e de uma molécula de MHC da classe II.

[0096] Alternativamente, as moléculas de MHC no complexo são tetrâmeros. O complexo pode ser proporcionado como uma molécula solúvel ou pode estar ligado a um veículo.

[0097] Consequentemente, em modalidades particulares, os métodos de tratamento e prevenção da presente invenção compreendem a administração de um peptídeo imunogênico como aqui descrito, em que o peptídeo

compreende	um	epitopo	de células	T de	uma	proteína
antigênica	que	desempenha	um papel na	doença	a ser	tratada
(por exemplo,	como as	descritas	acima)	Em	outras
modalidades	particulares,	o epitopo	usado	é um	epitopo

dominante.

[0098] Os peptideos de acordo com a presente invenção serão preparados sintetizando-se um peptídeo em que o epitopo de células T e o motivo redox modificado estarão separados por 0 a 5 aminoácidos. Em certas modalidades, o motivo redox modificado pode ser obtido através introduzindo-se 1, 2 ou 3 mutações fora da sequência do epitopo, para preservar o contexto da sequência tal como ocorre na proteína. Tipicamente, os aminoácidos em P-2 e P-l, assim como em P+10 e P+ll, com referência ao nonapeptídeo que faz parte da sequência natural, estão preservados na sequência peptídica. Estes

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39/67 resíduos flanqueadores geralmente estabilizam a ligação a MHC da classe II. Em outras modalidades, o N-terminal da sequência ou o C-terminal do epítopo não estará relacionado à sequência da proteína antigênica que contém a sequência do epítopo de células T.

[0099] Assim, com base nos métodos acima para desenhar um peptídeo, é gerado um peptídeo por síntese química de peptídeos, métodos de expressão recombinante ou, em casos mais excepcionais, fragmentação proteolítica ou

química de	proteínas.
[0100]	Os peptídeos	produzidos	nos	métodos acima
podem ser	testados quanto	à presença	de	um epítopo	de
células T	em métodos in vitro e in	vivo	, e podem	ser

testados quanto à sua atividade redutora em ensaios in vitro. Como controle de qualidade final, os peptídeos podem ser testados em ensaios in vitro para verificar se os peptídeos podem gerar células T CD4+ que são citolíticas por meio de uma via apoptótica para células apresentadoras de antígenos apresentando o antigeno gue contém a sequência do epítopo que também está presente no peptídeo com o motivo redox modificado.

[0101] Os peptídeos da presente invenção podem ser gerados usando-se técnicas de DNA recombinante, em bactérias, leveduras, células de insetos, células vegetais ou células de mamíferos. Tendo em vista o comprimento

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40/67 limitado dos peptideos, eles podem ser preparados por síntese química de peptideos, em que os peptideos são preparados acoplando-se os diferentes aminoácidos entre si. A síntese química é particularmente adequada para a inclusão de, por exemplo, D-aminoácidos, aminoácidos com cadeias laterais de ocorrência não natural ou aminoácidos naturais com cadeias laterais modificadas, tais como cisteína metilada.

[0102] Os métodos químicos para síntese de peptideos estão bem descritos e os peptideos podem ser encomendados a empresas tais como a Applied Biosystems e outras empresas.

[0103] A síntese de peptideos pode ser realizada ou como síntese de peptideos em fase sólida (SPPS, do inglês solid phase peptide synthesis) ou contrária à síntese de peptideos em fase de solução. Os métodos de SPPS mais conhecidos são a química de fase sólida t-Boc e Fmoc:

[0104] Durante a síntese de peptideos, são usados vários grupos protetores. Por exemplo, as funcionalidades hidroxila e carboxila são protegidas pelo grupo t-butila, a lisina e o triptofano são protegidos pelo grupo t-Boc, e asparagina, glutamina, cisteína e histidina são protegidas pelo grupo tritila, e a arginina é protegida pelo grupo pbf. Caso apropriado, tais grupos protetores podem ser deixados no peptídeo após a síntese. Os peptideos podem ser

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41/67 ligados entre si para formarem peptídeos mais longos usando-se uma estratégia de ligação (ligation strategy) (acoplamento quimiosseletivo de dois fragmentos de peptídeos não protegidos), conforme descrito originalmente por Kent (Schnelzer & Kent (1992) Int. J. Pept. Protein Res. 40., 180-193) e revisado, por exemplo, por Tam et al. (2001) Biopolymers 60, 194-205, proporciona um tremendo potencial para alcançar a síntese de proteínas, o que está além do escopo da SPPS. Muitas proteínas com o tamanho de 100-300 resíduos foram sintetizadas com sucesso por este método. Os peptídeos sintéticos continuaram a desempenhar um papel cada vez mais crucial nos campos de pesquisa em bioquímica, farmacologia, neurobiologia, enzimologia e biologia molecular, devido aos enormes avanços na SPPS.

[0105] Alternativamente, os peptídeos podem ser sintetizados usando-se moléculas de ácidos nucleicos que codificam os peptídeos desta invenção em um vetor de expressão apropriado que inclui as sequências nucleotídicas codificadoras. Tais moléculas de DNA podem ser prontamente preparadas usando-se um sintetizador de DNA automatizado e a bem conhecida relação códon-aminoácido do código genético. Tal molécula de DNA também pode ser obtida como DNA genômico ou como cDNA usando-se sondas oligonucleotídicas e metodologias convencionais de hibridização. Tais moléculas de DNA podem ser incorporadas

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42/67 em vetores de expressão, incluindo plasmídeos, que são adaptados para a expressão do DNA e produção do polipeptídeo em um hospedeiro adequado, tal como bactéria, por exemplo, Escherichia coli, célula de levedura, célula animal ou célula vegetal.

[0106] As propriedades físicas e químicas de um peptídeo de interesse (por exemplo, solubilidade, estabilidade) são examinadas para determinar se o peptídeo é/seria adequado para uso em composições terapêuticas. Tipicamente, isto é otimizado ajustando-se a sequência do peptídeo. Opcionalmente, o peptídeo pode ser modificado após a síntese (modificações químicas, por exemplo, adição/exclusão de grupos funcionais) usando-se técnicas conhecidas na técnica.

[0107] Pensa-se que os epítopos de células T sozinhos desencadeiem eventos precoces no nível da célula auxiliar T, ligando-se a uma molécula de HLA apropriada na superfície de uma célula apresentadora de antígenos e estimulando a subpopulação de células T relevante. Estes eventos levam à proliferação de células T, secreção de linfocinas, reações inflamatórias locais, recrutamento de células imunes adicionais ao local, e ativação da cascata de células B, levando à produção de anticorpos. Um isotipo destes anticorpos, IgE, é fundamentalmente importante no desenvolvimento de sintomas alérgicos e sua produção é

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43/67 influenciada precocemente na cascata de eventos, no nível da célula T auxiliar, pela natureza das linfocinas secretadas. Um epitopo de células T é o elemento básico ou a menor unidade de reconhecimento por um receptor de células T, em que o epitopo compreende resíduos de aminoácidos essenciais para o reconhecimento de receptores, que são contíguos na sequência de aminoácidos da proteína.

[0108] No entanto, após a administração dos peptídeos com um epitopo de células T e um motivo redox, acredita-se que ocorram os seguintes eventos:

ativação de (i) células T antígeno-específicas resultantes da interação cognata com o peptídeo derivado de antígenos apresentado pelas moléculas de MHC da classe II; a sequência da redutase reduz as proteínas da superfície das células T, tais como a molécula CD4, cujo segundo domínio contém uma ponte dissulfeto restrita. Isto transduz um sinal para dentro das células T. Entre uma série de consequências relacionadas à via oxidativa aumentada, eventos importantes são influxo de cálcio e translocação do fator de transcrição NF-kB para o núcleo aumentados. O último resulta em transcrição aumentada de IFN-gama e granzimas, o que permite que as células adquiram propriedades citolíticas por meio de um mecanismo indutor de apoptose; a propriedade citolítica afeta as células que apresentam o peptídeo por um mecanismo que envolve a

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44/67 secreção de granzima B, e interações Fas-FasL. Uma vez que o efeito de morte celular é obtido por via apoptótica, células citolíticas são um termo mais apropriado do que células citotóxicas para estas células. A destruição das células alvo apresentadoras de antigenos impede a ativação de outras células T específicas para epítopos localizados no mesmo antigeno, ou para um antigeno não relacionado que seria processado pela mesma célula apresentadora de antigenos; uma consequência adicional da ativação das células T é suprimir a ativação das células T espectadoras por um mecanismo dependente de contatos célula-célula. Em tal caso, as células T ativadas por um antigeno apresentado por uma célula apresentadora de antigenos diferente também são suprimidas, desde que tanto as células T citolíticas quanto as espectadoras estejam próximas, ou seja, ativadas na superfície da mesma célula apresentadora de antigenos.

[0109] O mecanismo de ação acima postulado é substanciado por dados experimentais divulgados no pedido PCT W02008/017517 acima citado e publicações dos presentes inventores.

[0110] A presente invenção proporciona métodos para gerar células T CD4+ citolíticas antígeno-específicas, quer ín vivo quer in vitro e, independentemente disso, métodos para discriminar células T CD4+ citolíticas de outras populações celulares, tais como Foxp3+ Tregs, com base em

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45/67 dados de expressão característicos.

[0111] A presente invenção descreve métodos ín vivo para a produção de células T CD4+ antígeno-específicas. Uma modalidade particular refere-se ao método para produzir ou isolar as células T CD4+ imunizando-se animais (incluindo humanos) com os peptídeos da invenção como aqui descritos e, então, isolando-se as células T CD4+ a partir dos animais imunizados. A presente invenção descreve métodos ín vitro para a produção de células T CD4+ citolíticas antígeno-específicas quanto às APC. A presente invenção proporciona métodos para gerar células T CD4+ citolíticas antígeno-específicas quanto às APC.

[0112] Em uma modalidade, são proporcionados métodos que compreendem o isolamento de células do sangue periférico, a estimulação da população de células in vitro por um peptídeo imunogênico de acordo com a invenção e a expansão da população de células estimuladas, mais particularmente na presença de IL-2. Os métodos de acordo com a invenção têm a vantagem de ser produzido um número alto de células T CD4+ e de que as células T CD4+ podem ser geradas que são específicas para a proteína antigênica (usando-se um peptídeo compreendendo um epítopo antígenoespecifico).

[0113] Em uma modalidade alternativa, as células T CD4+ podem ser geradas in vivo, isto é, pela injeção dos

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46/67 peptídeos imunogênicos aqui descritos em um indivíduo e coleta das células T CD4+ citolíticas geradas ín vivo.

[0114] As células T CD4+ citolíticas antígenoespecíficas em relação à APC, obtidas pelos métodos da presente invenção, são de particular interesse para a administração a mamíferos para imunoterapia, na prevenção de reações alérgicas e no tratamento de doenças autoimunes. Está previsto o uso de células alogênicas e autogênicas.

[0115]	As	populações de células T	CD4 +	citolíticas
são obtidas	como aqui descrito abaixo.
[0116]	As	células T CD4+ citol	í tica	s antígeno-
específicas,	como	aqui descritas, podem	ser	usadas como
medicamento,	mais	particularmente para	uso	em terapia
celular adotiva,	mais particularmente no tratamento de

reações alérgicas agudas e recidivas de doenças autoimunes, tais como esclerose múltipla. Células T CD4+ citolíticas isoladas ou populações de células, mais particularmente populações de células T CD4+ citolíticas antígenoespecíficas geradas como descrito são usadas para a fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de transtornos imunes. São divulgados métodos de tratamento

usando-se	as células T CD4+	citolíticas	isoladas ou
geradas.
[0117]	Como explicado no	documento	WO2008/017517,
as células	T CD4+ citolíticas em	relação às	APC podem ser

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distinguidas das	células Treg	naturais com	base nas
características	de	expressão	das	células. Mais
particularmente,	uma	população	de	células	T CD4 +
citolíticas demonstra	uma ou	mais	das	seguintes

características em comparação com uma população de células Treg naturais:

[0118] uma expressão aumentada de marcadores de superfície, incluindo CD103, CTLA-4, Fasl e ICOS após a ativação, expressão intermediária de CD25, expressão de CD4, ICOS, CTLA-4, GITR e baixa ou nenhuma expressão de CD127 (IL7-R), nenhuma expressão de CD27 .

expressão do fator de transcrição T-bet e egr-2 (Krox20), mas não do repressor de transcrição Foxp3, uma alta produção de IFN-gama e nenhuma ou apenas pequenas quantidades de IL-10, IL-4, IL-5, IL-13 ou TGFbeta.

[0119] Além disso, as células T citolíticas expressam CD45RO e/ou CD45RA, não expressam CCR7, CD27 e apresentam altos níveis de granzima B e de outras granzimas, além do ligante (ligand) Fas.

[0120] Os peptídeos da invenção, após administração a um animal vivo, tipicamente um ser humano, elicitarão células T específicas que exercem uma atividade supressora

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48/67 sobre células T espectadoras.

[0121] Em modalidades específicas, as populações de células citolíticas da presente invenção são caracterizadas pela expressão de FasL e/ou interferon gama. Em modalidades específicas, as populações de células citolíticas da presente invenção são adicionalmente caracterizadas pela expressão de GranzimaB.

[0122] Este mecanismo também implica e os resultados experimentais mostram que os peptídeos da invenção, embora compreendam um epítopo específico de células T de um determinado antígeno, podem ser usados para a prevenção ou tratamento de transtornos provocados por uma reação imune contra outros epítopos de células T do mesmo antígeno ou, em certas circunstâncias, até mesmo para o tratamento de transtornos provocados por uma reação imune contra outros epítopos de células T de outros antígenos diferentes, se eles fossem apresentados através do mesmo

mecanismo pelas	moléculas	de MHC da classe II	nas
proximidades	das	células T	ativadas por peptídeos	da
invenção.
[0123]	São	divulgadas	populações celulares isoladas

do tipo celular com as características descritas acima, as quais, além disso, são antígeno-específicas, isto é, têm a capacidade de suprimir uma resposta imune antígenoespecí fica .

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49/67 [0124] A presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um ou mais peptídeos de acordo com a presente invenção, compreendendo adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. Como detalhado acima, a presente invenção também se refere às composições para uso como medicamento ou aos métodos para tratar um mamífero de um transtorno imune usando-se a composição e ao uso das composições para a fabricação de um medicamento para prevenção ou tratamento de transtornos imunes. A composição farmacêutica pode, por exemplo, ser uma vacina adequada para o tratamento ou prevenção de transtornos imunes, especialmente alergias aéreas e alimentares, assim como doenças de origem alérgica. Como um exemplo de uma composição farmacêutica, aqui descrito adicionalmente, um peptideo de acordo com a invenção é adsorvido sobre um adjuvante adequado para administração a mamíferos, tal como hidróxido de alumínio (alúmen). Tipicamente, 50 pg do peptideo adsorvido sobre alúmen são injetados por via subcutânea em 3 ocasiões, em intervalos de 2 semanas. Deverá ser óbvio para os especialistas na técnica que são possíveis outras vias de administração, incluindo oral, intranasal ou intramuscular. Além disso, o número de injeções e a quantidade injetada podem variar dependendo das condições a serem tratadas. Além disso, podem ser usados outros adjuvantes que não o alúmen, contanto que

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50/67 facilitem a apresentação de peptideos na apresentação de MHC da classe II e na ativação de células T. Assim, embora seja possível administrar os ingredientes ativos isoladamente, eles normalmente são apresentados como formulações farmacêuticas. As formulações, tanto para uso veterinário quanto para uso humano, da presente invenção compreendem pelo menos um ingrediente ativo, como descrito acima, juntamente com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção refere-se a composições farmacêuticas, compreendendo, como ingrediente ativo, um ou mais peptideos de acordo com a invenção, em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica da presente invenção deverá compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz do ingrediente ativo, tal como aqui indicado a seguir em relação ao método de tratamento ou de prevenção. Opcionalmente, a composição compreende adicionalmente outros ingredientes terapêuticos. Outros ingredientes terapêuticos adeguados, assim como a sua dosagem habitual, dependendo da classe a que pertencem, são bem conhecidos dos especialistas na técnica e podem ser selecionados a partir de outros medicamentos conhecidos usados para tratar transtornos imunes.

[0125] O termo veiculo farmaceuticamente aceitável, tal como aqui usado, significa qualquer material ou substância com os quais o ingrediente ativo é

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51/67 formulado para facilitar sua aplicação ou disseminação no local a ser tratado, por exemplo, dissolvendo-se, dispersando-se ou difundindo-se a composição, e/ou para facilitar seu armazenamento, transporte ou manuseio sem prejudicar sua eficácia. Eles incluem todo e qualquer solvente, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo, fenol, ácido sórbico, clorobutanol) , agentes isotônicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio) e semelhantes. Ingredientes adicionais podem ser incluídos para controlar a duração da ação do peptídeo imunogênico na composição. 0 veículo farmaceuticamente aceitável pode ser um sólido ou um líquido ou um gás que tenha sido comprimido para formar um líquido, isto é, as composições desta invenção podem ser adequadamente usadas como concentrados, emulsões, soluções, granulados, pós finamente divididos (dusts), sprays, aerossóis, suspensões, pomadas, cremes, comprimidos, pastilhas ou pós. Os veículos farmacêuticos adequados para uso nas composições farmacêuticas e sua formulação são bem conhecidos dos especialistas na técnica e não há nenhuma restrição particular à sua seleção dentro da presente invenção. Eles também podem incluir aditivos, tais como agentes molhantes, dispersantes, adesivos, agentes emulsificantes, solventes, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos (por exemplo, fenol, ácido

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52/67 sórbico, clorobutanol), agentes isotônicos (tais como açúcares ou cloreto de sódio) e semelhantes, contanto que os mesmos sejam consistentes com a prática farmacêutica, isto é, veículos e aditivos que não criem danos permanentes aos mamíferos. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser preparadas de qualquer maneira conhecida, por exemplo, misturando-se homogeneamente, revestindo-se e/ou moendo-se os ingredientes ativos, em um procedimento de uma ou múltiplas etapas, com o material do veículo selecionado e, quando apropriado, com os outros aditivos, tais como agentes tensoativos. Eles também podem ser preparados por micronização, por exemplo, para obtê-los na forma de microesferas geralmente com um diâmetro de cerca de 1 a 10 pm, ou seja, para a fabricação de microcápsulas para liberação controlada ou sustentada dos ingredientes ativos.

[0126] Agentes tensoativos adequados, também conhecidos como emulgentes ou emulsificantes, a serem usados nas composições farmacêuticas da presente invenção são materiais não iônicos, catiônicos e/ou aniônicos tendo boas propriedades emulsificantes, dispersantes e/ou molhantes. Surfactantes aniônicos adequados incluem tanto sabões solúveis em água como agentes tensoativos sintéticos solúveis em água. Sabões adequados são sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, sais de amônio não

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53/67 substituídos ou substituídos de ácidos graxos superiores (C10-C22), por exemplo, os sais de sódio ou de potássio do ácido oleico ou esteárico, ou de misturas naturais de ácidos graxos que podem ser obtidos na forma de óleo de coco ou óleo de sebo. Surfactantes sintéticos incluem sais de sódio ou de cálcio de ácidos poliacrílicos; sulfonatos e sulfatos graxos; derivados de benzimidazol sulfonados e alquilarilsulfonatos. Sulfonatos ou sulfatos graxos geralmente estão na forma de sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos, sais de amônio não substituídos ou sais de amônio substituídos por um radical alquila ou acila tendo 8 a 22 átomos de carbono, por exemplo, o sal de sódio ou de cálcio do ácido lignossulfônico ou ácido dodecilsulfônico ou uma mistura de sulfatos de álcoois graxos obtidos a partir de ácidos graxos naturais, sais de metais alcalinos ou alcalino-terrosos de ésteres de ácido sulfúrico ou sulfônico (tal como lauril sulfato de sódio) e ácidos sulfônicos de adutos de álcoois graxos/óxido de etileno. Derivados de benzimidazol sulfonados adequados contêm tipicamente 8 a 22 átomos de carbono. Exemplos de alquilarilsulfonatos são os sais de sódio, de cálcio ou de alcanolamina do ácido dodecilbenzenossulfônico ou ácido dibutil-naftalenossulfônico ou um produto de condensação de ácido naftalenossulfônico/formaldeído. Também adequados são os fosfatos correspondentes, por exemplo, sais de éster de

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54/67 ácido fosfórico e um aduto de p-nonilfenol com etileno e/ou óxido de propileno, ou fosfolipídios. Fosfolipídios adequados para este propósito são os fosfolipídios naturais (originários de células animais ou vegetais) ou sintéticos do tipo cefalina ou lecitina, tais como, por exemplo, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilglicerina, lisolecitina, cardiolipina, dioctanilfosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina e suas misturas.

[0127] Surfactantes não iônicos adequados incluem derivados polietoxilados e polipropoxilados de alquilfenóis, álcoois graxos, ácidos graxos, aminas ou amidas alifáticas contendo pelo menos 12 átomos de carbono na molécula, alquilarenossulfonatos e dialquilsulfossuccinatos, tais como derivados de éter poliglicólico de álcoois alifáticos e cicloalifáticos, ácidos graxos saturados e insaturados e alquilfenóis, contendo os derivados tipicamente 3 a 10 grupos éter glicol e 8 a 20 átomos de carbono na porção do hidrocarboneto (alifático) e 6 a 18 átomos de carbono na porção alquila do alquilfenol. Surfactantes não iônicos adequados adicionais são adutos solúveis em água de óxido de polietileno com polipropileno glicol, etilenodiaminopolipropileno glicol contendo 1 a 10 átomos de carbono na cadeia alquílica, adutos os quais contêm 20 a 250 grupos de éter

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55/67 etilenoglicólico e/ou 10 a 100 grupos de éter propilenoglicólico. Tais compostos contêm geralmente de 1 a 5 unidades de etilenoglicol por unidade de propilenoglicol. Exemplos representativos de surfactantes não iônicos são nonilfenol - polietoxietanol, éteres poliglicólicos de óleo de mamona, adutos de polipropileno/óxido de polietileno, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilenoglicol e octilfenoxipolietoxietanol. Esteres de ácidos graxos de polietileno sorbitano (como trioleato de polioxietileno sorbitano), glicerol, sorbitano, sacarose e pentaeritritol também são surfactantes não iônicos adequados. Surfactantes catiônicos adequados incluem sais quaternários de amônio, particularmente haletos, tendo 4 radicais de hidrocarbonetos opcionalmente substituídos por halo, fenila, fenila ou hidróxi substituídos; por exemplo, sais de amônio quaternário contendo como N-substituinte pelo menos um radical alquila C8C22 (por exemplo, cetila, laurila, palmitila, miristila, oleíla e semelhantes) e, como substituintes adicionais, radicais alquila inferior, benzila e/ou hidroxialquil inferiores ou não substituídos.

[0128] Uma descrição mais detalhada de agentes tensoativos adequados para este propósito pode ser encontrada, por exemplo, em McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual (MC Publishing Crop., Ridgewood, New Jersey, 1981), Tensid-Taschenbucw', 2^a ed. (Hanser Verlag,

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56/67

Vienna, 1981) e Encyclopaedia of Surfactants, (Chemical Publishing Co., New York, 1981). Peptídeos, homólogos ou derivados dos mesmos, de acordo com a invenção (e seus sais fisiologicamente aceitáveis ou composições farmacêuticas, todos incluídos no termo ingredientes ativos) podem ser administrados por qualquer via apropriada à condição a ser tratada e apropriada para os compostos, proteínas e fragmentos aqui a serem administrados. Possíveis vias incluem regional, sistêmica, oral (forma sólida ou inalação), retal, nasal, tópica (incluindo ocular, bucal e sublingual), vaginal e parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intratecal e epidural) . A via de administração preferida pode variar, por exemplo, com o estado do receptor ou com as doenças a serem tratadas. Como aqui descrito, o(s) veículo (s) é(são) otimamente aceitável(is) no sentido de ser(em) compatível (is) com os outros ingredientes da formulação e não deletérios ao seu receptor. As formulações incluem aquelas adequadas para administração oral, retal, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), vaginal ou parenteral (incluindo subcutânea, intramuscular, intravenosa, intradérmica, intra-arterial, intratecal e epidural).

[0129] Formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções para injeção estéreis aquosas e

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57/67 não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do receptor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multidose, por exemplo, ampolas e frascos selados, e podem ser armazenadas em uma condição liofilizada, exigindo apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes do uso. Soluções e suspensões de injeção extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo descrito anteriormente.

[0130] Formulações típicas de dosagem unitária são aquelas que contêm uma dose diária ou subdose diária

unitária,	como	aqui	descrito acima,	ou uma fração
apropriada	das	mesmas,	de um ingrediente	ativo. Deve-se
entender	que,	além	dos ingredientes	particularmente

mencionados acima, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica, tendo em conta o tipo de formulação em questão, por exemplo, aquelas adequadas para administração oral podem incluir agentes aromatizantes. Peptídeos, homólogos ou derivados dos mesmos, de acordo com a invenção, podem ser usados para fornecer formulações farmacêuticas de liberação controlada

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58/67 contendo, como ingrediente ativo, um ou mais compostos da invenção (formulações de liberação controlada) nas quais a liberação do ingrediente ativo pode ser controlada e regulada para permitir dosagem com menor frequência ou para melhorar o perfil farmacocinético ou de toxicidade de um dado composto da invenção. Formulações de liberação controlada adaptadas para administração oral nas quais unidades discretas compreendendo um ou mais compostos da invenção podem ser preparadas de acordo com métodos convencionais. Ingredientes adicionais podem ser incluídos para controlar a duração da ação do ingrediente ativo na composição. Composições de liberação controlada podem, assim, ser obtidas selecionando-se veículos de polímeros apropriados, tais como, por exemplo, poliésteres, poliaminoácidos, polivinilpirrolidona, copolímeros de etileno-acetato de vinila, metilcelulose, carboximetilcelulose, sulfato de protamina e semelhantes. A taxa de liberação do fármaco e a duração da ação também podem ser controladas incorporando-se o ingrediente ativo em partículas, por exemplo, microcápsulas, de uma substância polimérica, tais como hidrogéis, ácido polilático, hidroximetilcelulose, polinietilmetacrilato e os demais polímeros acima descritos. Tais métodos incluem sistemas de liberação de fármacos coloidais, como lipossomos, microesferas, microemulsões, nanoparticulas,

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59/67 nanocápsulas e assim por diante. Dependendo da via de administração, a composição farmacêutica pode exigir revestimentos protetores. Formas farmacêuticas adequadas para injeção incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea dos mesmos. Veículos típicos para este fim incluem, portanto, tampões aquosos biocompatíveis, etanol, glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol e semelhantes e misturas dos mesmos. Tendo em vista o fato de que, quando vários ingredientes ativos são usados em combinação, eles não necessariamente produzem seu efeito terapêutico conjunto diretamente ao mesmo tempo no mamífero a ser tratado, a composição correspondente também pode estar na forma de um kit médio ou embalagem contendo os dois ingredientes em repositórios ou compartimentos separados, mas adjacentes. Neste último contexto, cada ingrediente ativo pode, portanto, ser formulado de uma maneira adequada para uma via de administração diferente da do outro ingrediente, por exemplo, um deles pode estar na forma de uma formulação oral ou parenteral, ao passo que o outro está na forma de uma ampola para injeção intravenosa ou de um aerossol.

[0131] As células T CD4+ citolíticas, como obtidas na presente invenção, induzem a apoptose da APC após a ativação cognata dependente de MHC da classe II, afetando tanto células dendríticas quanto células B, como

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60/67 demonstrado in vitro e in vivo, e (2) suprimem células T espectadoras por um mecanismo dependente de contato na ausência de IL-10 e/ou de TGF-beta. Células T CD4+ citolíticas podem ser distinguidas tanto das Tregs naturais quanto das adaptativas conforme discutido em detalhes no documento W02008/017517.

[0132] A presente invenção será agora ilustrada por meio dos seguintes exemplos que são fornecidos sem qualquer intenção limitante. Além disso, todas as referências aqui descritas são explicitamente incluídas aqui por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1: desenho de peptideos [0133] Em comparação com o peptídeo divulgado no documento WO2016059236, um peptídeo é sintetizado compreendendo um epitopo de células T do domínio C da insulina, em foi removida que a sequência do dipeptídeo VR, que não ocorre na sequência da insulina, como mostrado no alinhamento representado abaixo:

P17 001 : HCPYC VR SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 25]

P17 003 : HCPYC- SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 26] [0134] O peptídeo P17 003 contém, portanto, um motivo CxxC [SEQ ID NO: 18] precedido por His em que xx são Pro e Tyr. O epitopo de células T de 9 aminoácidos tem a sequência LALEGSLQK [SEQ ID NO: 3] e é separado do motivo CxxC [SEQ ID NO: 18] por um ligante (linker) de 4

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61/67 aminoácidos SLQP. O dipeptídeo RG é uma sequência flanqueadora c terminal do epítopo. Neste peptideo, a sequência SLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 20] é 100% idêntica à sequência tal como ocorre na insulina.

Exemplo 2: metodologia para avaliar a atividade redutora de peptídeos [0135] A atividade redutase dos peptídeos é determinada usando-se um fluorescente descrito em Tomazzolli et al. (2006) Anal. Blochem. 350, 105-112. Dois peptídeos com um marcador de FITC se tornam-se autoextinguíveis quando covalentemente ligados um ao outro através de uma ponte dissulfeto. Após redução por um peptideo de acordo com a presente invenção, os peptídeos individuais reduzidos tornam-se novamente fluorescentes.

[0136] Experimentos controle foram realizados com ditiotreitol (100% de atividade redutora) e água (100% de atividade redutora).

[0137] O peptideo P17 001 apresentou atividade redutora de 68%, ao passo que o peptideo P17 003 apresentou atividade redutora de 65%.

Exemplo 3: Liberação de interferon gama por linhagens de células T CD4+ citolíticas [0138] O interferon gama é um marcador importante para caracterizar células T CD4+ citolíticas.

[0139] Uma linhagem específica de células T CD4+

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62/67 foi obtida iniciando-se (priming) e estimulando-se células T CD4+ inativas (naive) de um paciente com T1D (T1D07) com o peptídeo pl7-001. Após 12 estimulações, as células foram cocultivadas com células B LCL autólogas carregadas (2 μΜ) com o peptídeo pl7-001 ou pl7-003. Após 24 horas, os sobrenadantes foram coletados e o IFN-gama foi medido por ensaio multiplex (vide a tabela 1 abaixo).

Tabela 1

	Estímulo 1
	IFN-gama (pg/ml)
pl7 UL	2,35 ± 1,2
pl7 001	11,1 ± 0,8
p!7 003	29,7 ± 14,1

[0140] Existe uma diferença marcante na produção de IFN-gama entre os dois peptídeos (cerca de 3 vezes mais IFN-gama produzido após estimulação com pl7 003 em comparação com pl7 001).

Exemplo 4: Liberação de FasL por linhagens de células T CD4+ citolíticas [0141] A linhagem de células T originalmente gerada com pl7 001 como descrito no exemplo 3 acima foi dividida e estimulada com o peptídeo P17 003 ou P17 001 ao longo de 4 estimulações sucessivas in vitro usando-se a linhagem de células B LCL autólogas como APC. No 11° dia de cada estimulação (total de 4), as células foram testadas quanto a FasL após reestimulação com o peptídeo correspondente

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63/67 apresentado por células B autólogas. Os sobrenadantes foram coletados após 24h (estimulação 1 e 2) ou 72h (estimulação 3 e 4) da cocultura.

Tabela 2 Expressão de FasL pelas linhagens de células

T CD4+ de pacientes com T1D

Expressão de FasL (pg/ml)	Estimulação 1	Estimulação 2	Estimulação 3	Estimulação 4
Controle	0	0	0	0
P17-001	1335 ± 23,1	1144 ± 15,4	1227 ± 49,1	1008 ± 102
P17-003	1795 ± 42,4	1812 ± 34,7	2063 ± 166	1526 ± 102

[0142] A expressão de FasL (também denominada sFasL) é significativamente maior para P17-003 para cada uma das quatro estimulações.

[0143] Isto ilustra uma maior capacidade do peptídeo P17-003 de gerar células T citolíticas em comparação com o peptídeo P17-001.

Exemplo 5: liberação de sFasL e produção de citocinas em PBMCs de pacientes com T1D.

[0144] As PBMCs do paciente T1D018 com T1D foram estimuladas in vitro ou com peptídeo P17001, ou com o peptídeo P17003. Estas duas populações liberam especificamente 11-5 após ativação antigênica. Após 6 ciclos de estimulação com os peptideos, ambas as linhagens celulares foram enriquecidas com relação a células produtoras de IL-5 com esferas de captura de citocinas. As duas populações de células negativas para Interleucina-5 foram usadas como controles.

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64/67 [0145] Estas quatro populações são então testadas quanto à liberação específica de sFasL, Granzima B e citocinas após estimulação com seu peptídeo cognato (P17001 ou P17-003) . Os sobrenadantes são coletados após 24 horas de cultura e sFasL e Granzima B são medidos por ELISA (sFasL: Diaclone 851730010; Granzima B: eBioscience BMS2027) e citocinas pelo kit MACSplex Cytokine 12 (Miltenyi, 130-099-169).

5.1 Produção de sFasL [0146] Os níveis de sFasL das quatro linhagens celulares são mostrados na figura 1. Isto mostra que as frações positivas para IL5 (histogramas pretos) que são enriquecidas em células específicas para o peptídeo pl7-003 ou pl7-001 liberam mais sFasL em comparação com as frações negativas (histogramas abertos), indicação de uma purificação celular específica eficiente.

[0147] Além disso, os resultados indicam que as células geradas por estimulação in vitro com pl7-003 liberam especificamente 4,5 vezes mais sFasL em comparação com as células geradas pelo peptídeo pl7-001 (p<0,0001).

5.2. Produção de Granzima B [0148] As frações positivas para IL5 que são enriquecidas em células específicas para o peptídeo pl7-003 ou pl7-001 são testadas quanto à liberação de mais Granzima B em comparação com as frações negativas para IL5, como uma

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65/67 medida da purificação eficiente de células específicas.

[0149] Além disso, as células geradas por estimulação in vitro com pl7-003 serão testadas quanto à liberação especificamente aumentada de Granzima B em comparação com as células geradas pelo peptídeo pl7-001.

5.3. Liberação de citocinas [0150] Para determinar se as células cultivadas in vitro a partir de doadores com T1D são específicas para o peptídeo P17001 ou P17003, a liberação de citocinas, uma característica de ativação celular após estimulação por peptideos, foi investigada usando-se o kit MACSplex Cytokine 12 (Miltenyi, 130-099-169). O sobrenadante foi coletado após 24 horas da cultura de PBMCs de doador com T1D na ausência ou na presença do peptídeo. As concentrações de citocinas foram determinadas para as duplicatas biológicas e exibidas em pg/mL. O teste de especificidade foi realizado no final da estimulação 10 (dia de descanso). O resultado é apresentado como a diferença na concentração de cada citocina nas condições sem e com peptídeo.

[0151] A Figura 2 mostra que a fração IL5 positiva da linhagem celular P17003 responde especificamente à estimulação em comparação com as linhagens celulares P17003 IL5 negativa, P17001 IL5 negativa e P17001 IL5 positiva. Isso ilustra que o peptídeo P17003 é mais potente em

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66/67 elicitar células peptídeo-específicas em comparação com o

P17001.

[0152] Em conclusão, as células geradas de novo com P17-003 são mais potentes na liberação de moléculas líticas (tais como sFasL e potencialmente Granzima B) e citocinas do que as células geradas com P17-001. O peptídeo, portanto, resulta em uma população de células CD4+ com propriedades citolíticas superiores contra APC que apresentam epítopos de insulina.

Exemplo 6: Ensaio clinico [0153] Antes da administração, o peptídeo da invenção é reconstituído com o diluente contendo o adjuvante. O produto deve ser reconstituído extemporaneamente e é usado preferencialmente em menos de 3 horas após a reconstituição.

[0154] O produto medicinal experimental pode ser formulado de modo que, após reconstituição no diluente, a concentração do peptídeo no frasco seja de 250 pg/ml. O volume apropriado será retirado para cumprir o protocolo do ensaio clínico. Por exemplo:

A dose baixa (Coorte 1) pode compreender a administração SC de 50 pg de peptídeo em duas injeções separadas de 25 pg cada (100 pL cada), seguidas de três injeções consecutivas de 25 pg de peptídeo como duas injeções separadas de 12,5 pg cada (50 pL cada).

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A dose média (Coorte 2) pode compreender a administração SC de 150 pg de peptídeo em duas injeções separadas de 75 pg cada (300 pL cada) , seguidas de três administrações consecutivas de 75 pg de peptídeo como duas injeções separadas de 37,5 pg cada (150 pL cada).

- A dose mais alta (Coorte 3) pode compreender a administração SC de 450 pg de peptídeo em duas injeções separadas de 225 pg cada (900 pL cada), seguidas de três administrações consecutivas de 225 pg de peptídeo como duas injeções separadas de 112,5 pg cada (450 pL cada).

[0155] Produtos experimentais de acordo com a invenção são preferencialmente injetados subcutaneamente (SC) na região da parte lateral do braço, a meio caminho entre o cotovelo e o ombro. Quando são necessárias duas injeções separadas, elas são preferencialmente administradas concomitantemente em ambos os braços: por exemplo, injeção 1 no braço direito e injeção 2 no braço esquerdo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo com um comprimento entre 12 e 50 aminoácidos caracterizado pelo fato de que compreende a sequência Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 4] ou [CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:5].
2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência CxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 6].
3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:7] ou H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO:8].
4. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência HCxxCSLQPLALEGSLQK [SEQ ID NO: 9] .

5. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que consiste na sequência de aminoácidos HCPYCSLQPLALEGSLQKRG [SEQ ID NO: 2 6] . 6. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das

reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso como medicamento.
7. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de diabetes tipo 1.

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8. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
9. Método in vitro para a geração de uma população de células T CD4+ citolíticas contra APC que apresentam epítopos de insulina caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

- proporcionar células sanguíneas periféricas;

- colocar em contato as referidas células in vitro com o peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; e

- expandir as referidas células na presença de IL-2.
10. População de células T CD4+ citolíticas contra APC que apresentam epítopos de insulina caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo método como definido na reivindicação 9.
11. População de células T CD4+ citolíticas contra APC que apresentam epítopos de insulina caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo método como definido na reivindicação 9, para uso como medicamento.
12. População de células T CD4+ citolíticas contra APC que apresentam epítopos de insulina caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo método como definido na reivindicação 9, para uso no tratamento ou prevenção de

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3/3 diabetes tipo 1.
13. Peptídeo imunogênico isolado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de diabetes tipo 1, ou para reduzir os sintomas de diabetes tipo 1.