CN110291111A - 重组pMHC II类分子 - Google Patents

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Abstract

本文描述了含有至少一种第一多肽和至少一种第二多肽的异二聚体，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面含有工程化凸起，该凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽含有MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽含有MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。

Description

重组pMHC II类分子
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年11月9日提交的美国临时申请序列号62/419,947的优先权权益，其全文并入于此。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交并且通过引用以其全文并入于此。所述ASCII副本于2017年10月31日创建，命名为42363-711_601_SL.txt，大小为242,369个字节。
背景技术
主要组织相容性复合物(MHC)II类分子通常见于抗原呈递细胞上，它们在该细胞上将抗原呈递给同源CD4+T细胞，从而帮助调节免疫应答。MHC II类分子由α链和β链的二聚化形成，并且在存在缔合在由α链和β链形成的结合沟中的多肽抗原的情况下是稳定的。然而，由于蛋白质异二聚体的内在不稳定性，即使在多肽存在下，在体外工程化系统中产生MHC II类一直具有挑战性。
发明内容
本文公开了分离和纯化的抗原-MHC异二聚体及其有效制备方法。异二聚体被工程化以便易于生产和分离。采用多种方法提高分离的异二聚体的产量。首先，α链和β链二者单独地融合到IgG重链的一部分，然后该IgG被工程化具有孔-突起接合(knob-in-hole)架构(其中一个α链或β链IgG包含突起而相反的α或β链IgG包含孔)。在一些情况下，异二聚体可以通过抗原与MHC II类结合沟的残基之间的半胱氨酸阱进一步稳定。为使用半胱氨酸阱，抗原可以包含内源性或工程化半胱氨酸，其与紧邻结合沟的MHC分子的α或β链上的工程化半胱氨酸形成二硫键。该半胱氨酸阱可以进一步增加肽MHC分子的稳定性。出乎意料的是，发现在没有先前已使用的异源二聚化结构域的情况下，孔-突起接合架构是有效的。事实上，发现异源二聚化结构域对异二聚体的形成是有害的。
在一个方面，本文提供了分离的异二聚体，其包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。在一些实施方案中，凸起包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，凸起包含一个或多个天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，凸起包含选自苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，凸起包含精氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含苯丙氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含酪氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含色氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含半胱氨酸残基和色氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含非天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，空腔包含天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，空腔包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，空腔包含丙氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含丝氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含苏氨酸残基。
在一些实施方案中，空腔包含缬氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含半胱氨酸残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基和缬氨酸残基。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽通过抗体的CH3结构域相接。在一些实施方案中，CH3结构域来自IgG。在一些实施方案中，IgG是IgG1亚型。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽进一步包含生物素化位点。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽进一步包含Strep标签。在一些实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种由SEQ ID NO:1编码的多肽。在一些实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种由SEQ ID NO:2编码的多肽。在一些实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种由SEQ ID NO:3编码的多肽。在一些实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种由SEQ ID NO:4编码的多肽。在一些实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种由SEQ ID NO:5-8中的任一个编码的多肽。在一些实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种由包含SEQ ID NO:1-26、64或65中的任一个的DNA序列编码的多肽。在一些实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种包含SEQ ID NO:27-63中的任一个的氨基酸序列的多肽，或其片段。
在另一个方面，本文提供了包含两个或更多个本文所述的分离的异二聚体的多聚体。在一些实施方案中，多聚体进一步包含亲和素。
在一些实施方案中，两个或更多个异二聚体中的每一个均连接至亲和素。在一些实施方案中，多聚体进一步包含聚合物主链，其中两个或更多个异二聚体中的每一个均连接至聚合物主链。在一些实施方案中，聚合物主链是葡聚糖或聚乙二醇(PEG)。
在另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；以及至少一个工程化凸起。在一些实施方案中，至少一个工程化凸起不位于MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域。在一些实施方案中，工程化凸起位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类α2结构域与具有工程化凸起的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自S354C、T366W以及S354C和T366W二者(EU编号)的至少一种突变。
在另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；以及至少一个工程化凸起。在一些实施方案中，至少一个工程化凸起不位于MHC II类β1结构域或MHC II类β2结构域。在一些实施方案中，工程化凸起位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类β2结构域与具有工程化凸起的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自S354C、T366W以及S354C和T366W二者(EU编号)的至少一种突变。
在一些实施方案中，凸起包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，凸起包含一个或多个天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，凸起包含选自苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，凸起包含精氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含苯丙氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含酪氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含色氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含半胱氨酸残基和色氨酸残基。
在另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；以及至少一个工程化空腔。在一些实施方案中，至少一个工程化空腔不位于MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域。在一些实施方案中，工程化空腔位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类α2结构域与具有工程化空腔的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合的至少一种突变。
在另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；以及至少一个工程化空腔。在一些实施方案中，至少一个工程化空腔不位于MHC II类β1结构域或MHC II类β2结构域。在一些实施方案中，工程化空腔位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类β2结构域与具有工程化空腔的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合的至少一种突变。
在一些实施方案中，空腔包含非天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，空腔包含天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，空腔包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，空腔包含丙氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含丝氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含苏氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含缬氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含半胱氨酸残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基和缬氨酸残基。
在一些实施方案中，凸起位于CH3抗体恒定域。在一些实施方案中，空腔位于CH3抗体恒定域。在一些实施方案中，多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。
在另一个方面，本文提供了由包含SEQ ID NO:1-26、64或65中的任一个的DNA序列编码的多肽。
在另一个方面，本文提供了包含SEQ ID NO:27-63中的任一个的氨基酸序列的多肽，或其片段。
在另一个方面，本文提供了异二聚体-纳米颗粒缀合物，其包含至少一个本文所述的异二聚体；以及纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且/或者具有固体核心。在一些实施方案中，固体核心是金核心或氧化铁核心。在一些实施方案中，该至少一个异二聚体共价或非共价连接至纳米颗粒。在一些实施方案中，该至少一个异二聚体通过连接体共价连接至纳米颗粒。在一些实施方案中，连接体包含聚乙二醇。
在另一个方面，本文提供了制备包含第一多肽和第二多肽的异二聚体的方法，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；
该方法包括以下步骤：(a)培养包含核酸的宿主细胞，该核酸编码第一多肽和第二多肽及其界面，其中编码第一多肽的界面的核酸已经从编码第一多肽的原始界面的核酸改变以编码凸起，或编码第二多肽的界面的核酸已经从编码第二多肽的原始界面的核酸改变以编码空腔，或两者兼有，并且其中培养使第一多肽和第二多肽表达；以及(b)从宿主细胞培养物回收异二聚体。
在一些实施方案中，编码第一多肽的核酸已从原始核酸改变，以编码凸起，并且编码第二多肽的核酸已从原始核酸改变，以编码空腔。
在一些实施方案中，步骤(a)之前是这样的步骤，其中编码来自第一多肽的界面的原始氨基酸残基的一个或多个核酸中的每一个被替换为编码输入氨基酸残基的核酸，其中凸起包含一个或多个输入残基。在一些实施方案中，输入残基选自苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸。在一些实施方案中，输入残基是精氨酸。在一些实施方案中，输入残基是苯丙氨酸。
在一些实施方案中，输入残基是酪氨酸。在一些实施方案中，输入残基是色氨酸。在一些实施方案中，输入残基是半胱氨酸。
在一些实施方案中，步骤(a)之前是这样的步骤，其中编码第二多肽的界面中的原始氨基酸残基的一个或多个核酸中的每一个被替换为编码输入氨基酸残基的核酸，其中空腔包含一个或多个输入残基。在一些实施方案中，输入残基选自半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，输入残基是半胱氨酸。在一些实施方案中，输入残基是丙氨酸。在一些实施方案中，输入残基是丝氨酸。在一些实施方案中，输入残基是苏氨酸。在一些实施方案中，输入残基是缬氨酸。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含抗体恒定域。在一些实施方案中，抗体恒定域是CH3结构域。在一些实施方案中，抗体恒定域来自IgG。在一些实施方案中，IgG是人IgG1。在一些实施方案中，抗体恒定域是CH2和CH3结构域。在某些实施方案中，CH3进一步包含工程化凸起(突起)或空腔(孔)。
在另一个方面，本文提供了制备异二聚体-纳米颗粒缀合物的方法，其包括将至少一个本文所述的异二聚体连接至纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且/或者具有固体核心。在一些实施方案中，固体核心是金核心或氧化铁核心。在一些实施方案中，连接步骤包括将至少一个异二聚体共价或非共价连接至纳米颗粒。在一些实施方案中，连接步骤包括将至少一个异二聚体通过连接体共价连接至纳米颗粒。在一些实施方案中，连接体包含聚乙二醇。
在另一个方面，本文描述了分离的异二聚体，其包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。在某些实施方案中，凸起包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基。在某些实施方案中，凸起包含选自苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，分离的异二聚体的第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，分离的异二聚体的第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:54至少80％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，分离的异二聚体的第一或第二多肽包含CH3结构域，并且CH3结构域包含选自S354C、T366W以及S354C和T366W二者(EU编号)的至少一种突变。在某些实施方案中，空腔包含非天然存在的氨基酸残基。在某些实施方案中，空腔包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在某些实施方案中，分离的异二聚体的第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，分离的异二聚体的第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，分离的异二聚体的第一或第二多肽包含CH3结构域，并且CH3结构域包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合的至少一种突变。
在某些实施方案中，第一多肽或第二多肽之一或二者不包含异源二聚化结构域。在某些实施方案中，第一多肽或第二多肽之一或二者不包含亮氨酸拉链。在某些实施方案中，第一多肽或第二多肽之一或二者不包含位点特异性生物素化位点。在某些实施方案中，分离的异二聚体进一步包含自身免疫疾病相关的抗原。在某些实施方案中，疾病相关的抗原包含长度至少为11个氨基酸的多肽。在某些实施方案中，自身免疫疾病相关的抗原通过柔性连接体连接至MHC II类α1结构域或MHC II类β1结构域。在某些实施方案中，抗原通过二硫键共价连接至MHC II类α1结构域或MHC II类β1结构域，该二硫键在与抗原肽缔合的半胱氨酸氨基酸与MHC II类α1结构域或MHC II类β1结构域的半胱氨酸氨基酸之间形成。在某些实施方案中，MHC II类α1结构域或MHC II类β1结构域的半胱氨酸氨基酸在形成MHC II类结合沟的一部分的残基的10个氨基酸内。在某些实施方案中，MHC II类α1结构域或MHC II类β1结构域的半胱氨酸残基在形成MHC II类结合沟的一部分的残基的3个氨基酸内。在某些实施方案中，MHC II类α1结构域或MHC II类β1结构域的半胱氨酸氨基酸已被引入MHC II类α1结构域或MHC II类β1结构域的天然存在序列中。在某些实施方案中，分离的异二聚体用于治疗被诊断或疑似患有自身免疫疾病的个体。在某些实施方案中，分离的异二聚体由编码本文所述的第一或第二多肽的多核苷酸编码。在某些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸。在某些实施方案中，多核苷酸稳定整合到基因组中。在某些实施方案中，至少一个异二聚体缀合至纳米颗粒，以形成异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中纳米颗粒是非脂质体的并且/或者具有固体核心。在某些实施方案中，固体核心是金核心、铁核心或氧化铁核心。在某些实施方案中，固体核心的直径小于100纳米。在某些实施方案中，至少一个异二聚体共价连接至纳米颗粒。在某些实施方案中，至少一个异二聚体通过包含聚乙二醇(PEG)的连接体共价连接至纳米颗粒。在某些实施方案中，聚乙二醇用马来酰亚胺官能化。在某些实施方案中，聚乙二醇小于5kD。在某些实施方案中，包含异二聚体-纳米颗粒缀合物的药物组合物与药物赋形剂、稳定剂或稀释剂一起形成。在某些实施方案中，分离的异二聚体或药物组合物用于治疗自身免疫疾病或炎症病况的方法。在某些实施方案中，治疗自身免疫疾病或炎症病况的方法包括向个体施用分离的异二聚体-纳米颗粒缀合物或药物组合物。
在另一个方面，本文描述了制备包含第一多肽和第二多肽的异二聚体的方法，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；该方法包括以下步骤：(a)培养包含核酸的宿主细胞，该核酸编码第一多肽和第二多肽及其界面，其中编码第一多肽的界面的核酸已经从编码第一多肽的原始界面的核酸改变以编码凸起，或编码第二多肽的界面的核酸已经从编码第二多肽的原始界面的核酸改变以编码空腔，或两者兼有，并且其中培养使第一多肽和第二多肽表达；以及(b)从宿主细胞培养物回收异二聚体。在某些实施方案中，编码第一多肽和第二多肽的核酸稳定整合到宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在某些实施方案中，从宿主细胞培养物回收异二聚体包括将包含异二聚体的液体应用于液相层析柱。在某些实施方案中，液相层析柱包含蛋白A、蛋白G、蛋白L或其组合。
在另一个方面，本文描述了制备包含第一多肽和第二多肽的异二聚体的方法，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；该方法包括以下步骤：(a)培养包含编码第一多肽的核酸的第一宿主细胞；(b)培养包含编码第二多肽的核酸的第二宿主细胞；(c)从宿主细胞培养物中回收多肽；以及(d)通过将第一和第二多肽一起温育而形成异二聚体；其中编码第一多肽的界面的核酸已经从编码第一多肽的原始界面的核酸改变以编码凸起，或编码第二多肽的界面的核酸已经从编码第二多肽的原始界面的核酸改变以编码空腔，或两者兼有。在某些实施方案中，编码第一多肽和第二多肽的核酸稳定整合到宿主细胞的基因组中。在某些实施方案中，第一和第二宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括从宿主细胞培养物回收异二聚体或多肽，包括将包含异二聚体或多肽的液体应用于液相层析柱。在某些实施方案中，液相层析柱包含蛋白A、蛋白G、蛋白L或其组合。
在一个方面，本文提供了分离的异二聚体，其包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中凸起由IgG CH3结构域中对应于S354C和T366W(EU编号)的突变形成；并且(ii)第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中空腔由IgG CH3结构域中对应于Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)的突变形成。
在一个方面，本文提供了分离的异二聚体，其包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中凸起由IgG CH3结构域中对应于S354C和T366W(EU编号)的突变形成；并且(ii)第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中空腔由IgG CH3结构域中对应于Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)的突变形成。
附图说明
图1A-B显示了呈线性化(A)和环状形式(B)的慢病毒载体。
图2显示了使用亮氨酸拉链的pMHC工程化的实例。
图3显示了示意性孔-突起接合pMHC设计(具有和不具有亮氨酸拉链)。
图4A-C图4A显示了对CHO细胞中的eGFP表达的流式细胞术分析，该细胞通过编码具有(左)或不具有(右)亮氨酸拉链的BDC2.5mi/IAg7-孔-突起接合pMHC的慢病毒转导。图4B和图4C显示了培养物上清液的蛋白G亲和层析洗脱曲线，该上清液来自表达无亮氨酸拉链(图4B)和有亮氨酸拉链(图4C)的基于孔-突起接合的pMHC的CHO细胞。
图5显示了通过非变性(左)和变性(右)SDS-PAGE得到的基于孔-突起接合的无拉链pMHC的电泳迁移率。
图6显示了使用用常规pMHC单体(左图)或基于孔-突起接合的无拉链设计(中图和右图)制备的四聚体得到的BDC2.5-CD4+T细胞的FACS染色谱。
图7显示了与无拉链BDC2.5mi/IAg7孔-突起接合pMHC缀合的PFM纳米颗粒的非变性(左)和变性(右)SDS-PAGE凝胶图像。
图8显示了用2.5mi/IAg7-无拉链孔-突起接合纳米颗粒(左)或有拉链常规(非基于孔-突起接合)2.5mi/Ag7-纳米颗粒(右)处理的小鼠的T细胞应答。小鼠用10个剂量(每周2个剂量，持续5周)处理，然后分离脾T细胞，分选成2.5mi/IAg7四聚体阳性和阴性级分，并用抗CD3/抗CD28mAb包被的珠子刺激。针对来自四聚体阳性和阴性级分的TR1细胞相关转录物的存在，对mRNA进行分析。
图9A-B显示了分离自如图8中处理的小鼠的T细胞的细胞因子释放。小鼠用2.5mi/IAg7-无拉链孔-突起接合纳米颗粒(A)或有拉链常规(非基于孔-突起接合)2.5mi/Ag7-纳米颗粒(B)处理。
图10显示了BDC-PEG-生物素蛋白的mono-Q纯化谱。收集级分编号19至38用于生物素筛选ELISA和SDS PAGE分析。
图11显示了mono-Q纯化级分的SDS-PAGE谱。泳道用每个FPLC级分的编号标记。将20μL的每种级分加载到凝胶上。
图12显示了级分22-25(泳道5-9)的蛋白质印迹分析，其显示，与携带α链中的生物素化序列并使用BirA酶生物素化的BDC2.5mi/IAg7pMHC单体(泳道1)相比较，生物素仅存在于pMHC单体的α链中。将编号25-29的级分合并，并且用于制备pMHC四聚体。泳道11-17显示了级分30-36。
图13显示了用四聚体染色的BDC2.5-CD4+T细胞的流式细胞术谱，该四聚体使用BDC2.5mi/I-Ag7-马来酰亚胺-PEG2-生物素产生。
图14A和图14B显示了FPLC洗脱曲线。图14C和图14D显示了图14A和图14B中所示的洗脱级分的SDS-PAGE分析。
图15A-D显示了GFP标记的JURMA细胞的流式细胞术，该JURMA细胞表达对与IGRP13-25多肽复合的DR具有特异性的TCR。图15A显示了细胞系本身；图15B显示了与通过标准亮氨酸拉链二聚化技术制备的PE标记DR3IGRP13-25一起温育的细胞系；图15C显示了与使用孔-突起接合和cys-trap二聚化技术制备并且缺少亮氨酸拉链的PE标记DR3IGRP13-25一起温育的细胞系；图15D显示了与不相关的PE标记MHC II类异二聚体一起温育的细胞系。
图16A和图16B显示了对表达TCR的JURMA细胞的刺激，该TCR对与缀合至纳米颗粒的IGRP13-25多肽复合的DR具有特异性。
具体实施方式
以下描述了各种实施方案。应该注意的是，具体实施方案并非旨在作为详尽描述或作为对本文所讨论的更广泛方面的限制。结合特定实施方案描述的一个方面不一定限于该实施方案，并且可以与任何其他实施方案一起实施。
在一个方面，本文提供了分离的异二聚体，其包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。第一多肽、第二多肽或两者可包含与多肽融合的抗体CH3结构域。任选地，第一多肽、第二多肽或两者包含位于MHC(α或β链)与CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，第一多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自S354C、T366W以及S354C和T366W二者(EU编号)的至少一种突变。在某些实施方案中，第二多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合的至少一种突变。在进一步的实施方案中，分离的异二聚体包含自身免疫或炎性疾病相关的肽，该肽任选地与第一或第二多肽共价结合。任选地，自身免疫或炎性疾病相关的肽包含半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与第一或第二多肽中的半胱氨酸残基相互作用，以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，异二聚体的一个多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；以及至少一个工程化凸起。在一些实施方案中，至少一个工程化凸起不位于MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域。在一些实施方案中，工程化凸起位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类α2结构域与具有工程化凸起的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自S354C、T366W以及S354C和T366W二者(EU编号)的至少一种突变。在进一步的实施方案中，多肽包含自身免疫或炎性疾病相关的肽。任选地，自身免疫或炎性疾病相关的肽包含半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用，以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，异二聚体的一个多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；以及至少一个工程化凸起。在一些实施方案中，至少一个工程化凸起不位于MHC II类β1结构域或MHC II类β2结构域。在一些实施方案中，工程化凸起位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类β2结构域与具有工程化凸起的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自S354C、T366W以及S354C和T366W二者(EU编号)的至少一种突变。在进一步的实施方案中，多肽包含自身免疫或炎性疾病相关的肽。任选地，自身免疫或炎性疾病相关的肽包含半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用，以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，异二聚体的一个多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；以及至少一个工程化空腔。在一些实施方案中，至少一个工程化空腔不位于MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域。在一些实施方案中，工程化空腔位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类α2结构域与具有工程化空腔的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合的至少一种突变。在进一步的实施方案中，多肽包含自身免疫或炎性疾病相关的肽。任选地，自身免疫或炎性疾病相关的肽包含半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用，以产生半胱氨酸阱。
在一个方面，异二聚体的一个多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；以及至少一个工程化空腔。在一些实施方案中，至少一个工程化空腔不位于MHC II类β1结构域或MHC II类β2结构域。在一些实施方案中，工程化空腔位于与多肽融合的抗体CH3结构域。在一些实施方案中，多肽任选地包含位于MHC II类β2结构域与具有工程化空腔的CH3结构域之间的抗体CH2结构域。在某些实施方案中，多肽包含抗体CH3结构域，并且抗体CH3结构域包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合的至少一种突变。在进一步的实施方案中，多肽包含自身免疫或炎性疾病相关的肽。任选地，自身免疫或炎性疾病相关的肽包含半胱氨酸残基，该半胱氨酸残基与MHCα1或β1结构域中的半胱氨酸残基相互作用，以产生半胱氨酸阱。
如本文所用，“约”将是本领域普通技术人员所理解的，并且在某种程度上根据其所用于的上下文而变化。如果该术语的使用对于本领域普通技术人员来说是不清楚的，则考虑到其所用于的上下文，“约”将意指特定术语的至多正负10％。
术语“一个”、“一种”和“该”以及类似的指代方式在描述元素的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)的使用应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。除非本文另有说明，否则本文对数值范围的记载仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独数值的简写方法，并且每个单独数值均并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以任何适当的顺序进行。除非另有说明，否则本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“如”)的使用仅旨在更好地说明实施方案，并且不对权利要求的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释为表明任何未要求保护的元素是必要的。
如本文所用，“异二聚体”是指包含第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽与第一多肽在氨基酸序列上至少有一个氨基酸残基不同。“多聚体”是指包含两个或更多个异二聚体或包含四个或更多个本文公开的多肽的分子。
如本文所用，“个体”与“受试者”同义。个体可以被诊断患有疾病。基于表现出所述疾病的至少一种症状、具有所述疾病的家族史、具有与定义所述疾病的风险相关的基因型，或具有处于或接近使个体处于疾病风险的水平的一种或表型测量“实验室测试”，可怀疑个体患有特定疾病。个体可以是哺乳动物，如马、猫、狗、猪、牛、山羊或绵羊。在某些情况下，个体可以是人。
如本文所用，“多肽”通常是指具有多于约十个氨基酸的肽和蛋白质。
如本文所用，“第一多肽”是与第二多肽缔合的任何多肽。第一和第二多肽在“界面”(下文定义)处相遇。除界面外，第一多肽可包含一个或多个附加的结构域，如“结合域”(例如，配体结合域)或抗体恒定域(或其部分)，包括CH2、CH1和CL结构域。在一些实施方案中，第一多肽包含至少一个来源于抗体的结构域。在进一步的实施方案中，结构域方便地是恒定域，如抗体的CH3结构域。在更进一步的实施方案中，结构域形成第一多肽的界面。
如本文所用，“第二多肽”是通过“界面”与第一多肽缔合的任何多肽。除界面外，第二多肽可包含附加的结构域，如“结合域”(例如，配体结合域)，或抗体恒定域(或其部分)，包括CH2、CH1和CL结构域。在一些实施方案中，第二多肽包含至少一个来源于抗体的结构域。在进一步的实施方案中，结构域方便地是恒定区，如抗体的CH3结构域。在更进一步的实施方案中，结构域形成第二多肽的界面。
如本文所用，“结合域”包括多肽的任何区域，其负责选择性地结合感兴趣的分子(例如抗原)。
如本文所用，“结合沟”是指存在于MHC II类α1结构域与MHC II类β2结构域之间形成的MHC II类异二聚体中的分子口袋或狭缝。这是MHC II类异二聚体与抗原相互作用的部分。抗原通常是多肽抗原，但可以被脂质部分、二醇部分或糖脂部分进一步修饰。构成结合沟的残基表现出多态性，并说明了不同HLA等位基因之间抗原结合的差异。MHC II类分子的结合沟的一个重要特征是沟的末端是开放的并且允许抗原延伸至超过结合沟的任一侧或两侧。
如本文所用，“界面”包括与第二多肽的界面中的一个或多个“接触”氨基酸残基相互作用的第一多肽中的那些“接触”氨基酸残基。在一些实施方案中，界面包含免疫球蛋白的CH3结构域。在进一步的实施方案中，免疫球蛋白来源于IgG抗体。IgG抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型。在更进一步的实施方案中，免疫球蛋白来源于人IgG1抗体。
如本文所用，“凸起”是指至少一个氨基酸侧链，其从第一多肽的界面伸出，因此可定位于相邻界面的补偿空腔(即，第二多肽的界面)中，以稳定异二聚体，从而例如有利于形成异二聚体，而非同二聚体。凸起可以存在于原始界面中，或可以合成引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。“工程化凸起”是合成引入的。在一些实施方案中，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码凸起。为此，编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸被编码至少一个“输入”氨基酸残基的核酸替换，该“输入”氨基酸残基具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积。应当理解，可以存在多于一个原始和相应的输入残基。在一些实施方案中，被替换的原始残基数的上限是第一多肽的界面中的残基总数。在一些实施方案中，用于形成凸起的输入残基通常是天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基选自精氨酸(R)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一些实施方案中，输入残基选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。在一些实施方案中，输入残基是色氨酸和酪氨酸。在一些实施方案中，输入残基是色氨酸和半胱氨酸。在一些实施方案中，用于形成凸起的原始残基具有小的侧链体积，例如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一些实施方案中，丝氨酸残基被半胱氨酸替换，并且苏氨酸残基被色氨酸替换。在一些实施方案中，354位的丝氨酸被另一氨基酸残基替换，形成凸起的部分或全部。在一些实施方案中，366位的苏氨酸被另一氨基酸残基替换，形成凸起的部分或全部。在进一步的实施方案中，氨基酸替换包括S354C和T366W(EU编号)。所有编号都是根据Edelman,Gerald M.等人,PNAS 63(1)(1969):78–85。
如本文所用，“空腔”是指至少一个氨基酸侧链，其从第二多肽的界面凹下，从而容纳第一多肽的相邻界面上的相应凸起。空腔可以存在于原始界面中，或可以合成引入(例如，通过改变编码界面的核酸)。“工程化空腔”是合成引入的。在一些实施方案中，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码空腔。为此，编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸被编码至少一个“输入”氨基酸残基的DNA替换，该“输入”氨基酸残基比原始氨基酸具有更小的侧链体积。应当理解，可以存在多于一个原始和相应的输入残基。被替换的原始残基数的上限是第二多肽的界面中的残基总数。在一些实施方案中，用于形成空腔的输入残基通常是天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，输入残基选自丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，输入残基选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，输入残基选自丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，输入残基是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一些实施方案中，输入残基是丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，349位的酪氨酸被另一氨基酸残基替换，形成空腔的部分或全部。在一些实施方案中，366位的苏氨酸被另一氨基酸残基替换，形成空腔的部分或全部。在一些实施方案中，368位的亮氨酸被另一氨基酸残基替换，形成空腔的部分或全部。在一些实施方案中，407位的酪氨酸被另一氨基酸残基替换，形成空腔的部分或全部。在一些实施方案中，用于形成凸起的原始残基具有较大的侧链体积，例如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。在其他实施方案中，原始残基选自酪氨酸、苏氨酸和亮氨酸。在一些实施方案中，一个或多个酪氨酸残基被半胱氨酸或缬氨酸替换，苏氨酸残基被丝氨酸替换，而亮氨酸残基被丙氨酸替换。在进一步的实施方案中，氨基酸替换包括Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)。所有编号都是根据Edelman,Gerald M.等人,PNAS 63(1)(1969):78–85。
如本文所用，“原始”氨基酸残基是被“输入”残基替换的残基，“输入”残基的侧链体积可比原始残基更小或更大。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。“天然存在的”氨基酸残基是由遗传密码编码的那些残基。“非天然存在的”氨基酸残基是指不由遗传密码编码，但能够共价结合多肽链中的相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的实例为正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其他氨基酸残基类似物，例如在Ellman等人,Meth.Enzym.202:301-336(1991)中所描述的那些。为了产生这种非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人,Science 244:182(1989)和前述Ellman等人的程序。简言之，这涉及用非天然存在的氨基酸残基化学地活化阻抑型tRNA，然后进行RNA的体外转录和翻译。本发明的方法包括替换至少一个原始氨基酸残基，但可以替换不止一个原始残基。通常，第一或第二多肽的界面中的不超过总残基将包含被替换的原始氨基酸残基。用于替换的优选原始残基是“隐蔽的”。“隐蔽的”是指残基基本上是溶剂不可及的。在某些实施方案中，输入残基不是半胱氨酸，以防止二硫键可能的氧化或错配。
凸起在空腔中是“可定位的”，这意味着分别在第一多肽和第二多肽的界面上的凸起和空腔的空间位置以及凸起和空腔的大小使凸起可以定位在空腔中，而不会无明显干扰第一和第二多肽在界面处正常缔合。由于包含一个或多个氨基酸(诸如但不限于，Cys、Tyr、Phe和Trp)的凸起通常不从界面的轴垂直延伸并且具有优选的构象，因此凸起与相应空腔的对齐依赖于基于三维结构(如通过X射线晶体学或核磁共振(NMR)获得的)对凸起/空腔对的建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来实现。
“原始核酸”是编码感兴趣的多肽的核酸，其可以被“改变”(即遗传工程化或突变)以编码凸起或空腔。原始核酸或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包括已经受先前改变的核酸(例如人源化抗体片段)。“改变”核酸是指通过插入、删除或替换编码感兴趣的氨基酸残基的至少一个密码子，使原始核酸突变。通常，编码原始残基的密码子被编码输入残基的密码子替换。以这种方式遗传修饰DNA的技术已在Mutagenesis:a PracticalApproach,M.J.McPherson,Ed.,(IRL Press,Oxford,UK.(1991)中综述，并且例如包括定点诱变、盒式诱变和聚合酶链反应(PCR)诱变。
凸起或空腔可以通过合成方法“引入”第一或第二多肽的界面中，例如通过重组技术、体外肽合成、用于引入先前所述的非天然存在氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶促或化学偶联，或这些技术的一些组合。因此，“引入”的凸起或空腔是“非天然存在的”或“非原生的”，这意味着它不存在于自然界或原始多肽中(例如人源化单克隆抗体)。
优选地，用于形成凸起的输入氨基酸残基具有数目相对少的“旋转异构体”(例如，约3-6个)。“旋转异构体”是氨基酸侧链的一种能量上有利的构象。各种氨基酸残基的旋转异构体的数目在Ponders和Richards,J.Mol.Biol.193:775-791(1987)中综述。
如本文所用，“孔-突起接合(knob-in-hole或knob-into-hole)”是指需要在第一多肽的界面处的凸起(或“突起”)和在第二多肽的界面处的相应空腔(或“孔”)的多肽架构，使得该凸起可以定位在该空腔中以促进异二聚体形成。可以通过用较大的侧链(例如，苯丙氨酸或酪氨酸)代替第一多肽的界面处的小氨基酸侧链来构建凸起。可以通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替大氨基酸侧链，在第二多肽的界面中产生与该凸起相同或类似大小的空腔。可由本领域技术人员使用常规方法通过合成手段来制备凸起和空腔，如通过改变编码多肽的氨基酸或通过肽合成。在一些实施方案中，第一多肽的界面位于第一多肽中的Fc结构域上；且第二多肽的界面位于第二多肽的Fc结构域上。孔-突起接合异二聚体及其制备方法和用途公开在美国专利号5,731,168；5,807,706；5,821,333；7,642,228；7,695,936；8,216,805；和8,679,785中，以及Merchant等人,Nature Biotechnology,1998,16:677-681中，它们全部通过引用全文并入本文。
如本文所用，“分离的”异二聚体是指已从其天然细胞培养环境的组分中鉴定并分离和/或回收的异二聚体。其天然环境的污染组分是将会干扰异二聚体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选的实施方案中，异二聚体将被(1)纯化至如Lowry方法所测定的大于95wt％的蛋白质，并且最优选大于99wt％，(2)纯化至足以获得通过使用旋转杯测序仪测得的N-末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)纯化至在使用考马斯蓝或银染色的还原或非还原条件下通过SDS-PAGE测得的同质性。
“纳米球”、“NP”或“纳米颗粒”在本文中意指小的离散颗粒，其根据情况以单数或复数形式施用于受试者、细胞样品或组织样品。在某些实施方案中，如本文所用的术语“纳米颗粒”包括纳米颗粒核心周围的任何层。在某些实施方案中，纳米颗粒的形状基本上呈球形。在某些实施方案中，纳米颗粒不是脂质体或病毒颗粒。在进一步的实施方案中，纳米颗粒包含任何合适的材料，例如，固体、固体核心、金属、树状聚体、聚合物胶束、金属氧化物或蛋白质或其片段或组合。如本文所用的术语“基本上呈球形”意指颗粒的形状不偏离球形超过约10％。本公开内容的各种已知的抗原或肽复合物可应用于颗粒。本公开内容的纳米颗粒的大小范围为约1nm至约1μm，约1nm至约500nm，或备选地约1nm至约100nm，或备选地约1nm至约50nm，或备选地约5nm至约100nm，并且在一些方面当预期多个纳米颗粒时，是指多个纳米颗粒的平均或中值直径。较小的纳米大小的颗粒可通过例如分级分离过程获得，从而使较大颗粒沉降在水溶液中。该溶液的上部随后通过本领域技术人员已知的方法回收。该上部富含较小大小的颗粒。重复该过程直到产生所需的平均大小。术语“纳米结构”通常用来描述小于约1μm的结构。
抗原-MHC-纳米颗粒复合物(“NP-复合物”或“复合物”或pMHC-NP或“纳米颗粒复合物”)是指肽、碳水化合物、脂质或其他抗原区段、片段或抗原分子或蛋白质(即，自身肽或自身抗原)的表位呈现在表面如纳米颗粒核心上。
“纳米颗粒核心”是包含或不包含层或涂层的纳米颗粒基底。纳米颗粒复合物包含核心，至少抗原-MHC复合物偶联至核心。
当提及每个纳米颗粒的pMHC时，“密度”计算为具有或不具有外层的纳米颗粒核心的表面积，该外层还可包括连接体。表面积是所用构建体的总可用表面积。在一方面，当使用PEG连接体时，它可以使纳米颗粒核心的总直径增加约20nm2的纳米颗粒，这相应地增加该纳米颗粒的总可用表面积的表面积。换句话说，它是在没有添加pMHC、共刺激分子和/或细胞因子中的一种或多种的情况下纳米颗粒的最终表面积。
如本文所用，“抗原”是指可以在受试者中诱导免疫应答或免疫细胞(优选T或B细胞)的扩增的分子的全部、部分、片段或区段。
如本文所用，术语“疾病相关的”抗原是指被选择用来治疗所选择的疾病的抗原或其片段，并且参与疾病过程。例如，糖尿病相关抗原是一种抗原或其片段，当呈递时产生用来治疗糖尿病的免疫应答；因此，选择产生这种作用的糖尿病相关抗原来治疗糖尿病。选择多发性硬化(MS)相关抗原来治疗MS。不选择糖尿病相关抗原来治疗MS。类似地，自身免疫有关的抗原是一种与自身免疫疾病有关的抗原，且不被选择用于治疗除自身免疫以外的病症或疾病，例如癌症。本文公开了非限制性的示例性疾病相关抗原，并且另外，可根据文献中记录的技术、机制以及方法针对特定的疾病确定这样的抗原。
MHC II类异二聚体和孔-突起接合架构
MHC II类分子的表达是困难的，因为即使在肽配体存在下，所分泌的缺乏跨膜和胞质结构域的MHC II类α和β链也不会形成稳定的异二聚体。MHC II类α和β链的跨膜区促进αβ异二聚体的适当组装，据推测这是通过两个α-螺旋跨膜区段的相互作用。
目前，现有技术是使用亮氨酸拉链产生重组pMHC II类分子，以产生pMHC四聚体。对于NIH四聚体设施和pMHC四聚体的商业供应商也是如此。
然而，该方法作为构建用于产生疾病相关的pMHC II类纳米颗粒化合物的pMHC II类单体的平台，具有其自身局限性：1)jun/fos序列可能被视为“外来的”并因此在pMHC-纳米颗粒处理的个体中具有免疫原性，这可能潜在地限制治疗活性，特别是在重复给药后；2)如果未在pMHC复合物中引入亲和分离标签，则难以从真核细胞培养物(即，中国仓鼠卵巢-CHO-)上清液中层析分离pMHC复合物；以及3)由于亲和标签如FLAG或6xHIS的抗原性，亲和标签也是有问题的。由于抗原性的可能性及其在纯化不同蛋白质中的潜在广泛应用，这些标签不适合用于人类治疗。不幸的是，向这些蛋白质添加亲和标签可能会引发抗药物抗体(ADA)的产生。
在一个方面，本文提供了分离的异二聚体，其包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。
在另一个方面，本文提供了分离的异二聚体，其包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。
在另一个方面，本文提供了分离的异二聚体，其包含第一多肽和第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域和MHCII类α2结构域；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域和MHC II类β2结构域；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域和MHC II类β2结构域；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域和MHC II类α2结构域。
在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含抗体的CH3结构域并通过CH3结构域相接。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含抗体的CH2结构域并通过CH2结构域相接。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含抗体的CH2结构域和CH3结构域，并且通过CH2结构域、CH3结构域或其组合相接。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽各自包含抗体的CH2结构域和CH3结构域，并且通过CH3结构域相接。在一些实施方案中，CH3结构域来自IgG。在一些实施方案中，CH2结构域来自IgG。IgG可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在一些实施方案中，IgG是IgG1亚型。
在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，第一多肽或第二多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。
通过BirA将pMHC生物素化是一种常规用于生产适合于使用链霉亲和素进行四聚化的生物素化pMHC单体的技术。此类pMHC四聚体及其更高级衍生物(五聚体、dextramer或其他多聚体)可用作能够历数生物样品中抗原特异性T细胞的频率的试剂。在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽进一步包含生物素化位点。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽进一步包含生物素化位点。在一些实施方案中，第一多肽或第二多肽进一步包含生物素化位点。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含生物素化位点。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含生物素化位点。
在一些实施方案中，第一多肽和/或第二多肽进一步包含Strep标签。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽进一步包含Strep标签。在一些实施方案中，第一多肽或第二多肽进一步包含Strep标签。在一些实施方案中，第一多肽进一步包含Strep标签。在一些实施方案中，第二多肽进一步包含Strep标签。
在一些实施方案中，分离的异二聚体进一步包含亮氨酸拉链。在一些实施方案中，第一多肽包含C-Jun片段，而第二多肽包含C-Fos片段。在一些实施方案中，分离的异二聚体不包含亮氨酸拉链。
在一些实施方案中，分离的异二聚体缺乏可能是免疫反应性靶标的外来蛋白质序列，如BirA酶所靶向以附接生物素分子或表位/亲和/纯化标签(例如，c-Myc、FLAG、V5、多聚组氨酸、6xHIS等)的生物素化序列。通常使用异源二聚化结构域产生MHC二聚体。一些实例包括亮氨酸拉链(Fos/Jun、Acid-p1/Base-p1或GCN4二聚体)、大肠菌素E9/E9DNA酶免疫力蛋白二聚体或Kv1.2T1结构域二聚体。在一些实施方案中，分离的异二聚体缺乏除孔-突起接合架构之外的二聚化结构域。在一些实施方案中，分离的异二聚体缺乏亮氨酸拉链二聚化结构域。在一些实施方案中，分离的异二聚体缺乏c-FOS/c-JUN二聚化结构域。
在某些实施方案中，异二聚体的MHC II类α1结构域和MHC II类α2结构域以及MHCII类β1结构域和MHC II类β2结构域来源于人白细胞抗原(HLA)分子，例如HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP。在某些实施方案中，MHC II类α1结构域和MHC II类α2结构域来源于DRA、DQA1或DPA1。在某些实施方案中，MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域来源于DRA、DQA1或DPA1。在某些实施方案中，MHC II类β1结构域和MHC II类β2来源于HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1或HLA-DPB1。在某些实施方案中，MHC II类β1结构域或MHC II类β2来源于HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1或HLA-DPB1。
在一些实施方案中，两个或更多个异二聚体通过聚合物主链彼此共价附接，以形成多聚体。在一些实施方案中，聚合物主链是葡聚糖或聚乙二醇。在一些实施方案中，异二聚体内的每个多肽均附接至聚合物主链。在一些实施方案中，异二聚体内的每个多肽均通过每个多肽上的末端半胱氨酸残基附接至聚合物主链。在一些实施方案中，异二聚体内的每个多肽均通过每个多肽上的生物素化位点附接至聚合物主链。
在一些实施方案中，两个异二聚体通过亲和素彼此共价附接，以形成多聚体。
抗原
在某些实施方案中，本文所述的异二聚体进一步包含抗原。在某些实施方案中，抗原是多肽抗原，其长度至少为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个氨基酸，并且在某些实施方案中，长度不超过50、60、70、80、90或100个氨基酸。在某些实施方案中，抗原是疾病相关的抗原。在某些实施方案中，抗原是自身免疫疾病相关的抗原。在某些实施方案中，抗原是炎性疾病相关的抗原。本文所述的抗原与MHC II类α或MHC II类β多肽的N末端接合。在某些实施方案中，抗原通过柔性肽连接体接合。例如，连接体可以是多肽连接体并包含甘氨酸和丝氨酸。
在某些实施方案中，抗原是自身免疫相关的抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是I型糖尿病、多发性硬化、乳糜泻、原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎、原发性硬化性胆管炎、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、关节炎(包括类风湿性关节炎)、变应性哮喘、炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、气肿、银屑病、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、舍格伦综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关性血管炎或僵人综合征相关的抗原。在进一步的方面，疾病相关抗原是肿瘤或癌症相关抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是I型糖尿病相关抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是多发性硬化相关抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是类风湿性关节炎相关抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是克罗恩病相关抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是溃疡性结肠炎疾病相关抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是乳糜泻相关抗原。在某些实施方案中，自身免疫相关抗原是肝-胆自身免疫疾病相关的抗原。在某些实施方案中，肝-胆自身免疫相关抗原是原发性胆汁性肝硬化、自身免疫性肝炎或原发性硬化性胆管炎疾病相关的抗原。在某些实施方案中，抗原来源于胃肠道的微生物。在某些实施方案中，源自胃肠道微生物的抗原是鞭毛蛋白、Fla-2、Fla-X、未表征的大肠杆菌蛋白(YIDX)或拟杆菌整合酶。在某些实施方案中，抗原是食物抗原。在某些实施方案中，食物抗原是麦醇溶蛋白。在某些实施方案中，食物抗原是卵清蛋白。在某些实施方案中，食物抗原是源自花生的抗原。
半胱氨酸诱捕
半胱氨酸阱可用于稳定本文所述的异二聚体。半胱氨酸诱捕涉及从未结合的多肽配偶体形成共价接合的多肽复合物。在一些实施方案中，半胱氨酸诱捕包括在多肽配偶体的相互作用界面内的策略性选择的位置引入半胱氨酸，以形成稳定的多肽复合物。在一些实施方案中，半胱氨酸诱捕可稳定多肽复合物，以有利于特定构象并防止解离。半胱氨酸诱捕也称为二硫化物诱捕和二硫化物交联。在Kufareva等人,Methods Enzymol.570:389–420(2016)中综述了半胱氨酸诱捕方法和应用的实例。在MHC的情况下，半胱氨酸被工程化到已知或疑似与MHC II类二聚体的结合沟缔合的多肽中。然后半胱氨酸在结合沟中或附近工程化，使当多肽与结合沟缔合时，结合沟半胱氨酸可以接近多肽半胱氨酸并与之形成二硫键。
使用半胱氨酸阱需要将两个半胱氨酸被工程化到构成异二聚体的多肽中。第一个半胱氨酸是“结合沟半胱氨酸”，其位于MHC II类结合沟内或附近。结合沟半胱氨酸可以在结合沟的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内。半胱氨酸可以位于α链或β链中的任一个之上，并且可以位于结合沟的N-或C末端。第二个半胱氨酸是“多肽半胱氨酸”，其位于结合沟中缔合的抗原多肽内或附近。多肽半胱氨酸可以在抗原多肽的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸内。多肽半胱氨酸可位于抗原多肽的N-或C末端。通常，抗原多肽通过柔性连接体接合至α链或β链，并且半胱氨酸被置于连接体与抗原多肽之间。在一些实施方案中，多肽链的排列是抗原多肽-多肽半胱氨酸-连接体-MHC II类α1结构域，MHC II类α2结构域。在一些实施方案中，多肽链的排列是抗原多肽-多肽半胱氨酸-连接体-MHC II类β1结构域，MHC II类β2结构域。在一些实施方案中，多肽链的排列是多肽半胱氨酸-抗原多肽-连接体-MHC II类α1结构域，MHC II类α2结构域。在一些实施方案中，多肽链的排列是多肽半胱氨酸-抗原多肽-连接体-MHC II类β1结构域，MHC II类β2结构域。这些MHC II类多肽可以进一步包含在一个多肽上的具有工程化突起的CH2和CH3结构域，以及在另一个多肽上的具有工程化孔的CH2和CH3结构域。在某些情况下，抗原多肽可包含天然存在的半胱氨酸，从而无需添加半胱氨酸残基。
在一些实施方案中，本文所述的异二聚体的多肽包含一个或多个突变，以引入半胱氨酸。在一些实施方案中，突变可以在MHC II类α链中。在一些实施方案中，突变可以在MHC II类β链中。在一些实施方案中，突变可以在MHC II类α1结构域中。在一些实施方案中，突变可以在MHC II类β1结构域中。在一些实施方案中，突变可以在MHC II类α1链与MHC II类β1链之间在α链和β链之一或两者上形成的结合沟附近。在一些实施方案中，突变可以位于与结合沟缔合的多肽抗原中。在一些实施方案中，突变可以位于与结合沟缔合的抗原多肽的N末端。在一些实施方案中，突变可以位于与结合沟缔合的抗原多肽的C末端。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的N端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类α链上的结合沟的N端处的残基之间形成。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的N端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类α链上的结合沟的C末处的端残基之间形成。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的C末端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类α链上的结合沟的N端处的残基之间形成。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的C末端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类α链上的结合沟的C末端处的残基之间形成。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的N端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类β链上的结合沟的N端处的残基之间形成。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的N端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类β链上的结合沟的C末端处的残基之间形成。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的C末端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类β链上的结合沟的N端处的残基之间形成。在一些实施方案中，半胱氨酸阱可以在缔合于MHC结合沟中的抗原肽的C末端处的半胱氨酸残基与位于MHC II类β链上的结合沟的C末端处的残基之间形成。在一些实施方案中，突变可以位于结合核心多肽中。在一些实施方案中，突变包括用半胱氨酸替换氨基酸残基。在一些实施方案中，突变包括在具有其他残基的框内添加半胱氨酸残基。
包含半胱氨酸阱的多肽的非限制性实例包括，但不限于，SEQ ID NO:60和61所示的多肽。在一些实施方案中，用于半胱氨酸诱捕的多肽包含与SEQ ID NO:60和61中的任一个所示的多肽具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，半胱氨酸的突变可以位于SEQ ID NO:62和63所示多肽的任何一个或多个残基处。在一些实施方案中，用于半胱氨酸诱捕的多肽包含与SEQ ID NO:62和63中的任一个所示的多肽具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，半胱氨酸的突变可以位于SEQ ID NO:62和63所示多肽的任何一个或多个残基处。
异二聚体-纳米颗粒缀合物
在另一个方面，本文提供了异二聚体-纳米颗粒缀合物，其包含至少一个本文所述的异二聚体和纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且/或者具有固体核心。在某些实施方案中，固体核心可以是金属或金属氧化物。在某些实施方案中，固体核心可以是铁、氧化铁或金。固体核心可以是高密度核心，使得密度大于约2.0g/cm3、约3.0g/cm3、约4.0g/cm3、约5.0g/cm3、约6.0g/cm3或约7.0g/cm3。在某些实施方案中，固体核心的密度为约4.0g/cm3至约8.0g/cm3。在某些实施方案中，固体核心的密度为约5.0g/cm3至约8.0g/cm3。在某些实施方案中，固体核心的密度为约5.0g/cm3至约7.0g/cm3。在某些实施方案中，固体核心的密度为约5.0g/cm3至约6.0g/cm3。
在另一个方面，本文提供了异二聚体-纳米颗粒缀合物，其包含至少一个本文所述的异二聚体和纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且具有氧化铁核心。
在另一个方面，本文提供了异二聚体-纳米颗粒缀合物，其包含至少一个本文所述的异二聚体和纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且具有金核心。
在另一个方面，本文提供了异二聚体-纳米颗粒缀合物，其包含至少一个本文所述的异二聚体和纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且具有氧化铁核心；并且该至少一个异二聚体通过连接体共价连接至纳米颗粒。
在另一个方面，本文提供了异二聚体-纳米颗粒缀合物，其包含至少一个本文所述的异二聚体和纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且具有氧化铁核心；并且该至少一个异二聚体通过包含聚乙二醇的连接体共价连接至纳米颗粒。在一些实施方案中，异二聚体-纳米颗粒缀合物包含至少一个本文所述的异二聚体和纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且具有氧化铁核心；并且该至少一个异二聚体通过包含分子量小于500道尔顿的聚乙二醇的连接体共价连接至纳米颗粒。在一些实施方案中，聚乙二醇的分子量小于1kD、2kD、3kD、4kD、5kD、6kD、7kD、8kD、9kD或10kD。在一些实施方案中，聚乙二醇用马来酰亚胺官能化。在一些实施方案中，聚乙二醇的分子量为约1kD至约5kD、约2kD至约5kD、约3kD至约5kD。在一些实施方案中，聚乙二醇用马来酰亚胺官能化。在某些实施方案中，与固体核心接触的连接体的端部嵌入固体核心中。
在一些方面，纳米颗粒核心的直径选自约1nm至约100nm；约1nm到约75nm；约1nm到约50nm；约1nm到约25nm；约1nm到约25nm；约5nm到约100nm；约5nm到约50nm；约5nm到约25nm、约15nm到约25nm或约5nm到约20nm。在一些实施方案中，纳米颗粒核心的直径为约25nm至约60nm、约25nm至约50nm、约20nm至约40nm、约15nm至约50nm、约15nm至约40nm、约15nm至约35nm、约15nm至约30nm或约15nm至约25nm，或者为约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约35nm或约40nm。
在一些方面，每个纳米颗粒核心的pMHC数目(在本文中称为纳米颗粒复合物的“化合价”)可以在约1个pMHC复合物比1个纳米颗粒核心至约6000个pMHC复合物比1个纳米颗粒核心，或约10:1至约6000:1，或约11:1至约6000:1，或约12:1至约6000:1之间的范围内，或为至少2:1，或至少8:1，或至少9:1，或至少10:1，或至少11:1，或至少12:1。在一些实施方案中，每个纳米颗粒核心的pMHC数目为约10:1至约6000:1、约20:1至约5500:1，或约10:1至约5000:1，或约10:1至约4000:1，或约10:1至约3500:1，或约10:1至约3000:1，或约10:1至约2500:1，或约10:1至约2000:1，或约10:1至约1500:1，或约10:1至1000:1，或约10:1至约500:1，或约10:1至约100:1，或约20:1至约50:1，或约25:1至约60:1；或约30:1至约50:1，或约35:1至约45:1，或约40:1。在一些实施方案中，每个纳米颗粒核心的pMHC数目为约10:1至约100:1、约10:1至约110:1、约10:1至约120:1、约10:1至约130:1、约10:1至约140:1、约10:1至约150:1或约10:1至约160:1。在一些实施方案中，每个纳米颗粒核心的pMHC数目为约30:1至约100:1、约30:1至约110:1、约30:1至约120:1、约30:1至约130:1、约30:1至约140:1、约30:1至约150:1或约30:1至约160:1。在一些实施方案中，每个纳米颗粒核心的pMHC数目为约32:1至约100:1、约32:1至约110:1、约32:1至约120:1、约30:1至约130:1、约32:1至约140:1、约32:1至约150:1或约32:1至约160:1。
在一些方面，纳米颗粒核心具有限定的化合价/核心表面积，在本文中也称为“密度”。在这些方面，每个纳米颗粒的pMHC密度为约0.025pMHC/100nm2至约100pMHC/100nm2纳米颗粒核心表面积，或约0.406pMHC/100nm2至约50pMHC/100nm2，或约0.05pMHC/100nm2至约25pMHC/100nm2。在某些方面，每个纳米颗粒的pMHC密度为约0.4pMHC/100nm2至约25pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约20pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约15pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约14pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约13pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约12pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约11.6pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约11.5pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约11pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约10pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约9pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约8pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm 2至约7pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约6pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约5pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约4pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约3pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约2.5pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约2pMHC/100nm2或约0.4pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2。
在另一个方面，纳米颗粒的pMHC密度可为约0.22pMHC/100nm2至约10pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约9pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约8pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约7pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约6pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约5pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约4pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约3pMHC/100nm2、约0.22pMHC/100nm2至约2pMHC/100nm2或约0.22pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2。在一些方面，纳米颗粒的pMHC密度为约0.22pMHC/100nm2至约10pMHC/100nm2、0.24pMHC/100nm2至约9pMHC/100nm2、约0.26pMHC/100nm2至约8pMHC/100nm2、约0.28pMHC/100nm2至约7pMHC/100nm2、约0.24pMHC/100nm2至约4pMHC/100nm2、约0.5pMHC/100nm2至约3pMHC/100nm2或约0.6pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2。在进一步的方面，纳米颗粒的pMHC密度为约0.4pMHC/100nm2至约1.3pMHC/100nm2，或约0.5pMHC/100nm2至约0.9pMHC/100nm2，或约0.6pMHC/100nm2至约0.8pMHC/100nm2。
在一些实施方案中，纳米颗粒的pMHC密度可为约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9或12.0pMHC/100nm2。在具体的实施方案中，纳米颗粒的pMHC密度可为约0.4pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2、0.4pMHC/100nm2至约2.5pMHC/100nm2、约0.4pMHC/100nm2至约6pMHC/100nm2或约0.4pMHC/100nm2至约12pMHC/100nm2。
在另一个方面，纳米颗粒具有约0.4pMHC/100nm2至约1.3pMHC/100nm2，或约0.5pMHC/100nm2至约0.9pMHC/100nm2，或约0.6pMHC/100nm2至约0.8pMHC/100nm2的如本文所定义的pMHC密度，并且此外其中纳米颗粒核心的直径为约25nm至约60nm、约25nm至约50nm、约20nm至约40nm、约15nm至约50nm、约15nm至约40nm、约15nm至约35nm、约15nm至约30nm、约15nm至约25nm，或者为约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约35nm，或约40nm，或约50nm。
共刺激分子组分
在某些方面，NP另外包含至少一个共刺激分子，或者备选地基本上由至少一个共刺激分子组成，或进一步由至少一个共刺激分子组成。共刺激分子是在体内产生次级信号的分子，该次级信号用于将幼稚T细胞激活成能够对具有所述特异性抗原的细胞产生免疫应答的抗原特异性T细胞。本公开内容不限于任何特定的共刺激分子。各种共刺激分子是本领域公知的。共刺激分子的一些非限制性实例是4-IBBL、OX40L、CD40、IL-15/IL-15Ra、CD28、CD80、CD86、CD30L和ICOSL。只有一种特定的共刺激分子可以与一个纳米颗粒偶联，或者多种共刺激分子可以与相同的纳米颗粒偶联。在某些实施方案中，该共刺激分子是蛋白质，如能够使T细胞上的共刺激受体激动的抗体。在这种情况下，该抗体能够诱导共刺激信号，该信号是激活幼稚T细胞和以抗原特异性方式诱导免疫应答所必需的。此外或备选地，如本文所用的术语“共刺激分子”也可指能够通过对天然共刺激信号分子的激动作用产生共刺激信号的试剂，例如产生SD28共刺激反应的抗-CD28或CD28配体。
在具体的实施方案中，本公开内容的共刺激分子可以是以下分子中的任何一种或多种：B7-1/CD80、BTLA、B7-2/CD86、CD28、B7-H1/PD-L1、CTLA-4、B7-H2、Gi24/VISTA/B7-H5、B7-H3、ICOS、B7-H4、PD-1、B7-H6、PD-L2/B7-DC、B7-H7、PDCD6、LILRA3/CD85e、LILRB2/CD85d/ILT4、LILRA4/CD85g/ILT7、LILRB3/CD85a/ILT5、LILRB1/CD85j/ILT2、LILRB4/CD85k/ILT3、4-1BB/TNFRSF9/CD137、GITR配体/TNFSF18、4-1BB配体/TNFSF9、HVEM/TNFRSF14、BAFF/BLyS/TNFSF13B、LIGHT/TNFSF14、BAFF R/TNFRSF13C、淋巴毒素-α/TNF-β、CD27/TNFRSF7、OX40/TNFRSF4、CD27配体/TNFSF7、OX40配体/TNFSF4、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD30配体/TNFSF8、TACI/TNFRSF13B、CD40/TNFRSF5、TL1A/TNFSF15、CD40配体/TNFSF5、TNF-α、DR3/TNFRSF25、TNF RII/TNFRSF1B、GITR/TNFRSF18、2B4/CD244/SLAMF4、CD84/SLAMF5、BLAME/SLAMF8、CD229/SLAMF3、CD2、CRACC/SLAMF7、CD2F-10/SLAMF9、NTB-A/SLAMF6、CD48/SLAMF2、SLAM/CD150、CD58/LFA-3、CD7、DPPIV/CD26、CD96、EphB6、CD160、整联蛋白α4β1、CD200、整联蛋白α4β7/LPAM-1、CD300a/LMIR1、LAG-3、CRTAM、TIM-1/KIM-1/HAVCR、DAP12、TIM-4、Dectin-1/CLEC7A、TSLP R、ICOSL和/或其生物等同物。
共刺激分子可以以与pMHC复合物相同的方式与纳米颗粒偶联。在本公开内容的一个实施方案中，共刺激分子和抗原/MHC复合物单独地附接至纳米颗粒。在本公开内容的另一个实施方案中，共刺激分子和pMHC复合物首先复合在一起，随后与纳米颗粒复合。多个共刺激分子可与纳米颗粒偶联；这些分子可以是多个相同的共刺激分子或多个不同的共刺激分子。通常，将多肽复合物添加至纳米颗粒以产生具有吸附或偶联的多肽复合物的纳米颗粒，其具有约1至6000个分子/纳米颗粒的共刺激分子数:纳米颗粒数的比例，或备选地至少约或至多约0.1:1、0.5:1、1:1、10:1、100:1、500:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1或更多，以及其中的范围，通常为约0.1:1至约50:1。在另一个方面，共刺激分子与pMHC复合物的比例可以为约0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1、50:1或更多，优选获得1:1、1:2、1:9、1:10、1:100、2:1、9:1、10:1或100:1的共刺激分子:pMHC复合物比例。类似地，可根据与pMHC复合物相同的相关公式计算共刺激分子相对于纳米颗粒表面积的密度。在某些实施方案中，每单位纳米颗粒表面积的共刺激分子的密度为约0.0022个共刺激分子/100nm2至约13.26个共刺激分子/100nm2。在一些实施方案中，共刺激分子的密度范围可与pMHC复合物的密度范围相同或不同。
在其中所述纳米颗粒包含一个或多个共刺激分子且不包含pMHC复合物的一些实施方案中，该纳米颗粒具有约0.2个共刺激分子/100nm2至约6.5个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约6个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约5.8个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约5.75个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约5.5个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约5个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约4.5个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约4个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约3.5个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约3个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约2.5个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约2个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约1.5个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约1.25个共刺激分子/100nm2、约0.2个共刺激分子/100nm2至约1个共刺激分子/100nm2或约0.2个共刺激分子/100nm2至约0.75个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。
在另一个方面，该纳米颗粒可具有约0.11个共刺激分子/100nm2至约5个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约4.5个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约4个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约3.5个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约3个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约2.5个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约2个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约1.5个共刺激分子/100nm2、约0.11个共刺激分子/100nm2至约1pMHC/100nm2或约0.11个共刺激分子/100nm2至约0.75个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。在一些方面，该纳米颗粒核心具有约0.11个共刺激分子/100nm2至约5个共刺激分子/100nm2、0.12个共刺激分子/100nm2至约4.5个共刺激分子/100nm2、约0.13个共刺激分子/100nm2至约4个共刺激分子/100nm2、约0.14个共刺激分子/100nm2至约3.5个共刺激分子/100nm2、约0.12个共刺激分子/100nm2至约2个共刺激分子/100nm2、约0.25个共刺激分子/100nm2至约1.5个共刺激分子/100nm2或约0.3个共刺激分子/100nm2至约0.75个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。在进一步的方面，该纳米颗粒核心具有约0.2个共刺激分子/100nm2至约0.65个共刺激分子/100nm2、备选地约0.25个共刺激分子/100nm2至约0.45个共刺激分子/100nm2，或备选地约0.3个共刺激分子/100nm2至约0.4个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。
在其中所述纳米颗粒包含pMHC复合物和一个或多个共刺激分子的一些实施方案中，该纳米颗粒具有约0.4个共刺激分子/100nm2至约13个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约12个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约11.6个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约11.5个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约11个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约10个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约9个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约8个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约7个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约6个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约5个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约4个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约3个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约2.5个共刺激分子/100nm2、约0.4个共刺激分子/100nm2至约2个共刺激分子/100nm2或约0.4个共刺激分子/100nm2至约1.5个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。
在另一个方面，该纳米颗粒可具有约0.22个共刺激分子/100nm2至约10个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约9个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约8个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约7个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约6个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约5个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约4个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约3个共刺激分子/100nm2、约0.22个共刺激分子/100nm2至约2个共刺激分子/100nm2或约0.22个共刺激分子/100nm2至约1.5个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。在一些方面，该纳米颗粒核心具有约0.22个共刺激分子/100nm2至约10个共刺激分子/100nm2、0.24个共刺激分子/100nm2至约9个共刺激分子/100nm2、约0.26个共刺激分子/100nm2至约8个共刺激分子/100nm2、约0.28个共刺激分子/100nm2至约7个共刺激分子/100nm2、约0.24个共刺激分子/100nm2至约4个共刺激分子/100nm2、约0.5个共刺激分子/100nm2至约3个共刺激分子/100nm2或约0.6个共刺激分子/100nm2至约1.5个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。在进一步的方面，该纳米颗粒具有约0.4个共刺激分子/100nm2至约1.3个共刺激分子/100nm2、备选地约0.5个共刺激分子/100nm2至约0.9个共刺激分子/100nm2，或备选地约0.6个共刺激分子/100nm2至约0.8个共刺激分子/100nm2的共刺激分子密度。
在一个方面，纳米颗粒包含共刺激分子，并且不包含任何肽-MHC组分。在某些实施方案中，将该共刺激分子纳米颗粒复合物与纳米颗粒肽-MHC-复合物混合，以形成包含两种不同纳米颗粒群体的组合物，一种群体仅包含共刺激分子，另一种群体仅包含肽MHC。这两个群体可以以任何合适的比例混合，包括包含共刺激分子的纳米颗粒与包含肽MHC的纳米颗粒的比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8或1:9；或包含肽-MHC的纳米颗粒与包含共刺激分子的纳米颗粒的比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9。细胞因子
在某些方面，所述NP进一步包含至少一个细胞因子分子，或者备选地基本上由至少一个细胞因子分子组成，或进一步由至少一个细胞因子分子组成。如本文所用，术语“细胞因子”包括由免疫系统中的各种细胞分泌的低分子量蛋白质，所述蛋白质用作用于在分子和细胞水平上调节体内广泛范围的生物过程的信号分子。“细胞因子”包括属于淋巴因子、白细胞介素或趋化因子类别的单独的免疫调节蛋白质。
本文公开了以下非限制性实例：例如，IL-1A和IL-1B是人白细胞介素-1(IL-1)家族的两个不同成员。成熟的IL-1A是一种18kDa的蛋白质，又称成纤维细胞激活因子(FAF)、淋巴细胞激活因子(LAF)、B细胞激活因子(BAF)、白细胞内源性介质(LEM)等。IL-4是诱导T辅助细胞-2(Th2)细胞分化的细胞因子，并且与IL-13密切相关且具有与IL-13相似的功能。IL-5由Th2细胞和肥大细胞产生。IL-5用来刺激B细胞生长并增加免疫球蛋白分泌。IL-5还参与嗜酸性粒细胞激活。IL-6是可用作促炎性或抗炎性细胞因子的白细胞介素。它由T细胞和巨噬细胞分泌，以刺激对创伤或导致炎症的其他组织损伤的免疫应答。IL-6也由肌肉响应于肌肉收缩而产生。IL-8是由巨噬细胞和其他细胞类型如上皮细胞和内皮细胞产生的趋化因子，并且用作先天性免疫系统应答中免疫反应的重要介质。IL-12参与幼稚T细胞向T辅助(Th1或Th2)细胞的分化。作为异二聚体细胞因子，IL-12在由两个单独的基因IL-12A(p35)和IL-12B(p40)编码的两个亚基在蛋白质合成后二聚化之后形成。IL-12p70表示该异二聚体组合物。IL-13是由许多细胞类型、特别是Th2细胞分泌的细胞因子，是变应性炎症和疾病的重要介质。IL-17是由T辅助细胞产生的细胞因子并且由IL-23诱导，导致迟发型反应中的破坏性组织损伤。IL-17充当促炎性细胞因子，它响应于细胞外病原体对免疫系统的侵袭并诱导病原体细胞基质的破坏。IP-10或干扰素γ诱导蛋白10也被称为C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)或小诱导型细胞因子B10。作为属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，IP-10由几种细胞类型(包括单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞)响应于IFN-γ而分泌。巨噬细胞炎性蛋白质(MIP)属于趋化因子的家族。有两种主要形式的人MIP：MIP-1α和MIP-1β，也分别被称为趋化因子(C-C基序)配体3(CCL3)和CCL4。两者均由巨噬细胞在用细菌内毒素刺激之后产生。粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)也被称为集落刺激因子3(CSF 3)，是一种集落刺激因子激素。G-CSF是由许多不同组织产生的糖蛋白、生长因子和细胞因子，以刺激骨髓产生粒细胞和干细胞。G-CSF还刺激嗜中性粒细胞前体和成熟嗜中性粒细胞的存活、增殖、分化和功能。表皮生长因子或EGF是一种生长因子，它通过以高亲和力与其受体EGFR结合，在调节细胞生长、增殖和分化中发挥重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是生长因子家族，它是参与血管发生(胚胎循环系统的从头形成)和血管生成(来自预先存在的脉管系统的血管生长)的重要信号蛋白质。
一个或多个细胞因子可以以与pMHC复合物相同的方式与纳米颗粒偶联。在本公开内容的一个实施方案中，一个或多个细胞因子和pMHC复合物分别附接至纳米颗粒。在本公开内容的另一个实施方案中，一个或多个细胞因子分子和pMHC复合物首先复合在一起，随后与纳米颗粒复合。多个细胞因子可与纳米颗粒偶联；这些细胞因子可以是多个相同的细胞因子或不同的细胞因子。
在一些实施方案中，细胞因子与抗细胞因子抗体复合形成细胞因子/抗细胞因子抗体复合物，该复合物随后与纳米颗粒复合。在一些实施方案中，细胞因子/抗细胞因子抗体复合物包括但不限于IL-2/抗-IL-2复合物。IL-2/抗-IL-2复合物可具有激动性质或拮抗性质。.
在一些实施方案中，细胞因子与抗细胞因子受体复合形成细胞因子/细胞因子受体复合物，该复合物随后与纳米颗粒复合。在一些实施方案中，细胞因子/细胞因子受体复合物包括但不限于IL15/IL-15Ra和/或IL-1/IL-2Ra。在一些实施方案中，IL15/IL-15Ra复合物可充当T细胞共刺激物。
通常，将多肽复合物添加至纳米颗粒以产生具有吸附或偶联的多肽复合物的纳米颗粒，其具有约1至5999个分子/纳米颗粒的细胞因子数：纳米颗粒数的比例，或备选地至少约或至多约0.1:1、0.5:1、1:1、10:1、100:1、500:1、1000:1、2000:1、3000:1、4000:1、5000:1、6000:1或更多，以及其中的范围，例如约0.1:1至约50:1。在另一个方面，细胞因子与抗原/MHC复合物的比例可以为约0.1:1、0.5:1、1:1、2:1、5:1、10:1、50:1或更多，优选获得1:1、1:2、1:9、1:10、1:100、2:1、9:1、10:1或100:1的细胞因子：抗原/MHC复合物比例。类似地，可根据与抗原/MHC复合物相同的相关公式计算细胞因子相对于纳米颗粒表面积的密度。在某些实施方案中，每单位纳米颗粒表面积的细胞因子的密度为约0.0022个细胞因子/100nm2至约13.26个细胞因子/100nm2。在一些实施方案中，细胞因子的密度范围可与抗原/MHC复合物的密度范围相同或不同。
在一个方面，纳米颗粒包含细胞因子分子，并且不包含任何肽-MHC组分。在某些实施方案中，将该细胞因子分子纳米颗粒复合物与纳米颗粒肽-MHC复合物混合，以形成包含两种不同纳米颗粒群体的组合物，一个群体仅包含细胞因子分子，另一个群体仅包含肽-MHC。这两个群体可以以任何合适的比例混合，包括包含细胞因子分子的的纳米颗粒与包含肽MHC的纳米颗粒的比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9；或包含肽-MHC的纳米颗粒与包含细胞因子分子的纳米颗粒的比例为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9。NP合成
纳米颗粒可以通过以下步骤形成：接触含有共刺激分子、pMHC复合物和/或细胞因子和聚合物的水相，以及非水相，随后蒸发该非水相，以引起颗粒从该水相中的聚结，如美国专利号4,589,330或4,818,542中所教导的。用于这类制备的某些聚合物为天然的或合成的共聚物或聚合物，其包括明胶琼脂、淀粉、阿拉伯半乳聚糖、白蛋白、胶原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)、聚(ε-己内酯-共-乙醇酸)、聚(β-羟基丁酸)、聚(氧化乙烯)、聚乙烯、聚(烷基-2-氰基丙烯酸酯)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)、聚酰胺、聚(氨基酸)、聚(2-羟乙基DL-天冬酰胺)、聚(酯脲)、聚(L-苯丙氨酸/乙二醇/1,6-二异氰酸己烷)和聚(甲基丙烯酸甲酯)。特别地，某些聚合物为聚酯，如聚乙醇酸、聚乳酸、乙交酯-L(-)丙交酯聚(ε-己内酯)、聚(ε-己内酯-共-乳酸)和聚(ε-己内酯-共-乙醇酸)。可用于溶解聚合物的溶剂包括：水、六氟异丙醇、二氯甲烷、四氢呋喃、己烷、苯或六氟丙酮倍半水合物。
如(Perrault,S.D.等人,(2009)Nano Lett 9:1909-1915)所述，用柠檬酸钠化学还原氯化金来合成金纳米颗粒(GNP)。简言之，在剧烈搅拌下将2mL 1％的HAuCl4(SigmaAldrich)添加至100mL H2O中，并将该溶液在油浴中加热。将6mL(对于14nm GNP)或2mL(对于40nm GNP)1％的柠檬酸钠添加至沸腾的HAuCl4溶液中，将其再搅拌10分钟，然后冷却至室温。通过添加1μMol的用-COOH或-NH2基团官能化的巯基-PEG连接体(Nanocs,MA)作为MHC的受体来稳定GNP。聚乙二醇化的GNP用水洗涤以除去游离的巯基-PEG，浓缩，并储存在水中以供进一步分析。NP密度通过分光光度法测定并且根据比尔定律计算。
SFP系列氧化铁NP(SFP IONP)也可以如下产生：在表面活性剂的存在下在有机溶剂中进行乙酸铁的热分解，然后通过聚乙二醇化在水性缓冲液中提供溶剂(Xie,J.等人(2007)Adv Mater 19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.78:1003-1014；Xu,C.等人(2007)Polymer International 56:821-826)。简言之，将2mMol Fe(acac)3(SigmaAldrich,Oakville,ON)溶解于10mL二苄醚和油酰胺的混合物中，并且加热至100℃保持1小时，随后在氮气层保护下回流加热至300℃保持2小时。通过添加乙醇使合成的NP沉淀并且重悬于己烷中。对于IONP的聚乙二醇化，将100mg不同的3.5kDa DPA-PEG连接体(JenKemTech USA)溶解于CHCl3和HCON(CH3)2(二甲基甲酰胺(DMF))的混合物中。然后将该NP溶液(20mg Fe)添加至DPA-PEG溶液中，并且在室温下搅拌4小时。通过添加己烷使聚乙二醇化的SFP NP沉淀过夜，然后重悬于水中。通过高速离心(20,000xg，30分钟)去除痕量的聚集体，并且将单分散SFP NP储存于水中以供进一步表征和pMHC结合。IONP产物中铁的浓度通过在2N HCL中在A410下的分光光度法测定。基于SFP NP(Fe3O4；直径8+1nm)的分子结构和直径(Xie,J.等人(2007)Adv Mater 19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.78:1003-1014)，申请人估计含有1mg铁的SFP溶液含有5x1014个NP。
纳米颗粒也可以通过热分解或加热纳米颗粒前体来制备。在一个实施方案中，该纳米颗粒为金属或金属氧化物纳米颗粒。在一个实施方案中，该纳米颗粒为氧化铁纳米颗粒。在一个实施方案中，该纳米颗粒为金纳米颗粒。在一个实施方案中，本文提供了根据本技术制备的纳米颗粒。在一个实施方案中，本文提供了制备包含乙酰丙酮酸铁的热分解反应的氧化铁纳米颗粒的方法。在一个实施方案中，所获得的氧化铁纳米颗粒为水溶性的。在一方面，该氧化铁纳米颗粒适用于蛋白质缀合。在一个实施方案中，所述方法包括单步热分解反应。
在一方面，所述热分解在官能化PEG分子的存在下发生。
在一方面，所述热分解包括加热乙酰丙酮酸铁。在一个实施方案中，所述热分解包括在官能化PEG分子的存在下加热乙酰丙酮酸铁。在一个实施方案中，所述热分解包括在二苄醚和官能化PEG分子的存在下加热乙酰丙酮酸铁。
不受理论束缚，在一个实施方案中，使用官能化PEG分子作为还原剂和表面活性剂。本文提供的制备纳米颗粒的方法简化了并且改进了常规方法，其使用难以被PEG分子置换的或不能完全置换的表面活性剂，以使颗粒成为水溶性的。常规地，表面活性剂可以是昂贵的(例如磷脂)或有毒的(例如油酸或油酰胺)。另一个方面，不受理论束缚，所述制备纳米颗粒的方法避免了使用常规表面活性剂的需要，由此获得高度的分子纯度和水溶性。
在一个实施方案中，所述热分解涉及乙酰丙酮酸铁和二苄醚，并且不存在除本文使用的那些之外的常规表面活性剂。
在一个实施方案中，热分解温度为约80℃至约300℃，或约80℃至约200℃，或约80℃至约150℃，或约100℃至约250℃，或约100℃至约200℃，或约150℃至约250℃，或约150℃至约250℃。在一个实施方案中，热分解在约1小时至约2小时的时间发生。
在一个实施方案中，所述制备氧化铁纳米颗粒的方法包括纯化步骤，如通过使用Miltenyi Biotec LS磁体柱。
在一个实施方案中，所述纳米颗粒在约4℃下在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中稳定，没有任何可检测的降解或聚集。在一个实施方案中，所述纳米颗粒稳定至少6个月。
在一方面，本文提供了制备纳米颗粒复合物的方法，其包括使pMHC与本文提供的氧化铁纳米颗粒接触。不受理论束缚，pMHC在其羧基末端编码半胱氨酸，该半胱氨酸可以在约pH 6.2至约pH 6.5下与官能化PEG中的马来酰亚胺基团反应约12至约14小时。
在一方面，所述制备纳米颗粒复合物的方法包括纯化步骤，如通过使用MiltenyiBiotec LS磁体柱。
疾病相关抗原
pMHC-NP的pMHC复合物基于待治疗的疾病选择使用。例如，糖尿病相关抗原是这样的抗原或其片段，其在该自身免疫疾病中靶向的细胞、组织或器官中表达，并且在由自身免疫应答引起的细胞、组织或器官损伤时暴露于免疫系统，即使该抗原不是疾病过程的触发物或其发病机制中的关键参与者，并且当呈递时，该抗原产生用于治疗糖尿病的免疫应答；因此，选择符合该定义的糖尿病相关抗原来治疗糖尿病。选择MS相关抗原来治疗MS。不会选择糖尿病相关抗原来治疗MS。癌症相关或肿瘤相关抗原可治疗癌症和/或肿瘤。本文公开了非限制性的示例性疾病相关抗原，且另外，可基于文献中充分记载的技术、机制和方法针对特定疾病确定这样的抗原。
在某些方面，包含在抗原-MHC复合物中的疾病相关抗原选自自身免疫疾病相关抗原、炎症相关抗原或变应性疾病相关抗原。在进一步的方面，免疫炎症相关抗原是选自以下的一种或多种：哮喘相关抗原、糖尿病相关抗原、前驱糖尿病相关抗原、多发性硬化相关抗原、变应性哮喘相关抗原、原发性胆汁性肝硬化相关抗原、硬化相关抗原、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克病，NMO)相关抗原、自身免疫性脑炎相关抗原、自身抗体介导的神经系统综合征相关抗原、僵人综合征相关抗原、副肿瘤病相关抗原、中枢和周围神经系统其他疾病相关抗原、寻常型天疱疮相关抗原、炎性肠病(IBD)相关抗原、克罗恩病相关抗原、溃疡性结肠炎相关抗原、关节炎相关抗原、类风湿性关节炎相关抗原、系统性红斑狼疮(SLE)相关抗原、乳糜泻相关抗原、银屑病相关抗原、斑秃相关抗原、获得性血小板减少性紫癜相关抗原、自身免疫性心肌病相关抗原、特发性扩张型心肌病(IDCM)相关抗原、重症肌无力相关抗原、葡萄膜炎相关抗原、强直性脊柱炎相关抗原、格雷夫斯病相关抗原、桥本甲状腺炎相关抗原、免疫介导性肌病相关抗原、抗磷脂综合征(ANCA+)相关抗原、动脉粥样硬化相关抗原、硬皮病相关抗原、自身免疫性肝炎相关抗原、皮肌炎相关抗原、慢性阻塞性肺疾病相关抗原、脊髓损伤相关抗原、创伤性损伤相关抗原、烟草诱发的肺破坏相关抗原、慢性阻塞性肺疾病(COPD)相关抗原、肺气肿相关抗原、硬化性胆管炎相关抗原、周围神经病变相关抗原、发作性睡病相关抗原、古德帕斯丘综合征相关抗原、川畸病相关抗原、自身免疫性葡萄膜炎相关抗原、结肠炎相关抗原、气肿相关抗原、天疱疮相关抗原、落叶型天疱疮相关抗原、关节炎相关抗原、舍格伦综合征相关抗原、ANCA相关性血管炎相关抗原、原发性硬化性胆管炎相关抗原、脂肪组织炎症/II型糖尿病相关抗原或肥胖症相关的脂肪组织炎症/胰岛素抗性相关抗原。
在某些方面，疾病相关抗原来源于以下的一种或多种：PPI、IGRP、GAD、外周蛋白、aGlia、PDC-E2、胰岛素、DG1EC2、DG3、AQP4、PLP、MOG、MBP、CII、DERP1、DERP2、OVA、BacInt、CBir、Fla-X、Fla-2、YIDX、AChR、甲状腺过氧化物酶、甲状腺受体、磷脂抗原、H4、H2B、H1、DNA、ApoB、ApoE、NMDAR、电压门控钾通道、弹性蛋白、抑制蛋白、PERM_HUMAN髓过氧化物酶、PRTN3_HUMAN成髓细胞素、CP2D6_HUMAN细胞色素P450 2D6、SPCS_HUMAN O-磷酸丝氨酰-tRNA(Sec)硒转移酶、CAMP_HUMAN Cathelicidin抗菌肽、DNA拓扑异构酶I、CENP-C、APOH_HUMANβ-2-糖蛋白1、RO60_HUMAN 60kDa SS-A/Ro核糖核蛋白、LA_HUMAN狼疮La蛋白、IRBP、肌球蛋白、CD1d-结合脂质抗原、Cap18、CP2D6、SPCS、RO60、RO52、LA、APOH、MPO、PRTN3或HSP。
在一些实施方案中，疾病相关抗原为：
a)糖尿病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：前胰岛素原(PPI)、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)、胰岛素、胰岛素原，或其各自的片段或等同物；
b)多发性硬化相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：髓鞘碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、周围髓磷脂蛋白22、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶，或其各自的片段或等同物；
c)乳糜泻相关抗原，并且来源于麦醇溶蛋白或其片段或等同物；
d)原发性胆汁性硬化相关抗原，并且来源于PDC-E2或其片段或等同物；
e)落叶型天疱疮相关抗原和/或寻常型天疱疮相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：DG1、DG3，或其各自的片段或等同物；
f)视神经脊髓炎谱系障碍相关抗原，并且来源于AQP4或其片段或等同物；
g)关节炎相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：热休克蛋白、免疫球蛋白结合蛋白、异源核RNP、膜联蛋白V、钙蛋白酶抑制蛋白、II型胶原蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶、延伸因子人软骨gp39、甘露糖结合凝集素、瓜氨酸化波形蛋白、II型胶原蛋白、纤维蛋白原、α烯醇酶、抗氨基甲酰化蛋白质(抗CarP)、4型肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD4)、BRAF、纤维蛋白原γ链、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H1、α-1-抗胰蛋白酶、血浆蛋白酶C1抑制剂、凝溶胶蛋白、α1-B糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、补体因子H、α2巨球蛋白、血清淀粉样蛋白、C反应蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原β链、血清转铁蛋白、α2HS糖蛋白、波形蛋白、补体C3，或其各自的片段或等同物；
h)变应性哮喘相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：DERP1、DERP2，或其各自的片段或等同物；
i)炎性肠病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：Flagelin、Fla-2、Fla-X、YIDX、拟杆菌整合酶，或其各自的片段或等同物；
j)系统性红斑狼疮相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：双链(ds)DNA、核糖核蛋白(RNP)、Smith(Sm)、舍格伦综合征相关抗原A(SS-A)/Ro、舍格伦综合征相关抗原B(SS-B)/La、RO60、RO52、组蛋白，或其各自的片段或等同物；
k)动脉粥样硬化相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：ApoB、ApoE或其各自的片段或等同物；
l)COPD相关抗原和/或气肿相关抗原，并且来源于弹性蛋白或其片段或等同物；
m)银屑病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：Cap18、ADMTSL5、ATL5，或其各自的片段或等同物；
n)自身免疫性肝炎相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：CYP2D6、SLA，或其各自的片段或等同物；
o)葡萄膜炎相关抗原，并且来源于抑制蛋白或其片段或等同物；
p)舍格伦综合征相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：(SS-A)/Ro、(SS-B)/La、MR3、RO60、RO52，或其各自的片段或等同物；
q)硬皮病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：CENP-C、TOP 1、RNA聚合酶III，或其各自的片段或等同物；
r)抗磷脂综合征相关抗原，并且来源于APOH或其片段或等同物；
s)ANCA相关性血管炎相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：MPO、PRTN3，或其各自的片段或等同物；或
t)僵人综合征相关抗原，并且来源于GAD或其片段或等同物。糖尿病相关抗原
糖尿病相关抗原包括但不限于来源于PPI、IGRP、GAD、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)和/或胰岛素的那些抗原。自身反应性糖尿病相关抗原肽包括但不限于以下表1中所列出的那些肽，以及通过引用整体并入于此的美国公开号2005/0202032中公开的肽和蛋白质，及其各自的等同物和/或组合，
MS相关抗原
本公开内容的抗原包括与多发性硬化有关的抗原。这样的抗原包括例如美国专利申请公开号2012/0077686中公开的那些抗原，以及来源于髓鞘碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、周围髓磷脂蛋白22或2’3’-环核苷酸3’-磷酸二酯酶的抗原。在某些实施方案中，抗原来源于髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
在更进一步的方面，用于治疗MS和MS相关病症的肽抗原包括但不限于表2中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合：
乳糜泻(CD)相关抗原
与乳糜泻相关的抗原包括但不限于来源于麦醇溶蛋白的那些抗原。在一些实施方案中，麦醇溶蛋白的非限制性类型包括α/β麦醇溶蛋白、γ-麦醇溶蛋白或ω-麦醇溶蛋白。其他非限制性的示例性乳糜泻相关抗原包括表3中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
原发性胆汁性肝硬化(PBC)相关抗原
与原发性胆汁性肝硬化相关的抗原包括但不限于来源于PDC-E2的那些抗原。示例性抗原的非限制性实例包括表4中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
落叶型天疱疮(PF)和寻常型天疱疮(PV)相关的抗原
与PF和PV相关的抗原包括但不限于来源于桥粒芯糖蛋白3(DG3)和/或桥粒芯糖蛋白1(DG1)的那些抗原。非限制性实例包括表5中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
视神经脊髓炎谱系障碍(NMO)相关抗原
与NMO相关的抗原包括但不限于来源于AQP4或水通道蛋白4的那些抗原。非限制性实例包括表6中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
关节炎相关抗原
与关节炎相关的抗原包括但不限于来源于热休克蛋白、免疫球蛋白结合蛋白、异源核RNP、膜联蛋白V、钙蛋白酶抑制蛋白、II型胶原蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶、延伸因子人软骨gp39、甘露糖结合凝集素、瓜氨酸化波形蛋白、II型胶原蛋白、纤维蛋白原、α烯醇酶、抗氨基甲酰化蛋白质(抗CarP)、4型肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD4)、BRAF、纤维蛋白原γ链、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H1、α-1-抗胰蛋白酶、血浆蛋白酶C1抑制剂、凝溶胶蛋白、α1-B糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、补体因子H、α2巨球蛋白、血清淀粉样蛋白、C反应蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原β链、血清转铁蛋白、α2HS糖蛋白、波形蛋白、补体C3或其各自的片段或等同物的那些抗原。
变应性哮喘相关抗原
与变应性哮喘相关的抗原包括但不限于来源于DERP1和DERP2的那些抗原。非限制性实例包括表7中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
炎症性肠病相关抗原
与炎性肠病相关的抗原包括但不限于克罗恩病相关抗原和溃疡性结肠炎相关抗原。在一些实施方案中，炎性肠病相关抗原包括但不限于来源于拟杆菌整合酶、flagelin、鞭毛蛋白2(Fla-2/Fla-X)或未表征的大肠杆菌蛋白质(YIDX)的那些抗原。非限制性实例包括表8中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
系统性红斑狼疮(SLE)相关抗原
与SLE相关的抗原包括但不限于来源于H4、H2B、H1’、dsDNA、RNP、Smith(Sm)、舍格伦综合征相关抗原A(SS-A)/Ro、舍格伦综合征相关抗原B(SS-B)/La和/或组蛋白的那些抗原。在一些实施方案中，SS-A包括但不限于RO60和RO52。在一些实施方案中，组蛋白包括但不限于H4、H2B、H1′。非限制性实例包括表9中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
动脉粥样硬化相关抗原
与动脉粥样硬化相关的抗原包括但不限于来源于载脂蛋白B(ApoB)或载脂蛋白E(ApoE)的那些抗原。非限制性实例包括表10中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)和/或气肿相关抗原
与COPD和/或气肿相关的抗原包括但不限于来源于弹性蛋白的那些抗原。非限制性实例包括表11中列出的那些抗原及其各自的等同物和/或组合。
银屑病相关抗原
与银屑病相关的抗原包括但不限于以下表12中列出的那些抗原，以及其等同物和/或组合。其他非限制性的示例性银屑病相关抗原可来源于人adamis样蛋白5(ATL5)、cathelicidin抗菌肽(CAP18)和/或ADAMTS样蛋白5(ADMTSL5)。
自身免疫性肝炎相关抗原
自身免疫性肝炎相关抗原包括但不限于以下表13中公开的那些抗原以及其等同物和/或组合。其他非限制性的示例性自身免疫性肝炎相关抗原可来源于微粒体细胞色素P450IID6(CYP2D6)和/或可溶性肝抗原(SLA)。
葡萄膜炎相关抗原
葡萄膜炎相关抗原包括但不限于以下表14中公开的那些抗原以及其等同物和/或组合。其他非限制性的示例性葡萄膜炎相关抗原可来源于抑制蛋白、人视网膜S抗原和/或光感受器间类维生素A结合蛋白(IRBP)。
舍格伦综合征相关抗原
舍格伦综合征相关抗原包括但不限于以下表15中公开的那些抗原以及其等同物和/或组合。其他非限制性的示例性舍格伦综合征相关抗原可来源于(SS-A)/Ro、(SS-B)/La、RO60、RO52和/或毒蕈碱受体3(MR3)。
硬皮病相关抗原
硬皮病相关抗原包括但不限于以下表16中公开的那些抗原以及其等同物和/或组合。非限制性的示例性硬皮病相关抗原可来源于着丝粒自身抗原着丝粒蛋白C(CENP-C)、DNA拓扑异构酶I(TOP1)和/或RNA聚合酶III。
抗磷脂综合征相关抗原
抗磷脂综合征相关抗原包括但不限于以下表17中公开的那些抗原以及其等同物和/或组合。非限制性的示例性抗磷脂综合征相关抗原可来源于β-2-糖蛋白1(BG2P1或APOH)。
ANCA相关性血管炎相关抗原
ANCA相关性血管炎相关抗原包括但不限于以下表18中公开的那些抗原以及其等同物和/或组合。非限制性的示例性ANCA相关性血管炎相关抗原可来源于髓过氧化物酶(MPO)、蛋白酶(PRTN3)或细菌通透性增高因子(BPI)。
僵人综合征相关抗原
僵人综合征相关抗原包括但不限于以下表14中公开的那些抗原以及其等同物和/或组合。非限制性的示例性僵人综合征相关抗原可来源于谷氨酸脱羧酶(GAD)。在一些实施方案中，GAD包括但不限于GAD65。
预期在本公开内容的组合物中，每ml组合物中存在约0.001mg至约10mg的总蛋白质。因此，组合物中蛋白质的浓度可以为约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100μg/ml或mg/ml或更多(或其中可得到的任何范围)。其中，约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99或100％可以是肽/MHC/纳米颗粒复合物。
本公开内容预期施用肽/MHC/纳米颗粒复合物来实现针对与自身免疫应答或癌症相关的疾病或病况的发展的诊断、治疗或预防性疗法。
另外，通过引用并入本文的美国专利号4,554,101(Hopp)教导了以亲水性为基础从一级氨基酸序列中鉴定和制备表位。通过Hopp中公开的方法，本领域技术人员能够从氨基酸序列中鉴定可能的表位，并确定它们的免疫原性。许多科学出版物也致力于从氨基酸序列分析中预测二级结构，并鉴定表位(Chou&Fasman,1974a,b；1978a,b；1979)。如果需要，可以使用这些技术中的任意技术来补充Hopp在美国专利号4,554,101中的教导。
其他抗原组分
可以使用除肽之外的分子作为抗原或抗原片段与MHC分子复合。此类分子包括但不限于碳水化合物、脂质、小分子等。碳水化合物是多种细胞外表面的主要组分。某些碳水化合物是不同分化阶段的特征，并且这些碳水化合物经常被特异性抗体所识别。不同碳水化合物的表达可局限在特定的细胞类型中。针对子宫内膜和血清抗原的自身抗体应答已显示为子宫内膜易位症的常见特征。已描述了子宫内膜易位症中针对数种之前所鉴定抗原(包括2-HS糖蛋白(2-Heremans Schmidt glycoprotein)和碳酸酐酶)的血清自身抗体应答，它们对碳水化合物表位是特异性的。
非限制性的示例性抗原-MHC复合物
在某些实施方案中，可以优化抗原与MHC的特定组合以治疗特定疾病。非限制性实例包括但不限于以下实例：
对于I型糖尿病的治疗，pMHC复合物的抗原可以来源于下组中的抗原：PPI76-90(K88S)、IGRP13-25、GAD555-567、GAD555-567(557I)、IGRP23-35、B24-C36、PPI76-90或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC包含下组的全部或部分多肽：HLA-DRB1*0401/DRA、HLA-DRB1*0301/DRA或其各自的片段或等同物。
在一些实施方案中，pMHC复合物的抗原包括：
a)糖尿病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：前胰岛素原(PPI)、胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶(IGRP)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)、胰岛素、胰岛素原，或其各自的片段或等同物；
b)多发性硬化相关抗原，并且来源于选自下组中的一个或多个的抗原：髓鞘碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、周围髓磷脂蛋白22、2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶，或其各自的片段或等同物；
c)乳糜泻相关抗原，并且来源于麦醇溶蛋白或其片段或等同物；
d)原发性胆汁性硬化相关抗原，并且来源于PDC-E2或其片段或等同物；
e)落叶型天疱疮相关抗原和/或寻常型天疱疮相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：DG1、DG3，或其各自的片段或等同物；
f)视神经脊髓炎谱系障碍相关抗原，并且来源于AQP4或其片段或等同物；
g)关节炎相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：热休克蛋白、免疫球蛋白结合蛋白、异源核RNP、膜联蛋白V、钙蛋白酶抑制蛋白、II型胶原蛋白、葡萄糖-6-磷酸异构酶、延伸因子人软骨gp39、甘露糖结合凝集素、瓜氨酸化波形蛋白、II型胶原蛋白、纤维蛋白原、α-烯醇酶、抗氨基甲酰化蛋白质(抗CarP)、4型肽基精氨酸脱亚胺酶(PAD4)、BRAF、纤维蛋白原γ链、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H1、α-1-抗胰蛋白酶、血浆蛋白酶C1抑制剂、凝溶胶蛋白、α1-B糖蛋白、血浆铜蓝蛋白、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H4、补体因子H、α2巨球蛋白、血清淀粉样蛋白、C-反应蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原β链、血清转铁蛋白、α2HS糖蛋白、波形蛋白、补体C3，或其各自的片段或等同物；
h)变应性哮喘相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：DERP1、DERP2，或其各自的片段或等同物；
i)炎性肠病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：Flagelin、Fla-2、Fla-X、YIDX、拟杆菌整合酶，或其各自的片段或等同物；
j)系统性红斑狼疮相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：双链(ds)DNA、核糖核蛋白(RNP)、Smith(Sm)、舍格伦综合征相关抗原A(SS-A)/Ro、舍格伦综合征相关抗原B(SS-B)/La、RO60、RO52、组蛋白，或其各自的片段或等同物；
k)动脉粥样硬化相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：ApoB、ApoE，或其各自的片段或等同物；
l)COPD相关抗原和/或气肿相关抗原，并且来源于弹性蛋白或其片段或等同物；
m)银屑病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：Cap18、ADMTSL5、ATL5，或其各自的片段或等同物；
n)自身免疫性肝炎相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：CYP2D6、SLA，或其各自的片段或等同物；
o)葡萄膜炎相关抗原，并且来源于抑制蛋白或其片段或等同物；
p)舍格伦综合征相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：(SS-A)/Ro、(SS-B)/La、MR3、RO60、RO52，或其各自的片段或等同物；
q)硬皮病相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：CENP-C、TOP 1、RNA聚合酶III，或其各自的片段或等同物；
r)抗磷脂综合征相关抗原，并且来源于APOH或其片段或等同物；
s)ANCA相关性血管炎相关抗原，并且来源于选自下组中一个或多个的抗原：MPO、PRTN3，或其各自的片段或等同物；或者
t)僵人综合征相关抗原，并且来源于GAD或其片段或等同物。
在一些实施方案中，pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分的经典MHC I类蛋白质、非经典MHC I类蛋白质、经典MHC II类蛋白质、非经典MHC II类蛋白质、MHC二聚体(Fc融合体)、MHC四聚体或MHC蛋白质的聚合形式，其中该MHC蛋白质任选地包含基于孔-突起接合的MHC-α-Fc/MHC-β-Fc异二聚体或多聚体。
在一些实施方案中，pMHC复合物的MHC蛋白质包含下组的多肽的全部或部分：HLADR、HLA DQ、HLA DP、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、CD1d或其各自的片段或等同物。
在一些实施方案中，pMHC复合物的MHC蛋白质包含下组的多肽的全部或部分：HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP，或其各自的片段或等同物。
在一些实施方案中，pMHC复合物的MHC蛋白质包含下组的多肽的全部或部分：LA-DRB1/DRA、HLA-DRB3/DRA、HLA-DRB4/DRA、HLA-DRB5/DRA、HLA-DQA1/HLA-DQB1、HLA-DPB1/HLA-DPA1或其各自的片段或等同物。
在某些方面，pMHC复合物包含：
a)糖尿病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：hInsB10-18、hIGRP228-236、hIGRP265-273、IGRP206-214、hIGRP206-214、NRP-A7、NRP-I4、NRP-V7、YAI/Db、INSB15-23、PPI76-90(K88S)、IGRP13-25、GAD555-567、GAD555-567(557I)、IGRP23-35、B24-C36、PPI76-90、INS-I9、TUM、G6Pase、胰岛素原L2-10、胰岛素原L3-11、胰岛素原L6-14、胰岛素原B5-14、胰岛素原B10-18、胰岛素原B14-22、胰岛素原B15-24、胰岛素原B17-25、胰岛素原B18-27、胰岛素原B20-27、胰岛素原B21-29、胰岛素原B25-C1、胰岛素原B27-C5、胰岛素原C20-28、胰岛素原C25-33、胰岛素原C29-A5、胰岛素原A1-10、胰岛素原A2-10、胰岛素原A12-20，或其各自的片段或等同物；
b)多发性硬化相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：MOG35-55、MOG36-55、MAG287-295、MAG509-517、MAG556-564、MBP110-118、MOG114-122、MOG166-175、MOG172-180、MOG179-188、MOG188-196、MOG181-189、MOG205-214、PLP80-88、MAG287-295、MAG509-517、MAG556-564、MOG97-109MOG97-109(E107S)、MBP89-101、PLP175-192、PLP94-108、MBP86-98、PLP54-68、PLP249-263、MOG156-170、MOG201-215、MOG38-52、MOG203-217、PLP250-264、MPB13-32、MPB83-99、MPB111-129、MPB146-170、MOG223-237、MOG6-20、PLP88-102、PLP139-154，或其各自的片段或等同物；
c)乳糜泻相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：aGlia57-68、aGlia62-72、aGlia217-229，或其各自的片段或等同物；
d)原发性胆汁性肝硬化相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：PDC-E2122-135、PDC-E2249-262、PDC-E2249-263、PDC-E2629-643、PDC-E272-86、PDC-E2353-367、PDC-E2422-436、PDC-E2629-643、PDC-E280-94、PDC-E2353-367、PDC-E2535-549，或其各自的片段或等同物；
e)落叶型天疱疮相关抗原和/或寻常型天疱疮相关抗原，其各自来源于选自下组中一个或多个的抗原：DG1216-229、DG397-111、DG3251-265、DG3441-455、DG3351-365、DG3453-467、DG3540-554、DG3280-294、DG3326-340、DG3367-381、DG313-27、DG3323-337、DG3438-452、DG148-62、DG1206-222、DG1363-377、DG13-17、DG1192-206、DG1326-340、DG11-15、DG135-49、DG1325-339，或其各自的片段或等同物；
f)视神经脊髓炎谱系障碍相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：AQP4129-143、AQP4284-298、AQP463-76、AQP4129-143、AQP439-53，或其各自的片段或等同物；
g)变应性哮喘相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：DERP116-30、DERP1171-185、DERP1110-124、DERP-226-40、DERP-2107-121，或其各自的片段或等同物；
h)炎性肠病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：拟杆菌整合酶抗原183-197、拟杆菌整合酶抗原146-160、拟杆菌整合酶抗原175-189、拟杆菌整合酶抗原1-15、拟杆菌整合酶抗原183-197、拟杆菌整合酶抗原30-44、拟杆菌整合酶抗原70-84、拟杆菌整合酶抗原337-351、拟杆菌整合酶抗原171-185、拟杆菌整合酶抗原4-18、拟杆菌整合酶抗原256-270、Fla-2/Fla-X366-380、Fla-2/Fla-X164-178、Fla-2/Fla-X261-275、Fla-2/Fla-X1-15、Fla-2/Fla-X51-65、Fla-2/Fla-X269-283、Fla-2/Fla-X4-18、Fla-2/Fla-X271-285、YIDX78-92、YIDX93-107、YIDX98-112、YIDX23-37、YIDX78-92、YIDX195-209、YIDX22-36、YIDX80-94、YIDX101-115，或其各自的片段或等同物；
i)系统性红斑狼疮相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：H471-94、H474-88、H476-90、H475-89、H478-92、H480-94、H2B10-24、H2B16-30、H1′22-42、H1′27-41，或其各自的片段或等同物；
j)动脉粥样硬化相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：ApoB3501-3516、ApoB1952-1966、ApoB978-993、ApoB3498-3513、ApoB210A、ApoB210B、ApoB210C，或其各自的片段或等同物；
k)COPD相关抗原和/或气肿相关抗原，其各自来源于选自下组中一个或多个的抗原：弹性蛋白89-103、弹性蛋白698-712、弹性蛋白8-22、弹性蛋白94-108、弹性蛋白13-27、弹性蛋白695-709、弹性蛋白563-577、弹性蛋白558-572、弹性蛋白698-712、弹性蛋白566-580、弹性蛋白645-659，或其各自的片段或等同物；
l)银屑病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：Cap1864-78、Cap1834-48、Cap1847-61、Cap18151-165、Cap18149-163、Cap18152-166、Cap18131-145、Cap1824-38、ADMTSL5245-259、ADMTSL5267-281、ADMTSL5372-386、ADMTSL5289-303、ADMTSL5396-410、ADMTSL5433-447、ADMTSL5142-156、ADMTSL5236-250、ADMTSL5301-315、ADMTSL5203-217、ADMTSL5404-418，或其各自的片段或等同物；
m)自身免疫性肝炎相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：(CYP2D6)193-207、CYP2D676-90、CYP2D6293-307、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315、CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D6131-145、CYP2D6216-230、CYP2D6238-252、CYP2D6199-213、CYP2D6235-252、CYP2D6293-307、CYP2D6381-395、CYP2D6429-443、SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197、SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431、SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125、SLA110-124、SLA299-313、SLA342-356、SLA49-63、SLA119-133、SLA260-274、SLA26-40、SLA86-100、SLA331-345，或其各自的片段或等同物；
n)葡萄膜炎相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：抑制蛋白199-213、抑制蛋白77-91、抑制蛋白250-264、抑制蛋白172-186、抑制蛋白354-368、抑制蛋白239-253、抑制蛋白102-116、抑制蛋白59-73、抑制蛋白280-294、抑制蛋白291-306、抑制蛋白195-209、抑制蛋白200-214，或其各自的片段或等同物；
o)舍格伦综合征相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：RO60127-141、RO60523-537、RO60243-257、RO60484-498、RO60347-361、RO60369-383、RO60426-440、RO60267-281、RO60178-192、RO60358-372、RO60221-235、RO60318-332、RO60407-421、RO60459-473、RO6051-65、RO60312-326、LA241-255、LA101-115、LA153-167、LA178-192、LA19-33、LA37-51、LA133-147、LA50-64、LA32-46、LA153-167、LA83-97、LA136-150、LA297-311、LA59-73、LA151-165、LA86-100、LA154-168，或其各自的片段或等同物；
p)硬皮病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：TOP1346-360、TOP1420-434、TOP1750-764、TOP1419-433、TOP1591-605、TOP1695-709、TOP1305-319、TOP1346-360、TOP1419-433、TOP1425-439、TOP1614-628、CENP-C297-311、CENP-C857-871、CENP-C887-901、CENP-C212-226、CENP-C643-657、CENP-C832-846、CENP-C167-181、CENP-C246-260、CENP-C846-860、CENP-C149-163、CENP-C833-847、CENP-C847-861，或其各自的片段或等同物；
q)抗磷脂综合征相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：APOH235-249、APOH306-320、APOH237-251、APOH295-309、APOH28-42、APOH173-187、APOH264-278、APOH295-309、APOH49-63、APOH269-283、APOH295-309、APOH321-355、APOH322-336、APOH324-338，或其各自的片段或等同物；
r)ANCA相关性血管炎相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：MPO506-520、MPO302-316、MPO7-21、MPO689-703、MPO248-262、MPO444-458、MPO513-527、MPO97-111、MPO616-630、MPO462-476、MPO617-631、MPO714-728、PRTN344-58、PRTN3234-248、PRTN359-73、PRTN3117-131、PRTN3164-178、PRTN371-85、PRTN3241-255、PRTN359-73、PRTN3183-197、PRTN362-76、PRTN3118-132、PRTN3239-253，或其各自的片段或等同物；或者
s)僵人综合征相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：GAD212-226、GAD555-569、GAD297-311，或其各自的片段或等同物。
在某些方面，pMHC复合物包含：
a)糖尿病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：hInsB10-18、hIGRP228-236、hIGRP265-273、IGRP206-214、hIGRP206-214、NRP-A7、NRP-I4、NRP-V7、YAI/Db、INSB15-23、PPI76-90(K88S)、IGRP13-25、GAD555-567、GAD555-567(557I)、IGRP23-35、B24-C36、PPI76-90、INS-I9、TUM、G6Pase、胰岛素原L2-10、胰岛素原L3-11、胰岛素原L6-14、胰岛素原B5-14、胰岛素原B10-18、胰岛素原B14-22、胰岛素原B15-24、胰岛素原B17-25、胰岛素原B18-27、胰岛素原B20-27、胰岛素原B21-29、胰岛素原B25-C1、胰岛素原B27-C5、胰岛素原C20-28、胰岛素原C25-33、胰岛素原C29-A5、胰岛素原A1-10、胰岛素原A2-10、胰岛素原A12-20或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
b)多发性硬化相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：MOG35-55、MOG36-55、MAG287-295、MAG509-517、MAG556-564、MBP110-118、MOG114-122、MOG166-175、MOG172-180、MOG179-188、MOG188-196、MOG181-189、MOG205-214、PLP80-88、MAG287-295、MAG509-517、MAG556-564、MOG97-109MOG97-109(E107S)、MBP89-101、PLP175-192、PLP94-108、MBP86-98、PLP54-68、PLP249-263、MOG156-170、MOG201-215、MOG38-52、MOG203-217、PLP250-264、MPB13-32、MPB83-99、MPB111-129、MPB146-170、MOG223-237、MOG6-20、PLP88-102、PLP139-154或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
c)乳糜泻相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：aGlia57-68、aGlia62-72、aGlia217-229或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DQ或其片段或等同物；
d)原发性胆汁性肝硬化相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：PDC-E2122-135、PDC-E2249-262、PDC-E2249-263、PDC-E2629-643、PDC-E272-86、PDC-E2353-367、PDC-E2422-436、PDC-E2629-643、PDC-E280-94、PDC-E2353-367、PDC-E2535-549或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
e)落叶型天疱疮相关抗原和/或寻常型天疱疮相关抗原，其各自来源于选自下组中一个或多个的抗原：DG1216-229、DG397-111、DG3251-265、DG3441-455、DG3351-365、DG3453-467、DG3540-554、DG3280-294、DG3326-340、DG3367-381、DG313-27、DG3323-337、DG3438-452、DG148-62、DG1206-222、DG1363-377、DG13-17、DG1192-206、DG1326-340、DG11-15、DG135-49、DG1325-339或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
f)视神经脊髓炎谱系障碍相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：AQP4129-143、AQP4284-298、AQP463-76、AQP4129-143、AQP439-53或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DQ或其片段或等同物；
g)变应性哮喘相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：DERP116-30、DERP1171-185、DERP1110-124、DERP-226-40、DERP-2107-121或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含下组的全部或部分多肽：HLA-DR、HLA-DP或其各自的片段或等同物；
h)炎性肠病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：拟杆菌整合酶抗原183-197、拟杆菌整合酶抗原146-160、拟杆菌整合酶抗原175-189、拟杆菌整合酶抗原1-15、拟杆菌整合酶抗原183-197、拟杆菌整合酶抗原30-44、拟杆菌整合酶抗原70-84、拟杆菌整合酶抗原337-351、拟杆菌整合酶抗原171-185、拟杆菌整合酶抗原4-18、拟杆菌整合酶抗原256-270、Fla-2/Fla-X366-380、Fla-2/Fla-X164-178、Fla-2/Fla-X261-275、Fla-2/Fla-X1-15、Fla-2/Fla-X51-65、Fla-2/Fla-X269-283、Fla-2/Fla-X4-18、Fla-2/Fla-X271-285、YIDX78-92、YIDX93-107、YIDX98-112、YIDX23-37、YIDX78-92、YIDX195-209、YIDX22-36、YIDX80-94、YIDX101-115或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DQ或其片段或等同物；
i)系统性红斑狼疮相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：H471-94、H474-88、H476-90、H475-89、H478-92、H480-94、H2B10-24、H2B16-30、H1′22-42、H1′27-41或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含下组的全部或部分多肽：I-Ad、HLA-DR或其各自的片段或等同物；
j)动脉粥样硬化相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：ApoB3501-3516、ApoB1952-1966、ApoB978-993、ApoB3498-3513、ApoB210A、ApoB210B、ApoB210C或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分I-Ab或其片段或等同物；
k)COPD相关抗原和/或气肿相关抗原，其各自来源于选自下组中一个或多个的抗原：弹性蛋白89-103、弹性蛋白698-712、弹性蛋白8-22、弹性蛋白94-108、弹性蛋白13-27、弹性蛋白695-709、弹性蛋白563-577、弹性蛋白558-572、弹性蛋白698-712、弹性蛋白566-580、弹性蛋白645-659或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
l)银屑病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：Cap1864-78、Cap1834-48、Cap1847-61、Cap18151-165、Cap18149-163、Cap18152-166、Cap18131-145、Cap1824-38、ADMTSL5245-259、ADMTSL5267-281、ADMTSL5372-386、ADMTSL5289-303、ADMTSL5396-410、ADMTSL5433-447、ADMTSL5142-156、ADMTSL5236-250、ADMTSL5301-315、ADMTSL5203-217、ADMTSL5404-418或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
m)自身免疫性肝炎相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：CYP2D6193-207、CYP2D676-90、CYP2D6293-307、CYP2D6313-332、CYP2D6393-412、CYP2D6199-213、CYP2D6450-464、CYP2D6301-315、CYP2D6452-466、CYP2D659-73、CYP2D6130-144、CYP2D6193-212、CYP2D6305-324、CYP2D6131-145、CYP2D6216-230、CYP2D6238-252、CYP2D6199-213、CYP2D6235-252、CYP2D6293-307、CYP2D6381-395、CYP2D6429-443、SLA334-348、SLA196-210、SLA115-129、SLA373-386、SLA186-197、SLA317-331、SLA171-185、SLA417-431、SLA359-373、SLA215-229、SLA111-125、SLA110-124、SLA299-313、SLA342-356、SLA49-63、SLA119-133、SLA260-274、SLA26-40、SLA86-100、SLA331-345或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
n)葡萄膜炎相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：抑制蛋白199-213、抑制蛋白77-91、抑制蛋白250-264、抑制蛋白172-186、抑制蛋白354-368、抑制蛋白239-253、抑制蛋白102-116、抑制蛋白59-73、抑制蛋白280-294、抑制蛋白291-306、抑制蛋白195-209、抑制蛋白200-214或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
o)舍格伦综合征相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：RO60127-141、RO60523-537、RO60243-257、RO60484-498、RO60347-361、RO60369-383、RO60426-440、RO60267-281、RO60178-192、RO60358-372、RO60221-235、RO60318-332、RO60407-421、RO60459-473、RO6051-65、RO60312-326、LA241-255、LA101-115、LA153-167、LA178-192、LA19-33、LA37-51、LA133-147、LA50-64、LA32-46、LA153-167、LA83-97、LA136-150、LA297-311、LA59-73、LA151-165、LA86-100、LA154-168或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含下组的全部或部分多肽：HLA-DR、HLA-DP或其各自的片段或等同物；
p)硬皮病相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：TOP1346-360、TOP1420-434、TOP1750-764、TOP1419-433、TOP1591-605、TOP1695-709、TOP1305-319、TOP1346-360、TOP1419-433、TOP1425-439、TOP1614-628、CENP-C297-311、CENP-C857-871、CENP-C887-901、CENP-C212-226、CENP-C643-657、CENP-C832-846、CENP-C167-181、CENP-C246-260、CENP-C846-860、CENP-C149-163、CENP-C833-847、CENP-C847-861或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
q)抗磷脂综合征相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：APOH235-249、APOH306-320、APOH237-251、APOH295-309、APOH28-42、APOH173-187、APOH264-278、APOH295-309、APOH49-63、APOH269-283、APOH295-309、APOH321-355、APOH322-336、APOH324-338或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；
r)ANCA相关性血管炎相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：MPO506-520、MPO302-316、MPO7-21、MPO689-703、MPO248-262、MPO444-458、MPO513-527、MPO97-111、MPO616-630、MPO462-476、MPO617-631、MPO714-728、PRTN344-58、PRTN3234-248、PRTN359-73、PRTN3117-131、PRTN3164-178、PRTN371-85、PRTN3241-255、PRTN359-73、PRTN3183-197、PRTN362-76、PRTN3118-132、PRTN3239-253或其各自的片段或等同物，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含全部或部分HLA-DR或其片段或等同物；或者
s)僵人综合征相关抗原，其来源于选自下组中一个或多个的抗原：GAD212-226、GAD555-569、GAD297-311，并且pMHC复合物的MHC蛋白质包含下组的全部或部分多肽：HLA-DR、HLA-DQ或其各自的片段或等同物。
在某些方面，pMHC复合物用于治疗：
a)I型糖尿病，并且pMHC复合物选自：PPI76-90(K88S)-HLA-DRB1*0401/DRA至IGRP13-25-HLA-DRB1*0301/DRA、GAD555-567-HLA-DRB1*0401/DRA、GAD555-567(557I)-HLA-DRB1*0401/DRA、IGRP23-35-HLA-DRB1*0401/DRA、B24-C36-HLA-DRB1*0301/DRA或PPI76-90-HLA-DRB1*0401/DRA；
b)多发性硬化，并且pMHC复合物选自：MBP86-98-HLA-DRB1*1501/DRA、MBP89-101-HLA-DRB5*0101/DRA、MOG38-52-HLA-DRB4*0101/DRA、MOG97-109(E107S)-HLA-DRB1*0401/DRA、MOG203-217-HLA-DRB3*0101/DRA、PLP54-68-HLA-DRB3*0101/DRA、PLP94-108-HLA-DRB1*0301/DRA、PLP250-264-HLA-DRB4*0101/DRA、MPB13-32-HLA-DRB5*0101/DRA、MPB83-99-HLA-DRB5*0101/DRA、MPB111-129-HLA-DRB5*0101/DRA、MPB146-170-HLA-DRB5*0101/DRA、MOG223-237-HLA-DRB3*0202/DRA、MOG6-20-HLA-DRB5*0101/DRA、PLP88-102-HLA-DRB3*0202/DRA或PLP139-154-HLA-DRB5*0101/DRA；
c)乳糜泻，并且pMHC复合物选自：aGlia57-68-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、aGlia62-72-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、aGlia217-229-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0302或aGlia217-229-HLA-DQA1*03/HLA-DQB1*0302；
d)原发性胆汁性肝硬化，并且pMHC复合物选自：PDC-E2122-135-HLA-DRB4*0101/DRA、PDC-E2249-262-HLA-DRB4*0101/DRA、PDC-E2249-263-HLA-DRB1*0801/DRA、PDC-E2629-643-HLA-DRB1*0801/DRA、PDC-E272-86-HLA-DRB3*0202/DRA、PDC-E2353-367-HLA-DRB3*0202/DRA、PDC-E2422-436-HLA-DRB3*0202/DRA、PDC-E2629-643-HLA-DRB4*0101/DRA、PDC-E280-94-HLA-DRB5*0101/DRA、PDC-E2353-367-HLA-DRB5*0101/DRA或PDC-E2535-549-HLA-DRB5*0101/DRA、mPDC-E2166-181-I-Ag7或mPDC-E282-96-I-Ag7；
e)落叶型天疱疮和/或寻常型天疱疮，并且pMHC复合物选自：DG1216-229-HLA-DRB1*0101/DRA、DG1216-229-HLA-DRB1*0102/DRA、DG397-111-HLA-DRB1*0402/DRA、DG3251-265-HLA-DRB1*0402/DRA、DG3251-265-HLA-DRB1*0401/DRA、DG3441-455-HLA-DRB1*0402/DRA、DG3351-365-HLA-DRB3*0202/DRA、DG3453-467-HLA-DRB3*0202/DRA、DG3540-554-HLA-DRB3*0202/DRA、DG3280-294-HLA-DRB4*0101/DRA、DG3326-340-HLA-DRB4*0101/DRA、DG3367-381-HLA-DRB4*0101/DRA、DG313-27-HLA-DRB5*0101/DRA、DG3323-337-HLA-DRB5*0101/DRA、DG3438-452-HLA-DRB5*0101/DRA、DG148-62-HLA-DRB3*0202/DRA、DG1206-222-HLA-DRB3*0202/DRA、DG1363-377-HLA-DRB3*0202/DRA、DG13-17-HLA-DRB4*0101/DRA、DG1192-206-HLA-DRB4*0101/DRA、DG1326-340-HLA-DRB4*0101/DRA、DG11-15-HLA-DRB5*0101/DRA、DG135-49-HLA-DRB5*0101/DRA或DG1325-339-HLA-DRB5*0101/DRA；
f)视神经脊髓炎谱系障碍，并且pMHC复合物选自：AQP4129-143-HLA-DRB1*0101/DRA、AQP4284-298-HLA-DRB1*0301/DRA、AQP463-76-HLA-DRB1*0301/DRA、AQP4129-143-HLA-DRB1*0401/DRA或AQP439-53-HLA-DRB1*1501/DRA；
g)变应性哮喘，并且pMHC复合物选自：DERP-116-30-HLA-DRB1*0101/DRA、DERP-116-30-HLA-DRB1*1501/DRA、DERP1171-185-HLA-DRB1*1501/DRA、DERP-1110-124-HLA-DPB1*0401/DRA、DERP-226-40-HLA-DRB1*0101/DRA；DERP-226-40-HLA-DRB1*1501/DRA或DERP-2107-121-HLA-DRB1*0301/DRA；
h)炎性肠病，并且pMHC复合物选自：拟杆菌整合酶抗原183-197-HLA-DRB3*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原146-160-HLA-DRB3*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原175-189-HLA-DRB3*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原1-15-HLA-DRB5*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原183-197-HLA-DRB5*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原183-197-HLA-DRB3*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原30-44-HLA-DRB5*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原70-84-HLA-DRB4*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原337-351-HLA-DRB4*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原171-185-HLA-DRB4*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原4-18-HLA-DRB3*0202/DRA、拟杆菌整合酶抗原171-185-HLA-DRB3*0202/DRA、拟杆菌整合酶抗原256-270-HLA-DRB3*0202/DRA、Fla-2/Fla-X366-380-HLA-DRB3*0101/DRA、Fla-2/Fla-X164-178-HLA-DRB3*0101/DRA、Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB5*0101/DRA、Fla-2/Fla-X1-15-HLA-DRB5*0101/DRA、Fla-2/Fla-X51-65-HLA-DRB4*0101/DRA、Fla-2/Fla-X269-283-HLA-DRB4*0101/DRA、Fla-2/Fla-X4-18-HLA-DRB3*0202/DRA、Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB3*0202/DRA、Fla-2/Fla-X271-285-HLA-DRB3*0202/DRA、YIDX78-92-HLA-DRB3*0101/DRA、YIDX78-92-HLA-DRB4*0101/DRA、YIDX93-107-HLA-DRB3*0101/DRA、YIDX98-112-HLA-DRB5*0101/DRA、YIDX23-37-HLA-DRB5*0101/DRA、YIDX78-92-HLA-DRB4*0101/DRA、YIDX195-209-HLA-DRB4*0101/DRA、YIDX22-36-HLA-DRB3*0202/DRA、YIDX80-94-HLA-DRB3*0202/DRA或YIDX101-115-HLA-DRB3*0202/DRA；
i)COPD和/或气肿，并且pMHC复合物选自：弹性蛋白89-103-HLA-DRB3*0101/DRA、弹性蛋白698-712-HLA-DRB5*0101/DRA、弹性蛋白8-22-HLA-DRB5*0101/DRA、弹性蛋白94-108-HLA-DRB5*0101/DRA、弹性蛋白13-27-HLA-DRB4*0101/DRA、弹性蛋白695-709-HLA-DRB4*0101/DRA、弹性蛋白563-577-HLA-DRB4*0101/DRA、弹性蛋白558-572-HLA-DRB4*0101/DRA、弹性蛋白698-712-HLA-DRB5*0101/DRA、弹性蛋白566-580-HLA-DRB3*0202/DRA或弹性蛋白645-659-HLA-DRB3*0202/DRA；
j)银屑病，并且pMHC复合物选自：Cap1864-78-HLA-DRB3*0101/DRA、Cap1834-48-HLA-DRB3*0101/DRA、Cap1847-61-HLA-DRB3*0101/DRA、Cap18151-165-HLA-DRB4*0101/DRA、Cap18149-163-HLA-DRB5*0101/DRA、Cap18152-166-HLA-DRB5*0101/DRA、Cap18131-145-HLA-DRB5*0101/DRA、Cap1824-38-HLA-DRB3*0202/DRA、ADMTSL5245-259-HLA-DRB3*0101/DRA、ADMTSL5267-281-HLA-DRB3*0101/DRA、ADMTSL5372-386-HLA-DRB3*0101/DRA、ADMTSL5289-303-HLA-DRB4*0101/DRA、ADMTSL5396-410-HLA-DRB4*0101/DRA、ADMTSL5433-447-HLA-DRB4*0101/DRA、ADMTSL5142-156-HLA-DRB5*0101/DRA、ADMTSL5236-250-HLA-DRB5*0101/DRA、ADMTSL5301-315-HLA-DRB5*0101/DRA、ADMTSL5203-217-HLA-DRB3*0202/DRA、ADMTSL5404-418-HLA-DRB3*0202/DRA或ADMTSL5433-447-HLA-DRB3*0202/DRA；
k)自身免疫性肝炎，并且pMHC复合物选自：CYP2D6193-207-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D676-90-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6293-307-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6313-332-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6393-412-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6199-213-HLA-DRB1*0401/DRA、CYP2D6450-464-HLA-DRB1*0401/DRA、CYP2D6301-315-HLA-DRB1*0401/DRA、CYP2D6452-466-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D659-73-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6130-144-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6193-212-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6305-324-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6131-145-HLA-DRB3*0202/DRA、CYP2D6216-230-HLA-DRB3*0202/DRA、CYP2D6238-252-HLA-DRB3*0202/DRA、CYP2D6199-213-HLA-DRB4*0101/DRA、CYP2D6235-252-HLA-DRB4*0101/DRA、CYP2D6293-307-HLA-DRB4*0101/DRA、CYP2D6238-252-HLA-DRB5*0101/DRA、CYP2D6381-395-HLA-DRB5*0101/DRA、CYP2D6429-443-HLA-DRB5*0101/DRA、SLA334-348-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA196-210-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA115-129-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA373-386-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA186-197-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA317-331-HLA-DRB1*0401/DRA、SLA171-185-HLA-DRB1*0401/DRA、SLA417-431-HLA-DRB1*0401/DRA、SLA359-373-HLA-DRB1*0701/DRA、SLA215-229-HLA-DRB1*0701/DRA、SLA111-125-HLA-DRB1*0701/DRA、SLA110-124-HLA-DRB3*0202/DRA、SLA299-313-HLA-DRB3*0202/DRA、SLA342-356-HLA-DRB3*0202/DRA、SLA49-63-HLA-DRB4*0101/DRA、SLA119-133-HLA-DRB4*0101/DRA、SLA260-274-HLA-DRB4*0101/DRA、SLA26-40-HLA-DRB5*0101/DRA、SLA86-100-HLA-DRB5*0101/DRA或SLA331-345-HLA-DRB5*0101/DRA；
l)葡萄膜炎，并且pMHC复合物选自：抑制蛋白199-213-HLA-DRB3*0101/DRA、抑制蛋白77-91-HLA-DRB3*0101/DRA、抑制蛋白250-264-HLA-DRB3*0101/DRA、抑制蛋白172-186-HLA-DRB4*0101/DRA、抑制蛋白354-368-HLA-DRB4*0101/DRA、抑制蛋白239-253-HLA-DRB4*0101/DRA、抑制蛋白102-116-HLA-DRB5*0101/DRA、抑制蛋白59-73-HLA-DRB5*0101、抑制蛋白280-294-HLA-DRB5*0101、抑制蛋白291-306-HLA-DRB1*0301/DRA、抑制蛋白195-209-HLA-DRB3*0202/DRA、抑制蛋白199-213-HLA-DRB3*0202/DRA或抑制蛋白200-214-HLA-DRB3*0202/DRA；
m)舍格伦综合征，并且pMHC复合物选自：RO60127-141-HLA-DRB1*0301/DRA、RO60523-537-HLA-DRB1*0301/DRA、RO60243-257-HLA-DRB1*0301/DRA、RO60484-498-HLA-DRB3*0101/DRA、RO60347-361-HLA-DRB3*0101/DRA、RO60369-383-HLA-DRB3*0101/DRA、RO60426-440-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60267-281-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60178-192-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60358-372-HLA-DRB5*0101/DRA、RO60358-372-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60221-235-HLA-DRB5*0101/DRA、RO60221-235-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60318-332-HLA-DRB5*0101/DRA、RO60318-332-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60407-421-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60407-421-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、RO60459-473-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60459-473-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、RO60318-332-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、RO6051-65-HLA-DRB3*0202/DRA、RO60312-326-HLA-DRB3*0202/DRA、RO60347-361-HLA-DRB3*0202/DRA、LA241-255-HLA-DRB1*0301/DRA、LA101-115-HLA-DRB1*0301/DRA、LA153-167-HLA-DRB1*0301/DRA、LA178-192-HLA-DRB3*0101/DRA、LA19-33-HLA-DRB3*0101/DRA、LA37-51-HLA-DRB3*0101/DRA、LA133-147-HLA-DRB4*0101/DRA、LA50-64-HLA-DRB4*0101/DRA、LA32-46-HLA-DRB4*0101/DRA、LA153-167-HLA-DRB5*0101/DRA、LA83-97-HLA-DRB5*0101/DRA、LA136-150-HLA-DRB5*0101/DRA、LA297-311-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、LA59-73-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、LA59-73-HLA-DRB4*0101/DRA、LA151-165-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、LA151-165-HLA-DRB4*0101/DRA、LA297-311-HLA-DRB4*0101/DRA、LA50-64-HLA-DRB3*0202/DRA、LA86-100-HLA-DRB3*0202/DRA或LA154-168-HLA-DRB3*0202/DRA；
n)硬皮病，并且pMHC复合物选自：TOP1346-360-HLA-DRB3*0101/DRA、TOP1420-434-HLA-DRB3*0101/DRA、TOP1750-764-HLA-DRB3*0101/DRA、TOP1419-433-HLA-DRB4*0101/DRA、TOP1591-605-HLA-DRB4*0101/DRA、TOP1695-709-HLA-DRB4*0101/DRA、TOP1305-319-HLA-DRB5*0101/DRA、TOP1346-360-HLA-DRB5*0101/DRA、TOP1419-433-HLA-DRB5*0101/DRA、TOP1420-434-HLA-DRB3*0202/DRA、TOP1425-439-HLA-DRB3*0202/DRA、TOP1614-628-HLA-DRB3*0202/DRA、CENP-C297-311-HLA-DRB3*0101/DRA、CENP-C857-871-HLA-DRB3*0101/DRA、CENP-C887-901-HLA-DRB3*0101/DRA、CENP-C212-226-HLA-DRB4*0101/DRA、CENP-C643-657-HLA-DRB4*0101/DRA、CENP-C832-846-HLA-DRB4*0101/DRA、CENP-C167-181-HLA-DRB5*0101/DRA、CENP-C246-260-HLA-DRB5*0101/DRA、CENP-C846-860-HLA-DRB5*0101/DRA、CENP-C149-163-HLA-DRB3*0202/DRA、CENP-C833-847-HLA-DRB3*0202/DRA或CENP-C847-861-HLA-DRB3*0202/DRA；
o)抗磷脂综合征，并且pMHC复合物选自：APOH235-249-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH306-320-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH237-251-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH295-309-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH28-42-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH173-187-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH264-278-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH295-309-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH49-63-HLA-DRB5*0101/DRA、APOH269-283-HLA-DRB5*0101/DRA、APOH295-309-HLA-DRB5*0101/DRA、APOH321-355-HLA-DRB3*0202/DRA、APOH322-336-HLA-DRB3*0202/DRA或APOH324-338-HLA-DRB3*0202/DRA；
p)ANCA相关性血管炎，并且pMHC复合物选自：MPO506-520-HLA-DRB3*0101/DRA、MPO302-316-HLA-DRB3*0101/DRA、MPO7-21-HLA-DRB3*0101/DRA、MPO689-703-HLA-DRB4*0101/DRA、MPO248-262-HLA-DRB4*0101/DRA、MPO444-458-HLA-DRB4*0101/DRA、MPO513-527-HLA-DRB5*0101/DRA、MPO97-111-HLA-DRB5*0101/DRA、MPO616-630-HLA-DRB5*0101/DRA、MPO462-476-HLA-DRB3*0202/DRA、MPO617-631-HLA-DRB3*0202/DRA、MPO714-728-HLA-DRB3*0202/DRA、PRTN344-58-HLA-DRB3*0101/DRA、PRTN3234-248-HLA-DRB3*0101/DRA、PRTN359-73-HLA DRB3*0101/DRA、PRTN359-73-HLA-DRB5*0101/DRA、PRTN3117-131-HLA-DRB4*0101/DRA、PRTN3164-178-HLA-DRB4*0101/DRA、PRTN371-85-HLA-DRB4*0101/DRA、PRTN3241-255-HLA-DRB5*0101/DRA、PRTN3183-197-HLA-DRB5*0101/DRA、PRTN362-76-HLA-DRB3*0202/DRA、PRTN3118-132-HLA-DRB3*0202/DRA或PRTN3239-253-HLA-DRB3*0202/DRA；或者
q)僵人综合征，并且pMHC复合物选自：GAD212-226-HLA-DRB1*0801/DRA、GAD555-569-HLA-DRB1*0801/DRA或GAD297-311-HLA-DRB1*0301/DRA。
在一些方面，pMHC复合物用于治疗：
a)I型糖尿病，并且pMHC复合物选自：PPI76-90(K88S)-HLA-DRB1*0401/DRA、IGRP13-25-HLA-DRB1*0301/DRA、GAD555-567-HLA-DRB1*0401/DRA、GAD555-567(557I)-HLA-DRB1*0401/DRA、IGRP23-35-HLA-DRB1*0401/DRA或PPI76-90-HLA-DRB1*0401/DRA；
b)多发性硬化，并且pMHC复合物选自：MBP86-98-HLA-DRB1*1501/DRA、MBP89-101-HLA-DRB5*0101/DRA、MOG38-52-HLA-DRB4*0101/DRA、MOG97-109(E107S)-HLA-DRB1*0401/DRA、MOG203-217-HLA-DRB3*0101/DRA、PLP54-68-HLA-DRB3*0101/DRA、PLP94-108-HLA-DRB1*0301/DRA、PLP250-264-HLA-DRB4*0101/DRA、MPB13-32-HLA-DRB5*0101/DRA、MPB83-99-HLA-DRB5*0101/DRA、MPB111-129-HLA-DRB5*0101/DRA、MPB146-170-HLA-DRB5*0101/DRA、MOG223-237-HLA-DRB3*0202/DRA、MOG6-20-HLA-DRB5*0101/DRA、PLP88-102-HLA-DRB3*0202/DRA或PLP139-154-HLA-DRB5*0101/DRA；
c)乳糜泻，并且pMHC复合物选自：aGlia57-68-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201、aGlia62-72-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0201或aGlia217-229-HLA-DQA1*0501/HLA-DQB1*0302；
d)原发性胆汁性肝硬化，并且pMHC复合物选自：PDC-E2122-135-HLA-DRB4*0101/DRA、PDC-E2249-262-HLA-DRB4*0101/DRA、PDC-E2249-263-HLA-DRB1*0801/DRA、PDC-E2629-643-HLA-DRB1*0801/DRA、PDC-E272-86-HLA-DRB3*0202/DRA、PDC-E2353-367-HLA-DRB3*0202/DRA、PDC-E2422-436-HLA-DRB3*0202/DRA、PDC-E2629-643-HLA-DRB4*0101/DRA、PDC-E280-94-HLA-DRB5*0101/DRA、PDC-E2353-367-HLA-DRB5*0101/DRA或PDC-E2535-549-HLA-DRB5*0101/DRA；
e)落叶型天疱疮和/或寻常型天疱疮，并且pMHC复合物选自：DG1216-229-HLA-DRB1*0101/DRA、DG397-111-HLA-DRB1*0402/DRA、DG3251-265-HLA-DRB1*0401/DRA、DG3441-455-HLA-DRB1*0402/DRA、DG3351-365-HLA-DRB3*0202/DRA、DG3453-467-HLA-DRB3*0202/DRA、DG3540-554-HLA-DRB3*0202/DRA、DG3280-294-HLA-DRB4*0101/DRA、DG3326-340-HLA-DRB4*0101/DRA、DG3367-381-HLA-DRB4*0101/DRA、DG313-27-HLA-DRB5*0101/DRA、DG3323-337-HLA-DRB5*0101/DRA、DG3438-452-HLA-DRB5*0101/DRA、DG148-62-HLA-DRB3*0202/DRA、DG1206-222-HLA-DRB3*0202/DRA、DG1363-377-HLA-DRB3*0202/DRA、DG13-17-HLA-DRB4*0101/DRA、DG1192-206-HLA-DRB4*0101/DRA、DG1326-340-HLA-DRB4*0101/DRA、DG11-15-HLA-DRB5*0101/DRA、DG135-49-HLA-DRB5*0101/DRA或DG1325-339-HLA-DRB5*0101/DRA；
f)视神经脊髓炎谱系障碍，并且pMHC复合物选自：AQP4284-298-HLA-DRB1*0301/DRA、AQP463-76-HLA-DRB1*0301/DRA,AQP4129-143-HLA-DRB1*0401/DRA或AQP439-53-HLA-DRB1*1501/DRA；
g)变应性哮喘，并且pMHC复合物选自：DERP-116-30-HLA-DRB1*0101/DRA、DERP-116-30-HLA-DRB1*1501/DRA、DERP1171-185-HLA-DRB1*1501/DRA、DERP-1110-124-HLA-DPB1*0401/DRA、DERP-226-40-HLA-DRB1*0101/DRA；DERP-226-40-HLA-DRB1*1501/DRA或DERP-2107-121-HLA-DRB1*0301/DRA；
h)炎性肠病，并且pMHC复合物选自：拟杆菌整合酶抗原1-15-HLA-DRB5*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原183-197-HLA-DRB3*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原70-84-HLA-DRB4*0101/DRA、拟杆菌整合酶抗原4-18-HLA-DRB3*0202/DRA、拟杆菌整合酶抗原171-185-HLA-DRB3*0202/DRA、拟杆菌整合酶抗原256-270-HLA-DRB3*0202/DRA、Fla-2/Fla-X366-380-HLA-DRB3*0101/DRA、Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB5*0101/DRA、Fla-2/Fla-X51-65-HLA-DRB4*0101/DRA、Fla-2/Fla-X4-18-HLA-DRB3*0202/DRA、Fla-2/Fla-X261-275-HLA-DRB3*0202/DRA、Fla-2/Fla-X271-285-HLA-DRB3*0202/DRA、YIDX78-92-HLA-DRB3*0101/DRA、YIDX78-92-HLA-DRB4*0101/DRA、YIDX98-112-HLA-DRB5*0101/DRA、YIDX22-36-HLA-DRB3*0202/DRA、YIDX80-94-HLA-DRB3*0202/DRA或YIDX101-115-HLA-DRB3*0202/DRA；
i)气肿，并且pMHC复合物选自：弹性蛋白89-103-HLA-DRB3*0101/DRA、弹性蛋白698-712-HLA-DRB5*0101/DRA、弹性蛋白558-572-HLA-DRB4*0101/DRA、弹性蛋白566-580-HLA-DRB3*0202/DRA或弹性蛋白645-659-HLA-DRB3*0202/DRA；
j)银屑病，并且pMHC复合物选自：Cap1864-78-HLA-DRB3*0101/DRA、Cap1834-48-HLA-DRB3*0101/DRA、Cap1847-61-HLA-DRB3*0101/DRA、Cap18151-165-HLA-DRB4*0101/DRA、Cap18149-163-HLA-DRB5*0101/DRA、Cap18152-166-HLA-DRB5*0101/DRA、Cap18131-145-HLA-DRB5*0101/DRA、Cap1824-38-HLA-DRB3*0202/DRA、ADMTSL5245-259-HLA-DRB3*0101/DRA、ADMTSL5267-281-HLA-DRB3*0101/DRA、ADMTSL5372-386-HLA-DRB3*0101/DRA、ADMTSL5289-303-HLA-DRB4*0101/DRA、ADMTSL5396-410-HLA-DRB4*0101/DRA、ADMTSL5433-447-HLA-DRB4*0101/DRA、ADMTSL5142-156-HLA-DRB5*0101/DRA、ADMTSL5236-250-HLA-DRB5*0101/DRA、ADMTSL5301-315-HLA-DRB5*0101/DRA、ADMTSL5203-217-HLA-DRB3*0202/DRA、ADMTSL5404-418-HLA-DRB3*0202/DRA或ADMTSL5433-447-HLA-DRB3*0202/DRA；
k)自身免疫性肝炎，并且pMHC复合物选自：CYP2D6193-207-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D676-90-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6293-307-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6313-332-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6393-412-HLA-DRB1*0301/DRA、CYP2D6199-213-HLA-DRB1*0401/DRA、CYP2D6450-464-HLA-DRB1*0401/DRA、CYP2D6301-315-HLA-DRB1*0401/DRA、CYP2D6452-466-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D659-73-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6130-144-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6193-212-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6305-324-HLA-DRB1*0701/DRA、CYP2D6131-145-HLA-DRB3*0202/DRA、CYP2D6216-230-HLA-DRB3*0202/DRA、CYP2D6238-252-HLA-DRB3*0202/DRA、CYP2D6199-213-HLA-DRB4*0101/DRA、CYP2D6235-252-HLA-DRB4*0101/DRA、CYP2D6293-307-HLA-DRB4*0101/DRA、CYP2D6238-252-HLA-DRB5*0101/DRA、CYP2D6381-395-HLA-DRB5*0101/DRA、CYP2D6429-443-HLA-DRB5*0101/DRA、SLA334-348-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA196-210-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA115-129-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA373-386-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA186-197-HLA-DRB1*0301/DRA、SLA317-331-HLA-DRB1*0401/DRA、SLA171-185-HLA-DRB1*0401/DRA、SLA417-431-HLA-DRB1*0401/DRA、SLA359-373-HLA-DRB1*0701/DRA、SLA215-229-HLA-DRB1*0701/DRA、SLA111-125-HLA-DRB1*0701/DRA、SLA110-124-HLA-DRB3*0202/DRA、SLA299-313-HLA-DRB3*0202/DRA、SLA342-356-HLA-DRB3*0202/DRA、SLA49-63-HLA-DRB4*0101/DRA、SLA119-133-HLA-DRB4*0101/DRA、SLA260-274-HLA-DRB4*0101/DRA、SLA26-40-HLA-DRB5*0101/DRA、SLA86-100-HLA-DRB5*0101/DRA或SLA331-345-HLA-DRB5*0101/DRA；
l)葡萄膜炎，并且pMHC复合物选自：抑制蛋白199-213-HLA-DRB3*0101/DRA、抑制蛋白77-91-HLA-DRB3*0101/DRA、抑制蛋白250-264-HLA-DRB3*0101/DRA、抑制蛋白172-186-HLA-DRB4*0101/DRA、抑制蛋白354-368-HLA-DRB4*0101/DRA、抑制蛋白239-253-HLA-DRB4*0101/DRA、抑制蛋白102-116-HLA-DRB5*0101/DRA、抑制蛋白59-73-HLA-DRB5*0101、抑制蛋白280-294-HLA-DRB5*0101、抑制蛋白291-306-HLA-DRB1*0301/DRA、抑制蛋白195-209-HLA-DRB3*0202/DRA、抑制蛋白199-213-HLA-DRB3*0202/DRA或抑制蛋白200-214-HLA-DRB3*0202/DRA；
m)舍格伦综合征，并且pMHC复合物选自：RO60127-141-HLA-DRB1*0301/DRA、RO60523-537-HLA-DRB1*0301/DRA、RO60243-257-HLA-DRB1*0301/DRA、RO60484-498-HLA-DRB3*0101/DRA、RO60347-361-HLA-DRB3*0101/DRA、RO60369-383-HLA-DRB3*0101/DRA、RO60426-440-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60267-281-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60178-192-HLA-DRB4*0101/DRA、RO60358-372-HLA-DRB5*0101/DRA、RO60221-235-HLA-DRB5*0101/DRA、RO60318-332-HLA-DRB5*0101/DRA、RO6051-65-HLA-DRB3*0202/DRA、RO60312-326-HLA-DRB3*0202/DRA、RO60347-361-HLA-DRB3*0202/DRA、LA241-255-HLA-DRB1*0301/DRA、LA101-115-HLA-DRB1*0301/DRA、LA153-167-HLA-DRB1*0301/DRA、LA178-192-HLA-DRB3*0101/DRA、LA19-33-HLA-DRB3*0101/DRA、LA37-51-HLA-DRB3*0101/DRA、LA133-147-HLA-DRB4*0101/DRA、LA50-64-HLA-DRB4*0101/DRA、LA32-46-HLA-DRB4*0101/DRA、LA153-167-HLA-DRB5*0101/DRA、LA83-97-HLA-DRB5*0101/DRA、LA136-150-HLA-DRB5*0101/DRA、LA50-64-HLA-DRB3*0202/DRA、LA86-100-HLA-DRB3*0202/DRA或LA154-168-HLA-DRB3*0202/DRA；
n)硬皮病，并且pMHC复合物选自：TOP1346-360-HLA-DRB3*0101/DRA、TOP1420-434-HLA-DRB3*0101/DRA、TOP1750-764-HLA-DRB3*0101/DRA、TOP1419-433-HLA-DRB4*0101/DRA、TOP1591-605-HLA-DRB4*0101/DRA、TOP1695-709-HLA-DRB4*0101/DRA、TOP1305-319-HLA-DRB5*0101/DRA、TOP1346-360-HLA-DRB5*0101/DRA、TOP1419-433-HLA-DRB5*0101/DRA、TOP1420-434-HLA-DRB3*0202/DRA、TOP1425-439-HLA-DRB3*0202/DRA、TOP1614-628-HLA-DRB3*0202/DRA、CENP-C297-311-HLA-DRB3*0101/DRA、CENP-C857-871-HLA-DRB3*0101、CENP-C887-901-HLA-DRB3*0101、CENP-C212-226-HLA-DRB4*0101/DRA、CENP-C643-657-HLA-DRB4*0101/DRA、CENP-C832-846-HLA-DRB4*0101/DRA、CENP-C167-181-HLA-DRB5*0101/DRA、CENP-C246-260-HLA-DRB5*0101/DRA、CENP-C846-860-HLA-DRB5*0101/DRA、CENP-C149-163-HLA-DRB3*0202/DRA、CENP-C833-847-HLA-DRB3*0202/DRA或CENP-C847-861-HLA-DRB3*0202/DRA；
o)抗磷脂综合征，并且pMHC复合物选自：APOH235-249-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH306-320-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH237-251-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH295-309-HLA-DRB3*0101/DRA、APOH28-42-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH173-187-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH264-278-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH295-309-HLA-DRB4*0101/DRA、APOH49-63-HLA-DRB5*0101/DRA、APOH269-283-HLA-DRB5*0101/DRA、APOH295-309-HLA-DRB5*0101/DRA、APOH321-355-HLA-DRB3*0202/DRA、APOH322-336-HLA-DRB3*0202/DRA或APOH324-338-HLA-DRB3*0202/DRA；
p)ANCA相关性血管炎，并且pMHC复合物选自：MPO506-520-HLA-DRB3*0101/DRA、MPO302-316-HLA-DRB3*0101/DRA、MPO7-21-HLA-DRB3*0101/DRA、MPO689-703-HLA-DRB4*0101/DRA、MPO248-262-HLA-DRB4*0101/DRA、MPO444-458-HLA-DRB4*0101/DRA、MPO513-527-HLA-DRB5*0101/DRA、MPO97-111-HLA-DRB5*0101/DRA、MPO616-630-HLA-DRB5*0101/DRA、MPO462-476-HLA-DRB3*0202/DRA、MPO617-631-HLA-DRB3*0202/DRA、MPO714-728-HLA-DRB3*0202/DRA、PRTN344-58-HLA-DRB3*0101/DRA、PRTN3234-248-HLA-DRB3*0101/DRA、PRTN359-73-HLA DRB3*0101/DRA、PRTN359-73-HLA-DRB5*0101/DRA、PRTN3117-131-HLA-DRB4*0101/DRA、PRTN3164-178-HLA-DRB4*0101/DRA、PRTN371-85-HLA-DRB4*0101/DRA、PRTN3241-255-HLA-DRB5*0101/DRA、PRTN3183-197-HLA-DRB5*0101/DRA、PRTN362-76-HLA-DRB3*0202/DRA、PRTN3118-132-HLA-DRB3*0202/DRA或PRTN3239-253-HLA-DRB3*0202/DRA；或者
q)僵人综合征，并且pMHC复合物选自：GAD212-226-HLA-DRB1*0801/DRA、GAD555-569-HLA-DRB1*0801/DRA或GAD297-311-HLA-DRB1*0301/DRA。
与pMHC/NP复合物偶联的一个或多个共刺激分子的选择也可以类似地优化，并将主要取决于需要分化或扩增的免疫细胞群体的性质。例如，如果意图扩增或分化T调节细胞群体，则相关的组合可以包括但不限于共刺激分子和细胞因子，如IL15-IL15Ra、IL-2、IL-10、IL-35、ICOS-L、IL2/抗-IL2mAb复合物、TGF-β、IL-21、ITE或ICOSL。相反，在某些实施方案中，如对于某些类型的癌症，T调节表型的扩增和/或分化可能不是所需的应答。因此，供选择的共刺激分子和细胞因子将针对特定的治疗进行优化。
多肽
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；以及至少一个工程化凸起。在一些实施方案中，MHC II类α1结构域和MHC II类α2结构域来源于人白细胞抗原(HLA)分子，例如HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP。在某些实施方案中，MHCII类α1结构域和MHC II类α2结构域来源于DRA、DQA1或DPA1。在一些实施方案中，MHC II类α1结构域或MHC II类α2结构域来源于DRA、DQA1或DPA1。
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；以及至少一个工程化凸起。在一些实施方案中，MHC II类β1结构域和MHC II类β2结构域来源于人白细胞抗原(HLA)分子，例如HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP。在某些实施方案中，MHCII类β1结构域和MHC II类β2来源于HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1或HLA-DPB1。在一些实施方案中，MHC II类β1结构域或MHC II类β2来源于HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1或HLA-DPB1。
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；以及至少一个工程化空腔。
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；以及至少一个工程化空腔。
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类α1结构域和MHC II类α2结构域；以及至少一个工程化凸起。
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类β1结构域和MHC II类β2结构域；以及至少一个工程化凸起。
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类α1结构域和MHC II类α2结构域；以及至少一个工程化空腔。
另一个方面，本文提供了多肽，其包含MHC II类β1结构域和MHC II类β2结构域；以及至少一个工程化空腔。
在一些实施方案中，多肽进一步包含C末端半胱氨酸残基。在一些实施方案中，多肽进一步包含生物素化位点。在一些实施方案中，多肽进一步包含Strep标签。
在一些实施方案中，本文提供的多肽由包含SEQ ID NO:1-26、64或65中任一个的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ ID NO:1的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ ID NO:2的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ ID NO:3的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ ID NO:4的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ ID NO:25的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含SEQ IDNO:26的DNA序列编码。
在一些实施方案中，本文提供的多肽由SEQ ID NO:1-8中的任一个编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:1编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:2编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:3编码。在一些实施方案中，多肽由SEQ ID NO:4编码。在一些实施方案中，本文提供的多肽由SEQ ID NO:5-6中的任一个编码。在一些实施方案中，本文提供的多肽由SEQ ID NO:5-8中的任一个编码。
在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1-26、64或65中的任一个具有至少80％同一性的DNA序列的DNA序列编码。这包括与SEQ ID NO:1-8中的任一个具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1-26、64或65中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:2具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQID NO:3具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:4具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-6中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-8中的任一个具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列的DNA序列编码。
在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1-26、64或65中的任一个具有至少85％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1具有至少85％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ IDNO:3具有至少85％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQID NO:4具有至少85％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-6中的任一个具有至少85％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-8中的任一个具有至少85％同一性的DNA序列的DNA序列编码。
在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1-26、64或65中的任一个具有至少90％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1具有至少90％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ IDNO:3具有至少90％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQID NO:4具有至少90％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-6中的任一个具有至少90％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-8中的任一个具有至少90％同一性的DNA序列的DNA序列编码。
在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1-26、64或65中的任一个具有至少95％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ IDNO:3具有至少95％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQID NO:4具有至少95％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-6中的任一个具有至少95％同一性的DNA序列的DNA序列编码。在一些实施方案中，多肽由包含与SEQ ID NO:5-8中的任一个具有至少95％同一性的DNA序列的DNA序列编码。
在一些实施方案中，本文提供的多肽是包含SEQ ID NO:27-63中任一个的氨基酸序列的多肽，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:35-50的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含SEQID NO:53的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含SEQ ID NO:55-59的氨基酸序列，或其片段。如本文所用，氨基酸序列或多肽的“片段”包含至少5个氨基酸。在一些实施方案中，片段包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。在一些实施方案中，片段包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、本文所述的工程化凸起或其任何组合。在一些实施方案中，片段包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、本文所述的工程化空腔或其任何组合。在一些实施方案中，片段包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、本文所述的工程化凸起或其任何组合。在一些实施方案中，片段包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、本文所述的工程化空腔或其任何组合。
在一些实施方案中，片段包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域和本文所述的工程化凸起。在一些实施方案中，片段包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域和本文所述的工程化空腔。在一些实施方案中，片段包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域和本文所述的工程化凸起。在一些实施方案中，片段包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域和本文所述的工程化空腔。
在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:27-63中任一个的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列，或其片段。这包括与SEQ ID NO:27-63中的任一个至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:35-50中任一个的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ IDNO:52的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:54的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:55-59中任一个的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其片段。
在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:27-63中任一个的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:35-50中任一个的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQID NO:54的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:55-59中任一个的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，或其片段。
在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:27-63中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:35-50中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQID NO:54的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:55-59中任一个的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，或其片段。
在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:27-63中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:35-50中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:52的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:53的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQID NO:54的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，或其片段。在一些实施方案中，本文提供的多肽包含与SEQ ID NO:55-59中任一个的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列，或其片段。
在一些实施方案中，本文提供的多肽是包含SEQ ID NO:60-61中任一个的氨基酸序列的多肽，或其片段。在一些实施方案中，多肽包含与SEQ ID NO:60-61中任一个的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列，或其片段。
在一些实施方案中，本文所述的四个或更多个多肽共价附接至聚合物主链以形成多聚体。在一些实施方案中，聚合物主链是葡聚糖或聚乙二醇。在一些实施方案中，每个多肽通过每个多肽上的末端半胱氨酸残基附接至聚合物主链。在一些实施方案中，每个多肽通过每个多肽上的生物素化位点附接至聚合物主链。
在一些实施方案中，四个或更多个多肽与亲和素共价附接以形成多聚体。
凸起和/或空腔
在一些实施方案中，多肽包含工程化凸起。在一些实施方案中，凸起包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，凸起包含一个或多个天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，凸起包含选自苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，凸起包含苯丙氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含精氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含酪氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含色氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，凸起包含半胱氨酸残基和色氨酸残基。
在一些实施方案中，多肽包含工程化空腔。在一些实施方案中，空腔包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，空腔包含一个或多个天然存在的氨基酸残基。在一些实施方案中，空腔包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。在一些实施方案中，空腔包含丙氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含丝氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含苏氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含缬氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含半胱氨酸残基。在一些实施方案中，空腔包含半胱氨酸残基、丝氨酸残基、丙氨酸残基和缬氨酸残基。
在一些实施方案中，凸起或空腔不位于多肽上的MHC II类结构域。在一些实施方案中，凸起或空腔位于多肽上的CH3抗体恒定域。在一些实施方案中，凸起位于多肽上的CH3抗体恒定域。在一些实施方案中，空腔位于多肽上的CH3抗体恒定域。
在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQID NO:25所示的核苷酸序列具有至少98％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，空腔包含SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔包含与SEQID NO:51所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔包含SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，空腔包含与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH2或CH3结构域中。在某些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中。在某些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，空腔被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQID NO:26所示的核苷酸序列具有至少98％同一性的核苷酸序列。在某些实施方案中，凸起包含SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列。在一些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:26所示的核苷酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起包含与SEQID NO:53所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起包含SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，凸起包含与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH2或CH3结构域中。在某些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中。在某些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并包含SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，凸起被工程化到免疫球蛋白分子的CH3结构域中，并且包含与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列具有至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
凸起和空腔可以通过与MHC II类α结构域或MHC II类β结构域融合的IgG1的CH3结构域中的特定突变来工程化。在某些实施方案中，凸起包含IgG1分子的CH3区域中的S354C突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，凸起包含IgG1分子的CH3区域中的T366W突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，凸起包含IgG1分子的CH3区域中的S354C和T366W突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，凸起包含IgG1分子的CH3区域中的S354C和T366W突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，凸起由IgG1分子的CH3区域中的S354C和T366W突变(EU抗体编号方案)组成。在某些实施方案中，空腔包含IgG1分子的CH3区域中的Y349C突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，空腔包含IgG1分子的CH3区域中的T366S突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，空腔包含IgG1分子的CH3区域中的L368A突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，空腔包含IgG1分子的CH3区域中的Y407V突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，空腔包含IgG1分子的CH3区域中的Y349C、T366S、L368A和Y407V突变(EU抗体编号方案)。在某些实施方案中，空腔由IgG1分子的CH3区域中的Y349C、T366S、L368A和Y407V突变(EU抗体编号方案)组成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中凸起由IgG CH3结构域中的突变形成，并且(ii)第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中空腔由IgG CH3结构域中的突变形成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中凸起由IgG CH3结构域中的突变形成；并且(ii)第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中空腔由IgG CH3结构域中的突变形成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中凸起由IgG CH3结构域中对应于S354C和T366W(EU编号)的突变形成；并且(ii)第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中空腔由IgG CH3结构域中对应于Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)的突变形成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中凸起由IgG CH3结构域中对应于S354C和T366W(EU编号)的突变形成；并且(ii)第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域，其中空腔由IgG CH3结构域中对应于Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)的突变形成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽由MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中凸起由IgG CH3结构域中的突变形成，并且(ii)第二多肽由MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中空腔由IgG CH3结构域中的突变形成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽由MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中凸起由IgG CH3结构域中的突变形成；并且(ii)第二多肽由MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中空腔由IgG CH3结构域中的突变形成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽由MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中凸起由IgG CH3结构域中对应于S354C和T366W(EU编号)的突变形成；并且(ii)第二多肽由MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中空腔由IgG CH3结构域中对应于Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)的突变形成。
在一个实施方案中，分离的异二聚体包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽由MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域，IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中凸起由IgG CH3结构域中对应于S354C和T366W(EU编号)的突变形成；并且(ii)第二多肽由MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域、IgG CH2结构域和IgG CH3结构域组成，其中空腔由IgG CH3结构域中对应于Y349C、T366S、L368A和Y407V(EU编号)的突变形成。
制备方法
在另一个方面，本文提供了制备本文所述的异二聚体的方法。本公开内容考虑到产生异二聚体的方法，其中异二聚体包含含有MHC II类α1结构域和MHC II类α2结构域的第一多肽，以及含有MHC II类β1结构域和MHC II类β2结构域的第二多肽。在一些实施方案中，每种多肽进一步包含CH2和CH3结构域。在一些实施方案中，CH3结构域进一步包含工程化突起(凸起)或工程化孔(空腔)。如果突起与包含MHC II类α1和α2结构域的多肽缔合，则孔与包含MHC II类β1和β2结构域的多肽缔合。可以转变构型，其中突起与包含MHC II类β1和β2结构域的多肽缔合，而孔与包含MHC II类α1和α2结构域的多肽缔合。异二聚体还包含免疫学相关的多肽，该多肽与在MHC II类α链与MHC II类β链之间形成的结合沟缔合。多肽可以是第一多肽链或第二多肽链中任一个的一部分，或通过柔性氨基酸连接体与之缔合。
在一些实施方案中，异二聚体的多肽由引入真核细胞系中的多核苷酸编码。在某些实施方案中，真核生物系是哺乳动物细胞系。在某些实施方案中，真核生物系是CHO细胞系(中国仓鼠卵巢)。多核苷酸可以通过本领域已知的方法引入，如病毒转导(逆转录病毒或慢病毒)，或通过产生包含整合到基因组中的多核苷酸拷贝的稳定细胞系。表达后，异二聚体在细胞中组装并分泌到培养基中。在此阶段，使培养基经历至少一个进一步的纯化步骤。在某些实施方案中，该纯化步骤包括离心、超速离心、透析、过滤、层析或柱层析中的任一种或多种。在某些实施方案中，由于多肽包含人免疫球蛋白的CH2和CH3结构域，因此层析步骤包括使用蛋白A、蛋白G、蛋白L或其任何组合的亲和层析。在某些实施方案中，层析步骤包括使用蛋白A的亲和层析。在某些实施方案中，层析步骤包括使用蛋白G的亲和层析。在某些实施方案中，层析步骤包括使用蛋白A/G的亲和层析。在某些实施方案中，层析步骤由使用蛋白A的亲和层析组成。在某些实施方案中，层析步骤由使用蛋白G的亲和层析组成。在某些实施方案中，层析步骤由使用蛋白A/G的亲和层析组成。在某些实施方案中，层析步骤不使用除蛋白A、蛋白G、蛋白质L或其组合之外的亲和试剂(这不包括非基于亲和力的层析步骤，如脱盐或尺寸排阻层析)。
在一些实施方案中是制备包含第一多肽和第二多肽的异二聚体的方法，其中第一多肽和第二多肽在界面处相遇，其中第一多肽的界面包含工程化凸起，该工程化凸起可定位于第二多肽的界面的工程化空腔中；并且(i)第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者(ii)第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；该方法包括以下步骤：(a)培养包含核酸的宿主细胞，该核酸编码第一多肽和第二多肽及其界面，其中编码第一多肽的界面的核酸已经从编码第一多肽的原始界面的核酸改变以编码凸起，或编码第二多肽的界面的核酸已经从编码第二多肽的原始界面的核酸改变以编码空腔，或两者兼有，并且其中培养使第一多肽和第二多肽表达；以及(b)从宿主细胞培养物回收异二聚体。在一些实施方案中，编码第一多肽的核酸已从原始核酸改变，以编码凸起，并且编码第二多肽的核酸已从原始核酸改变，以编码空腔。在一些实施方案中，步骤(a)之前是这样的步骤，其中编码来自第一多肽的界面的原始氨基酸残基的一个或多个核酸中的每一个被替换为编码输入氨基酸残基的核酸，其中凸起包含一个或多个输入残基。在进一步的实施方案中，一个或多个输入残基具有比原始氨基酸残基更大的侧链体积。在一些实施方案中，步骤(a)之前是这样的步骤，其中编码第二多肽的界面中的原始氨基酸残基的一个或多个核酸中的每一个被替换为编码输入氨基酸残基的核酸，其中空腔包含一个或多个输入残基。在进一步的实施方案中，一个或多个输入残基具有比原始氨基酸残基更小的侧链体积。
在一些实施方案中，输入残基选自苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和半胱氨酸。在一些实施方案中，输入残基是精氨酸。在一些实施方案中，输入残基是苯丙氨酸。在一些实施方案中，输入残基是酪氨酸。在一些实施方案中，输入残基是色氨酸。在一些实施方案中，输入残基是丙氨酸。在一些实施方案中，输入残基是丝氨酸。在一些实施方案中，输入残基是苏氨酸。在一些实施方案中，输入残基是缬氨酸。在一些实施方案中，输入残基不是半胱氨酸。在一些实施方案中，输入残基是半胱氨酸。在一些实施方案中，输入残基是半胱氨酸和色氨酸。在一些实施方案中，输入残基是半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸和缬氨酸。
在另一个方面，本文提供了制备本文所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物的方法。在一些实施方案中，该方法包括将至少一个本文所述的异二聚体连接至纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并且/或者具有固体核心。在一些实施方案中，该方法包括将至少一个本文所述的异二聚体连接至纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并具有固体核心。在一些实施方案中，该方法包括将至少一个本文所述的异二聚体连接至纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的或具有固体核心。在一些实施方案中，该方法包括将至少一个本文所述的异二聚体连接至纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并具有固体金核心。在一些实施方案中，该方法包括将至少一个本文所述的异二聚体连接至纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并具有固体氧化铁核心。在一些实施方案中，该方法包括将至少一个本文所述的异二聚体连接至纳米颗粒，其中纳米颗粒是非脂质体的并具有氧化铁核心；并且连接步骤包括通过连接体将至少一个异二聚体共价连接至纳米颗粒。
治疗疾病的方法
在另一个方面，本文提供了使用组合物治疗疾病的方法，该组合物包含本文公开的异二聚体和/或本文公开的异二聚体-纳米颗粒缀合物，由其组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，该疾病是自身免疫疾病或病症。
本公开内容的分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物可用于使自身反应性T细胞重编程/分化成T调节细胞或TR1细胞。在某些实施方案中，TR1细胞表达IL-10。在某些实施方案中，TR1细胞分泌IL-10。在某些实施方案中，TR1细胞表达CD49b。在某些实施方案中，TR1细胞表达LAG-3。具有这些表型特征的T细胞可用于治疗个体的炎症或自身免疫病况。
“自身免疫疾病或病症”包括由个体的自身组织或器官引起并针对该自身组织或器官的疾病或病症，或其表现，或由此产生的病况。在一个实施方案中，它是指由对正常身体组织和抗原具有反应性的T细胞引起、产生或由其加剧的病况。自身免疫疾病或病症的实例包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱发性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、斯蒂尔病、脊椎关节炎和青少年发作型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritischronica progrediente)、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)，炎性过度增殖性皮肤病，银屑病(如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲的银屑病)，特应性(包括特应性疾病，如枯草热和Job综合征)，皮炎(包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎)，x连锁高IgM综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹(如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹)，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化(如系统性硬化，多发性硬化(MS)，如脊柱光学MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)，进行性系统性硬化，动脉粥样硬化，动脉硬化，弥漫性硬化和运动失调性硬化)，视神经脊髓炎谱系障碍(NMO，也称为德维克病或德维克综合征)，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病；自身免疫介导的胃肠疾病；结肠炎，如溃疡性结肠炎、溃疡结肠炎、镜下结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎；以及自身免疫性炎性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征(包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS))，脑膜炎，全部或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液病，类风湿性脊椎炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，脑膜炎的脑神经损伤，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙痒、自身免疫性卵巢功能早衰，由于自身免疫病况引起的突发性听觉丧失，IgE介导的疾病，如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎，如Rasmussen脑炎和边缘和/或脑干脑炎，葡萄膜炎(如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎)，伴有和不伴有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)(如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，以及快速进行性GN或增生性肾炎)，自身免疫性多腺内分泌衰竭，龟头炎，包括浆细胞性局限性龟头炎、龟头包皮炎，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑，环状肉芽肿，光泽苔藓，硬化萎缩苔藓，慢性单纯性苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，片层状鱼鳞藓，表皮松懈角化过度症，恶变前角化症，坏疽性脓皮病，变应性病况和反应，变态反应，湿疹(包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、汗疱湿疹和水疱样掌跖湿疹)，哮喘(如细支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘)，涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的病况，针对外来抗原如妊娠期间的胎儿ABO血型的免疫反应，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮(包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、小儿狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)，如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮)，I型糖尿病，II型糖尿病，以及成人潜伏性自身免疫性糖尿病(或1.5型糖尿病)。还想到与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应有关的免疫应答，结节病，肉芽肿病(包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病，或粒细胞缺乏)，血管炎病(包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu)动脉炎)、中血管血管炎(包括川畸病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、显微镜可见的多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、超敏感性血管炎、坏死性血管炎，如系统性坏死性血管炎，和ANCA相关性血管炎(如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关性小血管血管炎))，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血，免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，艾迪生病，自身免疫性中性白细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，阿尔茨海默病，帕金森病，多器官损伤综合征(如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征)，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基膜疾病，抗磷脂抗体综合征，抗磷脂综合征，变应性神经炎，贝赫切特病/综合征，卡斯尔曼综合征，古德帕斯丘综合征，雷诺综合征，舍格伦综合征，史-约综合征，类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮和红斑型天疱疮)，自身免疫性多内分泌腺疾病，赖特尔病或综合征，热伤，先兆子痫，免疫复合物病症，如免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，多发性神经病，慢性神经病，如IgM多发性神经病或IgM-介导的神经病，自身免疫性或免疫介导的血小板减少，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，获得性血小板减少性紫癜，巩膜炎，如特发性角膜-巩膜炎，巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退症，自身免疫性内分泌病(包括甲状腺炎(如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎)，自身免疫性甲状腺疾病，特发性甲状腺功能减退症，格雷夫斯病)，多腺性综合征，如自身免疫性多腺性综合征(或多腺性内分泌病综合征)，类肿瘤综合征，包括神经病类肿瘤综合征，如兰-伊肌无力综合征或伊-兰综合征，僵人综合征，脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎或过敏性脑脊髓炎和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力，如胸腺瘤相关性重症肌无力，小脑退化，神经性肌强直，视性眼阵挛或眼球斜视痉挛综合征(OMS)，感觉神经病，多病灶运动神经病，希恩综合征，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，类狼疮性肝炎，巨细胞性肝炎，慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎(LIP)，闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP、格林-巴利综合征，贝尔热病(Berger's disease)(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线状IgA皮肤病，急性发热性嗜中性皮肤病，角层下脓疱性皮肤病，暂时性棘层松解性皮肤病，硬化，如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠病综合征，腹或腹腔疾病，乳糜泻(麸质肠病)，难治性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩侧索硬化(ALS；LouGehrig病)，冠状动脉疾病，自身免疫性耳病，如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力损失，多软骨炎，如难治性或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，寇甘综合征/非梅毒性间质性角膜炎，贝尔麻痹，斯威特病/综合征，自身免疫性酒渣鼻，带状疱疹相关性疼痛，淀粉样变性，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙球蛋白病和意义未明的单克隆丙球蛋白病，MGUS)，周围神经病，副肿瘤综合征，通道病变，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉病症、耳聋、失明、周期性瘫痪、CNS的通道病变，孤独症，炎性肌病，局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，德雷斯勒综合征，斑秃(alopecia greata)，全秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象，食管活动不良、指端硬化和毛血管扩张)，男性和女性自身免疫性不育(例如，由抗精子抗体引起的)，混合性结缔组织病，南美洲锥虫病，风湿热，复发性流产，农民肺，多形性红斑，心脏切开后综合征，库欣综合征，养鸟迷的肺(bird-fancier's lung)，变应性肉芽肿性脉管炎，良性淋巴细胞脉管炎，奥尔波特综合征，肺泡炎，如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，寄生虫病，如利什曼病，锥虫病(kypanosomiasis)，血吸虫病、蛔虫病、曲霉病，Sampter综合征，Caplan综合征，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，肺间质纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythema elevatum etdiutinum)，胎儿成红细胞增多症，嗜酸性筋膜炎，舒尔曼综合征，费尔蒂综合征，丝虫病(flariasis)，睫状体炎，如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch睫状体炎，Henoch Schonlei紫癜，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，埃可病毒感染，脓毒症，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染、风疹病毒感染，疫苗接种后综合征，先天性风疹感染、EB病毒感染，流行性腮腺炎，埃文斯综合征，自身免疫性腺衰竭，西登哈姆舞蹈病，链球菌感染后肾炎，闭塞性血栓性脉管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，慢性过敏性肺炎，干燥性角结膜炎，流行性角结膜炎，特发性肾病综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血再灌注损伤，移植器官再灌注，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺疾病，矽肺，口疮，口疮性口炎，动脉硬化病症，asperniogenese，自身免疫性溶血、伯克病、冷球蛋白血症、Dupuytren挛缩，晶状体蛋白过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)，变应性肠炎，麻风结节性红斑、特发性面神经麻痹，慢性疲劳综合征，发热肌痛，哈-里病，感音神经性听觉丧失，haemoglobinuriaparoxysmatica，性腺功能减退，局限性回肠炎，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯脊髓炎，原发性特发性粘液性水肿，肾病，ophthalmia symphatica，肉芽肿性睾丸炎，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮病，Quervain甲状腺炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的病况，白细胞粘附缺陷，与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征、抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌腺疾病，卵巢炎，原发性粘液性水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌腺衰竭，I型自身免疫性多内分泌腺综合征，成人发作型特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，心肌病，如扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解(EBA)，血色素沉着症，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛骨、额骨、上颌骨或蝶窦炎，嗜酸性粒细胞相关疾病，如嗜酸性粒细胞增多，肺嗜酸性粒细胞增多性浸润，嗜酸性粒细胞增多肌痛综合征，吕弗勒综合征，慢性嗜酸细胞性肺炎，热带性肺嗜酸细胞浸润症，支气管肺曲霉病，曲霉肿或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊柱关节病，多内分泌自身免疫疾病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性皮肤粘膜念珠菌病，布鲁顿综合征，婴儿一过性低丙种球蛋白血症，威-奥综合征，共济失调-毛细血管扩张综合征，血管扩张，与胶原病相关的自身免疫病症，风湿病，神经系统疾病，淋巴结炎，血压反应减少，血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血，脑缺血以及伴随血管生成的疾病，变应性超敏反应病症、肾小球肾炎、再灌注损伤、缺血再灌注病症，心肌或其他组织再灌注损伤，淋巴瘤性气管支气管炎，炎性皮肤病，具有急性炎性组分的皮肤病，多器官衰竭，大疱性疾病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其他中枢神经系统炎性病症，眼部和眼眶的炎性病症，粒细胞输注相关综合征，细胞因子诱发的毒性，发作性睡病，急性严重炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉增生，消化性溃疡，瓣膜炎，气肿，斑秃，脂肪组织炎症/II型糖尿病，肥胖症相关的脂肪组织炎症/胰岛素抗性，以及子宫内膜异位症。
在一些实施方案中，自身免疫病症或疾病可包括但不限于I型和II型糖尿病、前驱糖尿病、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关的病症、卵巢功能早衰、硬皮病、舍格伦病/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)，多腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退症、多肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退症、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退症和/或类风湿性关节炎。其他感兴趣的适应证包括但不限于哮喘、变应性哮喘、原发性胆汁性肝硬化、硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克病、视神经脊髓型多发性硬化(OSMS))、寻常型天疱疮、炎性肠病(IBD)、关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力(Myasthyenia Gravis)、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导性肌病、前列腺癌、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、气肿、脊髓损伤、创伤性损伤、烟草诱发的肺破坏、ANCA相关性血管炎、银屑病、硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎，和中枢神经系统和周围神经系统疾病。
在一些实施方案中，自身免疫病症或疾病可包括但不限于I型糖尿病、多发性硬化、乳糜泻、原发性胆汁性肝硬化、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、关节炎(包括类风湿性关节炎)、变应性哮喘、炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、气肿、银屑病、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、舍格伦综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关的血管炎和僵人综合征。在另一个方面，疾病相关抗原是肿瘤或癌症相关抗原。
在某些实施方案中，本公开内容的分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物被包括在包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、载体和稀释剂的药物组合物中。在某些实施方案中，将本公开内容的分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物以在无菌溶液中悬浮的方式施用。在某些实施方案中，溶液包含0.9％NaCl。在某些实施方案中，溶液进一步包含以下的一种或多种：缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐和羟甲基氨基甲烷(Tris)；表面活性剂，例如，聚山梨醇酯80(吐温80)、聚山梨醇酯20(吐温20)和泊洛沙姆188；多元醇/二糖/多糖，例如葡萄糖、右旋糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖和葡聚糖40；氨基酸，例如，甘氨酸或精氨酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸、蛋氨酸；或螯合剂，例如，EGTA或EGTA。在某些实施方案中，本公开内容的分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物在施用前被运输/储存、冻干和重构。在某些实施方案中，冻干的分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物制剂包含填充剂，例如甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖或葡聚糖40。冻干的制剂可以包含在由玻璃构成的小瓶中。当配制时，分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物，无论是否重构，均可在一定pH值下缓冲，该pH值通常小于7.0。在某些实施方案中，pH值可介于4.5至6.5、4.5至6.0、4.5至5.5、4.5至5.0或5.0至6.0之间。在某些实施方案中，可以配制分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物用于静脉注射。在某些实施方案中，可以配制分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物用于口服摄入。在某些实施方案中，可以配制分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物用于肠胃外、肌内或组织内注射。在某些实施方案中，可以在没有任何旨在增加或降低免疫应答的免疫佐剂或其他化合物或多肽的情况下，配制和/或施用分离的异二聚体或分离的异二聚体-纳米颗粒复合物。
在另一个方面，本文提供了检测和/或监测免疫细胞群体(优选T细胞群体)的方法，其包括施用标记的抗原-MHC复合物，其中受试者已接受本文公开的异二聚体和/或本文公开的异二聚体-纳米颗粒缀合物。
在某些方面，本文提供了在受试者中以抗原特异性方式检测TR1细胞群体和/或效应T细胞群体的方法，该受试者已接受本文公开的异二聚体和/或本文公开的异二聚体-纳米颗粒缀合物。该方法包括以下步骤，备选地由以下步骤组成，或者进一步基本上由以下步骤组成：使疑似包含TR1细胞的样品与有效量的经标记pMHC复合物接触以形成多聚体复合物，以及检测任何多聚体复合物，从而检测TR1细胞群体。在一些实施方案中，该方法进一步包括使用经标记的多聚体复合物对任何T细胞群体进行染色，备选地进一步由该步骤组成，或进一步基本上由该步骤组成。在一些实施方案中，检测TR1细胞群体的步骤包括用于检测任何多聚体复合物的流式细胞术。在一些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用复合物或组合物，备选地由该步骤组成，或进一步基本上由该步骤组成。
在某些方面，本文提供了在受试者中以抗原特异性方式检测TR1细胞群体和/或效应T细胞群体的方法，该受试者已接受本文公开的异二聚体和/或本文公开的异二聚体-纳米颗粒缀合物。该方法包括以下任何一种测定，备选地由该测定组成，或进一步基本上由该测定组成：细胞因子ELISPOT测定、多聚体指导的表位分析或多聚体下拉测定。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用本文公开的异二聚体和/或本文公开的异二聚体-纳米颗粒缀合物，备选地进一步由该步骤组成，或进一步基本上由该步骤组成。
在其他方面，本文提供了监测受试者中抗原特异性TR1和/或效应T细胞群体扩增的方法。该方法包括以下步骤，备选地由以下步骤组成，或进一步基本上由以下步骤组成：a)向受试者施用有效量的本文公开的异二聚体和/或本文公开的异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中选择pMHC复合物的疾病相关抗原，以扩增抗原特异性TR1和/或效应T细胞；b)从疑似含有该群体的受试者分离出合适的样品；c)使样品与有效量的经标记pMHC复合物接触以形成多聚体复合物，并检测任何多聚体复合物；以及d)对该群体中抗原特异性TR1和/或效应T细胞的数目进行定量。在一些实施方案中，该方法进一步包括对任何多聚体复合物进行染色，备选地进一步由该步骤组成，或进一步基本上由该步骤组成。在一些实施方案中，抗原特异性TR1和/或效应T细胞数目的定量步骤包括流式细胞术和/或ELISA。在一些实施方案中，该方法进一步包括施用本文公开的异二聚体和/或本文公开的异二聚体-纳米颗粒缀合物，备选地进一步由该步骤组成，或进一步基本上由该步骤组成。
可以实现许多类型的免疫测定。本公开内容包含的免疫测定包括但不限于美国专利4,367,110(双单克隆抗体夹心测定)和美国专利4,452,901(Western印迹法)中所描述的。其他测定包括体外和体内的标记配体的免疫沉淀和免疫细胞化学。
循环抗原特异性免疫细胞数的一种定量方法为四聚体测定。在该测定中，特异性表位结合以合成荧光标记的MHC分子的多聚形式。因为免疫细胞识别与MHC分子结合的短肽形式的抗原，因此带有合适的T细胞受体的细胞会与标记的四聚体结合，并且可通过流式细胞术进行定量。尽管此方法比ELISPOT测定节省时间，但是多聚体测定仅测量结合，而不测量功能。并不是所有与特定抗原结合的细胞都必定被活化。然而，已经证明了ELISPOT、多聚体与细胞毒性测定之间的相关性
免疫测定通常是结合测定。某些免疫测定，包括各种类型的酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)或基于珠子的测定，例如技术，是本领域已知的。使用组织切片的免疫组织化学检测也是有用的。
在ELISA的一个实例中，抗体或抗原被固定在选定的表面上，例如聚苯乙烯微量滴定板的孔、试纸或柱支持物。然后，将疑似含有预期抗原或抗体的测试组合物如临床样品添加至孔中。在结合并洗涤以除去非特异性结合免疫复合物之后，可检测所结合的抗原或抗体。检测一般通过添加对预期抗原或抗体有特异性的连接有可检测标记的另一种抗体来实现。这种类型的ELISA被称为“夹心ELISA”。还可以通过添加对预期抗原具有特异性的第二抗体，然后添加对第二抗体具有结合亲和力的第三抗体来实现检测，其中第三抗体与可检测标记连接。ELISA技术的变化是本领域技术人员已知的。
竞争性ELISA也是可行的，其中测试样品与已知量的经标记的抗原或抗体竞争结合。未知样品中反应性物质的量通过在与已包被的孔温育之前或期间将样品与已知的经标记物质混合来确定。该样品中反应性物质的存在减少了可用于与孔结合的经标记物质的量，从而降低了最终的信号。
不论采用什么样的形式，ELISA都具有一些共同特征，如包被、温育或结合，清洗以除去非特异性结合的物质，和检测所结合的免疫复合物。
抗原或抗体还可以与诸如板、珠子、试纸、膜或者柱基质的形式的固体支持物相连，并将待分析的样品应用于已固定的抗原或抗体。在用抗原或抗体包被板时，一般将该板的孔与该抗原或抗体的溶液一起温育过夜或指定的一段时间。然后洗涤该板的孔，以除去不完全吸附的物质。然后用非特异性蛋白质“包被”孔上剩余的任何可用表面，该非特异性蛋白质相对于测试抗血清是抗原中性的。它们包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。所述包被使得固定表面上的非特异性吸附位点被封闭，因此减少了由抗血清非特异性结合至该表面上造成的背景。
在ELISA中，更惯常的是使用第二或第三种检测手段，而不是直接检测。因此，在抗原或抗体与孔结合之后，用非反应性材料包被以减少背景，并且洗涤以除去未结合的材料，在有效允许免疫复合物(抗原/抗体)形成的条件下，固定表面与待检测的临床或生物样品接触。然后，对所述免疫复合物的检测需要标记的第二结合配体或抗体，或者与标记的第三抗体或第三结合配体一起使用的第二结合配体或抗体。
另外，根据细胞表面标志物，可使用流式细胞术检测和定量特定的细胞亚型。采用流式细胞术的常见检测和定量手段包括使用荧光标记的珠子，该珠子结合每种免疫细胞亚型特有的细胞表面标志物，例如CD4特异性珠子，以选择CD4+T细胞等。
本文所述的组合物可以通过注射常规地肠胃外施用，例如静脉内、皮下或肌内注射。静脉内施用的组合物可包括稳定剂、赋形剂和防腐剂。pMHC-纳米颗粒组合物可以悬浮在无菌盐水、缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水中。此外，在某些实施方案中，静脉内制剂包含右旋糖、葡萄糖、甘露醇、pH缓冲剂或碳酸氢钠。适用于其他施用模式的其他制剂包括口服制剂。口服制剂包含通常使用的赋形剂，例如药物等级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放制剂或粉末的形式，并且含有约10％至约95％的活性成分，优选约25％至约70％。根据本公开内容，本领域技术人员将知晓含有改变受试者免疫病况的抗原-MHC-纳米颗粒复合物的水性组合物的制备。在某些实施方案中，组合物可以吸入(例如，美国专利号6,651,655，其特别通过引用整体并入)。在一个实施方案中，全身施用抗原-异二聚体-纳米颗粒复合物(即抗原-pMHC-NP复合物)。在具体的实施方案中，静脉内施用本文所述的pMHC-NP复合物或包含多种本文所述的pMHC-NP复合物的组合物。
实施例
实施例1.具有亮氨酸拉链的肽-MHC(pMHC)复合物的表达。
为了在CHO-S细胞中表达pMHC复合物，将编码pMHC复合物(不同构型，见图2)的DNA片段克隆到pLV/CMV-GW慢病毒表达载体中(图1A和1B)。pMHC复合物的α链和β链二者由单个ORF编码，作为由P2A核糖体跳跃序列分开的两个单独的链(图2，顶部)或作为在两个不同载体中克隆的两个单独的链(图2，底部)。将pMHC编码片段克隆到IRES-EGFP盒的上游。所表达的β链产物由前导序列、表位序列、GS连接体和随后的β链的细胞外结构域和C-Jun片段(40a.a.)组成。所表达的α链含有前导序列、α链的细胞外结构域、C-fos片段(40a.a.)、BirA生物素化位点(14a.a.)和具有C末端半胱氨酸的6X组氨酸和/或Strep标签。优选的载体设计(图2，底部)在单独的质粒上编码两条链。
实施例2.基于孔-突起接合的pMHC的异二聚化。
以下实验描述了开发pMHC异二聚体所做的工作，该pMHC异二聚体用于人的临床用途，具有改善的安全性、功效和调节特性；并且适合于这种临床用途所需的大量纯化。目前包括标准表位标签(例如，FLAG、6xHIS)的生物药物从临床角度来看是不利的，因为表位标签可能引发抗药物抗体的产生。当不同的药物携带相同的标签，或者相同的药物需要后续的施用时，这一点尤其相关。例如，向患者注射使用表位标签X-纯化的药物A可导致针对表位标签X的免疫应答，使相同药物或具有相同表位标签的不同药物的任何后续施用将被第一次施用药物A产生的抗体应答中和。没有表位标签的纯化产生了可溶性MHC II类α-β异二聚体体外分离的问题。这是因为MHC多肽的层析分离技术不能纯化出大量高纯度蛋白质。
因此，寻求开发有利于重组pMHC的纯化的重组MHC II类分子：a)具有增强的CHO细胞分泌；b)无需使用净化标签；并且c)能实现用于四聚体生产的单体生物素化，而无需将生物素化标签引入序列中。最初，寻求产生携带异二聚化亮氨酸拉链但融合成人IgG1Fc的“孔-突起接合”形式的稳定MHC II类异二聚体，使得能够使用蛋白A或蛋白G亲和层析从培养物上清液纯化重组pMHC异二聚体。作为对照，产生了缺少亮氨酸拉链的形式(图3右侧所示)，并且预期会产生不稳定的pMHC异二聚体。选择如上文实施例1所述的构建体(图1A、1B和2)来表达，其中MHC复合物的α和β链由单个ORF编码，编码出由P2A核糖体跳跃序列分开的两个单独的链。还包括BirA生物素化位点(14a.a.)(用于常规的酶基生物素化)、6X组氨酸和Strep标签(如果需要，用于进一步提高制剂的纯度)和C末端半胱氨酸(用于实现与马来酰亚胺官能化纳米颗粒缀合)。然而，需要注意的是，生物素化位点、6X组氨酸和链霉亲和素标签的存在是任选的，并且可以省略，以允许使用蛋白A/G/L来纯化异二聚体。
简言之，将具有和不具有亮氨酸拉链的鼠BDC2.5mi/IAg7或人IGRP13-25/DRB1*0301pMHC II类α链连接至经修饰以包含多肽“突起”的人IgG1的Fc区。同样地，将肽-MHCβ链构建体(具有和不具有亮氨酸拉链)连接至经修饰以包含多肽“孔”的人IgG1的Fc区。SEQ IDNO:1-8和27-34分别提供了相应的pMHC编码盒的DNA和氨基酸序列。
为了表达这些pMHC构建体，首先将含有pMHC基因的质粒与编码HIV病毒核心和用于病毒包装的包膜蛋白的质粒一起转染到293T细胞中。然后将包装的病毒颗粒用于转导CHO-S细胞。然后通过FACS细胞分选来选择表达最高水平的eGFP的转导CHO-S细胞。高eGFP-细胞进一步扩增、储存，然后用作pMHC生产细胞系。
工作聚焦于具有C-Jun/C-Fos亮氨酸拉链或不具有C-Jun/C-Fos亮氨酸拉链的鼠BDC2.5mi/IAg7编码构建体。用构建体转导的这两种CHO细胞系均表达转基因RNA，如通过相应细胞系中高水平eGFP(通过流式细胞术测量)的表达所证明的。图4A显示了用具有C-Jun/C-Fos亮氨酸拉链的BDC2.5mi/IAg7编码构建体转导的CHO细胞402或用不具有C-Jun/C-Fos亮氨酸拉链的BDC2.5mi/IAg7编码构建体转导的CHO细胞404分别与阴性对照CHO细胞401和403的比较。使用透析对来自CHO-S细胞的上清液进行浓缩和清理。使浓缩培养基中的pMHC经历基于蛋白G的亲和层析，并在酸性pH下洗脱。令人惊讶的是，图4C显示，尽管表达RNA信息，表达含有亮氨酸拉链的pMHC孔-突起接合的CHO细胞系产生极低水平的pMHC。参见蛋白G洗脱谱的峰406(图4C)。最出乎意料的是，如图4B所示，表达无拉链pMHC孔-突起接合的细胞系表达了大量的蛋白G结合物质。参见蛋白G洗脱谱的峰405(图4B)。
将通过蛋白G亲和层析收集的无拉链pMHC物质定量，并在非变性和变性SDS-PAGE上使用电泳分析其纯度。图5显示，通过蛋白G亲和层析收集的无拉链pMHC物质在非还原条件下(标记物左侧)作为单一带运行，并且如预期，这些分子物种在变性SDS-PAGE中作为三个单独带运行，该图案与使用基于常规C-Jun/C-Fos亮氨酸拉链的构建体表达的pMHC所观察到的非常相似。非还原条件下的单一带参见501和502，变性条件下的三个带参见503(图5)。
实施例3.pMHC复合物与同源T细胞的结合。
为了测试纯化的无拉链pMHC复合物与同源T细胞特异性结合的能力，将纯化的复合物在体外进行生物素化，随后通过阴离子交换层析纯化。生物素化的级分被合并、透析，并用于使用荧光染料缀合的链霉亲和素制备pMHC四聚体。然后在体外测试这些试剂特异性结合同源T细胞的能力。使用来自表达BDC2.5mi特异性T细胞受体的转基因小鼠的脾CD4+T细胞，其中大多数CD4+T细胞具有相同的抗原特异性(而不是具有高度多克隆的抗原TCR库)。作为阳性对照，使用采用pMHC单体产生的四聚体，该pMHC单体是使用图2中描述的基于C-Jun/C-Fos亮氨酸拉链的构建体表达的。如图6所示，基于无拉链孔-突起接合pMHC的四聚体与其有拉链的非Fc融合对应物有基本相同的表现，证明了这种新方法的可行性。
实施例4.无拉链pMHC与马来酰亚胺官能化纳米颗粒的偶联。
为了确定该无拉链形式的pMHC是否可以通过其C末端游离半胱氨酸有效地偶联至马来酰亚胺官能化纳米颗粒，将PF-Mal纳米颗粒与纯化的蛋白质一起温育，随后使用Miltenyi-Biotec磁柱纯化，以从游离pMHC中除去缀合物。图7的左侧显示了游离pMHC(N1泳道：6μg的2.5mi-孔-突起接合)与pMHC-缀合的纳米颗粒(N2泳道：6.4μL的2.5mi-孔-突起接合-PFM-031716，N3泳道：3.2μL的2.5mi-孔-突起接合-PFM-031716)的非变性凝胶图像。该图显示，制剂中大多数pMHC都偶联至纳米颗粒，而不进入凝胶。图7的右侧显示了SDS-PAGE凝胶图像，其中相同制剂在变性条件(10％SDS-PAGE)下运行，该变性条件将pMHC从纳米颗粒表面分离。泳道1含有蛋白梯，而泳道2含有6μg的2.5mi-孔-突起接合。泳道3含有6.4μL的2.5mi-孔-突起接合-PFM-031716，而泳道4含有3.2μL的2.5mi-孔-突起接合-PFM-031716。该图像清楚地显示，无拉链pMHC的两条链均有效地结合到纳米颗粒表面。pMHC化合价的定量分析表明，每个纳米颗粒上有42个pMHC，该化合价与用常规无拉链pMHC单体获得的化合价相当。
实施例5.使用无拉链pMHC纳米颗粒扩增自动调节T细胞。
用无拉链孔-突起接合pMHC包覆的纳米颗粒在体内触发同源自动调节CD4+T细胞(1型调节性T细胞，TR1)形成和扩增的能力被确定，正如其有拉链的常规pMHC(非孔-突起接合)对应物的情况一样。如图8所示，同源(四聚体+)CD4+T细胞，与其非同源(四聚体阴性)对应物相比，响应于用该化合物的处理而在体内扩增，表达TR1相关mRNA标志物，如通过定量的实时PCR所确定的。图9A和图9B显示，与此结果一致，(四聚体+)CD4+T细胞与其四聚体阴性对应物不同，其在体内扩增，在体外用抗CD3和抗CD28mAb刺激时分泌TR1相关细胞因子。因此，这些无拉链的基于孔-突起接合的pMHC异二聚体具有与有拉链的常规pMHC相似的生物活性。
实施例6.缺乏生物素化(BirA)标签的无拉链pMHC异二聚体的位点定向生物素化。
为了治疗目的而生产的pMHC应该缺少可能是免疫反应性靶标的外来蛋白质序列，如被BirA酶靶向以附接生物素分子的生物素化序列。通过BirA将pMHC生物素化是一种常规用于生产适合于使用链霉亲和素进行四聚化的生物素化pMHC单体的技术。此类pMHC四聚体及其更高级衍生物(五聚体、dextramer等，统称为“多聚体”)可用作能够计算生物样品中抗原特异性T细胞的频率的试剂。这里，在下文描述了一种能够从无生物素化标签的pMHC单体生产pMHC多聚体的方法，使得能够使用为了治疗目的而生产的pMHC单体(例如，待通过纳米颗粒递送)产生其诊断衍生物。
这是通过经由用马来酰亚胺官能化的生物素偶联聚乙二醇(PEG)间隔区将单个生物素分子偶联到BDC2.5mi/IAg7单体的羧基端半胱氨酸而实现的。简言之，将pMHC和不同长度的生物素-PEG-马来酰亚胺连接体温育过夜，然后通过12-14kD截留分子量的膜充分透析，以除去游离的生物素-PEG-马来酰亚胺。使所得混合物经受monoQ柱上的阴离子交换层析(图10)，以通过ELISA鉴定含有生物素化的pMHC分子的洗脱级分。参见图10中1001处的UV吸收峰。然后在变性SDS-PAGE凝胶上分析阳性级分。如图11所示，级分25、27、28、29、30、31、32、33和34含有最高浓度的生物素化pMHC。如图12所示，对MHCα链的蛋白质印迹证实，级分25、27、28、29、30、31、32、33和34包含生物素化的MHC异二聚体。然后将这些级分中包含的pMHC分子进行缓冲液交换，并用于使用荧光染料缀合的链霉亲和素产生pMHC四聚体。然后使用流式细胞术测试这些pMHC四聚体结合BDC2.5T细胞受体转基因CD4+T细胞的能力(图13)。
用不同长度的PEG进行的初始实验是不成功的。令人惊讶的是，使用仅含两个PEG单元的低分子量生物素-PEG-马来酰亚胺的实验产生了成功的结果，表明即使少量游离的、未缀合的生物素-PEG-马来酰亚胺分子的存在也足以干扰四聚体的形成。
实施例7.通过热分解(PFM)合成聚乙二醇化铁纳米颗粒(NP)。
用于合成的材料包括乙酰丙酮铁(III){Fe(acac)3,Fe(C5H7O2)3},M.W.353.17,(Sigma-Aldrich,目录号517003-50G)；二苄醚{(C6H5CH2)2O},M.W.198.26,(Sigma-Aldrich,目录号108014-1KG)；己烷,CH3(CH2)4CH3,M.W.86.18,(Sigma-Aldrich,目录号34859-1L)；FeCl3.6H2O,M.W.270.3,(Sigma-Aldrich,目录号44944-50G)；mPEG2000-马来酰亚胺,(JenKem Tech USA,目录号A3214-10)；
半球形织物加热套，50mL，(Safety Emporium，实验室和安全用品，品目号：20310)；DigiTril II电源控制，(Safety Emporium，实验室和安全用品，品目号：20010)；50mL圆底烧瓶，(VWR，目录号89091-464,24/40接头)；螺旋冷凝器，(VWR，目录号89053-932,24/40接头)；带摆动转子的桌上型离心机，(Beckman Coulter，Allegra 25R离心机)；带SS5转子的高速离心机(Sorvall RC-6Plus，Thermo Scientific)；带有SS5转子适配器的30mL玻璃离心管(Corex，No8445)；LS柱和磁体(Miltenyi Biotech，目录号130-042-041)；透射电镜(H7650，Hitachi)；(Eppendorf，24孔)；分光光度计(UV-2550，SHIMADZU)；以及用于分光光度法的微量比色皿(100μL)。
反应方案：
将50mL烧瓶置于搅拌板的加热套上。加热套与DigiTril II电源控制连接。将PEG2000-马来酰亚胺(1.5g)添加至烧瓶中。温度设定为80℃，加热PEG材料直至PEG材料完全熔化。在搅拌下将二苄醚(3.5mL)和Fe(acac)3(353mg)添加至烧瓶中。将混合物在110℃下脱水1小时。将螺旋冷凝器连接至烧瓶。将混合物加热至260℃。混合物的颜色由深棕色变为黑色。在回流下将混合物的温度保持在260℃，持续2小时，然后将混合物逐渐冷却至室温。向混合物添加无内毒素的水(20mL)。将混合物转移至一个50mL锥形管中，并剧烈涡旋2分钟。用台式离心机将混合物以4,000rpm离心20分钟。丢弃沉淀物。将己烷(15mL)添加至混合物，并将混合物剧烈涡旋2分钟。用台式离心机将混合物以4,000rpm离心10分钟。从每个管收集黑色的水性级分(下面的级分)并转移至50mL的锥形管中。重复三次己烷洗涤。将黑色溶液转移至两个30mL玻璃离心管中。使用高速离心机将每个管以20,000rpm离心20分钟。将黑色溶液转移至50mL的锥形管中，丢弃沉淀物。使用LS柱纯化黑色溶液(例如，加载黑色溶液(2-3mL)用于纯化，溶液通过柱排出，并用5mL水将柱洗涤3次)。通过将保留在LS柱中的NP冲入干净的50mL锥形管中来收集经纯化的PFM NP。PFM NP溶液通过穿过一系列孔径为0.45μm、0.2μm和0.1μm的注射器过滤装置进行灭菌。
产品特性：
1.粒径和单分散性：
1a.单个PFM NP的氧化铁核心大小：透射电镜(TEM)分析。
TEM分析的样品制备：将PFM NP溶液(20μL)在水(40μL)中稀释，并将稀释的PFM NP(10μL)溶液滴在覆盖有聚乙烯基formvar(Electron Microscopy Sciences,目录号FF300-Cu)或碳膜(Electron Microscopy Sciences,目录号CF300-Cu)的铜网表面上。用滤纸除去残留溶液。
使用H7650(Hitachi)在10,000X至40,000X的放大倍数下进行TEM分析。测量30-50个PFM NP的大小，以获得平均大小(平均的PFM NP核心大小预计在18-20nm之间)。
1b.PFM NP的流体动力学大小：
动态光散射(DLS)分析。
将PFM NP溶液(20μL)在DLS比色皿中的1mL水中稀释，并使用Zeta NanoSizer单元(Melvern，UK)检查，以确定溶液中PFM NP的DLS大小。预计在约45-50nm处出现单峰。
2.铁浓度(分光光度分析)：
2a.铁浓度标准：
通过将FeCl3.6H2O(48.3mg)溶解在去离子H2O(5mL)中，制备2mg Fe/mL标准溶液。将标准溶液(20μL)添加至微管1中的6N HCl(400μL)中。将微管1中的经稀释标准溶液(200μL)转移至含有200μL 6N HCl的微管2中。将微管2中的经稀释标准溶液(200μL)转移至含有6N HCl(200μL)的微管3中。稀释额外重复4次。2b.样品溶液：
将PFM NP溶液(20μL)添加至微管S1中的6N HCl(400μL)中并混合。将微管S1中的经稀释PFM NP溶液(200μL)转移至含有6N HCl(200μL)的微管S2中。将微管S2中的经稀释PFM NP溶液(200μL)转移至含有6N HCl(200μL)的微管S3中。PFM NP溶液的稀释额外重复3次。
2c.样品加热：
将含有连续稀释的Fe标准溶液和PFM NP溶液的微管加热至60℃持续30分钟，然后冷却至室温。
2d.分光光度法：
用具有微量比色皿(100μL)的分光光度计测量Fe标准溶液和PFM NP溶液在A410(λ＝410nm)下的吸收。
2e.计算：
绘制标准曲线。计算PFM NP溶液的Fe浓度。
3.表面电荷与表面化学
3a.PFM NP的表面电荷：ζ电位的测量。
在毛细管池中用去离子水(1mL)稀释PFM NP溶液(100μL)。使用Zeta NanoSizer单元(Melvern，UK)测定PFM NP的ζ电位。3b.表面暴露官能团分析：傅立叶变换红外(FT-IR)光谱分析。
对照样品：将mPEG-Mal样品置于ATR(衰减全反射)板上。
PFM NP样品：将PFM NP溶液(10μL)滴在ATR板上并风干。
FT-IR分析：对照PEG和固定在PFM-NP表面上的PEG的FT-IR光谱由Nicolet FT-IR分光光度计在ATR(衰减全反射)模式下生成。每个光谱记录为4cm-1光谱分辨率下256次扫描的平均值。
实施例8.pMHC-纳米颗粒缀合物(pMHC-PFM)的制备。
用于合成的材料包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH值为7.2-7.4；200mM磷酸盐缓冲液，pH值为6.2；PBS中的pMHC-Cys蛋白(1-6mg/mL，通过分子工程将一个半胱氨酸残基添加至pMHCα链的C末端)；1M氯化钠溶液；0.5M EDTA溶液，pH值为8.0；PFM NP溶液(1-3mg Fe/mL)；LS柱和磁体(Miltenyi Biotech,目录号130-042-041)；透射电镜(H7650,Hitachi)；(Eppendorf，24孔)；分光光度计(UV-2550，SHIMADZU)；以及用于分光光度法的微量比色皿(100μL)。
缀合反应方案：
将pMHC-cys蛋白(M.W.约55KD)和PFM NP(18-20nm，约1×1014NP/mg Fe)以100：1的摩尔比在40mM、pH值为6.2且含有150μl mM NaCl和2mM EDTA的磷酸盐缓冲液中混合。反应溶液(含有相当于1-5mg Fe的PFM NP)的总体积为10mL。pMHC蛋白质和PFM-NP二者的回收率预期为40-50％。将pH值为6.2的磷酸盐缓冲液(2.0mL)添加至15mL锥形管中。添加0.5MEDTA溶液(0.04mL)，并添加1M氯化钠溶液以调节至最终浓度为150mM。添加水使最终反应体积达到10mL，该体积包括蛋白质和PFM NP溶液的体积。添加pMHC蛋白质(3mg)。将反应在室温下温育过夜并伴随轻轻摇动。将反应溶液转移至50mL锥形管中，并添加PBS(30mL)。在室温下将反应溶液在温和摇动的条件下温育30分钟。用LS柱来纯化反应溶液(例如，加载反应溶液(5mL)进行纯化，溶液通过柱排出，并用5mL PBS将柱洗涤3次)。通过将保留在LS柱中的NP冲入15mL锥形管中来收集纯化的PFM NP。纯化的pMHC-PFM NP溶液通过穿过孔径为0.45μm的注射器过滤装置进行灭菌。pMHC-PFM NP溶液储存在4℃下。
产物：
在pH值为7.4的PBS中，pMHC化合价为约50pMHC/NP的pMHC-PFM NP。
实施例9.用生物素-PEG-马来酰亚胺将pMHC单体生物素化。
生物素化反应
将蛋白质(尾部具有游离半胱氨酸的II类pMHC)(5.0mg)溶于含有2mM EDTA的pH值为6.2的40mM磷酸盐缓冲液(2.0mL)中。将PBS(190μL)添加至EZ-link马来酰亚胺-PEG2-生物素(2.0mg)中，以制备20mM储备溶液。(Thermo Scientific:目录号21902BID，描述:马来酰亚胺-PEG2-生物素,No-WeighTM形式,8x2mg)(每次新鲜制备)。将储备溶液(78.12μL)快速添加至蛋白质溶液中(这使得马来酰亚胺-PEG2-生物素相对于蛋白质20倍摩尔过量)。反应管用铝箔覆盖以避光，并在室温下、在温和摇动条件下温育过夜。通过使用10KD amicon超离心(Millipore：目录号UFC801024)装置与20mM pH值为8.0的Tris进行缓冲液交换至少5次，除去过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素。为了确保除去过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素，使用12-14KD截留膜(目录号132678)将蛋白质溶液在20mM pH值为8.0的Tris中透析过夜。(过量的马来酰亚胺-PEG2-生物素的污染可能干扰纯化和生物素特异性筛选ELISA)。收集蛋白质样品进行mono-Q纯化。
纯化-Mono-Q IEX层析
将线路A置于缓冲液A[20mM Tris，pH值为8.0]中，将线路B置于缓冲液B[20mMTris+400mM NaCl]中。将ddH2O(10-20mL)注入样品环中，并且除了约0.5mL之外全部手动注入以冲洗样品环。将Mono-Q柱和流动限制器适配器(FR902)附接至FPLC。用缓冲液A使该柱平衡。用20mM pH值为8.0的Tris使蛋白质生物素化反应混合物的体积增加至5-10mL。将混合物注射器注射到超环(super-loop)(INV-900)中。注入样品以与柱结合，洗去未结合的蛋白质，并用缓冲液B的梯度洗脱结合的蛋白质。收集与色谱峰相关的所有洗脱级分。根据制造商的方案，在每次运行后对柱进行洗涤，以0.5mL/min流速洗涤，最少为：2mL 2M NaCl、4mL 1M NaOH以及再次的2mL 2M NaCl。用水洗涤该柱直至线稳定(最少2mL)。根据需要将柱倒置清洗。将线路A和线B置于20％乙醇中，进行PumpWash，然后冲洗该柱以供储存。然后移除柱和限制器，并清除样品环中的任何残留蛋白质。
用于鉴定生物素化单体的ELISA
将ELISA板用由2-20μL(取决于峰强度)收集的每个洗脱级分包被，直至每孔与PBS合计100μl，一式两份。将该板在37℃下温育1-2小时。阳性对照为1：200稀释的抗小鼠Kd-生物素。阴性对照为PBS。将该板用150μl PBS中的0.05％吐温20洗涤3次。每孔添加100μL的HRP-Extravidin(Sigma:目录号E2886-1ML)(在封闭缓冲液(PBS中1％BSA，0.02％NaN3)中的1：2000稀释液)，并将该板在室温下温育30分钟。将该板用150μL PBS中的0.05％吐温20洗涤3次。每孔添加预热的TMB底物(100μL)，并在室温下将该板在黑暗中温育15-30分钟(取决于颜色变化)。每孔添加2N H2SO4(50μL)以终止反应。在OD450-570nm处对板进行评估。阴性对照的OD450-570nm应为约0.005。阳性对照的OD450-570nm应为约3。良好的阳性样品的OD450-570nm读数在2-3之间。
用于鉴定生物素化单体的SDS PAGE和蛋白质印迹
对mono-Q纯化的每个级分(10-20μL/孔，取决于峰强度)运行SDS PAGE，以鉴定具有预期带型的蛋白质级分。蛋白质印迹分析：以每孔2μg每个级分运行另一次SDS PAGE。将凝胶在转移缓冲液中温育15分钟(转移缓冲液：25mM Tris、190mM甘氨酸、20％甲醇，pH值为8.3)。组装转移夹层，并在18V的恒压下转移15分钟。将膜与封闭缓冲液一起温育1小时至过夜(封闭缓冲液：在具有150mM氯化钠的20mM Tris缓冲液中的3％BSA，pH值为7.5)。在室温下将膜在HRP-Extravidin(在封闭缓冲液中以1：2000稀释)中温育1小时。用TBST将膜洗涤5次(TBST：20mM Tris，150mM NaCl，0.1％吐温20，pH值为7.5)。通过添加化学发光底物(Thermo Scientific:目录号34087)获得图像(预期在α链位置处有单一带)。
生物素化单体的收集：
根据ELISA、SDS page和蛋白质印迹分析，合并所需的级分，并使用10KD amicon超离心装置与PBS进行缓冲液交换。通过Bradford方法测量生物素化单体的浓度，并将其等分到几个清晰标记的管中。
使用链霉亲和素-PE制备pMHC四聚体，以染色同源CD4+T细胞，可能是因为过量的游离的、未缀合生物素-PEG-马来酰亚胺分子无法被充分去除，因此干扰了四聚体的形成。材料在-80℃下储存。
实施例10.有Cys阱的无亮氨酸拉链的孔-突起接合pMHC异二聚体使pMHC异二聚体得到稳定
对于一些肽MHC II类异二聚体，孔-突起接合架构是足够的。然而，一些异二聚体需要额外的稳定化。与IGRP13-25多肽复合的HLA DR3异二聚体在用孔-突起接合构建并缺少亮氨酸拉链时无法表达，如图14A的FPLC 1401谱中洗脱峰的缺乏以及图14C所示的洗脱级分的SDS-PAGE凝胶所示。当半胱氨酸在将IGRP多肽连接至孔-β结构域(SEQ ID NO:61)的间隔区之间的IGRP13-25的C末端处引入并与突起-α结构域(SEQ ID NO:60)被表达时，稳定的异二聚体得以形成。参见图14B中的洗脱峰1402和图14D中的SDS-PAGE。
实施例11.IGRP13-25/DR3pMHC异二聚体与表达同源TCR的细胞系结合
接下来，测试了有cys阱的、无拉链的、孔-突起接合的IGRP13-25pMHC-DR3异二聚体结合T细胞受体的能力。为此，使用了表达来自对IGRP13-25pMHC-DR3具有特异性的人T细胞受体的α和β链的报告细胞系。
采用编码IGRP-TCR的逆转录病毒的JURMA-hCD4细胞系的转导方案
GP+EnvAM12包装细胞系的产生。我们用表达IGRP-TCR和GFP报告基因的逆转录病毒，以及gag/pol和VSV包装构建体转染293T细胞。三天后，富集VSV假型的上清液被收获、等分并冷冻。通过旋转感染(2700rpm，1小时)使用这些等分试样转导两性包装细胞系GP+envAm12(ATCC CRL-9641)。经5次旋转感染后，如果需要，针对GFP的表达来分选经转导的GP+envAm12。
用编码IGRP-TCR的逆转录病毒转导JURMA-hCD4细胞系
将3百万个经转导和分选的GP+envAm12铺板到6孔板的每个孔中，最终体积为3ml。次日，将100,000个JURMA-hCD4与预先铺板的经转导GP+envAm12共培养，最终体积为3ml，补充8ug/ml的聚凝胺。在两周内保持这种共培养，每隔2或3天更换培养基。共培养后，收获JURMA-hCD4细胞，通过流式细胞术分析，并针对高转基因表达进行分选。然后用PE标记的异二聚体将细胞染色。图15A描绘了作为阴性对照的未染色细胞。图15D描绘了用不相关的四聚体染色的细胞，图15B描绘了由使用cys阱和亮氨酸拉链技术表达的异二聚体制备的四聚体的染色，图15C描绘了由使用cys阱和孔-突起接合技术表达的异二聚体制备的四聚体，没有亮氨酸拉链。使用任一技术制备的异二聚体的染色都较为稳固。这些数据表明，使用无拉链、有cys阱的孔-突起接合技术制备的异二聚体能够结合T细胞受体。
实施例12.IGRP13-25/DR3孔-突起接合pMHC异二聚体在体外刺激报告细胞系
使用在NFAT启动子控制下表达人IGRP13-25TCR和荧光素酶的Jurma细胞，测试了附接至氧化铁纳米颗粒的有cys阱的、孔-突起接合稳定的异二聚体刺激T细胞信号传导的能力。图16A和图16B所示的这些结果表明，当附接至氧化铁纳米颗粒时，有cys阱的、孔-突起接合稳定的异二聚体能够诱导T细胞信号传导。
尽管已经说明和描述了某些实施方案，但应该理解，本领域普通技术人员可以在不脱离以下权利要求所限定的更广泛方面的技术的情况下在其中进行改变和修改。
本文说明性描述的实施方案可在缺少本文未具体公开的任何一个或多个元素、限制的情况下适当实施。因此，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被开放性地而非限制地解读。此外，本文使用的术语和表达被用作描述的术语而非限制的术语，并且这些术语和表达的使用并非旨在排除所示和所描述特征的任何等同物或其部分，但应认识到，可以在要求保护的技术范围内进行各种修改。此外，短语“基本上由…组成”应理解为包括具体记载的那些元素和那些不会对所要求保护的技术的基本和新颖特性产生实质影响的附加元素。短语“由......组成”排除未指定的任何元素。
本公开内容不限于本申请中描述的特定实施方案。在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以进行许多修改和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。从之前的描述中，除本文列举的那些方法和组合物之外的在本公开内容范围内的功能等同的方法和组合物对于本领域技术人员而言是显而易见的。这些修改和变化旨在落入所附权利要求的范围内。本公开内容仅受所附权利要求的条目以及这些权利要求所赋予的等同物的完整范围的限制。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在限制。
此外，在以马库什组的方式描述本公开内容的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本公开内容也因此可以以马库什组中的任何单个成员或成员亚组的形式进行描述。
如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还涵盖其任何和所有的可能子范围及子范围组合。可以容易地将任何列出的范围认作为充分地描述该范围，并使得该范围能够被分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性示例，本文所讨论的每个范围都可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本领域技术人员还将理解，诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”等所有语言包括所记载的数字，并且指代可以随后被分解成如上所讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。
本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权专利和其他文献均通过引用并入本文，如同特别地且单独地指出每个单独的出版物、专利申请、授权专利或其他文献通过引用以其整体并入。通过引用并入的文本中所包含的定义如与本公开内容中的定义相抵触，则予以排除。
其他实施方案在以下权利要求中阐述。
序列表
<110> 优迪有限合伙公司
<120> 重组pMHC II类分子
<130> 42363-711.601
<140>
<141>
<150> 62/419,947
<151> 2016-11-09
<160> 65
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3171
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 1
atgggttctc tgcaaccgct ggccaccttg tacctgctgg gtatgctggt cgctagcagc 60
ctcggacagc acctgcagaa ggactacaga gcctactaca ccttcggagg tggaggcggc 120
tcaggaggtg gaagcggcgg ctctggggac acccgaccac gtttcttgga gtactctacg 180
tctgagtgtc atttcttcaa tgggacggag cgggtgcggt acctggacag atacttccat 240
aaccaggagg agaacgtgcg cttcgacagc gacgtggggg agttccgggc ggtgacggag 300
ctggggcggc ctgatgccga gtactggaac agccagaagg acctcctgga gcagaagcgg 360
ggccgggtgg acaactactg cagacacaac tacggggttg tggagagctt cacagtgcag 420
cggcgagtcc atcctaaggt gactgtgtat ccttcaaaga cccagcccct gcagcaccat 480
aacctcctgg tctgttctgt gagtggtttc tatccaggca gcattgaagt caggtggttc 540
cggaatggcc aggaagagaa gactggggtg gtgtccacag gcctgatcca caatggagac 600
tggaccttcc agaccctggt gatgctggaa acagttcctc ggagtggaga ggtttacacc 660
tgccaagtgg agcacccaag cgtgacaagc cctctcacag tggaatggag agcacggtct 720
gaatctgcac agagcaagtc cggaggcgga ggcggacgga tcgctcggct agaggaaaaa 780
gtgaaaacct tgaaagcgca aaactccgag ctggcgtcca cggccaacat gctcagggaa 840
caggtggcac agcttaagca gaaagtcatg aaccacgaca aaactcacac atgcccaccg 900
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 960
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 1020
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 1080
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1140
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aagtctccaa caaagccctc 1200
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 1260
tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gagctgcgcg 1320
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1380
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc 1440
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1500
catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc cggcggctcc 1560
ggagccacga acttctctct gttaaagcaa gcaggagacg tggaagaaaa ccccggtccc 1620
atggctatca tctacctcat cctcctgttc accgctgtgc ggggcatcaa agaagaacat 1680
gtgatcatcc aggccgagtt ctatctgaat cctgaccaat caggcgagtt tatgtttgac 1740
tttgatggtg atgagatttt ccatgtggat atggcaaaga aggagacggt ctggcggctt 1800
gaagaatttg gacgatttgc cagctttgag gctcaaggtg cattggccaa catagctgtg 1860
gacaaagcca acctggaaat catgacaaag cgctccaact atactccgat caccaatgta 1920
cctccagagg taactgtgct cacaaacagc cctgtggaac tgagagagcc caacgtcctc 1980
atctgtttca tagacaagtt caccccacca gtggtcaatg tcacgtggct tcgaaatgga 2040
aaacctgtca ccacaggagt gtcagagaca gtcttcctgc ccagggaaga ccaccttttc 2100
cgcaagttcc actatctccc cttcctgccc tcaactgagg acgtttacga ctgcagggtg 2160
gagcactggg gcttggatga gcctcttctc aagcactggg agtttgatgc tccaagccct 2220
ctcccagaga ctacagagtc cggaggcgga ggcggactga cagatacact ccaagcggag 2280
acagatcaac ttgaagacga gaagtctgcg ttgcagaccg agattgccaa tctactgaaa 2340
gagaaggaaa aactggagtt tattttggca gcccacgaca aaactcacac atgcccaccg 2400
tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 2460
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 2520
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 2580
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 2640
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aagtctccaa caaagccctc 2700
ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 2760
tacaccctgc ccccatgccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gtggtgcctg 2820
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 2880
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catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc gggcggtagt 3060
ggtagtggta gtggatctct gggtggtatc ttcgaggcta tgaagatgga gctgcgcgat 3120
caccatcacc atcaccataa ctggagccac cctcagttcg agaagtgttg a 3171
<210> 2
<211> 2931
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 2
atgggttctc tgcaaccgct ggccaccttg tacctgctgg gtatgctggt cgctagcagc 60
ctcggacagc acctgcagaa ggactacaga gcctactaca ccttcggagg tggaggcggc 120
tcaggaggtg gaagcggcgg ctctggggac acccgaccac gtttcttgga gtactctacg 180
tctgagtgtc atttcttcaa tgggacggag cgggtgcggt acctggacag atacttccat 240
aaccaggagg agaacgtgcg cttcgacagc gacgtggggg agttccgggc ggtgacggag 300
ctggggcggc ctgatgccga gtactggaac agccagaagg acctcctgga gcagaagcgg 360
ggccgggtgg acaactactg cagacacaac tacggggttg tggagagctt cacagtgcag 420
cggcgagtcc atcctaaggt gactgtgtat ccttcaaaga cccagcccct gcagcaccat 480
aacctcctgg tctgttctgt gagtggtttc tatccaggca gcattgaagt caggtggttc 540
cggaatggcc aggaagagaa gactggggtg gtgtccacag gcctgatcca caatggagac 600
tggaccttcc agaccctggt gatgctggaa acagttcctc ggagtggaga ggtttacacc 660
tgccaagtgg agcacccaag cgtgacaagc cctctcacag tggaatggag agcacggtct 720
gaatctgcac agagcaagtc cggaggcgga ggcggagaca aaactcacac atgcccaccg 780
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gacaaagcca acctggaaat catgacaaag cgctccaact atactccgat caccaatgta 1800
cctccagagg taactgtgct cacaaacagc cctgtggaac tgagagagcc caacgtcctc 1860
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gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 2280
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<210> 8
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
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atggctatca tctacctcat cctcctgttc accgctgtgc ggggcagatc tgcccaccat 60
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多核苷酸"
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acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 720
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 780
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1080
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agtaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1260
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320
ccgggc 1326
<210> 24
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 24
atggctatca tctacctcat cctcctgttc accgctgtgc ggggcgaaga cgacattgag 60
gccgaccacg taggcttcta tggtacaact gtttatcagt ctcctggaga cattggccag 120
tacacacatg aatttgatgg tgatgagttg ttctatgtgg acttggataa gaagaaaact 180
gtctggaggc ttcctgagtt tggccaattg atactctttg agccccaagg tggactgcaa 240
aacatagctg cagaaaaaca caacttggga atcttgacta agaggtcaaa tttcacccca 300
gctaccaatg aggctcctca agcgactgtg ttccccaagt cccctgtgct gctgggtcag 360
cccaacaccc ttatctgctt tgtggacaac atcttcccac ctgtgatcaa catcacatgg 420
ctcagaaata gcaagtcagt cacagacggc gtttatgaga ccagcttcct cgtcaaccgt 480
gaccattcct tccacaagct gtcttatctc accttcatcc cttctgatga tgacatttat 540
gactgcaagg tggagcactg gggcctggag gagccggttc tgaaacactg ggaacctgag 600
attccagccc ccatgtcaga gctgacagag tccggaggcg gaggcggaga caaaactcac 660
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 720
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 780
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020
gaaccacagg tgtgcaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1080
ctgagctgcg cggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200
ttcctcgtca gcaagctcac cgtggacaag agtaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1260
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320
cccggc 1326
<210> 25
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 25
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 240
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 300
tgcaaagtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 360
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtgcacc ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag 420
aaccaggtca gcctgagctg cgcggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 480
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
gacggctcct tcttcctcgt cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 600
aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac acagaagagc 660
ctctccctgt ctcccggc 678
<210> 26
<211> 678
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 26
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 60
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 120
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 180
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gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat gccgggatga gctgaccaag 420
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tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 540
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ctctccctgt ctccgggc 678
<210> 27
<211> 1056
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 27
Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu
1 5 10 15
Val Ala Ser Ser Leu Gly Gln His Leu Gln Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr
20 25 30
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Asp Thr Arg Pro Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His
50 55 60
Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Tyr Leu Asp Arg Tyr Phe His
65 70 75 80
Asn Gln Glu Glu Asn Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg
85 90 95
Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln
100 105 110
Lys Asp Leu Leu Glu Gln Lys Arg Gly Arg Val Asp Asn Tyr Cys Arg
115 120 125
His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val His
130 135 140
Pro Lys Val Thr Val Tyr Pro Ser Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His
145 150 155 160
Asn Leu Leu Val Cys Ser Val Ser Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu
165 170 175
Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser
180 185 190
Thr Gly Leu Ile His Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met
195 200 205
Leu Glu Thr Val Pro Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu
210 215 220
His Pro Ser Val Thr Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser
225 230 235 240
Glu Ser Ala Gln Ser Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Arg Ile Ala Arg
245 250 255
Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala
260 265 270
Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys
275 280 285
Val Met Asn His Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
290 295 300
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
305 310 315 320
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
325 330 335
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
340 345 350
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
355 360 365
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
370 375 380
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
385 390 395 400
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
405 410 415
Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
420 425 430
Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
435 440 445
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
450 455 460
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser
465 470 475 480
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
485 490 495
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
500 505 510
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
515 520 525
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Ile Ile
530 535 540
Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Ile Lys Glu Glu His
545 550 555 560
Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu
565 570 575
Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala
580 585 590
Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser
595 600 605
Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn
610 615 620
Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val
625 630 635 640
Pro Pro Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu
645 650 655
Pro Asn Val Leu Ile Cys Phe Ile Asp Lys Phe Thr Pro Pro Val Val
660 665 670
Asn Val Thr Trp Leu Arg Asn Gly Lys Pro Val Thr Thr Gly Val Ser
675 680 685
Glu Thr Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His
690 695 700
Tyr Leu Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val
705 710 715 720
Glu His Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Asp
725 730 735
Ala Pro Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Ser Gly Gly Gly Gly Gly
740 745 750
Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys
755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
805 810 815
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820 825 830
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
835 840 845
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
850 855 860
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
865 870 875 880
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
885 890 895
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
945 950 955 960
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
965 970 975
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980 985 990
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly
1010 1015 1020
Ser Gly Ser Leu Gly Gly Ile Phe Glu Ala Met Lys Met Glu Leu
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Arg Asp His His His His His His Asn Trp Ser His Pro Gln Phe
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Glu Lys Cys
1055
<210> 28
<211> 976
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 28
Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu
1 5 10 15
Val Ala Ser Ser Leu Gly Gln His Leu Gln Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr
20 25 30
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Asp Thr Arg Pro Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His
50 55 60
Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Tyr Leu Asp Arg Tyr Phe His
65 70 75 80
Asn Gln Glu Glu Asn Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg
85 90 95
Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln
100 105 110
Lys Asp Leu Leu Glu Gln Lys Arg Gly Arg Val Asp Asn Tyr Cys Arg
115 120 125
His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val His
130 135 140
Pro Lys Val Thr Val Tyr Pro Ser Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His
145 150 155 160
Asn Leu Leu Val Cys Ser Val Ser Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu
165 170 175
Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser
180 185 190
Thr Gly Leu Ile His Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met
195 200 205
Leu Glu Thr Val Pro Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu
210 215 220
His Pro Ser Val Thr Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser
225 230 235 240
Glu Ser Ala Gln Ser Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
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370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser
465 470 475 480
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu
485 490 495
Asn Pro Gly Pro Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala
500 505 510
Val Arg Gly Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr
515 520 525
Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp
530 535 540
Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu
545 550 555 560
Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala
565 570 575
Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Ile Met Thr Lys Arg Ser
580 585 590
Asn Tyr Thr Pro Ile Thr Asn Val Pro Pro Glu Val Thr Val Leu Thr
595 600 605
Asn Ser Pro Val Glu Leu Arg Glu Pro Asn Val Leu Ile Cys Phe Ile
610 615 620
Asp Lys Phe Thr Pro Pro Val Val Asn Val Thr Trp Leu Arg Asn Gly
625 630 635 640
Lys Pro Val Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr Val Phe Leu Pro Arg Glu
645 650 655
Asp His Leu Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu Pro Phe Leu Pro Ser Thr
660 665 670
Glu Asp Val Tyr Asp Cys Arg Val Glu His Trp Gly Leu Asp Glu Pro
675 680 685
Leu Leu Lys His Trp Glu Phe Asp Ala Pro Ser Pro Leu Pro Glu Thr
690 695 700
Thr Glu Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
705 710 715 720
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
725 730 735
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740 745 750
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
755 760 765
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
770 775 780
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
785 790 795 800
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
805 810 815
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
820 825 830
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835 840 845
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850 855 860
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900 905 910
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His His His His His His Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Cys
965 970 975
<210> 29
<211> 1055
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 29
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Arg
1 5 10 15
Ser Ala His His Pro Ile Trp Ala Arg Met Asp Ala Gly Gly Gly Gly
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130 135 140
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180 185 190
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro
195 200 205
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210 215 220
Ser Pro Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser
225 230 235 240
Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val
245 250 255
Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met
260 265 270
Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Asp
275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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420 425 430
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
435 440 445
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450 455 460
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485 490 495
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565 570 575
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580 585 590
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645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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690 695 700
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740 745 750
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<221> 来源
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<221> 来源
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<220>
<221> 来源
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 40
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 40
Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu
1 5 10 15
Val Ala Ser Ser Leu Gly Gln His Leu Gln Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr
20 25 30
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Asp Thr Arg Pro Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His
50 55 60
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65 70 75 80
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Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser
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His Pro Ser Val Thr Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser
225 230 235 240
Glu Ser Ala Gln Ser Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
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340 345 350
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 41
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 41
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Ile
1 5 10 15
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20 25 30
Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His
35 40 45
Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly
50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 42
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Ile
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
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Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Arg
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Ser Ala His His Pro Ile Trp Ala Arg Met Asp Ala Gly Gly Gly Gly
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Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val
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Gly
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 44
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Arg
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Ser Ala His His Pro Ile Trp Ala Arg Met Asp Ala Gly Gly Gly Gly
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Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ser Glu
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Ser Pro Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser
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Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val
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Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Asp
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Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
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Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
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Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
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Gly
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<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 45
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Glu
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Lys Ser Val Thr Asp Gly Val Tyr Glu Thr Ser Phe Leu Val Asn Arg
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Asp Asp Ile Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Glu Glu Pro
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly
<210> 46
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 46
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Glu
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435 440 445
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Pro Gly
<210> 47
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 47
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Arg
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165 170 175
Asn Gly Gln Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg
180 185 190
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro
195 200 205
His Gln Gly Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys
210 215 220
Ser Pro Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser
225 230 235 240
Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 48
<211> 473
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 48
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Arg
1 5 10 15
Ser Ala His His Pro Ile Trp Ala Arg Met Asp Ala Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ser Glu
35 40 45
Arg His Phe Val His Gln Phe Lys Gly Glu Cys Tyr Phe Thr Asn Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Tyr Leu Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg Ala Val Thr Glu
85 90 95
Leu Gly Arg His Ser Ala Glu Tyr Tyr Asn Lys Gln Tyr Leu Glu Arg
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130 135 140
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165 170 175
Asn Gly Gln Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr Gln Leu Ile Arg
180 185 190
Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu Glu Met Thr Pro
195 200 205
His Gln Gly Glu Val Tyr Thr Cys His Val Glu His Pro Ser Leu Lys
210 215 220
Ser Pro Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu Ser Ala Arg Ser
225 230 235 240
Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470
<210> 49
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 49
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Glu
1 5 10 15
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20 25 30
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65 70 75 80
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Asp His Ser Phe His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile Pro Ser Asp
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Val Leu Lys His Trp Glu Pro Glu Ile Pro Ala Pro Met Ser Glu Leu
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210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440
<210> 50
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 50
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Glu
1 5 10 15
Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Thr Thr Val Tyr
20 25 30
Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly Asp
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Asp His Ser Phe His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile Pro Ser Asp
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Asp Asp Ile Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Glu Glu Pro
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Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
275 280 285
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
290 295 300
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
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Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
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Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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<210> 51
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 51
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
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165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 52
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<210> 53
<211> 226
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 53
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
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Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 54
<211> 106
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp
1 5 10 15
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
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<211> 113
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
1 5 10 15
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
20 25 30
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
35 40 45
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
50 55 60
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65 70 75 80
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
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Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
100 105 110
Lys
<210> 56
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 56
Gln His Leu Gln Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Asp Thr Arg Pro Arg
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Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His Phe Phe Asn Gly Thr Glu
35 40 45
Arg Val Arg Tyr Leu Asp Arg Tyr Phe His Asn Gln Glu Glu Asn Val
50 55 60
Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg Ala Val Thr Glu Leu Gly
65 70 75 80
Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln Lys Asp Leu Leu Glu Gln
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Lys Arg Gly Arg Val Asp Asn Tyr Cys Arg His Asn Tyr Gly Val Val
100 105 110
Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val His Pro Lys Val Thr Val Tyr
115 120 125
Pro Ser Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His Asn Leu Leu Val Cys Ser
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Val Ser Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu Val Arg Trp Phe Arg Asn
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Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser Thr Gly Leu Ile His Asn
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Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met Leu Glu Thr Val Pro Arg
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Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu His Pro Ser Val Thr Ser
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<210> 57
<211> 191
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro
1 5 10 15
Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe
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His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe
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Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala
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Thr Thr Gly Val Ser Glu Thr Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu
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Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val
145 150 155 160
Tyr Asp Cys Arg Val Glu His Trp Gly Leu Asp Glu Pro Leu Leu Lys
165 170 175
His Trp Glu Phe Asp Ala Pro Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu
180 185 190
<210> 58
<211> 198
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 58
Gly Asp Ser Glu Arg His Phe Val His Gln Phe Lys Gly Glu Cys Tyr
1 5 10 15
Phe Thr Asn Gly Thr Gln Arg Ile Arg Leu Val Thr Arg Tyr Ile Tyr
20 25 30
Asn Arg Glu Glu Tyr Leu Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Tyr Arg
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Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg His Ser Ala Glu Tyr Tyr Asn Lys Gln
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Tyr Leu Glu Arg Thr Arg Ala Glu Leu Asp Thr Ala Cys Arg His Asn
65 70 75 80
Tyr Glu Glu Thr Glu Val Pro Thr Ser Leu Arg Arg Leu Glu Gln Pro
85 90 95
Asn Val Ala Ile Ser Leu Ser Arg Thr Glu Ala Leu Asn His His Asn
100 105 110
Thr Leu Val Cys Ser Val Thr Asp Phe Tyr Pro Ala Lys Ile Lys Val
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Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln Glu Glu Thr Val Gly Val Ser Ser Thr
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Gln Leu Ile Arg Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Val Leu Val Met Leu
145 150 155 160
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Pro Ser Leu Lys Ser Pro Ile Thr Val Glu Trp Arg Ala Gln Ser Glu
180 185 190
Ser Ala Arg Ser Lys Ser
195
<210> 59
<211> 196
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 59
Glu Asp Asp Ile Glu Ala Asp His Val Gly Phe Tyr Gly Thr Thr Val
1 5 10 15
Tyr Gln Ser Pro Gly Asp Ile Gly Gln Tyr Thr His Glu Phe Asp Gly
20 25 30
Asp Glu Leu Phe Tyr Val Asp Leu Asp Lys Lys Lys Thr Val Trp Arg
35 40 45
Leu Pro Glu Phe Gly Gln Leu Ile Leu Phe Glu Pro Gln Gly Gly Leu
50 55 60
Gln Asn Ile Ala Ala Glu Lys His Asn Leu Gly Ile Leu Thr Lys Arg
65 70 75 80
Ser Asn Phe Thr Pro Ala Thr Asn Glu Ala Pro Gln Ala Thr Val Phe
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Pro Lys Ser Pro Val Leu Leu Gly Gln Pro Asn Thr Leu Ile Cys Phe
100 105 110
Val Asp Asn Ile Phe Pro Pro Val Ile Asn Ile Thr Trp Leu Arg Asn
115 120 125
Ser Lys Ser Val Thr Asp Gly Val Tyr Glu Thr Ser Phe Leu Val Asn
130 135 140
Arg Asp His Ser Phe His Lys Leu Ser Tyr Leu Thr Phe Ile Pro Ser
145 150 155 160
Asp Asp Asp Ile Tyr Asp Cys Lys Val Glu His Trp Gly Leu Glu Glu
165 170 175
Pro Val Leu Lys His Trp Glu Pro Glu Ile Pro Ala Pro Met Ser Glu
180 185 190
Leu Thr Glu Ser
195
<210> 60
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 60
Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Thr Ala Val Arg Gly Ile
1 5 10 15
Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr Leu Asn Pro Asp
20 25 30
Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp Glu Ile Phe His
35 40 45
Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu Glu Glu Phe Gly
50 55 60
Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val
65 70 75 80
Asp Lys Ala Asn Leu Glu Cys Met Thr Lys Arg Ser Asn Tyr Thr Pro
85 90 95
Ile Thr Asn Val Pro Pro Glu Val Thr Val Leu Thr Asn Ser Pro Val
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Thr Gly Val Ser Glu Thr Val Phe Leu Pro Arg Glu Asp His Leu Phe
145 150 155 160
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Trp Glu Phe Asp Ala Pro Ser Pro Leu Pro Glu Thr Thr Glu Ser Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
210 215 220
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
275 280 285
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290 295 300
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
305 310 315 320
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
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355 360 365
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Leu Gly
435 440 445
Gly Ile Phe Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Arg Asp His His His His
450 455 460
His His Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Cys
465 470 475
<210> 61
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 61
Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu
1 5 10 15
Val Ala Ser Ser Leu Gly Gln His Leu Gln Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr
20 25 30
Tyr Thr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Asp Thr Arg Pro Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His
50 55 60
Phe Phe Asn Gly Thr Glu Arg Val Arg Tyr Leu Asp Arg Tyr Phe His
65 70 75 80
Asn Gln Glu Glu Asn Val Arg Phe Asp Ser Asp Val Gly Glu Phe Arg
85 90 95
Ala Val Thr Glu Leu Gly Arg Pro Asp Ala Glu Tyr Trp Asn Ser Gln
100 105 110
Lys Asp Leu Leu Glu Gln Lys Arg Gly Arg Val Asp Asn Tyr Cys Arg
115 120 125
His Asn Tyr Gly Val Val Glu Ser Phe Thr Val Gln Arg Arg Val His
130 135 140
Pro Lys Val Thr Val Tyr Pro Ser Lys Thr Gln Pro Leu Gln His His
145 150 155 160
Asn Leu Leu Val Cys Ser Val Ser Gly Phe Tyr Pro Gly Ser Ile Glu
165 170 175
Val Arg Trp Phe Arg Asn Gly Gln Glu Glu Lys Thr Gly Val Val Ser
180 185 190
Thr Gly Leu Ile His Asn Gly Asp Trp Thr Phe Gln Thr Leu Val Met
195 200 205
Leu Glu Thr Val Pro Arg Ser Gly Glu Val Tyr Thr Cys Gln Val Glu
210 215 220
His Pro Ser Val Thr Ser Pro Leu Thr Val Glu Trp Arg Ala Arg Ser
225 230 235 240
Glu Ser Ala Gln Ser Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 62
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 62
Met Met Ser Phe Val Ser Leu Leu Leu Val Gly Ile Leu Phe His Ala
1 5 10 15
Thr Gln Ala Ile Lys Glu Glu His Val Ile Ile Gln Ala Glu Phe Tyr
20 25 30
Leu Asn Pro Asp Gln Ser Gly Glu Phe Met Phe Asp Phe Asp Gly Asp
35 40 45
Glu Ile Phe His Val Asp Met Ala Lys Lys Glu Thr Val Trp Arg Leu
50 55 60
Glu Glu Phe Gly Arg Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala
65 70 75 80
Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Glu Met Thr Lys Arg Ser Asn
85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Phe Arg Lys Phe His Tyr Leu Pro Phe Leu Pro Ser Thr Glu Asp Val
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
225 230 235 240
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
245 250 255
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
260 265 270
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Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
325 330 335
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Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
370 375 380
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
405 410 415
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420 425 430
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Ser Gly Ser Cys
435 440
<210> 63
<211> 478
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多肽"
<400> 63
Met Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Thr Leu Tyr Leu Leu Gly Met Leu
1 5 10 15
Val Ala Ser Ser Leu Gly Gln His Leu Gln Lys Asp Tyr Arg Ala Tyr
20 25 30
Tyr Thr Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
35 40 45
Gly Asp Thr Arg Pro Arg Phe Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Glu Cys His
50 55 60
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65 70 75 80
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260 265 270
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275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
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325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
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435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
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465 470 475
<210> 64
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 64
atgatgagct tcgtgagcct gctgctggtg ggcatcctgt tccacgccac ccaggccatc 60
aaagaagaac atgtgatcat ccaggccgag ttctatctga atcctgacca atcaggcgag 120
tttatgtttg actttgatgg tgatgagatt ttccatgtgg atatggcaaa gaaggagacg 180
gtctggcggc ttgaagaatt tggacgattt gccagctttg aggctcaagg tgcattggcc 240
aacatagctg tggacaaagc caacctggaa tgcatgacaa agcgctccaa ctatactccg 300
atcaccaatg tacctccaga ggtaactgtg ctcacaaaca gccctgtgga actgagagag 360
cccaacgtcc tcatctgttt catagacaag ttcaccccac cagtggtcaa tgtcacgtgg 420
cttcgaaatg gaaaacctgt caccacagga gtgtcagaga cagtcttcct gcccagggaa 480
gaccaccttt tccgcaagtt ccactatctc cccttcctgc cctcaactga ggacgtttac 540
gactgcaggg tggagcactg gggcttggat gagcctcttc tcaagcactg ggagtttgat 600
gctccaagcc ctctcccaga gactacagag tccggaggcg gaggcggaga caaaactcac 660
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 720
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 780
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 840
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 900
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 960
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1020
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatgc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1080
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1140
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1200
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agtaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1260
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacac agaagagcct ctccctgtct 1320
ccgggcggta gtggtagttg ttga 1344
<210> 65
<211> 1437
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /备注="人工序列的描述：合成
多核苷酸"
<400> 65
atgggttctc tgcaaccgct ggccaccttg tacctgctgg gtatgctggt cgctagcagc 60
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aaccaggagg agaacgtgcg cttcgacagc gacgtggggg agttccgggc ggtgacggag 300
ctggggcggc ctgatgccga gtactggaac agccagaagg acctcctgga gcagaagcgg 360
ggccgggtgg acaactactg cagacacaac tacggggttg tggagagctt cacagtgcag 420
cggcgagtcc atcctaaggt gactgtgtat ccttcaaaga cccagcccct gcagcaccat 480
aacctcctgg tctgttctgt gagtggtttc tatccaggca gcattgaagt caggtggttc 540
cggaatggcc aggaagagaa gactggggtg gtgtccacag gcctgatcca caatggagac 600
tggaccttcc agaccctggt gatgctggaa acagttcctc ggagtggaga ggtttacacc 660
tgccaagtgg agcacccaag cgtgacaagc cctctcacag tggaatggag agcacggtct 720
gaatctgcac agagcaagtc cggaggcgga ggcggagaca aaactcacac atgcccaccg 780
tgcccagcac ctgaagccgc ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 900
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1020
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aagtctccaa caaagccctc 1080
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tgcaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gagctgcgcg 1200
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aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctcgtcagc 1320
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1380
catgaggctc tgcacaacca ctacacacag aagagcctct ccctgtctcc cggctga 1437

Claims (42)

1.一种分离的异二聚体，其包含至少一种第一多肽和至少一种第二多肽，其中所述第一多肽和所述第二多肽在界面处相遇，其中所述第一多肽的所述界面包含工程化凸起，所述工程化凸起可定位于所述第二多肽的所述界面的工程化空腔中；并且
(i)所述第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者
(ii)所述第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合。
2.如权利要求1所述的分离的异二聚体，其中所述凸起包含一个或多个非天然存在的氨基酸残基。
3.如权利要求1或2所述的分离的异二聚体，其中所述凸起包含选自苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的异二聚体，其中所述分离的异二聚体的所述第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:53所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
5.如权利要求4所述的分离的异二聚体，其中所述分离的异二聚体的所述第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:54所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
6.如权利要求1所述的分离的异二聚体，其中所述分离的异二聚体的所述第一或第二多肽包含CH3结构域，并且所述CH3结构域包含选自S354C、T366W以及S354C和T366W二者(EU编号)的至少一种突变。
7.如权利要求1所述的分离的异二聚体，其中所述空腔包含非天然存在的氨基酸残基。
8.如权利要求1或7所述的分离的异二聚体，其中所述空腔包含选自丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸和半胱氨酸的一个或多个氨基酸。
9.如权利要求1、7或8中任一项所述的分离的异二聚体，其中所述分离的异二聚体的所述第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:51所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
10.如权利要求9所述的分离的异二聚体，其中所述分离的异二聚体的所述第一或第二多肽包含与SEQ ID NO:52所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的分离的异二聚体，其中所述分离的异二聚体的所述第一或第二多肽包含CH3结构域，并且所述CH3结构域包含选自Y349C、T366S、L368A、Y407V(EU编号)及其组合的至少一种突变。
12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的异二聚体，其中所述第一多肽或所述第二多肽之一或二者不包含异源二聚化结构域。
13.如权利要求1至11中任一项所述的分离的异二聚体，其中所述第一多肽或所述第二多肽之一或二者不包含亮氨酸拉链。
14.如权利要求1至11中任一项所述的分离的异二聚体，其中所述第一多肽或所述第二多肽之一或二者不包含位点特异性生物素化位点。
15.如权利要求1至14中任一项所述的分离的异二聚体，其进一步包含自身免疫疾病相关的抗原。
16.如权利要求15所述的分离的异二聚体，其中所述疾病相关的抗原包含长度至少为11个氨基酸的多肽。
17.如权利要求15或16所述的分离的异二聚体，其中所述自身免疫疾病相关的抗原通过柔性连接体连接至所述MHC II类α1结构域或所述MHC II类β1结构域。
18.如权利要求15至17中任一项所述的分离的异二聚体，其中所述抗原通过二硫键共价连接至所述MHC II类α1结构域或所述MHC II类β1结构域，所述二硫键在与抗原肽缔合的半胱氨酸氨基酸与所述MHC II类α1结构域或所述MHC II类β1结构域的半胱氨酸氨基酸之间形成。
19.如权利要求18所述的分离的异二聚体，其中所述MHC II类α1结构域或所述MHC II类β1结构域的所述半胱氨酸氨基酸在形成MHC II类结合沟的一部分的残基的10个氨基酸内。
20.如权利要求19所述的分离的异二聚体，其中所述MHC II类α1结构域或所述MHC II类β1结构域的半胱氨酸残基在形成所述MHC II类结合沟的一部分的残基的3个氨基酸内。
21.如权利要求18至20中任一项所述的分离的异二聚体，其中所述MHC II类α1结构域或所述MHC II类β1结构域的所述半胱氨酸氨基酸已被引入所述MHC II类α1结构域或所述MHC II类β1结构域的天然存在序列中。
22.如权利要求1至21中任一项所述的分离的异二聚体，其用于治疗被诊断或疑似患有自身免疫疾病的个体。
23.一种编码如权利要求1至21中任一项所述的第一或第二多肽的多核苷酸。
24.一种包含如权利要求23所述的多核苷酸序列的宿主细胞。
25.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述多核苷酸稳定整合到基因组中。
26.如权利要求1至21中任一项所述的分离的异二聚体，其中至少一个异二聚体缀合至纳米颗粒，以形成异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中所述纳米颗粒是非脂质体的并且/或者具有固体核心。
27.如权利要求26所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中所述固体核心是金核心、铁核心或氧化铁核心。
28.如权利要求26或27所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中所述固体核心的直径小于100纳米。
29.如权利要求26至28中任一项所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中所述至少一个异二聚体共价连接至所述纳米颗粒。
30.如权利要求29所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中所述至少一个异二聚体通过包含聚乙二醇(PEG)的连接体共价连接至所述纳米颗粒。
31.如权利要求30所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中所述聚乙二醇用马来酰亚胺官能化。
32.如权利要求31所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物，其中所述聚乙二醇小于5kD。
33.一种包含如权利要求26至32中任一项所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物，以及药物赋形剂、稳定剂或稀释剂的药物组合物。
34.如权利要求26至32中任一项所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物或如权利要求33所述的药物组合物在治疗自身免疫疾病或炎症病况的方法中的用途。
35.一种治疗自身免疫疾病或炎症病况的方法，其包括向个体施用如权利要求26至32中任一项所述的异二聚体-纳米颗粒缀合物或如权利要求33所述的药物组合物。
36.一种制备包含第一多肽和第二多肽的异二聚体的方法，其中
所述第一多肽和所述第二多肽在界面处相遇，其中所述第一多肽的所述界面包含工程化凸起，所述工程化凸起可定位于所述第二多肽的所述界面的工程化空腔中；并且
(i)所述第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者
(ii)所述第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；
所述方法包括以下步骤：
(iii)培养包含核酸的宿主细胞，所述核酸编码所述第一多肽和所述第二多肽及其所述界面，其中编码所述第一多肽的所述界面的核酸已经从编码所述第一多肽的原始界面的核酸改变以编码所述凸起，编码所述第二多肽的所述界面的核酸已经从编码所述第二多肽的原始界面的核酸改变以编码所述空腔，或两者兼有，并且其中所述培养使所述第一多肽和第二多肽表达；以及
(iv)从所述宿主细胞的培养物回收和纯化所述异二聚体。
37.一种制备包含第一多肽和第二多肽的异二聚体的方法，其中
所述第一多肽和所述第二多肽在界面处相遇，其中所述第一多肽的所述界面包含工程化凸起，所述工程化凸起可定位于所述第二多肽的所述界面的工程化空腔中；并且
(i)所述第一多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；或者
(ii)所述第一多肽包含MHC II类β1结构域、MHC II类β2结构域或其组合；并且所述第二多肽包含MHC II类α1结构域、MHC II类α2结构域或其组合；
所述方法包括以下步骤：
(iii)培养包含编码所述第一多肽的核酸的第一宿主细胞；
(iv)培养包含编码所述第二多肽的核酸的第二宿主细胞；
(v)从所述宿主细胞的培养物回收所述第一和第二多肽；以及
(vi)通过将所述第一和第二多肽一起温育而形成所述异二聚体；
其中编码所述第一多肽的所述界面的核酸已经从编码所述第一多肽的原始界面的核酸改变以编码所述凸起，编码所述第二多肽的所述界面的核酸已经从编码所述第二多肽的原始界面的核酸改变以编码所述空腔，或两者兼有。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中编码所述第一多肽和所述第二多肽的所述核酸稳定整合到所述宿主细胞的基因组中。
39.如权利要求36所述的方法，其中所述宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
40.如权利要求37所述的方法，其中所述第一和第二宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
41.如权利要求36至40中任一项所述的方法，其中从所述宿主细胞的培养物回收所述多肽包括将包含所述异二聚体的液体应用于液相层析柱。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述液相层析柱包含蛋白A、蛋白G、蛋白L或其任何组合。
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