BR112014023859B1 - Nanopartícula, uso da mesma, e composição - Google Patents

Abstract

Nanopartícula, Composições, Polipeptídeos Isolados e Purificados, Métodos Para Preparar ou Obter Nanopartícula e Para Induzir Resposta Anti-Inflamatória de Célula ou Tecido, Para Tratar Inflamação, Para Acumular Células T Anti-Inflamatórias e/ou Células Anti-Inflamatórias no Trato Gastrointestinal de Paciente Necessitado do Mesmo e Para Transferir Linfócitos T Citotóxicos e Respectivos Usos. Esta divulgação fornece composições e métodos terapêuticos para induzir uma resposta anti-inflamatória e/ou tratar a inflamação no trato gastrointestinal e/ou a acumulação de células T anti-inflamatória específicas para o antígeno microbiano do intestino.

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS

[0001] Este Pedido reivindica a prioridade mediante 35 USC § 119(e) para o Pedido Provisório U.S. N°. de Série 61/615.743, depositado em 26 de março de 2012, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[0002] A divulgação é dirigida a composições e métodos relacionados para a imunoterapia e medicina. Em particular, esta divulgação está relacionada com agentes terapêuticos para o tratamento de inflamação, por exemplo, inflamação do trato gastrointestinal.

ANTECEDENTES

[0003] A doença inflamatória intestinal (IBD) é o nome de um grupo de doenças que fazem com que os intestinos se tornem inflamados (vermelho e inchado). Mais de 600,000 americanos têm algum tipo de doença inflamatória do intestino a cada ano. Este grupo de doenças é muitas vezes de natureza crônica e associada com sintomas como dor abdominal, vômitos, diarréia, sangramento retal, cólicas internas/ espasmos musculares graves na região da pélvis e perda de peso. Os sintomas associados com IBD podem limitar a qualidade de vida e afetar os que sofrem diariamente.

[0004] As modalidades de tratamento de IBD incluem principalmente imunossupressores que baixam a imunidade geral do paciente. Tal tratamento é arriscado e muitas vezes coloca o paciente em risco de infecção e doença, devido a imunidade comprometida.

[0005] Há uma necessidade na técnica por terapias alvos que tratam a doença, mas não comprometem a imunidade geral do paciente. Esta divulgação satisfaz esta necessidade e fornece também vantagens relacionadas.

SUMÁRIO

[0006] Em resposta a uma necessidade na técnica, são descritos no presente documento métodos e composições terapêuticas que ativam e amplificam os mecanismos endógenos de pré-existentes dirigidos para supressão de respostas inflamatórias crônicas. Em um aspecto, as composições e os métodos são fornecidos para o tratamento de inflamação do trato gastrointestinal.

[0007] Um aspecto refere-se a um método para induzir uma resposta anti-inflamatória em uma célula ou tecido pela administração de uma quantidade eficaz de um complexo de antígeno-MHC- nanopartícula; em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a Gl. Também é fornecido um complexo de antígeno-MHC- nanopartícula para uso na indução de uma resposta anti-inflamatória de uma célula ou tecido, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1. Também é fornecido o uso de um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula na fabricação de um medicamento útil para a indução de uma resposta anti-inflamatória em uma célula ou tecido, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou infecta o trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1.

[0008] Em um outro aspecto, é fornecido um método para o tratamento da inflamação em um paciente necessitado do mesmo pela administração de uma quantidade eficaz de um complexo de antígeno- MHC-nanopartícula; em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1. Também é fornecido um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula para uso no tratamento de inflamação em um paciente que necessite do mesmo, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado Gl. Também é fornecido o uso de um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula na fabricação de um medicamento para o tratamento de inflamação no trato gastrintestinal em um paciente necessitado do mesmo, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou infecta o trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1.

[0009] Ainda noutro aspecto, um método para a acumulação de células T anti-inflamatórias em um paciente necessitado do mesmo é fornecido por administração de uma quantidade eficaz de um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula; em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1. Também é fornecido um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula para uso na acumulação de células T anti-inflamatórias em um paciente necessitado do mesmo, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1. Também é fornecido o uso de um complexo de antígeno-MHC- nanopartícula na fabricação de um medicamento útil para a acumulação de células T anti-inflamatórias em um paciente necessitado do mesmo, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1.

[0010] Outros aspectos referem-se a um complexo compreendendo, consistindo essencialmente, ou ainda adicionalmente consistindo em, uma nanopartícula, uma proteína de MHC e um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro do, ou infecta o, trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1. Também são fornecidas composições que compreendem, consistem essencialmente em, ou consistem ainda adicionalmente, no complexo de antígeno-MHC-nanopartículas, tal como descrito aqui e um carreador.

[0011] Também é fornecido um kit que compreende, ou alternativamente consiste essencialmente em, ou consiste ainda adicionalmente em, uma composição tal como descrita aqui e instruções para uso das composições para o seu fim pretendido.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0012] Os desenhos a seguir fazem parte do presente Relatório Descritivo e estão incluídos para demonstrar melhor certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais destes desenhos em combinação com a descrição detalhada das modalidades específicas aqui apresentadas.

[0013] As FIGS. 1A-1C mostram que BacIYL liga-se a H-2Kd, com elevada afinidade e o complexo de pMHC resultante se liga às células T específicas de IGRP 206-214. A, uma estabilização induzida por peptídeos de moléculas de Kd em células RMA-SKd. TUM é um controle positivo e Gp33 é um controle negativo (ligação a Db-). B e C, tetrâmeros de BacIYL/Kd ligam-se especificamente às células T CD8+ - 8.3, embora com menor avidez do que tetrâmeros de NRP-V7/Kd.

[0014] As FIGS. 2A-2D mostram que BacIYL funcionam como um antagonista no isolamento, mas como um agonista parcial na presença de LPS e a sua proteína doadora é apresentada cruzada de modo eficaz por células dendríticas. A, expressão de CD44 e CD69 em células T 8.3- CD8+ cultivadas na presença de BacIYL, IGRP206-214 (controle positivo) ou TUM (controle negativo). B, ensaio de antagonismo. TUM é usado como um controle negativo. Note como o aumento das concentrações de BacIYL (mas não de TUM, um controle negativo que se liga a Kd) antagoniza as respostas de células T 8.3 CD8+ induzidas por IGRP 206-214 (secreção de IFNg, parte superior e a proliferação, parte inferior). C, BacIYL funciona como um agonista na presença de LPS. NTG, não-transgênico (células T CD8+). D, DCs pode processar epítopos semelhantes a BacIYL ou BACIGRP206-214 a partir de integrase recombinante do tipo selvagem ou integrase recombinante mutante (onde o epítopo BacIYL é mutado para codificar IGRP206-214).

[0015] As FIGS. 3A-3D mostram que o peptídeo BacIYL induz a formação de células T CD8+ de memória in vitro. A e B, Fenótipo das células T 8.3-CD8+ 28 dias após a cultura na presença de DCs de peptídeo pulsado (10 ou 0,001 ug/ml). Células T 17.6-CD8+ são células T CD8+ específicas de IGRP206-214 de muito baixa avidez; como esperado elas permanecem naives após 28 dias em cultura com BacIYL. C, teor de IFNY intracelular em resposta ao desafio do peptídeo. Células T 8.3-CD8+ cultivadas por BacIYL produzem rapidamente IFNY em resposta a estimulação por IGRP206-214. D, Secreção de IFNY por e proliferação de células T 8.3CD8+ semelhante as de memória (induzidas por BacIYL) em resposta ao desafio do peptídeo.

[0016] As FIGS. 4A-4H mostram que uma resposta de células T CD8+ reativas para BacIYL 36-44 fornece proteção contra a colite induzida por DSS. A e B mostram as curvas de peso (A) e as pontuações de atividade da doença (B) de 8.3-NOD, 17.6 NOD mediante o tratamento com DSS contra camundongos não tratados. As Figs. C e D mostram curvas de peso (C) e pontuações de atividade da doença (D) de camundongos 8.3-NOD vs. Itgβ7-/- 8.3-NOD mediante o tratamento com DSS. As Figs. E e F mostram as curvas de sobrevivência para os camundongos estudados em A-D. A Fig. G demonstra que camundongos IGRP 206-214-/- NOD, mas não camundongos NOD são resistentes à perda de peso, em resposta a colite induzida por DSS a 4%. A Fig. H mostra que a transferência adotiva de CD8+ CTL de reação cruzada com BacIYL 36_44- para camundongos IGRP206-214-/-NOD resultou em uma redução significativa das pontuações de atividade da doença, em comparação com as suas contrapartes de CTL não transfundidas.

[0017] As FIGS. 5A-5B mostram camundongos 17.6-NOD com proteção de CD8+ CTL reativa para BacIYL36-44- a partir de colite induzida por DSS-. A Fig. 5A mostra as curvas de peso e a Fig. 5B mostra as pontuações de atividade da doença para camundongos 17.6-NOD em resposta ao tratamento com DSS e transferência de 8.3-CTL, ao tratamento com DSS sozinho e a nenhum tratamento. Note como a transferência adotiva de CD8+ CTL de reação cruzada com BacIYL 36_44- para camundongos 17.6- NOD reduziu significativamente as pontuações de atividade da doença e a perda de peso em resposta ao tratamento com DSS, em comparação com as suas contrapartes de CTL não transfundidas.

[0018] A FIG. 6 demonstra o recrutamento de células T CD4+ de autorregulação semelhante a Trl para tecido linfóide associado ao intestino em camundongos NOD tratados com IGRP 4_ 22/I-Ag7 -NP. Os dados sobre os dois camundongos são mostrados.

[0019] A FIG. 7 representa um mapa de Baclnt40_ 54-I-Ab-C-Jun em pMT/V 5. O contruto de DNA entre Nco I (854) para sítios Xho I (1738) codifica a proteína de fusão HA-Baclnt 40_54-I-Abeta (b)-C-Jun (293 a.a). A proteína de fusão inclui a sequência líder de HA de 15 a.a. seguida por peptídeo BacInt40-54 (TNV) (15 a.a.). O peptídeo de codificação da sequência de DNA foi ligado a I-Abeta (b) (199 a.a.) através de um ligante GS de 16 a.a.. O C-terminal de I-Abeta (b) foi ligado à sequência de C- Jun (40 a.a.) através de um ligante GS de 8 a.a.. a.a. = aminoácido.

[0020] A FIG. 8 mostra as sequências de DNA e proteína do construto BacInt 40-54-I-Abeta (b)-C-Jun. As sequências dos componentes individuais da proteína de fusão são assequências líder HA (sublinhada) seguida pela sequência de peptídeo Baclnt40-54 (sublinhado duplo), I-Abeta.(b).. (sublinhado pontilhado) e C-Jun. Os ligantes GS não são destacados.

[0021] A FIG. 9 representa um mapa de I-Aalpha (b)-C-Fos-BirA- His6 em pMT/V5. Os sítios de construto de DNA que codificam a proteína de fusão líder HA -I-Aalpha (b)-C-Fos-BirA X-His 6 (284 a.a.) foi clonada em vetor de expressão de célula de mosca pMT/V5 entre Nco I (854) para Xba I (1711). A proteína de fusão inclui I-Aalpha (d) (195 a.a.), seguido de C-Fos através de um ligante GS (6 a.a.) e, em seguida, a sequência BirA e 6 X His.

[0022] A FIG. 10 mostra as sequências de DNA e proteínas do construto I-Aalpha (b) C-Fos. As sequências dos componentes individuais da proteína de fusão são sequências líder HA (sublinhado) seguido por I-Aalpha(b) (sublinhado duplo), C-Fos (sublinhado tracejado), BirA (sombreado) e 6 X His. Os ligantes GS não são destacados.

[0023] A FIG. 11 representa um mapa de Baclnt 81_95-I-Ab-C-Jun em pMT/V5. O construto de DNA entre os sítios Ncol (854) a XhoI (1738) codificam a proteína de fusão HA-Baclnt81_95-I-Abeta (b)-C-Jun (293 a.a.). A proteína de fusão inclui a sequência líder HA de 15 a.a. seguido por peptídeo BecInt81-95 (LGY) (15 a.a.). O peptídeo de codificação da sequência de DNA foi ligado a I-Abeta (b) (199 a.a.), através de um ligante GS de 16 a.a.. O C-terminal de I-Abeta (b) foi ligado à sequência de C- Jun (40 a.a.,) através de um ligante GS de 8 a.a..

[0024] A FIG. 12 mostra as sequências de DNA e proteínas do construto Baclnt 81_95 Abeta-I-(b)-C-Jun. As sequências dos componentes individuais na proteína 1-95de fusão são sequências líder HA (sublinhado), seguido pela sequência de peptídeos BacIntsi-,) Baclnt 81-95 (sublinhado duplo), I-Abeta (b). (sublinhado pontilhado) e C-Jun (sombreado). Os ligantes GS não são destacados.

[0025] A FIG. 13 representa um mapa de Baclnt 365_379-I-Ab-C-Jun em pMT/V5. O construto de DNA entre os sítios Ncol (854) a XhoI (1738) codifica a proteína de fusão C-Jun HA-Baclnt 365_ 379-I-Abeta (b) (293 a.a.). A proteína de fusão inclui a sequência líder HA de 15 a.a. seguido pelo peptídeo BacInt 365- 379 (TQI) (15 a.a.). O peptídeo de codificação da sequência de DNA foi ligado a I-Abeta (b) (199 a.a.) através de um ligante GS de 16 a.a.. O C-terminal de I-Abeta (b) foi ligado à sequência de C- Jun (40 a.a.,) através de um ligante GS de 8 a.a..

[0026] A FIG. 14 mostra as sequências de DNA e proteínas do construto BacInt 365- 379-I-Abeta (b)-C-Jun. As sequências dos componentes individuais na proteína de fusão são as sequências líder HA (sublinhado) seguido pelas sequências de peptídeo Baclnt365-379 (sublinhado duplo), I-Abeta (b). (sublinhado pontilhado) e C-Jun (sombreado). Os ligantes GS não são destacados.

[0027] A FIG. 15 apresenta um mapa de Baclnt 57_ 71-I-Ab-C-Jun em pMT/V5. O construto de DNA entre os sítios de Ncol (854) a XhoI (1738) codifica a proteína de fusão HA-Baclnt57_ 71 -I-Abeta (b)-C-Jun (293 a.a.). A proteína de fusão inclui a sequência líder HA de 15 a.a. seguido pelo peptídeo Baclnt 57_ 71 (INH) (15 a.a.). O peptídeo de codificação da sequência de DNA foi ligado a I-Abeta (b) (199 a.a.), através de um ligante GS de 16 a.a.. O C-terminal de I-Abeta (b) foi ligado à sequência de C- Jun (40 a.a.) através de um ligante GS de 8 a.a..

[0028] A FIG. 16 mostra as sequências de DNA e proteínas do construto Baclnt 57_ 71-I-Abeta (b)-C-Jun. As sequências dos componentes individuais da proteína de fusão são destacadas: sequências Líder HA (sublinhado) seguido pela sequência de peptídeo BacInt57 -71 (sublinhado duplo), I-Abeta (b) (sublinhado pontilhado) e C-Jun (sombreado). Os ligantes GS não são destacados.

[0029] A FIG. 17 apresenta um mapa de BacInt 88_102-I-Ab-C-Jun em pMT/V5. O construto de DNA entre os sítios de Ncol (854) a XhoI (1738) codifica a proteína de fusão HA-BacInt88-102-I-Abeta (b) C-Jun (293 a.a.). A proteína de fusão inclui a sequência líder HA de 15 a.a. seguido pelo peptídeo Baclnt 88_102 (IPA) (15 a.a.). O peptídeo de codificação da sequência de DNA foi ligado a I-Abeta (b) (199 a.a.) através de um ligante GS de 16 a.a.. O C-terminal de I-Abeta (b) foi ligado à sequência de C- Jun (40 a.a.) através de um ligante GS de 8 a.a..

[0030] A FIG. 18 mostra as sequências de DNA e proteínas de construto Baclnt 88_102-I-Abeta (b)-C-Jun. As sequências dos componentes individuais da proteína de fusão são destacadas: sequências líder HA (sublinhado) seguido por sequência de peptídeo BacInt88-102 (sublinhado duplo), I-Abeta (b) (sublinhado pontilhado) e C-Jun (sombreado). Os ligantes GS não são destacados.

[0031] A FIG. 19 mostra uma imagem TEM representativa de NPs ouro revestido com pMHC (~ 14 nm) concentrados em densidades elevadas (~ 5xl013/ml) e monodispersos. Mag: 50,000X.

[0032] A FIG. 20 mostra os efeitos da dose de pMHC (GNP) e da valência de pMHC nas propriedades agonísticas de GNPs revestidos com pMHC. A Figura compara as quantidades de IFNY secretadas pelas células T 8.3-CD8+cognatas em resposta a duas amostras de pMHC-GNP diferentes (ambas consistindo em 2x1013 de GNPs de 14 nm de diâmetro/ml). Au- 022410 e Au-21910 carregaram ~250 e ~120 pMHCs/GNP, respectivamente. Au-011810-C carregou ~120 pMHCs/GNP de controle.

[0033] A FIG. 21 demonstra a secreção induzida por pMHC-NP de IFNY por células T 8.3 CD8+ como uma função da valência de pMHC. As células T 8.3-CD8+ (2,5xl05 células/ml) foram cultivadas com números crescentes de NPs revestidos com três diferentes valências de IGRP 206- 214/Kd.

[0034] A FIG. 22 mostra que a atividade agonística mais baixa de pMHC-NPs pode ser compensada pelo aumento da densidade de pMHC- NP, mas apenas acima de um limiar de valência de pMHC. O gráfico compara a atividade agonística de três diferentes preparações de pMHC (transportando três valências diferentes de pMHC-NP) sobre uma faixa de densidades de NP. Note que os NPs transportando 8 pMHCs, ao contrário daqueles transportando 11 pMHCs, não podem acionar adequadamente a secreção de IFNY mesmo em altas densidades de pMHC- NP, em comparação com NPs transportando 54 pMHCs.

[0035] A FIG. 23 mostra os efeitos do limiar da valência de pMHC sobre as propriedades agonísticas de pMHC-NPs como função da quantidade total de pMHC.

[0036] A FIG. 24 mostra os efeitos da valência de pMHC sobre a atividade agonística de pMHC-NPs produzidos com núcleos de NP de óxido de ferro maiores.

[0037] A FIG. 25 mostra o efeito do tamanho sobre a atividade agonística. Au-0224-15 foram GNPs de 14 nm revestidos com uma valência de pMHC relativamente baixa, mas preparados a uma elevada densidade; Au-0323-40 eram GNPs de 40 nm revestidos com alta valência de pMHC, mas em baixa densidade. Au-0224-15 teve atividade agonística superior à da amostra Au-0323-40.

[0038] A FIG. 26 mostra o efeito de PEGs protetores sobre a função de pMHC-GNPs. Au-021910 consistia em ~ 2xl013 GNPs de 14 nm de diâmetro/ml protegidos por tiol-PEGs de 2 kD e revestidos com ~120 pMHCs/GNP. Au-012810 GNPs (também ~ 2x1013 de GNP/ml de 14 nm) foram protegidos por tiol-PEGs de 5 kD e foram revestidos com ~175 pMHCs/GNP. A amostra Au-021910 teve atividade agonística superior.

[0039] A FIG. 27 mostra a expansão Eficiente de células -T CD8+ reativas para NRP-V7 por NPs ouro revestidos com NRP-V7/Kd. Foram usados 3 x 1012 NPs (~10 nm de tamanho) transportando 25 μg de pMHC (150 pMHC/NP). Camundongos NOD de 10 semanas de idade pré- diabéticos foram tratados com duas injeções semanais de NPs ouro revestidos com NRP-V7/Kd durante 5 semanas. O tetrâmero TUM/Kd é um controle negativo. Cada coluna dos painéis corresponde a um camundongo diferente.

[0040] A FIG. 28 representa a grande expansão das células T CD8+ cognatas em camundongos tratados com NPs revestidos com pMHC. 3 x 1012 de IGRP 206-214/Kd -NPs (~10 nm de tamanho) transportando 25 μg de pMHC (150 pMHC/NP) foram usados. Painel superior: perfil de um camundongo sacrificado após quatro doses. Painel inferior: perfil dos dois camundongos diferentes após 10 injeções (apenas sangue; vivo no momento desta apresentação).

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0041] Deve ser compreendido que esta invenção não está limitada a modalidades particulares descritas, como tal, pode, obviamente, variar. Deve também ser compreendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será apenas limitado pelas Reivindicações anexas.

[0042] Deve-se notar que, tal como usado no presente documento e nas Reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o, a” incluem os referentes plurais a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a “um excipiente” inclui uma pluralidade de excipientes.

I. DEFINIÇÕES

[0043] A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o normalmente entendido por um vulgar versado na técnica à qual esta invenção pertence. Como usados no presente documento, os seguintes termos têm os seguintes significados.

[0044] Tal como usado no presente documento, o termo “compreendendo” ou “compreende”, é destinado a significar que as composições e métodos incluem os elementos citados, mas não excluindo outros. “Consistindo essencialmente em, quando usado para definir as composições e métodos, deverá significar a exclusão de outros elementos de qualquer significado essencial para a combinação para os fins indicados. Dessa forma, uma composição consistindo essencialmente nos elementos tais como definidos no presente documento que não excluem outros materiais ou etapas que não afetam materialmente a(s) característica(s) básica(s) e nova(s) da invenção reivindicada, como a capacidade para tratar a doença inflamatória intestinal em um sujeito com necessidade de tal tratamento e/ou induzir uma resposta anti- inflamatória. “Consistindo em deverá significar a exclusão de mais do que elementos traços de outros ingredientes e etapas substanciais do método. As modalidades definidas por cada um destes termos de transição estão dentro do escopo da presente invenção.

[0045] Por “biocompatível”, entende-se que os componentes do sistema de distribuição não irão causar lesões do tecido ou lesões no sistema biológico humano. Para conferir a biocompatibilidade, os polímeros e os excipientes que tiveram história de uso seguro em humanos ou com status GRAS (Geralmente Aceito Como Seguro), serão usados, de preferência. Por biocompatibilidade, entende-se que os ingredientes e excipientes usados na composição serão finalmente “bioabsorvidos” ou depurados pelo organismo, sem efeitos adversos para o corpo. Para uma composição ser biocompatível e ser considerada como não tóxica, a mesma não deve causar toxicidade para as células. Da mesma forma, o termo “bioabsorvível” refere-se a nanopartículas feitas a partir de materiais que são sujeitos a bioabsorção in vivo ao longo de um período de tempo de tal modo que a acumulação de longo prazo do material no paciente é evitada. Em uma modalidade preferencial, a nanopartícula biocompatível é bioabsorvida, durante um período de menos de 2 anos, de preferência, menos de 1 ano e ainda com mais preferência, de menos de 6 meses. A taxa de bioabsorção está relacionada com o tamanho da partícula, o material usado e outros fatores bem conhecidos pelo versado na técnica. Uma mistura de materiais biocompatíveis, bioabsorviveis pode ser usada para formar as nanopartículas usadas na presente invenção. Em uma modalidade, o óxido de ferro e um polímero biocompatível, bioabsorvível podem ser combinados. Por exemplo, óxido de ferro e PGLA podem ser combinados para formar uma nanopartícula

[0046] Um complexo de antígeno-MHC-nanoesferas refere-se à apresentação de um peptídeo, carboidrato, lipídeo, ou outro segmento antigênica, fragmento, ou epítopo de uma molécula ou proteína antigênica (isto é, autopeptídeo ou autoantígeno) sobre uma superfície, tal como uma nanoesfera biodegradável biocompatível. “Antífeno”, tal como usado no presente documento refere-se a tolidade, parte, fragmento ou segmento de uma molécula, que pode induzir uma resposta imune em um sujeito, ou uma expansão de células antipatogênicas.

[0047] O termo “cerca de”, quando usado antes de uma designação numérica, por exemplo, temperatura, tempo, quantidade e concentração, incluindo faixa, indica aproximações que podem variar de acordo com (+) ou (-) 10%, 5%, ou 1%.

[0048] Um “mimético” é um análogo de um dado ligante ou peptídeo, em que o análogo é substancialmente semelhante ao ligante. “Substancialmente semelhante” significa que o análogo tem um perfil de ligação semelhante à do ligante, exceto que o mímico tem um ou mais grupos funcionais ou modificações que representam coletivamente menos do que cerca de 50%, menos do que cerca de 40%, menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 10%, ou menos do que cerca de 5% do peso molecular do ligante.

[0049] O termo “célula imune” refere-se a uma célula do sistema imune. As células do sistema imune incluem, por exemplo, esplenócitos de adultos e linfócitos T, linfócitos B e células de origem da medula óssea, tais como células apresentadoras de antígeno de um mamífero, que possuem atividade para o organismo a partir do qual é derivada a célula imune. Também estão incluídas as células do sistema imune inato, tais como, por exemplo, as células assassinas naturais, mastócitos, eosinófilos, basófilos e células fagocíticas, tais como macrófagos, neutrófilos e células dendríticas.

[0050] O termo “células T anti-inflamatórias” refere-se a uma célula T que promove uma resposta anti-inflamatória. A função anti- inflamatória da célula T pode ser conseguida através da produção e/ou secreção de proteínas anti-inflamatórias, citocinas, quimiocinas e semelhantes. As proteínas anti-inflamatórias são também destinadas a abranger os sinais antiproliferativos que suprimem as respostas imunes. As proteínas anti-inflamatórias incluem IL-4, IL-10, IL-13, IFN-α, TGF-β, IL-lra, G-CSF e os receptores solúveis para TNF e IL-6. Também estão incluídas as células anti-inflamatórias que têm um fenótipo inflamatório, mas matam as células apresentadoras de antígenos que orquestram uma resposta autoimune particular. Em certas modalidades, estas células produzem IFNY e TNFα, entre outras citocinas. Em certas modalidades, a célula T anti-inflamatória é uma que reconhece o epítopo bacteriano intestinal com baixa avidez. Em outras modalidades, a célula T anti- inflamatória é uma célula T citotóxica.

[0051] O termo “IL-10” ou “interleucina-10” refere-se a uma citocina codificada pelo gene da IL-10. A sequência da IL-10 é representada pelo Acesso GenBank n°. NM_000572.2 (mRNA) e NP 000.563.1 (proteína).

[0052] O termo “TGF-β” ou “fator de crescimento transformador beta” refere-se a uma proteína que pode ter um efeito anti-inflamatório. TGF-β é uma proteína secretada que existe em pelo menos três isoformas chamadas TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3. Este também era o nome original de TGF-β1, que foi o membro fundador desta família. A família de TGF-β faz parte de uma superfamília de proteínas conhecida como a superfamília do fator beta de crescimento de transformação, que inclui inibinas, activina, hormônio antimuleriana, proteína morfogenética do osso, decapentaplégica e Vg-1.

[0053] O termo “trato gastrointestinal “refere-se tanto o trato gastrointestinal superior quanto inferior. O trato gastrointestinal superior é composto do esôfago, estômago e duodeno. O trato gastrointestinal inferior inclui o intestino delgado e o intestino grosso.

[0054] O termo “micróbio” refere-se a um organismo unicelular microscópico. Micro-organismos incluem, por exemplo, bactérias, fungos, arquea e protistas.

[0055] Uma “quantidade eficaz” é uma quantidade suficiente para atingir o propósito pretendido, exemplos não limitativod de tais incluem: início da resposta imune, modulação da resposta imune, supressão de uma resposta inflamatória e modulação da atividade das células T ou populações de células T. Em um aspecto, a quantidade eficaz é uma que funciona para atingir um propósito terapêutico indicado, por exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz. Tal como descrito no presente documento em detalhe, a quantidade eficaz, ou a dosagem, depende do propósito da composição e dos componentes e pode ser determinada de acordo com a presente divulgação.

[0056] O uso da palavra “um” ou “uma”, quando usado em conjunção com o termo “compreendendo” nas Reivindicações e/ou Relatório Descritivo pode significar “um”, mas também é consistente com o significado de “um ou mais”, “pelo menos um” e “um ou mais de um”.

[0057] O termo “integrase” refere-se a uma proteína expressa em Bacteróides. O número de Acesso GenBank que corresponde à sequência de integrase é YP_001.300,081.1. Esta sequência é representada por SEQ ID No. 2. A SEQ ID No. 3 representa uma sequência de DNA de codificação da Integrase. A SEQ ID No. 1 corresponde a um epítopo na proteína integrase. Este epítopo é IYLKTNVYL (SEQ ID No. 1). As cepas de Bacteróides que são conhecidas por terem o epítopo IYLKTNVYL (SEQ ID No. 1) incluem, por exemplo, Bacteróides sp. 9_1__42FAA, Bacteróides sp. D4, Bacteróides sp. 3_1_33FAA, Bacteróides dorei 5_1_36/D4, Bacteróides dorei DSM 17855, Bacteróides vulgatus ATCC 8482, Bacteróides sp. 4_ 3_47FAA, Bacteróides vulgatus PC510.

[0058] Por “nanoesferas”, “NP”, ou “nanopartícula” entende-se aqui uma pequena partícula discreta que é administrada singularmente ou pluralmente a um sujeito, espécime de células ou espécime de tecido, conforme apropriado. Em certas modalidades, as nanoesferas são substancialmente esféricas. O termo “substancialmente esférico”, como usado no presente documento, significa que a forma das partículas não se desvie de uma esfera por mais do que cerca de 10%. Em certas modalidades, a nanopartícula não é um lipossoma ou partícula viral. Em outras modalidades, a nanopartícula é sólida. Vários complexos de antígenos ou peptídeos conhecidos da invenção podem ser aplicados às partículas. As nanoesferas desta invenção variam em tamanho de cerca de 1 nm a cerca de 1 μm e, de preferência, de cerca de 10 nm a cerca de 1 μm e, em alguns aspectos se refere ao diâmetro médio ou mediano de uma pluralidade de nanoesferas, quando uma pluralidade de nanoesferas é pretendida. Partículas de tamanho nanométrico menores podem ser obtidas, por exemplo, pelo processo de fracionamento através do qual as partículas maiores são deixadas assentar em uma solução aquosa. A parte superior da solução é então recuperada por métodos conhecidos pelos versados na técnica. Esta parte superior é enriquecida em partículas de tamanho menor. O processo pode ser repetido até que o tamanho médio desejado seja gerado.

[0059] O uso do termo “ou” nas Reivindicações é usado para significar “e/ou” a menos que explicitamente indicado para se referir apenas a alternativas ou as alternativas são mutuamente exclusivas, embora a divulgação suporte uma definição que se refere apenas a alternativa e “e/ou”.

[0060] Tal como usado no presente documento o termo “resposta imune” ou a sua “resposta imune” equivalente refere-se ao desenvolvimento de uma resposta mediada por células (mediada pelas células T específicas para o antígeno ou os seus produtos de secreção) dirigidacontra antígenos específicos de micróbio do trato gastrointestinal, ou um epítopo relacionado de antígenos específicos para micróbios do trato gastrointestinal. Uma resposta imune celular é provocada pela apresentação de epítopos de polipeptídeos em associação com moléculas de MHC da Classe I ou da Classe II, para ativar as células-CD4+ T helper específicas para o antígeno e/ou células T citotóxicas CD8+. A resposta também pode envolver a ativação de outros componentes.

[0061] Os termos “resposta inflamatória” e “inflamação”, tal como usado no presente documento, indicam a resposta biológica complexa de tecidos vasculares de um indivíduo a estímulos nocivos, tais como patógenos, células danificadas, ou irritantes e inclui a secreção de citocinas e, mais particularmente, de citocinas pró-inflamatórias, isto é, as citocinas que são produzidas predominantemente por células imunes ativadas e estão envolvidas na amplificação de reações inflamatórias. Exemplos de citocinas pró-inflamatórias incluem mas, sem limitação, IL- 1, IL-6, TNF-a, IL-17, IL21, IL23 e TGF-β. Inflamações exemplares incluem inflamação aguda e inflamação crônica. A inflamação aguda indica um processo de curta duração, caracterizado por sinais clássicos de inflamação (inchaço, vermelhidão, dor, calor e perda de função), devido à infiltração de tecidos por plasma e leucócitos. Uma inflamação aguda geralmente ocorre enquanto o estímulo prejudicial está presente e cessa uma vez que o estímulo foi removido, interrompido, ou emparedado por cicatrizes (fibrose). A inflamação crônica indica uma condição caracterizada pela inflamação simultânea ativa, destruição do tecido e tentativas de reparação. A inflamação crônica não é caracterizada pelos sinais clássicos da inflamação aguda listados acima. Em vez disso, o tecido cronicamente inflamado é caracterizado pela infiltração de células imunes mononucleares (monócitos, macrófagos, linfócitos e células de plasma), destruição dos tecidos e tentativas de cicatrização, o que inclui a angiogênese e fibrose. A inflamação pode ser inibida no sentido da presente divulgação afetando e, em particular, inibindo qualquer um dos eventos que formam a resposta biológica complexa associada com a inflamação em um indivíduo.

[0062] Os termos “epítopo” e “determinante antigênico” são usados indiferentemente para se referir a um sítio em um antígeno ao qual as células B e/ou T respondem ou reconhecem. Os epítopos de células B podem ser formados tanto a partir de aminoácidos contíguos quanto aminoácidos não contíguos justapostos por dobragem terciária de uma proteína. Os epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são normalmente mantidos em exposição a solventes desnaturantes enquanto que os epítopos formados por dobragem terciária são tipicamente perdidos no tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3 e mais geralmente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos de determinação da conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, por exemplo, Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996). As células T reconhecem os epítopos contínuos de cerca de nove aminoácidos para as células CD8 ou cerca de 13-15 aminoácidos para as células CD4. As células T que reconhecem o epítopo podem ser identificadas por ensaios in vitro que medem a proliferação dependente de antígenos, tal como determinado pela incorporação de 3H-timidina pelas células T iniciadas em resposta a um epítopo (Burke et al., J. Inf. Dis., 170:1110-1119, 1994), pela matança dependente de antígeno (ensaio de linfócitos T citotóxicos, Tigges et al, J. Immunol, 156 (10):3901- 3910, 1996) ou por secreção de citocinas. A presença de uma resposta imune mediada por células pode ser determinada por ensaios de proliferação (células T CD4+ ou ensaios de CTL (linfócitos T citotóxicos).

[0063] Opcionalmente, um antígeno ou, de preferência, um epítopo de um antígeno, pode ser conjugado quimicamente a, ou expressos como uma proteína de fusão com outras proteínas, tais como proteínas relacionadas a MHC e MHC.

[0064] Tal como usados no presente documento, os termos “paciente” e “sujeito” são usados como sinônimos e referem-se a um mamífero. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano. Em outras modalidades, o paciente ou sujeito é um mamífero vulgarmente usado em laboratório, tal como um camundongo, rato, símio, canino, felino, bovino, equino ou ovino.

[0065] Tal como é usado no presente pedido, o termo “polinucleotídeo” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que é quer recombinante ou foi isolada isenta de ácido nucleico genômico total. Incluídos dentro do termo “polinucleotídeo” são os ácidos nucleicos (oligonucleotídeos de 100 resíduos de comprimento ou menos), os vetores recombinantes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagos, vírus e semelhantes. Os polinucleotídeos incluem, em certos aspectos, as sequências reguladoras, isoladas substancialmente longe de seus genes de ocorrência natural ou sequências de codificação da proteína. Os polinucleotídeos podem ser RNA, DNA, os análogos dos mesmos, ou uma combinação dos mesmos. Um ácido nucleico que codifica a totalidade ou parte de um polipeptídeo pode incluir uma sequência de ácidos nucleicos contígua que codifica a totalidade ou uma parte de um tal polipeptídeo dos seguintes comprimentos: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, pares de 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000 ou mais nucleotídeos, nucleósideoss, ou pares de bases. É também contemplado que um polipeptídeo particular a partir de uma determinada espécie pode ser codificado pelos ácidos nucleicos que contêm variações naturais que têm sequências de ácidos nucleicos ligeiramente diferentes, mas, mesmo assim, codificam a mesma proteína, polipeptídeo ou peptídeo ou proteína, polipeptídeo ou peptídeo substancialmente semelhante.

[0066] Um polinucleotídeo é composto de uma sequência específica de quatro bases de nucleotídeos: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); e uracila (U) para timina quando o polinucleotídeo é de RNA. Assim, o termo “sequência de polinucleotídeos” é a representação alfabética de uma molécula de polinucleotídeo. Esta representação alfabética pode ser introduzida em bases de dados de um computador com uma unidade de processamento central e usada para aplicações de bioinformática, tais como genômica funcional e pesquisa de homologia.

[0067] O termo “isolado” ou “recombinante”, tal como usado no presente documento no que diz respeito aos ácidos nucleicos, tais como DNA ou RNA, refere-se a moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, que estão presentes na fonte natural da macromolécula bem como polipeptídeos. O termo “ácido nucleico isolado ou recombinante” pretende incluir fragmentos de ácidos nucleicos que não são de ocorrência natural como fragmentos e que não seriam encontrados no estado natural. O termo “isolado” também é usado no presente documento para referir-se a polinucleotídeos, polipeptídeos e proteínas que são isoladas a partir de outras proteínas celulares e se destina a abranger tanto polipeptídeos purificados quanto recombinantes. Em outras modalidades, o termo “isolado ou recombinante” significa separado dos constituintes celulares e, de outro modo, em que a célula, tecido, polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmento(s) dos mesmos, os quais são normalmente associados na natureza. Por exemplo, uma célula isolada é uma célula que é separada a partir dos tecidos ou células de fenótipo ou genótipo diferente. Um polinucleotídeo isolado está separado de nucleotídeos contíguos 3’ e 5’, com os quais está normalmente associado no seu ambiente nativo ou natural, por exemplo, sobre o cromossoma. Como é evidente para aqueles versados na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmento(s) dos mesmos que não ocorre naturalmente, não necessita de “isolamento” para distingui-lo do seu homólogo de ocorrência natural.

[0068] A região de polinucleotídeo ou um polinucleotídeo (ou uma região de polipeptídeo ou um polipeptídeo) que tem uma determinada porcentagem (por exemplo, 80%, 85%, 90%, ou 95%) de “identidade de sequência” a uma outra sequência significa que, quando alinhadas, essas porcentagens de bases (ou aminoácidos) são as mesmas em comparação com as duas sequências. O alinhamento e a homologia percentual ou identidade de sequência podem ser determinados com o uso de programas de software conhecidos na técnica, por exemplo os descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 1987) Supplement 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1. De preferência, os parâmetros padrões são usados para o alinhamento. Um programa de alinhamento preferido é o BLAST que usa os parâmetros padrões. Em particular, os programas preferenciais são BLASTN e BLASTP, que usam os seguintes parâmetros padrões: Código genético = padrão; filtro = nenhum; filamento = ambos; corte = 60; espectativa = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; selecionar por = HIGH SCORE; Base de Dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções CDS de GenBank + SwissProtein + SPupdate + PIR. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço eletrônico: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST.

[0069] Deve ser inferido sem recitação explícita e, a menos que de outra forma pretendida, que, quando a presente invenção se refere a um polipeptídeo, proteína, anticorpo ou polinucleotídeo, um equivalente ou um equivalente biologicamente de tal destina-se a fazer parte do escopo da presente invenção. Tal como usado no presente documento, o termo “equivalente biológico do mesmo” é destinado a ser sinônimo de “equivalente do mesmo” e quando se refere a uma proteína, anticorpo, fragmento, polipeptídeo ou ácido nucleico de referência, pretende que estes tenham homologia mínima, mantendo a estrutura ou a funcionalidade desejada. A menos que especificamente descrito no presente documento, é contemplado que qualquer polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína aqui mencionados, também inclui os seus equivalentes. Em um aspecto, um polinucleotídeo equivalente é um que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo ou complemento do polinucleotídeo, tal como descrito no presente documento para uso nos métodos descritos. Em outro aspecto, um polipeptídeo de ligação ao antígeno ou anticorpo equivalente refere-se a um que se liga com pelo menos 70%, ou, alternativamente, pelo menos 75%, ou, alternativamente, pelo menos 80%, ou, alternativamente, pelo menos 85%, ou, alternativamente, pelo menos 90%, ou alternativamente, pelo menos, 95% de afinidade ou afinidade maior a um fragmento de ligação ao antígeno ou anticorpo de referência. Em um outro aspecto, o equivalente do mesmo compete com a ligação do fragmento de ligação ao antígeno ou anticorpo ao seu antígeno mediante um ensaio de ELISA competitivo. Em um outro aspecto, um equivalente pretende pelo menos cerca de 80% de homologia ou identidade e, alternativamente, pelo menos cerca de 85%, ou, alternativamente, pelo menos cerca de 90%, ou, alternativamente, pelo menos cerca de 95%, ou, alternativamente, 98% por cento de homologia ou identidade e exibe atividade biológica substancialmente equivalente à proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico de referência.

[0070] “Hibridização” refere-se a uma reação em que um ou mais polinucleotídeos reagem para formar um complexo que é estabilizado através de ligação de hidrogênio entre as bases dos resíduos de nucleotídeos. A ligação de hidrogênio pode ocorrer por emparelhamento de bases de Watson-Crick, ligação de Hoogstein, ou de qualquer outra forma específica de sequência. O complexo pode compreender dois filamentos que formam uma estrutura duplex, três ou mais filamentos que formam um complexo de multifilamentos, um filamento de auto- hibridização simples, ou qualquer combinação dos mesos. A reação de hibridização, pode constituir uma etapa em um processo mais amplo, tal como a iniciação de uma reação de PC, ou a clivagem enzimática de um polinucleotídeo através de uma ribozima.

[0071] Exemplos de condições rigorosas de hibridização são: temperaturas de incubação de cerca de 25°C a cerca de 37°C; concentrações de tampão de hibridização de cerca de 6 x SSC a cerca de 10 x SSC; concentrações de formamida de cerca de 0% a cerca de 25%; e soluções de lavagem de cerca de 4 x SSC a cerca de 8 x SSC. Exemplos de condições de hibridização moderada incluem: temperaturas de incubação de cerca de 40°C a cerca de 50°C; concentrações de tampão de cerca de 9 x SSC a cerca de 2 x SSC; concentrações de formamida de cerca de 30% a cerca de 50%; e soluções de lavagem de cerca de 5 x SSC a cerca de 2 x SSC. Exemplos de condições de elevado rigor incluem: temperaturas de incubação de cerca de 55°C a cerca de 68°C; concentrações de tampão de cerca de 1 x SSC a cerca de 0,1 x SSC; concentrações de formamida de cerca de 55% a cerca de 75%; e soluções de lavagem de cerca de 1 x SSC, 0,1 x SSC, ou água desionizada. Em geral, os tempos de incubação de hibridização são a partir de 5 minutos até 24 horas, com 1, 2, ou mais etapas de lavagem e os tempos de incubação de lavagem são de cerca de 1, 2, ou 15 minutos. SSC é NaCl 0,15 M e tampão citrato de 15 mM. Entende-se que os equivalentes de SSC que usam outros sistemas tampão podem ser empregados.

[0072] “Homologia” ou “identidade” ou “similaridade” refere-se a similaridade de sequências entre dois peptídeos ou entre duas moléculas de ácido nucleico. A homologia pode ser determinada por comparação de uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para propósitos de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas nessa posição. Um grau de homologia entre sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências. Uma sequência “não relacionada” ou “não homóloga” compartilha menos do que 40% de identidade, ou, alternativamente, menos do que 25% de identidade, com uma das sequências da presente invenção.

[0073] A “homologia” ou “identidade” ou “semelhança” também pode se referir a duas moléculas de ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas.

[0074] Tal como usados no presente documento, os termos “tratar”, “tratamento” e similares são usados no presente documento para significar a obtenção de um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completamente ou parcialmente um distúrbio ou sinal ou sintoma da mesma, e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa de um distúrbio e/ou um efeito adverso atribuível ao distúrbio. Em um aspecto, o tratamento indica uma redução da inflamação em um paciente. Métodos para medição desta incluem, sem limitação vasodilatação, produção de marcadores de inflamação e cessação de infiltração de leucócitos. Os marcadores de inflamação incluem, por exemplo, IL-6, IL-8, IL-18, TNF- alfa e CRP. Qualquer método adequado para medir e monitorar tais marcadores é conhecido na técnica.

[0075] Evitar quer dizer evitar um distúrbio ou efeito in vitro ou in vivo, em um sistema ou sujeito que está predisposto ao distúrbio ou efeito.

[0076] Uma “composição” é pretende significar uma combinação de agente ativo e outro composto ou composição, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou ativo, tal como um adjuvante.

[0077] Uma “composição farmacêutica” pretende incluir a combinação de um agente ativo com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição adequada para uso de diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.

[0078] O termo “códon funcionalmente equivalente” é usado no presente documento para se referir a códons que codificam o mesmo aminoácido, tais como os seis códons para arginina ou serina e também se refere a códons que codificam aminoácidos biologicamente equivalentes (ver Tabela abaixo). Tabela de Códons

[0079] Tal como usado no presente documento, uma “proteína” ou “polipeptídeo” ou “peptídeo” refere-se a uma molécula que compreende pelo menos cinco resíduos de aminoácidos.

[0080] Outros objetivos, características e vantagens da presente invenção irão tornar-se evidentes a partir da seguinte descrição detalhada. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades específicas da invenção, são dados a título de ilustração apenas, uma vez que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da invenção se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir desta descrição detalhada.

Modalidades Descritivas

[0081] Era anteriormente desconhecido que os peptídeos antigênicos a partir de bactérias simbióticas do trato gastrointestinal eram especificamente reconhecidos por células T do hospedeiro endógeno após serem processados por células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs, tais como as células dendríticas ou DCs) e que esta interação conduzida pelo antígeno entre uma célula T e APC cognatas pode inibir IBD. Sem estar limitado pela teoria, os Requerentes acreditam que as proteínas a partir das bactérias que residem ou infectam o trato gastrointestinal são processadas pelo proteassoma ou no endossoma e os peptídeos resultantes são transportados para o retículo endoplasmático para a ligação a moléculas de MHC endógenas de classe I ou de classe II, as quais são, em seguida, transportadas para a membrana do plasma de APC, que, em seguida, ativa as células T cognatas.

[0082] Os Requerentes acreditam que esta é a primeira divulgação de que os antígenos de bactérias associadas ao trato gastrointestinal são processados e apresentados às células T endógenas cognatas com a capacidade para suprimir a doença inflamatória do intestino e, em consequência, os Requerentes acreditam que estes antígenos podem ser usados como um alvo para promover o recrutamento e a acumulação de células T autorreguladoras (anti-inflamatórias) para, por exemplo, o intestino na doença inflamatória do intestino. Os complexos de antígeno- MHC-nanopartículas foram anteriormente mostrados para expandir as populações de células T terapêuticas em outras doenças (por exemplo, ver Publicação de Patente US n°. 2009/0155292.), mas era desconhecido que esta tecnologia pode suprimir a inflamação, por exemplo, no trato gastrointestinal ou tratar doenças inflamatórias do intestino. As composições e métodos descritos no presente documento são úteis para a supressão da inflamação e para o tratamento de doenças associadas com a mesma.

II. MÉTODOS

[0083] Os métodos como descritos no presente documento compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou consistem adicionalmente na administração de uma quantidade eficaz de um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula a uma célula, tecido ou sujeito para o propósito de um ou mais dentre: (1) induzir uma resposta anti-inflamatória em uma célula ou tecido; (2) tratar ou reduzir a inflamação em um paciente necessitado do mesmo; (3) acumular células T anti-inflamatórias, autorreguladoras, em um paciente com necessidade das mesmas e/ou (4) transferirde linfócitos T citotóxicos alvos de epítopos bacterianos do intestino em um paciente com necessidade dos mesmos. Em uma modalidade, os linfócitos T reconhecem o epítopo citotóxico bacteriano intestinal com baixa avidez.

[0084] Em uma modalidade, a inflamação do trato gastrointestinal é reduzida ou tratada. Métodos para determinar e monitorar a terapia são conhecidos na técnica e descritos brevemente. Quando distribuída in vitro, a administração é por contato da composição com o tecido ou célula por qualquer método apropriado, por exemplo, através da administração ao meio de cultura de tecidos ou célula e é útil como uma triagem para determinar se a terapia é apropriada para um indivíduo ou para selecionar terapias alternativas para serem usadas como um substituto ou em combinação com as composições descritas. Quando administrada in vivo, a administração é por administração sistêmica ou local. In vivo, os métodos podem ser praticados em um animal não humano para pesquisar terapias alternativas que podem ser usadas como um substituto ou em combinação com as composições descritas antes da administração a seres humanos. Em um mamífero humano ou não humano, elas também são úteis para tratar a doença ou distúrbio.

[0085] Em certas modalidades, o paciente a ser tratado pelos métodos da presente divulgação sofre de uma doença gastrointestinal tendo como um sintoma ou condição da mesma a inflamação do tecido gastrointestinal. Exemplos não limitantes de doenças gastrointestinais incluem a doença inflamatória do intestino, colite, doença de Crohn, reações alérgicas do trato gastrointestinal, alergias alimentares, doenças eosinofílicas no sistema gastrointestinal, síndrome do intestino irritável, doença celíaca e hemorrhagia gástrica. Em uma modalidade, a doença é selecionada a partir do grupo de: doença inflamatória do intestino, colite, doença de Crohn, inflamação alérgica do trato gastrointestinal e a doença celíaca. Em uma modalidade relacionada, a doença é a doença inflamatória do intestino.

[0086] Os métodos descritos no presente documento são úteis para a indução de uma resposta anti-inflamatória em uma célula ou tecido. Em uma modalidade, a célula é uma célula ou tecido do trato gastrointestinal. O trato gastrointestinal superior é composto do esôfago, estômago e duodeno. A demarcação exata entre “superior” e “inferior” pode variar. Após a dissecção grosseira, o duodeno pode parecer ser um órgão unificado, mas muitas vezes é dividido em duas partes com base na função, suprimento arterial, ou embriologia. O trato gastrointestinal inferior inclui o intestino delgado e o intestino grosso. O intestino delgado tem três partes: o duodeno, jejuno, íleo e. No duodeno, as enzimas digestivas do pâncreas e vesícula biliar (bile) se misturam. As enzimas digestivas quebram as proteínas e bile e emulsionam as gorduras em micelas. O duodeno contém glândulas de Brunner que produzem bicarbonato e suco pancreático que contém bicarbonato para neutralizar o ácido clorídrico do estômago. O jejuno é a seção intermediária do intestino, que conecta o duodeno até ao íleo. Ele contém as circulares de plicas e vilosidades para aumentar a área da superfície da parte do trato GI. O íleo tem vilosidades, onde todas as moléculas solúveis são absorvidas para a corrente sanguínea (capilares e vaso quilífero). O intestino grosso tem três partes: ceco, cólon e reto. O apêndice vermiforme está fixo ao ceco. O cólon inclui o cólon ascendente, cólon transverso, cólon descendente e flexura sigmóide. A principal função do cólon é absorver a água, mas também contém bactérias produtoras de vitaminas benéficas.

[0087] Em uma outra modalidade, a resposta anti-inflamatória é induzida em uma célula imune ou tecido contendo as mesmas. As células imunes incluem, por exemplo, esplenócitos de adultos e linfócitos T, linfócitos B e células de origem de medula óssea, tais como células apresentadoras de antígeno defeituosos de um mamífero, que têm atividade para o organismo a partir do qual é derivada a célula imune.

[0088] O MHC do complexo de antígeno-MHC-nanopartícula pode ser MHC I, MHC II, ou MHC não clássico. As proteínas de MHC estão descritas no presente documento. Em uma modalidade, MHC do complexo de antígeno-MHC-nanopartícula é uma MHC de classe I. Em outra modalidade, o MHC é um MHC de classe II. Em outras modalidades, o componente de MHC do complexo de antígeno-MHC- nanopartícula é MHC de classe II ou uma molécula de MHC não clássica, tal como descrito no presente documento.

[0089] Em um dos seus aspectos de método, é fornecido um método para a acumulação de células T anti-inflamatórias do intestino (específicas para micróbio ou específicas para micróbios gastrointestinais) em um paciente com necessidade das mesmas. Em uma modalidade, as células T são acumuladas no trato gastrointestinal do paciente. Em uma outra modalidade, a célula T é uma célula T CD8+ convencional que reconhece qualquer antígeno microbiano do trato gastrointestinal. Em uma outra modalidade, a célula T é uma célula T CD8+ de autoregulação semelhante a memória. Em ainda uma outra modalidade, a célula T é uma célula T CD4+. Em uma modalidade relacionada, a célula T secreta IL-10 ou TGFβ.

[0090] Os detalhes sobre modos de administração in vitro e in vivo são descritos dentro.

III. COMPLEXOS DE ANTÍGENO-MHC-NANOPARTÍCULA

[0091] Certos aspectos se relacionam com processos de produção de medicamentos anti-IBD específicos de antígeno do intestino que visam especificamente a inflamação do intestino, sem comprometer a imunidade sistêmica. O Exemplo 2 descreve a produção de complexos de antígeno-MHC-nanopartículas. OS complexos de antígeno-MHC- nanopartículas úteis na presente invenção compreendem um antígeno derivado de um micróbio do trato gastrointestinal. É contemplado que a administração de nanopartículas revestidas com complexos de MHC- antígeno específicos do intestino a um paciente irá resultar em uma expansão de células T circulantes específicas para o antígeno do intestino, que são de cerca de 0,5% a cerca de 90% do total de células T circulantes, ou de cerca de 1% a cerca de 80%, ou de cerca de 5% a cerca de 80%, ou de cerca de 10% a cerca de 80%, ou de cerca de 10% a cerca de 50%, ou de cerca de 50% a cerca de 90%, ou de cerca de 20% a cerca de 50%), ou de cerca de 30% a cerca de 60%, ou de cerca de 35% a cerca de 65%, ou de cerca de 40% a cerca de 70%), ou de cerca de 45% a cerca de 75%, ou de cerca de 50% a cerca de 80%, ou de cerca de 25% a cerca de 55%, ou de cerca de 0,5% a cerca de 1%, ou de cerca de 1% a cerca de 2,5%, ou de cerca de 2,5%) a cerca de 5%, ou de cerca de 0,1% a cerca de 5%, ou de cerca de 1% a cerca de 5%, ou de cerca de 0,1% a cerca de 10%.

A. Polipeptídeos e Polinucleotídeos

[0092] Outros aspectos referem-se a um polipeptídeo isolado ou purificado compreendendo, ou consistindo essencialmente em, ou consistindo ainda adicionalmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID No. 1 ou um polipeptídeo que tem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, ou, alternativamente, pelo menos 85%, ou, alternativamente, pelo menos 90%, ou, alternativamente, pelo menos 95%, ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 1. Também são fornecidos polinucleotídeos isolados e purificados que codificam o polipeptídeo correspondente à SEQ ID No. 1, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 1, ou, alternativamente, pelo menos 85%, ou, alternativamente, pelo menos 90%, ou, alternativamente, pelo menos 95%, ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 1 ou equivalente, ou um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo, seu equivalente ou o seu complemento e polipeptídeos isolados ou purificados codificados por esses polinucleotídeos.

[0093] Outros aspectos referem-se a um polipeptídeo isolado ou purificado compreendendo, ou consistindo essencialmente em, ou consistindo ainda adicionalmente, na sequência de aminoácidos de SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 7, ou 8 ou um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência, pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 4-8, ou, alternativamente, pelo menos 85%, ou, alternativamente, pelo menos 90%, ou, alternativamente, pelo menos 95%, ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência com as SEQ ID Nos. 4-8. Também são fornecidos os polinucleotídeos isolados e purificados que codificam o polipeptídeo correspondente à SEQ ID Nos. 4-8, ou um equivalente, ou um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo, seu equivalente ou o seu complemento e polipeptídeos isolados ou purificados codificados por esses polinucleotídeos ou um tendo, pelo menos, cerca de 80% de identidade de sequência com os polinucleotídeos que codificam as SEQ ID Nos.4-8, ou, alternativamente, pelo menos 85%, ou, alternativamente, pelo menos 90%, ou, alternativamente, pelo menos 95%, ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência com polinucleotídeos que codificam as SEQ ID Nos.4-8. LISTAGENS DE SEQUÊNCIAS SEQ ID No. 1: Epítopo BacIYL IYLKTNVYL SEQ ID No.2: Proteína integrase (Bacteróides vulgatus) MLEKIRYRLVFNRQKKLNKQGTALVQVEAYLNQRKIYLKTNVYLKPECWSREGAQVINHPQSNELNAMLY EYILYLQGIELGYWKRGIPATLSLLKDAVKKKSAVNVSFSTFAKSAIDNSDKKQSTKDNLHSTLAVLNDF RSGLDFKDLTYTFLRDFEQYLREKGNAVNTIAKHMRQLRTLVNEAINQGYMHADAYPFRKYKIKQEKGRH EFLTPDELKKLETVEVEEKSMRHVLDAFLFCCYTGLRYSDFCQLTPENFIRVNGKRWLYFKSVKTGVEIR LPLHLLFESRALGILDRYPDIGSLVSLPCNSEVNKQLRKLTGLCGIKKRITYHVSRHTCATLLVHQGVAI TTVQKLLGHTSVKTTQIYSEVLSSTIVRDLKNVQRKRKKVKMFPDKGLRTSDFIDNR SEQ ID No. 3: Sequência de DNA da integrase (Bacteróides vulgatus) ATGCTAGAGAAGATACGATACAGGTTGGTCTTTAACCGCCAAAAGAAACTGAATAAGCAAGGCACGGCCCTTGTACA GGTTGAAGCCTATTTGAACCAAAGGAAAATCTACCTGAAGACCAATGTTTACCTCAAACCGGAGTGCTGGAGCCGTG AGGGGGCACAAGTCATTAACCACCCCCAATCTAACGAACTCAACGCAATGCTCTATGAATACATCCTGTATCTGCAA GGCATAGAGTTGGGGTATTGGAAGCGCGGAATACCTGCCACACTCTCACTACTGAAGGATGCTGTCAAGAAGAAAAG TGCCGTGAATGTCAGCTTCTCCACTTTCGCCAAATCAGCCATTGACAATTCGGACAAGAAGCAGTCCACCAAGGACA ACCTGCACTCGACACTGGCGGTCCTGAATGACTTCCGTTCCGGATTGGACTTCAAGGATCTTACCTATACATTCCTT CGTGATTTTGAGCAATATTTAAGGGAAAAGGGCAATGCGGTCAATACGATAGCCAAGCACATGAGACAGCTCCGTAC CTTGGTCAATGAGGCAATCAACCAGGGATATATGCACGCGGACGCTTATCCGTTCAGAAAGTACAAAATCAAACAGG AGAAAGGCAGACATGAGTTTCTTACCCCGGACGAGCTGAAGAAGCTGGAAACGGTCGAAGTGGAAGAGAAGTCCATG CGCCATGTGCTCGATGCCTTCCTGTTCTGCTGTTATACCGGATTGCGCTATTCTGACTTCTGCCAGCTCACACCTGA GAATTTCATTAGAGTAAACGGCAAACGGTGGCTGTACTTCAAATCCGTCAAGACAGGGGTGGAAATCCGTCTGCCGT TACATCTGCTGTTTGAAAGCAGGGCATTGGGCATTCTTGACCGTTATCCGGATATAGGTAGTCTTGTATCCCTACCC TGTAACTCGGAAGTGAATAAGCAGCTTCGAAAGCTGACCGGATTGTGTGGTATCAAAAAACGGATAACCTACCATGT GAGCCGTCATACCTGTGCCACCCTGCTGGTTCATCAGGGAGTTGCGATTACAACAGTCCAGAAGCTGCTCGGACATA CTTCCGTAAAGACCACACAGATTTATTCGGAGGTACTTTCCAGCACCATTGTGCGTGACTTGAAAAATGTTCAAAGG AAAAGGAAAAAAGTAAAGATGTTTCCTGATAAAGGCTTGAGAACATCTGATTTTATAGACAACCGGTAG SEQ ID No. 4: Sequência de peptídeo BacInt40-54: TNVYLKPECWSREGA SEQ ID No.5: Sequência de peptídeo Baclnt81-95: LGYWKRGIPATLSLL SEQ ID No. 6: Sequência de peptídeo BacInt365-379: TQIYSEVLSSTIVRD SEQ ID No. 7: Sequência de peptídeo Baclnt 57_ 71: INHPQSNELNAMLYE SEQ ID No. 8: Sequência de peptídeo Baclnt 88_102: IPATLSLLKDAVKKK

[0094] Os antígenos, incluindo segmentos, fragmentos e outras moléculas derivadas de uma espécie antigênica, incluindo, mas sem limitação, peptídeos, carboidratos, lipídeos ou outras moléculas apresentadas por moléculas de MHC clássicas e não clássicas da invenção são tipicamente complexados ou operativamente acoplados a uma molécula de MHC ou derivado da mesma. O reconhecimento de antígenos por linfócitos T é o complexo principal de histocompatibilidade (MHC)-restrito. Um determinado linfócito T reconhecerá um antígeno apenas quando estiver ligado a uma molécula de MHC particular. Em geral, os linfócitos T são estimulados apenas na presença de moléculas auto-MHC e o antígeno é reconhecido como fragmentos de antígeno ligados a moléculas de MHC. A restrição de MHC define a especificidade dos linfócitos T em termos do antígeno reconhecido e em termos da molécula de MHC que liga o seu(s) fragmento(s) antigênico(s). Em aspectos particulares certos antígenos serão emparelhados com certas moléculas de MHC ou polipeptídeos derivados das mesmas.

[0095] O termo “operativamente acoplado” ou “revestido”, tal como usado no presente documento, refere-se a uma situação em que os componentes de polipeptídeo individual (por exemplo, MHC) e antigênicos (por exemplo, peptídeo) são combinados para formar o complexo ativo antes da ligação ao sítio local, por exemplo, uma célula imune. Isto inclui a situação em que os componentes de complexos polipeptídicos individuais são sintetizados ou expressos de forma recombinante e subsequentemente isolados e combinados para formar um complexo, in vitro, antes da administração a um sujeito; a situação em que um polipeptídeo de fusão ou quimérico (isto é, cada componente proteico discreto do complexo está contido em uma única cadeia de polipeptídeo) é sintetizado ou expresso de forma recombinante, como um complexo intacto. Tipicamente, os complexos de polipeptídeo são adicionados às nanopartículas para produzir nanopartículas com complexos de polipeptídeo adsorvidos ou acoplados com uma razão entre o número de moléculas:número de nanopartículas desde cerca de pelo menos ou, no máximo, cerca de 0,1, 0,5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500 ou mais para: 1, mais tipicamente de 0,1:1, 1:1 a 50:1 ou 300:1. Em uma modalidade específica, a razão entre o número de moléculas de antígeno-MHC para o número de nanopartículas é de cerca de 10:1 a cerca de 1000:1. O teor de polipeptídeo das nanopartículas pode ser determinado por meio de técnicas convencionais.

[0096] Os peptídeos e as proteínas aqui descritos podem também ser usados em métodos convencionais para o tratamento da inflamação do trato gastrointestinal. Em consequência, certos aspectos referem-se a métodos para a indução de uma resposta anti-inflamatória em uma célula ou tecido, compreendendo o contato da célula ou tecido com uma quantidade eficaz de um antígeno, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro de, ou infecta, uma célula ou tecido do trato gastrointestinal (GI), ou é um antígeno associado a G1. Um outro aspecto refere-se a um método para o tratamento da inflamação em um doente em necessidade do mesmo, que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antígeno para o paciente, em que o antígeno é derivado de um micróbio que reside dentro de, ou infecta, uma célula ou tecido do trato gastrointestinal ou é um antígeno associado a G1. Um outro aspecto refere-se a um método para a acumulação de células T anti-inflamatórias no trato gastrointestinal de um paciente em necessidade do mesmo que compreende a administração de uma quantidade eficaz de um antígeno para o paciente, em que o antígeno é um antígeno derivado de um micróbio que reside dentro de, ou infecta, uma célula ou tecido do trato gastrointestinal ou um antígeno associado G1. O antígeno pode ser, por exemplo, um antígeno que corresponde a um peptídeo tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência do peptídeo do grupo: SEQ ID Nos. 1, 2, 4, 5, 6, 7, ou 8. Em determinadas modalidades, o antígeno é complexado com moléculas de MHC antes da administração. Em outras modalidades, o antígeno é administrado com um adjuvante. Exemplos de adjuvantes adequados incluem, mas, sem limitação, sais minerais, meio completo e incompleto de Freund e polinucleotídeos. Outros exemplos não limitativos de adjuvantes adequados incluem monofosforil lipídeo A (MPL), derivados mutantes da enterotoxina termolábil de E. coli, os derivados mutantes da toxina da cólera, oligonucleotídeos de CPG e adjuvantes derivados de esqualeno.

B. Moléculas de MHC

[0097] Os antígenos intracelulares e extracelulares apresentam desafios bem diferentes para o sistema imune, tanto em termos de reconhecimento e de resposta apropriada. A apresentação de antígenos a células T é mediada por duas classes distintas de moléculas de MHC de classe I (MHC-I) e MHC de classe II (MHC-II) que utilizam vias distintas de processamento do antígeno. Os peptídeos derivados a partir de antígenos intracelulares são apresentados a células T CD8+ por moléculas de MHC de classe I, que são expressas em todas as células virtualmente, enquanto os peptídeos derivados de antígenos extracelulares são apresentados a células T CD4+ por moléculas de MHC- II. No entanto, existem algumas exceções a esta dicotomia. Vários estudos demonstraram que os peptídeos gerados a partir de particulado endocitado ou proteínas solúveis são apresentados sobre moléculas do MHC-I em macrófagos bem como em células dendríticas. Em certas modalidades da invenção, um antígeno particular é identificado e apresentado no complexo de antígeno-MHC-nanopartícula, no contexto de um polipeptídeo de MHC de classe I ou II adequado. Em certos aspectos, a constituição genética de um sujeito pode ser avaliada para determinar quais polipeptídeo de MHC devem ser usados por um paciente particular e um conjunto particular de peptídeos.

[0098] As moléculas de MHC não clássico são também contempladas para uso nos complexos de MHC da presente invenção. As moléculas de MHC não clássicos são não polimórficas, conservadas entre as espécies e possuem bolsas de ligação ao ligante estreitas, profundas, hidrofóbicas. Estas bolsas de ligação são capazes de apresentar glicolipídeos e fosfolipídeos a células T assassinas naturais (NKT) ou certos subconjuntos de células T CD8+, tais como células T CD8+ restritas por Qal ou HLA-E. As células NKT representam uma população única de linfócitos que coexpressa os marcadores de células NK e um receptor de células T semi-invariante (TCR). Elas estão envolvidas na regulação das respostas imunes associadas com uma ampla gama de doenças.

C. Componentes Antigênicos

[0099] Alguns aspectos da invenção incluem composições e métodos relativos a composições antigênicas incluindo segmentos, fragmentos ou epítopos de polipeptídeos, peptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídeos e outras moléculas que provocam ou induzem uma resposta antigênica, geralmente referida como antígenos. Em particular, os segmentos ou fragmentos antigênicos de determinantes antigênicos, que conduzem à destruição da célula por meio de uma resposta autoimune, podem ser identificados e usados na fabricação de um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula descrito no presente documento. As modalidades da invenção incluem composições e métodos para a modulação da resposta imune de uma célula ou tecido do corpo.

[0100] Os polipeptídeos e peptídeos da invenção podem ser modificados por várias deleções, inserções e/ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos e/ou peptídeos modificados são capazes de modular uma resposta imune em um sujeito. Em algumas modalidades, uma versão do tipo selvagem de uma proteína ou peptídeo é usada, no entanto, em muitas modalidades da invenção, uma proteína ou polipeptídeo modificado é usada para gerar um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula. Um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula pode ser usado para gerar uma resposta imune anti-inflamatória, para modificar a população de células T do sistema imune (isto é, reeduca o sistema imune), e/ou estimular o recrutamento e a acumulação de células T anti-inflamatória para um tecido particular, tal como, por exemplo, um tecido do trato gastrointestinal. Os termos descritos acima podem ser usados no presente documento indiferentemente. Uma “proteína modificada” ou “polipeptídeo modificado” ou “peptídeo modificado” refere-se a uma proteína ou polipeptídeo, cuja estrutura química, em particular a sua sequência de aminoácidos, é alterada em relação à proteína ou polipeptídeo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo ou peptídeo modificado tem pelo menos uma atividade ou função modificada (reconhecendo que as proteínas ou polipeptídeos ou peptídeos podem ter várias atividades ou funções). É especificamente contemplado que uma proteína ou polipeptídeo ou peptídeo modificado pode ser alterada com respeito a uma atividade ou função e ainda retém uma atividade de tipo selvagem ou função de outros aspectos, tais como a imunogenicidade ou capacidade para interagir com outras células do sistema imune quando no contexto de um complexo de MHC- nanopartícula.

[0101] Os antígenos da presente invenção incluem antígenos derivados de proteínas de um micróbio comum ao trato gastrointestinal. Os micróbios comuns do trato gastrointestinal incluem, por exemplo, Achromobacter spp, Acidaminococcus fermentans, Acinetobacter cacoaceticus, Actinomyces spp, Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii, Aeromonas spp, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Alistipes Putredinis, Anaerotruncus colihominis, Anaerobio Spirillum spp, Alcaligenes faecalis, Arachnia propionica, Bacillus spp, Bacteróides spp, Bacteróides caccae, Bacteriodes capillosus, Bacteróides dorei, Bacteróides eggerthii, Bacteróides gingivalis, Bacteróides finegoldii, Bacteróides fragilis, Bacteróides intermedius, Bacteróides intestinalis, Bacteróides melaninogenicus, Bacteróides Ovatus, Bacteróides pectinophilus, Bacteróides pneumosintes, Bacteróides stercoris, Bacteróides thetaiotaomicron, Bacteróides uniformis, Bacteróides vulgatus, Bacteróides xylanisolvens, Bacterionema matruchotii, Blautia hansenii, Corynebacterium matruchotii, Bifidobacterium spp, Buchnera aphidicola, Butyrivibrio crossotus, Butyriviberio fibrosolvens, Campylobacter spp, Campylobacter coli, Campylobacter sputorum, Campylobacter upsaliensis, Candida albicans, Capnocytophaga spp, Clostridium spp, Citrobacter freundii, Clostridium asparagiforme, Clostridium dijficile, Clostridium leptum, Clostridium nexile, scindens perfringens, Clostridium sordellii, Collinsella aerofaciens, Coprococcus vem, Coprococcus eutactus, Corynebacterium spp, Dorea formicigenerans, Dorea longicatena, Eikenella corrodens, Enterobacter cloacae, Enterococcus spp, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium spp, Eubacterium hallii, Eubacterium rectale, Eubacterium siraeum, Eubacterium ventriosum, Faecalibacterium prausnitzii, Flavobacterium spp, Fusobacterium spp, Fusobacterium nucleatum, Gordonia Bactéria spp, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus paraphrophilus, Holdemania filiformis, Lactobacillus spp, Leptotrichia buccalis, Morganella morganii, Micobactérias spp, Mycoplasma spp, Micrococcus spp, Mycoplasma spp, Mycobacterium chelonae, Neisseria spp, Neisseria sicca, Parabacteróides distasonis, Parabacteróides johnsonii, Parabacteróides merdae, Peptococcus spp, Peptostreptococcus spp, Plesiomonas shigelloides, Porphyromonas gingivalis, Propionibacterium spp, Propionibacterium acnes, Providencia spp, Pseudomonas aeruginosa, Roseburia intestinalis, Ruminococcus bromii, Ruminococcus gnavus, torques Ruminococcus, Ruminococcus lactaris, Ruminococcus obeum, Rothia dentocariosa, Ruminococcus spp, Sarcina spp, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus sobrinus, Streptococcus thermophilus, Streptococcus viridans, Subdoligranulum variabile, Torulopsis glabrata, Treponema denticola, refringens Treponema, Veillonella spp, Vibrio spp, Vibrio sputorum, succinogenes Wolinella e Yersinia enterocolitica. Qin et al., (2010) Nature, vol. 464:4 descreve bactérias predominantes no trato gastrointestinal. Em certas modalidades, o antígeno é derivado de uma bactéria pertencente ao gênero do grupo: Bacteróides, Clostridium, Dorea, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus e Bifidobacterium. Em uma modalidade relacionada, o antígeno é derivado de Bacteróides. Em uma outra modalidade, o antígeno é derivado de uma proteína de Bacteróides. Em ainda outra modalidade, o antígeno é derivado da proteína Integrase. Em uma outra modalidade, o antígeno correspondente a um peptídeo tendo pelo menos 80% de identidade, ou pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência com a SEQ ID No. 1, ou, alternativamente, pelo menos 85%, ou, alternativamente, pelo menos 90%), ou alternativamente, pelo menos 95%, ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de peptídeo de SEQ ID No. 1. Em outras modalidades, o antígeno corresponde a um peptídeo tendo pelo menos 80% de identidade com a sequência do peptídeo de SEQ ID Nos. 4-8. Outros antígenos úteis incluem aqueles que induzem as células T que podem reagir de forma cruzada com um antígeno de um micróbio do intestino. Por exemplo, o epítopo de IGRP206-214 (expresso pelas células beta do pâncreas) e NRP- V7 ou NRP-A7 (miméticos de IGRP 206-214) podem ser usados para induzir células T -CD8+ tipo 8.3 que podem reagir de forma cruzada com a sequência de BacIYL.

[0102] Os antígenos da presente invenção também incluem antígenos associados a G1, tais como antígenos relacionados com a doença inflamatória do intestino conhecidos (por exemplo, ovalbumina), antígenos alimentares tais como manano de levedura, gliadina e antígenos relacionados com a doença celíaca conhecidos, tais como a gliadina a partir de glúten.

[0103] Em certas modalidades, o tamanho de uma proteína ou polipeptídeo (do tipo selvagem ou modificado), incluindo qualquer complexo de uma proteína ou peptídeo de interesse e, em particular, uma fusão de MHC-peptídeo, pode incluir, mas sem limitação, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 moléculas de aminoácidos ou superior, incluindo qualquer faixa ou valor derivável no mesmo, ou derivado do mesmo. Em certos aspectos, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais aminoácidos contíguos, incluindo derivados dos mesmos e fragmentos de antígeno, tais como as sequências de aminoácidos descritas e aqui referidas, podem ser usados como antígenos. É contemplado que os polipeptídeos podem ser mutados por truncagem, tornando-os mais curtos que a sua correspondente forma do tipo selvagem, mas também poderiam ser alterados através da fusão ou conjugação de uma sequência de proteína heteróloga com uma função particular (por exemplo, para a apresentação como um complexo de proteínas, para uma melhor imunogenicidade, etc).

[0104] As composições proteicas podem ser feitas por qualquer técnica conhecida dos versados na técnica, incluindo (i) a expressão de proteínas, polipeptídeos ou peptídeos através de técnicas de biologia molecular convencionais, (ii) o isolamento de compostos proteicos a partir de fontes naturais, ou (iii) a síntese química de materiais proteicos. O nucleotídeo, bem como as proteínas, polipeptídeos e sequências de peptídeos de vários genes foram anteriormente descritos e podem ser encontrados nas bases de dados informatizadas conhecidas. Uma dessas bases de dados é o National Center for Biotechnology Information’s GenBank and GenPept databases (Centro Nacional de Bases de dados de GenPept e GenBank de Informações Biotecnológicas) (na World Wide Web em ncbi.nlm.nih.gov/). A totalidade ou uma parte das regiões de codificação para estes genes pode ser amplificada e/ou expressa com o uso das técnicas descritas no presente documento ou como seria conhecido para os especialistas na matéria divulgada.

[0105] As variantes de sequência de aminoácidos de epítopos autoantigênicos e outros polipeptídeos destas composições podem ser variantes de substituição, inserção ou deleção. Uma modificação de um polipeptídeo da invenção pode afetar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 ou mais aminoácidos contíguos ou não contíguos de um peptídeo ou polipeptídeo, em comparação com o tipo selvagem.

[0106] A deleção de variantes tipicamente não tem um ou mais resíduos de aminoácidos da sequência nativa ou do tipo selvagem. Os resíduos individuais podem ser deletados ou uma série de aminoácidos contíguos podeser deletada. Um códon de parada pode ser introduzido (por substituição ou inserção) em uma sequência de ácido nucleico de codificação para gerar uma proteína truncada. Os mutantes insercionais tipicamente envolvem a adição de material em um ponto não terminal no polipeptídeo. Isto pode incluir a inserção de um ou mais resíduos. As adições terminais, chamadas proteínas de fusão, podem também ser geradas.

[0107] As variantes de substituição contêm tipicamente a troca de um aminoácido por outro, em um ou mais sítios dentro da proteína e podem ser projetadas para modular uma ou mais propriedades do polipeptídeo, com ou sem a perda de outras propriedades ou funções. As substituições podem ser conservativas, isto é, um aminoácido é substituído por outro de forma e carga semelhantes. As substituições conservativas são bem conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, as alterações de: alanina para serina; arginina para lisina; asparagina para glutamina ou histidina; aspartato para glutamato; cisteína para serina; glutamina para asparagina; glutamato para aspartato; glicina para prolina; histidina para asparagina ou glutamina; isoleucina para leucina ou valina; leucina para valina ou isoleucina; lisina para arginina; metionina para leucina ou isoleucina; fenilalanina para tirosina, leucina ou metionina; serina para treonina; treonina para serina; triptofano para tirosina; tirosina para triptofano ou fenilalanina; e valina para isoleucina ou leucina. Em alternativa, as substituições podem ser não conservativas de tal forma que uma função ou atividade de um polipeptídeo ou peptídeo é afetada, tal como avidez ou afinidade para um receptor(es) celular. As alterações não conservativas envolvem normalmente a substituição de um resíduo com um que seja quimicamente diferente, tal como um aminoácido polar ou carregado por um aminoácido não polar ou não carregadas e vice-versa.

[0108] As proteínas da presente invenção podem ser recombinantes, ou sintetizadss in vitro. Alternativamente, uma proteína recombinante pode ser isolada a partir de bactérias ou outras células hospedeiras.

[0109] Será também entendido que as sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos podem incluir resíduos adicionais, tais como aminoácidos N- ou C-terminais adicionais, ou sequências de ácidos nucleicos 5’ ou 3’, respectivamente e ainda assim são essencialmente conforme estabelecidos em uma das sequências descritas no presente documento, desde que a sequência satisfaça os critérios estabelecidos acima, incluindo a manutenção da atividade da proteína biológica (por exemplo, imunogenicidade). A adição de sequências terminais aplica-se particularmente a sequências de ácidos nucleicos que podem, por exemplo, incluir várias sequências flanqueadoras não codificantes quer das partes 5’ ou 3’ da região de codificação.

[0110] É contemplado que nas composições da invenção, há entre cerca de 0,001 mg e cerca de 10 mg de proteína total por ml. Dessa forma, a concentração de proteína na composição pode ser de cerca de, pelo menos cerca de, ou no máximo cerca de 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 50, 100 μg/mL ou mg/ml ou mais (ou qualquer faixa derivável das mesmas). Desse total, cerca de, pelo menos cerca de, ou no máximo cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% pode ser complexo de antígeno-MHC-nanopartícula.

[0111] A presente invenção contempla a administração de um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula para efetuar um tratamento contra uma doença ou condição associada com a inflamação do trato gastrointestinal.

[0112] Além disso, a patente US No. 4.554.101 (Hopp), que é aqui incorporada como referência, ensina a identificação e preparação de epítopos a partir de sequências de aminoácidos primários, com base na hidrofilicidade. Através dos métodos descritos em Hopp, um versado na técnica seria capaz de identificar potenciais epítopos a partir de uma sequência de aminoácidos e confirmar a sua imunogenicidade. Numerosas publicações científicas têm sido dedicadas à previsão de estruturas secundárias e à identificação de epítopos, a partir de análises de sequências de aminoácidos (Chou & Fasman, Adv. Enzymol., 47:45-148, 1978; Chous and Fasman, Annu, Rev. Biochem., 47:251-276, 1978, Chou e Fasman, Biochemistry, 13(2):211-222, 1974; Chau e Fasman, Biochemistry, 13(2):222-245, 1974, Chou e Fasman, Biophys. J., 26(3):385-399, 1979). Qualquer uma destas pode ser usada, se desejado, para completar os ensinamentos de Hopp na Patente US No. 4.554.101.

[0113] As moléculas diferentes de peptídeos podem ser usadas como antígenos ou fragmentos antigênicos em complexos com moléculas de MHC, tais moléculas incluem, mas, sem limitação carboidratos, lipídeos, moléculas pequenas e semelhantes. Os carboidratos são os principais componentes da superfície externa de uma variedade de células. Determinados carboidratos são característicos de diferentes estágios de diferenciação e muitas vezes estes carboidratos são reconhecidos por anticorpos específicos. A expressão de carboidratos diferentes pode ser restringida a tipos específicos de células.

D. Substratos/Nanopartículas

[0114] Em certos aspectos, os complexos de MHC/antígeno são operativamente acoplados a um substrato. Um substrato pode estar sob a forma de uma nanopartícula que opcionalmente compreende um material biocompatível, bioabsorvível. Deste modo, em uma modalidade, a nanopartícula é biocompatível e/ou bioabsorvível. Um substrato pode também estar na forma de uma nanopartícula tal como as descritas anteriormente na Pub. De Patente US No.: 2009/0155292 que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. As nanopartículas podem ter uma estrutura de dimensão variável e conhecida variadamente como um nanoesfera, ou uma nanoesfera biodegradável biocompatível ou uma nanopartícula biodegradável biocompatível. Tais formulações de partículas que contêm um complexo de antígeno-MHC podem ser formadas por acoplamento covalente ou não covalente do complexo com a nanopartícula.

[0115] As nanopartículas consistem tipicamente em um núcleo substancialmente esférico e, opcionalmente, uma ou mais camadas. O núcleo pode variar em tamanho e composição. Além do núcleo, a nanopartícula pode ter uma ou mais camadas para fornecer funcionalidades adequadas para as aplicações de interesse. As espessuras das camadas, se presentes, podem variar dependendo das necessidades de aplicações específicas. Por exemplo, as camadas podem conferir propriedades ópticas úteis.

[0116] As camadas podem também conferir funcionalidades químicas ou biológicas, aqui referidas como as camadas quimicamente ativas ou biologicamente ativas e para estas funcionalidades a camada ou camadas podem tipicamente variar em espessura de cerca de 0,001 micrômetros (1 nanômetro) e cerca de 10 micrômetros ou mais (dependendo do diâmetro das nanopartículas desejadas), sendo estas camadas normalmente aplicadas na superfície externa da nanopartícula.

[0117] As composições do núcleo e das camadas podem variar. Os materiais adequados para as partículas ou núcleo incluem, mas, sem limitação polímeros, cerâmicas, vidros, minerais e semelhantes. Exemplos incluem, mas, sem limitação, vidros padrões e de especialidade, sílica, poliestireno, poliéster, policarbonato, polímeros acrílicos, poliacrilamida, poliacrilonitrila, poliamida, fluoropolímeros, silicone, celuloses, silício, metais (por exemplo, ferro, ouro, prata), minerais (por exemplo, rubi), nanopartículas (por exemplo, nanopartículas de ouro, partículas coloidais, óxidos de metal, sulfetos de metal, selenetos de metal e materiais magnéticos tais como o óxido de ferro) e compostos dos mesmos. O núcleo pode ser de composição homogênea, ou uma combinação de duas ou mais classes de materiais, dependendo das propriedades desejadas. Em certos aspectos, as nanopartículas de metal serão usadas. Estas partículas ou nanopartículas de metal podem ser formadas a partir de Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Mn, Ni, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si e In, precursores, suas ligas binárias, suas ligas ternárias e seus compostos intermetálicos. Ver Patente US 6.712.997, que é aqui incorporada por referência na sua totalidade. Em certas modalidades, as composições do núcleo e as camadas podem variar desde que as nanopartículas sejam biocompatíveis e bioabsorvíveis. O núcleo pode ser de composição homogênea, ou uma combinação de duas ou mais classes de materiais, dependendo das propriedades desejadas. Em certos aspectos, as nanoesferas de metal serão usadas. Estas nanopartículas de metal podem ser formadas a partir de Fe, Ca, Ga e semelhantes.

[0118] Como foi estabelecido anteriormente, a nanopartícula pode, além do núcleo, incluir uma ou mais camadas. As nanopartículas podem incluir uma camada constituída por um açúcar ou outro polímero biodegradável. Exemplos de camadas biodegradáveis incluem, mas, sem limitação dextrano; poli(etileno glicol); poli(óxido de etileno); manitol; poli(ésteres) com base no polilactídeo (PLA), poliglicolídedo (PGA), policaprolactona (PCL); poli(hidróxi alcanoato)s da classe de PHB-PHV; e outros poli(sacarídeos) modificados tal como amido, celulose e quitosano. Além disso, a nanopartícula pode incluir uma camada com as superfícies adequadas para a fixação de funcionalidades químicas para sítios de ligação ou acoplamento químicos.

[0119] As camadas podem ser produzidas sobre as nanopartículas em uma variedade de formas conhecidas dos versados na técnica. Exemplos incluem as técnicas de química de sol-gel, tal como descrito em Iler, Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979; Brinker e Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990). Abordagens adicionais para a produção de camadas de nanopartículas incluem técnicas de química e de encapsulamento de superfície tal como as descritas em Partch e Brown, J. Adhesion, 67: 259-276, 1998; Pekarek et al., Nature, 367: 258, (1994); Hanprasopwattana, Langmuir, 12: 3173-3179, (1996); Davies, Materiais Avançados, 10: 1264-1270, (1998); e referências contidas nas mesmas. As técnicas de deposição por vapor pPodem também ser usadas; ver, por exemplo Golman e Shinohara, Trends Chem. Engin, 6, 1-6, (2000); e Pat. US No. 6.387.498. Ainda outras aborgagens incluem técnicas de automontagem camada-por-camada, como descrito em Sukhorukov et al. Polymers Adv. Tech., 9 (10-11):759-767, (1998);. Caruso et al., Macromolecules, 32 (7):2317-2328, (1998); Caruso et al. J.Amer. Chem. Soe, 121 (25): 6039-6046, (1999); Pat. US No. 6.103.379 e as referências citadas na mesma.

[0120] As nanopartículas podem ser formadas pelo contato de uma fase aquosa contendo o complexo de molécula co- estimuladora/antígeno/MHC e de um polímero e uma fase não aquosa, seguido por evaporação da fase não aquosa para causar a coalescência das partículas a partir da fase aquosa, como ensinado na Pat.US No. 4.589.330 ou 4.818.542. Os polímeros preferenciais para tais preparações são copolímeros naturais ou sintéticos ou polímeros selecionados a partir do grupo que consiste em agar de gelatina, amido, arabinogalactano, albumina, colágeno, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicólido-L (-) lactido poli(epsilon-caprolactona, poli(epsilon- caprolactona-CO-ácido láctico), poli(epsilon-caprolactona-CO- ácido glicólico), poli(β-hidr0xi ácido butírico), poli(óxido de etileno), polietileno, poli(alquil-2-cianoacrilato), poli(hidroxietil metacrilato), poliamidas, poli(aminoácidos), poli(2-hidroxietil DL-aspartamida), poli(éster de ureia), poli(L-fenilalanina/etileno glicol/1,6-di-isocianato) e poli(metacrilato de metila). Os polímeros particularmente preferenciais são os poliésteres, como o ácido poliglicólico, ácido poliláctico, glicolido-L(-) lactido poli(epsilon-caprolactona, poli(epsilon-caprolactona-CO- ácido láctico) e poli(epsilon-caprolactona-CO- ácido glicólico. Os solventes úteis para dissolver o polímero incluem: água, hexafluorisopropanol, cloreto de metileno, tetra-hidrofurano, hexano, benzeno ou sesqui hexafluoroacetona.

[0121] O tamanho das nanopartículas pode variar de cerca de 1 nm a cerca de 1 μm. Em certas modalidades, a nanopartícula é menor do que cerca de 1 μm. Em outras modalidades, a nanopartícula é menor do que cerca de 500 nm, menor do que cerca de 400 nm, menor do que cerca de 300 nm, menor do que cerca de 200 nm, menor do que cerca de 100 nm, ou menor do que cerca de 50 nm. Em outras modalidades, a nanopartícula é de cerca de 1 nm a cerca de 15 nm, ou de cerca de 30 nm, 50 nm, 75 nm, ou 100 nm. Em outras modalidades, a nanopartícula é de cerca de 5 nm a cerca de 50 nm. Em uma modalidade relacionada, a nanopartícula é de cerca de 5 a cerca de 15 nm de diâmetro.

E. Acoplamento de Complexo de Antígeno-MHC com a Nanopartícula

[0122] A fim de acoplar o substrato ou nanoesfera ao complexo de antígeno-MHC as seguintes técnicas podem ser aplicadas.

[0123] A ligação pode ser gerada através da modificação química do substrato ou nanopartícula que normalmente envolve a geração de “grupos funcionais” sobre a superfície, sendo os referidos grupos funcionais capazes de se ligarem a um complexo de antígeno-MHC e/ou, de se ligar à superfície modificada opcionalmente quimicamente do substrato ou nanopartícula com as chamadas “moléculas de ligação” de forma covalente ou de forma não covalente ligado, seguido por reação do complexo de antígeno-MHC com as nanopartículas obtidas.

[0124] O termo “molécula de ligação” significa uma substância capaz de se ligar com o substrato ou nanopartícula e também capaz de se ligar a um complexo de antígeno-MHC.

[0125] A expressão “grupos funcionais” como usada no presente documento anteriormente, não está restringida a grupos químicos reativos que formam ligações covalentes, mas também inclui grupos químicos que conduzem a uma interação iônica ou ligações de hidrogênio com o complexo de antígeno-MHC. Além disso, deve-se notar que uma clara distinção entre “grupos funcionais” gerados na superfície e as moléculas de ligação portadoras de “grupos funcionais” não é possível, uma vez que, por vezes, a modificação da superfície exige a reação de moléculas de ligação menores, tais como etileno glicol com a superfície das nanoesferas.

[0126] Os grupos funcionais ou as moléculas de ligação portadoras dos mesmos podem ser selecionados a partir de grupos de amino, grupos de ácido carbônico, tióis, tioéteres, dissulfetos, guanidino, grupos de hidroxila, grupos de amina, dióis vicinais, aldeídos, grupos de alfa- haloacetila, organelas de mercúrio, grupos de éster, haleto de ácido, tioéster de ácido, anidrido de ácido, isocianatos, isotiocianatos, haletos de ácidos sulfônicos, imidoésteres, diazoacetatos, sais de diazônio, 1,2- dicetonas, os ácidos fosfônicos, ésteres de ácido fosfórico, ácidos sulfônicos, azolidas, imidazóis, indóis, N-maleimidas, compostos de carbonilo -alfa-beta insaturados, halogenetos de arila ou derivados dos mesmos.

[0127] Exemplos não limitativos de outras moléculas que se ligam com pesos moleculares mais elevados são as moléculas de ácidos nucleicos, os polímeros, os copolímeros, os agentes de acoplamento polimerizáveis, sílica, proteínas e moléculas do tipo cadeia que têm uma superfície com a polaridade oposta em relação ao substrato ou nanopartícula. Os ácidos nucleicos podem fornecer uma ligação a moléculas de afinidade contendo as moléculas de ácidos nucleicos em si, embora com uma sequência complementar no que diz respeito à molécula de ligação.

[0128] Um exemplo específico de um ligante covalente inclui poli(etileno) glicol (PEG). O ligante PEG pode ser um ligante de tiol-PEG- NH2.

[0129] Em certas modalidades, o ligante, tal como descrito neste documento tem um tamanho definido. Em algumas modalidades, o ligante é de menos do que cerca de 10 kD, menos do que cerca de 5 kD, menos do que cerca de 4,5 kD, menos do que cerca de 4 kD, menos do que cerca de 3,5 kD, menos do que cerca de 3 kD, menos do que cerca de 2,5 kD, menos do que cerca de 2 kD, ou menos do que cerca de 1 kD. Em outras modalidades, o ligante é de cerca de 0,5 a cerca de 5 kDa, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, 1,5, ou 1 kD. Em ainda outras modalidades, o ligante é de cerca de 1 a cerca de, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5, 2, ou 1,5 kD.

[0130] Exemplos para agentes de acoplamento polimerizáveis, diacetileno, butadieno estireno, acetato de vinila, acrilato, acrilamida, compostos vinílicos, estireno, óxido de silicone, óxido de boro, óxido de fósforo, boratos, pirrole, polipirrol e fosfatos podem ser citados.

[0131] A superfície do substrato ou nanopartícula pode ser quimicamente modificada, por exemplo, por ligação de derivados de ácido fosfônico tendo grupos funcionais reativos. Um exemplo destes derivados de ácido fosfônico ou éster de ácido fosfônico é ácido imino-bis (metileno fosfono) carbônico, que pode ser sintetizado de acordo com a reação de “Mannich-Moedritzer”. Esta reação de ligação pode ser realizada com o substrato ou nanoesfera como diretamente obtidos a partir do processo de preparação ou após um pré-tratamento (por exemplo, com brometo de trimetil silila). No primeiro caso, o derivado de ácido (éster) fosfônico pode, por exemplo, deslocar os componentes do meio de reação que ainda estão ligados à superfície. Este deslocamento pode ser melhorado em temperaturas mais elevadas. Acredita-se, por outro lado, que o brometo de trimetil silila desalquila os agentes de complexação à base de fósforo contendo o grupo alquil, criando assim novos sítios de ligação para o derivado de ácido (éster) fosfônico. O derivado de ácido (éster) fosfórico, ou moléculas de ligação que se ligam ao mesmo podem exibir os mesmos grupos funcionais, tal como indicado acima. Um outro exemplo de tratamento da superfície do substrato ou nanoesfera envolve o aquecimento em um diol tais como etileno glicol. Deve-se notar que este tratamento pode ser desnecessário se a síntese já ocorreu em um diol. Nestas circunstâncias, o produto de síntese obtido diretamente é provável que mostre os grupos funcionais necessários. Este tratamento é, no entanto, aplicável ao substrato ou nanopartícula que foram produzidos em agentes de complexação contendo -P ou -N. Se tais substratos ou partículas são submetidos a um pós-tratamento com etileno glicol, os ingredientes do meio de reação (por exemplo, agente de complexação) que ainda se ligamr à superfície podem ser substituídos pelo diol e/ou podem ser desalquilados.

[0132] Também é possível substituir os agentes de complexação contendo N ainda ligados à superfície da partícula através de derivados de aminas primárias tendo um segundo grupo funcional. A superfície do substrato ou nanopartícula, também pode ser revestida com sílica. A sílica permite a conjugação química relativamente simples de moléculas orgânicas uma vez que a sílica reage facilmente com os ligantes orgânicos, tais como silano ou clorossilano. A superfície das nanopartículas pode ser também revestida por homo ou copolímeros. Exemplos de agentes de acoplamento polimerizáveis são N-(3- aminopropil)-3 mercaptobenzamidina, 3-(trimetóxi silil) propil hidrazida e 3-trimetóxi silil) propil maleimida. Outros exemplos não limitativos de agentes de acoplamento polimerizáveis são aqui mencionados. Estes agentes de acoplamento podem ser usados isoladamente ou em combinação dependendo do tipo de copolímero a ser gerado como um revestimento.

[0133] Uma outra técnica de modificação da superfície que pode ser usada com substratos ou nanopartículas contendo compostos de metal de transição oxídicos é a conversão dos compostos de metais de transição oxídicos pelo gás cloro ou agentes de cloração orgânico para os oxicloretos correspondentes. Estes oxicloretos são capazes de reagir com os nucleófilos, tais como grupos de hidróxi ou amino, como frequentemente encontrado em biomoléculas. Esta técnica permite a geração de uma conjugação direta com proteínas, por exemplo, por meio do grupo amino de cadeias laterais de lisina. A conjugação com proteínas após a modificação da superfície com oxicloretos também pode ser efetuada com o uso de um agente de ligação bifuncional, tal como hidrazida de ácido maleimidopropiônico.

[0134] Para as técnicas de ligação não covalentes, as moléculas do tipo cadeia tendo uma polaridade ou carga oposta à da superfície do substrato ou nanoesfera são particularmente adequados. Exemplos de moléculas de ligação que podem ser ligadas de forma não covalente ao núcleo/casca das nanoesferas envolvem surfactantes aniônicos, catiônicos ou zwitteriônicos, proteínas ácidas ou básicas, poliaminas, poliamidas, polisulfona ou ácido policarboxílico. A interação hidrofóbica entre o substrato ou nanoesfera e reagente anfifílico tendo um grupo funcional reativo pode gerar a ligação necessária. Em particular, as moléculas do tipo cadeia, com carácter anfifílico, tais como fosfolipídeos ou polissacarídeos derivatizados, que podem ser reticuladas umas com as outras, são úteis. A absorção destas moléculas sobre a superfície pode ser conseguida por coincubação. A ligação entre a molécula de afinidade e substrato ou nanopartícula também pode ser baseada em ligações de auto-organização, não-covalentes. Um exemplo das mesmas envolve sondas de detecção simples com biotina como a molécula de ligação e as moléculas acopladas a avidina ou estrepdavidina.

[0135] Os protocolos para reações de acoplamento de grupos funcionais de moléculas biológicas podem ser encontrados na literatura, por exemplo, em “Bioconjugate Techniques” (Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996). A molécula biológica (por exemplo, uma molécula de MHC ou derivado da mesma) pode ser acoplada à molécula de ligação, de forma covalente ou não covalente, em conformidade com os procedimentos padrões da química orgânica, tais como oxidação, halogenação, alquilação, acilação, adição, substituição ou amidação. Estes métodos para o acoplamento da molécula de ligação ligada de forma covalente ou de forma não covalente podem ser aplicados antes do acoplamento da molécula de ligação ao substrato ou nanoesfera, ou posteriormente. Além disso, é possível, por meio de incubação, efetuar uma ligação direta de moléculas ao substrato ou nanopartícula correspondentemente pré-tratados (por exemplo, brometo de trimetil silila), que apresentam uma superfície modificada por este pré- tratamento (por exemplo, uma maior carga ou superfície polar).

F. Produção de Proteínas

[0136] A presente invenção descreve polipeptídeos, peptídeos e proteínas para uso em várias modalidades da presente invenção. Por exemplo, os peptídeos específicos e os seus complexos são ensaiados quanto à sua capacidade para induzir ou modular uma resposta imune. Em modalidades específicas, a totalidade ou parte dos peptídeos ou proteínas da invenção também podem ser sintetizados em solução ou sobre um suporte sólido de acordo com técnicas convencionais. Vários sintetizadores automáticos estão comercialmente disponíveis e podem ser usados de acordo com protocolos conhecidos. Ver, por exemplo, Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2°. Ed, Pierce Chemical Co.l, (1984).; Tam et al., J. Am. Chem. Soe, 105: 6442, (1983); Merrifield, Science, 232 (4748): 341-347, (1986); e Barany e Merrifield, The Peptides, Gross e Meinhofer (Eds.), Academic Press, Nova Iorque, 1 284, (1979), cada uma aqui incorporada por referência. Alternativamente, a tecnologia de DNA recombinante pode ser empregada, em que uma sequência de nucleotídeos que codifica um peptídeo da presente invenção é inserida em um vetor de expressão, transformada ou transfectada para uma célula hospedeira apropriada e cultivada sob condições adequadas para expressão.

[0137] Uma modalidade da invenção inclui o uso de transferência de genes para as células, incluindo micro-organismos para a produção de proteínas. O gene para a proteína de interesse pode ser transferido para células hospedeiras adequadas, seguido por cultura de células em condições adequadas. Um ácido nucleico que codifica virtualmente qualquer polipeptídeo pode ser empregado. A geração de vetores de expressão recombinantes e os elementos incluídos nos mesmos, são conhecidos por um versado na técnica e são brevemente aqui discutidos. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamífero incluem, mas, sem limitação células Vero e HeLa, outras linhagens de células Be T-, tais como a CEM, 721,221, H9, Jurkat, Raji, bem como linhagens de células de ovário de hamster chinês, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN e MDCK. Além disso, uma cepa de células hospedeiras pode ser escolhida, a qual modula a expressão das sequências inseridas ou que modifica e processa o produto de gene da maneira desejada. Tais modificações (por exemplo, glicosilação) e processamento (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. As células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-tradução e modificação de proteínas. As linhagens de células ou os sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e o processamento corretos da proteína estranha expressa.

[0138] Uma série de sistemas de seleção pode ser usada, incluindo, mas sem limitação, genes de HSV timidina quinase, hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase e adenina fosforibosiltransferase, em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Além disso, a resistência anti- metabólito pode ser usada como base de seleção: para dhfr, que confere resistência ao trimetoprim e metotrexato; gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico; neo, que confere resistência ao aminoglicosídeo G418; e higro, que confere resistência à higromicina.

G. Ácidos Nucleicos

[0139] A presente invenção pode incluir polinucleotídeos recombinantes que codificam as proteínas, polipeptídeos, peptídeos da invenção, tais como, por exemplo, SEQ ID No. 1, 2, ou 3. As sequências de ácidos nucleicos de antígenos exemplares e as moléculas de MHC para a apresentação os antígenos, são incluídos e podem ser usados para preparar um complexo de antígeno-MHC.

[0140] Em modalidades particulares, a invenção diz respeito a segmentos de ácidos nucleicos isolados e vetores recombinantes que incorporam as sequências de ácidos nucleicos que codificam um auto- antígeno e/ou uma molécula de MHC. O termo “recombinante” pode ser usado em conjunto com um polipeptídeo ou o nome de um polipeptídeo específico e isto refere-se geralmente a um polipeptídeo produzido a partir de uma molécula de ácido nucleico que tenha sido manipulada in vitro ou que é um produto de replicação de uma tal molécula.

[0141] Os segmentos de ácido nucleico usados na presente invenção, independentemente do comprimento da sequência de codificação em si, podem ser combinados com outras sequências de ácidos nucleicos, tais como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzimas de restrição adicionais, sítios de clonagem múltiplos, outros segmentos de codificação e semelhantes, de tal modo que o seu comprimento completo pode variar consideravelmente. Em consequência, é contemplado que um fragmento de ácido nucleico de praticamente qualquer comprimento possa ser empregado, com o comprimento completo, de preferência, a ser limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo de ácido nucleico recombinante pretendido. Em alguns casos, uma sequência de ácidos nucleicos pode codificar uma sequência de polipeptídeo com sequências adicionais de codificação heterólogas, por exemplo, para permitir a purificação do polipeptídeo, transporte, secreção, modificação pós-translacional, ou para benefícios terapêuticos, tais como a concentração ou eficácia. Uma etiqueta ou outro polipeptídeo heterólogo pode ser adicionado à sequência de codificação de polipeptídeo modificado, em que “heterólogo” refere-se a um polipeptídeo que não é o mesmo que o polipeptídeo modificado.

IV. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E ADMINISTRAÇÃO

[0142] São fornecidas aqui composições farmacêuticas úteis para o tratamento de doenças.

A. Composições Farmacêuticas

[0143] As composições da invenção podem ser convencionalmente administradas por via parentérica, por injeção, por exemplo, por via intravenosa, subcutânea ou intramuscular. As formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem formulações orais. As formulações orais incluem os excipientes normalmente empregados tais como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e semelhantes. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós e contêm cerca de 10% a cerca de 95% do ingrediente ativo, de preferência, cerca de 25% a cerca de 70%. A preparação de uma composição aquosa que contém um complexo de antígeno-MHC-nanopartícula que modifica a condição imune do sujeito será conhecida dos versados na técnica, à luz da presente divulgação. Em certas modalidades, uma composição pode ser inalada (por exemplo, a Patente US No. 6.651.655, que é especificamente incorporada como referência na sua totalidade). Em uma modalidade, o complexo de antígeno-MHC-nanopartícula é administrado sistemicamente.

[0144] Tipicamente, as composições da invenção são administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal que será terapeuticamente eficaz e de modificação imune. A quantidade a ser administrada depende do sujeito a ser tratado. As quantidades precisas de ingrediente ativo necessárias para serem administradas dependem do julgamento do profissional. No entanto, intervalos de dosagem adequados são da ordem de dez a centenas de nanogramas ou microgramas do complexo de antígeno-MHC- nanopartícula por administração. Os regimes adequados para a administração inicial e reforços são também variáveis, mas são tipificados por uma administração inicial seguida por administrações subsequentes.

[0145] Em muitos casos, será desejável ter múltiplas administrações de um complexo de peptídeo-MHC-nanopartícula, cerca de, no máximo cerca de, ou pelo menos cerca de, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais. As administrações estarão normalmente na faixa de 2 dias a intervalos de doze semanas, mais usualmente de uma a duas semanas de intervalo. Reforços periódicos com intervalos de 0,5-5 anos, usualmente de dois anos, podem ser desejáveis para manter a condição do sistema imune. O curso das administrações pode ser seguido por ensaios para as respostas imunes inflamatórias e/ou atividade das células T autorreguladoras anti-inflamatórias.

[0146] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são administradas a um sujeito. Diferentes aspectos da presente invenção envolvem a administração de uma quantidade eficaz de uma composição de complexo de antígeno-MHC-nanopartícula a um sujeito. Além disso, tais composições podem ser administradas em combinação com modificadores do sistema imune. Tais composições serão geralmente dissolvidas ou dispersas em um veículo farmaceuticamente aceitável, ou meio aquoso.

[0147] As frases “farmaceuticamente aceitável” ou “farmacologicamente aceitável” referem-se a entidades moleculares e composições que não produzem uma reação adversa nociva, alérgica, ou outra reação colateral quando administrada a um animal, ou humano. Tal como usado no presente documento, “carreador farmaceuticamente aceitável” inclui quaisquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento da absorção e isotônicos e semelhantes. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmacêuticas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com os ingredientes ativos, o seu uso em composições imunogênicas e terapêuticas é contemplado.

[0148] As formas farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis; formulações incluindo óleo de sésamo, óleo de amendoim, ou propileno glicol aquoso; e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida na medida em que ela possa ser facilmente injetada. A mesma também deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminante de micro-organismos, tais como bactérias e fungos.

[0149] As composições podem ser formuladas em uma forma neutra ou de sal. Sais farmaceuticamente aceitáveis, incluem os sais de adição de ácido (formados com os grupos de amino livres da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico e semelhantes. Os sais formados com os grupos carboxil livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou hidróxidos férricos e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e semelhantes.

[0150] O carreador pode ser um meio de dispersão ou solvente contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e poli (etileno glicol) líquido e semelhantes), as misturas adequadas, dos mesmos e óleos vegetais. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferencial a inclusão de agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser conseguida pelo uso nas composições de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[0151] As soluções injetáveis estéreis são preparadas por incorporação dos compostos ativos na quantidade necessária no solvente apropriado com vários dos outros ingredientes enumerados acima, como requerido, seguido de esterilização. A esterilização da solução irá ser feita de tal forma que não diminua as propriedades terapêuticas do complexo de antígeno-MHC-nanopartícula. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são a secagem a vácuo e as técnicas de secagem por congelação, que produzem um pó do ingrediente ativo, mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução destes previamente esterilizada. Um tal método de esterilização da solução é a filtração estéril, no entanto, esta invenção destina-se a incluir qualquer método de esterilização que não diminua significativamente as propriedades terapêuticas dos complexos de antígeno-MHC- nanopartículas. Os métodos de esterilização que envolvem a intenso calor e pressão, tal como a autoclavagem, podem comprometer a estrutura terciária do complexo, diminuindo assim significativamente as propriedades terapêuticas dos complexos de antígeno-MHC- nanopartículas.

[0152] Uma quantidade eficaz da composição terapêutica é determinada com base no objetivo pretendido. O termo “dose unitária” ou “dosagem” refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas para o uso em um sujeito, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição calculada para produzir as respostas desejadas acima descritas em associação com a sua administração, ou seja, a rota e regime adequados. A quantidade a ser administrada, tanto de acordo com o número de tratamentos quanto com a dose unitária, depende do resultado e/ou proteção desejada. As quantidades precisas de composição também dependem do julgamento do profissional e é peculiar a cada indivíduo. Os fatores que afetam a dosagem incluem o estado físico e clínico do sujeito, a rota de administração, o objetivo de tratamento pretendido (alívio de sintomas versus cura) e a potência, estabilidade, toxicidade e a composição particular. Mediante a formulação, as soluções serão administradas de uma forma compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade tal que seja terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de dosagem, tais como o tipo de soluções injetáveis descritas acima.

B. Terapia combinada

[0153] As composições e os métodos relacionados da presente invenção, particularmente a administração de um complexo de antígeno- MHC-nanopartícula, também podem ser usados em combinação com a administração de terapias tradicionais. Estes incluem, mas, sem limitação, fármacos anti-inflamatórios, tais como sulfassalazina, corticosteróides, tais como prednisona e supressores do sistema imune, tais como a azatioprina e mercaptopurina. Um antibiótico, tal como metronidazol, também pode ser útil para matar os micróbios nos intestinos.

[0154] Para ajudar a tratar os sintomas, um médico pode recomendar antidiarréicos, laxantes, analgésicos ou outros fármacos de venda livre (over-the-counter) (OTC). Os esteróides são geralmente usados para as pessoas que têm forma mais grave da doença de Crohn. Na doença mais agressiva, os esteróides podem ser usados com agentes imunossupressores ou com um medicamento mais novo chamado infliximab.

[0155] Quando a terapia combinada é empregada, várias combinações podem ser empregadas, por exemplo, a administração do complexo de antígeno-MHC-nanopartícula é “A” e do agente adicional é “B”:

[0156] A administração das composições de complexos de peptídeo- MHC da presente invenção a um paciente/sujeito irá seguir os protocolos gerais para a administração de tais compostos, tendo em conta a toxicidade, caso exista. Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos conforme necessário. É também contemplado que as várias terapias convencionais, tais como a hidratação, possam ser aplicadas em combinação com a terapia descrita.

C. Administração In vitro ou Ex vivo

[0157] Tal como usado no presente documento, o termo administração in vitro refere-se a manipulações realizadas em células removidas ou fora de um sujeito, incluindo, mas sem limitação, células em cultura. O termo administração ex vivo refere-se a células que foram manipuladas in vitro e são subsequentemente administradas a um sujeito. O termo administração in vivo inclui todas manipulações realizadas dentro de um sujeito, incluindo a administração.

[0158] Em certos aspectos da presente invenção, as composições podem ser administradas in vitro, ex vivo ou in vivo. Em certas modalidades in vitro, as células T autólogas são incubadas com as composições da presente invenção. As células ou os tecidos podem, então, ser usadas para a análise in vitro, ou em alternativa, para administração ex vivo.

V. EXEMPLOS

[0159] Os exemplos seguintes são apresentados com a finalidade de ilustrar diversas modalidades da invenção e não se destinam a limitar a presente invenção em qualquer forma. Um versado na técnica apreciará prontamente que a presente invenção está bem adaptada para realizar os objetivos e obter os fins e vantagens mencionados, bem como os objetivos, os fins e as vantagens inerentes desta invenção. Os presentes exemplos, juntamente com os métodos descritos no presente documento são presentemente representativos de modalidades e são exemplares e não pretendem ser limitações ao escopo da invenção. Alterações e outros usos que são englobados no espírito da invenção tal como definido pelo escopo das Reivindicações ocorrerão aos versados na técnica.

Exemplo 1 Bacteróides Integrase como um alvo antigênico das células T de autorregulação semelhante a memória

[0160] Investigou-se se a um novo epítopo de Bacteróides Integrase (BacIYL: SEQ ID No. 1) pode ligar-se ao complexo de histocompatibilidade principal de ratinho NOD de moléculas H-2Kd de classe I ao longo de uma faixa de concentrações, em comparação com TUM (um controle positivo), IGRP206-214 e Gp33 codificado por LCMV (um controle negativo de ligação a Db). Como mostrado na Figura 1 A, a sequência BacIYL (SEQ ID No. 1) ligou moléculas Kd na superfície das células RMA-SKd-deficientes de Transportador-Associado com antígeno-Processamento (TAP) de forma tão eficiente como IGRP 206-214 e TUM.

[0161] Para se determinar se o complexo de peptídeo-MHC (pMHC) de BacIYL/Kd poderia ser reconhecido por células T CD8+ reativas para IGRP 206-214- naive, células T CD8+ de baço de camundongos NOD transgênicos-8.3-TCR- (8,3-NOD) foram coradas com TUM/Kd conjugado com fluorocromo (controle negativo), NRP-V7/Kd (controle positivo) e tetrâmeros de pMHC de BacIYL/Kd. Como mostrado na Fig. 1B, as células T 8.3-CD8+ ligaram tetrâmeros Bac-IYL/Kd de forma eficiente, embora com menor intensidade média de fluorescência (mfi) que tetrâmeros de IGRP 206-214/Kd, sugerindo que o 8.3-TCR liga este complexo com baixa afinidade a pMHC. Isto foi confirmado através da realização de análises de gráficos de Scatchard de ligação a tetrâmero em equilíbrio. Como mostrado na Fig. 1C os tetrâmeros de Bac-IYL/Kd ligaram as células T 8.3-CD8+ com avidez ~ 2 vezes mais baixa.

[0162] Para investigar se a sequência de Bac-IYL tinha atividade agonística em células T 8.3-CD8+ naives, as células T 8.3-CD8+ naive foram cultivadas com TUM (controle negativo), IGRP206-214 (controle positivo) e Bac-IYL durante 24 h. Ao contrário de IGRP206-214, que provocou a sobrerregulação de ambos CD44 e CD69, Bac-IYL só foi capaz de induzir a sobrerregulação de CD69 (Fig. 2A). Isto indicou que BacIYL teve atividade agonística parcial, de acordo com a avidez de ligação baixa a partir dos tetrâmeros correspondentes visto na Fig. 1C. Uma vez que os linfócitos-T citotóxicos diferenciados-8.3 (8.3-CTL) não matam as células HEK293-Kd transfectadas com cDNA- de codificação de Integrase ou BacIYL-pulsada alvos esses dados mostram que BacIYL pode se ligar e ‘excitam’ o 8.3-TCR sem acionar a maioria dos programas de ativação de células T a jusante de TCR.

[0163] Devido a certos ligantes de ligação a TCR de baixa avidez terem propriedades antagonísticas (em adição a atividade agonística parcial em densidades de ligantes mais elevadas), investigou-se se BacIYL pode ser capaz de antagonizar as respostas de células T 8.3-CD8+ induzidas por IGRP206-214. Como mostrado na Fig. 2B, Bac-IYL mas não TUM (um peptídeo de ligação a Kd que não é reconhecido por 8.3-TCR) foi capaz de antagonizar as respostas de células T 8.3-CD8+ induzidas por IGRP206-214 (secreção de IFNY e proliferação) sobre uma faixa de concentrações (acima de 1 uM). Assim, quando apresentado a células T 8.3-CD8+, em isolamento, Bac-IYL se liga a TCRs como 8.3 com baixa avidez, agoniza antagoniza as respostas agonistas induzidas em densidades de ligante relativamente baixas e induz as respostas agonísticas parciais em densidades de ligante elevadas.

[0164] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se então que, Bac- IYL, in vivo, codificado em cepas bacterianas prevalentes do intestino, não seria apresentado isoladamente, mas sim no contexto de ligantes de receptores do tipo toll bacterianos, tais como a LPS. Isto, por sua vez, pode revogar as propriedades antagonísticas de Bac-IYL e fornecer a atividade agonística. De acordo com esta hipótese, as células T 8.3-CD8+ naive montaram IFNy eficiente e respostas proliferativas para Bac-IYL na presença de LPS (Fig. 2C).

[0165] Os peptídeos antigênicos codificados em bactérias devem ser processados a partir da proteína doadora de comprimento completo por células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs, tais como as células dendríticas -DCs-). No caso do peptídeo Bac-IYL, sua proteína doadora, a Bacteróides Integrase, teria de ser processada pelo proteassoma e os peptídeos resultantes transportados para o ER para ligação a moléculas endógenas MHC (Kd), que seriam então transportadas para membrana plasmática das APCs para a exposição de células T. Para investigar se DCs podem processar a proteína Bacteróides Integrase e gerar complexos de Bac-IYL/Kd capazes de induzir a ativação das células T 8.3-CD8+, as preparações de integrase fundida a GST- recombinante que codificam a sequência de Bac-IYL do tipo selvagem ou um epítopo Bac-IYL mutado idêntico a IGRP 206-214 foram produzidas e purificadas. As DCs foram, em seguida, alimentadas com as proteínas recombinantes (na presença de LPS) e as células T 8.3-CD8+, para medir a ativação de células T 8.3-CD8+. Como mostrado na Fig. 2D, ambos os tipos de preparações de Integrase recombinante induziram a ativação das células T 8.3-CD8+, em particular, uma que codifica IGRP 206-214, como esperado. Assim, as DCs podem processar Bacteróides Integrase e gerar epítopos capazes de ativar as células T cognatas.

[0166] Devido as células T autoreativas de baixa avidez tenderem a diferenciar-se em células T autorreguladoras (supressora de doença autoimune) anérgicas (não-proliferação, mas secretoras de citocinas) semelhantes a memória em resposta à estimulação autoantigênica crônica, foi contemplado que Bac-IYL pode ser capaz de induzir as células T 8.3-CD8+ semelhante a memória in vitro. Como mostrado na Fig. 3A, as células T 8.3-CD8+ (mas não as células T 17.6 CD8+ reativas para IGRP206-214 de baixa avidez) cultivadas na presença de peptídeo Bac-IYL durante 28 dias expressaram o marcador de ativação de células T tardias CD44 e baixos níveis de marcador de células T naive CD62L. Além disso, estas células expressaram o marcador de ativação precoce CD69 e CD122, um marcador de células T de memória (Fig. 3B). Funcionalmente, essas células se comportaram como células T de memória. Assim, elas produziram rapidamente IFNg em resposta as DCs-pulsadas (IGRP206-214) agonísticas (Figs. 3C e D). No entanto, ao contrário das células T CD8+ semelhantes a memória convencionais e como as células T CD8+ de autorregulação, elas não exibiram responsividade proliferativa (anergia), em comparação com as células T 8.3-CD8+ naive (FIG. 3D). Assim, as células T CD8+ ativadas com Bac-IYL têm todas as características das células T CD8+ de autorregulação que surgem espontaneamente, in vivo, em resposta à estimulação autoantigênica crônica.

[0167] Foi documentado que camundongos TCRa-/- podem desenvolver IBD espontânea (ver, por exemplo, Mombaerts, P., et al (1993) Cell 75: 274-282) ou IBD induzida por DSS (ver, por exemplo, Mahler, M., et al. (1998) Am J Physiol 274: G544-551) e a cepa NOD também é suscetível a IBD induzida por DSS (ver, por exemplo, Mahler, M., et al. (1998) Am J Physiol 274: G544-551). Vários fatores, tais como genética, meio ambiente, composição de uma flora microbiana intestinal, a estrutura da camada epitelial intestinal, assim como os elementos dos sistemas imunes inato e adaptativo são todos conhecidos porcontribuir para a iniciação, progressão e regulação de IBD, embora através de mecanismos pouco conhecidos. IBD é definida como uma inflamação da mucosa sob as camadas epiteliais e da parede do intestino (ver, por exemplo, Nell, S., et al. Nat Rev Microbiol 8: 564-577; Maloy, K. J., et al. Nature 474: 298-306; Khor, B., et al. Nature 474: 307-317; e Kaser, A., et al. (2010) Annu Rev Immunol 28: 573-621). Para investigar o significado biológico do reconhecimento de BacIYL36_44 por células T CD8+ cognatas no contexto de IBD, os Requerentes compararam a sensibilidade de camundongos NOD.IGRP206-214-/- TCR-transgênico 8.3- versus 17.6 (carregando células T CD8 + específicas de IGRP206-214 capazes de reconhecer ou não reconhecer BacIYL 36_44, respectivamente). Os camundongos foram expostos a DSS a 2% em água potável durante 1 semana, para comprometer a integridade do epitélio intestinal e expor a microbiota intestinal para o tecido linfóide associado ao intestino (GALT) sem indução de doença declarada (sangramento ou perda de peso). Depois de mais uma semana em DSS a 0%, estes camundongos foram expostos a três ciclos de DSS a 3,5% (semana l)/DSS a 0% (semana 2 e 3). Como mostrado nas Figs. 4A, 4B e 4E, os camundongos NOD-8.3 apresentaram resistência significativa à colite e nenhuma mortalidade, em comparação com camundongos NOD 17.6, sugerindo que a ativação in vivo de células 8.3-CD8+ pelo epítopo BacIYL 36_44 forneceu os hospedeiros resistentes à colite. Além disso, os camundongos NOD 8.3 sem integrina β7 foram altamente suscetíveis a colite (Figs. 4C, 4D e 4F). Estes resultados suportam a ideia de que o efeito anticolitogênico de células T 8.3-CD8+ requer o recrutamento para o GALT.

[0168] Os dados acima previram que camundongos NOD.IGRP 206 214-/-, que exportam números aumentados de células CD8+ reativas para IGRP206-214 de alta avidez (BacIYL 36_44 de reação cruzada) para a periferia, devem exibir uma resistência relativa a colite induzida por DSS versus camundongos NOD do tipo selvagem, em que uma fração significativa destas células T CD8+ de avidez superior é excluída. Com efeito, como mostrado na Fig. 4G, os camundongos NOD.IGRP206-214-/-, ao contrário dos camundongos NOD, foram resistentes à perda de peso resultante de DSS a 4%. Para investigar diretamente um papel para uma resposta de células T CD8+ citotóxica de contra APCs carregadas com BacIYL36-44 em resistência a colite, DSS a 4% foi alimentado a hospedeiros NOD.IGRP206- 214-/- juntamente com injeções i.v. de 8.3-CTL diferenciada in vitro (linfócitos T citotóxicos). Como mostrado na Fig. 4H os hospedeiros transfundidos com 8.3-CTL- apresentaram menores pontuações de atividade da doença do que os camundongos não transfundidos.

[0169] Para fundamentar ainda mais esses resultados, os Requerentes avaliaram a capacidade de 8.3-CTL para proteger camundongos 17.6-NOD que são altamente suscetíveis a colite induzida por DSS, da doença. Como mostrado na Fig. 5A, os camundongos NOD- 17.6 transferidos com 8.3-CTL- (uma transferência de CTL por semana) não perdeu significativamente o peso ao longo de 35 dias de acompanhamento, em comparação com camundongos NOD-17.6 não- CTL-transferidos. Além disso, a transferência de 8.3-CTL reduziu significativamente as pontuações de atividade da doença nesses animais (Fig. 5B). Juntos, esses dados sustentam a idéia de que uma resposta de CTL contra um epítopo bacteriano intestinal oferece resistência à colite. Assim, mostra-se capaz de induzir a ativação in vivo e a expansão de CTLs específicos de microbiota de intestino deve ter um significado terapêutico em IBD.

[0170] Os dados descritos no presente documento demonstram conclusivamente que a Bacteróides Integrase é um alvo antigênico de boa- fé de células T anti-IBD no tecido linfóide associado ao intestino. Em consequência, este antígeno pode ser usado como um alvo para promover a acumulação e recrutamento de células T autorreguladoras (anti- inflamatórias), para o intestino na doença inflamatória do intestino. Em uma modalidade, o tratamento sistêmico de sujeitos com nanopartículas revestidas com complexos de peptídeo-MHC de classe I, induz as células T CD8+ específicas para o antígeno (semelhantes a 8.3-, tanto autorregulador convencional quanto de memória). Em uma outra modalidade, o tratamento sistêmico de sujeitos com nanopartículas revestidas com complexos de peptídeo-MHC de classe II induz as células T CD4+ -reguladoras-1 (produtoras de IL-10/TGFb) específicas para o antígeno. Na verdade, as células T CD4+ semelhantes a Trl expandidas por nanopartículas revestidas com a molécula MHC de classe II de camundongo NOD IAg7 apresentando um epítopo autoantigênico derivado de IGRP acumulam no tecido linfóide associado ao intestino, incluindo os Pensos de Peyer e agregados de linfócitos intraepiteliais. A Fig. 6 mostra os dados de dois camundongos curados da diabetes através de tratamento com nanopartículas revestidas com IGRP4_ 22/IAg7 - estes camundongos foram analisados em 50 semanas de idade; o tetrâmero de GPI/IAg7 é um tetrâmero de controle negativo).

[0171] Em consequência, as nanopartículas revestidas com moléculas MHC de classe I e/ou II que apresentam epítopos de Bacteróides Integrase provocam a expansão de células T CD4+ semelhantes a Trl ou CD8+ específicas de integrasse, a maioria dos quais irá acumular-se no intestino, ajudando restaurar a homeostase imune em indivíduos afetados com IBD. Assim, as composições da presente divulgação fornecem este método de tratamento também.

Exemplo 2 Processo para produção de complexos de antígeno-MHC-nanopartículas.

[0172] Nanopartículas inorgânicas (óxido de ferro = IONP; ouro = GNP) de um tamanho desejado. IONPs são produzidas através de decomposição térmica. As IONPs sintetizadas como tal são biocompatíveis e podem ser PEGuiladas para a conjugação de proteínas. Para revestir pMHC e/ou outras proteínas sobre IONPs, NPs revestidas com surfactante sãoreagidas com os ligantes de PEG funcionalizados com o comprimento apropriado. Os ligantes foram purificados por HPLC e caracterizados por 1H-RMN, MALDI/GPC e GPC para confirmar a identidade química, pureza, peso molecular e polidispersividade. Ligantes e abordagens similares podem ser usados para revestir GNP, exceto que os ligantes terão um grupo tiol (SH) na sua extremidade de ligação a NP.

Exemplo 3 Tamanho, Densidade e Exposição de Nanopartículas revestidas com pMHC I. Síntese e caracterização de NP revestida com pMHC à base de ouro

[0173] As nanopartículas de ouro (GNPs) de tamanhos específicos foram sintetizadas. O tamanho, densidade, carga superficial e monodispersividade das preparações de GNPs são mensurados usando espectrofotometria, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e espalhamento dinâmico de luz. As amostras de GNP são, em seguida, concentradas e conjugadas com complexos de pMHC monoespecíficos usando diferentes abordagens, como descrito abaixo. Os Requerentes desenvolveram métodos para quantificar a valência de pMHC por GNP e para concentrar as preparações de GNP revestidas com pMHC de diferentes tamanhos em altas densidades (~ 1014/ml) sem comprometer a monodispersão (Fig. 19).

II. Caracterização da capacidade de ligação de GNPs a pMHC

[0174] Os complexos de pMHC foram revestidos em GNPs de vários tamanhos, usando duas abordagens diferentes: (i) ligação aleatória de pMHC a superfície de GNP via interações eletrostáticas; e (ii) ligação direcional por meio de um ligante tiol-PEG-NH2 (neste caso, um ligante de tiol-PEG adicional como estabilizador de GNP foi usado para evitar a agregação). Acredita-se que a primeira abordagem permitiria densidades muito elevadas de ligante (de pMHC por GNP), comprometendo a direcionalidade da ligação de pMHC (ou seja, apenas uma fração das moléculas pode tornar-se disponível para reconhecimento por linfócitos T cognatos). A segunda abordagem teve como objetivo gerar GNPs revestidos com pMHC carregando densidades mais baixas de pMHC mas ligados direcionalmente, através de seus C-terminais. Ambas as abordagens foram testadas em GNPs de vários diâmetros, variando de 14 a 40 nm. Confirmou-se que, para ambas as abordagens, a capacidade de ligação a pMHC das GNPs é uma função do tamanho, e, mais especificamente, da área de superfície (maior número de pMHCs em maiores NPs). Surpreendentemente, verificou-se que a ligação mediada por PEG não só garante a direcionalidade da ligação, mas também aumenta a capacidade de ligação das GNP individuais (ao contrário das expectativas iniciais). A Tabela 1 abaixo resume os dados. Tabela 1. Capacidade de ligação a pMHC de GNP

III. Atividade agonística versus teor de pMHC.

[0175] Os efeitos da valência de pMHC, do tamanho de GNP, densidade de GNP e estratégia de revestimento sobre a atividade funcional (agonística) de GNPs revestidas com pMHC in vitro foram testadas. A capacidade de várias preparações de GNP-IGRP 206-214-Kd para ativar as células T CD8+ cognatas naive (IGRP206-214-específicas) (aqui referidas como “células T 8.3-CD8+”‘) derivadas de receptor decélulas T (TCR) de camundongos NOD transgênicos (ou camundongos NOD-8.3) foi comparada. O primeiro conjunto de experimentos teve como objetivo comparar os efeitos da valência de IGRP 206-214-Kd (pMHC) em uma faixa de densidades de GNP na cultura. As GNPs conjugadas com um complexo de pMHC (Tum-Kd) de controle (não cognato) foram usadas como controles negativos. Como esperado, as GNPs revestidas com IGRP 206- 214-Kd - (mas não revestidas com TUM-Kd) ativou estas células T (como medido pela produção de IFNy) e elas fizeram isso em uma dose de GNP (aqui dose de pMHC) - de modo dependente. A Fig. 20 mostra um experimento usando ~ 14 nm de GNPs revestidas com diferentes números de moléculas de pMHC/GNP usando o método de ligação. A Fig. 20 compara as quantidades de IFNY secretadas por células T 8.3-CD8+ cognatas em resposta a duas amostras de pMHC-GNP diferentes (ambas constituídas de ~2x1013 GNPs de 14 nm de diâmetro/ml). Au-022410 e Au-21910 carregaram ~250 e ~120 pMHCs/GNP, respectivamente. Au- 011810-C carregou ~120 de pMHCs/GNP de controle. As GNPs revestidas com ~2 vezes maiores números de complexos de pMHC/GNP tiveram a atividade agonística superior. Deste modo, a atividade agonística de GNPs revestidas pMHC é uma função do teor total de pMHC (GNP). Estes resultados foram contra-intuitivos já que o estado da técnica sugere que, na ausência de moléculas coestimuladoras sobre NPs, o aumento do número de pMHCs em NPs individuais poderia também aumentar a avidez e deve promover a deleção (morte celular), ao invés da proliferação e secreção de citocinas de células T cognatas. Isso seria verdadeiro tanto para baixa avidez quanto alta avidez de células T. Por exemplo, o trabalho anterior dos Requerentes (Han et al., Nature Medicine, 2005) e outros indicaram que os peptídeos reconhecidos com alta avidez ou peptídeos reconhecidos com baixa avidez, mas com altas concentrações têm uma maior capacidade de deletar as células T cognatas in vivo. Portanto, no contexto da administração terapêutica de nanopartículas revestidas com MHC-antígeno intravenoso ou peptídeos solúveis, as células T cognatas devem sofrer deleção em um peptídeo de afinidade e de forma dependente da dose. Essa expectativa não foi atendida pelos dados apresentados na Fig. 20.

IV. Um limiar de valência na atividade agonística dos complexos de peptídeo-MHC-nanopartículas

[0176] Para investigar o papel da valência de peptídeo-MHC (pMHC) sobre as propriedades agonísticas das nanopartículas conjugadas a pMHC (pMHC-NPs), a capacidade de NPs de óxido de ferro de 8nm diâmetro (Fe3O4) acopladas de forma covalente com números crescentes de monômeros de IGRP 206-214/Kd pMHC, para desencadear a secreção de IFN-gama (IFNY) por células T CD8+ cognatas (IGRP206-2i4/Kd -específico) (aqui referida como células T 8.3-CD8+) foi comparada in vitro. Como mostrado na Tabela 2, as células-T 8.3-CD8+ produziram quantidades insignificantes de IFNy quando cultivadas na presença de NPs revestidas com 8 monômeros de pMHC por NP, mas produziram quantidades substancialmente mais elevadas de IFNy em resposta a NPs revestidas com maiores valências de pMHC, como também partir de 11 monômeros de pMHC/NP, em um modo de dose-resposta. Tabela 2. Secreção de IFNY por células T 8.3-CD8+ em resposta a NPs conjugadas com o aumento valências de pMHC (a 5x1011 NPs/mL)

[0177] Este efeito positivo de valência de pMHC sobre a atividade agonística de pMHC-NPs foi mantido ao longo de uma faixa de densidades de pMHC-NP (Fig. 21). Surpreendentemente, no entanto, embora 25x1011 NPs (por ml) transportando 11 pMHCs/NP tenham atividade agonística semelhante a 5x1011 NPs (por ml) transportando 54 pMHCs/NP, o aumento do número de NPs transportando 8 pMHCs/NP para valores tão altos como 40x1011 NPs/ml teve efeitos mínimos (Fig. 22). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que existe um limite de valência de pMHC, que se encontram entre 9 e 11 pMHCs/NP, abaixo do qual aumentos relativamente pequenos no número de NPs (ou seja, 5 vezes) não podem superar a baixa atividade agonística de pMHC-NPs revestidas em baixas valências (note-se que o uso de > 50x1011 NPs nestes experimentos in vitro não é informativo, devido à toxicidade celular causada por elevadas densidades de NP).

[0178] Este efeito limiar de valência de pMHC é ainda ilustrado na Fig. 23, onde os dados de secreção de IFNY são normalizados para a concentração de pMHC total fornecida pelas NPs revestidas nas culturas. As NPs transportando 11 pMHCs/NP desencadearam respostas de IFNy significativamente mais elevadas ao longo de um intervalo de concentrações de pMHC do que aquelas desencadeadas por NPs que transportam 8 pMHCs/NP. Além disso, as diferenças nas propriedades agonísticas destas duas preparações de NP aumentou substancialmente com o teor total de pMHC. Isto é, as diferenças nas propriedades agonísticas de 2,4 μg/ml de pMHC liberados pelas NPs como octâmeros contra monodecâmeros eram muito maiores do que as diferenças nas propriedades agonísticas das mesmas formulações a concentrações 10 vezes mais baixas de pMHC total.

[0179] A Fig. 24 mostra que estes efeitos profundos da valência de pMHC sobre as propriedades agonísticas de pMHC-NPs também podem ser vistos quando se utiliza NPs maiores (que pode aceitar valências de pMHC muito mais elevadas do que as NPs de 8 nm estudadas nas Figs. 21-23) usada em menores densidades de NP (para normalizar o teor total de óxido de ferro nas culturas). Considerando que o diâmetro de 18nm das NPs transportando <10 pMHCs/NP não teve praticamente nenhuma atividade biológica até 4x1011 NPs/ml, a atividade agonística de NPs de 18nm de diâmetro transportando maiores valências de pMHC aumentou linearmente com a densidade de NP. A comparação das Figs. 23 e 24 mostra ainda que 2x1011 NPs de 18nm fornecendo 61 pMHCs/NP têm atividade agonística semelhante a de 2x1011 NPs de 8nm fornecendo um número similar (54) de pMHCs/NP, indicando que os efeitos da valência de pMHC não são significativamente afetados por volume de NP.

[0180] Em conjunto, estes dados demonstram que NPs revestidas com pMHC adquirem poderosa atividade agonística acima de um certo limiar de valência de pMHC (situada entre 9 e 11 pMHCs/NP). Aumentos em qualquer valência de pMHC ou densidade de NP podem melhorar as propriedades agonísticas de pMHC-NPs transportando valências de pMHC de “limiar” ou “supra-limiar”, mas não as propriedades agonísticas das NPs transportando valências de pMHC de “infra-limiar”.

V. Atividade Agonística versus tamanho e densidade de NP

[0181] Uma análise mais aprofundada indicou que o teor total de pMHC não é o único fator que afeta a atividade agonística de pMHC-NPs in vitro e que o tamanho da NP também desempenha um papel importante independente. Isto foi investigado comparando a atividade agonística de duas amostras de pMHC-GNP de diferentes tamanhos (14 e 40 nm de diâmetro, respectivamente) e diferentes valências de pMHC, mas sob condições de teor de pMHC total semelhantes. Na experiência apresentada na Fig. 25, GNPs de 14 nm transportando ~200 moléculas de pMHC/GNP e GNPs de 40 nm transportando ~5000 pMHCs/GNP foram usados. As densidades de GNP destas duas amostras foi ajustada (a 3x1013 e 1012 GNPs/ml, respectivamente) para ajustar o teor total de pMHC em cada amostra de ~450 ug/ml. Notavelmente, As células T 8.3- CD8+ responderam significativamente melhor ao composto de pMHC/GNP de 14 nm do que ao de 40 nm sobre uma faixa de teor de pMHC total, apesar do fato destes últimos terem sido decorados com significativamente mais complexos de pMHC do que o anterior. Isto sugere que a densidade de GNP (mais células T cognatas/GNPs) é fundamental. Em outras palavras, NPs de 4x40 nm transportando 1000 pMHCs/GNP (4000 pMHCs) seria menos desejável do que NPs de 40x10 nm transportando 100 pMHCs/GNP (4000 pMHCs). Assim, quando tomados em conjunto, estes dados sugerem que as preparações ideais de pMHC-GNP são aquelas compostas de pequenas GNPs usadas em altas densidades de pMHC. O aumento da valência de pMHC sobre estas NPs pequenas aumenta ainda mais suas propriedades agonísticas surpreendentes e inesperadas.

VI. Atividade agonística versus a exposição de pMHC

[0182] Como mencionado acima, as amostras de GNPs revestidas com pMHC são produzidas por co-revestimento de GNP com ligante de tiol-PEG-NH2 de 3,4 kD (como receptor de pMHC carboxitermini) com um ligante de tiol-PEG que funciona como estabilizador de GNP. Para investigar se o comprimento da estabilização de ligante de tiol-PEG influencia nas suas propriedades antiagregação de GNP, a capacidade do ligante de tiol-PEG-NH2 para ligar moléculas de pMHC e/ou as propriedades agonísticas de GNPs revestidas com pMHC, as GNPs revestidas com pMHC preparadas usando ligantes estabilizadores de diferentes tamanhos (2 kD e 5 kD, mais curtos e mais longos do que o ligante receptor de pMHC, respectivamente) foram comparadas. Verificou-se que ambos os ligantes têm propriedades antiagregação semelhantes e que o ligante de 5 kD não inibiu a ligação de pMHC ao ligante de tiol-PEG-NH2 de 3,4 kD mais curto. Notavelmente, no entanto, as pMHC-GNPs que foram protegidas por tiol-PEG mais curto (2 kDa) teve atividade agonística superiores in vitro do que os co-revestidos com o tiol-PEG (Fig 26) mais longo (5 kD). Isto sugere que os ligantes de tiol- PEG protetores longos blindam as moléculas de pMHC ligadas ao ligante receptor da exposição a células T cognatas.

VII. Pequenas NPs acopladas de forma covalente a altas densidades de pMHC produzem máximos efeitos de expansão das células T in vivo de autorregulação

[0183] As nanopartículas tendo um diâmetro médio de cerca de 10 nm e acopladas a qualquer NRP-V7/Kd (também referidas como IGRP 206-214-Kd) ou TUM/Kd (controle) foram feitas de acordo com os métodos descritos no presente documento e testadas quanto à sua capacidade para induzir a ampliação de células T CD8+ cognatas autorreguladoras in vivo. A Fig. 27 mostra os resultados de uma experiência em que o complexo de antígeno-MHC-GNPs foi injetado por via intravenosa em camundongos NOD do tipo selvagem de 10 semanas de idade, duas vezes por semana durante 5 semanas consecutivas. As alterações na dimensão da população de células T cognatas na circulação e diferentes tecidos linfóides em resposta à terapia foram avaliadas por coloração das suspensões de células com tetrâmeros de antígeno-MHC marcados fluorescentemente (ambas cognatas, bem como tetrâmeros de controle irrelevante). A administração de 10-100 menos GNPs do que o que foi previamente demonstrado na técnica (Ver, por exemplo, Tsai et al., Immunity, 2010, em que as nanopartículas revestidas com 1-8 pMHCs foram testadas), mas revestidas com 150 antígeno-MHCs por GNP resultou em expansões substancialmente mais elevadas (Fig. 27). Eles expandiram as células T CD8+ in vivo para níveis diversas vezes maiores (até 44% de todas as células T CD8+ circulantes) do que os que nós normalmente obtinhamos com nanopartículas revestidas com pMHC em uma valência de cerca de 8 (1-2% de células do sangue, ver, por exemplo, Tsai et al., Immunity, 2010, Fig. 1C). Os dados acima indicam que as nanopartículas pequenas revestidas com altas valências de antígeno-MHC produziram máximos efeitos de expansão de células T. Estes resultados foram inesperados. Em consequência, não é a avidez global da interação de células-T-pMHC-NP que é responsável pelo efeito terapêutico, mas sim a avidez da população precursora que dá origem às células T, que se expandem em resposta a terapia com pMHC-NP. Esta interpretação é consistente com os dados descritos no presente documento e implica que a valência de pMHCs em NPs deve aumentar a eficácia terapêutica de pMHC-NPs.

Exemplo 4 Grande expansão de células T CD8+ cognatas por pMHC-GNPs revestidas em valências de pMHC mais elevadas.

[0184] Foi em seguida determinado se pMHC-NPs têm o potencial para induzir expansões maciças de células T cognatas in vivo. Isso foi feito por tratamento dos camundongos com várias injeções de 3xl012 NPs de 10-14 nm transportando 25 ug de pMHC total (~150 moléculas de IGRP206-214/Kd por NP). Como mostrado na Fig. 28, os camundongos tratados com 10 doses (duas vezes por semana, durante 10 semanas) exibiram expansões maciças de células T CD8+ cognatas reativas (NRP- V7) para IGRP206-214 no sangue periférico, em comparação com os seus homólogos não tratados (de < 0,4 a > 17 ou 47% de células T CD8+) (painéis inferiores). Essa expansão já foi vista em um camundongo que foi sacrificado após 4 doses de pMHC-NPs (painéis superiores). As células de pMHC-NP-expandidas se ligam especificamente a tetrâmeros de pMHC cognatos, mas não aos não cognatos (NRP-V7/Kd vs. TUM/Kd, respectivamente).

Exemplo 5 Preparação de nanopartículas de ouro conjugadas com pMHC

[0185] Preparação de nanopartículas de ouro conjugadas a pMHC (pMHC-GNPs, 12 e 30 nm). Preparação do GNPs. GNPs foram preparadas por aquecimento de água D.D. (200 ml) em um balão redondo em um banho de óleo de silicone, até ferver. Uma solução de HAuCL4 a 1% (4 mL) foi então adicionada na água fervendo. A solução foi agitada durante 10 min antes da adição de solução de citrato de Na a 1%. Para GNPs de 12 nm foram adicionados 12 mL de solução de Citrato de Na. Para GNPs de 30 nm foram adicionados 12 mL de solução de Citrato de Na. A cor vinho aparece imediatamente após a adição da solução de citrato de Na. Para completar a reação, a solução de GNP foi agitada durante mais 30 minutos. Esta é uma modificação do método descrito em Levy, R. et al. (“Rational and combinatorial design of peptide capping ligands for gold nanoparticles.” J Am Chem Soc 126, 10076-84 (2004)) que é aqui incorporada por referência.

[0186] Modificação da superfície de GNPs. GNPs foram peguiladas através da adição de tiol PEG-NH2 25 mM de (PM 3400) e tiol- PEG 50 mM (PM 2000, a razão de PEG/GNP 10000:1) em solução de GNP. A solução foi agitada durante 5 horas à temperatura ambiente. As GNPs Peguiladas foram então lavadas com 3 X 30 mL de água D.D. esterilizada para remover o excesso de PEG e ressuspensas em 40 mL de tampão MES (C6H13NO4S.xH2O) 100 mM de, de pH 5,5.

[0187] Conjugação de pMHC. pMHCs (IGRP 206-214/Kd, 4 mg) foi adicionada na solução de GNPs peguiladas, gota a gota, com agitação suave à temperatura ambiente. A mistura é agitada durante uma hora antes da adição de 20 mg de l-Etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC). A mistura é agitada durante 4 horas adicionais. Conjugados de pMHC-GNPs são então lavados com 40 mL de tampão fosfato salino (PBS, pH 7,2-7,4) por três vezes e ressuspensos em 8 mL de PBS.

Exemplo 6. Preparação de nanopartículas de ouro conjugadas com pMHC

[0188] Preparação de GNPs conjugadas com pMHC (pMHC-GNPs, 2-10 nm). GNPs para Preparação (2-5 nm). GNPs de 2-5 nm foram preparadas por dissolução de 250 mg (para GNPs de 2 nm) ou 50 mg (para GNPs de 4 nm) de dodecilamina em 10 mL de solução de DDAB (Brometo de didodecildimetilamônio (DDAB) 100 mM em tolueno). Em segundo lugar, 100 mg de Boro-hidreto de tetrabutilamônio (TBAB) foram dissolvidos em 4 mL de solução de DDAB. As soluções de dodecilamina e TBAB foram então misturadas em um frasco de com três gargalos de 50 ml, com agitação sob nitrogênio. 34 mg de AUCl3 foram resolvidos em 4,5 mL de solução de DDAB e injetados rapidamente em uma mistura de solução de TBAB e dodecilamina. A solução torna-se vermelho escuro imediatamente, indicando a formação de GNPs. A mistura foi continuamente agitada durante 30 min e 15 mL de etanol foram adicionados à mistura. A mistura foi então centrifugada a 4100 x g durante 12 min para precipitar GNPs.

[0189] Preparação de GNPs (6-10 nm). Para preparar GNPs de 6- 10nm o ácido decanóico (172 mg) foi primeiro dissolvido em 10 ml de tolueno e, em seguida, misturado com várias quantidades de solução de TBAB (4 e 1 mL para GNPs de 6 e 10 nm, respectivamente) um frasco de três gargalos de 50 mL, com agitação sob nitrogênio. AuCl3 (34 mg dissolvidos em 4,5 ml de solução de estoque de DDAB) foi, em seguida, rapidamente injetado na mistura de uma solução de ácido decanóico e TBAB. A solução tornou-se vermelho escuro imediatamente. A mistura foi continuamente agitada durante 30 min e 15 mL de etanol foram adicionados à mistura. A mistura é então centrifugada a 4100 x g durante 12 min para precipitar as GNPs.

[0190] Modificação da superfície das GNPs. As GNPs foram ressuspensas em 20 mL de ácido mercaptopropanóico (MPA) 0,1 M em metanol, pH 10 e agitou-se durante uma hora à temperatura ambiente. 10 mL de acetato de etila foram então adicionados. A mistura foi então centrifugada a 4100 x g durante 15 min. As GNPs precipitadas foram então lavadas com 30 ml de água D.D. esterilizada por três vezes e ressuspendeu-se em 20 mL de MES 100 mM (C6H13NO4S x H2O), pH 5,5. A esta mistura, soluções de bis (polioxietileno) amina a 0,5 M (a 10000:1 de razão de PEG/GNP) e 1-etil-3 (3-dimetilaminopropil) carbodi-imida (EDC) 0,1 M (concentração final de EDC de 2mM) foram adicionados. A mistura foi então agitada durante 4 horas. As GNPs peguiladas foram lavadas com 3 X 30 ml de água D.D. esterilizada para remover o excesso de PEG e EDC.

[0191] Conjugação de pMHC. GNPs Peguiladas foram ressuspensas em 20 mL de MES (C6H13NO4S x H2O) 100 mM, pH 5,5. pMHCs (5 mg/ml, total de 10 - 30 mg) foram então adicionados às GNPs ressuspensas (500:1 de razão de pMHC/GNP), gota a gota e agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente antes da adição de l-Etil -3 (3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0,1 M (concentração final de EDC de 2 mM). A mistura foi agitada durante mais 4 horas. Conjugados de pMHC-GNP foram lavados três vezes com 40 mL de tampão fosfato salino (PBS, pH 7,2-7,4) e, em seguida, novamente suspensos em 10-20 mL de PBS.

[0192] Deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente descrita por modalidades preferenciais e características opcionais, a modificação, melhoramento e variação das invenções incorporadas na mesma aqui divulgadas podem ser invocadas pelos versados na técnica e que tais modificações, melhoramentos e variações são consideradas como estando dentro do escopo da presente invenção. Os materiais, métodos e exemplos fornecidos no presente documento são representativos das modalidades preferenciais, são exemplares e não pretendem ser limitações ao escopo da invenção.

[0193] A invenção foi descrita de forma ampla e genérica no presente documento. Cada uma das espécies mais estreitas e grupos subgenéricos que fazem parte da descrição genérica também fazem parte da invenção. Isto inclui a descrição genérica da invenção com a condição ou limitação negativa de remoção de qualquer matéria do género, independentemente de se o material retirado é ou não especificamente descrito no presente documento.

[0194] Além disso, sempre que as características ou aspectos da invenção são descritos em termos de grupos de Markush, os versados na técnica irão reconhecer que a invenção também é, portanto, descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo de Markush.

[0195] Ao longo desta divulgação, várias publicações, patentes e especificações de patente publicadas são referenciados por uma citação de identificação. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outras referências aqui mencionadas são expressamente incorporadas por referência na sua totalidade, na mesma extensão como se cada uma fosse incorporada por referência individualmente. Em caso de conflito, a presente descrição, incluindo as definições, irá prevalecer.

Claims (15)

1. Nanopartícula, compreendendo um complexo de antígeno-MHC, caracterizada por que: (a) o complexo de antígeno-MHC compreende uma proteína de MHC complexada a um peptídeo antigênico de Bacteroides integrase de SEQ ID NO: 1; (b) a nanopartícula possui um diametro de 1 nm a 100 nm; e (c) a razão de complexo antígeno-MHC por nanopartícula é de 10:1 a 1000:1.

2. Nanopartícula, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizada por que a nanopartícula tem um diâmetro selecionado de 5 nm a 50 nm ou de 5 a 15 nm.

3. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que a nanopartícula compreende ainda uma camada biodegradável na superfície externa da nanopartícula e os complexos antígeno-MHC são acoplados à nanopartícula ou à camada biodegradável.

4. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que a camada biodegradável compreende um ou mais de dextrano, manitol ou poli(etileno glicol).

5. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que o complexo antígeno-MHC está ligado covalentemente ou não covalentemente à nanopartícula.

6. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que o complexo antígeno-MHC está covalentemente ligado à nanopartícula através de um ligante com menos de 5 kD de tamanho.

7. Nanopartícula, de acordo com a Reivindicação 6, caracterizada por que o ligante compreende poli(etileno) glicol.

8. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que a nanopartícula compreende um metal, um óxido metálico, um sulfeto metálico, um seleneto metálico, um polímero ou um material magnético.

9. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que o antígeno compreende uma sequência peptídica do grupo: SEQ ID Nos. 4, 5, 6, 7 ou 8.

10. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que a nanopartícula é biocompatível ou bioabsorvível ou não lipossômica.

11. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações anteriores, caracterizada por que o MHC compreende uma proteína MHC classe I ou uma proteína MHC classe II.

12. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 11, caracterizada por que a nanopartícula compreende ouro, ferro ou óxido de ferro.

13. Composição, caracterizada por que compreende a nanopartícula, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações de 1 a 11, e um carreador.

14. Uso de Nanopartícula, conforme definida em qualquer uma das Reivindicações 1 a 11, caracterizado por que é no fabrico de medicamentos para o tratamento de doença inflamatória intestinal, colite, doença de Crohn, inflamação alérgica do trato gastrointestinal ou doença celíaca.

15. Uso de Nanopartícula, de acordo com a Reivindicação 14, caracterizado por que a célula T é uma célula T CD4+ ou uma célula T CD8+, em particular a célula T secreta IL-10 ou TGFβ.

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