ES2712688T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de la esclerosis múltiple y trastornos asociados - Google Patents

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Abstract

Un complejo de nanopartícula que comprende: un núcleo de nanopartícula; una serie de complejos de antígeno- MHC (pMHC) que comprenden una serie de proteínas del MHC y una serie de antígenos relacionados con la esclerosis múltiple; y en donde el complejo de nanopartícula tiene una densidad de antígeno-MHC desde 0,05 moléculas de pMHC/100 nm2 a 30 moléculas de pMHC/100 nm2 y en donde el núcleo de nanopartícula comprende opcionalmente un metal, un óxido metálico, un sulfuro metálico, un seleniuro metálico, un material magnético, un polímero, hierro, óxido de hierro u oro, y en donde el núcleo de nanopartícula está opcionalmente recubierto con dextrano, manitol y polietilenglicol.

Description

DESCRIPCION
Metodos y composiciones para el tratamiento de la esclerosis multiple y trastornos asociados
Referencia cruzada con solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de conformidad con 35 U.S.C. § 119 (e) del documento de Solicitud Provisional de EE.UU. n° 61/712.733, presentado el 11 de octubre de 2012 y del n° de serie de EE.UU. 13/830.521, presentado el 14 de marzo de 2013.
Campo de la descripcion
Esta descripcion se dirige a composiciones y a metodos relacionados con la inmunoterapia y la medicina. En particular, esta descripcion esta relacionada con agentes terapeuticos para el tratamiento de la esclerosis multiple y trastornos relacionados.
Antecedentes
La esclerosis multiple (EM) es una enfermedad potencialmente debilitante en la que el sistema inmune del cuerpo destruye la vaina protectora que cubre nuestros nervios. Esto interfiere con la comunicacion entre el cerebro y el resto del cuerpo. En ultima instancia, esto puede dar lugar a un deterioro de los propios nervios, un proceso que no es reversible.
Las estadfsticas muestran que aproximadamente a 250.000 a 350.000 personas en los Estados Unidos se les ha diagnosticado esa enfermedad. Los smtomas vanan ampliamente, dependiendo de la cantidad de dano y de que nervios estan afectados. Las personas con casos graves de esclerosis multiple pueden perder la capacidad de caminar o de hablar. Los smtomas de la EM incluyen un entumecimiento en los brazos o las piernas, dolor, perdida de vision, debilidad muscular o temblores, paralisis, vertigo, fatiga, dificultad para hablar, disfuncion de la vejiga, depresion, perdida de la audicion y picazon.
No existe una cura para la EM, pero se han encontrado ciertos medicamentos para aliviar los ataques de EM y posiblemente retardar la enfermedad. Los tratamientos intentan devolver la funcion despues de un ataque, prevenir nuevos ataques y prevenir la discapacidad. Los medicamentos de la EM pueden tener efectos adversos o ser mal tolerados. El documento WO 2010/085509 A1 describe una composicion para la induccion de tolerancia espedfica de antfgeno que comprende una nanopartmula de soporte fijada a peptidos antigenicos tales como la protema basica de la mielina, espedfica de la esclerosis multiple. Una molecula de senalizacion apoptotica es el principal agente de tolerancia. Tales moleculas se pueden asociar con efectos secundarios significativos.
En consecuencia, existe una necesidad en la tecnica de terapias mejor toleradas, mas eficaces para la EM.
Compendio
La invencion se define en las reivindicaciones adjuntas.
Como respuesta a una necesidad en la tecnica, en esta memoria se describen metodos terapeuticos y composiciones para tratar o prevenir la esclerosis multiple o trastornos relacionados con la esclerosis multiple. Un aspecto de la descripcion se refiere a un metodo para expandir y/o desarrollar poblaciones de linfocitos T autorreactivos antipatogenos en un sujeto con esclerosis multiple o un trastorno relacionado con la esclerosis multiple, en donde el metodo comprende, consiste esencialmente o consiste ademas tambien en administrar a ese sujeto un complejo de antfgeno-MHC-nanopartmula, en donde el antfgeno es un antfgeno relacionado con la esclerosis multiple.
Un aspecto adicional se refiere a un metodo para el tratamiento de la esclerosis multiple o un trastorno relacionado con la esclerosis multiple en un sujeto que lo requiere que comprende, consiste esencialmente o consiste ademas tambien en administrar una cantidad eficaz de un complejo de antfgeno-MHC-nanopartfcula al sujeto, en donde el antfgeno es un antfgeno relacionado con la esclerosis multiple.
Otros aspectos se refieren a un complejo que comprende, consiste esencialmente o consiste ademas tambien en una nanopartmula; una protema del MHC; y un antfgeno relacionado con la esclerosis multiple. Tambien se proporcionan composiciones que comprenden, consisten esencialmente o consisten ademas tambien en el antfgeno-MHC-nanopartmula como se describe en esta memoria y un vedculo. Otros aspectos adicionales se refieren a kits que compren­ den, consisten esencialmente o consisten ademas tambien en composiciones de antigeno-MHC-nanopartmula descritas en esta memoria e instrucciones de uso.
Descripcion de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invencion. La invencion puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o varios de estos dibujos en combinacion con la descripcion detallada de realizaciones espedficas presentadas en esta memoria.
La FIG. 1 muestra que la terapia con pMHC de clase II-NP reduce la gravedad de una EAE establecida en ratones C57BL/6. Ratones B6 fueron inmunizados con pMOG35-55 en CFA y se trataron con toxina pertussis por via i.v. Los ratones recibieron una puntuacion de los signos de EAE utilizando criterios establecidos a traves de una escala de 15 puntos. Los ratones afectados se trataron con dos dosis semanales de 7,5-22,5 |jg de NPs recubiertas con pMOG3s-49/IAb, comenzando 21 dfas despues de la inmunizacion.
La FIG. 2 demuestra que los ratones con EAE cronica tratados con una terapia de pMHC de clase II-NP (NPs recu­ biertas con pMOG38-49/I-Ab) tienen un peso incrementado en comparacion con los ratones con EAE sin tratar.
La FIG. 3 es una fotograffa de los ratones con EAE tratados y sin tratar. Los ratones tratados (NAVACIM) aparecen mas sanos que los ratones sin tratar.
La FIG. 4 muestra la expansion sistemica de linfocitos T CD4+ autorreguladores cognados mediante NPs recubiertas con pMOG38-49/IAb en ratones C57BL/6 afectados por EAE. La magnitud de la expansion en este modelo es compara­ ble a la observada en los ratones NOD tratados con NPs recubiertas con pMHC de clase II relevante para la diabetes de tipo 1 diabetes (vease, por ejemplo, el documento de Patente de EE.UU. n° 8.354.110).
La FIG. 5 representa las medulas espinales de ratones sin tratar. Los ratones sin tratar mostraban una desmielinizacion significativa e infiltrados de celulas mononucleares densas de la sustancia blanca.
La FIG. 6 representa las medulas espinales de ratones tratados con pMOG38-49/IAb-NPs. Los ratones tratados con pMHC-NP teman significativamente menos desmielinizacion e infiltrados de celulas mononucleares.
La FIG. 7 muestra ejemplos representativos de los bordes de la medula espinal de 2 ratones con EAE sin tratar.
La FIG. 8 muestra ejemplos representativos de los bordes de la medula espinal de 2 ratones con EAE tratados con pMOG38-49/IAb-NPs. Los ratones tratados con pMHC-NP tienen significativamente menos desmielinizacion, asf como menos infiltracion de celulas mononucleares.
La FIG. 9 muestra la secuencias proteica (SEQ ID NO: 2) y de ADN (SEQ ID NO: 3) de la estructura artificial pMOG36-55-I-Abeta (b)-C-Jun (SEQ ID NOS: 2 y 3, respectivamente, en orden de aparicion). Las secuencias de los componentes individuales en la protema de fusion son lider HA (subrayado) seguido de la secuencia del peptido pMOG3s.4q (subrayado doble), la secuencia de J.-Abeta..(b) (subrayado punteado) y C-Jun (sombreado). Los enlazadores GS no se resaltan.
La FIG. 10 es un mapa del ADN del vector que contiene el antfgeno. Los sitios de la estructura artificial de ADN que codifican la protema de fusion lfder HA-I-Aalfa (b) -C Fos-BirA-His X 6 (284 aa) ("His X 6" se describe como SEQ ID NO: 18) se clonaron en el vector de expresion de celula de mosca pMT/V5 entre Nco I (854) hasta Xba I (1711). La protema de fusion incluye I-Aalfa (d) (195 aa), seguido de C-Fos a traves de un enlazador GS (6 aa) y despues la secuencia BirA y His 6 X (SEQ ID n O: 18).
La FIG. 11 muestra la imagen TEM representativa de NPs de oro recubiertas con pMHC (~14 nm) concentradas a densidades altas (~5x1013/ml) y monodispersadas. Mag: 50.000X.
La FIG. 12 muestra los efectos de la dosis de pMHC (GNP) y de la valencia de pMHC sobre las propiedades agonistas de NPs recubiertas con pMHC. La Figura compara las cantidades de IFNy secretadas por linfocitos T 8.3-CD8+ cog­ nados como respuesta a dos muestras de pMHC-NP diferentes (ambas consisten en ~2x1013 NPs de 14 nm de diametro/ml). Au-022410 y Au-21910 eran portadoras de ~250 y ~120 pMHCs/NP, respectivamente. Au-011810-C era portadora de ~120 pMHCs/NP de control.
La FIG. 13 demuestra la secrecion inducida por pMHC-NP de IFNy a traves de linfocitos T 8.3-CD8+ como una funcion de la valencia de pMHC. Linfocitos T 8.3-CD8+ (2,5x105 celulas/ml) se cultivaron con cantidades en aumento de NPs recubiertas con tres valencias diferentes de IGRP206-214/Kd. IGRP206-214 comprende el peptido antigenico VYLKTNVFL (SEQ ID NO: 19).
La FIG. 14 muestra que la actividad agonista inferior de las pMHC-NPs se puede compensar mediante el aumento de la densidad de pMHC-NP pero solo por encima de un umbral de valencia de pMHC. El grafico compara la actividad agonista de tres preparaciones diferentes de pMHC-NP (que son portadoras de tres valencias diferentes de pMHC) en un intervalo de densidades de NP. Observese que las NPs que son portadoras de 8 pMHCs, a diferencia de las que son portadoras de 11 pMHCs, no pueden desencadenar adecuadamente la secrecion IFNy incluso con densida­ des altas de pMHC-NP, en comparacion con NPs que son portadoras de 11 y 54 pMHCs por NP.
La FIG. 15 muestra los efectos del umbral de la valencia de pMHC sobre las propiedades agonistas de pMHC-NPs como una funcion del aporte total de pMHC.
La FIG. 16 muestra los efectos de la valencia de pMHC sobre la actividad agonista de pMHC-NPs producidas con nucleos de NP de oxido de hierro mas grandes.
La FIG. 17 muestra el efecto del tamano sobre la actividad agonista. Au-0224-15 eran GNPs de 14 nm recubiertas con una Valencia relativamente baja de pMHC pero preparadas con una densidad elevada; Au-0323-40 eran GNPs de 40 nm recubiertas con una valencia alta de pMHC pero con densidad baja. Au-0224-15 tema una actividad agonista superior que la muestra Au-0323-40.
La FIG. 18 muestra el efecto de PEGs protectores sobre la funcion de pMHC-GNPs. Au-021910 consistfa en ~2x1013 GNPs de 14 nm de diametro/ml protegidas mediante tiol-PEGs de 2 kD y recubiertas con ~20 pMHCs/GNP. Au-012810 GNPs (tambien ~2x1013 GNP/ml de 14 nm) estaban protegidas mediante tiol-PEGs de 5 kD y se recubrieron con ~175 pMHCs/GNP. La muestra de Au-021910 tema una actividad agonista superior.
La FIG. 19 muestra la expansion eficaz de los linfocitos T CD8+ reactivos con NRP-V7 mediante NPs de oro recubier­ tas con NRP-V7/Kd. Se emplearon 3 x 1012 NPs (~10 nm de tamano) que eran portadoras de 25 |jg de pMHC (150 pMHC/NP). Se trataron ratones NOD de 10 semanas de edad pre-diabeticos con dos inyecciones semanales de NPs de oro recubiertas con NRP-V7/kd durante 5 semanas. El tetramero TUM/Kd es un control negativo. Cada columna de paneles corresponde a un raton diferente.
La FIG. 20 representa la gran expansion de linfocitos T CD8+ cognados en ratones tratados con NPs recubiertas con pMHC. Se emplearon 3 x 1012 IGRP206-214/KD-NPs (~10 nm de tamano) que eran portadoras de 25 jg de pMHC (150 pMHC/NP). Panel superior: perfil de un raton sacrificado despues de 4 dosis. Panel inferior: perfil de dos ratones diferentes despues de 10 inyecciones (sangre solamente).
La FIG. 21 demuestra que los mismos principios para los complejos de pMHC de clase I-Np se aplican a Nps recu­ biertas con pMHC de clase II (vease la FIG. 18). Observese que pMHC de clase II-Nps (partfculas de nanopartfculas de 6-8 nm recubiertas con BDC2.5mi (SFPZ) recubiertas con 17 pMHCs tienen mayor actividad agonista que las partfculas PFM (20-25 nm) recubiertas con 53 pMHCs por NP. Esto confirma que tanto con Nps con pMHC de clase I como con Nps con pMHC de clase II, lo que importa no es la valencia absoluta de pMHC, sino mas bien la densidad de pMHC. Como se demuestra por la secrecion incrementada de IFNy inducida por pMHC-NP mediante linfocitos T CD4+ como una funcion de la densidad de pMHC.
Descripcion detallada
Se ha de entender que esta invencion no se limita a realizaciones particulares descritas ya que, por supuesto, pueden variar. Se ha de entender tambien que la terminologfa usada en esta memoria es solo con el fin de describir realiza­ ciones particulares y no pretende ser limitante, ya que el alcance de la presente invencion estara limitado unicamente por las reivindicaciones adjuntas.
Hay que senalar que, tal y como se usa en esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Asf, por ejemplo, la referencia a "un excipiente" incluye una pluralidad de excipientes.
I. Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientfficos usados en esta memoria tienen el mismo significado que el que entiende comunmente cualquier experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Tal y como se usan en esta memoria, los siguientes terminos tienen los siguientes significados.
Tal y como se utiliza en la presente memoria, la expresion "que comprende" o el termino "comprende" significa que las composiciones y los metodos incluyen los elementos citados, sin excluir a otros.
"Que consiste esencialmente en", cuando se usa para definir composiciones y metodos, significa excluir otros elemen­ tos con cualquier significado esencial para la combinacion para el proposito declarado. Por lo tanto, una composicion que consiste esencialmente en los elementos como se definen en esta memoria, no excluina otros materiales o etapas que no afecten materialmente a la o las caractensticas basicas y novedosas de la invencion reivindicada, tales como composiciones para tratar o prevenir la esclerosis multiple. "Que consiste en" significa excluir mas que los oligoelementos de otros ingredientes y las etapas sustanciales del metodo. Las realizaciones definidas por cada uno de estos terminos de transicion estan dentro del alcance de esta invencion.
Por "biocompatible" se entiende que los componentes del sistema de administracion no causaran una lesion tisular o una lesion en el sistema biologico humano. Para impartir biocompatibilidad, se utilizaran preferentemente los polfmeros y excipientes que han mostrado antecedentes de uso seguro en seres humanos o con el estado GRAS (Generalmente Aceptado como Seguro). Por biocompatibilidad se entiende que los ingredientes y excipientes usados en la composi­ cion seran finalmente "bioabsorbidos" o eliminados por el cuerpo sin efectos adversos para el cuerpo. Para que una composicion sea biocompatible y se considere no toxica, no debe causar toxicidad a las celulas. De forma similar, el termino "bioabsorbible" se refiere a nanopartfculas hechas de materiales que se someten a una bioabsorcion in vivo durante un periodo de tiempo tal, que se evita una acumulacion a largo plazo del material en el paciente. En una realizacion preferida, la nanopartfcula biocompatible es bioabsorbida durante un periodo de menos de 2 anos, preferiblemente menos de 1 ano e incluso mas preferiblemente menos de 6 meses. La tasa de bioabsorcion esta relacionada con el tamano de la partfcula, el material utilizado y otros factores bien reconocidos por los expertos en la tecnica. Se puede usar una mezcla de materiales biocompatibles y bioabsorbibles para formar las nanopartfculas usadas en esta invencion. En una realizacion, se puede combinar oxido de hierro y un poUmero biocompatible y bioabsorbible. Por ejemplo, el oxido de hierro y PGLA se pueden combinar para formar una nanopartmula.
Un complejo de antfgeno/MHC/nanopartmula se refiere a la presentacion de un peptido, carbohidrato, lfpido u otro segmento, fragmento o epttopo antigenico de una molecula o protema antigenica (es decir, autopeptido o autoanth geno) sobre una superficie, tal como una nanoesfera biocompatible y biodegradable. "Antfgeno", tal y como se utiliza en la presente memoria, se refiere a todo, una parte, un fragmento o un segmento de una molecula que puede inducir una respuesta inmune en un sujeto o una expansion de celulas antipatogenicas.
El termino "aproximadamente", cuando se usa antes de una designacion numerica, por ejemplo, temperatura, tiempo, cantidad y concentracion, incluyendo un intervalo, indica aproximaciones que pueden variar en (+) o (-) un 10%, 5% o 1%.
Un "irnmico" es un analogo de un ligando o peptido dado, en donde el analogo es sustancialmente similar al ligando. "Sustancialmente similar" significa que el analogo tiene un perfil de union similar al ligando, excepto que el irnmico tiene uno o varios grupos funcionales o modificaciones que representan colectivamente menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 10% o menos de aproximadamente 5% del peso molecular del ligando.
La esclerosis multiple (EM) es tambien conocida como "esclerosis diseminada," "encefalomielitis diseminada" o "encefalomielitis alergica". La EM es una enfermedad inflamatoria en la que las vainas de mielina grasas que rodean los axones del cerebro y la medula espinal estan danadas, dando lugar a una desmielinizacion y cicatrizacion, asf como a un amplio espectro de signos y smtomas. Los trastornos relacionados con la esclerosis multiple incluyen, por ejem­ plo, neuromielitis optica (NMO), uveftis, dolor neuropatico y similares.
La "glicoprotema oligodendrodtica de la mielina" (MOG) es una glicoprotema que se cree que es importante en el proceso de mielinizacion de los nervios en el sistema nervioso central (SNC). En los seres humanos, esta protema esta codificada por el gen MOG. Se especula que sirve como una "molecula de adhesion" necesaria para proporcionar una integridad estructural a la vaina de mielina y se sabe que se desarrolla tarde en el oligodendrocito. Los numeros de registro del GenBank NM_001008228.2 y NP_001008229.1 representan la secuencia de ARNm y de la protema, respectivamente, del gen MOG.
La expresion "linfocito T autorreactivo antipatogeno" se refiere a un linfocito T con propiedades antipatogenas (es decir, linfocitos T que neutralizan la EM). Estos linfocitos T pueden incluir linfocitos T antiinflamatorios, linfocitos T efectores, linfocitos T de memoria, linfocitos T de baja avidez, linfocitos T auxiliares, linfocitos T autorreguladores, linfocitos T citotoxicos, linfocitos T citoltticos naturales, linfocitos T CD4+, linfocitos T CD8+ y similares.
La expresion "linfocito T antiinflamatorio" se refiere a un linfocito T que promueve una respuesta antiinflamatoria. La funcion antiinflamatoria del linfocito T se puede llevar a cabo mediante la produccion y/o la secrecion de protemas antiinflamatorias, citocinas, quimiocinas y similares. Las protemas antiinflamatorios tambien se entiende que incluyen senales antiproliferativas que suprimen las respuestas inmunes. Las protemas antiinflamatorias incluyen IL-4, IL-10, IL-13, IFN-a, TGF-p, IL-1ra, G-CSF y receptores solubles para TNF e IL-6. En ciertas realizaciones, la administracion del complejo de antigeno-MHC-nanopartmula conduce a una expansion y o aumento de la induccion de linfocitos T antiinflamatorios eficaces para el tratamiento de la esclerosis multiple. Por consiguiente, unos aspectos de la descripcion se refieren a metodos para tratar, en un paciente, una inflamacion asociada con la EM, comprendiendo el metodo, consistiendo fundamentalmente o ademas consistiendo adicionalmente en administrar a ese paciente un complejo de antigeno-MHC-nanopartmula en donde el antfgeno es un antfgeno relacionado con la esclerosis multiple.
El termino "IL-10" o "interleucina-10" se refiere a una citocina codificada por el gen de IL-10. La secuencia de IL-10 esta representada por el numero de registro en el GenBank NM_000572.2 (ARNm) y NP_000563.1 (protema).
El termino "TGF-p" o "factor de crecimiento transformante beta" se refiere a una protema que puede tener un efecto antiinflamatorio. TGF-p es una protema secretada que existe en al menos tres isoformas, denominadas TGF-p1, TGF-p2 y TGF-p3. Tambien era el nombre original para TGF-p1, que fue el miembro fundador de esta familia. La familia de TGF-p es parte de una superfamilia de protemas conocidas como la superfamilia de factor de crecimiento transfor­ mante beta, que incluye inhibinas, activina, hormona antimulleriana, protema morfogenetica osea, decapentaplegic y Vg-1.
Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para conseguir el objetivo pretendido, ejemplos no limitantes del mismo incluyen: iniciacion de la respuesta inmune, modulacion de la respuesta inmune, supresion de una respuesta inflamatoria y modulacion de la actividad de linfocitos T o poblaciones de linfocitos T. En un aspecto, la cantidad eficaz es una que funciona para lograr un fin terapeutico indicado, por ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz. Como se describe en esta memoria en detalle, la cantidad eficaz o la dosificacion, depende del fin y de la composicion, del componente y se puede determinar de acuerdo con la presente descripcion.
El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con la expresion "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, puede significar "uno", pero tambien es compatible con el significado de "uno o varios", "al menos uno" y "uno o mas de uno".
Por "nanoesfera", "NP" o "nanopartmula" en esta memoria, se entiende una pequena partmula discreta que se administra individualmente o de forma plural a un sujeto, muestra celular o muestra de tejido, segun proceda. En ciertas realizaciones, las nanopartmulas tienen una forma sustancialmente esferica. En ciertas realizaciones, la nanopartmula no es un liposoma o una partmula vftica. En realizaciones adicionales, la nanopartmula es solida. La expresion "sus­ tancialmente esferica", tal y como se emplea en esta memoria, significa que la forma de las partmulas no se desvfa de la de una esfera en mas de aproximadamente un 10%. Varios complejos conocidos de antigenos o peptidos de la invencion se pueden aplicar a las partmulas. Las nanopartmulas de esta invencion vanan en tamano desde aproxima­ damente 1 nm a aproximadamente 1 pm y, preferiblemente, desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm y en algunos aspectos se refiere al diametro promedio o la mediana de una pluralidad de nanopartmulas, cuando se desea una pluralidad de nanopartmulas. Las partmulas mas pequenas de tamano nanometrico se pueden obtener, por ejemplo, mediante el procedimiento de fraccionamiento mediante el cual se permite que las partmulas mas grandes se sedimenten en una solucion acuosa. La porcion superior de la solucion se recupera a continuacion mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Esta porcion superior esta enriquecida con partmulas de tamano mas pequeno. El procedimiento se puede repetir hasta que se genera un tamano promedio deseado.
El uso del termino "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/o" a menos que se indique expftcitamente que se refiere solamente a alternativas o que las alternativas son mutuamente excluyentes, aunque la descripcion apoya una definicion que se refiere solo a alternativas y a "y/o".
Tal y como se usa en esta memoria, la expresion "respuesta inmune" o su equivalente "respuesta inmunologica" se refiere al desarrollo de una respuesta mediada por celulas (mediada por linfocitos T espedficos de antigeno o sus productos de secrecion). Una respuesta inmune celular se provoca por la presentacion de epftopos polipeptfdicos en asociacion con moleculas del MHC de clase I o de clase II, para activar linfocitos T auxiliares CD4+ espedficos de antigeno y/o linfocitos T citotoxicos CD8+. La respuesta tambien puede implicar la activacion de otros componentes.
Las expresiones "respuesta inflamatoria" e "inflamacion", tal y como se emplean en esta memoria, indican la respuesta biologica compleja de los tejidos vasculares de un individuo frente a estfmulos nocivos, tales como agentes patogenos, celulas danadas o agentes irritantes, e incluye la secrecion de citocinas y mas particularmente de citocinas proinflamatorias, es decir, citocinas que se producen predominantemente por celulas inmunes activadas y estan implicadas en la amplificacion de reacciones inflamatorias. Las citocinas proinflamatorias a modo de ejemplo incluyen pero no se limitan a IL-1, IL-6, TNF-a, IL-17, IL21, IL23 y TGF-p. Las inflamaciones a modo de ejemplo incluyen la inflamacion aguda y la inflamacion cronica. Una inflamacion aguda indica un proceso a corto plazo que se caracteriza por los signos clasicos de la inflamacion (hinchazon, enrojecimiento, dolor, calory perdida de funcion) debido a la infiltracion de los tejidos con plasma y leucocitos. Una inflamacion aguda se produce normalmente siempre que el estfmulo nocivo esta presente y cesa una vez que el estfmulo se ha retirado, destruido o eliminado por cicatrizacion (fibrosis). La inflamacion cronica indica un estado caracterizado por una inflamacion concurrente activa, destruccion de tejido e intentos de reparacion. Una inflamacion cronica no se caracteriza por los signos clasicos de inflamacion aguda enumerados anteriormente. En su lugar, un tejido inflamado de forma cronica se caracteriza por la infiltracion de celulas mononucleares inmunes (monocitos, macrofagos, linfocitos y celulas plasmaticas), destruccion de tejido e intentos de curacion, que incluyen angiogenesis y fibrosis. Una inflamacion se puede inhibir en el sentido de la presente descripdon, afectando y en particular inhibiendo cualquiera de los eventos que forman la compleja respuesta biologica asociada a una inflamacion en un individuo.
Las expresiones "epftopo" y "determinante antigenico" se usan indistintamente para referirse a un sitio en un antfgeno al cual responden o reconocen los linfocitos B y/o linfocitos T. Los epftopos de linfocitos B se pueden formar tanto a partir de aminoacidos contiguos como de aminoacidos no contiguos, yuxtapuestos mediante el plegamiento terciario de una protema. Los epftopos formados a partir de aminoacidos contiguos normalmente se conservan durante una exposicion a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epftopos formados por plegamiento terciario, normal­ mente se pierden durante un tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epftopo incluye normalmente al menos 3 y mas habitualmente al menos 5 u 8-10 aminoacidos en una conformacion espacial unica. Los metodos para determinar la conformacion espacial de los epftopos incluyen cristalograffa de rayos X, por ejemplo, y resonancia magnetica nuclear de 2 dimensiones. Vease, por ejemplo, Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996). Los linfocitos T reconocen epftopos continuos de aproximadamente nueve aminoacidos para los linfocitos CD8 o de aproximadamente 13-15 aminoacidos para los linfocitos CD4. Los linfocitos T que reconocen el epftopo se pueden identificar mediante ensayos in vitro que miden la proliferacion dependiente de antfgeno, tal y como se determina mediante la incorporacion de 3H-timidina por linfocitos T cebados, como respuesta a un epftopo (Burke et al., J. Inf. Dis., 170: 1110-1119, 1994), mediante una destruccion dependiente de antfgeno (ensayo de linfocitos T citotoxicos, Tigges et al., J. Immunol, 156(10):3901-3910, 1996) o mediante la secrecion de citocinas. La presencia de una respuesta inmunologica mediada por celulas se puede determinar mediante ensayos de proliferacion (linfocitos T CD4+) o ensayos de CTL (linfocitos T citotoxicos).
Opcionalmente, un antfgeno o, preferiblemente, un epftopo de un antfgeno, se puede conjugar qmmicamente o expresar como una protema de fusion con otras protemas, tales como protemas del MHC y protemas relacionadas con el MHC.
Tal y como se usa en esta memoria, los terminos "paciente" y "sujeto" se utilizan como sinonimos y se refieren a un mamfero. En algunas realizaciones el paciente es un ser humano. En otras realizaciones el paciente es un mairftfero comunmente utilizado en un laboratorio, tal como raton, rata, simio, canino, felino, bovino, equino u ovino.
Tal y como se utiliza en esta solicitud, el termino "polinucleotido" se refiere a una molecula de acido nucleico que, o bien es recombinante o se ha aislado exenta de acido nucleico genomico total. Dentro del termino "polinucleotido" se incluyen oligonucleotidos (acidos nucleicos con una longitud de 100 residuos o menos), vectores recombinantes, incluyendo, por ejemplo, plasmidos, cosmidos, fagos, virus y similares. Los polinucleotidos incluyen, en ciertos aspectos, secuencias reguladoras, aisladas sustancialmente apartadas de sus genes de origen natural o secuencias que codifican protemas. Los polinucleotidos pueden ser ARN, ADN, analogos de los mismos o una combinacion de los mismos. Un acido nucleico que codifica todo o parte de un polipeptido, puede contener una secuencia de acido nucleico contigua que codifica la totalidad o una porcion de un polipeptido de ese tipo con las siguientes longitudes: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070,1080, 1090,1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 o mas nucleotidos, nucleosidos o pares de bases. Tambien se contempla que un polipeptido particular procedente de una especie dada puede estar codificado por acidos nucleicos que contienen variaciones naturales que tienen secuencias de acido nucleico ligeramente diferentes pero, sin embargo, codifican la misma o sustancialmente la misma protema, polipeptido o peptido.
Un polinucleotido esta compuesto por una secuencia espedfica de cuatro bases de nucleotidos: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) en lugar de la timina cuando el polinucleotido es ARN. Por lo tanto, la expre­ sion "secuencia de polinucleotido" es la representacion alfabetica de una molecula de polinucleotido. Esta representacion alfabetica se puede introducir en bases de datos en un ordenador que tiene una unidad de procesamiento central y utilizarse para aplicaciones bioinformaticas tales como la genomica funcional y la busqueda de homologfas.
El termino "aislado" o "recombinante" tal y como se usa en esta memoria con respecto a los acidos nucleicos, tales como ADN o ARN, se refiere a moleculas distintas de otros ADNs o ARNs, respectivamente, que estan presentes en la fuente natural de la macromolecula, asf como polipeptidos. La expresion "acido nucleico aislado o recombinante" se entiende que incluye fragmentos de acido nucleico que no son de origen natural como fragmentos y que no se encontranan en estado natural. El termino "aislado" tambien se utiliza en esta memoria para referirse a polinucleotidos, polipeptidos y protemas que se afslan a partir de otras protemas celulares y se entiende que incluyen polipeptidos tanto purificados como recombinantes. En otras realizaciones, la expresion "aislado o recombinante" significa separado de los constituyentes, de forma celular y de otro modo, en donde la celula, el tejido, el polinucleotido, el peptido, el polipeptido, la protema, el anticuerpo o fragmento(s) de los mismos, que normalmente estan asociados en la naturaleza. Por ejemplo, una celula aislada es una celula que esta separada del tejido o de celulas con un fenotipo o genotipo diferente. Un polinucleotido aislado esta separado de nucleotidos contiguos en 3' y 5' con los que esta nor­ malmente asociado en su entorno originario o natural, por ejemplo, en el cromosoma. Como es evidente para los expertos en la tecnica, un polinucleotido, peptido, polipeptido, protema, anticuerpo o fragmento(s) de los mismos con origen no natural, no requiere un "aislamiento", para distinguirlo de su homologo que se produce de forma natural.
Una region de polinucleotido o polinucleotido (o un polipeptido o region de polipeptido) que tiene un cierto porcentaje (por ejemplo, 80%, 85%, 90% o 95%) de "identidad de secuencia" con otra secuencia, significa que cuando se alinea, ese porcentaje de bases (o aminoacidos) es el mismo que al comparar las dos secuencias. La alineacion y el porcentaje de homologfa o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas informaticos conocidos en la tecnica, por ejemplo, los descritos en Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., compiladores, 1987) Suplemento 30, Seccion 7.7.18, Tabla 7.7.1. Preferiblemente, se emplean parametros por defecto para la alineacion. Un programa de alineacion preferido es BLAST, que emplea parametros por defecto. En particular, los programas preferidos son BLASTN y BLASTP, que emplean los siguientes parametros por defecto: codigo genetico = estandar; filtro = ninguno; hebra = ambas; punto de corte = 60; esperado = 10; Matrix = BLOSUM62; Descripciones = 50 se­ cuencias; ordenado por = HIGH SCORE; Bases de datos = no redundante, GenBank EMBL d DbJ PDB traducciones de CDS de GenBank SwissProtein Spupdate PIR. Detalles de estos programas se pueden encontrar en la siguiente direccion de Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.
Se ha de concluir sin una indicacion explfcita y a menos que se pretenda de otro modo, que cuando la presente invencion se refiere a un polipeptido, una protema, un polinucleotido o un anticuerpo, se entiende que un equivalente o un equivalente biologico de los mismos esta dentro del alcance de esta invencion. Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresion "equivalente biologico de los mismos" se entiende que es un sinonimo de "equivalente de los mismos" cuando se refiere a una protema, un anticuerpo, un fragmento, un polipeptido o un acido nucleico de referen­ da, se entienden aquellos que tienen una homologfa minima a la vez que todavfa conservan la estructura o funcionalidad deseadas. A menos que se indique espedficamente en esta memoria, se contempla que cualquier polinucleotido, polipeptido o protema mencionada en esta memoria, tambien incluye sus equivalentes. En un aspecto, un polinucleotido equivalente es uno que se hibrida en condiciones rigurosas con el polinucleotido o un complemento del polinu­ cleotido como se describe en esta memoria, para uso en los metodos descritos. En otro aspecto, un anticuerpo equi­ valente o un polipeptido que se une a antfgeno se entiende que es uno que se une con al menos 70% o alternativamente al menos 75% o alternativamente al menos 80% o alternativamente al menos 85% o alternativamente al menos 90% o alternativamente al menos 95% de afinidad o una afinidad mayor con un anticuerpo de referencia o un fragmento que se une a antigeno. En otro aspecto, su equivalente compite en la union del anticuerpo o un fragmento que se une a antigeno, con su antfgeno un ensayo ELISA de competencia. En otro aspecto, un equivalente se entiende que tiene al menos aproximadamente 80% de homologfa o identidad y, alternativamente, al menos aproximadamente un porcentaje de 85%, o alternativamente al menos 90%, o alternativamente al menos aproximadamente 95%, o alternativamente 98% de homologfa o identidad y muestra sustancialmente una actividad biologica equivalente a la de la protema, polipeptido o acido nucleico de referencia.
"Hibridacion" se refiere a una reaccion en la que uno o varios polinucleotidos reaccionan para formar un complejo que se estabiliza a traves de enlaces de hidrogeno entre las bases de los residuos de nucleotidos. El enlace de hidrogeno se puede producir mediante apareamiento de bases de Watson-Crick, union Hoogstein o cualquier otra forma especffica de secuencia. El complejo puede comprender dos hebras que forman una estructura duplex, tres o mas hebras que forman un complejo multihebras, una sola hebra autohibridada o cualquier combinacion de las mismas. Una reac­ cion de hibridacion puede constituir una etapa de un proceso mas extenso, como el inicio de una reaccion PCR o la escision enzimatica de un polinucleotido con una ribozima.
Ejemplos de condiciones de hibridacion rigurosas incluyen: temperaturas de incubacion de aproximadamente 25°C a aproximadamente 37°C; concentraciones de tampon de hibridacion de aproximadamente 6x SSC a aproximadamente 10x SSC; concentraciones de formamida de aproximadamente 0% a aproximadamente 25%; y soluciones de lavado desde aproximadamente 4x SSC a aproximadamente 8x SSC. Ejemplos de condiciones de hibridacion moderadas incluyen: temperaturas de incubacion de aproximadamente 40°C a aproximadamente 50°C; concentraciones de tam­ pon de aproximadamente 9x SSC a aproximadamente 2x SSC; concentraciones de formamida de aproximadamente 30% a aproximadamente 50%; y soluciones de lavado de aproximadamente 5x SSC a aproximadamente 2x SSC. Ejemplos de condiciones muy rigurosas incluyen: temperaturas de incubacion de aproximadamente 55°C a aproxima­ damente 68°C; concentraciones de tampon de aproximadamente 1x SSC a aproximadamente 0,1x SSC; concentra­ ciones de formamida de aproximadamente 55% a aproximadamente 75%; y soluciones de lavado de aproximada­ mente de 1x SSC, 0,1x SSC o agua desionizada. En general, los tiempos de incubacion de la hibridacion son de 5 minutos a 24 horas, con 1,2 o mas etapas de lavado y los tiempos de incubacion del lavado son de aproximadamente 1, 2 o 15 minutos. SSC es tampon NaCl 0,15 M y citrato 15 mM. Se entiende que se pueden emplear equivalentes de SSC utilizando otros sistemas de tampon.
"Homologfa" o "identidad" o "similitud" se refiere a la similitud de secuencia entre dos peptidos o entre dos moleculas de acido nucleico. La homologfa se puede determinar comparando una posicion en cada secuencia que se puede alinear para fines de comparacion. Cuando una posicion en la secuencia comparada esta ocupada por la misma base o aminoacido, entonces las moleculas son homologas en esa posicion. Un grado de homologfa entre secuencias es una funcion del numero de posiciones coincidentes u homologas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homologa" comparte una identidad de menos del 40% o alternativamente una identidad de menos del 25%, con una de las secuencias de la presente invencion.
"Homologfa" o "identidad" o "similitud" tambien se puede referir a dos moleculas de acido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas.
Tal y como se usa en esta memoria, los terminos "tratar", "tratamiento" y similares se usan en esta memoria con el significado de obtener un efecto farmacologico y/o fisiologico deseado. El efecto puede ser terapeutico en terminos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. En un aspecto, el tratamiento indica una reduccion de los signos de la enfermedad usando una escala establecida.
Tal y como se usa en esta memoria, con la expresion "trastorno relacionado con la esclerosis multiple" se entiende un trastorno que esta presente junto con una susceptibilidad a la EM o con EM. Ejemplos no limitantes de ellos incluyen neuromielitis optica (NMO), uveftis, dolor neuropatico, aterosclerosis, arteriosclerosis, esclerosis sistemica diseminada, EM espino-optica, EM primaria progresiva (PPEM) y EM remitente recurrente (EMRR), esclerosis sistemica progresiva y esclerosis ataxica,
IGRP, que esta codificada por un gen (localizado en el cromosoma 2q28-32 que solapa un locus de susceptibilidad a T1D, IDDM7 (2q31)), tambien se ha identificado recientemente como un autoantfgeno de celulas beta de relevancia potencial en la T1D humana. Dos epftopos que se unen al HLA-A*0201 de IGRP humana (hIGRP228-236 y hIGRP265-273) son reconocidos por celulas CD8+ asociadas a los islotes procedentes de ratones NOD con una deficiencia en el MHC murino de clase I que expresan un transgen HLA-A*0201. IGRP206-214 comprende el peptido antigenico VYLKTNVFL (SEQ ID NO: 19).
Prevenir se entiende que es evitar un trastorno o un efecto in vitro o in vivo en un sistema o un sujeto que esta predispuesto a la enfermedad o el efecto.
Una "composicion" se entiende que significa una combinacion de agente activo y otro compuesto o composicion, inerte (por ejemplo, un agente detectable o un marcador) o activo, tal como un adyuvante. En ciertas realizaciones, la com­ posicion no contiene un adyuvante.
Una "composicion farmaceutica" se entiende que incluye la combinacion de un agente activo con un vehfculo, inerte o activo, haciendo que la composicion sea adecuada para un uso diagnostico o terapeutico in vitro, in vivo o ex vivo.
La expresion "codon funcionalmente equivalente" se utiliza en esta memoria para referirse a codones que codifican el mismo aminoacido, tal como los seis codones para arginina o serina y tambien se refiere a los codones que codifican aminoacidos biologicamente equivalentes (vease la Tabla siguiente).
Tabla de codones
Aminoacidos Codones
Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU
Cistema Cys C UGC UGU
Acido aspartico Asp D GAC GAU
Acido glutamico Glu E GAA GAG
Fenilalanina Phe F UUC UUU
Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidina His H CAC CAU
Isoleucina Ile I AUA AUC AUU
Lisina Lys K AAA AAG
Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionina Met M AUG
Asparagina Asn N AAC AAU
Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU
Glutamina Gln Q CAA CAG
Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonina Thr T ACA ACC ACG ACI
Valina Val V GUA GUC GUG GUU
Triptofano Trp W UGG
Tirosina Tyr Y UAC UAU
Tal y como se usa en esta memoria, una "protema" o un "polipeptido" o un "peptido" se refiere a una molecula que comprende al menos cinco residuos de aminoacidos.
Descripcion de las realizaciones
Esta descripcion se basa en el descubrimiento de que nanopartfculas acopladas a complejos de antfgeno relevante para EM-MHC reducen los smtomas de la EM o la encefalomielitis (EAE) (Ejemplo 1).
II. METODOS
Los metodos tal y como se describen en esta memoria comprenden o alternativamente consisten esencialmente o consisten ademas tambien en la administracion de una cantidad eficaz de un complejo de antigeno-MHC-nanoparth cula a una celula, tejido o sujeto con el fin de: (1) ampliar y/o desarrollar poblaciones de linfocitos T autorreactivas antipatogenas (o anti-EM); y/o (2) tratar o prevenir la esclerosis multiple o un trastorno relacionado con la esclerosis multiple en un paciente con esclerosis multiple o un trastorno relacionado con la esclerosis multiple o en un paciente susceptible de esclerosis multiple o un trastorno relacionado con la esclerosis multiple, en un aspecto sin comprometer la inmunidad sistemica. El antfgeno usado en el complejo es un antfgeno relacionado con la esclerosis multiple. Los metodos para determinar y supervisar la terapia son conocidos en la tecnica y se describen brevemente en esta memoria. Cuando se entrega in vitro, la administracion es mediante la puesta en contacto de la composicion con el tejido o la celula a traves de cualquier metodo apropiado, por ejemplo, mediante la administracion a una celula o un tejido de un medio de cultivo y es util como un escrutinio para determinar si la terapia es apropiada para un individuo o para escrutarterapias alternativas que se pueden utilizarcomo sustituto o en combinacion con las composiciones descritas. Cuando se administra in vivo, la administracion es mediante administracion sistemica o local. In vivo, los metodos se pueden poner en practica en un animal no humano para escrutar terapias alternativas para ser utilizadas como un sustituto o en combinacion con las composiciones descritas, antes de la administracion a seres humanos. En un mairnfero humano o no humano tambien son utiles para tratar la enfermedad o el trastorno.
Los metodos requieren la administracion de una cantidad eficaz de un complejo que comprende, consiste esencialmente o que consiste ademas tambien en, una nanopartfcula; una protema del m HC; y un antfgeno relacionado con la esclerosis multiple.
El MHC del complejo de antfgeno-MHC-nanopartfcula puede ser MHC I, MHC II o MHC no clasico. Las protemas del MHC se describen en esta memoria. En una realizacion, el MHC del complejo de antfgeno-MHC-nanopartfcula es un MHC de clase I. En otra realizacion, el MHC es un MHC de clase II. En otras realizaciones, el componente del MHC del complejo de antigeno-MHC-nanopartfcula es MHC de clase II o una molecula del MHC no clasico, como se des­ cribe en esta memoria. En un aspecto, el antfgeno comprende o de forma alternativa consiste esencialmente o consiste ademas tambien en el polipeptido GWVRSPFSRVVH (SEQ ID NO: 1) o un equivalente de SEQ ID NO: 1. Antfgenos adicionales que se pueden utilizar en esta invencion comprenden polipeptidos que comprenden o alternativamente consisten esencialmente o que consisten ademas tambien en los polipeptidos del grupo: MOG35-55, MEVGWYRS-PFSRVVHLYRNGK (SEQ ID NO: 4); MOG36-55, EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEQ ID NO: 5); MAG287-295, SLLLE-LEEV (SEQ ID NO: 6); MAG509-517, LMWAKIGPV (SEQ ID NO: 7); MAG556-564, VLFSSDFRI (SEQ ID NO: 8); MBPI110-118, SLSRFSWGA (SEQ ID NO: 9); MOG114-122, KVEDPFYWV (SEQ ID NO: 10); MOG166-175, RTFDPHFLRV (SEQ ID NO: 11); MOG172-180, FLRVPCWKI (SEQ ID NO: 12); MOG179-188, KITLFVIVPV (SEQ ID NO: 13); MOG188-196, VLGPL-VALI (SEQ ID NO: 14); MOG181-189, TLFVIVPVL (SEQ ID NO: 15); MOG205-214, RLAGQFLEEL (SEQ ID NO: 16); PLP80-88, FLYGALLLA (SEQ ID NO: 17), o un equivalente de cada uno de los mismos o combinaciones de los mismos.
El tamano de la nanopartfcula puede variar desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1 pm. En ciertas reali­ zaciones, la nanopartfcula es menor de aproximadamente 1 pm de diametro. En otras realizaciones, la nanopartfcula es menor de aproximadamente 500 nm, menor de aproximadamente 400 nm, menor de aproximadamente 300 nm, menor de aproximadamente 200 nm, menor de aproximadamente 100 nm o menor de aproximadamente 50 nm de diametro. En realizaciones adicionales, la nanopartfcula es desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 75 nm o 100 nm de diametro. En realizaciones espedficas, la nanopartfcula es desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm o de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm.
El tamano del complejo puede variar desde aproximadamente 5 nm a aproximadamente 1 pm. En ciertas realizaciones, el complejo es menor de aproximadamente 1 pm o alternativamente menor de 100 nm de diametro. En otras realiza­ ciones, el complejo es menor de aproximadamente 500 nm, menor de aproximadamente 400 nm, menor de aproxima­ damente 300 nm, menor de aproximadamente 200 nm, menor de aproximadamente 100 nm o menor de aproximada­ mente 50 nm de diametro. En realizaciones adicionales, el complejo es de aproximadamente 10 nm a aproximada­ mente 50 nm o de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 25 nm a aproximada­ mente 60 nm o de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 60 nm o, en un aspecto, aproximadamente 55 nm.
El solicitante ha descubierto que la densidad de los complejos de antfgeno-MHC sobre la nanopartfcula contribuye al beneficio terapeutico. Por lo tanto, como se describe en esta memoria, el complejo de antigeno-MHC-nanopartfcula puede tener una densidad definida en el intervalo de aproximadamente 0,05 moleculas de MHC por 100 nm2 de area de superficie de la nanopartfcula, asumiendo al menos 2 MHCs o alternativamente al menos 8 o alternativamente al menos 9 o alternativamente al menos 10 o alternativamente al menos 11 o alternativamente al menos 12 MHCs formando un complejo con la nanopartfcula. En un aspecto el complejo tiene una densidad de MHC de aproximadamente 0,01 MHC por 100 nm2 (0,05 Mh C/100 nm2) a aproximadamente 30 MHC/100 nm2 o de forma alternativa de 0,1 MHC/100 nm2 a aproximadamente 25 MHC/100 nm2 o alternativamente de aproximadamente 0,3 MHC/100 nm2 a aproximadamente 25 MHC/100 nm2 o alternativamente de aproximadamente 0,4 MHC/100 nm2 a aproximadamente 25 MHC/100 nm2 o alternativamente de aproximadamente 0,5 MHC/100 nm2 a aproximadamente 20 MHC/100 nm2 o alternativamente de aproximadamente, o alternativamente de 0,6 MHC/100 nm2 a aproximadamente 20 MHC/100 nm2 o alternativamente de aproximadamente 1,0 MHC/100 nm2 a aproximadamente 20 MHC/100 nm2 o alternativamente de aproximadamente 5,0 MHC/100 nm2 a aproximadamente 20 MHC/100 nm2, o alternativamente de aproximada­ mente 10,0 MHC/100 nm2 a aproximadamente 20 MHC/100 nm2 o alternativamente de aproximadamente 15 MHC/100 nm2 a aproximadamente 20 MHC/100 nm2 o alternativamente al menos aproximadamente 0,5 o alternativamente al menos aproximadamente 1,0 o alternativamente al menos aproximadamente 5,0 o alternativamente al menos aproxi­ madamente 10,0 o alternativamente al menos aproximadamente 15,0 MHC/100 nm2. En un aspecto, cuando 9 o al menos 9 MHCs forman un complejo con una nanopartfcula, el intervalo de densidad es de aproximadamente 0,3 MHC/100 nm2 a aproximadamente 20 MHC/100 nm2
En uno de los aspectos del metodo, se proporciona un metodo para la acumulacion de linfocitos T antiinflamatorios en un paciente que lo requiere. En una realizacion adicional, el linfocito T es un linfocito T CD4+ o CD8+. En una realiza­ cion relacionada, el linfocito T secreta IL-10 o TGFp. El metodo comprende, consiste esencialmente o consiste ademas tambien en administrar a un paciente que lo requiere una cantidad eficaz del complejo de nanopartfculas con antigeno-MHC como se describe en esta memoria.
En una realizacion, los metodos descritos en esta memoria son para el tratamiento de un trastorno relacionado con la esclerosis multiple. El metodo comprende, consiste esencialmente o consiste ademas tambien en administrar a un paciente que lo requiere una cantidad eficaz del complejo de nanopartfculas con antigeno-MHC como se describe en esta memoria. En una realizacion relacionada, el trastorno relacionado con la esclerosis multiple se selecciona a partir del grupo que consiste en neuromielitis optica (NMO), uveitis y dolor neuropatico.
A continuacion se describen detalles relativos a los modos de administracion in vitro e in vivo.
III. Complejos de antigeno-MHC-nanopartfcula
Ciertos aspectos se refieren a procedimientos para la produccion de medicamentos espedficos de antfgeno de la EM que tratan espedficamente la EM sin comprometer la inmunidad sistemica. El Ejemplo 2 describe la produccion de complejos de antfgeno-MHC-nanopartfcula. Los complejos de antigeno-MHC-nanopartfcula utiles en esta invencion comprenden un antfgeno relevante para la EM.
A. Polipeptidos y polinucleotidos
Otros aspectos se refieren a un polipeptido aislado o purificado que comprende o que consiste esencialmente o que consiste ademas tambien en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1, o un polipeptido que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia o alternativamente al menos 85% o alternativamente al menos 90% o alternativamente al menos 95% o alternativamente al menos 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o un polipeptido codificado por polinucleotidos que tienen al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia o alternativamente al menos 85% o alternativamente al menos 90% o alternativamente al menos 95% o alternativamente al menos 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o su complemento, o un polipeptido codificado por un polinucleotido que se hibrida en condiciones de moderadas a muy rigurosas con un polinucleotido que codifica SEQ ID NO: 1 o su complemento. Tambien se proporcionan polinucleotidos aislados y purificados que codifican el polipeptido correspondiente a SEQ ID NO: 1, con al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, o alternativamente al menos 85% o alternativamente al menos 90% o alternativamente al menos 95% o alter­ nativamente al menos 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1 o un equivalente, o un polinucleotido que se hibrida en condiciones rigurosas con el polinucleotido, su equivalente o su complemento y polipeptidos aislados o purificados codificados por esos polinucleotidos. Los polipeptidos y polinucleotidos se pueden combinar con sustancias de origen no natural con las que no estan asociados en la naturaleza, por ejemplo, vedculos, vedculos farmaceuticamente aceptables, vectores y moleculas del MHC, nanopadculas como se conocen en la tecnica y como se describen en esta memoria.
Los antigenos, incluidos segmentos, fragmentos y otras moleculas obtenidas a partir de una especie antigenica, incluyendo pero que no se limitan a peptidos, carbohidratos, lfpidos u otras moleculas presentados por moleculas del MHC clasicas y no clasicas de la invencion, normalmente forman complejos o se acoplan funcionalmente con una molecula del MHC o un derivado de la misma. El reconocimiento del antigeno por los linfocitos T esta restringido al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, del ingles “major histocompatibility complex”). Un linfocito T dado reconocera un antigeno solo cuando se une a una molecula particular del MHC. En general, los linfocitos T se estimulan solamente en presencia de moleculas del MHC propias y el antfgeno es reconocido como fragmentos del antfgeno unidos a moleculas propias del MHC. La restriccion del MHC define la especificidad de los linfocitos T en terminos del antfgeno reconocido y en terminos de la molecula del MHC que se une a su o sus fragmentos antigenicos. En aspectos particulares, ciertos antfgenos se aparearan con ciertas moleculas del MHC o polipeptidos obtenidos a partir de las mismas.
La expresion "acoplado funcionalmente" o "recubierto" tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a una situa­ cion en la que un polipeptido individual (por ejemplo, el MHC) y componentes antigenicos (por ejemplo, un peptido) se combinan para formar el complejo activo antes de la union al sitio diana, por ejemplo, una celula inmune. Esto incluye la situacion en la que los componentes individuales polipeptfdicos del complejo se sintetizan o se expresan de forma recombinante y posteriormente se afslan y se combinan para formar un complejo, in vitro, antes de la administracion a un sujeto; la situacion en la que se sintetiza un polipeptido quimerico o de fusion (es decir, cada componente proteico discreto del complejo esta contenido en una unica cadena de polipeptido) o se expresa de forma recombinante como un complejo intacto. Tfpicamente, los complejos de polipeptido se anaden a las nanopadculas para producir nanopartfculas con complejos de polipeptido adsorbidos o acoplados que tienen una relacion entre el numero de moleculas:numero de nanopadculas desde aproximadamente, al menos aproximadamente o como maximo aproximadamente 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 o mas a:1, mas normalmente 0,1:1, 1:1 a 50:1 o 300:1. El contenido en polipeptido de las nanopadculas se puede determinar usando tecnicas convencionales.
B. Moleculas del MHC
Los antigenos intracelulares y extracelulares presentan desaffos muy distintos para el sistema inmune, tanto en terminos de reconocimiento como de respuesta adecuada. La presentacion de antigenos a los linfocitos T esta mediada por dos clases distintas de moleculas, el MHC de clase I (MHC-I) y el MHC de clase II (MHC-II) (tambien identificado como "pMHC" en esta memoria), que utilizan distintas vfas para el procesamiento de antigenos. Los peptidos obtenidos a partir de antigenos intracelulares se presentan a los linfocitos T CD8+ a traves de las moleculas del MHC de clase I, que se expresan en practicamente todas las celulas, mientras que los peptidos obtenidos a partir de antigenos extracelulares se presentan a los linfocitos T CD4+ a traves de las moleculas del MHC-II. Sin embargo, hay ciertas excepciones a esta dicotoirna. Varios estudios han mostrado que peptidos generados a partir de protemas en partfculas sometidas a endocitosis o solubles, se presentan sobre moleculas del MHC-I en macrofagos, asf como en celulas dendnticas. En ciertas realizaciones de la invencion, un antigeno particular se identifica y se presenta en el complejo de antigeno-MHC-nanopartmula en el contexto de un polipeptido de MHC de clase I o II apropiado. En ciertos aspectos, la composicion genetica de un sujeto se puede evaluar para determinar que polipeptido del MHC se va a utilizar para un paciente particular y un conjunto particular de peptidos. En ciertas realizaciones, el componente del MHC clase I comprende toda o parte de una molecula del HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G o CD-1. En realizaciones en las que el componente del MHC es un componente del MHC de clase II, el componente del MHC de clase II puede comprender todo o parte de un HLA-DR, HLA-DQ o HLA-DP.
Tambien se contemplan moleculas no clasicas del MHC para uso en complejos del MHC de la invencion. Las molecu­ las no clasicas del MHC no son polimorficas, se conservan entre especies y poseen bolsillos de union a ligando estrechos, profundos e hidrofobos. Estos bolsillos de union son capaces de presentar glicolfpidos y fosfolfpidos a linfocitos T citoltticos naturales (NKT) o a ciertos subconjuntos de linfocitos T CD8+, tales como linfocitos T CD8+ Qa1 o restringidos a HLA-E. Los linfocitos NKT representan una poblacion unica de linfocitos que coexpresan marcadores de linfo­ citos NK y un receptor de linfocito T semi-invariante (TCR). Estan implicados en la regulacion de las respuestas inmunes asociadas con una amplia gama de enfermedades.
C. Componentes antigenicos
Ciertos aspectos de la invencion incluyen metodos y composiciones referentes a composiciones antigenicas que incluyen segmentos, fragmentos o epftopos de polipeptidos, peptidos, acidos nucleicos, carbohidratos, lfpidos y otras moleculas que provocan o inducen una respuesta antigenica, generalmente denominadas antfgenos. En particular, los segmentos o fragmentos antigenicos de determinantes antigenicos que conducen a la destruccion de una celula a traves de una respuesta autoinmune, se pueden identificar y emplear en la preparacion de un complejo de antfgeno-MHC-nanopartmula descrito en esta memoria. Las realizaciones de la invencion incluyen composiciones y metodos para la modulacion de una respuesta inmune en una celula o tejido del organismo.
Los polipeptidos y peptidos de la invencion se pueden modificar mediante diversas deleciones, inserciones y/o sustituciones de aminoacidos. En realizaciones particulares, polipeptidos y/o peptidos modificados son capaces de modular una respuesta inmune en un sujeto. En algunas realizaciones, se emplea una version de tipo silvestre de una protema o peptido, sin embargo, en muchas realizaciones de la invencion, se emplea una protema o un polipeptido modificado para generar un complejo de antigeno-MHC-nanopartmula. Un complejo de antigeno-MHC-nanopartmula se puede utilizar para generar una respuesta inmune antiinflamatoria, para modificar la poblacion de linfocitos T del sistema inmune (es decir, reeducar el sistema inmune) y/o promover el reclutamiento y la acumulacion de linfocitos T antiinflamatorios en un tejido particular. Los terminos que se han descrito anteriormente se pueden usar de manera intercambiable en la presente memoria. Una "protema modificada" o un "polipeptido modificado" o un "peptido modificado" se refiere a una protema o un polipeptido cuya estructura qmmica, en particular su secuencia de aminoacidos, se altera con respecto a la protema o el polipeptido de tipo silvestre. En algunas realizaciones, una protema o un polipeptido o un peptido modificado tiene al menos una actividad o funcion modificada (reconociendo que las protemas o los polipeptidos o los peptidos pueden tener multiples actividades o funciones). Se contempla espedficamente que una pro­ tema o polipeptido o peptido modificado se puede alterar con respecto a una actividad o funcion que todavfa conserva una actividad o funcion de tipo silvestre en otros aspectos, tales como la inmunogenicidad o la capacidad de interaccionar con otras celulas del sistema inmune en el contexto de un complejo de MHC-nanopartmula.
Los antfgenos de la invencion incluyen antfgenos relacionados con la esclerosis multiple. Tales antfgenos incluyen, por ejemplo, los descritos en el documento de solicitud de patente de EE.UU. n°2012-0077686, y antfgenos obtenidos a partir de la protema basica de la mielina, la glicoprotema asociada a la mielina, la protema de la mielina de oligodendrocitos, la protema proteolipfdica, la oligoprotema de la mielina de oligodendrocitos, la protema basica de oligodendrocitos asociada con la mielina, la protema espedfica de oligodendrocitos, las protemas de choque termico, las pro­ temas espedficas de oligodendrocitos NOGO A, la glicoprotema Po, la protema de la mielina periferica 22 y 2'3'-nucleotido dclico 3'-fosfodiesterasa. En ciertas realizaciones, el antfgeno se obtiene a partir de un antfgeno que se obtiene de la glicoprotema de mielina de oligodendrocitos (MOG, por sus siglas en ingles). En una realizacion relacionada, el antfgeno se corresponde con un peptido que tiene al menos 80% de identidad con un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO: 1 o un polipeptido codificado por un polinucleotido que se hibrida en condiciones de moderadamente rigurosas a muy rigurosas con un polinucleotido que codifica una secuencia de SEQ ID NO: 1 o uno que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de SEQ ID NO: 1 o un complemento de la misma.
En algunas realizaciones, el tamano de una protema o un polipeptido (de tipo silvestre o modificado), incluyendo cualquier complejo de una protema o un peptido de interes y, en particular una fusion de MHC-peptido, puede comprender, pero sin limitarse a 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 , 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160 , 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 244, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100,1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 moleculas de aminoacidos o mas, incluyendo cualquier intervalo o valor derivable en el mismo o derivado del mismo. En ciertos aspectos, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas aminoacidos contiguos, incluyendo derivados de los mismos y fragmentos de un antigeno, tales como aquellas secuencias de aminoacidos dadas a conocer y a las que se hace referencia en esta memoria, se pueden utilizar como antfgenos. Se contempla que los polipeptidos se pueden mutar mediante truncamiento, haciendolos mas cortos que su correspondiente forma de tipo silvestre, pero tambien se pueden alterar fusionando o conjugando una secuencia de protema heterologa con una funcion particular (por ejemplo, para la presentacion como un complejo de protema, para aumentar la inmunogenicidad, etc.).
Las composiciones protemicas se pueden preparar mediante cualquier tecnica conocida por los expertos en la tecnica, incluyendo (i) la expresion de protemas, polipeptidos o peptidos a traves de tecnicas de biologfa molecular convencionales, (ii) el aislamiento de compuestos protemicos a partir de fuentes naturales o (iii) la smtesis qmmica de materiales protemicos. El nucleotido asf como las secuencias de protemas, polipeptidos y peptidos para diversos genes se han descrito previamente y se pueden encontrar en bases de datos informatizadas reconocidas. Una de esas bases de datos es la base de datos de GenBank y GenPept del National Center for Biotechnology Information (en internet en ncbi.nlm.nih.gov/). La totalidad o parte de las regiones codificantes de estos genes se puede amplificar y/o expresar utilizando las tecnicas descritas en la presente memoria o como senan conocidas por los expertos en la tecnica.
Las variantes de secuencia de aminoacidos de epttopos autoantigenicos y otros polipeptidos de estas composiciones, pueden ser variantes por sustitucion, insercion o delecion. Una modificacion en un polipeptido de la invencion puede afectar a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112,113,114,115,116,117,118,119,120,121,122,123,124,125,126,127,128,129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159. 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, l73, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 18b, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 198,199, 200, 201, 202, 203, 204, 205 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496 497, 498, 499, 500 o mas acidos aminoacidos contiguos o no contiguos de un peptido o un polipeptido, en comparacion con el tipo silvestre.
Las variantes por delecion carecen tfpicamente de uno o varios residuos de la secuencia de aminoacidos natural o de tipo silvestre. Se pueden eliminar residuos individuales o se pueden eliminar varios aminoacidos contiguos. Se puede introducir un codon de detencion (por sustitucion o insercion) en una secuencia de acido nucleico codificante para generar una protema truncada. Los mutantes por insercion implican tfpicamente la adicion de material en un punto no terminal en el polipeptido. Esto puede incluir la insercion de uno o varios residuos. Tambien se pueden generar adiciones terminales, denominadas protemas de fusion.
Las variantes por sustitucion tfpicamente contienen el intercambio de un aminoacido por otro en uno o varios sitios dentro de la protema, y se pueden disenar para modular una o varias propiedades del polipeptido, con o sin perdida de otras funciones o propiedades. Las sustituciones pueden ser conservadoras, es decir, se reemplaza un aminoacido por uno de forma y carga similares. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la tecnica e incluyen, por ejemplo, los cambios de: alanina a serina; arginina a lisina; asparagina a glutamina o histidina; aspartato a glutamato; cistema a serina; glutamina a asparagina; glutamato a aspartato; glicina a prolina; histidina a asparagina o glutamina; isoleucina a leucina o valina; leucina a valina o isoleucina; lisina a arginina; metionina a leucina o isoleucina; fenilalanina a tirosina, leucina o metionina; serina a treonina; treonina a serina; triptofano a tirosina; tirosina a triptofano o fenilalanina; y valina a isoleucina o leucina. Alternativamente, las sustituciones pueden ser no conservadoras de tal manera que se afecta a una funcion o actividad de un polipeptido o peptido, tal como la avidez o la afinidad hacia un receptor o receptores celulares. Los cambios no conservadores tipicamente implican la sustitucion de un residuo por uno que sea qmmicamente distinto, tal como un aminoacido polar o cargado por un aminoacido no polar o no cargado, y viceversa.
Las protemas de la invencion pueden ser recombinantes o estar sintetizadas in vitro. Alternativamente, una protema recombinante se puede aislar a partir de bacterias u otras celulas hospedadoras.
Tambien se entendera que las secuencias de aminoacidos y de acidos nucleicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoacidos C-terminales o N-terminales adicionales o secuencias 5' o 3' de acido nucleico, respectivamente y sin embargo todavfa ser esencialmente como se exponen en una de las secuencias descritas en la presente memoria, siempre que la secuencia cumpla los criterios establecidos anteriormente, incluyendo el mantenimiento de la actividad de la protema biologica (por ejemplo, la inmunogenicidad). La adicion de secuencias terminales se aplica particularmente a secuencias de acidos nucleicos que, por ejemplo, pueden incluir diversas secuencias no codificantes que flanquean cualquiera de las porciones 5' o 3' de la region codificante.
Se contempla que en las composiciones de la invencion, hay entre aproximadamente 0,001 mg y aproximadamente 10 mg de protema total por ml. Por lo tanto, la concentracion de protema en una composicion puede ser de aproxima­ damente, al menos aproximadamente o como maximo aproximadamente 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 50, 100 pg/ml o mg/ml o mas (o cualquier intervalo derivable en el mismo). De esta cantidad, aproximadamente, al menos aproxima­ damente o como maximo aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% puede ser el complejo de antfgeno-MHC-nanopartmula.
La presente invencion contempla la administracion de un complejo de antfgeno-MHC-nanopartmula para efectuar un tratamiento contra la EM y/o una inflamacion asociada con la Em .
Ademas, el documento de patente de EE.UU. n° 4.554.101 (Hopp), describe la identificacion y la preparacion de epftopos a partir de secuencias de aminoacidos primarios basandose en la hidrofilicidad. A traves de los metodos descritos por Hopp, un experto en la tecnica sena capaz de identificar epftopos potenciales a partir de una secuencia de aminoacidos y confirmar su inmunogenicidad. Numerosas publicaciones cientfficas tambien se han dedicado a la prediccion de la estructura secundaria y la identificacion de epftopos, a partir de analisis de secuencias de aminoacidos (Chou & Fasman, Adv. Enzymol., 47:45-148,1978; Chous y Fasman, Annu, Rev. Biochem., 47:251-276,1978, Chou y Fasman, Biochemistry, 13(2):211 -222, 1974; Chau y Fasman, Biochemistry, 13(2):222-245, 1974, Chou y Fasman, Biophys. J., 26(3):385-399, 1979). Cualquiera de ellas se puede usar, si se desea, para complementar las descripciones de Hopp en la patente de EE.UU. n° 4.554.101.
Se pueden emplear moleculas distintas de los peptidos como antfgenos o fragmentos antigenicos en un complejo con moleculas del MHC, tales moleculas incluyen, pero sin limitarse a hidratos de carbono, ftpidos, moleculas pequenas y similares. Los hidratos de carbono son componentes principales de la superficie exterior de una variedad de celulas. Ciertos hidratos de carbono son caractensticas de diferentes estadios de la diferenciacion y muy a menudo esos hidratos de carbono son reconocidos por anticuerpos espedficos. La expresion de distintos hidratos de carbono se puede restringir a tipos celulares espedficos.
D. Sustratos/nanopartmulas
En cierto aspecto, los complejos de antfgeno/MHC estan acoplados funcionalmente a un sustrato, los cuales se puede unir covalentemente o no covalentemente al sustrato. Un sustrato puede estar en forma de nanopartmula que comprende opcionalmente un material biocompatible y/o bioabsorbible. Por consiguiente, en una realizacion, la nanoparticula es biocompatible y/o bioabsorbible. Un sustrato tambien puede estar en forma de nanopartmula, tal como las descritas previamente en el documento de publicacion de patente de EE.UU. n° 2009/0155292, que en un aspecto no es un liposoma. Las nanopartmulas pueden tener una estructura de dimension variable y conocida diversamente como nanoesfera, una nanopartmula o una nanoesfera biodegradable biocompatible o una nanopartmula biodegradable bio­ compatible. Tales formulaciones en forma de partmulas que contienen un complejo de antfgeno/MHC pueden estar formadas mediante un acoplamiento covalente o no covalente del complejo con la nanopartmula.
Las nanopartmulas normalmente consisten en un nucleo sustancialmente esferico y, opcionalmente, una o varias ca­ pas. El nucleo puede variar en tamano y composicion. Ademas del nucleo, la nanopartmula puede tener una o varias capas para proporcionar funcionalidades apropiadas para las aplicaciones de interes. Los espesores de las capas, si estan presentes, pueden variar dependiendo de las necesidades de las aplicaciones espedficas. Por ejemplo, las capas pueden impartir propiedades opticas utiles.
Las capas tambien pueden impartir funcionalidades qmmicas o biologicas, denominadas en esta memoria como capas qmmicamente activas o biologicamente activas, y para esas funcionalidades la capa o las capas pueden variar nor­ malmente en espesor desde aproximadamente 0,001 micrometres (1 nanometre) a aproximadamente 10 micrometres o mas (dependiendo del diametro de nanopartfcula deseado), estas capas normalmente se aplican sobre la superficie exterior de la nanopartfcula.
Las composiciones del nucleo y las capas pueden variar. Los materiales adecuados para las partfculas o el nucleo incluyen, pero no se limitan a poKmeros, ceramicas, vidrios, minerales y similares. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, vidrios convencionales y especiales, sflice, poliestireno, poliester, policarbonato, polfmeros acnlicos, poliacrilamida, poliacrilonitrilo, poliamida, fluoropoKmeros, siliconas, celulosas, silicio, metales (por ejemplo, hierro, oro, plata), minerales (por ejemplo, rubf), nanopartfculas (por ejemplo, nanopartfculas de oro, partfculas coloidales, oxidos metalicos, sulfuros metalicos, seleniuros metalicos y materiales magneticos, tales como oxido de hierro) y combinaciones de los mismos. El nucleo podna ser de una composicion homogenea o una combinacion de dos o mas clases de materiales en funcion de las propiedades deseadas. En ciertos aspectos, se utilizaran nanopartfculas metalicas. Estas partfculas o nanopartfculas metalicas se pueden formar a partir de Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si e In, precursores, sus aleaciones binarias, sus aleaciones ternarias y sus compuestos intermetalicos. Vease el documento de patente de EE.UU. n° 6.712.997. En ciertas realizaciones, las composiciones del nucleo y las capas pueden variar con la condicion de que las nanopartfculas sean biocompatibles y bioabsorbibles. El nucleo podna ser de una composicion homogenea o una combinacion de dos o mas clases de materiales en funcion de las propiedades deseadas. En ciertos aspectos, se utilizaran nanoesferas de metal. Estas nanopartfculas metalicas pueden formarse a partir de Fc, Ca, Ga y similares. En ciertas realizaciones, la nanopartfcula comprende un nucleo que comprende metal u oxido de metal.
Como se ha mencionado anteriormente, la nanopartfcula puede incluir ademas del nucleo, una o varias capas. La nanopartfcula puede incluir una capa que consiste en un azucar biodegradable u otro polfmero. Ejemplos de capas biodegradables incluyen pero no se limitan a dextrano; polietilenglicol; poli(oxido de etileno); manitol; poliesteres basados en polilactida (PLA), poliglicolido (PGA), policaprolactona (PCL); polihidroxialcanoatos de la clase PHB-PHV; y otros polisacaridos modificados, tales como almidon, celulosa y quitosano. Ademas, la nanopartfcula puede incluir una capa con superficies adecuadas para la fijacion de funcionalidades qrnmicas para sitios de union o de acoplamiento qrnmico.
Las capas se pueden producir sobre las nanopartfculas en una variedad de formas conocidas por los expertos en la tecnica. Los ejemplos incluyen tecnicas de qrnmica de sol-gel, como se describen en Iler, Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979; Brinker y Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990). Enfoques adicionales para la produccion de capas sobre nanopartfculas incluyen tecnicas de qrnmica de superficies y de encapsulacion tal como se describen en Partch y Brown, J. Adhesion, 67: 259-276, 1998; Pekarek et al., Nature, 367: 258, (1994); Hanprasopwattana, Langmuir, 12: 3173-3179, (1996); Davies, Advanced Materials, 10: 1264-1270, (1998); y referencias en las mismas. Tambien se pueden emplear tecnicas de deposicion con vapor; vease, por ejemplo Golman y Shinohara, Trends Chem. Engin., 6: 1-6, (2000); y el documento de patente de EE.UU. n° 6.387.498. Todavfa otros enfoques incluyen tecnicas de autoensamblaje capa por capa, como se describen en Sukhorukov et al., Polymers Adv. Tech., 9(10-11): 759-767, (1998); Caruso et al., Macromolecules, 32(7): 2317-2328, (1998); Caruso et al., J. Amer. Chem. Soc., 121(25): 6039-6046, (1999); el documento de patente de Ee .UU. n° 6.103.379 y las referencias citadas en las mismas.
Las nanopartfculas se pueden formar poniendo en contacto una fase acuosa que contiene el complejo de antfgeno/MHC/molecula coestimuladora y un polfmero y una fase no acuosa, seguido de evaporacion de la fase no acuosa para provocar la coalescencia de partfculas desde la fase acuosa, como se describe en el documento de patente de EE.UU. n° 4.589.330 o 4.818.542. Los polfmeros preferidos para tales preparaciones son copolfmeros o polfmeros naturales o sinteticos, seleccionados a partir del grupo que consiste en agar de gelatina, almidon, arabinogalactano, albumina, colageno, poli(acido glicolico), poli(acido lactico), glicolida-L(-)lactida poli(epsilon-caprolactona, poli(epsiloncaprolactona-CO-acido lactico), poli(epsilon-caprolactona-CO-acido glicolico), poli(acido p-hidroxi butmco), poli(oxido de etileno), polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), poli(metacrilato de hidroxietilo), poliamidas, poli(aminoacidos), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), poli(urea ester), poli(L-fenilalanina/etilenglicol/1,6-diisocianatohexano) y poli(metacrilato de metilo). Los polfmeros particularmente preferidos son poliesteres, tales como poli(acido glicolico), poli(acido lactico), glicolida-L(-)lactida poli(epsilon-caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO-acido lactico) y poli(epsilon-caprolactona-CO-acido glicolico). Los disolventes utiles para disolver el polfmero incluyen: agua, hexafluoroisopropanol, cloruro de metileno, tetrahidrofurano, hexano, benceno o sesquihidrato de hexafluoroacetona.
El tamano de la nanopartfcula puede variar desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1 pm. En ciertas reali­ zaciones, la nanopartfcula es menor de aproximadamente 1 pm de diametro. En otras realizaciones, la nanopartfcula es menor de aproximadamente 500 nm, menor de aproximadamente 400 nm, menor de aproximadamente 300 nm, menor de aproximadamente 200 nm, menor de aproximadamente 100 nm o menor de aproximadamente 50 nm de diametro. En realizaciones adicionales, la nanopartfcula tiene un diametro de aproximadamente 1 nm a aproximada­ mente 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 75 nm o 100 nm. En realizaciones especfficas, la nanopartfcula es de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 100 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 50 nm, de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 20 nm o de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm.
El tamano del complejo puede variar de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 1 pm. En ciertas realizaciones, el complejo es menor de aproximadamente 1 pm o alternativamente menor de 100 nm de diametro. En otras realiza­ ciones, el complejo es menor de aproximadamente 500 nm, menor de aproximadamente 400 nm, menor de aproxima­ damente 300 nm, menor de aproximadamente 200 nm, menor de aproximadamente 100 nm o menor de aproximadamente 50 nm de diametro. En realizaciones adicionales, el complejo es de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 50 nm o de aproximadamente 20 nm a aproximadamente 75 nm o de aproximadamente 25 nm a aproximadamente 60 nm o de aproximadamente 30 nm a aproximadamente 60 nm, o en un aspecto aproximadamente 55 nm.
E. Acoplamiento del complejo de antigeno-MHC con la nanopartfcula
Con el fin de acoplar el sustrato o nanoesferas con los complejos de antigeno-MHC, se pueden aplicar las siguientes tecnicas.
La union se puede generar modificando qmmicamente el sustrato o la nanopartfcula la que normalmente implica la generacion de "grupos funcionales" en la superficie, siendo capaces dichos grupos funcionales de unirse a un complejo de antigeno-MHC, y/o uniendo la superficie opcionalmente modificada qmmicamente del sustrato o de la nanopartfcula con las llamadas "moleculas de enlace" unidas covalentemente o no covalentemente, seguido de hacer reaccionar el complejo de antigeno-MHC con las nanopartfculas obtenidas.
La expresion "molecula de enlace" significa una sustancia capaz de unirse con el sustrato o la nanopartfcula y tambien capaz de unirse a un complejo de antigeno-MHC. En ciertas realizaciones, los complejos de antigeno-MHC se acoplan a la nanopartfcula mediante un enlazador. Ejemplos no limitantes de enlazadores adecuados incluyen enlazadores de dopamina (DPA)-polietilenglicol (PEG), tales como ester de DPA-PEG-NHS ester, DPA-PEG-disulfuro de ortopiridilo (OPSS) y/o DPA-PEG-azida. Otros enlazadores incluyen enlazadores peptfdicos, etilenglicol, biotina y estreptavidina.
La expresion "grupos funcionales" tal y como se ha empleado anteriormente en la presente memoria, no se limita a grupos qmmicos reactivos que forman enlaces covalentes, sino que tambien incluye grupos qmmicos que conducen a una interaccion ionica o puentes de hidrogeno con el complejo de antigeno-MHC. Por otra parte, hay que senalar que una distincion estricta entre "grupos funcionales" generados en la superficie y moleculas de enlace que son portadoras de "grupos funcionales", no es posible, ya que a veces la modificacion de la superficie requiere la reaccion de moleculas de enlace mas pequenas, tales como etilenglicol, con la superficie de la nanoesfera.
Los grupos funcionales o las moleculas de enlace que los transportan se pueden seleccionar a partir de grupos amino, grupos de
acido carbonico, tioles, tioeteres, disulfuros, guanidino, grupos hidroxilo, grupos amino, dioles vecinos, aldehfdos, gru­ pos alfa-haloacetilo, organilos de mercurio, grupos ester, haluro de acido, tioester de acido, anfndrido de acido, isocianatos, isotiocianatos, haluros de acido sulfonico, imidoesteres, diazoacetatos, sales de diazonio, 1,2-dicetonas, acidos fosfonicos, esteres de acido fosforico, acidos sulfonicos, azolidas, imidazoles, indoles, N-maleimidas, compuestos de carbonilo insaturados en alfa-beta, arilhaluros o sus derivados.
Ejemplos no limitantes para otras moleculas de enlace con pesos moleculares mas altos, son moleculas de acidos nucleicos, polfmeros, copolfmeros, agentes de acoplamiento polimerizables, sflice, protemas y moleculas tipo cadena que tienen una superficie con la polaridad opuesta con respecto al sustrato o la nanopartfcula. Los acidos nucleicos pueden proporcionar un enlace a moleculas de afinidad que contienen moleculas de acido nucleico propias, aunque con una secuencia complementaria con respecto a la molecula de enlace.
Un ejemplo espedfico de un enlazador covalente incluye polietilenglicol (PEG). El enlazador PEG puede ser un enla­ zador tiol-PEG-NH2.
En ciertas realizaciones, el enlazador tal y como se describe en la presente memoria, tiene un tamano definido. En algunas realizaciones, el enlazador es menor de aproximadamente 10 kD, menor de aproximadamente 5 kD, menor de aproximadamente 4,5 kD, menor de aproximadamente 4 kD, menor de aproximadamente 3,5 kD, menor de apro­ ximadamente 3 kD, menor de aproximadamente 2,5 kD, menor de aproximadamente 2 kD o menor de aproximada­ mente 1 kD. En realizaciones adicionales, el enlazador tiene de aproximadamente 0,5 kD a aproximadamente 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5 o 1 kD. En aun otras realizaciones, el enlazador tiene de aproximadamente 1 a aproximadamente, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2 o 1,5 kD.
Como ejemplos de agentes de acoplamiento polimerizables, se pueden citar diacetileno, estireno butadieno, acetato de vinilo, acrilato, acrilamida, compuestos de vinilo, estireno, oxido de silicio, oxido de boro, oxido de fosforo, boratos, pirrol, polipirrol y fosfatos.
La superficie del sustrato o nanopartfcula se puede modificar qmmicamente, por ejemplo, mediante la union de deri­ vados de acido fosfonico que tienen grupos funcionales reactivos. Un ejemplo de esos derivados de acido fosfonico o ester de acido fosfonico es acido imino-bis(metilenfosfono)carbonico que se puede sintetizar de acuerdo con la reac­ cion "Mannich-Moedritzer". Esta reaccion de union se puede realizar con el sustrato o la nanoesfera tal y como se obtiene directamente a partir del procedimiento de preparacion o despues de un pretratamiento (por ejemplo con bromuro de trimetilsililo). En el primer caso, el derivado (ester) de acido fosfonico, por ejemplo, puede desplazar los componentes del medio de reaccion que todavfa estan unidos a la superficie. Este desplazamiento se puede mejorar a temperaturas mas altas. El bromuro de trimetilsililo, por el contrario, se cree que desalquila los agentes que forman un complejo a base de fosforo que contienen un grupo alquilo, creando de este modo nuevos sitios de union para el derivado (ester) de acido fosfonico. El derivado (ester) de acido fosfonico o las moleculas de enlace unidas al mismo, pueden mostrar los mismos grupos funcionales que los que se han proporcionado anteriormente. Un ejemplo adicional del tratamiento de la superficie del sustrato o la nanoesfera implica el calentamiento en un diol tal como etilenglicol. Cabe senalar que este tratamiento puede ser redundante si la smtesis ya procedio en un diol. En esas circunstancias, el producto de la smtesis obtenido directamente es probable que muestre los grupos funcionales necesarios. Este tratamiento sin embargo es aplicable a un sustrato o a una nanopartmula que se habfa producido en agentes formadores de complejos que conteman N o P. Si un sustrato o partmula de ese tipo se somete a un tratamiento posterior con etilenglicol, los ingredientes del medio de reaccion (por ejemplo, el agente formador de complejo) que todavfa se unen a la superficie, se pueden reemplazar por el diol y/o se pueden desalquilar.
Tambien es posible reemplazar los agentes que forman complejos que contienen N todavfa unidos a la superficie de la partmula por derivados de aminas primarias que tienen un segundo grupo funcional. La superficie del sustrato o de la nanopartmula tambien se puede recubrir con sffice. La sflice permite una conjugacion qrnmica relativamente simple de moleculas organicas ya que la sflice reacciona facilmente con enlazadores organicos, tales como trietoxisilano o clorosilano. La superficie de las nanopartmulas tambien se puede recubrir con homopolfmeros o copolfmeros. Ejemplos de agentes de acoplamiento polimerizables son N-(3-aminopropil)-3-mercaptobenzamidina, 3-(trimetoxisilil)propilhidrazida y 3-(trimetoxisilil)propilmaleimida. Otros ejemplos no limitantes de agentes de acoplamiento polimerizables se mencionan en esta memoria. Estos agentes de acoplamiento se pueden utilizar solos o en combinacion dependiendo del tipo de copolfmero que se va a generar como recubrimiento.
Otra tecnica de modificacion de la superficie que se puede usar con sustratos o nanopartmulas que contienen compuestos de metales de transicion de tipo oxido es la conversion de los compuestos de metales de transicion de tipo oxido mediante gas cloro o agentes de cloracion organicos, en los oxicloruros correspondientes. Estos oxicloruros son capaces de reaccionar con nucleofilos, tales como grupos hidroxi o amino ya que se encuentran frecuentemente en las biomoleculas. Esta tecnica permite la generacion de una conjugacion directa con protemas, por ejemplo, a traves del grupo amino de las cadenas laterales de lisina. La conjugacion con protemas despues de la modificacion de la superficie con oxicloruros puede efectuarse tambien mediante el uso de un enlazador bifuncional, tal como hidrazida de acido maleimidopropionico.
Para las tecnicas de union no covalentes, las moleculas de tipo cadena que tienen una polaridad o carga opuesta a la de la superficie del sustrato o la nanoesfera, son particularmente adecuadas. Ejemplos de moleculas de enlace que pueden estar unidas covalentemente a nanoesferas del nucleo/recubrimiento, implican tensioactivos anionicos, cationicos o ionicos bipolares, protemas acidas o basicas, poliaminas, poliamidas, polisulfona o poli(acido carboxffico). La interaccion hidrofoba entre el sustrato o la nanoesfera y el reactivo anfifflico que tiene un grupo reactivo funcional, puede generar el enlace necesario. En particular, son utiles las moleculas de tipo cadena con caracter anfifflico, tales como fosfolfpidos o polisacaridos derivatizados, que se pueden reticular entre s f La absorcion de esas moleculas sobre la superficie se puede lograr mediante coincubacion. La union entre la molecula de afinidad y el sustrato o la nanopartmula tambien se puede basar en enlaces no covalentes, autoorganizables. Un ejemplo de los mismos implica sondas de deteccion simples con biotina como molecula de enlace y moleculas acopladas con avidina o estreptavidina.
Protocolos para las reacciones de acoplamiento de grupos funcionales a moleculas biologicas se pueden encontrar en las publicaciones, por ejemplo en "Bioconjugate Techniques" (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996). La molecula biologica (por ejemplo, una molecula del MHC o un derivado de la misma) se puede acoplar a la molecula de enlace, de forma covalente o no covalente, de conformidad con procedimientos convencionales de qrnmica organica, tales como oxidacion, halogenacion, alquilacion, acilacion, adicion, sustitucion o amidacion. Estos metodos para el acoplamiento de la molecula de enlace unida covalentemente o no covalentemente se pueden aplicar antes del acoplamiento de la molecula de enlace al sustrato o a la nanoesfera, o despues. Ademas, es posible, por medio de una incubacion, efectuar una union directa de las moleculas a un sustrato o una nanopartmula pretratada correspondientemente (por ejemplo, con bromuro de trimetilsililo), la cual muestra una superficie modificada debido a este pretratamiento (por ejemplo, una mayor carga o superficie polar).
F. Produccion de protemas
La presente invencion describe polipeptidos, peptidos y protemas para uso en diversas realizaciones de la presente invencion. Por ejemplo, peptidos espedficos y sus complejos se someten a ensayo en cuanto a sus capacidades para inducir o modular una respuesta inmune. En realizaciones espedficas, la totalidad o parte de los peptidos o protemas de la invencion tambien se pueden sintetizar en solucion o sobre un soporte solido de acuerdo con tecnicas conven­ cionales. Varios sintetizadores automaticos estan disponibles comercialmente y se pueden utilizar de acuerdo con protocolos conocidos. Veanse, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. Ed, Pierce Chemical Co.1, (1984.); Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105: 6442, (1983); Merrifield, Science, 232 (4748): 341-347, (1986); y Barany y Merrifield, The Peptides, Gross y Meinhofer (compiladores), Academic Press, Nueva York, 1-284, (1979).
Alternativamente, la tecnologfa de ADN recombinante se puede emplear en la que una secuencia de nucleotidos que codifica un peptido de la invencion se inserta en un vector de expresion, se transforma o se transfecta en una celula hospedadora apropiada y se cultiva en condiciones adecuadas para la expresion.
Una realizacion de la invencion incluye el uso de la transferencia de genes a las celulas, incluyendo microorganismos, para la produccion de protemas. El gen de la protema de interes se puede transferir a celulas hospedadoras apropiadas seguido por un cultivo de las celulas en las condiciones apropiadas. Se puede emplear un acido nucleico que codifica virtualmente cualquier polipeptido. La generacion de vectores de expresion recombinantes y los elementos incluidos en los mismos, son conocidos por un experto en la tecnica y se describen brevemente en esta memoria. Ejemplos de lmeas celulares hospedadoras de mairnfero incluyen, pero no se limitan, a celulas Vero y HeLa, otras lmeas de linfocitos B y T, tales como CEM, 721.221, H9, Jurkat, Raji, asf como las lmeas de celulas de ovario de hamster chino, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN y celulas MDCK. Adicionalmente, una cepa de celulas hospedadoras se puede seleccionar de forma que module la expresion de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto genico en la manera deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilacion) y procesamiento (por ejemplo, escision) de productos proteicos puede ser importante para la funcion de la protema. Diferentes celulas hospedadoras tienen mecanismos caractensticos y espedficos para el procesamiento postraduccional y la modificacion de protemas. Las lmeas celulares o sistemas hospedadores apropiados se pueden elegir para asegurar la modificacion y el procesamiento correctos de la protema extrana expresada.
Se puede emplear una variedad de sistemas de seleccion, incluyendo, pero no limitados a los genes de timidina cinasa de HSV, hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa y adenina fosforribosiltransferasa en celulas tk, hgprt o aprt, respectivamente. Tambien, una resistencia a antimetabolito se puede usar como base para la seleccion: para dhfr, que confiere resistencia a la trimetoprima y el metotrexato; gpt, que confiere resistencia al acido micofenolico; neo, que confiere resistencia al aminoglucosido G418; e hygro, que confiere resistencia a la higromicina.
G. Acidos nucleicos
La presente invencion puede incluir polinucleotidos recombinantes que codifican las protemas, los polipeptidos, los peptidos de la invencion, tales como, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 o 2.
En realizaciones particulares, la invencion se refiere a segmentos aislados de acidos nucleicos y vectores recombi­ nantes que incorporan secuencias de acidos nucleicos que codifican un autoantfgeno y/o una molecula del MHC. El termino "recombinante" se puede usar junto con un polipeptido o el nombre de un polipeptido espedfico y este se refiere en general a un polipeptido producido a partir de una molecula de acido nucleico que ha sido manipulada in vitro o que es un producto de la replicacion de esa molecula.
Los segmentos de acido nucleico usados en la presente invencion, independientemente de la longitud de la propia secuencia codificante, se pueden combinar con otras secuencias de acidos nucleicos, tales como promotores, senales de poliadenilacion, sitios adicionales de enzimas de restriccion, sitios de clonacion multiple, otros segmentos codificantes y similares, de modo que su longitud total puede variar considerablemente. Por tanto, se contempla que se puede emplear un fragmento de acido nucleico de casi cualquier longitud, en donde la longitud total preferiblemente se limita por la facilidad de preparacion y el uso en el protocolo de acido nucleico recombinante previsto. En algunos casos, una secuencia de acido nucleico puede codificar una secuencia de polipeptido con secuencias codificantes heterologas adicionales, por ejemplo, para permitir una purificacion del polipeptido, transporte, secrecion, modificacion postraduccional o para beneficios terapeuticos, tales como el direccionamiento o la eficacia. Se puede anadir un marcador u otro polipeptido heterologo a la secuencia que codifica el polipeptido modificado, en donde "heterologo" se refiere a un polipeptido que no es el mismo que el polipeptido modificado.
IV. Composiciones farmaceuticas y administracion
En la presente memoria se proporcionan composiciones farmaceuticas utiles para el tratamiento de una enfermedad.
A. Composiciones farmaceuticas
Los complejos de nanopartmulas y antfgeno-MHC se pueden administrar solos o en combinacion con un vehmulo, tal como un veldculo farmaceuticamente aceptable en una composicion. Las composiciones de la invencion se pueden administrar convencionalmente de forma parenteral, mediante inyeccion, por ejemplo, por via intravenosa, subcutanea o intramuscular. Formulaciones adicionales que son adecuadas para otros modos de administracion incluyen formulaciones orales. Las formulaciones orales incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, grados farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones estan en forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, pfldoras, capsulas, formulaciones de liberacion sostenida o polvos y contienen de aproximadamente 10% a aproximadamente 95% de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 25% a aproximadamente 70%. La preparacion de una com­ posicion acuosa que contiene un complejo de antigeno-MHC-nanopartmula que modifica el estado inmune del sujeto, es conocida por los expertos en la tecnica de cara a la presente descripcion. En ciertas realizaciones, una composicion se puede inhalar (por ejemplo, documento de patente de EE.UU. n° 6.651.655). En una realizacion, el complejo de antigeno-MHC-nanopartmula se administra sistemicamente.
Tfpicamente, las composiciones de la invencion se administran de una manera compatible con la formulacion de la dosificacion y en una cantidad tal como si fuera terapeuticamente eficaz e inmunomodificadora. La cantidad que se va a administrar depende del sujeto que se va a tratar. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser administradas dependen del juicio del medico. Sin embargo, unos intervalos de dosificacion adecuados son del orden de diez a varios cientos de nanogramos o microgramos de complejo de antigeno-MHC-nanopartmula por administracion. Los regfmenes adecuados para una administracion inicial y para los refuerzos tambien son variables, pero estan tipificados por una administracion inicial seguida de administraciones posteriores.
En muchos casos, sera deseable tener multiples administraciones de un complejo de peptido-MHC-nanopartfcula, aproximadamente, a lo sumo aproximadamente o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas. Las admi­ nistraciones normalmente oscilaran entre 2 dfas a intervalos de doce semanas, mas habitualmente a intervalos desde una semana a dos semanas. Refuerzos periodicos a intervalos de 0,5-5 anos, por lo general dos anos, pueden ser deseables para mantener el estado del sistema inmune. El curso de las administraciones puede venir seguido por ensayos de respuestas inmunes inflamatorias y/o actividad de los linfocitos T autorreguladores.
En algunas realizaciones, las composiciones farmaceuticas se administran a un sujeto. Diferentes aspectos de la presente invencion implican la administracion de una cantidad eficaz de una composicion de complejo de antigeno-MHC-nanopartfcula a un sujeto. Adicionalmente, tales composiciones se pueden administrar en combinacion con modificadores del sistema inmune. Tales composiciones generalmente se disuelven o dispersan en un vehuculo farma­ ceuticamente aceptable o en medio acuoso.
Las expresiones "farmaceuticamente aceptable" o "farmacologicamente aceptable" se refieren a entidades moleculares y a composiciones que no producen una reaccion adversa, alergica u otra cuando se administran a un animal o un ser humano. Tal y como se usa en esta memoria, "vehfculo farmaceuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardadores de la absorcion y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmaceuticas activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los ingredientes activos, se contempla su uso en composiciones inmunogenicas y terapeuticas.
Las formas farmaceuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que se pueda inyectar facilmente. Tambien debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe preservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las composiciones se pueden formular en una forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables, inclu­ yen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhudrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico, mandelico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien se pueden obtener a partir de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o hierro y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procama y similares.
El vehfculo puede ser un disolvente o un medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante el uso de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos se puede facilitar con varios agentes antibacterianos y antifun­ gicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico, timerosal y similares. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. Una absorcion prolongada de las composi­ ciones inyectables se puede facilitar mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion. La esterilizacion de la solucion se realizara de manera que no se reduzcan las propiedades terapeuticas del complejo de antigeno-MHC-nanopartfcula. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehfculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingre­ dientes requeridos de los mencionados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos de preparacion preferidos son las tecnicas de secado al vacfo y liofilizacion, que producen un polvo del ingrediente activo, mas cualquier ingrediente adicional deseado procedente de una solucion previamente esterilizada del mismo. Un metodo de esterilizacion de la solucion de este tipo es la filtracion esteril, sin embargo, se entiende que esta invencion incluye cualquier metodo de esterilizacion que no disminuya significativamente las propiedades terapeuticas de los complejos de antigeno-MHC-nanopartfcula. Los metodos de esterilizacion que implican un calor y presion intensos, tales como la esterilizacion en autoclave, pueden afectar a la estructura terciaria del complejo, disminuyendo de este modo significativamente las propiedades terapeuticas de los complejos de antfgeno-MHC-nanopartfcula.
Una cantidad eficaz de la composicion terapeutica se determina basandose en el objetivo previsto. La expresion "dosis unitaria" o "dosificacion" se refiere a unidades ffsicamente discretas, adecuadas para uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composicion calculada para producir las respuestas deseadas descritas anteriormente, en asociacion con su administracion, es decir, la via y el regimen apropiados. La cantidad que se va a administrar, tanto de acuerdo con el numero de tratamientos y de la dosis unitaria, depende del resultado y/o la proteccion deseados. Las cantidades precisas de la composicion tambien dependen del juicio del medico y son peculiares para cada individuo. Los factores que afectan a la dosis incluyen el estado ffsico y clmico del sujeto, la via de administracion, el objetivo pretendido del tratamiento (alivio de smtomas frente a curacion) y la potencia, la estabilidad y la toxicidad de la composicion particular. Despues de la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de la dosificacion y en una cantidad tal que sea eficaz de forma terapeutica o profilactica. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion, tales como el tipo de solucio­ nes inyectables descritas anteriormente.
B. Terapia de combinacion
Las composiciones y los metodos relacionados de la presente invencion, en particular la administracion de un complejo de antigeno-MHC-nanopardcula, tambien se pueden utilizar en combinacion con la administracion de terapias tradicionales. Estas incluyen, pero no se limitan a, Avonex (interferon beta-1a), Betaseron (interferon beta-1b), Copaxone (acetato de glatiramer), Novantrone (mitoxantrona), Rebif (interferon beta-1a), Tysabri (natalizumab), Gilenya (fingolimod), Glatiramer, esteroides, Cytoxan, Imuran, Baclofen, estimulacion profunda del cerebro, Ampyra (dalfampridina), acupuntura y terapia ffsica.
Cuando se emplea una terapia de combinacion, se pueden emplear diversas combinaciones, porejemplo, la adminis­ tracion de un complejo de antigeno-MHC-nanopartfcula es "A" y el agente adicional es "B":
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B
B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A/ B/B/A/A
B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A
La administracion de las composiciones de complejo de peptido-MHC de la presente invencion a un paciente/sujeto seguira los protocolos generales para la administracion de tales compuestos, teniendo en cuenta la toxicidad, si la hay. Se espera que los ciclos de tratamiento se repitan cuando sea necesario. Tambien se contempla que varias terapias convencionales, tales como la hidratacion, se pueden aplicar en combinacion con la terapia descrita.
C. Administracion in vitro o ex vivo
Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresion administracion in vitro se refiere a las manipulaciones realizadas en celulas extrafdas de un sujeto o de fuera de este, incluyendo, pero sin limitarse a celulas en cultivo. La expresion administracion ex vivo se refiere a celulas que se han manipulado in vitro y se administran posteriormente a un sujeto. La expresion administracion in vivo incluye todas las manipulaciones realizadas dentro de un sujeto, incluidas las administraciones.
En ciertos aspectos de la presente invencion, las composiciones se pueden administrar in vitro, ex vivo o in vivo. En ciertas realizaciones in vitro, se incuban linfocitos T autologos con composiciones de esta invencion. Las celulas o el tejido se pueden utilizar despues para un analisis in vitro, o, alternativamente, para la administracion ex vivo.
V. Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan con el fin de ilustrar diversas realizaciones de la invencion y no estan destinados a limitar la presente invencion de ninguna manera. Un experto en la tecnica apreciara facilmente que la presente invencion esta bien adaptada para llevar a cabo los objetos y obtener los fines y ventajas mencionados, asf como los objetos, fines y ventajas inherentes a la presente memoria. Los presentes ejemplos, junto con los metodos descritos en esta memoria son actualmente representativos de las realizaciones y son ejemplares y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invencion.
Ejemplo 1
pMHC de clase II-NPs en un modelo de enfermedad autoinmune EAE cronica.
Este ejemplo describe el uso de nanopartfculas recubiertas con complejos de antfgeno relacionados con la EM-MHC para tratar la EAE en un modelo de raton con EAE. Este nuevo enfoque terapeutico se puede utilizar para la administracion sistemica de nanopartfculas recubiertas con complejos individuales de peptido relevante para la EM-MHC (pMHC) (es decir, un complejo de pMHC por enfermedad). Este descubrimiento permite un diseno racional de 'nanovacunas' espedficas de una enfermedad, capaces de amortiguar la autoinmunidad, sin perjudicar la inmunidad siste­ mica, un objetivo buscado desde hace tiempo en la terapia de esos trastornos. La FIG. 1 muestra que las nanovacunas monoespedficas, recubiertas con pMHC de clase II relevante para la EM, pueden revertir la encefalomielitis alergica experimental (EAE) establecida en ambos ratones C57BL/6. Este enfoque tambien es aplicable a los complejos de pMHC humanos conocidos por ser la diana de los linfocitos T CD4+ autorreactivos en pacientes con EM. Una demostracion de la eficacia clmica en esos modelos preclmicos allanara el camino para ensayos clfnicos en seres humanos y, potencialmente, el desarrollo de una curacion de la EM.
La EAE requiere la generacion de linfocitos T CD4+ autorreactivos junto con la ruptura de la barrera hematoencefalica, lo que permite el reclutamiento de celulas encefalitogenicas al s Nc . La inmunizacion de ratones C57BL/6 (B6) con PMOG36-55 (200 |jg) en CFA complementado con 10 jg/m l de Mycobacterium tuberculosis s.c. (en la base de la cola) junto con 300 ng de toxina pertussis i.p., seguido de otra dosis de la toxina pertussis el dfa 2, induce una forma de EAE cronica (>60 dfas) en todos los animales que se enferman (~70% en nuestra colonia).
Como se muestra en la FIG. 1, la terapia con pMHC de clase II-NP (NPs recubiertas con pMOG38-49/IAb) reduce la gravedad de la EAE establecida en ratones C57BL/6. Los ratones B6 fueron inmunizados con pMOG35-55 en CFA y se trataron con la toxina pertussis i.v. Se otorgo una puntuacion a los ratones para valorar los signos de EAE utilizando criterios establecidos a traves de una escala de 15 puntos. Los ratones afectados se trataron con dos dosis semanales de 7,5 - 22,5 jg de NPs recubiertas con pMOG38-49, comenzando 21 dfas despues de la inmunizacion. Es importante destacar que este efecto esta asociado con una expansion sistemica de los linfocitos T autorreactivos cognados (FIG.
4). Ademas, aunque las medulas espinales de los ratones sin tratarteman una desmielinizacion significativa e infiltrados de celulas mononucleares densas de la sustancia blanca (FIG. 5), los ratones tratados con pMHC-NP teman significativamente menos desmielinizacion e infiltrados de celulas mononucleares (FIG. 6). Las FIGs. 7 y 8 muestran ejemplos representativos de los bordes de la medula espinal (2 ratones cada una). En este caso, de nuevo, los ratones tratados con pMHC-NP tienen significativamente menos desmielinizacion, asf como una infiltracion menor con celulas mononucleares. Por lo tanto, el enfoque terapeutico con pMHC-NP induce respuestas clmicamente significativas en diferentes enfermedades (T1D, EAE), modelos animales y fondos geneticos (NOD, C57BL/6).
Estos estudios proporcionan pruebas de la eficacia dependiente de la dosis y la viabilidad de los tratamientos para la EM utilizando complejos de antfgeno de EM-MHC-nanopartfcula.
Ejemplo 2
Procedimiento para la preparacion de complejos de antigeno-MHC-nanopartfcula.
Nanopartfculas inorganicas (oxido de hierro = IONP; oro = GNPs) de un tamano deseado. Las IONPs se producen mediante descomposicion termica. Las IONPs sintetizadas de ese modo son biocompatibles y se pueden PEGilar para la conjugacion de protemas. Para recubrir con una protema del pMHC y/u otras protemas, las IONPs, NPs recubiertas con tensioactivo reaccionan con enlazadores de PEG funcionalizados con la longitud adecuada. Los enlazadores se purifican por HPLC y se caracterizan mediante 1H-NMR, MALDI/GPC y GPC, para confirmar la identidad qmmica, la pureza, el peso molecular y la polidispersidad. Enlazadores y enfoques similares se pueden utilizar para recubrir GNPs, a excepcion de que los enlazadores tendran un grupo tiol (SH) en su extremo que se une con la NP.
Ejemplo 3
Tamano, densidad y exposicion de nanopartmulas recubiertas con pMHC.
I. Smtesis y caracterizacion de NP recubierta con pMHC basada en oro.
Se sintetizaron nanopartmulas de oro (GNPs) de tamanos espedficos. El tamano, la densidad, la carga superficial y la monodispersidad de las preparaciones de GNP se miden usando espectrofotometna, microscopfa de transmision de electrones (TEM) y dispersion de luz dinamica. Las muestras de GNP se concentran a continuacion y se conjugan con complejos de pMHC monoespedficos, usando diferentes enfoques, como se describe a continuacion. Los solicitantes han desarrollado metodos para cuantificar la valencia de pMHC por cada GNP y para concentrar las prepara­ ciones de GNPs recubiertas con pMHC de diferentes tamanos a altas densidades (~1014/ml) sin comprometer la mo­ nodispersion (FIG. 11).
II. Caracterizacion de la capacidad de union a pMHC de las GNPs.
Los complejos de pMHC recubrieron las GNPs de diversos tamanos utilizando dos enfoques diferentes: (i) una union aleatoria de pMHC a la superficie de GNP a traves de interacciones electrostaticas; y (ii) una union direccional a traves de un enlazadortiol-PEG-NH2 (en este caso, se utilizo un enlazador adicional tiol-PEG como estabilizadorde las GNPs para evitar la agregacion). Se crefa que el primer enfoque permitina densidades muy altas de ligando (de pMHC por cada GNP), aunque comprometfa la direccionalidad de la union de pMHC (es decir, solo una fraccion de las moleculas podfa llegar a estar disponible para ser reconocida por los linfocitos T cognados). El segundo enfoque estaba destinado a generar GNPs recubiertas con pMHC que eran portadoras de densidades mas bajas de pMHC pero que se uman direccionalmente, a traves de sus extremos C-terminales. Ambos enfoques se sometieron a ensayo sobre GNPs con diametros diferentes, en el intervalo de 14 a 40 nm. Se confirmo que, para los dos enfoques, la capacidad de unirse a pMHC de las GNPs es una funcion del tamano y mas espedficamente del area superficial (mayor numero de pMHCs sobre NPs mas grandes). Asombrosamente, se encontro que la union mediada por PEG no solo asegura la direccio­ nalidad de la union, sino que tambien mejora la capacidad de union de las GNPs individuales (en contra de las expectativas iniciales). La Tabla 1 a continuacion resume los datos.
Tabla 1. Capacidad de union a pMHC de las GNPs
Diametro (nm) Area superficial: pMHCs/GNP pMHCs/GNP
(x 102 nm2) (absorcion) (enlazador)
14 7 212
20 12 3.750
30 28 335
40 50 2.850 5.250
III. Actividad agonista frente a contenido en pMHC.
Se sometieron a ensayo los efectos de la valencia de pMHC, el tamano de GNP, la densidad de GNP y la estrategia de recubrimiento sobre la actividad funcional (agonista) de las GNPs recubiertas con pMHC in vitro. Se comparo la capacidad de diversas preparaciones de IGRP206-2i 4-Kd-GNP para activar linfocitos T CD8+ sin tratamiento previo (espedficos de IGRP206-214) cognados (en esta memoria denominados “ linfocitos T 8.3-CD8+”) obtenidas a partir de ratones NOD con el receptor de linfocitos T (TCR)transgenicos (o ratones 8.3-NOD). El primer grupo de experimented estaba destinado a comparar los efectos de la valencia de IGRP206-214-K 1 (pMHC) sobre un intervalo de densidades de GNPs en el cultivo. Las GNPs conjugadas con un complejo de pMHC de control (no cognado) (Tum-Kd) se utilizaron como controles negativos. Como era de esperar, las GNPs recubiertas con IGRP206-214-K 1 (pero no recubiertas con TUM-Kd) activaban estos linfocitos T (tal y como se midio por la produccion IFNy) y lo hicieron de un manera dependiente de la dosis de GNP (por lo tanto, de la dosis de pMHC). La FIG. 12 muestra un experimento que emplea GNPs de ~14 nm recubiertas con diferentes cantidades de moleculas de pMHC/GNP utilizando el metodo del enlazador. La FIG. 12 compara las cantidades de IFNy secretada por los linfocitos T 8.3-CD8+ cognados como respuesta a dos muestras diferentes de pMHC-GNP (ambas consistfan en ~2x1013GNPs de 14 nm de diametro/ml). Au-022410 y Au-21910 eran portadoras de ~250 y ~120 pMHCs/GNP, respectivamente. Au-011810-C era portadora de ~120 pMHCs/GNP de control. Las GNPs recubiertas con cantidades superiores en mas del doble de complejos de pMHC/GNP teman una actividad agonista superior. Por tanto, la actividad agonista de las GNPs recubiertas con pMHC es una funcion del contenido total en pMHC (GNP). Estos resultados eran contradictorios, ya que el estado de la tecnica sugena que en ausencia de moleculas coestimuladoras sobre las NPs, un aumento de las cantidades de pMHCs sobre las NPs individuales tambien aumentana la avidez y debena favorecer la eliminacion (muerte celular), en lugar de una proliferacion y secrecion de citocinas desde los linfocitos T cognados. Esto sena cierto tanto para los linfocitos T con avidez reducida como con avidez elevada. Por ejemplo, un trabajo previo de los solicitantes (Han et al., (2005) Nature Medicine 11(6): 645-652) y otros, indicaba que los peptidos reconocidos con alta avidez o los peptidos reconocidos con baja avidez pero proporcionados en concentraciones elevadas, tienen una mayor capacidad para eliminar los linfocitos T cognados in vivo. Por lo tanto, en el contexto de una administracion terapeutica de nanopartteulas recubiertas con antfgeno-MHC por via intravenosa o peptidos solubles, los linfocitos T cognados deben someterse a delecion de una manera dependiente de la afinidad del peptido y de la dosis. Esta expectativa no se cumplio por los datos mostrados en la FIG. 12.
IV. Un umbral de valencia en la actividad agonista de los complejos de peptido-MHC-nanopartteula
Para investigar mas a fondo el papel de la valencia del peptido-MHC (pMHC) sobre las propiedades agonistas de nanopartteulas conjugadas con pMHC (pMHC-NPs), se comparo in vitro la capacidad de NPs de oxido de hierro (Fe3O4) con 8 nm de diametro acopladas covalentemente con cantidades crecientes de monomeros de IGRP206-214/Kd pMHC, para desencadenar la secrecion de IFN-gamma (IFNy) a traves de linfocitos T CD8+ (espedficos de IGRP206-214/Kd) cognados (en lo sucesivo denominados linfocitos T 8.3-CD8+) in vitro. Como se muestra en la Tabla 2, los linfocitos T 8.3-CD8+ produdan cantidades insignificantes de IFNy cuando se cultivaban en presencia de NPs recu­ biertas con 8 monomeros de pMHC por NP, pero produdan cantidades sustancialmente mas altas de IFNy como respuesta a NPs recubiertas con valencias de pMHC mas elevadas, incluso tan bajas como 11 monomeros de pMHC/NP, de una manera dosis-respuesta.
Tabla 2. Secrecion de IFNy mediante linfocitos T 8.3-CD8+ como respuesta a NPs conjugadas con valencias crecientes de pMHC (con 5x1011 NPs/mL)
Nanopartfculas Propiedad Tamano del
Valencia de pMHC Respuestas de IFNy (ng/ml) (NPs) del nucleo nucleo (nm)
IGRP-SFPM-110512 Fe3O4 8 8 0,03
IGRP-SFP-102912 Fe3O4 8 11 0,4
IGRP-SFP-012011 Fe3O4 8 14 0,2
IGRP-SFP-031511 Fe3O4 8 15 0,15
IGRP-SFP-051211 Fe3O4 8 31 0,7
IGRP-SFP-100711 Fe3O4 8 39 0,9
IGRP-SFP-011411 Fe3O4 8 54 2,3
Este efecto positivo de la valencia de pMHC sobre la actividad agonista de pMHC-NPs se mantuvo en un intervalo de densidades de pMHC-NP (FIG. 13). Sorprendentemente, sin embargo, aunque 25x1011 NPs (por ml) que eran portadoras de 11 pMHCs/NP teman una actividad agonista similar a 5x1011 NPs (por ml) que eran portadoras de 54 pMHCs/NP, aumentar el numero de NPs que eran portadoras de 8 pMHCs/NP a valores tan altos como 40x1011 NPs/ml, tema efectos mmimos (FIG. 14). En conjunto, estos resultados indican que existe un umbral de valencia de pMHC, que se encuentra entre 9 y 11 pMHCs/NP, por debajo del cual aumentos relativamente grandes del numero de NPs (es decir, 5 veces) no pueden superar la baja actividad agonista de las pMHC-NPs recubiertas con valencias bajas (se observa que el uso de >50x1011NPs en estos experimentos in vitro no es informativo debido a la toxicidad celular causada por altas densidades de NPs).
Este efecto del umbral de la valencia de pMHC se ilustra adicionalmente en la FIG. 15, en donde los datos de secrecion de IFNy se normalizan a la concentracion de pMHC total entregado por las NPs recubiertas en los cultivos. Las NPs que eran portadoras de 11 pMHCs/NP provocaban respuestas de IFNy significativamente mas altas en un intervalo de concentraciones de pMHC, que las que desencadenaban NPs que eran portadoras de 8 pMHCs/NP. Ademas, las diferencias en las propiedades agonistas de estas dos preparaciones de NPs aumentaron sustancialmente con el contenido total de pMHC. Es decir, las diferencias en las propiedades agonistas de 2,4 pg/ml de pMHC entregado por las NPs en forma de octameros frente monodecameros, eran mucho mas elevadas que las diferencias en las propie­ dades agonistas de las mismas formulaciones en concentraciones 10 veces menores de pMHC total.
La FIG. 16 muestra que esos efectos profundos de la valencia de pMHC sobre las propiedades agonistas de pMHC-NPs tambien se pueden observar utilizando NPs mas grandes (que pueden aceptar valencias mucho mas altas de pMHC que las NPs de 8 nm estudiadas en las FIGs. 13-15) utilizadas con menores densidades de NP (para normalizar el contenido total en oxido de hierro en los cultivos). Aunque las NPs con un diametro de 18 nm que son portadoras de <10 pMHCs/NP practicamente no teman actividad biologica hasta 4x1011 NPs/ml, la actividad agonista de las NPs con un diametro de 18 nm que eran portadoras de valencias de pMHC mas elevadas, se incrementaba linealmente con la densidad de las NPs. Una comparacion de las FIGs. 15 y 16 muestra adicionalmente que 2x1011 NPs de 18 nm que entregan 61 pMHCs/NP, tienen una actividad agonista similar a 2x1011 NPs de 8 nm que entregan un numero similar (54) de pMHCs/NP, lo que indica que los efectos de la valencia de pMHC no se ven afectados significativamente por el volumen de la NP.
En conjunto, estos datos muestran que las NPs recubiertas con pMHC adquieren una potente actividad agonista por encima de un cierto umbral de valencia de pMHC (que se encuentra entre 9 y 11 pMHCs/NP). Incrementos en la valencia de pMHC o en la densidad de NPs pueden mejorar las propiedades agonistas de las pMHC-NPs que son portadoras de valencias "umbrales" o "supra-umbrales" de pMHC, pero no las propiedades agonistas de NPs que son portadoras de valencias "infra-umbrales" de pMHC.
V. Actividad agonista frente al tamano de NP y la densidad.
Un analisis adicional indico que el contenido total en pMHC no es el unico factor que afecta a la actividad agonista de las pMHC-NPs in vitro y que el tamano de las NPs tambien tiene un papel importante independiente. Esto se investigo mediante la comparacion de la actividad agonista de dos muestras de pMHC-GNP de diferente tamano (14 y 40 nm de diametro, respectivamente) y diferentes valencias de pMHC, pero en condiciones de contenido total de pMHC similar. En el experimento mostrado en la FIG. 17, se utilizaron GNPs de 14 nm que eran portadoras de ~200 moleculas de pMHCs/GNP y GNPs de 40 nm que eran portadoras de ~5.000 pMHCs/GNP. La densidad de GNPs de estas dos muestras se ajusto (a 3x1013 y 1012 GNPs/ml, respectivamente) para ajustar el contenido total en pMHC de cada muestra a ~450 pg/ml. Notablemente, los linfocitos T 8.3-CD8+ respondfan significativamente mejor al compuesto de pMHC/GNP de 14 nm que al de 40 nm, a lo largo de un intervalo de contenido total de pMHC, a pesar del hecho de que este ultimo se disenara con significativamente mas complejos de pMHC que el primero. Esto sugirio que la den­ sidad de GNPs (mas GNPs/linfocito T cognado) es la clave. En otras palabras, NPs con 4x40 nm que eran portadoras de 1000 pMHCs/GNP (4000 pMHCs) senan menos deseables que NPs con 40x10 nm que eran portadoras de 100 pMHCs/GNP (4000 pMHCs). Por lo tanto, cuando se toman conjuntamente, estos datos sugieren que las preparaciones optimas de pMHC-GNP son las compuestas por pequenas GNPs utilizadas con altas densidades de pMHC. El aumento de la valencia de pMHC en estas NPs pequenas aumenta aun mas sus propiedades agonistas de forma sorprendente e inesperada.
VI. Actividad agonista frente a la exposicion a pMHC.
Como se ha senalado anteriormente, las muestras de GNPs recubiertas con pMHC son producidas mediante el recubrimiento conjunto de GNPs con un enlazador de tiol-PEG-NH2 de 3,4 kD (como aceptor de extremos carboxi de pMHC) con un enlazador de tiol-PEG que funciona como un estabilizador de la GNP. Para investigar si la longitud del enlazador de tiol-PEG estabilizador influye en sus propiedades antiagregacion de GNP, se comparo la capacidad del enlazador de tiol-PEG-NH2 para unir moleculas de pMHC y/o las propiedades agonistas de las GNPs recubiertas con pMHC, GNPs recubiertas con pMHC preparadas usando enlazadores estabilizadores de diferentes tamanos (2 kD y 5 kD, mas corto y mas largo que el enlazador aceptor de pMHC, respectivamente) se comparo. Se encontro que ambos enlazadores teman propiedades antiagregacion similares y que el enlazador de 5 kD no inhibfa la union de pMHC con el enlazador de tiol-PEG-NH2 mas corto de 3,4 kD. Notablemente, sin embargo, las pMHC-GNPs que estaban protegidas por el tiol-PEG mas corto (2 kD) teman una actividad agonista superior in vitro que las recubiertas conjuntamente con el tiol-PEG mas largo (5 kD) (FIG. 18). Esto sugiere que los enlazadores largos protectores de tiol-PEG protegen moleculas de pMHC unidas al enlazador aceptor frente a una exposicion a linfocitos T cognados.
VII. Pequenas NPs acopladas covalentemente con altas densidades de pMHC permiten efectos maximos de expan­ sion de linfocitos T autorreguladores in vivo.
Las nanopartfculas que teman un diametro promedio de aproximadamente 10 nm y estaban acopladas o bien a NRP-V7/Kd (tambien referido como IGRP206-214-Kd) o a TUM/Kd (control) se prepararon de acuerdo con los metodos descrito en esta memoria y se sometieron a ensayo para estudiar su capacidad para inducir una expansion de linfocitos T CD8+ autorreguladores cognados in vivo. La FIG. 19 muestra los resultados de un experimento en el que antfgeno-MHC-GNPs se inyectaron por via intravenosa a ratones NOD de 10 semanas de edad, de tipo silvestre, dos veces por semana durante 5 semanas consecutivas. Los cambios en el tamano de la poblacion de linfocitos T cognados en la circulacion y en diferentes tejidos linfoides como respuesta a la terapia, se evaluaron mediante una tincion de las suspensiones celulares con tetrameros de antfgeno-MHC marcados con fluorescencia (tanto tetrameros cognados, como tetrameros de control irrelevantes). La administracion de 10-100 menos GNPs de las que se habfan observado previamente en la tecnica (vease, por ejemplo, Tsai et al. (2010) Immunity 32(4): 568-580) en donde se analizaron nanopartfculas recubiertas con 1-8 pMHCs), pero recubiertas con 150 antfgeno-MHCs por GNP dio lugar a expansiones sustancialmente mas elevadas (FIG. 19). Expandfan los linfocitos T CD8+ in vivo hasta niveles varias veces superiores (hasta un 44% de todos los linfocitos T CD8+ circulantes) a los que normalmente se obtienen con nanopartfculas recubiertas con un pMHC con una valencia de aproximadamente 8 (1-2% de celulas en sangre; vease, por ejemplo, Tsai et al., Immunity, 2010, Figura 1C). Los datos anteriores indican que las pequenas nanopartfculas recu­ biertas con valencias elevadas de antfgeno-MHC ofrecen efectos maximos de expansion de linfocitos T. Estos resul­ tados eran inesperados. Por consiguiente, no es la avidez total de la interaccion pMHC-NP-linfocito T la que es responsable del efecto terapeutico, sino mas bien la avidez de la poblacion precursora que da lugar a los linfocitos T que se expanden como respuesta a la terapia con pMHC-NP. Esta interpretacion es compatible con los datos descritos en esta memoria e implica que la valencia de pMHCs sobre las NPs debena aumentar la eficacia terapeutica de pMHC-NPs.
Ejemplo 4
Gran expansion de linfocitos T CD8+ cognados mediante pMHC-GNPs recubiertas con valencias altas de pMHC. Despues se determino si las pMHC-NPs tienen un potencial para inducir expansiones masivas de linfocitos T cognados in vivo. Esto se realizo tratando los ratones con varias inyecciones de 3x1012 NPs de 10-14 nm que eran portadoras de 25 pg de pMHC total (~150 moleculas de IGRP206-214/Kd por NP). Como se muestra en la FIG. 20, los ratones tratados con 10 dosis (dos veces a la semana durante 10 semanas) mostraban expansiones masivas de linfocitos T CD8+ cognados reactivos con IGRP206-214 (NRP-V7) en sangre periferica, en comparacion con sus homologos sin tratar (desde <0,4 a >17 o 47% de linfocitos T CD8+) (paneles inferiores). Tal expansion ya se habfa observado en un raton que fue sacrificado despues de 4 dosis de pMHC-NPs (paneles superiores). Las celulas expandidas con pMHC-NP se uman espedficamente a tetrameros de pMHC cognados pero no a los no cognados (NRP-V7/Kd frente a TUM/Kd, respectivamente).
Ejemplo 5
Preparacion de nanopartfculas de oro conjugadas con pMHC
Preparacion de nanopartfculas de oro conjugadas con pMHC (pMHC-GNPs, 12 y 30 nm). Preparacion de GNPs. Las GNPs se prepararon mediante el calentamiento de agua D.D. (200 ml) en un matraz de bola en un bano de aceite de silicio hasta ebullicion. Una solucion de 1% de HAuCL4 se anadio a continuacion (4 ml) en el agua hirviendo. La solucion se agito durante 10 min antes de anadir una solucion de 1% de citrato de Na. Para GNPs de 12 nm, se anadieron 12 ml de solucion de citrato de Na. Para GNPs de 30 nm, se anadieron 12 ml de solucion de citrato de Na. Un color vino aparece inmediatamente despues de la adicion de la solucion de citrato de Na. Para completar la reaccion, la solucion de GNP se agito durante 30 minutos adicionales. Esta es una modificacion del metodo descrito en Levy, R. et al. ("Rational and combinatorial design of peptide capping ligands for gold nanoparticles". J Am Chem Soc 126, 10076-84 (2004)).
Modificacion de la superficie de las GNPs. Las GNPs se pegilaron mediante la adicion de tiol-PEG-NH225 mM (PM 3.400) y tiol-PEG 50 mM (PM 2.000, relacion PEG/GNP 10.000:1) en solucion de GNP. La solucion se agito durante 5 horas a temperatura ambiente. Las GNPs pegiladas se lavaron despues con 3 X 30 ml de agua D.D. esterilizada para eliminar el exceso de PEGs y se resuspendieron en 40 ml de tampon MES 100 mM (C6H13NO4S x H2O), pH 5,5.
Conjugacion de pMHC. pMHCs (IGRP206-214/Kd, 4 mg) se anadio a la solucion de las GNPs pegiladas, gota a gota con agitacion suave a temperatura ambiente. La mezcla se agito durante una hora antes de la adicion de 20 mg de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). La mezcla se agito durante 4 horas adicionales. Los conjugados de pMHC-GNPs se lavaron despues con 40 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2-7,4) tres veces y se resuspendieron en 8 ml de PBS.
Ejemplo 6
Preparacion de nanopartfculas de oro conjugadas con pMHC
Preparacion de GNPs conjugadas con pMHC (pMHC-GNPs, 2-10 nm). Preparacion de GNPs (2-5 nm). Las GNPs de 2-5 nm se prepararon disolviendo 250 mg (para GNPs de 2 nm) o 50 mg (para GNPs de 4 nm) de dodecilamina en 10 ml de solucion DDAB (bromuro de didodecildimetilamonio 100 mM (DDAB) en tolueno). En segundo lugar, 100 mg de borohidruro de tetrabutilamonio (TBAB) se disolvieron en 4 ml de solucion DDAB. Las soluciones de dodecilamina y TBAB se mezclaron despues en un matraz de tres bocas de 50 ml, agitando bajo atmosfera de nitrogeno. Se determinaron 34 mg de AuCh en 4,5 ml de solucion DDAB y se inyectaron rapidamente en una mezcla de solucion TBAB y dodecilamina. La solucion se vuelve de color rojo oscuro de inmediato, lo que indica la formacion de las GNPs. La mezcla se agito continuamente durante 30 min y se anadieron 15 ml de etanol a la mezcla. Despues, la mezcla se centrifugo a 4.100 x g durante 12 min para precipitar las GNPs.
Preparacion de GNPs (6-10 nm). Para preparar las GNPs de 6-10 nm, primero se disolvio acido decanoico (172 mg) en 10 ml de tolueno y despues se mezclo con diversas cantidades de solucion TBAB (4 y 1 mL para GNPs de 6 y 10 nm, respectivamente) en un matraz de tres bocas de 50 ml, mientras que se agitaba bajo atmosfera de nitrogeno. A continuacion, AuCh (34 mg disueltos en 4,5 ml de solucion madre de DDAB) se inyecto rapidamente en la mezcla de solucion TBAB y acido decanoico. La solucion se volvio de color rojo oscuro inmediatamente. La mezcla se agito continuamente durante 30 min y se anadieron 15 ml de etanol a la mezcla. La mezcla se centrifugo a continuacion a 4.100 x g durante 12 min para precipitar las GNPs.
Modificacion superficial de las GNPs. Las GNPs se resuspendieron en 20 ml de acido mercaptopropanoico (MPA) 0,1 M en metanol, pH 10 y se agitaron durante una hora a temperatura ambiente. A continuacion se anadieron 10 ml de acetato de etilo. Despues, la mezcla se centrifugo a 4.100 x g durante 15 min. A continuacion, las GNPs precipitadas se lavaron con 30 ml de agua D.D. esterilizada, tres veces y se resuspendieron en 20 ml de tampon MES 100 mM (C6H13NO4S x H2O), pH 5,5. A esta mezcla, se anadieron soluciones de polioxietilen bis(amina) 0,5 M (con una relacion 10000:1 de PEG/GNP) y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (e Dc ) 0,1 M (concentracion final de EDC 2 mM). Despues, la mezcla se agito durante 4 horas. Las GNPs pegiladas se lavaron con 3 X 30 ml de agua D.D. esterilizada para eliminar el exceso de PEG y EDC.
Conjugacion de pMHC. Las GNPs pegiladas se resuspendieron en 20 ml de tampon MES 100 mM (C6H13NO4S x H2O), pH 5,5. A continuacion se anadieron pMHCs (5 mg/ml, total 10 - 30 mg) a las GNPs resuspendidas (relacion 500:1 de pMHC/GNP), gota a gota y se agitaron durante 1 hora a temperatura ambiente antes de anadir 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) 0,1 M (concentracion final de e Dc 2 mM). La mezcla se agito durante 4 horas mas. Los conjugados de pMHC-GNPs se lavaron despues con 40 ml de solucion salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2-7,4) tres veces y se resuspendieron despues en 10-20 ml de PBS.
Optimizacion de pMHC. El diseno optimo de pMHC-NP consiste en pequenas partfculas recubiertas con monomeros de pMHC con la densidad mas alta posible, que producen complejos con pMHCs separados por 3-4 nm. Las pMHC-NPs disenadas siguiendo estos principios tienen una potencia optima (actividad agonista maxima y propiedades de expansion de Treg a dosis mas bajas de pMHC total). Esto se ha confirmado experimentalmente para los hallazgos de pMHC de clase I-NPs, tambien es cierto para Np recubierta con pMHC de clase II. Cuando se usa con una densidad

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un complejo de nanopartmula que comprende: un nucleo de nanopartmula; una serie de complejos de antigeno-MHC (pMHC) que comprenden una serie de protemas del MHC y una serie de antigenos relacionados con la esclerosis multiple; y en donde el complejo de nanopartmula tiene una densidad de antigeno-MHC desde 0,05 moleculas de pMHC/100 nm2 a 30 moleculas de pMHC/100 nm2 y en donde el nucleo de nanopartmula comprende opcionalmente un metal, un oxido metalico, un sulfuro metalico, un seleniuro metalico, un material magnetico, un polfmero, hierro, oxido de hierro u oro, y en donde el nucleo de nanopartmula esta opcionalmente recubierto con dextrano, manitol y polietilenglicol.
2. El complejo de nanopartmula segun la reivindicacion 1, en donde el nucleo de nanopartmula comprende hierro, oxido de hierro u oro.
3. El complejo de nanopartmula segun la reivindicacion 1 o 2, en donde el antfgeno es un antfgeno obtenido a partir de una protema seleccionada a partir del grupo de protema basica de la mielina, glicoprotema asociada a la mielina, protema de la mielina de oligodendrocito, protema proteolipfdica, oligoprotema de la mielina de oligodendrocito, pro­ tema basica de oligodendrocito asociada con la mielina, protema espedfica de oligodendrocito, protemas de choque termico, protemas espedficas de oligodendrocito NOGO A, glicoprotema Po, protema de la mielina periferica 22 y 2'3'-nucleotido dclico 3'-fosfodiesterasa y glicoprotema de mielina de oligodendrocito (MOG) o un antfgeno correspondiente a SEQ ID NOS. 1 o 4-17, un peptido que tiene al menos 80% de identidad con un peptido que comprende la secuencia de SEQ ID NOS: 1 o 4-17 o un polipeptido codificado por un polinucleotido que se hibrida en condiciones de rigor de moderado a elevado con un polinucleotido que codifica una secuencia de SEQ ID NOS: 1 o 4-17 o un complemento de cada uno (en donde las condiciones de rigor elevado comprenden temperaturas de incubacion de 55°C a 68°C; concentraciones de tampon de 1 x SSC a 0,1 x SSC; concentraciones de formamida de 55% a 75%; y soluciones de lavado de 1 x SSC, 0,1 x SSC o agua desionizada) o uno que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de SEQ ID NO: 1 o 4-17.
4. El complejo de nanopartmula segun las reivindicaciones 1 a 3, en el que la nanopartmula no es liposomica.
5. El complejo de nanopartmula segun las reivindicaciones 1 a 3, en el que el complejo de antigeno-MHC no esta unido covalentemente con el nucleo de nanopartmula o el complejo de antfgeno-MHC esta unido covalentemente con el nucleo de nanopartmula opcionalmente a traves de un enlazador de menos de 5 kD de tamano y en donde el enlazador comprende opcionalmente polietilenglicol.
6. El complejo de nanopartmula segun las reivindicaciones 1 a 3, en el que el MHC del complejo de antigeno-MHC-nanopartmula es un m Hc de clase I o II, en donde el MHC de clase I comprende opcionalmente toda o parte de una protema HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G o CD-1 y el MHC de clase II comprende opcionalmente toda o parte de una protema HLA-DR, HLA-DQ o HLA-DP.
7. El complejo de nanopartmula segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la nanopartmula esta recubierta con polietilenglicol.
8. El complejo de nanopartmula segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el nucleo de nanopartmula tiene un diametro de 1 nm a 100 nm.
9. El complejo de nanopartmula segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que tiene una relacion de complejo de antigeno-MHC a nanopartmulas de 10:1 a 1000:1.
10. Una composicion que comprende un vehmulo y una cantidad terapeuticamente eficaz del complejo de nanopartfcula segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
11. Un metodo para producir, preparar u obtener el complejo de nanopartmula segun una cualquiera de las reivindica­ ciones 1-9, que comprende recubrir o formar un complejo con una serie de complejos de antfgeno relacionado con la esclerosis multiple-MHC sobre un nucleo de nanopartmula, en donde:
el nucleo comprende, opcionalmente, un metal, un oxido metalico, un sulfuro metalico, un seleniuro metalico, un material magnetico, un polfmero, hierro, oxido de hierro u oro;
en donde el nucleo de nanopartmula esta recubierto opcionalmente con dextrano, manitol y polietilenglicol; y
en donde los complejos de antigeno-MHC (pMHC) recubren el nucleo de nanopartmula con una densidad desde 0,05 moleculas de pMHC/100 nm2 a 30 moleculas de pMHC/100 nm2.
12. El complejo de nanopartmula segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso en la expansion y/o el desarrollo de poblaciones de linfocitos T autorreactivos antipatogenos en un sujeto con esclerosis multiple o un trastorno relacionado con la esclerosis multiple.
13. El complejo de nanopartfcula segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso en el tratamiento de la esclerosis multiple o un trastorno relacionado con la esclerosis multiple en un sujeto que lo requiere.
14. El complejo de nanopartfcula para el uso segun la reivindicacion 13, en donde el trastorno relacionado con la esclerosis multiple se selecciona a partir del grupo que consiste en neuromielitis optica (NMO), uveftis y dolor neuropatico.
15. Un kit que comprende el complejo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, e instrucciones para el uso.
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