CN114746111A

CN114746111A - 用于对糖尿病患者进行分层的方法

Info

Publication number: CN114746111A
Application number: CN202080081686.5A
Authority: CN
Inventors: 文森特·卡利尔
Original assignee: Imcyse SA
Current assignee: Imcyse SA
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2022-07-12
Also published as: US20230136112A1; WO2021105371A1; JP2023503630A; CA3163178A1; EP4065156A1; AU2020392512A1

Abstract

本发明涉及预测1型糖尿病患者对用包含胰岛素MHCII T细胞表位和氧化还原酶基序的免疫原性肽进行的治疗的响应的方法，所述方法包括确定患者的MHC II类HLA单倍型。

Description

用于对糖尿病患者进行分层的方法

背景技术

已描述了数种策略来防止针对抗原的不希望免疫应答的产生。WO2008/017517描述了使用包含给定抗原蛋白MHC II类T细胞表位和氧化还原酶基序的肽的新策略。这些肽将CD4+T细胞转化为具有溶细胞特性的细胞类型，称为溶细胞性CD4+T细胞。这些细胞能够通过触发凋亡杀伤那些抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)，所述抗原呈递细胞呈递从中获得肽的抗原。WO2008/017517示出了用于变态反应和自身免疫病(例如1型糖尿病)的这一概念。此处，胰岛素可充当自身抗原

WO2009101207和Carlier et al.(2012)Plos one 7,10e45366进一步更详细地描述了抗原特异性溶细胞性细胞。

WO2016059236还公开了经修饰的肽，其中在氧化还原酶基序附近存在另外的组氨酸。

WO2018162498还公开了包含氧化还原酶基序和另外的组氨酸以及来自胰岛素的MHCII T细胞表位的肽及其在治疗1型糖尿病(type 1diabetes，T1D)中的用途。

然而，即使考虑到上述情况，仍然需要对将受益于治疗最多的那些T1D患者亚群进行分层和选择的方法并且(如果需要的话)为没那么具有响应性的其他患者亚群定制所述治疗。到目前为止，还没有关于在T1D患者使用包含与氧化还原酶基序连接的胰岛素T细胞表位的免疫原性肽的作用以及患者对其响应的信息。

本发明已经鉴定了对T1D患者进行分层以获得良好响应可能性的方法。

发明内容

本发明提供了用于预测1型糖尿病患者对用包含胰岛素抗原和氧化还原酶基序的免疫原性肽进行的治疗的响应性的分层方法和工具，以及用于用所述免疫原性肽治疗这样的1型糖尿病患者的方法。

然而，本发明人已经发现，在患者中，所述响应性水平可取决于MHC II类单倍型。

本发明因此提供了以下方面：

1.用于预测1型糖尿病患者对用长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽进行的治疗的响应的体外方法，所述免疫原性肽包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列，所述方法包括确定患者的MHC II类HLA单倍型，其中将HLA-DR4阳性(HLA-DR4+)的患者预测为对所述治疗具有响应性。

术语“HLA DR4阳性”包括杂合或纯合HLA-DR4阳性的患者。

在一个实施方案中，所述患者也为HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

术语“HLA-DR3阴性”是指纯合HLA-DR3阴性的患者。

更特别地，所述分层方法鉴定了将从用根据本发明的免疫原性肽的治疗中特别好地受益的患者。

更特别地，所述分层方法将具有HLA-DR4阳性单倍型且任选地HLA-DR3阴性单倍型的患者鉴定为比HLA-DR4阴性的患者更具有响应性。

这种响应性可例如通过以下来确定：

-通过计算每日总胰岛素剂量/kg，其中与未经治疗或非响应性的患者相比，所述总数量的降低表明对治疗的积极响应；或者

-通过使用测量C肽分泌的MMTT测试，其中与未经治疗或非响应性的患者相比，响应性患者呈现出改善的趋势(C肽的中位降低比参考模型慢，δ比率为>0)。

在一些实施方案中，在所述患者中所述单倍型确定是使用基于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)的分析、序列分析、电泳分析或通过抗体测试进行的。

2.在患者中降低针对选自胰岛素(原)或C肽的自身抗原的免疫应答的方法，其包括施用长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽，所述免疫原性肽包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列，其中所述患者是基于存在DR4阳性(HLA-DR4+)且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)的MHC II类HLA单倍型而选择的。

3.用于在基于存在DR4阳性(HLA-DR4+)且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)的MHCII类HLA单倍型而选择的患者中治疗或预防1型糖尿病的长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽，其包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列。

4.治疗或预防1型糖尿病的方法，其包括向基于存在DR4阳性(HLA-DR4+)且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)的MHC II类HLA单倍型而选择的患者施用有效剂量的长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽，所述免疫原性肽包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列。

5.在方面2至4的某些实施方案中，所述患者的MHC II类单倍型在治疗之前已确定或在治疗期间确定。

在一些实施方案中，所述单倍型确定是使用基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、电泳分析或通过抗体测试进行的。

6.在方面1至5中任一项的某些实施方案中，所述氧化还原酶基序可包含通式：

Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，优选0至3，更优选0、1、2或3，

其中m代表0至2的整数，

其中C代表半胱氨酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表任何氨基酸，并且Z代表任何氨基酸，优选碱性氨基酸。

在一些实施方案中，其中m为0，并且在N端氧化还原酶基序(氧化还原酶基序位于免疫原性肽的N端开端处)的情况下，该基序最先的半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸可通过N-乙酰化、N-甲基化、N-乙基化或N-丙酰化进行化学修饰。

在一些实施方案中，其中m为0，并且在C端氧化还原酶基序(氧化还原酶基序位于免疫原性肽的C端末端处)的情况下，该基序最后的半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸可通过其C端酰胺或酸基团的乙酰基、甲基、乙基或丙酰基的C端取代进行化学修饰。

下面进一步举例说明这些基序。

在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序可包含四肽序列Cxx[CST][SEQ IDNO：1]或[CST]xxC[SEQ ID NO：2]，任选地前面有一个或更多个碱性氨基酸，例如HCXXC、KCXXC、RCXXC、KHCXXC、HKCXXC、RHCXXC、HRCXXC、KRCXXC或RKCXXC。

在一些优选实施方案中，所述氧化还原酶基序不是天然存在于与T细胞表位相邻的N端或C端11个氨基酸的区域内，更优选地，所述氧化还原酶基序不是天然存在于T细胞表位内。

在某些实施方案中，MHC II类T细胞胰岛素表位可由序列LALEGSLQK[SEQ ID NO：3]限定。

7.根据方面1至6中任一项所述的方法或用途，其中所述肽包含序列Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：4]或[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：5]。

8.根据方面1至7中任一项所述的方法或用途，其中所述肽包含序列CxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：6]。

9.根据方面1至8中任一项所述的方法或用途，其中所述肽包含序列HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：7]或H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：8]。

10.根据方面1至9中任一项所述的方法或用途，其中所述肽包含序列HCxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：9]。

11.根据方面1至10中任一项所述的方法或用途，其中所述肽包含序列Cxx[CST][SEQ ID NO：1]或[CST]xxC[SEQ ID NO：2]氧化还原基序序列和序列SLQPLALEGSLQKRG[SEQID NO：20]。

12.根据方面1至11中任一项所述的方法或用途，其中所述肽包含氨基酸序列HCPYCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：26]或由其组成。

13.根据方面1至12中任一项所述的方法或用途，其中所述肽作为包含所述肽和可药用载体的药物组合物施用。

14.根据方面2至13中任一项所述的方法或用途，其中所述肽以50至1500μg，优选100至1200μg的剂量方案施用。

15.根据方面2至14中任一项所述的方法或用途，其中所述肽以单剂量或者以2、3、4、5或更多个剂量同时或连续地施用。

16.根据方面2至15中任一项所述的方法或用途，其中所述肽根据以下方案中的任一个通过4次双周皮下或肌内注射来施用：

1)第一次皮下注射50μg所述肽，随后三次连续皮下注射25μg所述肽，每次间隔2周进行；

2)第一次皮下注射150μg所述肽，随后三次连续皮下注射75μg所述肽，每次间隔2周进行；和

3)第一次皮下注射450μg所述肽，随后三次连续皮下注射225μg所述肽，每次间隔2周进行。

17.根据方面2至16中任一项所述的方法或用途，其中所述患者额外地为HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

18.根据方面2至17中任一项所述的方法或用途，其中所述肽作为包含所述肽和可药用载体的药物组合物施用。

19.根据方面2至18中任一项所述的方法或用途，其中所述肽作为包含所述肽和佐剂的药物组合物施用。

在本文中公开的实施方案或方面的任一个中使用的免疫原性肽的另一些具体实施方案由以下序列中的任一个组成：

Cxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：10]，

[CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：11]，

CxxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：12]，

HCxx[CST]SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：13]，

H[CST]xxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：14]，或

HCxxCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：15]。

在这样的免疫原性肽序列的一些具体实施方案中，Cxx[CST][SEQ ID NO：1]是CPY[CST][SEQ ID NO：16]，和/或[CST]xxC[SEQ ID NO：2]是[CST]PYC[SEQ ID NO：17]，更具体的CxxC[SEQ ID NO：18]是CPYC[SEQ ID NO：19]。

在一个具体实施方案中，肽由序列HCPYCVRSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：25]或HCPYCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：26]组成。

在上述方面或实施方案的任一个中，氧化还原基序位于表位的N端侧。

在替代的方面或实施方案组中，肽在表位的C端侧具有氧化还原基序。

20.本发明的另一个方面涉及如上所公开的任一种肽，其用作药物，尤其是用于治疗或预防1型糖尿病或者用于降低1型糖尿病之症状，其中患者或对象已被确定为对MHC II类分子的DR4 HLA单倍型呈阳性且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

在所述方面20的一些实施方案中，在所述患者中所述单倍型确定是使用基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、电泳分析或通过抗体测试进行的。

在所述方面20的一些实施方案中，对于HLA型DR4+纯合的患者被认为最具有响应性和/或对于HLA型DR4+杂合的患者例如DR4+且DR3+的患者被认为中等具有响应性。

21.另一个方面涉及包含如上所公开的任一种肽以及可药用载体的药物组合物，其用于治疗或预防1型糖尿病或者用于降低1型糖尿病之症状，其中患者或对象已被确定为对MHC II类分子的DR4 HLA单倍型呈阳性且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

22.在一些替代实施方案中，可使用针对呈递胰岛素表位之APC的溶细胞性CD4+T细胞群对为或已被确定为对MHC II类分子的DR4 HLA单倍型呈阳性且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)的患者或对象进行治疗，所述溶细胞性CD4+T细胞群通过以下用于产生针对呈递胰岛素表位之APC的溶细胞性CD4+T细胞群的体外方法获得，所述方法包括以下步骤：

-提供外周血细胞；

-在体外使所述细胞与如上所公开的任一种免疫原性肽接触，以及

-在存在IL-2的情况下扩增所述细胞。

23.另一个方面涉及可通过上述方法获得的针对胰岛素呈递APC的细胞溶细胞性CD4+T细胞群，其用于治疗或预防1型糖尿病或者用于降低1型糖尿病之症状，其中患者或对象已被确定为对MHC II类分子的DR4HLA单倍型呈阳性且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

在所述方面22或23的一些实施方案中，在所述患者中所述单倍型确定是使用基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、电泳分析或通过抗体测试进行的。

在所述方面22或23的一些实施方案中，对于HLA型DR4+纯合的患者被认为最具有响应性和/或对于HLA型DR4+杂合的患者例如DR4+且DR3+的患者被认为中等具有响应性。

附图说明

图1：示出了由序列HCPYCVRSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID NO：25)和HCPYCSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID NO：26)限定的两种受试肽与DRB1*0301(左图)或DRB1*0401(右图)重组MHC II蛋白的结合。通过由于与荧光标记的对照高亲和力结合物肽的竞争引起的荧光信号(RFU)的降低而剂量依赖性地表明了受试肽的结合。

图2：示出了不同T1D患者的反应性，其是通过在用由自体树突细胞呈递的具有序列HCPYCVRSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID NO：25)的免疫原性肽进行1、4和6次特异性再刺激之后对活的响应性CD4+T细胞进行计数来测量的。

图3：示出了Ib期研究设计的示意图，其中免疫原性肽由序列HCPYCSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID NO：26)限定。

图4：示出了在不同HLA基因型亚组中攻击之后2小时MMTT之后的C肽AUC的箱线图。P1＝安慰剂，C1＝组群(cohort)1，C2＝组群2，C3＝组群3。数据表示为纳入Ib期研究之后6个月的响应变化百分比((V8-V2)/V2)。

图5：示出了在不同HLA基因型亚组中胰岛素剂量/kg的箱线图。Pl＝安慰剂，C1＝组群1，C2＝组群2，C3＝组群3。数据表示为纳入Ib期研究之后6个月的响应变化百分比((V8-V2)/V2)。

图6：示出了在不同HLA基因型亚组中测量的与预期的攻击之后2小时MMTT的AUC之后的C肽的箱线图。P1＝安慰剂，C1＝组群1，C2＝组群2，C3＝组群3。数据表示为纳入Ib期研究之后3个月(V6)和6个月(V8)的响应变化百分比(δ比率)。

图7：示出了在不同HLA基因型亚组中从V3至V8的胰岛素剂量/kg的箱线图。数据表示为Ib期研究中的响应变化百分比((访问X-V2)/V2)。

具体实施方式

将针对具体实施方案来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书来限定。权利要求书中的任何附图标记不应被解释为限制范围。仅提供以下术语或定义以帮助理解本发明。除非本文中明确定义，否则本文中使用的所有术语具有与其对于本发明领域的技术人员来说相同的含义。本文中提供的定义的范围不应被解释为小于本领域普通技术人员所理解的范围。

除非另外指明，否则对本领域技术人员将明显的是，可以以本身已知的方式进行并且已经进行了未具体详细描述的所有方法、步骤、技术和操作。例如，再次参考标准手册、上面提及的一般背景技术以及其中引用的其他参考文献。

除非上下文另外明确地指出，否则本文中使用的没有数量词修饰的名词表示一个/种和更多个/种。当与本文中使用的方面、权利要求或实施方案相关使用时，术语“任何/任意”是指所涉及的所述方面、权利要求或实施方案中任何单个(即任一)以及所有组合。

本文中使用的术语“包含/括”和“由......构成”与“包括/含”或“含有”同义，并且是包括性的或开放式的，而不排除另外的非记载成员、要素或方法步骤。所述术语还涵盖“基本上由......组成”和“由......组成”的实施方案。

通过端点对数值范围的列举包括在相应范围内纳入的所有数字和分数，以及所列举的端点。

本文中涉及例如参数、量、时距(temporal duration)等可测量值时使用的术语“约/大约”意在涵盖指定值的或相对于指定值的+/-10％或更小、优选+/-5％或更小、更优选+/-1％或更小、并且还更优选+/-0.1％或更小的变化，并且在此范围内这样的变化适合于在所公开的发明中实施。应理解，修饰语“约/大约”所指的值本身也被具体地且优选地公开。

如本文中所用的，在“用于治疗疾病的组合物”中使用的术语“用于”还应公开相应的治疗方法和相应的制剂用于制备用于治疗疾病的药物的用途。

本文中使用的术语“肽”是指包含通过肽键连接的12至200个氨基酸的氨基酸序列但是其可包含非氨基酸结构的分子。

根据本发明的肽可包含任何常规的20种氨基酸或其经修饰形式，或者可包含通过化学肽合成或通过化学或酶修饰并入的非天然存在氨基酸。

本文中使用的术语“抗原”是指大分子，通常是蛋白质(具有或不具有多糖)的结构，或者由包含一种或更多种半抗原并包含T细胞表位的蛋白质组合物构成的结构。

本文中使用的术语“抗原蛋白”是指包含一个或更多个T细胞表位的蛋白质。本文中使用的自身抗原或自身抗原蛋白是指存在于体内的人或动物蛋白，其在同一人或动物体内引发免疫应答。

术语“表位”是指抗原蛋白的一个或数个部分(其可定义构象表位)，其被抗体或其部分(Fab’，Fab2’等)或者在B或T细胞淋巴细胞的细胞表面存在的受体特异性地识别并结合，并且所述B或T细胞淋巴细胞能够通过所述结合诱导免疫应答。

在本发明的上下文中，术语“T细胞表位”是指优势(dominant)、亚优势(sub-dominant)或次要(minor)的T细胞表位，即抗原蛋白的一部分，当与MHC II类分子复合时其被在T淋巴细胞的细胞表面处表达的受体特异性地识别并结合。表位是优势、亚优势还是次要的取决于针对该表位引发的免疫反应。优势性取决于在蛋白质的所有可能的T细胞表位中，这样的表位被T细胞识别并能够活化它们的频率。

T细胞表位是由MHC II类分子识别并与之相关的表位，其由适合MHC II分子的沟(groove)的+/-9个氨基酸的序列组成。在表示T细胞表位的肽序列中，表位中的氨基酸编号为P1至P9，表位的N端氨基酸编号为P-1、P-2等，表位的C端氨基酸编号为P+1、P+2等。由MHCII类分子而非MHC I类分子识别的肽称为MHC II类限制性T细胞表位。

术语“MHC”是指“主要组织相容性抗原(major histocompatibility antigen)”。在人中，MHC基因被称为HLA(“人白细胞抗原(human leukocyte antigen)”)基因。尽管没有始终遵循的惯例，但是一些文献使用HLA指代HLA蛋白分子，并且使用MHC指代编码HLA蛋白的基因。因此，当在本文中使用时，术语“MHC”和“HLA”是等同物。人中的HLA系统在小鼠中具有其等同物，即H2系统。研究最深入的HLA基因是九种所谓的经典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLADQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。在人中，MHC分为三个区域：I、II和III类。A、B和C基因属于MHC I类，而六个D基因属于II类。MHC I类分子由包含3个结构域(α1、2和3)的单一多态链构成，该链与细胞表面上的β2微球蛋白缔合。II类分子由2种多态链构成，每种链包含2条链(α1和2，以及β1和2)。

I类MHC分子在几乎所有有核细胞上表达。

在I类MHC分子的情况下呈递的肽片段由CD8+T淋巴细胞(溶细胞性T淋巴细胞或CTL)识别。CD8+T淋巴细胞经常成熟为溶细胞性效应物，其可裂解带有刺激性抗原的细胞。II类MHC分子主要在活化的淋巴细胞和抗原呈递细胞上表达。CD4+T淋巴细胞(辅助T淋巴细胞或Th)通过识别由II类MHC分子呈递的独特肽片段而活化，该片段通常在抗原呈递细胞(例如巨噬细胞或树突细胞)上发现。CD4+T淋巴细胞增殖并分泌支持抗体介导的和细胞介导的应答的细胞因子，例如IL-2、IFN-γ和IL-4。

功能性HLA的特征在于内源性以及外来的、潜在的抗原肽与之结合的结合沟深。该沟的特征还在于明确限定的形状和物理化学特性。HLA I类结合位点是封闭的，因为肽末端被固定在沟的末端中。它们还参与具有保守HLA残基的氢键网络。考虑到这些限制，结合的肽的长度限制为8、9或10个残基。但是，已证明多至12个氨基酸残基的肽也能够结合HLA I类。不同HLA复合物结构的比较证实了一般的结合方式，其中肽采用相对线性、延伸的构象或者可涉及中心残基向沟外凸出。

与HLA I类结合位点相反，II类位点在两端均开放。这允许肽从实际结合区延伸，从而在两端“悬垂(hanging out)”。因此，II类HLA可结合具有9个至超过25个氨基酸残基的可变长度的肽配体。与HLA I类类似，II类配体的亲和力由“恒定”和“可变”分量确定。恒定部分同样由HLA II类沟中保守残基与结合肽的主链之间形成的氢键网络产生。然而，该氢键模式不限于肽的N端和C端残基，而是分布在整个链上。后者是重要的，因为它将复合肽的构象限制为严格的线性结合方式。这对于所有II类同种异型都是常见的。由于II类结合位点内的某些多态性位置，决定肽结合亲和力的第二分量是可变的。不同的同种异型在沟内形成不同的互补口袋，从而解释了肽的亚型依赖性选择或特异性。重要地，对II类口袋中保留的氨基酸残基的限制通常比对I类的更“柔和”。在不同的HLA II类同种异型之间，存在多得多的肽交叉反应性。适合于MHC II分子的沟的MHC II类T细胞表位的+/-9个氨基酸(即8、9或10)的序列通常编号为P1至P9。另外的表位N端氨基酸编号为P-1、P-2等，表位C端氨基酸编号为P+1、P+2等。

在遗传水平上，MHC II类簇位于6号染色体的短臂(6p21)上。该簇包括三个经典II类基因(HLA-DP、-DQ和DR)和两个非经典II类基因(HLA-DM和-DO)。MHC II类的结构是通过两条膜结合链(称为α和β)的缔合来实现的，这产生了MHC II类的抗原结合槽(cleft)。α链和β链二者由紧密连接为α和β基因对的不同基因座(即DRα/DRβ、DQα/DQβ和DPα/DPβ)编码。HLA-DP、-DQ和DR基因座具有高度多态性，尤其是在II类分子的抗原结合口袋中。HLA-DP和-DQ在-α和-β链基因二者中都包含多态性(DPA、DPB、DQA和DQB)。在HLA-DR中，多态性仅涉及DRβ链(DRB基因)。有9个DRB基因座(编号从DRB1到DRB9)，但在所有单倍型上仅发现DRB1基因座，并因此构成了经典DR血清学的主要决定簇(McCluskey et al,Current Protocolsin Immunology(2017),118,A.1S.1-A.1S.6)。

以HLA-DRB1组为例，文献已报道存在超过40种不同的单倍型(Marsh et al,Tissue Antigens(2010),75,p291)。在整个人群体中最相关的是DRB1*03和DRB1*04单倍型组。在DRB1*03组中，两个等位基因是常见的，即DRB1*0301和DRB1*0302，但也已报道了其他等位基因，例如DRB1*0303、DRB1*0304和DRB1*0307。在DRB1*04组中，可找到10个主要等位基因，即DRB1*0401、DRB1*0402、DRB1*0403、DRB1*0404、DRB1*0405、DRB1*0406、DRB1*0407、DRB1*0408、DRB1*0410和DRB1*0411。在本申请通篇使用的术语“DR4阳性”或“DR4+”表示对象对DRB1*04单倍型之一呈阳性。类似地，在本申请通篇使用的术语“DR3阳性”或“DR3+”表示对象对DRB1*03单倍型之一呈阳性。在本申请通篇使用的术语“DR4阴性”或“DR4-”表示对象不具有任何DRB1*04单倍型。类似地，在本申请通篇使用的术语“DR3阴性”或“DR3-”表示对象不具有任何DRB1*03单倍型。

HLA分型可使用本领域已知的技术进行，包括但不限于基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析和电泳分析。基于PCR的分析的非限制性实例包括可从Applied Biosystems获得的

等位基因鉴别测定。序列分析的非限制性实例包括Maxam-Gilbert测序、Sanger测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序、固相测序、用质谱例如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱的测序以及通过杂交的测序。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳(例如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳)、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。用于在标志物中的多态性位点对个体进行基因分型的另一些方法包括，例如，来自Third WaveTechnologies,Inc.的

测定、限制性片段长度多态性(restrictionfragment length polymorphism，RFLP)分析、等位基因特异性寡核苷酸杂交、异源双链体迁移率测定和单链构象多态性(single strand conformational polymorphism，SSCP)分析。

或者，HLA分型可通过抗体测试进行。

关于本发明上下文中使用的表位，本文中使用的术语“同源物”是指这样的分子，其与天然存在表位具有至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同一性，从而维持表位结合抗体或者B和/或T细胞的细胞表面受体的能力。表位的特定同源物对应于在至多三个，更特别地在至多2个，最特别地在一个氨基酸中修饰的天然表位。

关于本发明的肽，本文中使用的术语“衍生物”是指这样的分子，其包含至少肽活性部分(即氧化还原基序和能够引发溶细胞性CD4+T细胞活性的MHC II类表位)并且除此之外还包含可具有不同的目的(例如稳定肽或改变肽的药代动力学或药效学特性)的互补部分。

本文中使用的术语两个序列的“序列同一性”涉及当比对当两个序列时，具有相同核苷酸或氨基酸的位置数除以序列中较短者的核苷酸或氨基酸数。特别地，序列同一性为70％至80％、81％至85％、86％至90％、91％至95％、96％至100％、或100％。

本文中使用的术语“肽编码多核苷酸(或核酸)”和“编码肽的多核苷酸(或核酸)”是指这样的核苷酸序列，其在适当的环境中表达时导致相关肽序列或其衍生物或同源物的产生。这样的多核苷酸或核酸包括编码该肽的正常序列，以及能够表达具有所需活性的肽的这些核酸的衍生物和片段。编码根据本发明的肽或其片段的核酸是编码源自于哺乳动物或对应于哺乳动物的肽或其片段(最特别是人肽片段)的序列。

术语“免疫病症”或“免疫疾病”是指其中免疫系统的反应负责或维持生物体中功能异常或非生理状况的疾病。免疫病症中尤其包括变应性病症和自身免疫病。

术语“自身免疫病”或“自身免疫病症”是指由于生物体无法将其自身组成部分(下至亚分子水平)识别为“自身”而引起针对其自身细胞和组织的异常免疫应答所导致的疾病。疾病组可分为两类：器官特异性疾病和全身性疾病。“变应原”被定义为在易患(特别是遗传倾向的)个体(特应性)患者中引发IgE抗体的产生的物质，通常为大分子或蛋白质组合物。在Liebers et al.(1996)Clin.Exp.Allergy 26,494-516中也提出了类似的定义。

术语“1型糖尿病”(T1D)或“糖尿病1型”(也称为“1型糖尿病(type 1diabetesmellitus)”或“免疫介导的糖尿病”或以前称为“幼年型糖尿病”或“胰岛素依赖型糖尿病”)是一种自身免疫病症，其通常在儿童时期在易感个体中发生。T1D发病机制的基础是通过自身免疫机制破坏大多数产生胰岛素的胰腺β细胞。简言之，生物体失去了针对负责胰岛素产生的胰腺β细胞的免疫耐受，并诱导主要是细胞介导的、与自身抗体的产生相关的免疫应答，从而导致β细胞的自我破坏。

术语“治疗有效量”是指在患者中产生期望的治疗或预防作用的本发明的肽或其衍生物的量。例如，关于疾病或病症，其是在一定程度上降低该疾病或病症的一种或更多种症状的量，并且更特别地是使与该疾病或病症相关或引起该疾病或病症的生理或生化参数部分或完全地恢复正常的量。通常来说，治疗有效量是将导致正常生理状况的改善或恢复的本发明的肽或其衍生物的量。例如，当用于治疗性治疗受免疫病症影响的哺乳动物时，其为每日量肽/所述哺乳动物的kg体重。或者，在通过基因治疗施用的情况下，调节裸DNA或病毒载体的量以确保局部产生本发明的肽、其衍生物或同源物的相关剂量。

当涉及肽时，术语“天然”涉及以下事实：序列与天然存在蛋白质(野生型或突变型)的片段相同。与此相反，术语“人工”是指其本身在自然界中不存在的序列。人工序列通过有限的修饰，例如在天然存在序列内改变/缺失/插入一个或更多个氨基酸或者通过添加/去除天然存在序列的N端或C端氨基酸而从天然序列获得。

在本文中，氨基酸以其全称、其三字母缩写或其单字母缩写来提及。

氨基酸序列的基序在本文中根据Prosite的格式书写。基序用于描述在序列的特定部分处的某个序列变化。符号X用于其中接受任意氨基酸的位置。通过在方括号(“[]”)之间列出给定位置的可接受氨基酸来指明替代项。例如：[CST]代表选自Cys、Ser或Thr的氨基酸。被排除作为替代项的氨基酸通过在波形括号(“{}”)之间将它们列出来指明。例如：{AM}代表除Ala和Met之外的任何氨基酸。基序中的不同要素任选地由连字符(-)彼此隔开。一个基序内相同要素的重复可通过在该要素后放置圆括号之间的数值或数值范围来指明。例如X(2)对应于X-X或XX；X(2,5)对应于2、3、4或5个X氨基酸，A(3)对应于A-A-A或AAA。

为了区分氨基酸X，将H和C之间的那些称为外部氨基酸X(在上述序列中加单下划线)，在氧化还原基序内的那些称为内部氨基酸X(在上述序列中加双下划线)。

X表示任何氨基酸，特别是L-氨基酸，更特别是20种天然存在的L-氨基酸之一。

包含T细胞表位和具有还原活性的经修饰肽基序序列的肽能够产生针对抗原呈递细胞的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的群。

因此，在其最广泛的意义上，本发明涉及包含具有触发免疫反应的潜力的抗原(自身或非自身)的至少一种T细胞表位以及对肽二硫键具有还原活性的“氧化还原酶”、“硫还原酶”、“硫氧化还原”或“氧化还原”(所有术语在本文中可互换使用)序列基序的肽的用途。MHC II类T细胞表位和经修饰氧化还原基序序列可在肽中彼此紧邻或任选地被一个或更多个氨基酸(所谓的接头序列)隔开。任选地，该肽另外地包含内体靶向序列和/或另外的“侧翼”序列。

本文中公开的肽包含具有触发免疫反应潜力的胰岛素抗原的MHC II类T细胞表位和经修饰氧化还原基序。肽中基序序列的还原活性可针对例如在胰岛素溶解度测定(其中胰岛素的溶解度在还原之后改变)中其还原巯基的能力来测定，或者用经荧光标记的底物(例如胰岛素)来测定。这样的测定的一个实例使用荧光肽，并描述于Tomazzolli et al.(2006)Anal.Biochem.350，105-112中。当带有FITC标记的两个肽通过二硫桥彼此共价连接时，它们会自猝灭。在被根据本发明的肽还原之后，被还原的单独肽再次变为具有荧光。

(经修饰)氧化还原基序可位于T细胞表位的氨基末端侧或T细胞表位的羧基末端处。

具有还原活性的肽片段见于硫还原酶中，所述硫还原酶是小的二硫化物还原酶，包括谷氧还蛋白、核氧化还原蛋白(nucleoredoxin)、硫氧还蛋白和其他硫醇/二硫化物氧化还原酶(Holmgren(2000)Antioxid.Redox Signal.2，811-820；Jacquot et al.(2002)Biochem.Pharm.64，1065-1069)。它们是多功能、普遍存在的，并且存在于许多原核生物和真核生物中。它们通过以下保守活性结构域共有序列内的氧化还原活性半胱氨酸对蛋白质(例如酶)上的二硫键发挥还原活性：CXXC[SEQ ID NO：18]、CXXS[SEQ ID NO：23]、CXXT[SEQID NO：24]、SXXC[SEQ ID NO：21]、TXXC[SEQ ID NO：22](Fomenko et al.(2003)Biochemistry 42，11214-11225；Fomenko et al.(2002)Prot.Science 11，2285-2296)，其中X代表任意氨基酸。这样的结构域也存在于较大蛋白质，例如蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)和磷酸肌醇特异性磷脂酶C中。

如从例如Fomenko和WO2008/017517已知的4个氨基酸氧化还原基序在第1位和/或第4位包含半胱氨酸；因此基序是CXX[CST][SEQ ID NO：1]或[CST]XXC[SEQ ID NO：2]。这样的四肽序列将被称为“基序”。肽中的基序可以是CXXC[SEQ ID NO：18]、SXXC[SEQ ID NO：21]、TXXC[SEQ ID NO：22]、CXXS[SEQ ID NO：23]或CXXT[SEQ ID NO：24]。特别地，肽包含序列基序CXXC[SEO ID NO：18]。

如进一步详细说明的，本发明中使用的肽可通过允许并入非天然氨基酸的化学合成来制备。因此，在以上记载的经氧化还原修饰的氧化还原基序中“C”代表半胱氨酸或具有巯基的另一种氨基酸例如巯基缬氨酸(mercaptovaline)、高半胱氨酸或者其他具有巯基功能的天然或非天然氨基酸。为了具有还原活性，存在于经修饰氧化还原基序中的半胱氨酸不应作为胱氨酸二硫桥的一部分出现。然而，经氧化还原修饰的氧化还原基序可包含经修饰半胱氨酸，例如甲基化的半胱氨酸，其在体内被转化为具有游离巯基的半胱氨酸。X可以是20种天然氨基酸中的任一种，包括S、C或T，或者可以是非天然氨基酸。在一些具体实施方案中，X是具有小侧链的氨基酸，例如Gly、Ala、Ser或Thr。在另一些具体实施方案中，X不是具有大侧链的氨基酸，例如Trp。在另一些具体实施方案中，X不是半胱氨酸。在另一些具体实施方案中，在经修饰氧化还原基序中的至少一个X是His。在另外的另一些具体实施方案中，在经修饰氧化还原中的至少一个X是Pro。

肽还可包含修饰以提高稳定性或溶解性，例如N端NH₂基团或C端COOH基团的修饰(例如，将COOH修饰成CONH₂基团)。

术语“氧化还原酶基序”、“硫醇-氧化还原酶基序”、“硫还原酶基序”、“硫氧化还原基序”或“氧化还原基序”在本文中用作同义术语，并且是指参与将电子从一个分子(还原剂，也称为氢或电子供体)转移至另一分子(氧化剂，也称为氢或电子接纳体)的基序。

特别地，术语“氧化还原酶基序”可指已知的[CST]XXC或CXX[CST]基序，但特别地是指更通用的序列基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，例如0、1、2、3、4、5或6。

其中m代表0至2的整数，例如0、1或2。

其中C代表半胱氨酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表任何氨基酸，并且

Z代表任何氨基酸，优选碱性氨基酸。

为了具有还原活性，经修饰的氧化还原酶基序中存在的半胱氨酸不应作为胱氨酸二硫桥的一部分出现。

通常来说，氧化还原酶基序可包含通式ZmCXnC，

其中X是任何氨基酸，

Z是碱性氨基酸，优选选自H、K或R，并且

其中n是0至3的整数并且

m是0至2的整数。

术语“碱性氨基酸”是指像布朗斯特-劳里碱(Bronsted-Lowry base)和路易斯碱(Lewis base)一样发挥作用的任何氨基酸，并且包括天然的碱性氨基酸，例如精氨酸(R)、赖氨酸(K)或组氨酸(H)，或者非天然的碱性氨基酸，例如但不限于：

·赖氨酸变体，如Fmoc-β-Lys(Boc)-OH(CAS号219967-68-7)；Fmoc-Orn(Boc)-OH，也称为L-鸟氨酸或鸟氨酸(CAS号109425-55-0)；Fmoc-β-Homolys(Boc)-OH(CAS号203854-47-1)；Fmoc-Dap(Boc)-OH(CAS号162558-25-0)或Fmoc-Lys(Boc)OH(DiMe)-OH(CAS号441020-33-3)；

·酪氨酸/苯丙氨酸变体，如Fmoc-L-3Pal-OH(CAS号175453-07-3)；Fmoc-β-HomoPhe(CN)-OH(CAS号270065-87-7)；Fmoc-L-β-HomoAla(4-吡啶基)-OH(CAS号270065-69-5)或Fmoc-L-Phe(4-NHBoc)-OH(CAS号174132-31-1)；

·脯氨酸变体，如Fmoc-Pro(4-NHBoc)-OH(CAS号221352-74-5)或Fmoc-Hyp(tBu)-OH(CAS号122996-47-8)；

·精氨酸变体，如Fmoc-β-Homoarg(Pmc)-OH(CAS号700377-76-0)。

因此，除本文中公开的通常已知的硫氧还原基序CXXC及其变体之外，还有其中两个半胱氨酸部分彼此相邻的基序(CC)或者其中两个半胱氨酸部分相隔1、3、4、5或6个氨基酸的基序，例如CXC、CXXXC、CXXXXC、CXXXXXC或CXXXXXXC。在所述实施方案的任一个中，半胱氨酸之一也可变成S或T。

通常来说，一种或更多种碱性氨基酸“Z”(例如选自H、K或R)可添加至硫氧还原基序，例如H-基序、K-基序、R-基序、KH--基序、HK-基序、RH--基序、HR-基序、KR--基序或RK--基序。

可用于本发明的硫氧化还原基序的特别感兴趣的实例是：

CC，HCC，KCC，RCC；

CXC，HCXC，KCXC，RCXC，KHCXC，HKCXC，RHCXC，HRCXC，RKCXC，KRCXC；

CXXC，HCXXC，KCXXC，RCXXC，KHCXXC，HKCXXC，RHCXXC，HRCXXC，RKCXXC，KRCXXC；

CXXXC，HCXXXC，KCXXXC，RCXXXC，KHCXXXC，HKCXXXC，RHCXXXC，HRCXXXC，RKCXXXC，KRCXXXC；

CXXXXC，HCXXXXC，KCXXXXC，RCXXXXC，KHCXXXXC，HKCXXXXC，RHCXXXXC，HRCXXXXC，RKCXXXXC，KRCXXXXC；

CXXXXXC，HCXXXXXC，KCXXXXXC，RCXXXXXC，KHCXXXXXC，HKCXXXXXXXC，RHCXXXXXC，HRCXXXXXC，RKCXXXXXC，KRCXXXXXC；

CXXXXXXC，HCXXXXXXC，KCXXXXXXC，RCXXXXXXC，KHCXXXXXXC，HKCXXXXXXC，RHCXXXXXXC，HRCXXXXXXC，RKCXXXXXXC，KRCXXXXXXC；

CXC基序的一些具体实例是：

CHC，CKC，CRC，CGC，CAC，CVC，CLC，CIC，CMC，CFC，CWC，CPC，CSC，CTC，CYC，CNC，CQC，CDC，和CEC。

这些示例性CXC基序中的任一个的前面可以为一个或更多个氨基酸(Z_m)，其中m是0至3的整数，优选0或1，并且其中Z是任何氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。这样的基序的一些优选实例是：

KCHC，KCKC，KCRC，KCGC，KCAC，KCVC，KCLC，KCIC，KCMC，KCFC，KCWC，KCPC，KCSC，KCTC，KCYC，KCNC，KCQC，KCDC，KCEC，HCHC，HCKC，HCRC，HCGC，HCAC，HCVC，HCLC，HCIC，HCMC，HCFC，HCWC，HCPC，HCSC，HCTC，HCYC，HCNC，HCQC，HCDC，HCEC，RCHC，RCKC，RCRC，RCGC，RCAC，RCVC，RCLC，RCIC，RCMC，RCFC，RCWC，RCPC，RCSC，RCTC，RCYC，RCNC，RCQC，RCDC，和RCEC；

在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序是CX₃C，即CXXXC，通常是CX¹X²X³C，其中X¹、X²和X³各自单独地可以是选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X¹、X²和X³是除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X¹、X²或X³中的至少一个是碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

CXXXC基序的一些具体实例是：CXPYC、CPXYC和CPYXC，其中X可以是任何氨基酸，更优选CXPYC，例如：

CKPYC，CRPYC(SEQ ID NO：55)，CHPYC，CGPYC，CAPYC，CVPYC，CLPYC，CIPYC，CMPYC，CFPYC，CWPYC，CPPYC，CSPYC，CTPYC，CCPYC，CYPYC，CNPYC，CQPYC，CDPYC，和CEPYC；或CPXYC，例如：

CPKYC，CPRYC，CPHYC，CPGYC，CPAYC，CPVYC，CPLYC，CPIYC，CPMYC，CPFYC，CPWYC，CPPYC，CPSYC，CPTYC，CPCYC，CPYYC，CPNYC，CpQYC，CPDYC，CPEYC，和CPLYC；或

CPYXC，例如：

CPYKC，CPYRC，CPYHC，CPYGC，CPYAC，CPYVC，CPYLC，CPYIC，CPYMC，CPYFC，CPYWC，CPYPC，CPYSC，CPYTC，CPYCC，CPYYC，CPYNC，CpYQC，CPYDC，CPYEC，和CPYLC.

CXXXC基序的另外的一些具体实例是：CXHGC、CHXGC和CHGXC，其中X可以是任何氨基酸，更优选CXHGC，例如：

CKHGC，CRHGC，CHHGC，CGHGC，CAHGC，CVHGC，CLHGC，CIHGC，CMHGC，CFHGC，CWHGC，CPHGC，CSHGC，CTHGC，CCHGC，CYHGC，CNHGC，CQHGC，CDHGC，CEHGC，和CKHGC；或CGXHC，例如：

CGKHC，CGRHC，CGHHC，CGGHC，CGAHC，CGVHC，CGLHC，CGIHC，CGMHC，CGFHC，CGWHC，CGPHC，CGSHC，CGTHC，CGCHC，CGYHC，CGNHC，CGQHC，CGDHC，CGEHC，和CGLHC；或CHGXC，例如：

CHGKC，CHGRC，CHGHC，CHGGC，CHGAC，CHGVC，CHGLC，CHGIC，CHGMC，CHGFC，CHGWC，CHGPC，CHGSC，CHGTC，CHGCC，CHGYC，CHGNC，CHGQC，CHGDC，CHGEC，和CHGLC.

CXXXC基序的另外的一些具体实例是：CXGPC、CGXPC和CGPXC，其中X可以是任何氨基酸，更优选CXGPC，例如：

CKGPC，CRGPC，CHGPC，CGGPC，CAGPC，CVGPC，CLGPC，CIGPC，CMGPC，CFGPC，CWGPC，CPGPC，CSGPC，CTGPC，CCGPC，CYGPC，CNGPC，CQGPC，CDGPC，CEGPC，和CKGPC；或CGXPC，例如：

CGKPC，CGRPC，CGHPC，CGGPC，CGAPC，CGVPC，CGLPC，CGIPC，CGMPC，CGFPC，CGWPC，CGPPC，CGSPC，CGTPC，CGCPC，CGYPC，CGNPC，CGQPC，CGDPC，CGEPC，和CGLPC；或CGPXC，例如：

CGPKC，CGPRC，CGPHC，CGPGC，CGPAC，CGPVC，CGPLC，CGPIC，CGPMC，CGPFC，CGPWC，CGPPC，CGPSC，CGPTC，CGPCC，CGPYC，CGPNC，CGPQC，CGPDC，CGPEC，和CGPLC.

CXXXC基序的另外的一些具体实例是：CXGHC、CGXHC和CGHXC，其中X可以是任何氨基酸，更优选CXGHC，例如：

CKGHC，CRGHC，CHGHC，CGGHC，CAGHC，CVGHC，CLGHC，CIGHC，CMGHC，CFGHC，CWGHC，CPGHC，CSGHC，CTGHC，CCGHC，CYGHC，CNGHC，CQGHC，CDGHC，CEGHC，和CKGHC；或CGXFC，例如：

CGKFC，CGRFC，CGHFC，CGGFC，CGAFC，CGVFC，CGLFC，CGIFC，CGMFC，CGFFC，CGWFC，CGPFC，CGSFC，CGTFC，CGCFC，CGYFC，CGNFC，CGQFC，CGDFC，CGEFC，和CGLFC；或CGHXC，例如：

CGHKC，CGHRC，CGHHC，CGHGC，CGHAC，CGHVC，CGHLC，CGHIC，CGHMC，CGHFC，CGHWC，CGHPC，CGHSC，CGHTC，CGHCC，CGHYC，CGHNC，CGHQC，CGHDC，CGHEC，和CGHLC.

CXXXC基序的另外的一些具体实例是：CXGFC、CGXFC和CGFXC，其中X可以是任何氨基酸，更优选CXGFC，例如：

CKGFC，CRGFC，CHGFC，CGGFC，CAGFC，CVGFC，CLGFC，CIGFC，CMGFC，CFGFC，CWGFC，CPGFC，CSGFC，CTGFC，CCGFC，CYGFC，CNGFC，CQGFC，CDGFC，CEGFC，和CKGFC；或CGXFC，例如：

CGKFC，CGRFC，CGHFC，CGGFC，CGAFC，CGVFC，CGLFC，CGIFC，CGMFC，CGFFC，CGWFC，CGPFC，CGSFC，CGTFC，CGCFC，CGYFC，CGNFC，CGQFC，CGDFC，CGEFC，和CGLFC；或CGFXC，例如：

CGFKC，CGFRC，CGFHC，CGFGC，CGFAC，CGFVC，CGFLC，CGFIC，CGFMC，CGFFC，CGFWC，CGFPC，CGFSC，CGFTC，CGFCC，CGFYC，CGFNC，CGFQC，CGFDC，CGFEC，和CGFLC.

CXXXC基序的另外的一些具体实例是：CXRLC、CRXLC和CRLXC，其中X可以是任何氨基酸，更优选CXRLC，例如：

CKRLC，CRRLC，CHRLC，CGRLC，CARLC，CVRLC，CLRLC，CIRLC，CMRLC，CFRLC，CWRLC，CPRLC，CSRLC，CTRLC，CCRLC，CYRLC，CNRLC，CQRLC，CDRLC，CERLC，和CKRLC；或CRXLC，例如：

CRKLC，CRRLC，CRHLC，CRGLC，CRALC，CRVLC，CRLLC，CRILC，CRMLC，CRFLC，CRWLC，CRPLC，CRSLC，CRTLC，CRCLC，CRYLC，CRNLC，CRQLC，CRDLC，CRELC，和CRLLC；或

CRLXC，例如：

CRLKC，CRLRC，CRLHC，CRLGC，CRLAC，CRLVC，CRLLC，CRLIC，CRLMC，CRLFC，CRLWC，CRLPC，CRLSC，CRLTC，CRLCC，CRLYC，CRLNC，CRLQC，CRLDC，CRLEC，和CRLLC.

CXXXC基序的另外的一些具体实例是：CXHPC、CHXPC和CHPXC，其中X可以是任何氨基酸，更优选CXHPC，例如：

CKHPC，CRHPC，CHHPC，CGHPC，CAHPC，CVHPC，CLHPC，CIHPC，CMHPC，CFHPC，CWHPC，CPHPC，CSHPC，CTHPC，CCHPC，CYHPC，CNHPC，CQHPC，CDHPC，CEHPC，和CKHPC；或CHXPC，例如：

CHKPC，CHRPC，CHHPC，CHGPC，CHAPC，CHVPC，CHLPC，CHIPC，CHMPC，CHFPC，CHWPC，CHPPC，CHSPC，CHTPC，CHCPC，CHYPC，CHNPC，CHQPC，CHDPC，CHEPC，和CHLPC；或CHPXC，例如：

CHPKC，CHPRC，CHPHC，CHPGC，CHPAC，CHPVC，CHPLC，CHPIC，CHPMC，CHPFC，CHPWC，CHPPC，CHPSC，CHPTC，CHPCC，CHPYC，CHPNC，CHPQC，CHPDC，CHPEC，和CHPLC.

这些示例性CXXXC基序中的任一个的前面可以为一个或更多个氨基酸(Z_m)，其中m是0至3的整数，优选0或1，并且其中Z是任何氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序是CX₄C，即CXXXXC，通常是CX¹X²X³X⁴C，其中X¹、X²、X³和X⁴各自单独地可以是选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X¹、X²、X³和X⁴是除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X¹、X²、X³或X⁴中的至少一个是碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

CXXXXC基序的一些具体实例是：CLAVLC、CTVQAC或CGAVHC及其变体，例如：CX¹AVLC、CLX²VLC、CLAX³LC或CLAVX⁴C；CX¹VQAC、CTX²QAC、CTVX³AC或CTVQX⁴C；CX¹AVHC、CGX²VHC、CGAX³HC或CGAVX⁴C；其中X¹、X²、X³和X⁴各自单独地可以是选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

这些示例性CXXXXC基序中的任一个的前面可以为一个或更多个氨基酸(Z_m)，其中m是0至3的整数，优选0或1，并且其中Z是任何氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序是CX₅C，即CXXXXXC，通常是CX¹X²X³X⁴X⁵C，其中X¹、X²、X³、X⁴和X⁵各自单独地可以是选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X¹、X²、X³、X⁴和X⁵是除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X¹、X²、X³、X⁴或X⁵中的至少一个是碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

CXXXXXC基序的一些具体实例是：CPAFPLC或CDQGGEC及其变体，例如：CX¹AFPLC、CPX²FPLC、CPAX³PLC、CPAFX⁴LC或CPAFPX⁵C；CX¹QGGEC、CDX²GGEC、CDQX³GEC、CDQGX⁴EC或CDQGGX⁵C，其中X¹、X²、X³、X⁴和X⁵各自单独地可以是选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。这些示例性CXXXXXC基序中的任一个的前面可以为一个或更多个氨基酸(Z_m)，其中m是0至3的整数，优选0或1，并且其中Z是任何氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

在一个优选实施方案中，所述氧化还原酶基序是CX₆C，即CXXXXXXC，通常是CX¹X²X³X⁴X⁵X⁶C，其中X¹、X²、X³、X⁴、X⁵和X⁶各自单独地可以是选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。优选地，所述基序中的X¹、X²、X³、X⁴、X⁵和X⁶是除C、S或T之外的任何氨基酸。在一个具体实施方案中，所述基序中的X¹、X²、X³、X⁴、X⁵或X⁶中的至少一个是碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

CXXXXXXC基序的一个具体实例是：CDIADKYC或其变体，例如：CX¹IADKYC、CDX²ADKYC、CDIX³DKYC、CDIAX⁴KYC、CDIADX⁵YC或CDIADKX⁶C，其中X¹、X²、X³、X⁴和X⁵各自单独地可以是选自以下的任何氨基酸：G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R和H，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

这些示例性CXXXXXXC基序中的任一个的前面可以为一个或更多个氨基酸(Z_m)，其中m是0至3的整数，优选0或1，并且其中Z是任何氨基酸，优选碱性氨基酸，例如H、K或R，或本文中限定的非天然碱性氨基酸。

这样的氧化还原酶基序的一些特别优选的实例是：

C[KHR]C，CX[KHR]XC，CXX[KHR]C，C[KHR]XXC，[KHR]CC，[KHR]CXC，[KHR]XXXCCC[KHR]，CXC[KHR]，CXXXC[KHR]，[KHR]CC[KHR]，[KHR]CXC[KHR]，[KHR]CXXXC[KHR]，[KHR]C[KHR]C，C[KHR]C[KHR]，[KHR]CXX[KHR]C，[KHR]CX[KHR]XC，[KHR]C[KHR]XXC，CXX[KHR]C[KHR]，CX[KHR]XC[KHR]，C[KHR]XXC[KHR]，等。

在本文中的任一个基序实施方案中，如果m为0并且在N端氧化还原酶基序(氧化还原酶基序位于免疫原性肽的N端开端处)的情况下，该基序最先的半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸可通过N-乙酰化、N-甲基化、N-乙基化或N-丙酰化进行化学修饰。

在本文中的任一个基序实施方案中，如果m为0并且在C端氧化还原酶基序(氧化还原酶基序位于免疫原性肽的C端末端处)的情况下，该基序最后的半胱氨酸、苏氨酸或丝氨酸可通过其C端酰胺或酸基团的乙酰基、甲基、乙基或丙酰基的C端取代进行化学修饰。

在本发明中使用的包含经修饰氧化还原基序的肽中，对基序进行定位以使得当表位适合于MHC沟时，基序保留在MHC结合沟的外部。经修饰氧化还原基序置于紧邻肽内的表位序列[换句话说，基序与表位之间的接头序列为零个氨基酸]，或者通过包含7个氨基酸或更少的氨基酸序列的接头与T细胞表位隔开。更特别地，接头包含1、2、3、4、5、6或7个氨基酸。一些具体的实施方案是在表位序列与经修饰氧化还原基序序列之间具有0、1、2、3或4个氨基酸接头的肽。优选地，接头包含4个氨基酸的氨基酸序列。在其中经修饰氧化还原基序序列与表位序列相邻的那些肽中，这表示为与表位序列相比的第P-4位至第P-1位或第P+1位至第P+4位。除肽接头之外，其他有机化合物也可用作接头，以将肽的部分彼此(例如，经修饰氧化还原基序序列与T细胞表位序列)连接。

用于本发明的肽还可在包含T细胞表位和经修饰氧化还原基序的序列的N端或C端包含另外的短氨基酸序列。这样的氨基酸序列在本文中通常被称为“侧翼序列”。侧翼序列可位于表位与内体靶向序列之间和/或经修饰氧化还原基序与内体靶向序列之间。在某些不包含内体靶向序列的肽中，短氨基酸序列可在肽中经修饰氧化还原基序和/或表位序列的N和/或C端存在。更特别地，侧翼序列是1至7个氨基酸的序列，最特别是2个氨基酸的序列。

经修饰氧化还原基序可位于表位的N端。

在本发明的某些实施方案中，提供了所用的包含一个表位序列和经修饰氧化还原基序序列的肽。在另一些具体实施方案中，经修饰氧化还原基序在肽中出现数次(1、2、3、4或甚至更多次)，例如作为可通过一个或更多个氨基酸彼此间隔的经修饰氧化还原基序的重复序列，或者作为彼此紧邻的重复序列。或者，在T细胞表位序列的N和C端二者均提供一个或更多个经修饰氧化还原基序。

针对本发明的肽设想的其他变化形式包含含有T细胞表位序列的重复序列的肽，其中每个表位序列在经修饰氧化还原基序之前和/或之后(例如“经修饰氧化还原基序-表位”的重复序列或“经修饰氧化还原基序-表位-经修饰氧化还原基序”的重复序列)。在本文中，经修饰氧化还原基序可都具有相同的序列，但这不是必须的。应注意，包含其本身包含经修饰氧化还原基序的表位的肽的重复序列还将导致序列包含“表位”和“经修饰氧化还原基序”二者。在这样的肽中，在一个表位序列内的经修饰氧化还原基序作为在第二个表位序列外的经修饰氧化还原基序发挥作用。

通常来说，用于本发明的肽仅包含一个T细胞表位。如下所述，可通过功能测定和/或二氧化硅预测测定中的一个或更多个来鉴定蛋白质序列中的T细胞表位。T细胞表位序列中的氨基酸根据其在MHC蛋白的结合沟中的位置来编号。存在于肽中的T细胞表位由8至25个氨基酸，但更特别地8至16个氨基酸组成，但最特别地由8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸组成。

在一个更具体的实施方案中，T细胞表位由9个氨基酸的序列组成。在另一个具体实施方案中，T细胞表位是由MHC II类分子呈递给T细胞的表位[MHC II类限制性T细胞表位]。通常来说，T细胞表位序列是指适合MHC II蛋白的槽的八肽或更特别地是九肽序列。

本发明的肽的T细胞表位可对应于蛋白质的天然表位序列，或者可以是其经修饰形式，前提是：与天然T细胞表位序列类似，经修饰T细胞表位保留其在MHC槽内结合的能力。经修饰T细胞表位可具有与天然表位相同的对MHC蛋白的结合亲和力，但也可具有降低的亲和力。特别地，经修饰肽的结合亲和力比原始肽小不少于10倍，更特别地小不少于5倍。本发明的肽对蛋白质复合物具有稳定作用。因此，肽-MHC复合物的稳定作用补偿了经修饰表位对MHC分子的降低的亲和力。

肽内包含T细胞表位和还原性化合物的序列可进一步与促进肽被摄取到晚期内体中以进行加工并在MHC II类决定簇中呈递的氨基酸序列(或另一种有机化合物)连接。晚期内体靶向是由存在于蛋白质的胞质尾中的信号介导的，并且对应于公认的肽基序。晚期内体靶向序列允许对抗原来源的T细胞表位进行加工并通过MHC II类分子高效呈递。这样的内体靶向序列包含在例如gp75蛋白(Vijayasaradhi et al.(1995)J.Cell.Biol.130,807-820)、人CD3γ蛋白、HLA-BM 11(Copier et al.(1996)J.lmmunol.157,1017-1027)、DEC205受体胞质尾(Mahnke et al.(2000)J.Cell Biol.151,673-683)内。在Bonifacio和Traub(2003)Annu.Rev.Biochem.72,395-447的综述中公开了作为内体的分拣信号发挥作用的肽的其他实例。或者，该序列可以是来自蛋白质的亚优势或次要T细胞表位的序列，其促进晚期内体中的摄取但未克服针对抗原的T细胞应答。晚期内体靶向序列可位于抗原来源肽的氨基端或羧基端末端处，以用于高效摄取和加工，并且也可通过侧翼序列，例如多至10个氨基酸的肽序列偶联。当出于靶向目的使用次要T细胞表位时，后者通常位于抗原来源肽的氨基端末端处。

因此，本发明设想了抗原蛋白的肽的用途及其在引发特异性免疫反应中的用途。这些肽可对应于在其序列内包含即被至多10个，优选7个氨基酸或更少的氨基酸隔开的还原性化合物和T细胞表位的蛋白质片段。或者，并且对于大多数抗原蛋白，本发明的肽是通过将还原性化合物，更特别地本文中所述的还原性经修饰氧化还原基序与抗原蛋白的T细胞表位在N端或C端偶联(与其直接相邻或用至多10个、更特别地至多7个氨基酸的接头)而产生的。此外，与天然存在的序列相比，可对蛋白质的T细胞表位序列和/或经修饰氧化还原基序修饰和/或可引入一个或更多个侧翼序列和/或靶向序列(或对其进行修饰)。因此，取决于是否可在目的抗原蛋白的序列内发现本发明的特征，本发明的肽可包含“人工的”或“天然存在的”序列。

本发明的肽的长度可显著变化。肽的长度可以为13或14个氨基酸(即由8至9个氨基酸的表位、与其相邻的具有组氨酸的5个氨基酸的经修饰的氧化还原基序组成)多至20、25、30、40或50个氨基酸而不等。例如，肽可包含40个氨基酸的内体靶向序列、约2个氨基酸的侧翼序列、5个氨基酸的如本文中所述的基序、4个氨基酸的接头和9个氨基酸的T细胞表位肽。

因此，在一些具体实施方案中，完整的肽由13个氨基酸多至20、25、30、40、50、75或100个氨基酸组成。更特别地，在还原性化合物是如本文中所述的经修饰氧化还原基序的情况下，无内体靶向序列的包含任选地通过接头连接的表位和经修饰氧化还原基序的(人工或天然)序列(本文中称为“表位-经修饰氧化还原基序”序列)的长度是至关重要的。“表位-经修饰氧化还原基序”更特别地具有13、14、15、16、17、18或19个氨基酸的长度。这样的13或14至19个氨基酸的肽可任选地与其大小不太关键的内体靶向信号偶联。

如上所述，在一些具体实施方案中，本发明的肽包含与T细胞表位序列连接的如本文中所述的还原性经修饰氧化还原基序。

在另一些具体实施方案中，用于本发明的肽是包含T细胞表位的肽，该T细胞表位不包含在其天然序列内具有氧化还原特性的氨基酸序列。

然而，在一些替代实施方案中，T细胞表位可包含确保表位与MHC槽结合的任何氨基酸序列。在抗原蛋白的目的表位在其表位序列内包含如本文中所述的经修饰氧化还原基序的情况下，根据本发明的免疫原性肽包含如本文中所述的经修饰氧化还原基序的序列和/或与表位序列N端或C端偶联的另一种还原性序列的序列，以使得(与埋在槽中的表位中存在的经修饰氧化还原基序相反)连接的经修饰氧化还原基序可确保还原活性。

因此，T细胞表位和基序彼此紧邻或隔开，并且不重叠。为了评估“紧邻”或“隔开”的概念，确定适合MHC槽的8或9个氨基酸的序列，并确定该八肽或九肽与氧化还原基序四肽或经修饰氧化还原基序五肽(包含组氨酸)之间的距离。

通常来说，用于本发明的肽不是天然的(因此没有像这样的蛋白质片段)而是人工肽，其除T细胞表位之外还包含如本文中所述的经修饰氧化还原基序，其中经修饰氧化还原基序通过由多至7个氨基酸、最特别地多至4个或多至2个氨基酸组成的接头与T细胞表位直接隔开。

已表明，在向哺乳动物施用(即注射)本文中公开的肽(或包含这样的肽的组合物)之后，该肽引发识别抗原来源的T细胞表位的T细胞活化，并通过还原表面受体向T细胞提供另外的信号。这种超最佳活化导致T细胞获得对呈递T细胞表位的细胞的溶细胞特性，以及对旁观者T细胞的抑制特性。以这种方式，本发明中所述的包含抗原来源的T细胞表位以及表位之外的经修饰氧化还原基序的肽或包含所述肽的组合物可用于哺乳动物包括人的直接免疫接种。因此，本发明提供了本文中公开的肽或其衍生物用作药物的用途。因此，本发明提供了治疗方法，其包括向有此需要的患者施用一种或更多种本文中公开的肽。

本发明提供了这样的方法，通过该方法，被赋予溶细胞特性的抗原特异性T细胞可通过用小肽进行的免疫接种来引发。已经发现包含以下的肽引发抑制性T细胞：(i)编码来自抗原的T细胞表位的序列和(ii)具有氧化还原特性的共有序列，并且另外任选地还包含促进该肽被摄取到晚期内体中以用于高效的MHC II类呈递的序列。

所公开肽的免疫原性特性在治疗和预防免疫反应中是特别令人感兴趣的。

本文中所述的肽用作药物，更特别地用于制备用于在哺乳动物中(更特别地在人中)预防或治疗免疫病症的药物。

本发明描述了通过使用本文中公开的肽、其同源物或衍生物来治疗或预防需要这样的治疗或预防的哺乳动物的免疫病症的方法，该方法包括向患有免疫病症或处于免疫病症的风险之中的所述哺乳动物施用治疗有效量的本文中公开的肽、其同源物或衍生物例如以降低免疫病症的症状的步骤。设想了对人和动物(例如宠物和农场动物)二者的治疗。在一个实施方案中，待治疗的哺乳动物是人。在一个具体实施方案中，以上提及的免疫病症选自变应性疾病和自身免疫病。

用于本发明的肽或包含如本文中所限定的这样的肽的药物组合物优选通过皮下或肌内施用来施用。优选地，可将肽或包含这样的肽的药物组合物皮下(SC)注射到位于肘和肩中间的上臂的外侧部的区域中。当需要两次或更多次分开的注射时，其可伴随地在两条臂中施用。

用于本发明的肽或包含这样的肽的药物组合物以治疗有效剂量施用。一些示例性但非限制性的剂量方案为50至1500μg，优选100至1200μg。根据患者的状况和疾病的严重程度，更具体的剂量方案可以为50至250μg、250至450μg、或850至1300μg。剂量方案可包含以单剂量或者以2、3、4、5或更多个剂量同时或连续地施用。一些示例性的非限制性施用方案如下：

-低剂量方案，其包括SC施用50μg肽，以各25μg(各100μL)的两次分开注射进行；随后三次连续注射25μg肽，每一次注射25μg肽都以各12.5μg(各50μL)的两次分开注射进行。

-中剂量方案，其包括SC施用150μg肽，以各75μg(各300μL)的两次分开注射进行；随后三次连续施用75μg肽，每一次注射75μg肽都以各37.5μg(各150μL)的两次分开注射进行。

-高剂量方案，其包括SC施用450μg肽，以各225μg(各900μL)的两次分开注射进行；随后三次连续施用225μg肽，每一次注射225μg肽都以各112.5μg(各450μL)的两次分开注射进行。

对于所有上述肽，设想了另外的变体，其中在组氨酸和半胱氨酸之间存在一个或两个氨基酸X。通常来说，这些外部氨基酸X不是His、Cys、Ser或Thr。

用于本发明的肽还可在用于在样品中检测II类限制性CD4+T细胞的体外诊断方法中使用。在该方法中，使样品与MHC II类分子和本文中公开的肽的复合物接触。通过测量复合物与样品中细胞的结合来检测CD4+T细胞，其中复合物与细胞的结合指示样品中存在CD4+T细胞。

复合物可以是肽与MHC II类分子的融合蛋白。或者，复合物中的MHC分子是四聚体。复合物可作为可溶性分子提供或者可与载体连接。

因此，在一些具体实施方案中，本发明的治疗和预防方法包括施用如本文中所述的免疫原性肽，其中所述肽包含在待治疗的疾病中发挥作用的抗原蛋白的T细胞表位(例如如以上描述的那些)。在另一些具体实施方案中，使用的表位是优势表位，其与对被认为受益于所述治疗最多的那些患者进行分层或选择的方法组合。

根据本发明使用的肽可通过合成其中T细胞表位与经修饰氧化还原基序将被0至5个氨基酸隔开的肽来制备。在某些实施方案中，经修饰氧化还原基序可通过在表位序列之外引入1、2或3个突变来获得，以保留如在蛋白质中存在的序列背景。通常来说，参照作为天然序列的一部分的九肽，P-2和P-1以及P+10和P+11中的氨基酸被保留在肽序列中。这些侧翼残基通常使与MHC II类的结合稳定。在另一些实施方案中，表位的N端或C端序列与包含T细胞表位序列的抗原蛋白的序列无关。

因此，基于以上用于设计肽的方法，通过化学肽合成、重组表达方法或在更特殊情况下的蛋白质的蛋白水解或化学片段化来产生肽。

可在体外和体内方法中测试如在上述方法中产生的肽的T细胞表位的存在，并且可在体外测定中测试其还原活性。作为最终的质量控制，可在体外测定中测试肽以验证该肽是否可产生CD4+T细胞，这些细胞通过针对呈递包含表位序列(其也存在于具有经修饰氧化还原基序的肽中)的抗原的抗原呈递细胞的凋亡途径而具有溶细胞性。

用于本发明的肽可使用重组DNA技术在细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞或哺乳动物细胞中产生。考虑到肽的有限长度，其可通过化学肽合成来制备，其中通过将不同的氨基酸彼此偶联来制备肽。化学合成特别适合于包含例如D-氨基酸、具有非天然存在侧链的氨基酸或具有经修饰侧链的天然氨基酸，例如甲基化半胱氨酸。

化学肽合成方法已被充分描述，并且肽可从例如Applied Biosystems和其他公司的公司订购。

肽合成可以作为固相肽合成(solid phase peptide synthesis，SPPS)或与液相肽合成相反地进行。最著名的SPPS方法是t-Boc和Fmoc固相化学：

在肽合成期间，使用了数个保护基。例如，羟基和羧基官能团被叔丁基保护，赖氨酸和色氨酸被t-Boc基团保护，并且天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸和组氨酸被三苯甲基保护，并且精氨酸被pbf基团保护。如果合适的话，这样的保护基可在合成之后留在肽上。可使用如Kent(Schnelzer&Kent(1992)lnt.J.Pept.Protein Res.40,180-193)最初所描述并且例如在Tam et al.(2001)Biopolymers 60,194-205中所综述的连接策略(两个未经保护的肽片段的化学选择性偶联)将肽彼此连接以形成更长的肽，所述连接策略为实现蛋白质合成提供了巨大的潜力，这超出了SPPS的范围。通过这种方法已成功地合成了大小为100至300个残基的许多蛋白质。由于SPPS的巨大进步，合成肽在生物化学、药理学、神经生物学、酶学和分子生物学的研究领域中继续发挥着越来越重要的作用。

或者，所述肽可通过在包含编码核苷酸序列的合适的表达载体中使用编码本发明肽的核酸分子来合成。这样的DNA分子可使用自动DNA合成仪和遗传密码的公知密码子-氨基酸关系来容易地制备。这样的DNA分子还可使用寡核苷酸探针和常规杂交方法作为基因组DNA或作为cDNA来获得。可将这样的DNA分子并入到表达载体(包括质粒)中，所述表达载体适合于在合适的宿主中表达DNA和产生多肽，所述合适的宿主例如细菌(例如大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母细胞、动物细胞或植物细胞。

检查目的肽的物理和化学特性(例如溶解性、稳定性)，以确定该肽是否/是否将适合用于治疗性组合物中。通常来说，这是通过调节肽的序列来优化的。任选地，可在合成之后使用本领域已知的技术对肽进行修饰(化学修饰，例如添加/缺失官能团)。

认为T细胞表位本身通过与抗原呈递细胞表面的适当HLA分子结合并刺激相关T细胞亚群来触发早期的T辅助细胞水平事件。这些事件导致T细胞增殖、淋巴因子分泌、局部炎症反应、向该部位募集另外的免疫细胞以及激活B细胞级联反应，从而产生抗体。这些抗体的一种同种型，IgE，在变应性症状的发展中具有根本性的重要性，并且它的产生在T辅助细胞水平事件的级联早期受到分泌的淋巴因子性质的影响。T细胞表位是T细胞受体识别的基本要素或最小单位，其中表位包含受体识别所必需的氨基酸残基，所述氨基酸残基在蛋白质的氨基酸序列中是连续的。

然而，在施用具有T细胞表位和氧化还原基序的肽之后，认为会发生以下事件：

由与MHC II类分子呈递的抗原衍生肽的同源相互作用引起的抗原(i)特异性T细胞的活化；

还原酶序列还原T细胞表面蛋白，例如CD4分子，其第二结构域包含受限制的二硫桥。这将信号转导到T细胞中。在与氧化途径提高相关的一系列结果中，重要事件是钙内流提高和NF-kB转录因子易位至细胞核。后者导致IFN-γ和颗粒酶的转录提高，这使得细胞通过凋亡诱导机制获得溶细胞特性；溶细胞特性通过涉及颗粒酶B分泌和Fas-FasL相互作用的机制影响呈递肽的细胞。由于细胞杀伤作用是通过凋亡途径获得的，因此与细胞毒性细胞相比，溶细胞性细胞是更适合这些细胞的术语。抗原呈递靶细胞的破坏阻止了针对位于同一抗原上的表位或针对将由同一抗原呈递细胞加工的不相关抗原的表位特异性的其他T细胞的活化；T细胞活化的另外的结果是通过细胞间接触依赖机制抑制旁观者T细胞的活化。在这样的情况下，由不同抗原呈递细胞呈递的抗原活化的T细胞也被抑制，前提是溶细胞性T细胞和旁观者T细胞二者非常接近，即在同一抗原呈递细胞的表面上被活化。

以上假定的作用机制由以上引用的PCT申请WO2008/017517中公开的实验数据证实。

本发明提供了用于在体内或体外产生抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的方法以及其在治疗已被分层或选择为受益于所述治疗最多的患者中的用途。与其无关，可设想基于特征表达数据区分溶细胞性CD4+T细胞与其他细胞群例如Foxp3+Treg的方法。

本发明描述了用于产生可用于根据本发明进行治疗的抗原特异性CD4+T细胞的体内方法。一个具体实施方案涉及用于通过以下来产生或分离CD4+T细胞的方法：用如本文中所述的肽来免疫接种动物(包括人)，并随后从经免疫接种的动物中分离CD4+T细胞。本发明描述了用于产生针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的体外方法。本申请还公开了用于产生针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞的方法。

在一个实施方案中，提供了这样的方法，其包括分离外周血细胞，通过本文中所述的免疫原性肽体外刺激细胞群，以及扩增经刺激的细胞群，更特别地在存在IL-2的情况下进行。根据本发明的方法具有以下优点：产生高数目的CD4+T细胞，并且可产生对抗原蛋白具有特异性的CD4+T细胞(通过使用包含抗原特异性表位的肽)。

在一个替代实施方案中，CD4+T细胞可在体内产生，即通过向对象注射本文中所述的免疫原性肽，并收集体内产生的溶细胞性CD4+T细胞。

可通过本文中公开的方法获得的针对APC的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞在预防变应性反应和治疗自身免疫病中向哺乳动物施用免疫治疗是特别令人感兴趣的。设想了使用同种细胞和自体细胞(autogeneic cell)二者。

溶细胞性CD4+T细胞群如下文中所述获得。

如本文中所述的抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞可用作药物，更特别地用于过继细胞治疗，更特别地用于治疗急性变应性反应和自身免疫病(例如多发性硬化)的复发。如所述产生的分离的溶细胞性CD4+T细胞或细胞群，更特别地抗原特异性溶细胞性CD4+T细胞群用于制备用于预防或治疗免疫病症的药物。公开了通过使用分离的或产生的溶细胞性CD4+T细胞进行治疗的方法。

如WO2008/017517中说明的，基于细胞的表达特征，可将针对APC的溶细胞性CD4+T细胞与天然Treg细胞区分开。更特别地，与天然Treg细胞群相比，溶细胞性CD4+T细胞群表现出以下特征中的一种或更多种：活化之后表面标志物(包括CD103、CTLA-4、Fasl和ICOS)的表达提高，CD25中等表达，CD4、ICOS、CTLA-4、GITR表达，以及CD127(IL7-R)低表达或不表达，CD27不表达，转录因子T-bet和egr-2(Krox-20)表达，但转录阻遏物Foxp3不表达，高的IFN-γ产生，以及没有或仅痕量的IL-10、IL-4、IL-5、IL-13或TGF-β。

此外，溶细胞性T细胞表达CD45RO和/或CD45RA，不表达CCR7、CD27，并且呈递高水平的颗粒酶B和其他颗粒酶以及Fas配体。

在施用于活的动物(通常是人)之后，用于本发明的肽将引发对旁观者T细胞发挥抑制活性的特异性T细胞。

在一些具体实施方案中，本文中公开的溶细胞性细胞群的特征在于FasL和/或干扰素γ的表达。在一些具体实施方案中，本发明的溶细胞性细胞群的特征还在于颗粒酶B的表达。

该机制还意味着并且实验结果表明，本发明的肽尽管包含某抗原的特定T细胞表位，但可用于预防或治疗由针对相同抗原的其他T细胞表位的免疫反应引发的病症，或者在某些情况下甚至用于治疗由针对其他不同抗原的其他T细胞表位的免疫反应引发的病症，如果所述其他不同抗原将由MHC II类分子在被本发明肽活化的T细胞附近通过相同的机制来呈递的话。

公开了具有上述特征的细胞类型的分离的细胞群，其另外是抗原特异性的，即能够抑制抗原特异性免疫应答。

本发明提供了包含一种或更多种根据本发明的肽的药物组合物的用途，所述药物组合物还包含可药用载体。如上所详述的，本发明还涉及用作药物的组合物或涉及通过使用所述组合物来治疗哺乳动物免疫病症的方法，以及涉及所述组合物用于制备用于预防或治疗免疫病症的药物的用途，其与对被认为受益于所述治疗最多的那些患者进行分层或选择的方法组合。药物组合物可例如是疫苗，其适用于治疗或预防免疫病症，尤其是空气源性(airborne)和食源性(foodborne)变态反应以及变应性源的疾病。作为药物组合物的本文中进一步描述的一个实例，将根据本发明的肽吸附在适合于向哺乳动物施用的佐剂，例如氢氧化铝(明矾)上。通常来说，以2周的间隔通过皮下途径注射3次本文中所述的期望剂量(例如50μg至1500μg)的吸附在明矾上的肽。对于本领域技术人员来说应明显的是，其他施用途径也是可能的，包括经口、鼻内或肌内。同样，注射次数和注射量可根据待治疗的病症而变化。此外，可使用除明矾之外的其他佐剂，前提是其促进MHC II类呈递中的肽呈递和T细胞活化。因此，尽管可单独施用活性成分，但它们通常作为药物制剂存在。本发明的用于兽用用途和用于人用途二者的制剂均包含至少一种如上所述的活性成分以及一种或更多种可药用载体。本公开内容涉及药物组合物，其包含与可药用载体混合的作为活性成分的一种或更多种本文中所述的肽。药物组合物应包含治疗有效量的活性成分，例如下文关于治疗或预防方法所指示的。任选地，组合物还包含其他治疗性成分。合适的其他治疗性成分以及其取决于其所属类别的常用剂量是本领域技术人员公知的，并且可选自用于治疗免疫病症的其他已知药物。

本文中使用的术语“可药用载体”意指与活性成分一起配制以便于例如通过溶解、分散或扩散该组合物来有助于其在待治疗的部位的施加或散布，和/或在不损害其效力的情况下有助于其储存、运输或处理的任何材料或物质。可药用载体包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂(例如酚、山梨酸、氯丁醇)、等张剂(例如糖或氯化钠)等。为了控制组合物中免疫原性肽的作用持续时间，可包含另外的成分。可药用载体可以是固体或液体或已被压缩以形成液体的气体，即本发明的组合物可合适地用作浓缩剂、乳剂、溶液剂、颗粒剂、粉尘剂(dust)、喷雾剂、气雾剂、混悬剂、软膏剂、乳膏剂、片剂、丸剂或粉剂。用于药物组合物及其制剂的合适的药物载体是本领域技术人员公知的，并且在本发明内对其选择没有特别限制。可药用载体还可包括添加剂，例如润湿剂、分散剂、黏贴剂(sticker)、黏合剂、乳化剂、溶剂、包衣、抗细菌和抗真菌剂(例如酚、山梨酸、氯丁醇)、等张剂(例如糖或氯化钠)等，前提是它们与药学实践一致，即不会对哺乳动物造成永久损害的载体和添加剂。本发明的药物组合物可以以任何已知方式制备，例如通过以一步或多步操作将活性成分与所选的载体材料以及(合适的话)其他添加剂(例如表面活性剂)一起均质地混合、对其进行包衣和/或研磨来制备。它们也可通过微粉化(micronisation)来制备，例如，考虑到以通常具有约1至10μm直径的微球形式获得它们，即用于制备用于控制或持续释放活性成分的微胶囊剂。

待用于本发明药物组合物中的合适的表面活性剂(也称为乳化剂(emulgent)或乳化剂(emulsifier))是具有良好的乳化、分散和/或润湿特性的非离子型、阳离子型和/或阴离子型材料。合适的阴离子型表面活性剂包括水溶性皂和水溶性合成表面活性剂。合适的皂是高级脂肪酸(C10至C22)的碱金属盐或碱土金属盐、未经取代或经取代的铵盐，例如油酸或硬脂酸的钠盐或钾盐，或者可从椰子油或动物脂油(tallow oil)获得的天然脂肪酸混合物的钠盐或钾盐。合成的表面活性剂包括聚丙烯酸的钠盐或钙盐；脂肪磺酸盐和硫酸盐；磺化苯并咪唑衍生物和烷基芳基磺酸盐。脂肪磺酸盐或硫酸盐通常为以下形式：碱金属盐或碱土金属盐、未经取代的铵盐或被具有8至22个碳原子的烷基或酰基基团取代的铵盐，例如，木质素磺酸(lignosulphonic acid)或十二烷基磺酸的钠盐或钙盐，或从天然脂肪酸中获得的脂肪醇硫酸盐的混合物、硫酸酯或磺酸酯的碱金属盐或碱土金属盐(例如月桂基硫酸钠)和脂肪醇/环氧乙烷加合物的磺酸。合适的磺化苯并咪唑衍生物通常包含8至22个碳原子。烷基芳基磺酸盐的一些实例是十二烷基苯磺酸或二丁基-萘磺酸或萘-磺酸/甲醛缩合产物的钠盐、钙盐或链烷醇胺盐。同样合适的是相应的磷酸盐，例如磷酸酯和对壬基苯酚与环氧乙烷和/或环氧丙烷的加合物，或磷脂的盐。用于此目的的合适的磷脂是脑磷脂或卵磷脂类型的天然的(来源于动物或植物细胞的)或合成的磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、溶血卵磷脂、心磷脂、二辛基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱，及其混合物。

合适的非离子型表面活性剂包括烷基酚、脂肪醇、脂肪酸、分子中包含至少12个碳原子的脂肪族胺或酰胺、烷基芳烃磺酸盐和二烷基磺基琥珀酸盐的聚乙氧基化和聚丙氧基化衍生物，例如脂肪族和脂环族醇、饱和和不饱和脂肪酸和烷基酚的聚乙二醇醚衍生物，所述衍生物通常在(脂肪族)烃部分中包含3至10个乙二醇醚基和8至20个碳原子，并且在烷基酚的烷基部分中包含6至18个碳原子。另外的合适的非离子型表面活性剂是聚环氧乙烷与聚丙二醇、在烷基链中包含1至10个碳原子的乙二胺基聚丙二醇(ethylenediaminopolypropylene glycol)的水溶性加合物，该加合物包含20至250个乙二醇醚基和/或10至100个丙二醇醚基。这样的化合物通常包含1至5个乙二醇单元/丙二醇单元。非离子型表面活性剂的代表性实例是壬基酚-聚乙氧基乙醇、蓖麻油聚乙醇醚(castoroil polyglycolic ether)、聚丙烯/聚环氧乙烷加合物、三丁基苯氧基聚乙氧基乙醇、聚乙二醇和辛基苯氧基聚乙氧基乙醇。如下物质也是合适的非离子型表面活性剂：聚乙烯脱水山梨糖醇的脂肪酸酯(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯)、甘油、脱水山梨糖醇、蔗糖和季戊四醇。合适的阳离子型表面活性剂包括具有4个任选地被卤素、苯基、经取代的苯基或羟基取代的烃基的季铵盐，特别是卤化物；例如包含作为N-取代基的至少一个C8C22烷基基团(例如鲸蜡基、月桂基、棕榈基、肉豆蔻基、油烯基等)以及作为另外的取代基的未经取代或卤代的低级烷基、苄基和/或羟基-低级烷基的季铵盐。

适用于此目的的表面活性剂的更详细描述可见于例如“McCutcheon'sDetergents and Emulsifiers Annual”(MC Publishing Crop.,Ridgewood,New Jersey,1981)、“Tensid-Taschenbucw”2d ed.(Hanser Verlag,Vienna,1981)和“Encyclopaediaof Surfactants,(Chemical Publishing Co.,New York,1981)中。根据本发明的肽、其同源物或衍生物(及其全部包括在术语“活性成分”中的其生理学上可接受的盐或药物组合物)可通过适合于待治疗病症和适合于所述化合物(在此为待施用的蛋白质和片段)的任何途径来施用。可能的途径包括区域性、全身性、经口(固体形式或吸入)、经直肠、经鼻、局部(包括经眼、经颊和舌下)、经阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)。优选的施用途径可根据例如接受者的状况或待治疗的疾病而变化。如本文中所述，在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体最佳地是“可接受的”。所述制剂包括适用于经口、经直肠、经鼻、局部(包括经颊和舌下)、经阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内、动脉内、鞘内和硬膜外)施用的那些。

适用于肠胃外施用的制剂包括：水性和非水性无菌注射溶液剂，其可包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，其使制剂与预期接受者的血液等张；以及水性和非水性无菌混悬剂，其可包括助悬剂和增稠剂。制剂可存在于单位剂量或多剂量的容器(例如密封的安瓿和小瓶)中，并且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需要在使用之前立即添加无菌液体载体(例如注射用水)。即用型(extemporaneous)注射溶液剂和混悬剂可由前述类型的无菌粉末剂、颗粒剂和片剂制备。

典型的单位剂量制剂是包含如上文中所述的活性成分的每日剂量或单位每日亚剂量或其适当分数的那些。应理解，除以上特别提及的成分之外，考虑到所讨论的制剂的类型，本发明的制剂可包含本领域常规的其他试剂，例如适用于经口施用的那些可包含矫味剂。根据本发明的肽、其同源物或衍生物可用于提供包含一种或更多种本发明化合物作为活性成分的控制释放药物制剂(“控制释放制剂”)，其中活性成分的释放可被控制和调节，以允许较低频率的给药或改善给定的本发明化合物的药代动力学谱或毒性谱。可根据常规方法制备适用于经口施用的控制释放制剂，其中离散单元包含一种或更多种本发明化合物。为了控制组合物中活性成分的作用持续时间，可包含另外的成分。因此，可通过选择合适的聚合物载体来获得控制释放组合物，所述合适的聚合物载体例如如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、硫酸鱼精蛋白等。药物释放的速率和作用的持续时间还可通过将活性成分并入到聚合物的颗粒(例如微胶囊)中来控制，所述聚合物例如水凝胶、聚乳酸、羟甲基纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯和其他上述聚合物。这样的方法包括胶体药物递送系统，如脂质体、微球、微乳剂、纳米粒、纳米胶囊剂等。根据施用途径，药物组合物可需要保护性包衣。适用于注射的药物形式包括无菌水性溶液剂或分散体以及用于其即用型制剂的无菌粉剂。因此，用于此目的的典型载体包括生物相容性水性缓冲剂、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇等，以及其混合物。鉴于以下事实：当组合使用数种活性成分时，其不一定在待治疗的哺乳动物中同时直接发挥其联合的治疗作用，因此相应的组合物也可以是在分开但相邻的储器或室中包含两种成分的医学药盒或包装的形式。因此，在后一种情况下，每种活性成分可以以适用于不同于另一种成分的施用途径的方式配制，例如，它们之一可以是经口或肠胃外制剂的形式，而另一种是用于静脉内注射的安瓿或气雾剂的形式。

如在体外和体内所证实的，如本文中所述的获得的溶细胞性CD4+T细胞在MHC-II类依赖性的同源激活之后诱导APC凋亡，影响树突细胞和B细胞二者，并且(2)在IL-10和/或TGF-β不存在的情况下通过接触依赖性机制抑制旁观者T细胞。如WO2008/017517中详细讨论的，可将溶细胞性CD4+T细胞与天然Treg和适应性Treg区分开。

现在将通过以下实施例对本发明进行举例说明，所述实施例是在不具有任何限制意图的情况下提供的。此外，本文中所述的所有参考文献均通过引用明确地包含在本文中。

实施例

实施例1：包含胰岛素MHCII T细胞表位和氧化还原酶基序的免疫原性肽与可溶性DRB1＊0301或DRB1＊0401重组MHC II蛋白的结合。

为了测试包含来自胰岛素原区域C20_A1的MHC II类T细胞表位和氧化还原酶基序的肽的结合，进行了可溶相竞争测定，其中提高浓度的具有序列HCPYCVRSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID.NO：25)和HCPYCSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID.NO.26)的肽与经标记的对照肽(高亲和力结合物；生物素化的)竞争结合可溶性DRBI*0301或DRB1*0401重组人MHC II蛋白。随着结合接近平衡(18小时)，肽-MHC II复合物被捕获并与未结合的试剂分离。所捕获的肽-MHCII复合物通过时间分辨荧光(Eu³⁺链霉抗生物素蛋白)进行定量检测，并对数据进行处理和绘制以确定受试肽的剂量依赖性结合特性和IC50的确定(荧光强度的降低反映肽的结合)。所有用这些肽进行的测试一式三份进行，并且每个测试进行两次。图1示出了一项实验的结果。具有序列HCPYCVRSLQPLALEGSLQKRG(SEQ ID.NO：25)和HCPYCSLQPLALEGSLQKRG(SEQID.NO.26)的肽是DRB1*0301和DRB1*0401单倍型的良好结合物，因为它们能够与测定中使用的高亲和力参考表位结合物竞争。

实施例2：包含胰岛素MHCII T细胞表位和氧化还原酶基序的免疫原性肽引发和扩增来自不同胰岛素依赖性糖尿病患者的CD4+T细胞的能力。

测试来自不同1型糖尿病(T1D)患者的初始CD4+T细胞对由序列HCPYCVRSLQPLALEGSLQKRG限定的肽的反应性。首先测试了T1D患者的HLA DRB1分型(参见表1)。

表1：受试T1D患者的HLA DRB1分型。

HLA分型使用本领域已知的方法进行，例如在Mack et al.，2009，TissueAntigens.2009Jan；73(1)：17-32中报道的。

然后处理血液样品，并通过磁分离技术纯化初始CD4+T细胞。使用肽预加载的自体树突细胞(在存在GM-CSF和IL-4的情况下分化随后用TNF-α成熟的单核细胞来源的DC)作为抗原呈递细胞，测试了肽引发和扩增这些初始CD4+T细胞的能力。

图2示出了通过在用自体树突细胞进行特定肽刺激经过连续再刺激(S1、S4和S6)之后CD4+T细胞数目的演变测量的反应性。数据显示出大多数受试患者良好的响应性(细胞维持和扩增)，除了两名患者没有明显观察到细胞反应性并且在刺激2时已经与死亡率相关(T1D02和T1D06；从S2到S6，n细胞＝0)。数据显示出不表达DRB1*04单倍型的患者在所述治疗测试条件下对肽刺激没有表现出显著响应。更引人注目的是，这些非响应性T1D患者表达DRB1*03单倍型，对于此，所述肽在竞争性HLA结合测定中显示出良好的结合能力。

实施例3：在T1D患者中用具有序列HCPYCSLQPLALEGSLQKRG的免疫原性肽进行的Ib期临床试验。

在近期发病(≤6个月)成年T1D患者的Ib期临床试验中评价了具有序列HCPYCSLQPLALEGSLQKRG的免疫原性肽的安全性、临床效率和诱导的免疫应答。在这项剂量递增、安慰剂对照研究中，患者接受4次双周皮下注射3种受试剂量中的一种或匹配的安慰剂。用明矾作为佐剂注射肽。对患者进行了6个月的随访，以评价肽的安全性和诱导的免疫应答。

主要纳入标准是：

-BMI 1728kg/m²的18至30岁的男性和女性；

-过去6个月内根据ADA/WHO标准初步诊断为1型糖尿病；

-由研究者确定的胰岛素需求量；

-HLA-DR3阳性和/或HLA-DR4阳性；

-存在至少一种自身抗体(GAD65、IA 2或ZnT8)；

-筛选时空腹C肽≥0 2nmol/L和/或经刺激C肽≥0 4nmol/L。

图3示出了Ib期研究设计的方案。将患者分为3个组群：

-低剂量组群(组群1)包括8名患者(6名接受治疗和2名安慰剂)，SC注射50μg肽，随后3次连续注射25μg肽。4次注射间隔2周进行。然后对患者进行随访直至第24周。

-中等剂量(组群2)包括12名患者(9名接受治疗和3名安慰剂)SC注射150μg肽，随后3次连续施用75μg肽。4次注射间隔2周进行。然后对患者进行随访直至第24周。

-较高剂量(组群3)包括21名患者(16名接受治疗和5名安慰剂)SC注射450μg肽，随后3次连续施用225μg肽。4次注射间隔2周进行。然后对患者进行随访直至第24周。

使用来自Ariana Pharma的专有

(知识提取和管理(KnowledgeExtraction and Management))人工智能技术对所有数据关系进行的系统分析，对来自临床试验的完全数据集进行数据挖掘分析。该方法旨在确定具有改善的临床参数的趋势的患者亚组。在此分析期间，HLA基因型成为评估未来临床响应时要考虑的关键因素。从最初的数据挖掘结果来看，在组群3(测试的较高剂量)中，具有HLA-DR4(+)基因型的患者以及具有HLA-DR3(-)基因型的患者在多个时间点多个参数正在改善。这一发现是重要的并且强化这一发现的是，在这些Ib期测试条件下在不同时间点，具有HLA-DR4(-)基因型的患者显示出同一参数没有改善。这些初步发现总结在下表2中。

表2：使用

的数据驱动分析通过数据挖掘确定组群3中具有差异临床参数演变的亚组。

已根据IMGM提供的分析计划通过使用用于Hamilton Robot的Chemagic STAR DNA血液试剂盒(Chemagen)进行DNA分离，并洗脱到150μl Tris-HCL(pH 8.0)中。已根据

SSO方法序列特异性寡核苷酸探针LABType SSO使用与荧光编码微球结合的序列特异性寡核苷酸(sequence-specific oligonucleotide，SSO)探针进行低分辨率HLA分型以确定样品DNA编码的等位基因。LABType将

技术应用于反向SSO DNA分型方法(https://www.onelambda.com/en/product/labtype-sso.html)并用HLA FusionTM软件进行了评价。对于高分辨率HLA分型，已使用根据SOP AA-1550的所谓长距离PCR(longRange PCR)，并已用Illumina技术对其进行测序。这些序列的评价是使用GenDX NGSengine版本2.13.0(https://www.gendx.com/products/ngsengine)进行的。

基于这一最初的无假设驱动的发现，根据HLA基因型并且更准确地来说HLA-DR3和HLA-DR4单倍型的表达，在临床试验的不同亚群中探究临床参数。表3总结了试验中不同基因型的分布。可观察到，不同的组(安慰剂、组群1、组群2和组群3)对于不同的基因型组合是不平衡的。这种不平衡纯粹是由于小的研究规模引起的。

表3：各研究组中根据患者的HLA-DR基因型的患者数目。X表示除DR3或DR4之外的HLA-DR基因型。

作为临床参数实例，根据不同患者的HLA-DR基因型，研究了混合膳食耐受测试(Mixed Meal Tolerance Test，MMTT)期间的C肽曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)的演变和每日总胰岛素剂量/kg(分别为图4和图5)。值得注意的是，用中等或高剂量的肽HCPYCSLQPLALEGSLQKRG治疗并且表达HLA-DR4(DR4(+)或DR3(-))的患者在纳入(＝访问2，V2)之后6个月(＝访问8，V8)对于这两个终点显示出积极趋势。在Ib期临床试验的测试条件下，在不表达HLA-DR4(DR4(-))的群体中没有观察到这种情况。

Greenbaum等(Diabetes.2012，61(8)：2066-73)已经描述了一个初步的在诊断之后前2年的T1D疾病演变模型，该模型基于以7至45岁的新诊断患者的该群体在不同临床试验中积累的大量数据。在该群体中，86％的患者呈DR3或DR4阳性。该模型使用了通过2小时或4小时MMTT测试测量的C肽分泌。我们使用该模型来比较我们的患者的两个目标的演变：第一，安全方面，其允许确认我们的经治疗患者没有表现出疾病恶化(即没有显示出比模型演变得更快)，并且第二，效力方面，期望表明经治疗患者会比模型演变得更慢。与第二方面一致，我们观察到DR4+且DR3-亚群在组群2和3中在3个月(V6)和6个月(V8)时并且还在安慰剂组中呈现改善趋势(C肽的中位降低慢于模型，δ比率>0)，而HLA-DR4(-)亚群在Ib期临床试验的测试条件下具有相反的临床响应(图6)。有趣的是，在组群3(测试的最高剂量)中，HLA-DR4(+)和HLA-DR4(-)亚群的演变存在显著性差异。在其他组群或安慰剂组中没有达到这种显著性。

对于每日总胰岛素剂量/kg，随时间也观察到相同的亚组差异。该参数显示出在组群2和3中对于HLA-DR4+且DR3(-)患者亚群呈下降的趋势，这是对治疗的积极响应。另一方面，在Ib期临床试验的测试条件下，患者HLA-DR4(-)并没有呈现出这种积极的结果(图7)。对于该参数，在安慰剂组随时间的演变更加异质。SEQ ID NO 26的肽在DR3+和DR4+个体中的效力将在更大样本量和HLA型分层的更大研究中进一步探究。

Claims

1.用于预测1型糖尿病患者对用长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽进行的治疗的响应的体外方法，所述免疫原性肽包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列，

其中所述氧化还原酶基序包含基序：

Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，

其中m是0至2的整数，

其中C代表半胱氨酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表任何氨基酸，并且Z代表任何氨基酸，优选碱性氨基酸，

所述方法包括确定所述患者的MHC II类HLA单倍型，其中将被确定为HLA-DR4阳性(HLA-DR4+)的患者预测为对所述治疗具有响应性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述胰岛素胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列由氨基酸序列LALEGSLQK[SEQ ID NO:3]限定。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述响应性患者是纯合或杂合HLA型DR4阳性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中在所述患者中所述单倍型确定是使用基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、电泳分析或通过抗体测试进行的。

5.在患者中降低针对选自胰岛素(原)或C肽的自身免疫抗原的免疫应答的方法，其包括向所述患者施用长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽，所述免疫原性肽包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列，其中所述氧化还原酶基序包含基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，

其中m是0至2的整数，

其中所述患者是基于存在DR4阳性MHC II类HLA单倍型而选择的。

6.用于在基于存在DR4阳性MHC II类HLA单倍型而选择的患者中治疗或预防1型糖尿病的长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽，其包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列，

其中所述氧化还原酶基序包含基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，

其中m是0至2的整数，

7.治疗或预防1型糖尿病的方法，其包括向基于存在DR4阳性(HLA-DR4+)且任选地HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)的MHC II类HLA单倍型而选择的患者施用有效剂量的长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽，所述免疫原性肽包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列，

其中所述氧化还原酶基序包含基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，

其中m是0至2的整数，

8.根据权利要求5或7所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述胰岛素胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列由序列LALEGSLQK[SEQ ID NO:3]限定。

9.根据权利要求5、7或8所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述患者的MHC II类单倍型在治疗之前已确定或在治疗期间确定。

10.根据权利要求5或7至9所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述单倍型确定是使用基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、电泳分析或通过抗体测试进行的。

11.根据权利要求5或7至10中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中对于HLA型DR4+纯合的患者被认为最具有响应性和/或其中对于HLA型DR4+杂合的患者例如DR4+且DR3+的患者被认为中等具有响应性。

12.根据权利要求5或7至11中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中在所述患者中所述单倍型确定是使用基于聚合酶链反应(PCR)的分析、序列分析、电泳分析或通过抗体测试进行的。

13.根据权利要求5或7至12中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽以50至1500μg，优选100至1200μg的剂量方案施用。

14.根据权利要求5或7至13中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽以单剂量或者以2、3、4、5或更多个剂量同时或连续地施用。

15.根据权利要求5或7至14中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽根据以下方案中的任一个通过4次双周皮下或肌内注射来施用：

16.根据权利要求5或7至15中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述患者额外地为HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

17.根据权利要求5或7至16中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽作为包含所述肽和可药用载体的药物组合物施用。

18.根据权利要求5或7至17中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽作为包含所述肽和佐剂的药物组合物施用。

19.用于预测1型糖尿病患者对用针对呈递胰岛素表位之APC的溶细胞性CD4+T细胞群进行的治疗的响应的体外方法，所述溶细胞性CD4+T细胞群通过包括以下步骤的方法获得：

-提供外周血细胞；

-在体外使所述细胞与长度为12至50个氨基酸的免疫原性肽接触，所述免疫原性肽包含氧化还原酶基序和与该基序相隔0至7个氨基酸的胰岛素(原)MHC II类T细胞表位序列，

其中所述氧化还原酶基序包含基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，

其中m是0至2的整数，

其中C代表半胱氨酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表任何氨基酸，并且Z代表任何氨基酸，优选碱性氨基酸；以及

-在存在IL-2的情况下扩增所述细胞；

所述预测方法包括确定所述患者的MHC II类HLA单倍型的步骤，其中将HLA-DR4阳性(HLA-DR4+)的患者预测为对所述治疗具有响应性。

20.根据权利要求19所述的方法，其中所述患者额外地为HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

21.在患者中降低针对选自胰岛素(原)或C肽的自身免疫抗原的免疫应答的方法，其包括向所述患者施用针对呈递胰岛素表位之APC的溶细胞CD4+T细胞群，所述CD4+T细胞群通过包括以下步骤的方法获得：

-提供外周血细胞；

其中所述氧化还原酶基序包含基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，

其中m是0至2的整数，

-在存在IL-2的情况下扩增所述细胞，其中所述患者是基于存在DR4阳性MHC II类HLA单倍型而选择的。

22.根据权利要求21所述的方法，其中已被选择的所述患者额外地为HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

23.用于在基于存在DR4阳性MHC II类HLA单倍型而选择的患者中治疗或预防1型糖尿病的针对呈递胰岛素表位之APC的溶细胞性CD4+T细胞群，其通过以下用于产生针对呈递胰岛素表位之APC的溶细胞性CD4+T细胞群的体外方法获得，所述方法包括步骤：

-提供外周血细胞；

其中所述氧化还原酶基序包含基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至6的整数，

其中m是0至2的整数，

-在存在IL-2的情况下扩增所述细胞。

24.根据权利要求23所述应用的细胞群，其中所述患者额外地为HLA-DR3阴性(HLA-DR3-)。

25.根据权利要求5、7至18或21至24中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述氧化还原酶基序包含基序Zm[CST]XnC或ZmCXn[CST]，

其中n是0至3的整数，

其中m代表0至2的整数，

其中C代表半胱氨酸，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表任何氨基酸，并且Z代表碱性氨基酸。

26.根据权利要求5、7至18或21至25中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述氧化还原酶基序包含四肽序列Cxx[CST][SEQ ID NO:1]或[CST]xxC[SEQ ID NO:2]。

27.根据权利要求5、7至18或21至26中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述MHC II类T细胞胰岛素表位可由序列LALEGSLQK[SEQ ID NO：3]限定。

28.根据权利要求5、7至18或21至27中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽包含序列Cxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：4]或[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：5]。

29.根据权利要求5、7至18或21至28中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽包含序列CxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：6]。

30.根据权利要求5、7至18或21至29中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽包含序列HCxx[CST]SLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：7]或H[CST]xxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：8]。

31.根据权利要求5、7至18或21至30中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽包含序列HCxxCSLQPLALEGSLQK[SEQ ID NO：9]。

32.根据权利要求5、7至18或21至31中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽包含序列Cxx[CST][SEQ ID NO：1]或[CST]xxC[SEQ ID NO：2]氧化还原基序序列和序列SLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：20]。

33.根据权利要求5、7至18或21至32中任一项所述的方法或者根据权利要求6所述应用的免疫原性肽，其中所述肽包含氨基酸序列HCPYCSLQPLALEGSLQKRG[SEQ ID NO：26]或由其组成。