JP6899863B2 - 多発性硬化症および関連障害を治療するための方法および組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2012年10月11日に出願された米国特許仮出願第61/712,733号および2013年3月14日に出願された米国特許出願第13/830,521号に対して、米国特許法第119条(e)の下で恩典および優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、全体が参照により本開示に組み入れられる。
本開示は、免疫療法および医学に関連した組成物および方法に指向している。特に、本開示は、多発性硬化症および関連障害の治療のための治療学に関する。
多発性硬化症(MS)は、潜在的に衰弱性の疾患であり、身体の免疫系がヒトの神経を覆っている保護鞘をむしばむ。これは、脳と身体の他の部分との間の伝達を妨げる。最終的には、これは、可逆的でないプロセスである神経自体の衰えを結果としてもたらす可能性がある。
当技術分野における必要性に応じて、本明細書において、多発性硬化症または多発性硬化症関連障害を治療または予防するための治療方法および治療用組成物が記載される。本開示の一局面は、多発性硬化症または多発性硬化症関連障害を有する対象において抗病原性自己反応性T細胞の集団を増殖および/または発生させるための方法であって、抗原が多発性硬化症関連抗原である抗原-MHC-ナノ粒子複合体を該対象に投与する工程を含むか、該工程から本質的になるか、または該工程からなる、方法に関する。
[本発明1001]
多発性硬化症または多発性硬化症関連障害を有する対象において、抗病原性自己反応性T細胞の集団を増殖および/または発生させるのに使用するための、ナノ粒子、MHCタンパク質および多発性硬化症関連抗原を含む複合体であって、該ナノ粒子が、直径約1 nm〜約100 nm;直径約1 nm〜約50 nm、または直径約1 nm〜約20 nm、または約5 nm〜約20 nmの群から選択される直径を有し、かつ、抗原-MHC複合体 対 ナノ粒子の数の比が、約10:1〜約1000:1である、複合体。
[本発明1002]
約0.005個のpMHC/100 nm2〜約25個のpMHC/100 nm2のMHC密度を有する、本発明1001の複合体。
[本発明1003]
抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質であるNOGO A、糖タンパク質Po、末梢ミエリンタンパク質22、および2'3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)の群から選択されるタンパク質に由来する抗原であるか、あるいは、SEQ ID NO: 1もしくは4〜17の配列を含むペプチドに対して少なくとも80%の同一性を有するペプチド、またはSEQ ID NO: 1もしくは4〜17の配列をコードするポリヌクレオチドもしくはそれらの各々の相補体に対して中程度から高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド(高いストリンジェンシーの条件が、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1×SSC〜約0.1×SSCのバッファー濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1×SSC、0.1×SSC、または脱イオン水の洗浄液を含む)によりコードされるポリペプチド、またはSEQ ID NO: 1の配列に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するものに対応する抗原である、本発明1001または1002の複合体。
[本発明1004]
ナノ粒子がリポソームではない、本発明1001または1002の複合体。
[本発明1005]
抗原-MHC複合体が、ナノ粒子に共有結合または非共有結合で連結されている、本発明1001または1002の複合体。
[本発明1006]
抗原-MHC複合体が、5 kD未満のサイズのリンカーを介してナノ粒子に共有結合で連結されている、本発明1001または1002の複合体。
[本発明1007]
ナノ粒子が、生体吸収性および/または生分解性である、本発明1001または1002の複合体。
[本発明1008]
抗原-MHC-ナノ粒子複合体のMHCが、MHCクラスIまたはIIである、本発明1001または1002の複合体。
[本発明1009]
抗原-MHC複合体 対 ナノ粒子の数の比が、約10:1〜約1000:1である、本発明1001または1002の複合体。
[本発明1010]
リンカーがポリエチレングリコールを含む、本発明1005の複合体。
[本発明1011]
SEQ ID NO: 1もしくは2のアミノ酸配列を含む単離および精製されたポリペプチド、あるいは、SEQ ID NO: 1もしくは2に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するポリペプチド、あるいは、SEQ ID NO: 1もしくは2をコードするかSEQ ID NO: 1もしくは2に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するものをコードするポリヌクレオチド、またはそれらの各ポリヌクレオチドの相補体に対して中程度から高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、
中程度のハイブリダイゼーション条件が、約40℃〜約50℃のインキュベーション温度;約9×SSC〜約2×SSCのバッファー濃度;約30%〜約50%のホルムアミド濃度;および約5×SSC〜約2×SSCの洗浄液を含み;
高いストリンジェンシーの条件が、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1×SSC〜約0.1×SSCのバッファー濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1×SSC、0.1×SSC、または脱イオン水の洗浄液を含む、
ポリペプチド。
[本発明1012]
本発明1011のポリペプチドもしくは等価物をコードする単離および精製されたポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチド、その等価物、もしくはその相補体に対して中程度または高いストリンジェントの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
[本発明1013]
SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含む、本発明1011の単離されたポリペプチド、MHCタンパク質および多発性硬化症関連抗原を含む、複合体。
[本発明1014]
ナノ粒子、MHCタンパク質および多発性硬化症関連抗原を含む複合体であって、該ナノ粒子が、直径約1 nm〜約100 nm;直径約1 nm〜約50 nm、または直径約1 nm〜約20 nm、または約5 nm〜約20 nmの群から選択される直径を有し、かつ、抗原-MHC複合体 対 ナノ粒子の数の比が、約10:1〜約1000:1である、複合体。
[本発明1015]
約0.005個のpMHC/100 nm2〜約25個のpMHC/100 nm2のMHC密度を有する、本発明1013または1014の複合体。
[本発明1016]
抗原が、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質であるNOGO A、糖タンパク質Po、末梢ミエリンタンパク質22、および2'3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼ、およびミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)の群から選択されるタンパク質に由来する抗原であるか、あるいは、SEQ ID NO: 1もしくは4〜17、SEQ ID NO: 1もしくは4〜17の配列を含むペプチドに対して少なくとも80%の同一性を有するペプチド、またはSEQ ID NO: 1もしくは4〜17の配列をコードするポリヌクレオチドもしくはそれらの各々の相補体に対して中程度から高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド(高いストリンジェンシーの条件が、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1×SSC〜約0.1×SSCのバッファー濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1×SSC、0.1×SSC、または脱イオン水の洗浄液を含む)によりコードされるポリペプチド、またはSEQ ID NO: 1もしくは4〜17の配列に対して少なくとも約80%の配列同一性を有するものに対応する抗原である、本発明1013の複合体。
[本発明1017]
ナノ粒子がリポソームではない、本発明1013または1016の複合体。
[本発明1018]
抗原-MHC複合体が、ナノ粒子に共有結合または非共有結合で連結されている、本発明1013または1016の複合体。
[本発明1019]
抗原-MHC複合体が、5 kD未満のサイズのリンカーを介してナノ粒子に共有結合で連結されている、本発明1013または1016の複合体。
[本発明1020]
ナノ粒子が、生体吸収性および/または生分解性である、本発明1013または1016の複合体。
[本発明1021]
抗原-MHC-ナノ粒子複合体のMHCが、MHCクラスIまたはIIである、本発明1013または1016の複合体。
[本発明1022]
抗原-MHC複合体 対 ナノ粒子の数の比が、約10:1〜約1000:1である、本発明1013または1016の複合体。
[本発明1023]
リンカーがポリエチレングリコールを含む、本発明1019の複合体。
[本発明1024]
本発明1013または1016の複合体の治療的有効量および担体を含む、組成物。
[本発明1025]
本発明1011のポリペプチドの有効量および担体を含む、組成物。
[本発明1026]
本発明1025のポリヌクレオチドの有効量および担体を含む、組成物。
[本発明1027]
抗原-MHC複合体をナノ粒子上にコーティングまたは複合体化する工程を含む、本発明1001または1013の複合体を作製、調製、または取得するための方法。
[本発明1028]
多発性硬化症または多発性硬化症関連障害を有する対象において抗病原性自己反応性T細胞の集団を増殖および/または発生させるための方法であって、本発明1001または1013の抗原-MHC-ナノ粒子複合体の有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1029]
それを必要とする対象において多発性硬化症または多発性硬化症関連障害を治療するための方法であって、本発明1001または1013の抗原-MHC-ナノ粒子複合体の有効量を該対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1030]
多発性硬化症関連障害が、視神経脊髄炎(NMO)、ブドウ膜炎、および神経障害性疼痛からなる群より選択される、本発明1028または1029の方法。
[本発明1031]
本発明1001または1013の複合体、および使用説明書を含む、キット。
(図2)pMHCクラスII-NP療法(pMOG38-49/I-AbコーティングNP)で処置した慢性EAEを有するマウスは、未処置EAEマウスと比較して体重が増加したことを示す。
(図3)EAEを有する処置マウスおよび未処置マウスの写真である。処置マウス(NAVACIM)は、未処置マウスよりも健康に見える。
(図4)EAEに罹患したC57BL/6マウスにおける、pMOG38-49/IAbコーティングNPによる同起源自己調節性CD4+ T細胞の全身性増殖を示す。このモデルにおける増殖の規模は、1型糖尿病に関連したpMHCクラスIIコーティングNPで処置したNODマウスにおいて見られるものに匹敵している(例えば、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,354,110号を参照されたい)。
(図5)未処置マウスの脊髄を示す。未処置マウスは、有意な脱髄および白質の高密度の単核細胞浸潤物を示した。
(図6)pMOG38-49/IAb-NPで処置したマウスの脊髄を示す。pMHC-NP処置マウスは、有意により少ない脱髄および単核細胞浸潤物を有していた。
(図7)2匹の未処置EAEマウスの脊髄辺縁についての代表的な例を示す。
(図8)pMOG38-49/IAb-NPで処置した2匹のEAEマウスの脊髄辺縁についての代表的な例を示す。pMHC-NP処置マウスは、有意により少ない脱髄およびより低い単核細胞浸潤を有している。
(図9−1)pMOG36-55-I-Aβ(b)-C-Jun構築物のタンパク質配列(SEQ ID NO: 2)およびDNA配列(SEQ ID NO: 3)を示す(それぞれ、記載順にSEQ ID NO: 2〜3)。融合タンパク質中の個々の成分の配列は、HAリーダー(下線)、続いて
(二重下線)、
(点線の下線)、および
(網掛け)の配列である。GSリンカーは強調表示されていない。
(図9−2)図9−1の続きを示す図である。
(図9−3)図9−2の続きを示す図である。
(図10)抗原含有ベクターのDNAマップである。HAリーダー-I-Aα(b)-C-Fos-BirA-His×6融合タンパク質(284 a.a)(SEQ ID NO: 18として記載される"His×6")をコードするDNA構築物部位を、pMT/V5ハエ細胞発現ベクター中のNco I(854)とXba I(1711)との間にクローニングした。融合タンパク質は、I-Aα(d)(195 a.a.)、これに続くGSリンカー(6 a.a.)を介したC-Fos、その後のBirA配列および6×His(SEQ ID NO: 18)を含む。
(図11)高密度(約5×1013個/ml)に濃縮されかつ単分散されたpMHCコーティング金NP(約14 nm)の代表的なTEM画像を示す。倍率:50,000倍。
(図12)pMHCコーティングNPのアゴニスト特性に及ぼすpMHC(GNP)用量およびpMHC結合価の影響を示す。この図は、2つの異なるpMHC-NP試料(両方とも約2×1013個/mlの直径14nmのNPからなる)に応答して同起源8.3-CD8+ T細胞により分泌されたIFNγの量を比較している。Au-022410およびAu-21910は、それぞれ、NP1個あたり約250個および約120個のpMHCを保持していた。Au-011810-Cは、NP1個あたり約120個の対照pMHCを保持していた。
(図13)pMHC結合価の関数としての8.3-CD8+ T細胞によるIFNγのpMHC-NP誘導性分泌を示す。8.3-CD8+ T細胞(2.5×105個/ml)は、3つの異なるIGRP206-214/Kd結合価でコーティングされたNPの数を増加させながら培養した。IGRP206-214は、抗原ペプチドVYLKTNVFL(SEQ ID NO: 19)を含む。
(図14)pMHC-NPのより低いアゴニスト活性がpMHC-NP密度を増加させることによって、ただしpMHC結合価の閾値を上回って補償され得ることを示す。グラフは、広範なNP密度にわたって3つの異なるpMHC-NP調製物(pMHCの3つの異なる結合価数を保持している)のアゴニスト活性を比較するものである。NP1個あたり11個および54個のpMHCを保持するNPと比較した場合、8個のpMHCを保持するNPは、11個のpMHCを保持するものとは異なって、高いpMHC-NP密度でさえも、IFNγ分泌を十分に引き起こすことができないことに留意されたい。
(図15)全pMHC投入量の関数としてのpMHC-NPのアゴニスト活性に及ぼすpMHC結合価閾値の影響を示す。
(図16)より大きな酸化鉄NPコアを用いて作製したpMHC-NPのアゴニスト活性に及ぼすpMHC結合価の影響を示す。
(図17)アゴニスト活性に及ぼすサイズの影響を示す。Au-0224-15は、比較的低いpMHC結合価でコーティングしたが高密度に調製した14nmのGNPであった。Au-0323-40は、高pMHC結合価であるが低密度にコーティングした40nmのGNPであった。Au-0224-15はAu-0323-40試料よりも優れたアゴニスト活性を有していた。
(図18)pMHC-GNPの機能に対する保護PEGの効果を示す。Au-021910は、2kD チオール-PEGで保護されかつ約120個pMHC/GNPでコーティングされた、約2×1013個/mlの直径14nmのGNPからなっていた。Au-012810 GNP(同様に約2×1013個/mlの14nm GNP)は、5kD チオール-PEGで保護され、約175個pMHC/GNPでコーティングされた。試料Au-021910は優れたアゴニスト活性を有していた。
(図19)NRP-V7/Kdコーティング金NPによるNRP-V7反応性CD8+ T細胞の効率的な増殖を示す。25μgのpMHCを保持する3×1012個のNP(サイズ約10nm)(150個pMHC/NP)を使用した。前糖尿病性の10週齢NODマウスをNRP-V7/kdコーティング金NPの週2回の注射で5週間処置した。TUM/Kd四量体は陰性対照である。パネルの各列は異なるマウスに対応する。
(図20)pMHCコーティングNPで処理したマウスにおける同起源CD8+ T細胞の大量増殖を示す。25μgのpMHCを保持する3×1012個のIGRP206-214/Kd-NP(サイズ約10nm)(150個pMHC/NP)を使用した。上のパネル:4回投与後に屠殺したマウスのプロファイル。下のパネル:10回注射後の2匹の異なるマウスのプロファイル(血液のみ)。
(図21)pMHCクラスI-Np複合体についての原理と同じ原理が、pMHCクラスIIコーティングNpに当てはまることを示す(図18を参照されたい)。NPあたり17個のpMHCでコーティングされたpMHCクラスII pMHC-Np(BDC2.5miコーティングの6〜8nmナノ粒子の粒子(SFPZ))は、53個のpMHCでコーティングされたPFM(20〜25nm)粒子よりも高いアゴニスト活性を有することに留意されたい。これは、pMHC-NPが誘導するCD4+ T細胞によるIFNγの分泌がpMHC密度の関数として増大することにより示されるように、クラスI-pMHC NpおよびクラスII-pMHC-Npの両方について問題になるのは、pMHCの絶対結合価ではなく、むしろpMHC密度であることを裏付けるものである。
本発明は、記載された特定の態様に限定されず、そのため、当然変化し得るものであることを理解されるべきである。さらに、本明細書中で用いる用語は、特定の態様のみを説明する目的のためであり、限定することを意図したものではないことを理解すべきである。なぜなら、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるからである。
他に定義されない限り、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書中で用いる場合、以下の用語は以下の意味を有する。
本開示は、MSに関連した抗原-MHC複合体に結合されたナノ粒子が、MSまたは脳脊髄炎(EAE)の症状を軽減するという発見に基づく(実施例1)。
本明細書に記載される方法は、(1)抗病原性(もしくは抗MS)自己反応性T細胞の集団を増殖および/もしくは発生させる目的で;ならびに/または(2)多発性硬化症もしくは多発性硬化症関連障害を有する患者において、または多発性硬化症もしくは多発性硬化症関連障害にかかりやすい患者において、一局面では全身性免疫を損なうことなく、多発性硬化症または多発性硬化症関連障害を治療または予防する目的で、細胞、組織、または対象への抗原-MHC-ナノ粒子複合体の有効量の投与を含むか、またはその代わり該投与から本質的になるか、または該投与からなる。複合体中で使用される抗原は、多発性硬化症関連抗原である。療法を判定しかつモニターする方法は、当技術分野で公知であり、本明細書に簡単に記載される。インビトロで送達される場合、投与は、任意の適切な方法によって、例えば細胞または組織培養培地への投与によって、組成物を組織または細胞と接触させることにより行われ、かつ該投与は、療法が個体に適切であるかどうかを判定するためのスクリーニングとして、または、代用として使用されるもしくは開示された組成物と組み合わせて使用される代替療法を選抜するためのスクリーニングとして有用である。インビボで投与される場合、投与は、全身投与または局所投与によるものである。インビボでは、ヒトへの投与に先立って、代用として使用されるまたは開示された組成物と組み合わせて使用される代替療法を選抜するために、非ヒト動物に対して方法を実施することができる。ヒトまたは非ヒト哺乳動物において、それらはまた、当該疾患または障害を治療するために有用である。
もしくはSEQ ID NO: 1の等価物を含むか、またはその代わり該ポリペプチドもしくは該等価物から本質的になるか、または該ポリペプチドもしくは該等価物からなる。本発明において使用され得る追加の抗原は、
の群のポリペプチドを含むか、もしくはその代わり該ポリペプチドから本質的になるか、もしくは該ポリペプチドからなるポリペプチド、またはそれらの各々の等価物、またはそれらの組み合わせを含む。
特定の局面は、全身性免疫を損なうことなくMSを特異的に治療する、MS抗原特異的な医薬を作製するための方法に関する。実施例2には、抗原-MHC-ナノ粒子複合体の作製が記載される。本発明において有用な抗原-MHC-ナノ粒子複合体は、MSに関連した抗原を含む。
さらなる局面は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を含むか、もしくは該アミノ酸配列から本質的になるか、もしくは該アミノ酸配列からなる、単離もしくは精製されたポリペプチド、または、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも約80%の配列同一性、もしくはその代わり少なくとも85%、もしくはその代わり少なくとも90%、もしくはその代わり少なくとも95%、もしくはその代わり少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチド、または、SEQ ID NO: 1をコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して約80%の配列同一性、もしくはその代わり少なくとも85%、もしくはその代わり少なくとも90%、もしくはその代わり少なくとも95%、もしくはその代わり少なくとも98%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、または、SEQ ID NO: 1をコードするポリヌクレオチドもしくはその相補体に対して中程度から高いストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに関する。また、SEQ ID NO: 1に対応するポリペプチド、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する、もしくはその代わりSEQ ID NO: 1に対して少なくとも85%、もしくはその代わり少なくとも90%、もしくはその代わり少なくとも95%、もしくはその代わり少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチドまたは等価物をコードする単離および精製されたポリヌクレオチド、または、該ポリヌクレオチド、その等価物もしくはその相補体に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドによりコードされる単離または精製されたポリペプチドが提供される。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それらが天然では会合しない非天然の物質と、例えば、担体、薬学的に許容される担体、ベクター、およびMHC分子と、当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載されるナノ粒子と、組み合わせることができる。
細胞内抗原および細胞外抗原は、認識の観点と適切な応答の観点の両面から、免疫系に対してまったく異なるチャレンジを示す。T細胞への抗原の提示は、異なる抗原プロセシング経路を用いる、2つの別個のクラスの分子MHCクラスI(MHC-I)とMHCクラスII(MHC-II)(本明細書においては「pMHC」としても同定されている)によって媒介される。細胞内抗原に由来するペプチドは、ほぼすべての細胞に発現されているMHCクラスI分子によってCD8+ T細胞に提示されるのに対し、細胞外抗原に由来するペプチドは、MHC-II分子によってCD4+ T細胞に提示される。しかしながら、この二分法には一定の例外がある。いくつかの研究は、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれた粒状または可溶性タンパク質から生成されたペプチドが、マクロファージのみならず樹状細胞でもMHC-I分子上に提示されることを示した。本発明の特定の態様では、特定の抗原は、同定されて、適切なMHCクラスIまたはIIポリペプチドの下で抗原-MHC-ナノ粒子複合体で提示される。特定の局面では、特定の患者および特定のペプチドセットのためにどのMHCポリペプチドが使用されるべきかを判定するために、対象の遺伝子構造が評価され得る。特定の態様では、MHCクラス1成分は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、またはCD-1分子の全部または一部を含む。MHC成分がMHCクラスII成分である態様では、MHCクラスII成分は、HLA-DR、HLA-DQ、またはHLA-DPの全部または一部を含むことができる。
本発明の特定の局面は、抗原組成物に関しての方法および組成物を包含し、該抗原組成物には、一般に抗原と呼ばれる、ポリペプチド、ペプチド、核酸、糖質、脂質、および抗原応答を惹起または誘導する他の分子のセグメント、断片またはエピトープが含まれる。特に、自己免疫応答を介して細胞の破壊に導く、抗原決定基の抗原セグメントまたは抗原断片を同定して、本明細書に記載の抗原-MHC-ナノ粒子複合体を作製するのに使用することができる。本発明の態様は、体の細胞または組織において免疫応答を調節するための組成物および方法を包含する。
特定の局面において、抗原/MHC複合体は基材に機能的に結合され、これは、共有結合によりまたは共有結合によらずに、該基材に結合され得る。基材は、生体適合性および/または生体吸収性の材料を任意で含むナノ粒子の形態であり得る。したがって、一態様では、ナノ粒子は生体適合性および/または生体吸収性である。基材はまた、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2009/0155292号に以前に記載されたようなナノ粒子の形態をとることもでき、一局面では、これはリポソームではない。ナノ粒子はさまざまな寸法の構造をしていてよく、ナノスフェア、ナノ粒子、または生体適合性で生分解性のナノスフェアもしくは生体適合性で生分解性のナノ粒子として種々に知られている。そのような抗原/MHC複合体を含む粒子状製剤は、ナノ粒子への該複合体の共有結合または非共有結合によって形成することができる。
基材またはナノスフェアを抗原-MHC複合体に結合させるために、以下の手法を適用することができる。
本発明では、本発明のさまざまな態様で使用するためのポリペプチド、ペプチド、およびタンパク質が記載される。例えば、特定のペプチドおよびそれらの複合体は、免疫応答を誘発または調節するそれらの能力についてアッセイされる。特定の態様では、本発明のペプチドまたはタンパク質の全部もしくは一部はまた、従来の技術に従って、溶液中でまたは固相支持体上で合成することが可能である。種々の自動合成装置が市販されており、公知のプロトコールに従って使用することができる。例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられる、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. Ed., Pierce Chemical Co.l, (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232(4748):341-347, (1986); およびBarany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meinhofer (Eds.), Academic Press, NY, 1-284, (1979)を参照されたい。あるいは、組換えDNA技術を用いることができ、この方法では、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクションされ、かつ発現に適する条件下で培養される。
本発明は、例えばSEQ ID NO:1または2などの本発明のタンパク質、ポリペプチド、ペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含むことができる。
本明細書において、疾患の治療のために有用である薬学的組成物を提供する。
抗原-MHCナノ粒子複合体を単独で、または担体、例えば、組成物中の薬学的に許容される担体と組み合わせて、投与することができる。本発明の組成物は通常、例えば、静脈、皮下、または筋肉内に、注射によって非経口的に投与されることができる。他の投与様式に適する追加の製剤としては、経口製剤が挙げられる。経口製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常用いられる賦形剤を含む。こうした組成物は、液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または粉剤の形をとり、約10%〜約95%の活性成分、好ましくは約25%〜約70%を含有する。対象の免疫状態を調整する抗原-MHC-ナノ粒子複合体を含有する水性組成物の調製は、本開示を踏まえて、当業者には公知である。特定の態様では、組成物は吸入されることが可能である(例えば、米国特許第6,651,655号参照;その全体が参照により本明細書に組み入れられる)。一態様では、抗原-MHC-ナノ粒子複合体を全身投与する。
本発明の組成物および関連する方法、特に、抗原-MHC-ナノ粒子複合体の投与はまた、従来の治療の投与と組み合わせて使用することができる。これらには、Avonex(インターフェロンβ-1a)、Betaseron(インターフェロンβ-1b)、Copaxone(グラチラマー酢酸塩)、Novantrone(ミトキサントロン)、Rebif(インターフェロンβ-1a)、Tysabri(ナタリズマブ)、Gilenya(フィンゴリモド)、グラチラマー、ステロイド、シトキサン、イムラン、バクロフェン、脳深部刺激療法、Ampyra(ダルファムプリジン)、刺鍼術、および理学療法が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書中で用いるインビトロ投与という用語とは、対象から取り出された細胞、または培養下の細胞を含むがこれに限定されない、対象の外部に取り出された細胞に対して実施される操作を指す。エクスビボ投与という用語とは、インビトロで操作されて、その後対象に投与される細胞を指す。インビボ投与という用語には、投与を含めて、対象の内部に実施されたすべての操作が含まれる。
以下の実施例は、本発明のさまざまな態様を説明する目的で提供され、どのような形であっても本発明を限定するものではない。当業者であれば、本発明は、その目的を成し遂げて、記載した結果および効果を得るだけでなく、本発明に固有の目的、結果および効果を得るのによく適合していることが容易に理解されよう。本明細書に記載の方法とともに本実施例は、ここで態様を代表しており、例示的であり、本発明の範囲への限定を目的としたものではない。特許請求の範囲によって定義される本発明の精神の範囲内に包含されるそれらの変更および他の使用が、当業者には想起されると考えられる。
慢性EAE自己免疫疾患モデルにおけるpMHCクラスII-NP
本実施例は、EAEマウスモデルにおいてEAEを治療するための、MS関連抗原-MHC複合体でコーティングされたナノ粒子の使用を記載する。この新規の治療アプローチは、単一のMSに関連したペプチドMHC複合体(pMHC)(すなわち疾患1種類あたり1種類のpMHC複合体)でコーティングされたナノ粒子の全身送達のために使用することができる。この発見は、これらの障害の治療において長く求められている目標である、全身性免疫を損なうことなく自己免疫を鈍らせることができる疾患特異的な「ナノワクチン」の合理的な設計を可能にする。図1は、単一特異性のMSに関連したpMHCクラスIIコーティングナノワクチンが、両方のC57BL/6マウスにおいて確立された実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)を回復できることを示す。このアプローチはまた、MS患者において自己反応性CD4+ T細胞により標的とされることが公知であるヒトpMHC複合体にも適用可能である。これらの前臨床モデルにおける臨床的有効性の実証が、ヒトにおける臨床試験、および潜在的にはMSの治療法の開発のための道を開くであろう。
抗原-MHC-ナノ粒子複合体の作製のための方法
所望のサイズの無機ナノ粒子(酸化鉄=IONP;金=GNP)。IONPは熱分解によって作製される。そのように合成されたIONPは、生体適合性であり、タンパク質結合のためにPEG化することができる。IONP上にpMHCおよび/または他のタンパク質をコーティングするには、界面活性剤をコーティングしたNPを、適切な長さの官能化PEGリンカーと反応させる。リンカーは、HPLCで精製して、化学的同一性、純度、分子量、および多分散性を確認するために、1H-NMR、MALDI/GPC、およびGPCによって特徴決定する。同様のリンカーおよびアプローチを用いてGNPをコーティングすることができるが、ただし、該リンカーはそのNP結合端にチオール(SH)基を有するものである。
pMHCコーティングされたナノ粒子のサイズ、密度、および曝露
I. 金ベースのpMHCでコーティングされたNPの合成および特徴決定
特定のサイズの金ナノ粒子(GNP)を合成した。GNP調製物のサイズ、密度、表面電荷および単分散性は、分光光度計、透過型電子顕微鏡(TEM)、および動的光散乱を用いて測定する。次にGNP試料を濃縮し、以下で説明するように異なるアプローチを用いて単一特異性pMHC複合体と結合させる。本出願人らは、GNP1個あたりのpMHC結合価を定量するための方法、および単分散性を損なうことなく高い密度(約1014個/ml)で異なるサイズのpMHCコーティングGNP調製物を濃縮するための方法を開発した(図11)。
pMHC複合体は、2つの異なるアプローチを用いてさまざまなサイズのGNPにコーティングした:(i)静電相互作用によるGNP表面へのpMHCのランダム結合;および(ii)チオール-PEG-NH2リンカーを介する方向性結合(この場合は、GNP安定剤として追加のチオール-PEGリンカーを用いて凝集を防止した)。第1のアプローチは、(GNP1個あたりのpMHCの)非常に高いリガンド密度を可能にするが、pMHC結合の方向性を損なうと考えられた(すなわち、分子のほんの一部だけが、同起源Tリンパ球による認識に利用可能であるようになる可能性がある)。第2のアプローチは、より低い密度のpMHCを保持するがそのC末端を介して指向的に結合された、pMHCコーティングGNPを生成することを目的としていた。両方のアプローチは、14〜40nmの範囲のさまざまな直径のGNPで試験された。両アプローチとも、GNPのpMHC結合能は、サイズの関数、より具体的には表面積の関数であることが確認された(より大きなNP上にはより多くのpMHC数)。驚くべきことに、PEGが介在する結合は、結合の方向性を保証するだけでなく、(当初の予想に反して)個々のGNPの結合能を向上させることが見出された。以下の表1は、そのデータをまとめたものである。
インビトロでpMHCコーティングGNPの機能(アゴニスト)活性に対する、pMHC結合価、GNPサイズ、GNP密度、およびコーティング戦略の影響を試験した。T細胞受容体(TCR)トランスジェニックNODマウス(または8.3-NODマウス)に由来する同起源(IGRP206-214特異的)ナイーブCD8+ T細胞(本明細書では「8.3-CD8+ T細胞」と呼ばれる)を活性化する各種IGRP206-214-Kd-GNP調製物の能力を比較した。第1セットの実験は、培養物中の広範なGNP密度にわたってIGRP206-214-Kd(pMHC)結合価の影響を比較することを目的とした。対照(非同起源)pMHC複合体(Tum-Kd)と結合したGNPを陰性対照として使用した。予想通りに、IGRP206-214-KdコーティングされたGNPは(IFNγ産生により測定した場合)これらのT細胞を活性化し、それらはGNP用量(それゆえにpMHC用量)に依存した様式でそのように活性化した(しかし、TUM-KdコーティングされたGNPはそうでなかった)。図12は、リンカー法を用いてGNP1個あたり異なる数のpMHC分子でコーティングされた約14nmのGNPを使用する実験を示している。図12では、2つの異なるpMHC-GNP試料(両方とも約2×1013個/mlの直径14nmのGNPからなる)に応答して同起源8.3-CD8+ T細胞により分泌されたIFNγの量を比較している。Au-022410およびAu-21910は、それぞれ、約250および約120個pMHC/GNPを保持していた。Au-011810-Cは、約120個対照pMHC/GNPを保持していた。約2倍多い数のpMHC複合体/GNPでコーティングされたGNPは優れたアゴニスト活性を有していた。かくして、pMHCコーティングGNPのアゴニスト活性は、全pMHC(GNP)含有量の関数である。これらの結果は反直感的な結果であった。というのは、最新の技術は、NP上の共刺激分子の非存在下で、各NP上のpMHCの数を増加させることは、同起源T細胞の増殖およびサイトカイン分泌よりもむしろ、結合活性を増加させて、消失(細胞死)を促進し得ることを示唆すると考えられるからである。このことは、低結合活性と高結合活性の両方のT細胞に当てはまると考えられる。例えば、本出願人らによる以前の研究(Han et al., (2005) Nature Medicine 11(6):645-652)などは、高結合活性で認識されるペプチド、または低結合活性で認識されるが高濃度を与えられたペプチドがインビボで同起源T細胞を消失させる能力を増大させていることを示した。したがって、抗原-MHCコーティングされたナノ粒子または可溶性ペプチドの静脈内への治療的送達の状況において、同起源T細胞は、ペプチド親和性および用量に依存した様式で消失するはずである。この予想は、図12に示したデータによって満たされなかった。
pMHC結合ナノ粒子(pMHC-NP)のアゴニスト活性に対するペプチド-MHC(pMHC)結合価の役割をさらに検討するために、インビトロで同起源(IGRP206-214/Kd特異的)CD8+ T細胞(本明細書では8.3-CD8+ T細胞と呼ばれる)によるIFNガンマ(IFNγ)の分泌を引き起こすための、IGRP206-214/Kd pMHC単量体の増加する数を共有結合させた直径8nmの酸化鉄(Fe3O4)NPの能力を比較した。表2に示すように、8.3-CD8+ T細胞は、NP1個あたり8個のpMHC単量体でコーティングされたNPの存在下で培養した場合、無視できる量のIFNγを産生したにすぎなかったが、より高いpMHC結合価でコーティングされたNPに応答して、たとえ11個pMHC単量体/NPほどの低い結合価でも、用量応答的に、実質的により多量のIFNγを産生した。
さらなる解析は、全pMHC含有量がインビトロでpMHC-NPのアゴニスト活性に影響を与える唯一の要因ではないこと、およびNPのサイズもまた重要な独立した役割を果たしていることを示した。これを検討するにあたって、異なるサイズ(それぞれ、直径14および40nm)および異なるpMHC結合価であるが、同様の全pMHC含有量の条件下にある、2つのpMHC-GNP試料のアゴニスト活性を比較した。図17に示した実験では、約200個pMHC分子/GNPを保持する14nm GNP、および約5,000個pMHC/GNPを保持する40nm GNPを使用した。これら2つの試料のGNP密度は、各試料の全pMHC含有量が約450μg/mlとなるように(それぞれ、3×1013および1012個のGNP/mLに)調整した。注目すべきことに、8.3-CD8+ T細胞は、広範な全pMHC含有量にわたって、40nmのものに対してよりも14nmのpMHC/GNP化合物に対して、前者が後者よりもはるかに多くのpMHC複合体で装飾されていたという事実にもかかわらず、かなり良好に応答した。このことは、GNP密度(より多くのGNP/同起源T細胞)が鍵となることを示唆した。つまり、4×の1000個pMHC/GNP(4000個pMHC)を保持する40nm NPは、40×の100個pMHC/GNP(4000個pMHC)を保持する10nm NPほど望ましくないと考えられる。したがって、総合すると、これらのデータは、最適なpMHC-GNP調製物は高いpMHC密度で使用される小さなGNPで構成されたものであることを示唆している。これらの小さいNP上のpMHC結合価数の増加は、それらの驚くべき予想外のアゴニスト特性をさらに増大させる。
上述したように、pMHCコーティングされたGNP試料は、(pMHCカルボキシ末端のアクセプターとしての)3.4kDのチオール-PEG-NH2リンカーを有するGNPを、GNP安定剤として機能するチオール-PEGリンカーで同時コーティングすることによって作製される。安定化用のチオール-PEGリンカーの長さがそのGNP抗凝集特性に影響を与えるかどうかを調べるために、pMHC分子を結合させるチオール-PEG-NH2リンカーの能力、ならびに/またはpMHCコーティングGNP、異なるサイズ(2kDおよび5kD、それぞれpMHC-アクセプターリンカーよりも短いサイズと長いサイズ)の安定化用リンカーを用いて調製したpMHCコーティングGNPのアゴニスト特性を比較した。両方のリンカーは同様の抗凝集特性を有すること、および5kDのリンカーはより短い3.4kDのチオール-PEG-NH2リンカーへのpMHCの結合を妨げなかったことが判明した。しかし、注目すべきことに、短い(2kD)チオール-PEGで保護されたpMHC-GNPは、長い(5kD)チオール-PEGで同時コーティングされたものよりもインビトロで優れたアゴニスト活性を有していた(図18)。このことは、保護用の長いチオール-PEGリンカーがアクセプターリンカーに結合されたpMHC分子を同起源T細胞への曝露から遮蔽することを示唆している。
NRP-V7/Kd(IGRP206-214-Kdとも呼ばれる)またはTUM/Kd(対照)のいずれかに結合された、平均径約10nmのナノ粒子を、本明細書に記載の方法に従って作製し、インビボで同起源自己調節性CD8+ T細胞の増殖を誘導するそれらの能力について試験した。図19は、抗原-MHC-GNPを10週齢の野生型NODマウスに週2回、5週間連続して静脈内注射した実験の結果を示す。治療に応答する循環中のおよび異なるリンパ系組織中の同起源T細胞集団のサイズの変化は、蛍光標識した抗原-MHC四量体を(同起源はもちろん関連のない対照四量体も)用いて細胞懸濁液を染色することによって評価した。以前に当技術分野で示されていたもの(例えば、1〜8個pMHCでコーティングされたナノ粒子が試験された、Tsai et al. (2010) Immunity 32(4):568-580を参照)よりも10〜100個少ないが、GNP1個あたり150個の抗原-MHCでコーティングされた、GNPの投与は、実質的により高い増殖をもたらした(図19)。それらは、結合価 約8のpMHCでコーティングされたナノ粒子により一般的に得られるレベル(血液中の1〜2%の細胞;例えば、Tsai et al., Immunity, 2010、図1C参照)よりも数倍高いレベル(すべての循環CD8+ T細胞の最大44%)にCD8+ T細胞をインビボで増殖させた。上記のデータは、高い抗原-MHC結合価でコーティングされた小さなナノ粒子が最大のT細胞増殖効果を提供することを示している。これらの結果は予想外であった。したがって、それは、治療効果に関与しているpMHC-NP-T細胞相互作用の全体的な結合活性ではなく、むしろpMHC-NP療法に応答して増殖するT細胞を生じさせる前駆体集団の結合活性である。この解釈は、本明細書に記載したデータと一致しており、NP上のpMHCの結合価数がpMHC-NPの治療効果を増大させるべきであることを暗示している。
より高いpMHC結合価でコーティングされたpMHC-GNPによる同起源CD8+T細胞の大規模増殖
次に、pMHC-NPがインビボで同起源T細胞の大量増殖を誘導する可能性があるかどうかを確認した。これは、25μgの全pMHC(NP1個あたり約150個のIGRP206-214/Kd分子)を保持する3×1012個の10〜14nm NPの数回の注射でマウスを処理することによって行った。図20に示したとおり、10回の注射(週2回で10週間)で処理されたマウスは、未処理の対応マウスに比べて、末梢血における同起源IGRP206-214(NRP-V7)反応性CD8+T細胞の大量増殖を示した(<0.4〜>17%または47%のCD8+T細胞)(下のパネル)。このような増殖は4回のpMHC-NP注射後に屠殺したマウスですでに見られた(上のパネル)。pMHC-NPで増殖された細胞は、同起源pMHC四量体を特異的に結合させたが、非同起源pMHC四量体を結合させなかった(それぞれNRP-V7/Kd対TUM/Kd)。
pMHC結合金ナノ粒子の調製
pMHCを結合させた金ナノ粒子(pMHC-GNP、12および30nm)の調製。GNPの調製。ボールフラスコ内のダブル蒸留(D.D.)水(200mL)をシリコンオイルバスで沸騰するまで加熱することによって、GNPを調製した。次に、1% HAuCl4の溶液(4mL)を沸騰水に加えた。その溶液を10分攪拌してから、1%クエン酸Na溶液を添加した。12nmのGNPの場合は、12mLのクエン酸Na溶液を添加した。30nmのGNPの場合は、12mLのクエン酸Na溶液を添加した。クエン酸Na溶液を添加した直後にワイン色が現れる。この反応を完了させるために、GNP溶液をさらに30分攪拌した。これは、Levy, R.ら("Rational and combinatorial design of peptide capping ligands for gold nanoparticles." J Am Chem Soc 126, 10076-84 (2004))に記載される方法を改良したものであり、この文献を参照により本明細書に組み入れる。
pMHC結合金ナノ粒子の調製
pMHCを結合させたGNP(pMHC-GNP、2〜10nm)の調製。GNP(2〜5nm)の調製。250mg(2nm GNPの場合)または50mg(4nm GNPの場合)のドデシルアミンを10mLのDDAB溶液(トルエン中の100mM臭化ジドデシルジメチルアンモニウム(DDAB))中に溶解することによって、2〜5nmのGNPを調製した。次に、100mgの水素化ホウ素テトラブチルアンモニウム(TBAB)を4mLのDDAB溶液中に溶解した。その後、ドデシルアミンとTBABの溶液を50mL三つ口フラスコ内で窒素下に攪拌しながら混合した。34mgのAuCl3を4.5mLのDDAB溶液に溶解し、TBABとドデシルアミンの混合溶液に速やかに注入した。溶液はすぐに真っ赤になり、これはGNPの形成を示す。この混合物を30分間連続して攪拌し、15mLのエタノールをその混合物に添加した。その後混合物を4,100×gで12分遠心分離してGNPを沈降させた。
SEQ ID NO: 1:pMOG38-49抗原:・ GWYRSPFSRVVH。
SEQ ID NO: 2:pMOG38-49抗原を含むベクターのタンパク質配列(図9)。
SEQ ID NO: 3:pMOG38-49抗原を含むベクターのDNA配列(図9)。
Claims (14)
- ナノ粒子コア、および該ナノ粒子コアに機能的に結合している複数の多発性硬化症関連抗原-MHC(pMHC)複合体を含む、多発性硬化症を治療するためのナノ粒子複合体であって、
該多発性硬化症関連抗原がSEQ ID NO:1の配列を含み、
該ナノ粒子コアが、15 nm〜100 nmの直径を有し、
pMHC複合体 対 ナノ粒子コアの数の比が、少なくとも10:1であり、
該ナノ粒子コア上のpMHC密度が0.03個のpMHC/100 nm2〜25個のpMHC/100 nm2を含み、かつ、
薬学的に許容される担体を用いて静脈内注射用に製剤化されている、
ナノ粒子複合体。 - ナノ粒子コアが、15 nm〜50 nmの直径を有する、請求項1に記載のナノ粒子複合体。
- ナノ粒子コアが、20 nm〜50 nmの直径を有する、請求項1に記載のナノ粒子複合体。
- ナノ粒子コアが、20 nm〜30 nmの直径を有する、請求項1に記載のナノ粒子複合体。
- ナノ粒子コアが、該ナノ粒子コアの外表面上に生分解性の層を有し、かつpMHC複合体が該ナノ粒子コアまたは該ナノ粒子コア上の該生分解性の層に機能的に結合している、請求項1〜4のいずれか一項に記載のナノ粒子複合体。
- 生分解性の層が、デキストラン、マンニトール、またはポリ(エチレングリコール)の1種または複数種を含む、請求項5に記載のナノ粒子複合体。
- ナノ粒子コアがリポソームではない、請求項1〜6のいずれか一項に記載のナノ粒子複合体。
- pMHC複合体が、ナノ粒子コアまたは生分解性の層に共有結合または非共有結合で連結されている、請求項1〜7のいずれか一項に記載のナノ粒子複合体。
- pMHC複合体が、5 kD未満のサイズのリンカーを介してナノ粒子コアまたは生分解性の層に共有結合で連結されている、請求項1〜8のいずれか一項に記載のナノ粒子複合体。
- リンカーがポリエチレングリコールを含む、請求項9に記載のナノ粒子複合体。
- ナノ粒子コアが、生体吸収性および/または生分解性である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のナノ粒子複合体。
- pMHC複合体のMHCが、MHCクラスIタンパク質またはMHCクラスIIタンパク質である、請求項1〜11のいずれか一項に記載のナノ粒子複合体。
- MHCクラスIタンパク質が、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、またはCD-1タンパク質の全部または一部を含む、請求項12に記載のナノ粒子複合体。
- MHCクラスIIタンパク質が、HLA-DR、HLA-DQ、またはHLA-DPタンパク質の全部または一部を含む、請求項12に記載のナノ粒子複合体。
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