KR20200004807A - 나노의약에서 수용체-리간드 상호작용의 효능을 측정하기 위한 어세이 - Google Patents

나노의약에서 수용체-리간드 상호작용의 효능을 측정하기 위한 어세이 Download PDF

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Abstract

MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 TCR 경로 의존적 리포터를 포함하는 단리된 세포가 본원에 기재된다. 자가면역 질환 또는 암을 치료하기 위한 의약으로서 사용될 수 있는 나노입자에 커플링된 펩타이드-주조직적합성 복합체(pMHC)(pMHC-NP)의 기능 또는 효능을 측정하기 위한 어세이로서 상기 단리된 세포를 사용하는 방법도 기재된다.

Description

나노의약에서 수용체-리간드 상호작용의 효능을 측정하기 위한 어세이
[관련 출원의 교차참조]
본원은, 전체로서 본원에 참고로 도입된, 2017년 4월 7일에 출원된 미국 가출원 제62/483,298호의 우선권의 이익을 주장한다.
자가면역 질환, 예컨대, 1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염은 불완전하게 정의된 자가항원 목록에 있는 수많은 항원성 에피토프들을 인식하는 T 세포 및 B 세포를 수반하는 만성 자가면역 반응으로부터 비롯된다(Santamaria, P. (2010) Immunity 32:437-445; Babbe, H. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:393-404; Firestein, G.S. (2003) Nature 423:356-361). 전신 면역을 손상시키지 않으면서 각각의 개별 자가면역 장애에서 (공지되어 있거나 공지되어 있지 않은) 모든 다중클론 자가반응성 T 세포 특이성들을 제거하거나 억제하는 것은 현재 가능하지 않다.
항원-주조직적합성 복합체(pMHC) 분자와 커플링된 나노입자가 생체내에서 1형 조절 T(TR1) 세포의 재프로그래밍 및 증폭을 유발할 수 있다는 것은 최근에 발견되었다. PCT 출원 제PCT/IB2016/000691호를 참조한다. 그러나, 안정한 항원 특이적 T 세포 클론에 대한 필요성, 일차 세포의 사용과 관련된 매우 가변적인 실험간 가변성, 및 항원 수용체 유발 사건과 관련 없는 판독의 좋지 않은 정량적 실험간 재현성을 고려할 때, 시험관내 pMHC-커플링된 나노입자 또는 나노입자에 커플링되지 않은 pMHC 복합체의 생물학적 및 광범위한 효능을 측정하는 고처리율 방법은 없다. 추가로, 당분야의 방법들(예를 들면, 웨스턴 블롯팅을 통해 측정된 반정량적 근위 TCR 신호전달 사건)은 농도 범위에 걸쳐 나노입자의 pMHC 밀도와 생물학적 활성 사이의 복잡한 관계를 엄밀히 모방할 수 없다. 결과적으로, 이 방법들은 특정 제제가 최적 생물학적 반응을 생성하기에 충분한 품질의 제제인지를 정확히 예측할 수 없다. 따라서, pMHC의 아고니스트 또는 광범위한 효능을 측정하는 시험관내 방법을 개발할 필요성이 당분야에 존재한다. 본 개시는 이 필요성을 충족시키고 관련 장점도 제공한다.
자가면역 질환, 예컨대, 1형 당뇨병(T1D), 다발성 경화증 및 류마티스성 관절염은 불안전하게 정의된 자가항원 목록에 있는 다수의 항원성 에피토프들을 인식하는 T 세포 및 B 세포를 수반하는 만성 자가면역 반응으로부터 비롯된다(Santamaria, P. (2010) Immunity 32:437-445; Babbe, H. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:393-404; Firestein, G.S. (2003) Nature 423:356-361). 전신 면역을 손상시키지 않으면서 각각의 개별 자가면역 장애에서 (공지되어 있거나 공지되어 있지 않은) 모든 다중클론 자가반응성 T 세포 특이성들을 제거하거나 억제하는 것은 현재 가능하지 않다.
생체외에서 증폭된 다중클론 FOXP3+CD4+CD25+ 조절 T(Treg) 세포의 입양 전달은 대안적 치료 방법으로서 제안되었다(Sakaguchi, S. et al. (2006) Immunol. Rev. 212:8-27). 방관자 면역억제에 대한 잠재력, 시험관내에서 항원 특이적 Treg 세포를 증폭시키는 효과적인 전략의 결여, 및 FOXP3+ Treg 세포의 계통 불안정성은 이 방법의 임상적 해석을 방해한다(Zhou, X. et al. (2009) Nature Immunol. 10:1000-1007; Komatsu, N. et al. (2014) Nature Med. 20:62-68; Bailey-Bucktrout, S.L. et al. (2013) Immunity 39:949-962). 사이토카인 IL-10 및 IL-21을 생성하고 표면 마커 CD49b 및 LAG-3, 및 전사 인자 c-Maf8을 발현하는 TR1 FOXP3-CD4+CD25- T 세포는 인간 염증성 질환의 치료를 위해 최근에 활용된 또 다른 조절 T 세포 서브세트를 구성한다(McLarnon, A. (2012) Nature Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9:559; Desreumaux, P. et al. (2012) Gastroenterology 143:1207-1217; Roncarolo, M.G. et al. (2011) Immunol. Rev. 241:145-163). 그러나, FOXP3+ Treg 세포와 마찬가지로, 생체내에서 자가항원 또는 질환 특이적 TR1 유사 세포를 증폭할 수 있는 약리학적 방법은 없다.
본 출원인은 주조직적합성 복합체 분자에 결합된 자가면역 질환 관련(미국 특허 제8,354,110호), 위장 관련(국제 특허출원 공보 제WO 2013/144811호), 또는 암 또는 종양 관련(미국 특허 제9,511,151호) 펩타이드로 코팅된 나노입자의 전신 전달이 환자의 림프구에 의해 인간화된 마우스를 포함하는 상이한 마우스 모델들에서 항원 특이적 조절 세포의 생성 및 증폭을 유발함으로써, 확립된 자가면역 현상의 해결을 이끌어낸다는 것을 이미 확인하였다(국제 특허출원 공보 제WO 2016/198932호 및 문헌(Clemente-Casares, X. et al. (2016) "Expanding antigen-specific regulatory networks to treat autoimmunity," Nature 530:434-440) 또한 참조). 그러나, 안정한 항원 특이적 T 세포 클론에 대한 필요성, 일차 세포의 사용과 관련된 기술적 과제 및 매우 가변적인 실험간 가변성, 및 항원 수용체 유발 사건과 관련 없는 판독의 좋지 않은 정량적 실험간 재현성을 고려할 때, 시험관내 pMHC-커플링된 나노입자 또는 나노입자에 커플링되지 않은 pMHC 복합체의 생물학적 및 광범위한 효능을 측정하는 고처리율 방법은 없다.
여기서 제시된 데이터는 일차 TCR-MHC 펩타이드 상호작용이 경로 의존적 리포터 및 그 자신의 천연 리간드(펩타이드 MHC 클래스 II 또는 펩타이드 MHC 클래스 I 분자)와 반응하는 수용체 복합체(TCR 플러스 CD4 또는 CD8 보조수용체)로 형질도입된/형질감염된 세포주에 의해 시험관내에서 정확히 모델링된다는 예상외의 결과를 제공한다. 도 1i와 1j를 참조한다. 본 개시에 기재된 방법 및 조성물은 그 자신의 동족 수용체 또는 리간드를 발현하는 세포와 상호작용하는 리간드 또는 수용체를 포함하는 나노의약의 효능 측정에 일반적으로 적용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 본원에 기재된 나노입자, 및 생체내 세포 반응을 변형시키고 재프로그래밍하는 데 효율적으로 활용될 수 있는 수용체에 대한 리간드를 포함하는 나노의약을 디자인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들면, 베타 세포 기능은 E-캐드헤린, P-캐드헤린 및 N-캐드헤린에의 결합에 의해 긍정적으로 영향을 받는다. 본원에 기재된 방법 및 조성물은 나노입자 및 E-캐드헤린, P-캐드헤린 또는 N-캐드헤린을 포함하는 물질의 조성물을 개발하고 시험할 수 있게 한다. 이러한 조성물은 글루코스에 대한 그 자신의 반응을 위해 선택될 수 있는 베타 세포 리포터를 갖는 적절한 세포주, 예컨대, Min6 세포주(글루코스 반응성 베타 세포주)와 메이팅될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시는 나노입자에 임의적으로 결합된 pMHC 복합체의 아고니스트 또는 길항제 활성 또는 "효능"을 측정하는 조성물 및 방법을 제공한다. 한 양태에서, 재조합 T 세포 수용체(TCR); TCR 경로 의존적 리포터; 및 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체(MHC) 리간드에 결합하는 보조수용체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 단리된 세포를 제공한다. 추가 양태에서, 상기 세포는 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체를 발현한다. 추가 실시양태에서, 상기 세포는 보조자극 분자 및/또는 사이토카인 중 하나 이상에 대한 수용체 또는 리간드를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된다.
MHC 리간드의 비한정적 예는 결합할 수용체들의 군으로부터 선택된다: 고전적 MHC 클래스 I 단백질, 비고전적 MHC 클래스 I 단백질, 고전적 MHC 클래스 II 단백질, 비고전적 MHC 클래스 II 단백질, MHC 이량체(Fc 융합체), MHC 사량체, 또는 중합체 형태의 MHC 단백질. 한 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 MHC 클래스 I 보조수용체, 예컨대, CD8을 코딩한다. 또 다른 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 MHC 클래스 II 보조수용체, 예컨대, CD4를 코딩한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 이 폴리뉴클레오타이드의 발현을 유도하는 조절 요소 및 추가로 임의적으로 인핸서 요소에 임의적으로 작동가능하게 연결된다.
한 양태에서, T 세포 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드(들)는 TCRα 및/또는 TCRβ 코딩 폴리뉴클레오타이드(들)에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 임의적으로 함유하는 TCRα 및/또는 TCRβ를 코딩한다. 이 폴리뉴클레오타이드는 리보좀 스킵핑 서열을 임의적으로 더 포함할 수 있다. 한 양태에서, 리보좀 스킵핑 서열은 2A 리보좀 스킵핑 서열을 포함하거나, 나아가 이러한 서열로 본질적으로 구성되거나, 대안적으로 이러한 서열로 구성된다. 2A 리보좀 스킵핑 서열의 비한정적 예는 F2A, T2A 또는 P2A 리보좀 스킵핑 서열, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이러한 서열 또는 조합으로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 서열 또는 조합으로 구성된다.
추가 양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 유전자 발현, 활성, 단백질 국소화, 단백질 변형 또는 단백질-단백질 상호작용 중 하나 이상의 측정을 임의적으로 제공할 수 있는 TCR 활성화 또는 TCR 경로 활성화의 리포터이다. 추가 양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 루시퍼라제(luciferase), 베타 락타마제(beta lactamase), CAT, SEAP 또는 형광 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 포함하거나, 대안적으로 이러한 단백질로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 단백질로 구성된다. 추가 양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 상기 세포는 세포 표면에서 CD3 신호전달 복합체를 발현시키기 위해 조절 서열, 예를 들면, 프로모터 및/또는 인핸서에 임의적으로 작동가능하게 커플링된, TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입된다. 한 실시양태에서, 상기 세포는 CD3 신호전달 복합체를 내생적으로 발현하지 않는다.
상기 세포는 임의의 항원의 활성화 잠재력을 확인하는 데 유용하고, 이러한 항원의 예로는 MHC(pMHC)에 임의적으로 커플링된 자가면역 또는 암 관련 항원들이 있으나 이들로 한정되지 않는다. pMHC는 나노입자 코어 또는 다른 담체에 임의적으로 커플링된다. 한 양태에서, pMHC는 임의적으로 코어의 링커를 통해, 또는 코어의 코팅을 통해 나노입자 코어와 복합체를 형성한다. 나노입자 코어당 pMHC의 수는 변경될 수 있고, 예를 들면, 약 10:1 내지 약 1000:1일 수 있고, 10:1 내지 약 1000:1의 범위 내에 있다. 나노입자 코어는 적절한 경우 복수의 보조자극 분자들 및/또는 사이토카인들도 임의적으로 포함할 수 있다.
특정 양태에서, pMHC, 사이토카인 및/또는 보조자극 분자는 코어의 코팅을 통해 나노입자 코어와 복합체를 형성한다. 코팅은 예를 들면, 중합체, 임의적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 코팅일 수 있고, 코어당 pMHC, 사이토카인 및/또는 보조자극 분자의 수는 중합체로 코팅된 나노입자 코어의 "밀도" 또는 표면적당 pMHC의 수에 의해 측정될 수 있다. 임의의 밀도는 예를 들면, 나노입자 코어의 표면적당 약 0.025 pMHC/100 nm2 내지 약 100 pMHC/100 nm2로 측정될 수 있고, 나노입자 코어의 표면적당 0.025 pMHC/100 nm2 내지 약 100 pMHC/100 nm2의 범위 내에 있다.
임의의 적절한 진핵 세포는 필수 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입될 수 있고; 이러한 세포의 비한정적 예로는 JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM 또는 Molt-4가 있다. 상기 세포는 임의의 적절한 종, 동물, 포유동물, 예를 들면, 인간의 세포일 수 있다. 추가 양태에서, 세포가 CD3 쇄 신호전달 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입되어야 할 때, 상기 세포는 CD3 쇄 신호전달 복합체를 내생적으로 발현하지 않는다.
한 양태에서, 실질적으로 균질한, 본원에서 확인된 세포의 집단도 제공한다. 본원은 세포 및 세포의 집단을 배양하는 방법도 제공한다.
본 개시는 본원에 기재된 단리된 세포를 제조하는 방법도 제공한다. 한 양태에서, 상기 방법은 재조합 T 세포 수용체(TCR); TCR 경로 의존적 리포터; 및 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체(MHC) 리간드에 결합하는 보조수용체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 단리된 세포를 형질도입하는 단계를 포함하거나, 대안적으로 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 단계로 구성된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 단리된 세포를 형질도입하는 단계를 포함하거나, 대안적으로 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 단계로 구성된다. 상기 방법은 재조합 T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터, 및 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체(MHC) 리간드에 결합하는 수용체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드의 발현에 유리한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체의 발현에 유리한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계도 포함한다.
추가 실시양태에서, 상기 방법은 복수의 보조자극 분자들, 복수의 보조자극 항체들, 복수의 억제 수용체 차단 항체들 및/또는 복수의 사이토카인들 중 하나 이상에 대한 수용체 또는 리간드를 발현하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질도입하는 단계도 포함하거나, 대안적으로 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 단계로 구성된다.
형질도입된 폴리뉴클레오타이드의 수용체 및 발현 생성물을 발현하는 세포는 예를 들면, 당분야에서 공지되어 있는 방법, 예컨대, 유세포분석에 의해 발현 생성물에 결합하는 검출가능하게 표지부착된 리간드 및/또는 항체를 사용함으로써 당분야에서 공지되어 있는 임의의 적절한 방법에 의해 확인될 수 있다.
세포의 형질도입 시, 세포는 폴리뉴클레오타이드의 발현 및 세포의 집단의 생성에 유리한 조건 하에서 생장된다.
세포 및 세포 집단은 (나노입자 코어에 임의적으로 결합된) 항원-MHC 복합체(pMHC) 및 임의적으로 보조자극 분자 및/또는 사이토카인을 포함하는 조성물을 수용체와 이의 리간드의 결합에 유리한, 본원에 기재된 단리된 세포와 접촉시킨 후 리포터에 의해 생성된 TCR 경로 의존적 리포터 신호를 검출함으로써 상기 조성물의 아고니스트 또는 길항제 활성을 측정하는 시험관내 방법에 유용하다. 숙련된 당업자에게 자명한 바와 같이, 상기 조성물 및 세포는 가능한 상호작용을 위해 선택된다. 예를 들면, 상기 조성물은 pMHC 클래스 II 특이적 TCR 분자를 함유하고 상기 세포는 MHC 클래스 II 보조수용체, 예를 들면, CD4를 발현한다.
한 양태에서, 세포를 조성물과 접촉시킨 후, 세포 또는 집단에 의해 생성된 임의의 리포터 신호를 정량한다. 측정된 반응을 목록으로 작성한 후, 아고니스트 또는 길항제 활성의 확인 전 및/또는 확인 후 측정치를 사용하여 정량된 신호와 비교함으로써, 요법의 효능을 다른 요법 또는 조성물과 대비하여 모니터링할 수 있다. 조성물이 보조자극 분자를 포함하고 세포 및 세포 집단이 적절한 수용체를 발현할 때, 측정된 반응을 목록으로 작성한 후, 길항제 활성의 확인 전 및/또는 확인 후 측정치를 사용하여 정량된 신호와 비교함으로써 요법의 효능을 다른 요법 또는 조성물과 대비하여 모니터링할 수 있다.
따라서, 본 개시의 일부 양태는 본원에 기재된 적어나 하나의 단리된 형질도입된 세포 또는 형질도입된 세포 집단 및 단리된 복합체를 포함하는 조합에 관한 것으로서, 이때 상기 단리된 복합체는 복수의 pMHC 복합체들에 커플링된 나노입자 코어를 포함하거나, 대안적으로 이러한 나노입자 코어로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 나노입자 코어로 구성되고, 상기 나노입자 코어는 나노입자 코어에 커플링된 하나 이상의 보조자극 분자 및/또는 하나 이상의 사이토카인도 임의적으로 포함하거나, 추가로 이들로 구성되거나, 대안적으로 추가로 이들로 본질적으로 구성된다.
복수의 복합체들을 함유하는 이 조성물의 경우, 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 MHC는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 사이토카인은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 보조자극 분자는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 나노입자 코어의 직경은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 결합가는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 밀도는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 보조자극 분자의 결합가 또는 밀도는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 사이토카인의 결합가 또는 밀도는 서로 동일하거나 상이하다.
한 양태에서, (a) (i) TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 재조합 T 세포 수용체(TCR), 및 (ii) T 세포 수용체 경로 의존적 리포터를 포함하는 적어도 하나의 세포로서, 상기 재조합 TCR이 주조직적합성(MHC) 분자에 결합된 질환 관련 항원에 특이적인 것인 적어도 하나의 세포; 및 (b) 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원을 포함하는 나노의약을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터는 능동적으로 전사된다. 일부 실시양태에서, MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원은 10:1 이상의 비로 나노입자에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 1 나노미터 내지 100 나노미터의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 금속 코어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원은 천식 또는 알레르기성 천식 항원, I형 진성 당뇨병 항원, 다발성 경화증 항원, 말초 신경병증 항원, 원발성 담즙성 간경변증 항원, 시신경척수염 스펙트럼 장애 항원, 강직 인간 증후군 항원, 자가면역 뇌염 항원, 심상성 천포창 항원, 낙엽상 천포창 항원, 건선 항원, 쇼그렌 질환/증후군 항원, 염증성 장 질환 항원, 관절염 또는 류마티스성 관절염 항원, 전신 홍반성 루푸스 항원, 피부경화증 항원, ANCA 관련 혈관염 항원, 굿파스처(Goodpasture) 증후군 항원, 가와사키병 항원, 셀리악(celiac)병, 자가면역 심근병증 항원, 중증 근무력증 항원, 자가면역 포도막염 항원, 그레이브스병 항원, 항-인지질 증후군 항원, 자가면역 간염 항원, 경화성 담관염 항원, 원발성 경화성 담관염 항원, 만성 폐쇄성 폐 질환 항원 또는 포도막염 관련 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터는 루시퍼라제 유전자, 베타 락타마제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(acetyltransferase)(CAT) 유전자, 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(alkaline phosphatase)(SEAP) 유전자, 형광 단백질 유전자, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 전사를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 및 이들의 조합을 포함하는 목록으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 세포는 JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM 또는 Molt-4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은 서열번호 1 내지 352 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은 서열번호 353 내지 455 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 단일 폴리펩타이드로서 번역된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드의 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄는 리보좀 스킵핑 서열에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 리보좀 스킵핑 서열은 서열번호 456 내지 523 중 어느 하나에 기재된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드는 서열번호 527, 533 또는 538 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 별개의 폴리펩타이드로서 번역된다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄는 서열번호 528, 530, 534, 536, 539 또는 541 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, TCR 베타 쇄는 서열번호 529, 531, 535, 537, 540 또는 542 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 IRES 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRES 핵산 서열은 서열번호 524 내지 526 중 어느 하나에 기재된다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 532 또는 557 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 나노의약의 효능 또는 활성을 측정하는 데 있어서 시험관내에서 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 나노의약은 인간 개체에서 사용하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, 주조직적합성 분자에 결합된 질환 관련 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 T 세포 수용체 경로 의존적 리포터를 포함하는 세포가 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터는 능동적으로 전사된다. 일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원은 천식 또는 알레르기성 천식 항원, I형 진성 당뇨병 항원, 다발성 경화증 항원, 말초 신경병증 항원, 원발성 담즙성 간경변증 항원, 시신경척수염 스펙트럼 장애 항원, 강직 인간 증후군 항원, 자가면역 뇌염 항원, 심상성 천포창 항원, 낙엽상 천포창 항원, 건선 항원, 쇼그렌 질환/증후군 항원, 염증성 장 질환 항원, 관절염 또는 류마티스성 관절염 항원, 전신 홍반성 루푸스 항원, 피부경화증 항원, ANCA 관련 혈관염 항원, 굿파스처 증후군 항원, 가와사키병 항원, 셀리악병, 자가면역 심근병증 항원, 중증 근무력증 항원, 자가면역 포도막염 항원, 그레이브스병 항원, 항-인지질 증후군 항원, 자가면역 간염 항원, 경화성 담관염 항원, 원발성 경화성 담관염 항원, 만성 폐쇄성 폐 질환 항원, 또는 포도막염 관련 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터는 루시퍼라제 유전자, 베타 락타마제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자, 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 유전자, 형광 단백질 유전자, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 전사를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM 또는 Molt-4로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은 서열번호 1 내지 352 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은 서열번호 353 내지 455 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합이다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 단일 폴리펩타이드로서 번역된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드의 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄는 리보좀 스킵핑 서열에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 리보좀 스킵핑 서열은 서열번호 456 내지 523 중 어느 하나에 기재된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드는 서열번호 527, 533 또는 538 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 별개의 폴리펩타이드로서 번역된다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄는 서열번호 528, 530, 534, 536, 539 또는 541 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, TCR 베타 쇄는 서열번호 529, 531, 535, 537, 540 또는 542 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 세포의 표면에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포는 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 IRES 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRES 핵산 서열은 서열번호 524 내지 526 중 어느 하나에 기재된다. 일부 실시양태에서, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 532 또는 557 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 상동성인 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포의 집단이다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포의 집단은 나노의약의 효능 또는 활성을 측정하는 데 있어서 시험관내에서 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 나노의약은 인간 개체에서 사용하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원을 포함하는 나노의약의 아고니스트 활성을 측정하는 시험관내 방법으로서, (a) 나노의약을 본원에 기재된 세포 또는 세포의 집단과 접촉시키는 단계; 및 (b) T 세포 수용체 경로 의존적 리포터에 의해 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 나노의약은 복수의 나노입자들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 복수의 나노입자들은 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 복수의 질환 관련 항원들을 포함하는 복수의 나노입자들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 질환 관련 항원은 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원은 I형 진성 당뇨병 항원, 천식 또는 알레르기성 천식 항원, 다발성 경화증 항원, 말초 신경병증 항원, 원발성 담즙성 간경변증 항원, 시신경척수염 스펙트럼 장애 항원, 강직 인간 증후군 항원, 자가면역 뇌염 항원, 심상성 천포창 항원, 낙엽상 천포창 항원, 건선 항원, 쇼그렌 질환/증후군 항원, 염증성 장 질환 항원, 관절염 또는 류마티스성 관절염 항원, 전신 홍반성 루푸스 항원, 피부경화증 항원, ANCA 관련 혈관염 항원, 굿파스처 증후군 항원, 가와사키병 항원, 셀리악병, 자가면역 심근병증 항원, 중증 근무력증 항원, 자가면역 포도막염 항원, 그레이브스병 항원, 항-인지질 증후군 항원, 자가면역 간염 항원, 경화성 담관염 항원, 원발성 경화성 담관염 항원, 만성 폐쇄성 폐 질환 항원, 또는 포도막염 관련 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 복수의 나노입자들은 1 나노미터 내지 약 100 나노미터의 직경을 갖는 복수의 나노입자들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포 수용체 경로 의존적 리포터 신호를 정량하는 단계도 포함한다. 일부 실시양태에서, 정량은 최대 반응의 약 50%인 반응을 개시하는 나노의약의 농도를 결정하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 최대 반응은, 복수의 농도의 나노의약을 세포 또는 세포의 집단과 접촉시킬 때 세포 또는 세포 집단과 접촉된 나노의약의 가장 높은 농도에서 개시된 반응이다. 일부 실시양태에서, 복수의 농도의 나노의약을 동일한 어세이에서 세포 또는 세포 집단과 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 정량은 음성 대조군의 적어도 약 200%인 반응을 개시하는 나노의약의 농도를 결정하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 음성 대조군은, 세포 또는 세포의 집단의 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 특이적으로 상호작용하지 않는 나노의약을 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호는 효소에 의해 생성된다. 일부 실시양태에서, 효소는 루시퍼라제 또는 퍼옥시다제(peroxidase)이다. 일부 실시양태에서, 신호는 형광 신호이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 제조 공정에서 품질 관리 단계로서 이용된다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시의 일부 양태를 더 입증하기 위해 포함된다. 본 개시는 본원에서 제공된 특정 실시양태의 상세한 설명과 함께 이 도면들 중 하나 이상의 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 1j는 T 세포 아고니스트 활성 및 TCR 신호전달에 대한 NP 크기 및 pMHC 결합가의 효과를 보여준다. 도 1a는 NRP-V7/Kd-SFP에 반응하여 8.3-CD8+ T 세포에 의해 IFNγ가 생성되는 것을 pMHC 결합가 및 NP 수의 함수로서 보여준다. 도 1b는 도 1a로부터의 NRP-V7/Kd-SFP의 아고니스트 성질을 어세이에서의 pMHC 농도의 함수로서 보여준다. 도 1c 및 1d는 2개의 상이한 NRP-V7/Kd 결합가로 접합된 PF에 반응하여 8.3-CD8+ T 세포에 의해 IFNγ가 생성되는 것을 어세이에서의 pMHC-NP(도 1c) 또는 pMHC(도 1d) 농도의 함수로서 보여준다. 도 1e 및 1f는 낮은 NRP-V7/Kd 결합가로 코팅된 작은(SFP) NP 대 큰(PF) NP의 아고니스트 성질의 비교를 pMHC-NP(도 1e) 또는 pMHC(도 1f) 농도의 함수로서 보여준다. 도 1a 내지 1f의 데이터는 삼중 웰에서 IFNγ 분비의 평균 + SEM 값에 상응하고(오차 막대는 통상적으로 데이터를 표시하는 데 사용된 부호의 크기보다 더 작았음), 각각의 패널은 적어도 3회의 독립적 실험들을 대표하는 하나에 상응한다. 음성 대조군은 접합되지 않은 NP 또는 시스테인-접합된 NP를 고농도의 NP(즉, 도 1a에서 50 x 1011개의 NP/㎖)로 사용하여 제로 IFNγ 값을 얻는 것을 포함한다. 도 1g는 BDC2.5-CD4+ T 세포에 대한 10개의 상이한 BDC2.5mi/IAg7 결합가로 접합된 PF NP의 아고니스트 성질의 비교를, pMHC-NP(상부) 또는 pMHC(하부) 농도의 함수로서 보여준다. 제시된 데이터는 하나의 실험에 상응한다. 5 및 10 ㎍의 pMHC에 대한 데이터를 2회 이상 반복하여, 유사한 결과를 얻었다. 본 출원인은 10 ㎍ pMHC/㎖의 10 pMHC/NP 제제(95x1011개 NP/㎖)의 철 농도와 동등한 철 농도로 시스테인-접합된 NP를 음성 대조군으로서 사용하여, 제로 IFNγ 값을 얻었다. 도 1h는 (역치 미만의 밀도, 역치 밀도, 최소 최적 밀도 및 역치 초과의 밀도에 따라 분류된) PF NP의 BDC2.5mi/IAg7 결합가와 밀도(각각 하부 및 상부 수평 축) 사이의 관계, 및 10 ㎍/㎖(좌측) 및 5 ㎍/㎖(우측)(최대치에 가까운 아고니스트 활성을 제공하는 pMHC의 농도)에서 BDC2.5-CD4+ T 세포에 대한 아고니스트 활성을 보여준다. 만-휘트니(Mann-Whitney) U를 통해 역치 미만/역치 대 최소 최적 결합가/역치 초과 결합가 사이의 P 값을 계산하였다. 도 1i는 다양한 시간 동안 BDC2.5mi/IAg7-PF-M(12.5 ㎍/㎖), 가용성 항-hCD3ε mAb(10 ㎍/㎖) 및 PMA/이오노마이신을 사용한 자극에 반응하여 생성된, BDC2.5-TCR/mCDA/NFAT-루시퍼라제 발현 JurMA 세포의 루시퍼라제 활성(삼중실험의 평균 + SEM)을 보여준다. RLU(상대적 광 유닛). 본 출원인은 5 ㎍ pMHC/㎖의 10 pMHC/NP 제제(45.5 x 1011개 NP/㎖)의 철 농도와 유사한 철 농도로 시스테인-접합된 NP를 음성 대조군으로서 사용하여, 1.05 RLU를 얻었다. 제시된 데이터는 자극 조건당 적어도 3회의 독립적 실험들을 대표한다. 이원 ANOVA를 통해 조건들 사이의 P 값을 계산하였다. 도 1j는 (역치 미만의 밀도, 역치 밀도, 최소 최적 밀도 및 역치 초과의 밀도에 따라 분류된) PF NP의 BDC2.5mi/IAg7 결합가와 밀도(각각 하부 및 상부 수평 축) 사이의 관계, 및 5 ㎍/㎖에서 BDC2.5-TCR/mCD4/NFAT-루시퍼라제 발현 JurMA 세포에 대한 아고니스트 활성을 보여준다. 만-휘트니 U를 통해 P 값을 계산하였다.
도 2a 및 2b는 동족 T 세포에 결합하는 pMHC-NP의 개략적 표시를 보여준다. 도 2a, 상부 패널: 4개의 조밀히 코팅된 pMHC-NP들(각각 4 nm의 간격을 둔 pMHC 단량체를 보유함)에 결합하는, 140 nm(TCRαβ의 4 nm 구형 크기 및 5 nm 간격을 가정함)에 걸쳐 있는 16개의 유닛들로 구성된 TCR 나노클러스터의 개략적 표시. 하부 패널 도면은 NP의 관점에서 볼 때 이들 4개의 pMHC-NP들이 TCR 섬(좌측) 또는 나노클러스터(우측)와 어떻게 상호작용하는지를 보여준다. 도 2b는 전체 결합 결합력, pMHC-TCR 회합 및 해리 속도, 및 동력학적 교정(proofreading) 모델 및 협력적 TCR 신호전달 모델 둘 다를 고려할 때, 역치 초과 결합가, 역치 결합가 및 역치 미만 결합가로 코팅된 pMHC-NP(좌측), 및 클러스터에서 TCR 신호전달을 이끌어내는 이들의 상대적 능력을 보여준다. 이 클러스터에서 인접 TCR 이종이량체들을 라이게이션할 수 있는 pMHC-NP는 TCR 신호전달을 유발하는 데 효율적이다. 이 모델은 가깝게 나란히 놓인 pMHC들로 코팅된 작은 NP가 왜 최적 면역학적 성질을 갖는지를 설명한다.
도 3a 내지 3g는 동족 T 세포에서의 pMHC-NP의 지속된 결합 및 클러스터링을 pMHC 밀도의 함수로서 보여준다. 도 3a 및 3b는 역치 초과 pMHC 밀도(46개의 pMHC/NP)로 코팅된 각각 BDC2.5mi/IAg7-PF-M 또는 NRP-V7/Kd-PF-M과 함께 인큐베이션된 BDC2.5mi-CD4+ T 세포(도 3a) 또는 8.3-CD8+ T 세포(도 3b)의 2D TEM 영상을 보여준다. 도 3a의 2개의 우측 패널 및 도 3b의 4개의 우측 패널은 37℃에서 3시간 인큐베이션 후 세포내 소포 내의 NP의 존재를 보여준다. 도 3c는 각각 비-동족 NRP-V7/Kd-PF-M 및 BDC2.5mi/IAg7-PF-M과 함께 인큐베이션된 BDC2.5mi-CD4+ T 세포 및 8.3-CD8+ T 세포의 2D TEM 영상을 보여준다. 도 3d, 좌측 패널: 3D 영상: 30분 동안 4℃에서 NRP-V7/Kd-PF-M-알렉사-647과 함께 인큐베이션된 8.3-CD8+ T 세포의 초고해상도 현미경관찰. 중간 패널 및 우측 패널: 2D 영상: 30분 동안 4℃에서 인큐베이션된 T 세포, 및 30분 동안 4℃에서 인큐베이션된 후 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션된 T 세포. 막대그래표는 NP 클러스터의 직경이 인큐베이션 시간 및 온도에 따라 증가한다는 것을 보여준다(179.1±4.6 nm 내지 401.7±4.2 nm; n=100개 클러스터/조건; 만-휘트니 U에 의해 계산된 P 값). 밝은 회색: NRP-V7/Kd-PF-M-알렉사-647; 어두운 회색: DAPI. 막대: 1 ㎛. 도 3e 및 3f는 pMHC 결합가로서 역치 미만인 10개 pMHC/NP(e) 또는 역치인 24개 pMHC/NP(f)를 갖는 BDC2.5mi/IAg7-PF-M 제제와 함께 인큐베이션된 BDC2.5mi-CD4+ T 세포의 2D TEM 영상을 보여준다. 도 3e 및 도 3f의 4개 좌측 패널은 마이크로클러스터가 T 세포막에 부재하거나(e) 존재한다는(f) 것을 보여준다. 도 3e 및 도 3f의 2개 우측 패널은 세포내 소포의 존재를 보여준다. 도 3g는 (59.5±6.5 nm), (271.2±17.3 nm) 및 (370±21.3 nm)로 코팅된 pMHC-NP의 존재 하에서 배양된 세포에서 마이크로클러스터의 평균 크기를 보여준다; (9개 내지 15개 세포/조건에서 n=50개 내지 60개 클러스터). 만-휘트니 U로 P 값을 계산하였다. 이 도면에 기재된 실험은 반복될 수 있고 일관된 결과로 재현될 수 있다.
도 4a 및 4b는 스캐닝 전자 현미경관찰(SEM)로 동족 T 세포에서의 pMHC-NP의 지속된 클러스터링을 보여준다. 도 4a는 NRP-V7/Kd-PF-M의 부재(좌측) 또는 존재(우측) 하에서 8.3-CD8+ T 세포의 3D SEM 영상을 보여준다. 배율, 100,000배; 막대: 500 nm. 흑색 파선은 대표적인 pMHC-NP 클러스터에 상응한다. 도 4b는 EDS 스펙트럼 분석을 보여준다. 확대된 SEM 영상에 표시된 3개의 대표적 클러스터 함유 막 영역(a 내지 c) 및 클러스터 부재 막 영역(d 내지 f)을 EDS를 통해 분석하였고 데이터를 막대그래프로서 작도하였다. 만-휘트니 U 검정으로 P 값을 수득하였다.
도 5는 효능 어세이의 결과 어세이간 가변성을 보여준다.
도 6은 T 세포주를 자극하는 pMHC의 능력에 대한 혈청 및 항-pMHC-NP 성분 항체의 효과를 측정하는 효능 어세이를 이용한 결과를 보여준다. pMHC-NP를 도 6c 및 도 6d에 표시된 바와 같이 인간 혈청과 함께 미리 인큐베이션하였거나, 도 6a 또는 6b에 표시된 바와 같이 미리 인큐베이션하지 않은 후, 표시된 항체 또는 토끼 과면역(H.I) 혈청과 함께 인큐베이션하였다. 각각의 항체를 도 6b 및 6d에서 혈청에 대한 1:10, 1;100 및 1:1000의 희석율(좌측에서 우측으로), 및 1:1, 1:4 및 1:16의 Ab:pMHC의 몰 비(좌측에서 우측으로)로 표시된 바와 같이 pMHC 및 세포와 함께 인큐베이션하였다. 막대는 표준 편차를 표시한다.
도 7a 내지 7d는 IGRP13-25 폴리펩타이드와 함께 복합체를 형성한 DR에 특이적인 TCR을 발현하는 GFP 표지부착된 JURMA 세포의 유세포분석을 보여준다. 도 7a는 세포주 그 자체를 보여주고; 도 7b는 표준 류신 지퍼 이량체화 기술에 의해 제조된 PE 표지부착된 DR3 IGRP13-25와 함께 인큐베이션된 세포주를 보여주고; 도 7c는 류신 지퍼를 결여하는, 놉-인-홀(knob-in-hole) 및 시스테인-트랩 이량체화 기술을 이용함으로써 제조된 PE 표지부착된 DR3 IGRP13-25와 함께 인큐베이션된 세포주를 보여주고; 도 7d는 관련 없는 PE 표지부착된 MHC 클래스 II 이종이량체와 함께 인큐베이션된 세포주를 보여준다.
도 8a 및 8b는 나노입자에 접합된 IGRP13-25 폴리펩타이드와 복합체를 형성한 DR에 특이적인 TCR을 발현하는 JURMA 세포의 자극을 보여준다.
한 양태에서, (a) (i) TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 재조합 T 세포 수용체(TCR), 및 (ii) T 세포 수용체 경로 의존적 리포터를 포함하는 적어도 하나의 세포로서, 상기 재조합 TCR이 주조직적합성(MHC) 분자에 결합된 질환 관련 항원에 특이적인 것인 적어도 하나의 세포; 및 (b) 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원을 포함하는 나노의약을 포함하는 조성물이 본원에 기재된다.
또 다른 양태에서, 주조직적합성 분자에 결합된 질환 관련 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 T 세포 수용체 경로 의존적 리포터를 포함하는 세포가 본원에 기재된다.
또 다른 양태에서, 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원을 포함하는 나노의약의 아고니스트 활성을 측정하는 시험관내 방법으로서, (a) 상기 나노의약을 본원에 기재된 세포 또는 세포의 집단과 접촉시키는 단계; 및 (b) T 세포 수용체 경로 의존적 리포터에 의해 생성된 신호를 검출하는 단계를 포함하는 시험관내 방법이 본원에 기재된다.
본 개시 전체에 걸쳐 본 개시 내에서, 본 개시와 관련된 분야의 기술수준을 보다 더 완전히 기술하기 위해 기술 문헌 및 특허 문헌을 참조한다. 일부 공개문헌들은 아라비아 숫자에 의해 식별되고, 공개문헌에 대한 전체 서지 정보는 청구범위 직전의 참고문헌 단락에서 발견된다. 모든 공개문헌들은 본 개시가 속하는 분야의 기술수준을 더 완전히 기술하기 위해 본원에 참고로 도입된다.
본 개시는 당연히 그 자체로 변경될 수 있기 때문에 기재된 특정 실시양태로 한정되지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 개시의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시양태만을 기술하기 위한 것이고 한정하기 위한 것이 아니라는 것도 이해해야 한다.
문맥이 달리 명시하지 않은 한, 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 복수형 지시대상을 포함한다는 것을 인지해야 한다. 따라서, 예를 들면, "부형제"의 언급은 복수의 부형제들을 포함한다. 용어 "적어도 하나"는 하나 이상을 의미한다.
본원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 값을 측정하는 데 이용되는 디바이스 또는 방법에 대한 오류의 표준 편차를 포함한다는 것을 표시하기 위해 사용된다. 범위를 포함하는 수치 표기, 예를 들면, 온도, 시간, 양 및 농도 앞에 사용될 때 용어 "약"은 (+) 또는 (-) 10%까지 변경될 수 있는 대략치를 표시한다.
달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 개시가 속하는 분야에서 통상의 기술을 갖는 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 하기 의미를 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하되 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하기 위한 것이다. 조성물 및 방법을 정의하기 위해 사용될 때 "본질적으로 구성된"은 언급된 목적을 위한 조합에 대한 임의의 본질적 유의성을 갖는 다른 요소를 배제한다는 것을 의미할 것이다. 따라서, 본원에서 정의된 요소들로 본질적으로 구성된 조성물, 예컨대, 다발성 경화증을 치료하거나 예방하는 조성물은 청구된 개시의 기본 특성(들) 및 신규 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 다른 물질 또는 단계를 배제하지 않을 것이다. "구성된"은 다른 성분 및 실질적인 방법 단계의 미량 초과의 요소를 배제한다는 것을 의미할 것이다. 이 이행 용어들 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 개시의 범위 내에 있다.
"생체적합성"은 전달 시스템의 성분들이 조직 손상 또는 인간 생물학적 시스템에 대한 손상을 야기하지 않을 것이라는 것을 의미한다. 생체적합성을 부여하기 위해, 인간에서 안전하게 사용된 이력, 또는 GRAS(안전한 것으로서 일반적으로 허용된) 상태를 갖는 중합체 및 부형제가 우선적으로 사용될 것이다. "생체적합성"은 조성물에서 사용된 성분 및 부형제가 궁극적으로 신체에 불리한 영향을 미치지 않으면서 신체에 의해 "생체흡수되거나" 제거될 것임을 의미한다. 조성물이 생체적합하고 무독성 조성물로서 간주되기 위해, 조성물은 세포에 대한 독성을 야기하지 않아야 한다. 유사하게, 용어 "생체흡수가능한"은 환자 내에서의 물질의 장기간 축적이 피해지도록 일정 시간에 걸쳐 생체내에서 생체흡수되는 물질로부터 제조된 나노입자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 생체적합성 나노입자는 2년 미만의 기간, 바람직하게는 1년 미만, 훨씬 더 바람직하게는 6개월 미만의 기간에 걸쳐 생체흡수된다. 생체흡수 속도는 입자의 크기, 사용된 물질, 및 숙련된 당업자에 의해 잘 인식되는 다른 요인과 관련되어 있다. 생체흡수가능한 생체적합성 물질들의 혼합물을 사용하여 본 개시에서 사용된 나노입자 코어를 형성할 수 있다. 한 실시양태에서, 산화철과 생체적합성 생체흡수가능한 중합체를 조합할 수 있다. 예를 들면, 산화철과 PGLA를 조합하여 나노입자를 형성할 수 있다.
용어 "주조직적합성 복합체" 또는 "MHC"는 항원과 회합하여 항원-회합된 면역 세포를 형성하는 능력을 갖는 면역 세포의 항원 제시 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, MHC는 클래스 I 또는 클래스 II 분자이다. 일부 실시양태에서, MHC는 고전적 MHC 클래스 I 단백질, 비고전적 MHC 클래스 I 단백질, 고전적 MHC 클래스 II 단백질, 비고전적 MHC 클래스 II 단백질, MHC 이량체(Fc 융합체), MHC 사량체 또는 중합체 형태의 MHC 단백질를 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성된다. MHC는 CD4 및 CD8로부터 선택되는 세포 표면 분자에 결합한다.
폴리펩타이드/항원-MHC-나노입자 복합체("NP-복합체" 또는 "복합체" 또는 "pMHC-NP" 또는 "나노입자 복합체")는 표면, 예컨대, 나노입자 코어의 MHC 분자에 의해 제시된 항원성 분자 또는 단백질의 펩타이드, 탄수화물, 지질, 또는 다른 항원성 분절, 단편 또는 에피토프(즉, 자가 펩타이드 또는 자가항원)의 제시를 의미한다.
"나노입자 코어"는 층 또는 코팅을 포함하거나 포함하지 않는 나노입자 기판이다. 나노입자 복합체는 적어도 코어에 커플링된 pMHC 복합체를 갖는 코어를 포함한다. 나노입자 코어는 다양한 물질들 중 임의의 물질로부터 만들어질 수 있고 생체적합할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "활성화된 T 세포의 핵 인자" 또는 "NFAT"는 면역 반응(예를 들면, T 세포에 의해 조절되는 면역 반응의 활성화)에 중요한 것으로 확인된 전사 인자들의 패밀리에 적용되는 일반 명칭이다. 면역 시스템은 NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4 및 NFAT5를 포함하나 이들로 한정되지 않는 NFAT 패밀리 구성원들 중 하나 이상의 구성원을 발현할 수 있다. NFATc1 내지 NFATc4는 칼슘 신호전달에 의해 조절된다. 잘 공지되어 있는 칼슘 센서 단백질인 칼모듈린(CaM)이 세린/쓰레오닌 포스파타제 칼시뉴린(CN)을 활성화시키기 때문에 칼슘 신호전달은 NFAT 활성화에 매우 중요하다. NFAT 단백질의 핵 이입은 세포질 내의 유지 키나제 및 핵 내의 이출 키나제에 의해 저해된다. 이출 키나제, 예컨대, PKA 및 GSK-3β는 NFAT 핵 체류를 위해 불활성화되어야 한다. 한 실시양태에서, NFAT 전사 인자는 칼슘 신호와 다른 신호전달 경로, 예컨대, ras-MAPK 또는 PKC의 통합 및 동시 검출을 가능하게 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 MHC 분자에 의해 제시될 때 펩타이드를 인식할 수 있는 분자를 지칭하다. 일부 실시양태에서, TCR은 가변(V) 영역 및 불변(C) 영역, 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 각각 포함하는 T 세포 수용체 α 쇄(TCR α) 및 T 세포 수용체 β 쇄(TCR β)를 포함하는 이종이량체이다. V 영역 및 C 영역은 일반적으로 면역글로불린 V 영역 및 C 영역에 상동하고 3개의 상보성 결정 영역들(CDR들)을 포함한다. TCR 쇄들 둘 다가 TCR을 제시하는 세포의 원형질막에 고착된다. 일부 실시양태에서, TCR은 TCR γ 쇄(TCRγ) 및 TCR δ 쇄(TCRδ)를 포함하는 이종이량체이다. 일부 실시양태에서, TCR은 단일 쇄 TCR 구축물이다. TCR α의 비한정적 예는 진뱅크(GenBank), 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAB31880.1, AAB28318.1, AAB24428.1 및 ADW95878.1, 및 이들 각각의 균등물에서 발견될 수 있다. TCR β의 비한정적 예도 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAB31887.1, AKG65861.1, ADW95908.1 및 AAM53411.1, 및 이들 각각의 균등물에서 발견될 수 있다. 한 실시양태에서, TCR γ 쇄는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAM21533.1, DAA30449.1 및 ABG91733.1, 및 이들 각각의 균등물에서 발견된 하나 이상의 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, TCR δ 쇄는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 Q7YRN2.1, AAC48547.1, JC4663 및 NP_001009418.1, 및 이들 각각의 균등물에서 발견된 하나 이상의 서열을 포함한다. 단일 쇄 TCR은 당분야에서 공지되어 있다. 단일 쇄 TCR의 비한정적 예는 전체로서 각각 참고로 도입된 국제 특허출원 공보 제WO1996018105호 및 미국 특허출원 공보 제US20120252742호에 개시되어 있다. 한 실시양태에서, TCR β의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 및 TCR β의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이 폴리뉴클레오타이드의 균등물은 이하에 제공된 예시적 서열목록에 나열되어 있다.
일부 실시양태에서, TCR은 CD3과 회합되고 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체(또는 TCR/CD3 복합체)를 형성한다. 이 실시양태에서, 세포는 α 및 β TCR 쇄, CD3γ, δ 및 ε 폴리펩타이드, 및 ζ 쇄를 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이들로 구성된 폴리펩타이드에 의해 형성된 TCR/CD3 복합체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질도입된다. TCR/CD3 복합체는 상이한 모듈을 형성하는 데 있어서 상이한 역할을 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 복합체는 항원 특이적 인식에 관여한다. 이 실시양태에서, 복합체는 주로 CD3 및 ζ 쇄의 세포질 꼬리 내의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프("ITAM")의 존재를 통해 신호 전달도입에 관여한다. 일부 실시양태에서, TCR/CD3 복합체는 항원, 수퍼항원 또는 항체(예를 들면, 항-수용체 항체)에 의해 자극된 TCR 신호전달 경로에 관여한다. 한 실시양태에서, TCR/CD3 복합체의 외인성 발현은 CD3 음성 세포에서 TCR 신호전달 경로를 용이하게 한다. CD3 음성 세포의 비한정적 예로는 BW5147(ATCC 번호 TIB-472), Nk-92(ATCC 번호 CRL-2407), Mino(ATCC 번호 PTS-CRL-3000) 및 JeKo-1(ATCC 번호 CRL-3006)이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 세포"는 pMHC와 커플링된 나노입자를 포함하는, 시험 물질의 효능을 평가하기 위해 제공된 세포를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포는 JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM 또는 Molt-4로부터 선택되는 T 계통 세포이다. 이들은 임의의 적절한 종, 예를 들면, 동물, 포유동물, 인간, 개, 고양이, 말, 소 또는 양으로부터 유래할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 세포는 이펙터 세포, 예컨대, 면역 세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 T 세포 수용체(TCR), TCR-회합된 CD3 다중유닛 쇄 복합체, 및/또는 TCR 경로 의존적 리포터 및 CD4 또는 CD8 수용체를 발현한다. 추가 양태에서, 세포는 보조자극 분자 및/또는 사이토카인에 대한 수용체도 발현한다. 특정 실시양태에서, TCR은 뮤린화된다(즉, TCR은 뮤린 CD4 분자와 상호작용하도록 최적화된다).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "리포터"는 세포의 생리학적 변화 또는 상태에 의존하거나, 이러한 변화 또는 상태와 상호관련되어 있거나, 이러한 변화 또는 상태에 의해 활성화되는 특성(예를 들면, 활성, 발현, 국소화, 상호작용, 변형 등)을 가진, 단리된 세포의 표면 또는 내부에 있는 요소를 의미한다. 예를 들면, "TCR 경로 의존적 리포터"는 TCR 경로의 활성화 또는 조절에 의해 활성화되거나, 이러한 활성화 또는 조절에 의존하는 특성을 가진, 세포의 표면 또는 내부에 있는 요소를 지칭한다. 일부 실시양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 업스트림 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터(예를 들면, NFAT 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 및 IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터)에 의해 활성화된다. 한 실시양태에서, 리포터(예를 들면, TCR 경로 의존적 리포터)는 루시퍼라제, 베타 락타마제, CAT, SEAP, 형광 단백질, 정량가능한 유전자 생성물 및/또는 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하거나, 이러한 유전자로 본질적으로 구성되거나, 이러한 유전자로 구성된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CD3"(분화의 클러스터 3)은 T 세포 수용체와 회합된 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CD3에 대해 유도된 항체는 T 림프구에서 활성화 신호를 생성할 수 있다. CD28, CD134, CD137 및 CD27을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 T 세포 활성화 리간드도 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD3은 4개의 상이한 쇄들을 포함하거나, 대안적으로 이러한 쇄들로 본질적으로 구성되거나, 이러한 쇄들로 구성된다. 포유동물의 경우, 상기 4개의 상이한 쇄들은 CD3감마, CD3델타, CD3엡실론 및 CD3제타이다. CD3 쇄의 비한정적 예는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 CAA72995.1, AAI45927.1, NP_998940.1, AAB24559.1, NP_000723.1, AEQ93556.1 및 EAW67366.1에서 발견될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CD4"(분화의 클러스터 4)는 면역 세포, 예를 들면, T 헬퍼 세포, 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포의 표면에서 발견되는 당단백질을 지칭한다. 일부 실시양태에서, CD4는 TCR에 대한 보조수용체로서 작용하고 티로신 키나제(예를 들면, Lck)를 집결시킨다. CD4의 비한정적 예는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAC36010.1, CAA72740.1, AFK73394.1, CAA60883.1 및 AAH25782.1에서 확인될 수 있다. CD4의 예시적 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열은 하기 제공된 예시적 서열목록에 나열되어 있다.
용어 "리보좀 스킵핑 서열"은 유전자 서열들이 별개의 폴리펩타이드들로서 번역되도록(즉, 비시스트론성(biscistronic) 또는 멀티시스트론성(multicistronic) 서열로서 번역되도록) 동일한 프로모터의 조절 하에서 2개 이상의 유전자 서열들 사이에 도입될 수 있는 임의의 서열을 지칭한다. 리보좀 스킵핑 서열의 예로는 2A 펩타이드 서열이 있으나 이것으로 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 1개의 리보좀 스킵핑 서열이 유전자 서열들 사이에 도입된다. 또 다른 실시양태에서, 2개 이상의 리보좀 스킵핑 서열들이 유전자 서열들 사이에 도입된다.
용어 "2A 리보좀 스킵핑 서열"은 컨센서스 모티프인 Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro을 포함하는 펩타이드 서열을 지칭하고, 이때 X는 임의의 아미노산을 표시한다. 한 실시양태에서, 2A 리보좀 스킵핑 서열은 돼지 테스코바이러스(teschovirus)-1 2A(P2A); T2A, 즉 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스 2A(T2A); 말 비염 A 바이러스(ERAV) 2A(E2A); FMDV 2A(F2A), 또는 이들의 조합을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성된다. 2A 펩타이드 서열의 비한정적 예로는 하기 제공된 예시적 서열목록에서 제공된 서열들이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
2A 리보좀 스킵핑 서열은 1개의 발현 벡터로 다수의 유전자들을 발현할 수 있게 한다. 예를 들면, 2A 리보좀 스킵핑 서열을 갖는 발현 벡터는 CD3 복합체를 구성하는 모든 4종의 단백질들을 발현할 수 있다. 한 실시양태에서, 발현 벡터의 비한정적 예시적 코딩 영역 서열은 하기 제공된 예시적 서열목록에 뮤린 CD3델타-F2A-감마-T2A-엡실론-P2A-제타의 폴리뉴클레오타이드 서열 및 뮤린 CD3델타-F2A-감마-T2A-엡실론-P2A-제타의 폴리펩타이드 서열, 및 이들 각각의 균등물로서 나열되어 있다.
또 다른 양태에서, 2A 리보좀 스킵핑 서열을 갖는 발현 벡터는 TCR의 다수의 서브유닛들을 발현할 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터의 비한정적 예시적 코딩 영역 서열은 서열번호 527 내지 531(IGRP13-25 TCR), 533 내지 537(뮤린화된 IGRP13-25 TCR), 538 내지 542(PPI76-90 TCR), 또는 543 내지 547(BDC 2.5 TCR)로 제공된다.
용어 "IRES 서열" 또는 "내부 리보좀 도입 부위 서열"은 RNA 서열의 중간에서 번역 시작을 허용하는 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. 일부 실시양태에서, IRES 서열을 2개의 유전자 서열들(예를 들면, 리포터 오픈 리딩 프레임) 사이에 삽입함으로써 mRNA 분자의 5' 말단에 결합된 5'-캡(cap) 구조와 독립적으로 다운스트림 단백질 코딩 영역의 번역을 유도할 수 있다. 적합한 IRES 서열은 당분야에서 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, IRES 서열은 폴리오바이러스, 리노바이러스, 뇌심근염 바이러스, 수족구병 바이러스, 간염 A 바이러스, 간염 C 바이러스, 고전적 돼지열 바이러스 및 소 바이러스성 설사 바이러스로부터 유래한다. IRES 서열의 비한정적 예는 전체로서 참고로 도입된 웹사이트(www.iresite.org)에서 확인될 수 있다. IRES 서열의 비한정적 예는 서열번호 524 내지 526으로 제공되고, EMCV IRES 서열, pBag1 IRES 서열 및 합성 IRES 서열, 및 이들 각각의 균등물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
용어 "루시퍼라제"는 생체발광 반응을 촉매작용할 수 있는 단백질을 의미한다. 예를 들면, 효소로서 루시퍼라제는 기질(예를 들면, 루시페린, 장쇄 알데하이드 또는 콜렌트라진(colentrazine)), 에너지 공급원(예를 들면, ATP) 및 산소와 함께 제공될 때 신호를 생성할 수 있다. 본 개시에 적합한 루시퍼라제 서열은 당분야에서 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 루시퍼라제 유전자는 반딧불이(예를 들면, 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis))로부터 유래한다. 루시퍼라제 서열의 비한정적 예는 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAR20792.1, AAL40677.1, AAL40676.1 및 AAV35379.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 루시퍼라제 리포터 시스템은 상업적으로 입수될 수 있다(예를 들면, 프로메가 카탈로그 # E1500 또는 E4550). 루시퍼라제 단백질 및 폴리펩타이드를 코딩하는 예시적 폴리뉴클레오타이드는 이하에 제공된 바와 같이 서열번호 555 및 556으로 제공된다.
용어 "베타 락타마제"는 베타-락탐 고리를 분해할 수 있는 효소 또는 단백질을 지칭한다. 한 실시양태에서, 베타 락타마제는 베타-락탐 항생제의 베타-락탐 고리를 부분적으로 또는 완전히 가수분해할 수 있는, 세균에 의해 생성된 효소이다. 베타 락타마제 서열의 비한정적 예는 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AMM70781.1, CAA54104.1 및 AAA23441.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다.
용어 "클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제" 또는 "CAT"는 아세틸 기를 아세틸화된 보조효소 A로부터 클로람페니콜 또는 관련 유도체에게 전달할 수 있는 효소 또는 단백질을 지칭한다. "CAT"의 비한정적 예는 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 OCR39292.1, WP_072643749.1, CUB58229.1 및 KIX82948.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. CAT 어세이는 상업적으로 입수될 수 있다(예를 들면, 써말 피셔(Thermal Fisher)로부터의 FAST CAT® 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 어세이 키트(F-2900)).
용어 "분비형 배아 알칼리성 포스파타제" 또는 "SEAP"는 프로모터 활성 또는 유전자 발현을 연구하기 위한 리포터로서 사용되는, SEAP 유전자(예를 들면, 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크 수납 번호 NP 001623 및 이의 균등물)에 의해 코딩된 효소를 지칭한다. SEAP 서열의 비한정적 예는 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 ADV10306.1, AAB64404.1, EEB84921.1 및 EFD70636, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. SEAP 활성은 루미노미터(예를 들면, 프로메가(Promega)로부터의 터너 바이오시스템스 베리타스 마이크로플레이트 루미노미터)에 의해 측정될 수 있다.
용어 "형광 단백질"은 적절한 전자기 방사선에 의해 여기될 때 광을 방사할 수 있고 천연 또는 조작된 서열이고 애쿠오레아(Aequorea) 관련 형광 단백질의 아미노산 서열로부터 유래한 아미노산 서열을 갖는 임의의 단백질을 지칭한다. 형광 단백질로부터 방사하는 광은 형광 판독기(예를 들면, FL600 형광 마이크로플레이트 판독기)에 의해 측정될 수 있다. 형광 단백질의 비한정적 예로는 녹색 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 적색 형광 단백질(RFP), 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 형광 부분 또는 유도체가 있다. 형광 단백질의 서열은 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AFA52654.1, ACS44348.1 및 AAQ96629.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 형광 단백질 프로모터 리포터는 상업적으로 입수될 수 있다(예를 들면, 타카라(TakaRa) 카탈로그 # 631089).
"전사 조절 하에서"는 당분야에서 잘 이해되는 용어이고, 폴리뉴클레오타이드 서열, 통상적으로 DNA 서열의 전사가 전사의 시작에 기여하거나 전사를 촉진하는 요소에 작동가능하게 연결되어 있는 지에 의해 좌우된다는 것을 시사한다. "작동가능하게 연결된"은 폴리뉴클레오타이드들이 세포에서 작용할 수 있게 하는 방식으로 정렬되어 있다는 것을 의미한다.
폴리뉴클레오타이드에 적용될 때 용어 "코딩한다"는 폴리뉴클레오타이드가 그의 천연 상태로 존재하거나 당분야에서 숙련된 자에게 잘 공지되어 있는 방법에 의해 조작될 때 폴리펩타이드 및/또는 이의 단편에 대한 mRNA를 생성하도록 전사될 수 있고/있거나 번역될 수 있는 경우 폴리펩타이드를 "코딩한다"라고 한다는 것을 의미한다. 안티센스 가닥은 이러한 핵산의 상보체이고, 코딩 서열은 이로부터 유추될 수 있다.
용어 "프로모터"는 특정 유전자의 전사를 시작하는 DNA의 영역을 지칭한다. 프로모터는 전사를 적절히 시작하기 위해 요구된 프로모터의 최소 부분인 코어 프로모터를 포함하고 조절 요소, 예컨대, 전사 인자 결합 부위도 포함할 수 있다. 조절 요소는 전사를 촉진할 수 있거나 전사를 억제할 수 있다. 프로모터의 조절 요소는 전사 활성화제 또는 전사 억제제를 위한 결합 부위일 수 있다. 프로모터는 항시성 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 항시성 프로모터는 항상 활성 상태로 존재하고/하거나 기초 수준의 전사보다 더 높은 유전자의 전사를 꾸준히 유도하는 프로모터를 지칭한다. 이의 비한정적 예로는 포스포글리세레이트 키나제 1(PGK) 프로모터; SSFV, CMV, MNDU3, SV40, Ef1a, UBC 및 CAGG가 있다. 유도성 프로모터는 세포에 첨가되거나 세포에서 발현된 분자 또는 인자에 의해 유도될 수 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터는 유도의 부재 하에서 기초 수준의 전사를 여전히 일으킬 수 있으나, 유도는 전형적으로 단백질의 유의미하게 더 많은 생성을 이끌어낸다.
인핸서는 표적 서열의 발현을 증가시키는 조절 요소이다. "프로모터/인핸서"는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오타이드이다. 예를 들면, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부는 프로모터 및 인핸서 기능 둘 다를 함유한다. 인핸서/프로모터는 "내인성" 또는 "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터일 수 있다. "내인성" 인핸서/프로모터는 게놈에서 소정의 유전자와 천연적으로 연결되어 있는 인핸서/프로모터이다. "외인성" 또는 "이종성" 인핸서/프로모터는 유전자의 전사가 연결된 인핸서/프로모터에 의해 유도되도록 유전적 조작(즉, 분자생물학적 기법)에 의해 그 유전자에 나란히 놓인 인핸서/프로모터이다. 본 개시의 폴리뉴클레오타이드는 임의적으로 인핸서 서열을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "NFAT 프로모터", "NFAT 전사 인자 결합 DNA 서열" 또는 "활성화된 T 세포의 핵 인자 프로모터"는 하나 이상의 NFAT 요소를 포함하거나, 이러한 요소로 본질적으로 구성되거나, 이러한 요소로 구성된 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, NFAT 프로모터와 NFAT 전사 인자(예를 들면, NFATc1, NFATc2, NFATc3, NFATc4 또는 NFAT5)의 결합은 다운스트림 서열(예를 들면, 리포터)의 전사를 증가시키거나 촉진한다. NFAT 프로모터 서열은 일반적으로 진뱅크에서 확인되고, 진뱅크로부터의 하기 서열들, 또는 이 서열들과 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 %, 99% 또는 100% 동일한 서열을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 진뱅크 수탁번호 DQ904462.1, KX591058.1, AF480838.1 및 이들 각각의 균등물.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "AP-1 프로모터" 또는 "AP-1 전사 인자 결합 DNA 서열"은 하나 이상의 AP-1 전사 활성화 요소를 포함하거나, 대안적으로 이러한 요소로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 요소로 구성된 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, AP-1 프로모터와 AP-1 전사 인자의 결합은 다운스트림 서열(예를 들면, 리포터 유사 루시퍼라제 또는 CAT)의 전사를 증가시키거나 촉진한다. AP-1 프로모터는 인간, 마우스, 래트, 제브라피시, 파리 또는 임의의 다른 종으로부터 유래할 수 있다. 한 실시양태에서, AP-1 프로모터는 서열 ATGAGTCAT 및 이의 균등물, 또는 ATGAGTCAT에 대한 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "NF-κB 프로모터" 또는 "NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열"은 하나 이상의 NF-κB 요소를 포함하거나, 대안적으로 이러한 요소로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 요소로 구성된 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 동종이량체 또는 이종이량체인 Rel/NF-κB 전사 인자와 NF-κB 프로모터의 결합은 다운스트림 서열(예를 들면, 리포터 유사 루시퍼라제 또는 CAT)의 전사를 증가시키거나 시작한다. NF-κB 프로모터 또는 결합 부위의 일부 실시양태는 전체로서 참고로 도입된 미국 특허 제8,299,237호에 개시되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IL-2 프로모터" 또는 "IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열"은 T 세포 자극에 반응하는 하나 이상의 IL-2 전사 활성화 요소를 포함하거나, 대안적으로 이러한 요소로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 요소로 구성된 서열을 지칭한다. 한 실시양태에서, 전사 인자와 IL-2 프로모터의 결합은 다운스트림 서열(예를 들면, 리포터 유사 루시퍼라제 또는 CAT)의 전사를 증가시키거나 시작한다. 한 실시양태에서, IL-2 프로모터는 인간, 마우스, 래트 또는 제브라피시로부터 유래한다. 일부 비한정적 예시적 IL-2 프로모터 서열들은 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크 수탁번호 AJ006884.1, EF397241.1, AB041341.1, KU058846.1, EF457240.1 및 HM802330.1, 및 이들 각각의 균등물로부터 입수될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 벡터가 예를 들면, 형질전환의 과정에 의해 세포 내부에 배치될 때 복제될 수 있도록 온전한 레플리콘을 포함하는 비-염색체성 핵산을 지칭한다. 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 바큘로바이러스, 변형된 바큘로바이러스, 파포바이러스, 또는 다른 방식으로 변형된 천연 생성 바이러스를 포함한다. 핵산을 전달하기 위한 예시적 비-바이러스 벡터는 네이키드 DNA; 단독으로 또는 양이온성 중합체와 함께 양이온성 지질과 복합체를 형성한 DNA; 음이온성 리포좀 및 양이온성 리포좀; 일부 경우 리포좀에 함유된, 양이온성 중합체, 예컨대, 불균질한 폴리라이신, 정해진 길이의 올리고펩타이드 및 폴리에틸렌 이민과 축합된 DNA를 포함하는 DNA-단백질 복합체 및 입자; 및 바이러스 및 폴리라이신-DNA를 포함하는 삼원 복합체의 사용을 포함한다.
"바이러스 벡터"는 생체내에서, 생체외에서 또는 시험관내에서 숙주 세포 내로 전달될 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 재조합적으로 생성된 바이러스 또는 바이러스 입자로서 정의된다. 바이러스 벡터의 예로는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터 등이 있다. 유전자 요법 및 면역요법에서 사용하기 위해 알파바이러스 벡터, 예컨대, 셈리키 포레스트(Semliki Forest) 바이러스 기반 벡터 및 신드비스(Sindbis) 바이러스 기반 벡터도 개발되었다. 문헌(Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439) 및 문헌(Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827)을 참조한다.
유전자 전달이 렌티바이러스 벡터에 의해 매개되는 양태에서, 벡터 구축물은 렌티바이러스 게놈 또는 이의 부분, 및 치료 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "렌티바이러스 매개 유전자 전달" 또는 렌티바이러스 형질도입"은 동일한 의미를 갖고, 바이러스가 세포 내로 들어가 그의 게놈을 숙주 세포 게놈에 삽입함으로써 유전자 또는 핵산 서열을 숙주 세포 내로 안정하게 전달하는 과정을 지칭한다. 바이러스는 그의 정상 감염 기작을 통해 숙주 세포 내로 들어갈 수 있거나, 상이한 숙주 세포 표면 수용체 또는 리간드에 결합하여 세포 내로 들어가도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스는 RNA의 형태로 그의 유전 정보를 갖지만, 일단 바이러스가 세포를 감염시키면, RNA가 감염된 세포의 게놈 DNA 내로 삽입되는 DNA 형태로 역전사된다. 삽입된 DNA 형태는 전구바이러스로서 지칭된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 렌티바이러스 벡터는 바이러스 또는 바이러스 유사 도입 기작을 통해 외인성 핵산을 세포 내로 도입할 수 있는 바이러스 입자를 지칭한다. "렌티바이러스 벡터"는 다른 레트로바이러스 벡터에 비해 비분열 세포를 형질도입하는 데 있어서 일부 장점들을 가진, 당분야에서 잘 공지되어 있는 레트로바이러스 벡터의 일종이다. 문헌(Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelberg)을 참조한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터는 온코레트로바이러스(MLV를 함유하는 레트로바이러스의 하위군) 및 렌티바이러스(HIV를 함유하는 레트로바이러스의 하위군)에 기반을 두거나 이러한 바이러스들로부터 유래한다. 예로는 ASLV, SNV 및 RSV가 있고, 이들 모두가 렌티바이러스 벡터 입자 생성 시스템을 위한 팩키징 성분과 벡터 성분으로 분할된다. 본 발명에 따른 렌티바이러스 벡터 입자는 특정 레트로바이러스의 유전적으로 또는 다른 방식으로(예를 들면, 팩키징 세포 시스템의 특정 선택에 의해) 변경된 버전에 기반을 둘 수 있다.
본 발명에 따른 벡터 입자가 특정 레트로바이러스에 "기반을 둔다"는 것은 상기 벡터가 그 특정 레트로바이러스로부터 유래한다는 것을 의미한다. 벡터 입자의 게놈은 골격으로서 그 레트로바이러스의 성분을 포함한다. 벡터 입자는 역전사 및 삽입 시스템을 포함하는, RNA 게놈과 잘 맞는 필수 벡터 성분을 함유한다. 통상적으로, 이들은 특정 레트로바이러스로부터 유래한 gag 및 pol 단백질을 포함할 것이다. 따라서, 벡터 입자의 구조적 성분들 중 대부분은 원하는 유용한 성질을 제공하도록 유전적으로 또는 다른 방식으로 변경될 수 있을지라도 통상적으로 그 레트로바이러스로부터 유래할 것이다. 그러나, 일부 구조적 성분들, 특히 env 단백질은 상이한 바이러스로부터 유래할 수 있다. 감염되거나 형질도입되는 벡터 숙주 범위 및 세포 유형은 벡터 입자 생성 시스템에서 상이한 env 유전자를 사용하여 상이한 특이성을 벡터 입자에게 제공함으로써 변경될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Jurkat"는 인간 림프구 세포주를 지칭한다. 상이한 유형의 Jurkat 세포가 있다. 한 실시양태에서, Jurkat 세포는 IL-2를 생성할 수 있다. Jurkat 세포는 상업적으로 입수될 수 있거나 세포주 저장소(예를 들면, ATCC 번호 TIB-152)로부터 입수될 수 있고, 상기 세포를 배양하는 방법 및 조성물은 그 안에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "JurMa" 또는 "Jurkat/MA"는 내인성 TCR 발현을 결여하는 Jurkat 세포주를 지칭한다. JurMa 세포의 한 실시양태는 암스테르담 의과대학 센터(Universiteit Medisch Centrum, Amsterdam)의 에릭 후이베르그 브리예 박사(Dr. Erik Hooijberg Vrije)에 의해 확립되었다(2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 문헌(Asai et al., PLoS One. 8(2): e56820 (2013)) 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "BW5147"은 T 세포 기능을 연구하는 데 사용될 수 있는 림프구 세포주를 지칭한다. 일부 실시양태에서, BW5147 세포는 림프종으로부터 유래한다. 상업적으로 입수될 수 있거나 세포주 저장소(예를 들면, ATCC 번호 TIB-472)로부터 입수될 수 있는 많은 유형의 BW5147 세포들이 있고, 상기 세포를 배양하는 방법 및 조성물은 그 안에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "HuT-78"은 림프구 세포주를 지칭한다. 한 실시양태에서, HuT-78은 T 세포 림프종 세포주이다. HuT-78 세포는 상업적으로 입수될 수 있거나(예를 들면, Sigma-Aldrich) 세포주 저장소(예를 들면, ATCC 번호 TIB-161)로부터 입수될 수 있고, 상기 세포를 배양하는 방법 및 조성물은 그 안에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CEM"은 림프구 세포주를 지칭한다. 한 실시양태에서, CEM 세포는 말초 혈액 림프모세포이다. CEM 세포는 세포주 저장소(예를 들면, ATCC 번호 CRL-2265 또는 CCL-119)로부터 입수될 수 있고, 상기 세포를 배양하는 방법 및 조성물은 그 안에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Molt-4"는 림프구 세포주를 지칭한다. 한 실시양태에서, Molt-4 세포는 급성 림프모구성 백혈병 세포이다. Molt-4 세포는 상업적으로 입수될 수 있거나(예를 들면, Sigma-Aldrich) 세포주 저장소(예를 들면, ATCC 번호 CRL-1582)로부터 입수될 수 있고, 상기 세포를 배양하는 방법 및 조성물은 그 안에 기재되어 있다.
"결합가"는 나노입자 코어당 pMHC 또는 나노입자당 보조자극 분자, 및/또는 나노입자 코어당 사이토카인의 수를 의미한다.
나노입자 코어당 pMHC 또는 나노입자당 보조자극 분자, 및/또는 나노입자 코어당 사이토카인을 언급할 때 "밀도"는 링커도 포함할 수 있는 외부 층을 갖는 나노입자 코어의 표면적으로서 계산된다. 표면적은 사용된 구축물의 총 이용가능한 표면적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항원"은 대상체의 면역 반응, 또는 면역 세포, 바람직하게는 T 또는 B 세포의 증폭을 유도할 수 있는 분자의 전체, 부분, 단편 또는 분절을 지칭한다. 한 양태에서, 항원은 암 관련 항원이다. 또 다른 양태에서, 항원은 자가면역 장애 관련 항원이다. 추가 양태에서, 항원은 알레르겐이다.
용어 "알킬"은 1개 내지 10개의 탄소 원자(즉, C1-C10 알킬), 1개 내지 6개의 탄소 원자(즉, C1-C6 알킬), 또는 1개 내지 4개의 탄소 원자를 갖는 1가 포화된 지방족 하이드로카빌 기를 지칭한다. 이 용어는 예를 들면, 선형 하이드로카빌 기 및 분지된 하이드로카빌 기, 예컨대, 메틸(CH3-), 에틸(CH3CH2-), n-프로필(CH3CH2CH2-), 이소프로필((CH3)2CH-), n-부틸(CH3CH2CH2CH2-), 이소부틸((CH3)2CHCH2-), sec-부틸((CH3)(CH3CH2)CH-), t-부틸((CH3)3C-), n-펜틸(CH3CH2CH2CH2CH2-) 및 네오펜틸((CH3)3CCH2-)을 포함한다.
용어 "알콕시"는 -O-알킬을 지칭한다.
"모방물질"은 소정의 리간드 또는 펩타이드의 유사체로서, 리간드와 실질적으로 유사한 유사체이다. "실질적으로 유사한"은 모방물질이 리간드의 분자량의 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만을 총체적으로 차지하는 하나 이상의 작용기 또는 변형을 가진다는 점을 제외하고 유사체가 리간드와 유사한 결합 프로파일을 가진다는 것을 의미한다.
"면역 세포"는 예를 들면, 골수에서 생성된 조혈 줄기 세포(HSC)로부터 유래한 백혈 세포(백혈구), 림프구(T 세포, B 세포, 천연 킬러(NK) 세포), 및 골수 유래 세포(호중구, 호산구, 호염기구, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포)를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "B 세포"는 적응 면역 시스템의 체액성 면역에 관여하는 림프구의 일종을 지칭한다. B 세포는 원칙적으로 항체를 만드는 기능을 하고, 항원 제시 세포로서 사용되고, 사이토카인을 방출하고, 항원 상호작용에 의한 활성화 후 기억 B 세포를 발생시킨다. B 세포는 세포 표면에의 B 세포 수용체의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대, T 세포와 구별된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "T 세포"는 흉선에서 성숙하는 림프구의 일종을 지칭한다. T 세포는 세포 매개 면역에서 중요한 역할을 하고, 세포 표면에의 T 세포 수용체의 존재에 의해 다른 림프구, 예컨대, B 세포와 구별된다. T 세포는 단리될 수 있거나 상업적으로 입수가능한 공급원으로부터 수득될 수 있다. "T 세포"는 T 헬퍼 세포(CD4+ 세포), 세포독성 T 세포(CD8+ 세포), 천연 킬러 T 세포, T 조절 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하는, CD3을 발현하는 모든 종류의 면역 세포들을 포함한다. "세포독성 세포"는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, 천연 킬러(NK) 세포 및 호중구를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 T 세포"는 추가 분화를 필요로 하지 않으면서 항원에 특이적으로 결합할 수 있고 면역 반응(이펙터 기능)을 매개할 수 있는 T 세포를 지칭한다. 이펙터 T 세포의 예로는 CTL, TH1 세포, TH2 세포, 이펙터 기억 세포 및 T 헬퍼 세포가 있다. 이펙터 T 세포와 대조적으로, 미감작 T 세포는 그의 특이적 항원-MHC 복합체와 우연히 만나지 않았고 이펙터 T 세포로의 증식 및 분화에 의해서도 이 복합체에 반응하지 않았다. 이펙터 T 세포는 휴면(세포 주기의 GO 기) 상태일 수 있거나 활성화될(증식될) 수 있다.
용어 "항-병원성 자가반응성 T 세포"는 항-병원성을 갖는 T 세포(즉, 자가면역 질환, 예컨대, MS, MS 관련 질환 또는 장애, 또는 당뇨병 전단계를 방해하는 T 세포)를 지칭한다. 이 T 세포는 소염성 T 세포, 중추 기억 T 세포, 이펙터 기억 T 세포, 기억 T 세포, 낮은 결합력 T 세포, T 헬퍼 세포, 자가조절 T 세포, 세포독성 T 세포, 천연 킬러 T 세포, 조절 T 세포, TR1 세포, 억제자 T 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 등을 포함할 수 있다.
용어 "소염성 T 세포"는 소염성 반응을 촉진하는 T 세포를 지칭한다. T 세포의 소염성 기능은 소염성 단백질, 사이토카인, 케모카인 등의 생성 및/또는 분비를 통해 달성될 수 있다. 소염성 단백질은 면역 반응을 억제하는 항-증식성 신호도 포괄하기 위한 것이다. 소염성 단백질은 IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, IL-23, IL-27, IFN-α, TGF-β, IL-1ra, G-CSF, 및 TNF 및 IL-6에 대한 가용성 수용체를 포함한다.
용어 "분화된"은 제1 유형의 세포가 제2 유형의 세포로 발달하도록 유도된 때를 의미한다. 일부 실시양태에서, 동족 T 세포는 조절 TR1 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, 활성화된 T 세포는 TR1 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, 기억 T 세포는 TR1 세포로 분화된다. 일부 실시양태에서, B 세포는 조절 B 세포로 분화된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "놉-인-홀"은 돌출부가 캐비티(cavity) 내에 위치되어 이종다량체 형성을 촉진하도록 제1 폴리펩타이드의 계면에서 돌출부(또는 "놉")를 요구하고 제2 폴리펩타이드의 계면에서 상응하는 캐비티(또는 "홀")를 요구하는 폴리펩티딜 구조를 지칭한다. 돌출부는 제1 폴리펩타이드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들면, 페닐알라닌 또는 티로신)로 대체함으로써 구축된다. 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 캐비티는 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 쓰레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩타이드의 계면에서 생성된다. 돌출부와 캐비티는 당분야에서 숙련된 자에 의해 관례적인 방법을 이용함으로써 합성 수단, 예컨대, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 변경 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드의 계면은 제1 폴리펩타이드의 Fc 도메인에 위치하고; 제2 폴리펩타이드의 계면은 제2 폴리펩타이드의 Fc 도메인에 위치한다. 놉-인-홀 이종다량체 및 이의 제조 방법 및 용도는 전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제5,731,168호, 제5,807,706호, 제5,821,333호, 제7,642,228호, 제7,695,936호, 제8,216,805호 및 제8,679,785호에 개시되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "MHC-알파-Fc/MHC-베타-Fc"는 MHC 클래스 II α 쇄 및 항체 Fc 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 MHC 클래스 II β 쇄 및 항체 Fc 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체를 지칭한다. 놉-인-홀 MHC-알파-Fc/MHC-베타-Fc는 하나의 Fc 도메인의 돌출부가 다른 Fc 도메인의 상응하는 캐비티 내에 상보적으로 위치함으로써, 각각의 폴리펩타이드의 Fc 도메인들이 서로 접할 것도 요구한다.
용어 "단리된"은 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편(들)이 천연 상태에서 일반적으로 그 자신과 회합되어 있는 세포 성분 또는 다른 성분으로부터 분리되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드의 경우, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 염색체에서 일반적으로 그 자신과 회합되어 있는 5' 서열 및 3' 서열로부터 분리되어 있는 폴리뉴클레오타이드이다. 당분야에서 숙련된 자에게 자명한 바와 같이, 비-천연 생성 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체, 또는 이들의 단편(들)은 그의 천연 생성 대응물로부터 구별되기 위해 "단리"를 요구하지 않는다. 또한, "농축된", "분리된" 또는 "희석된" 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체, 또는 이들의 단편(들)은 부피당 분자의 농도 또는 수가 그의 천연 생성 대응물의 부피당 분자의 농도 또는 수보다 더 크거나("농축된") 더 적다("분리된")는 점에서 그의 천연 생성 대응물과 구별될 수 있다. 예를 들면, 그 자신의 일차 서열 또는 그 자신의 글리코실화 패턴에 의해 천연 생성 대응물과 상이한 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편(들)은 그의 일차 서열 또는 대안적으로 그의 글리코실화 패턴과 같은 또 다른 특성에 의해 그의 천연 생성 대응물과 구별될 수 있기 때문에 그의 단리된 형태로 존재할 필요가 없다. 포유동물 세포, 예컨대, T 세포는 그 자신이 유기체에서 발견된 해부학적 부위로부터 제거된 경우 단리되어 있다.
"자가반응성 T 세포"는 T 세포를 함유하는 동일한 개체에 의해 생성되고 함유된 분자인 "자가항원"을 인식하는 T 세포이다.
"병원성 T 세포"는 T 세포를 함유하는 대상체에 유해한 T 세포인 반면, 비-병원성 T 세포는 대상체에 실질적으로 유해하지 않고, 항-병원성 T 세포는 병원성 T 세포의 유해함을 감소시키거나, 완화시키거나, 억제하거나 무효화한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 조절 B 세포 또는 B 조절 세포("B-reg")는 CD1d 및 CD5의 발현 및 IL-10의 분비를 특징으로 하는 소염성 효과를 책임지는 세포를 지칭한다. B-reg는 Tim-1의 발현에 의해서도 확인되고, Tim-1 라이게이션을 통해 유도되어 내성을 촉진할 수 있다. B-reg의 능력은 많은 자극 인자들, 예컨대, 톨(toll) 유사 수용체, CD40-리간드 등에 의해 유도되는 것으로 밝혀졌다. 그러나, B-reg의 전체 특징규명은 진행되고 있다. B-reg는 높은 수준의 CD25, CD86 및 TGF-β도 발현한다. B 세포의 이 서브세트는 Th1 증식을 억제함으로써, 자가내성의 유지에 기여할 수 있다. B-reg 기능의 증강은 자가면역 질환의 더 우수한 조절에 기여하는 많은 면역조절 약물들의 목적이 되어야 한다. 예를 들면, 2013년 10월 31일에 마지막으로 접속된 웹사이트(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23707422)를 참조한다.
1형 T 조절(TR1) 세포는 조절 성질을 갖고 시험관내에서 및 생체내에서 항원 특이적 면역 반응을 억제할 수 있는 CD4+ T 세포의 서브세트이다. 이 TR1 세포는 사이토카인 생성이라는 그의 독특한 프로파일에 의해 정의되고 높은 수준의 IL-10 및 TGF-베타를 만드나, IL-4 또는 IL-2를 만들지는 못한다. 이 세포에 의해 생성된 IL-10 및 TGF-베타는 시험관내에서 일차 미감작 T 세포의 억제를 매개한다. TR 세포가 생체내에 존재한다는 증거도 있고, 동종이계 줄기 세포 이식을 받은 중증 복합 면역결핍을 갖는 환자 내의 높은 IL-10 생성 CD4(+) T 세포의 존재는 문서로 기록되어 있다. TR1 세포는 말초 내성의 조절에 관여하고, 생체내에서 면역 반응을 조절하기 위한 세포 요법으로서 잠재적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 2013년 10월 31일에 마지막으로 접속된 웹사이트(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10887343)를 참조한다.
TR1 세포는 높은 수준의 IL-10 및 TGF-베타를 생성하는 그의 능력에 의해 정의된다. 다양한 항원들에 특이적인 TR1 세포가 생체내에서 생성되나, 시험관내에서 IL-10의 존재 하에서 미감작 CD4+ T 세포로부터 분화할 수도 있다. TR1 세포는 IL-15에 의해 극복될 수 있는 낮은 증식 능력을 갖는다. TR1 세포는 IL-10 및 TGF-베타의 생성을 통해 미감작 T 헬퍼 1형 또는 2형 반응 및 기억 T 헬퍼 1형 또는 2형 반응을 억제한다. 분자 수준에서의 TR1 세포의 추가 특징규명은 그의 작용 기작을 정의할 것이고 그와 TR 세포의 다른 서브세트의 관계를 명확히 할 것이다. 신규 표적을 확인하여 신규 치료제를 개발하기 위한 TR1 세포의 사용, 및 말초 내성을 조절하기 위한 세포 요법으로서의 TR1 세포의 사용은 예상될 수 있다. 예를 들면, 2013년 10월 31일에 마지막으로 접속된 웹사이트(ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11722624)를 참조한다.
"유효량"은 의도된 목적을 달성하기에 충분한 양이고; 이러한 목적의 비한정적 예로는 T 세포 수용체의 복합체 형성, 면역 반응의 시작, 면역 반응의 조절, 염증 반응의 억제, 및 T 세포 활성 또는 T 세포 집단의 조절이 있다. 한 실시양태에서, 유효량은 표적 세포의 TCR 경로를 자극하기에 충분한 양이다. 한 양태에서, 유효량은 언급된 치료 목적을 달성하도록 작용하는 양, 즉 치료 유효량이거나, 측정가능한 반응을 제공하도록 작용하는 양이다. 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 유효량 또는 유효 투여량은 목적 및 조성물에 따라 달라지고, 본 개시에 따라 결정될 수 있다.
치료 조성물의 유효량은 의도된 목적을 기반으로 결정된다. 용어 "단위 용량" 또는 "투여량"은 대상체에서 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고, 각각의 단위는 그의 투여, 즉 적절한 경로 및 용법과 관련하여 상기 논의된 원하는 반응을 생성하도록 계산된 소정의 양의 조성물을 함유한다. 치료 횟수 및 단위 용량 둘 다에 따라 투여될 양은 원하는 결과 및/또는 보호에 의해 좌우된다. 조성물의 정확한 양은 의사의 판단에 의해서도 좌우되고 각각의 개체에 특유하다. 용량에 영향을 미치는 요인은 대상체의 신체적 및 임상적 상태, 투여 경로, 의도된 치료 목적(증상의 완화 대 치유), 및 구체적인 조성물의 효능, 안정성 및 독성을 포함한다. 제제화 시, 용액은 투여량 제제에 적합한 방식으로 치료적으로 또는 예방적으로 효과적인 양으로 투여될 것이다. 제제는 다양한 제형들, 예컨대, 전술된 주사가능한 용액의 유형으로 용이하게 투여된다.
본원에서 사용될 때 용어 "MHC 다량체"는 2개 이상, 통상적으로 4개, 또는 최대 약 50개 이상의 MHC 단량체들의 복합체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "다량체 복합체"는 표적 세포 집단과 하나 이상의 pMHC 복합체 사이의 복합체를 지칭하고, 이때 pMHC 복합체의 MHC 단백질은 다량체 형태의 MHC 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다량체 형태의 MHC 단백질은 이량체, 삼량체, 사량체, 오량체 또는 덱스트라머(dextramer)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "면역 반응" 또는 이의 균등한 "면역학적 반응"은 (항원 특이적 T 세포 또는 이의 분비 생성물에 의해 매개된) 세포 매개 반응의 발생을 지칭한다. 세포 면역 반응은 클래스 I 또는 클래스 II MHC 분자와 함께 폴리펩타이드 에피토프를 제시함으로써 유발되어, 바이러스 감염을 치료하거나 예방하고/하거나 항원 특이적 Breg 세포, TC1, CD4+ T 헬퍼 세포 및/또는 CD8+ 세포독성 T 세포, 및/또는 질환에 의해 생성된 자가조절 T 세포 및 B 세포 "기억" 세포를 증폭시킨다. 반응은 다른 성분의 활성화도 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 용어 "면역 반응"은 면역 세포의 조절 네트워크의 형성을 포괄하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 용어 "조절 네트워크 형성"은 면역 세포, 바람직하게는 T 세포, 보다 바람직하게는 T 조절 세포가 B 세포 또는 항원 제시 세포를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다른 면역 세포의 추가 분화를 유발하도록 이끌어내진 면역 반응을 지칭할 수 있고, 이때 상기 항원 제시 세포의 비한정적 예로는 수지상 세포, 단핵구 및 대식세포가 있다. 일부 실시양태에서, 조절 네트워크 형성은 B 세포가 조절 B 세포로 분화되는 단계를 포함하고; 일부 실시양태에서, 조절 네트워크 형성은 면역관용(tolerogenic) 항원 제시 세포의 형성을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "나노스피어", "NP" 또는 "나노입자"는 적절한 경우 대상체, 세포 표본 또는 조직 표본에게 단수로 또는 복수로 투여되는 작은 분리된 입자를 의미한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "나노입자"는 나노입자 코어 주변의 임의의 층을 포함하므로, 링커 층과 같은 층을 갖거나 갖지 않는 코어를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 모양이 실질적으로 구형이다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 리포좀 또는 바이러스 입자가 아니다. 추가 실시양태에서, 나노입자는 임의의 적절한 재료, 예를 들면, 고체, 고체 코어, 금속, 덴드리머, 중합체 마이셀, 산화금속 또는 단백질, 또는 이들의 단편 또는 조합으로 구성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 구형"은 입자의 모양이 약 10% 초과의 수준까지 구를 벗어나지 않는다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "염증성 반응" 및 "염증"은 유해한 자극, 예컨대, 병원체, 손상된 세포 또는 자극제에 대한 개체의 유관속 조직의 복잡한 생물학적 반응을 표시하고, 사이토카인, 보다 구체적으로 전구염증성 사이토카인, 즉 주로 활성화된 면역 세포에 의해 생성되고 염증성 반응의 증폭에 관여하는 사이토카인의 분비를 포함한다. 예시적 전구염증성 사이토카인은 IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α, IL-17, IL21, IL23, IL27 및 TGF-β를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예시적 염증은 급성 염증 및 만성 염증을 포함한다. 급성 염증은 혈장 및 백혈구에 의한 조직의 침윤으로 인한 염증의 고전적 징후(팽윤, 발적, 통증, 열 및 기능 상실)을 특징으로 하는 단기간 과정을 표시한다. 급성 염증은 전형적으로 손상 자극이 존재하기만 하면 일어나고 일단 자극이 제거되거나, 분해되거나 흉터형성(섬유증)에 의해 격리되면 중단된다. 만성 염증은 동시적인 활성 염증, 조직 파괴 및 복구 시도를 특징으로 하는 상태를 표시한다. 만성 염증은 상기 나열된 급성 염증의 고전적 징후들을 특징으로 하지 않는다. 그 대신에, 만성 염증 조직은 단핵 면역 세포(단핵구, 대식세포, 림프구 및 형질 세포)의 침윤, 조직 파괴, 및 혈관신생 및 섬유증을 포함하는 치유 시도를 특징으로 한다. 염증은 개체에서 염증과 관련된 복잡한 생물학적 반응을 형성하는 사건들 중 어느 한 사건에 영향을 미침으로써, 특히 이러한 사건을 억제함으로써 본 개시의 의미에서 억제될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "질환 관련" 항원은 선택되는 질환을 치료하기 위해 선택되는 항원 또는 이의 단편을 지칭하고 질환 과정에 관여한다. 예를 들면, 당뇨병 관련 항원은 제시될 때 당뇨병을 치료하는 데 기여하는 면역 반응을 생성하는 항원 또는 이의 단편이므로; 이러한 효과를 생성하는 당뇨병 관련 항원은 당뇨병을 치료하기 위해 선택된다. 다발성 경화증(MS) 관련 항원은 MS를 치료하기 위해 선택된다. 당뇨병 관련 항원은 MS를 치료하기 위해 선택되지 않을 것이다. 유사하게, 자가면역 관련 항원은 자가면역 질환과 관련된 항원이고 자가면역 이외의 장애 또는 질환, 예를 들면, 암의 치료를 위해 선택되지 않을 것이다. 비한정적 예시적 질환 관련 항원은 본원에 개시되어 있고, 더 나아가 이러한 항원은 문헌에 기록된 기법, 기작 및 방법을 기반으로 특정 질환에 대해 확인될 수 있다.
"자가면역 질환 또는 장애"는 개체 자신의 조직 또는 장기로부터 비롯되고 이러한 조직 또는 장기에 대해 유도된 질환 또는 장애, 또는 이의 징후, 또는 이로부터 비롯된 상태를 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 용어는 정상 체조직 및 항원과 반응하는 T 세포에 의한 생성으로부터 비롯되거나 이러한 생성에 의해 악화되는 상태를 지칭한다. 자가면역 질환 또는 장애의 예로는 관절염(류마티스성 관절염, 예컨대, 급성 관절염, 만성 류마티스성 관절염, 통풍 또는 통풍성 관절염, 급성 통풍성 관절염, 급성 면역학적 관절염, 만성 염증성 관절염, 퇴행성 관절염, II형 콜라겐에 의해 유도된 관절염, 감염성 관절염, 라임 관절염, 증식성 관절염, 건선성 관절염, 스틸병, 척추 관절염, 소아 발병 류마티스성 관절염, 골관절염, 만성 진행성 관절염, 변형성 관절염, 만성 원발성 다발관절염, 반응성 관절염, 및 강직성 척수염), 염증성 과다증식성 피부 질환, 건선, 예컨대, 플라크 건선, 물방울 건선, 농포성 건선 및 손발톱의 건선, 아토피성 질환, 예컨대, 고초열 및 죠브 증후군(Job's syndrome)을 포함하는 아토피, 접촉 피부염, 만성 접촉 피부염, 박리성 피부염, 알레르기성 피부염, 알레르기성 접촉 피부염, 포진성 피부염, 동전형 피부염, 지루성 피부염, 비특이적 피부염, 일차 자극제 접촉 피부염 및 아토피성 피부염을 포함하는 피부염, x-연관된 과다 IgM 증후군, 알레르기성 안구내 염증성 질환, 두드러기, 예컨대, 만성 자가면역 두드러기를 포함하는 만성 알레르기성 두드러기 및 만성 특발성 두드러기, 근염, 다발근염/피부근염, 소아 피부근염, 독성 표피 괴사용해, (전신 피부경화증을 포함하는) 피부경화증, 경화증, 예컨대, 전신 경화증, 다발성 경화증(MS), 예컨대, 척수시신경 MS, 원발성 진행성 MS(PPMS), 및 재발 완화성 MS(RRMS), 진행성 전신 경화증, 죽상동맥경화증, 동맥경화증, 파종성 경화증, 실조성 경화증, 시신경척수염 스펙트럼 장애(데빅병 또는 데빅 증후군으로서도 공지되어 있는 NMO), 염증성 장 질환(IBD)(예를 들면, 크론병, 자가면역 매개 위장 질환, 결장염, 예컨대, 궤양성 결장염, 궤양 결장염, 미시적 결장염, 콜라겐성 결장염, 용종성 결장염, 괴사성 전장염, 경벽성 결장염 및 자가면역 염증성 장 질환), 장 염증, 괴저성 농피증, 결절성 홍반, 원발성 경화성 담관염, 성인 또는 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS)을 포함하는 호흡 곤란 증후군, 뇌수막염, 포도막의 전부 또는 일부의 염증, 홍채염, 맥락막염, 자가면역 혈액학적 장애, 류마티스성 척추염, 류마티스성 활액막염, 유전성 혈관부종, 뇌수막염에서의 신경 손상과 같은 두개 신경 손상, 임신 포진, 임신 유천포창, 음낭 소양증, 자가면역 미성숙 난소 부전, 자가면역 상태로 인한 갑작스런 청력 손실, IgE 매개 질환, 예컨대, 아나필락시스 및 알레르기성 및 아토피성 비염, 뇌염, 예컨대, 라스무센(Rasmussen) 뇌염, 및 변연부 및/또는 뇌간 뇌염, 포도막염, 예컨대, 후부 포도막염, 급성 전부 포도막염, 육아종성 포도막염, 비-육아종성 포도막염, 파코항원성 포도막염, 후부 포도막염 또는 자가면역 포도막염, 신증후군을 갖거나 갖지 않는 사구체신염(GN), 예컨대, 만성 또는 급성 사구체신염, 예컨대, 원발성 GN, 면역 매개 GN, 막성 GN(막성 신장병증), 특발성 막성 GN 또는 특발성 막성 신장병증, I형 및 II형을 포함하는 막 또는 막성 증식성 GN(MPGN), 및 신속 진행성 GN, 증식성 신장염, 자가면역 다선성 내분비 부전, 국한성 형질세포성 귀두염을 포함하는 귀두염, 귀두포피염, 중심성 환상 홍반, 지속성 색소이상 홍반, 다형성 홍반, 환상 육아종, 광택 태선, 경화성 위축성 태선, 만성 단순 태선, 극상 태선, 편평 태선, 층판 비늘증, 표피박리 과다각화증, 전암성 각화증, 괴저성 농피증, 알레르기성 상태 및 반응, 알레르기성 반응, 알레르기성 또는 아토피성 습진, 건성 습진, 한포진 및 수포성 손발바닥 습진을 포함하는 습진, 천식, 예컨대, 기관지의 천식, 기관지 천식 및 자가면역 천식, T 세포의 침윤 및 만성 염증성 반응을 수반하는 상태, 외부 항원, 예컨대, 임신 동안 태아 A-B-O 혈액 군에 대한 면역 반응, 만성 폐 염증성 질환, 자가면역 심근염, 백혈구 부착 결핍, 루푸스 신장염, 루푸스 뇌염, 소아 루푸스, 비-신장 루푸스, 신장외 루푸스, 원반모양 루푸스 및 원반모양 홍반 루푸스, 탈모 루푸스, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 예컨대, 피부 SLE 또는 아급성 피부 SLE, 태아 루푸스 증후군(NLE) 및 파종성 홍반성 루푸스를 포함하는 루푸스, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 성인의 잠복성 자가면역 당뇨병(또는 1.5형 당뇨병)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 사이토카인 및 T 림프구에 의해 매개된 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역 반응, 사르코이드증, 림프종모양 육아종증 및 베게너 육아종증을 포함하는 육아종증, 무과립구증, 혈관염, (류마티스성 다발근통 및 거대 T 세포(타카야수) 동맥염을 포함하는) 대혈관 혈관염, (가와사키병 및 결절성 다발동맥염/결절성 동맥주위염을 포함하는) 중혈관 혈관염, 미시적 다발동맥염, 면역혈관염, CNS 혈관염, 피부 혈관염, 과민성 혈관염, 괴사성 혈관염, 예컨대, 전신 괴사성 혈관염 및 ANCA 관련 혈관염, 예컨대, 처그-스트라우스(Churg-Strauss) 혈관염 또는 증후군(CSS) 및 ANCA 관련 소혈관 혈관염을 포함하는 맥관염, 측두 동맥염, 재생불량성 빈혈, 자가면역 재생불량성 빈혈, 쿰즈 양성 빈혈, 다이아몬드 블랙판(Diamond Blackfan) 빈혈, 용혈성 빈혈, 또는 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA)을 포함하는 면역 용혈성 빈혈, 애디슨병, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 누출을 수반하는 질환, CNS 염증성 장애, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 장기 손상 증후군, 예컨대, 패혈증, 외상 또는 출혈 후 다발성 장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 항-인지질 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병/증후군, 캐슬맨 증후군, 굿파스처 증후군, 레이노 증후군(Reynaud's syndrome), 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 증후군, 유천포창, 예컨대, 수포성 유천포창 및 피부 유천포창, (심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 천포창 점막 유천포창 및 홍반성 천포창을 포함하는) 천포창, 자가면역 다발내분비병증, 라이터병 또는 라이터 증후군, 열 손상, 자간전증, 면역 복합 장애, 예컨대, 면역 복합 신장염, 항체 매개 신장염, 다발신경병증, 만성 신경병증, 예컨대, IgM 다발신경병증 또는 IgM 매개 신경병증, 자가면역 또는 면역 매개 혈소판감소증, 예컨대, 만성 또는 급성 특발성 혈소판감소성 자반병(ITP)을 포함하는 ITP, 후천성 혈소판감소성 자반병, 공막염, 예컨대, 특발성 각막공막염, 상공막염, 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환 및 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선기능저하증, 부갑상선기능저하증, 갑상선염, 예컨대, 자가면역 갑상선염, 하시모토병, 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염) 또는 아급성 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 특발성 갑상선기능저하증, 그레이브스병, 다선성 증후군, 예컨대, 자가면역 다선성 증후군(또는 다선성 내분비병증 증후군)을 포함하는 자가면역 내분비 질환, 신경학적 부신생물 증후군, 예컨대, 람버트-이튼(Lambert-Eaton) 근무력증 증후군 또는 이튼-람버트(Eaton-Lambert) 증후군을 포함하는 부신생물 증후군, 강직 사람 또는 강직 인간 증후군, 뇌척수염, 예컨대, 알레르기성 뇌척수염 또는 알레르기 뇌척수염 및 실험적 알레르기성 뇌척수염(EAE), 중증 근무력증, 예컨대, 흉선종 관련 중증 근무력증, 소뇌 퇴행, 신경근육긴장증, 안구간대경련 또는 안구간대경련 근육간대경련 증후군(OMS), 및 감각 신경병증, 다초점 운동 신경병증, 시한 증후군(Sheehan's syndrome), 자가면역 간염, 만성 간염, 루푸스모양 간염, 거대 T 세포 간염, 만성 활성 간염 또는 자가면역 만성 활성 간염, 림프모양 간질성 폐렴(LIP), 폐쇄성 세기관지염(비-이식) 대 NSIP, 귈랑-바레(Guillain-Barre) 증후군, 버거병(IgA 신장병증), 특발성 IgA 신장병증, 선형 IgA 피부병, 급성 발열성 호중성 피부병, 각질하 농포성 피부병, 일과성 극세포해리성 피부병, 간경변증, 예컨대, 원발성 담즙성 간경변증 및 폐간경변증, 자가면역 장병증 증후군, 셀리악(Celiac) 또는 코엘리악(Coeliac) 질환, 셀리악 스프루(celiac sprue)(글루텐 장병증), 불응성 스프루, 특발성 스프루, 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증(ALS; 루게릭병), 관상 동맥 질환, 자가면역 귀 질환, 예컨대, 자가면역 내이 질환(AIED), 자가면역 청력 손실, 다발연골염, 예컨대, 불응성 또는 재발된 또는 재발성 다발연골염, 폐 폐포 단백증, 코간 증후군(Cogan's syndrome)/비매독성 간질성 각막염, 벨 마비, 스위트병/증후군, 주사비(rosacea) 자가면역, 대상포진 관련 통증, 아밀로이드증, 비-암성 림프구증가증, 단일클론 B 세포 림프구증가증(예를 들면, 양성 단일클론 감마병증 및 의미불명의 단일클론 감마병증(MGUS))을 포함하는 원발성 림프구증가증, 말초 신경병증, 부신생물 증후군, 채널병증, 예컨대, 간질, 편두통, 부정맥, 근육 장애, 청력상실, 시력상실, 주기성 마비, 및 CNS의 채널병증, 자폐증, 염증성 근육병증, 국소성 또는 분절성 또는 국소 분절성 사구체경화증(FSGS), 내분비 안구병증, 포도막망막염, 맥락막망막염, 자가면역 간 장애, 섬유근육통, 다발성 내분비 부전, 슈미츠(Schmidt) 증후군, 부신염, 위 위축증, 초로성 치매, 탈수초 질환, 예컨대, 자가면역 탈수초 질환 및 만성 염증성 탈수초 다발신경병증, 드레슬러(Dressler) 증후군, 원형 탈모, 전두 탈모, CREST 증후군(석회증, 레이노 현상, 식도 운동이상, 손발가락경화증 및 모세혈관확장증), 예를 들면, 항-정자 항체로 인한 남성 및 여성 자가면역 불임, 혼합된 결합 조직 질환, 샤가스병, 류마티스성 열, 재발성 유산, 농부의 폐, 다형성 홍반, 심장절개 후 증후군, 쿠싱 증후군, 조류-애호가의 폐, 알레르기성 육아종증성 혈관염, 양성 림프구성 혈관염, 알포트 증후군, 폐포염, 예컨대, 알레르기성 폐포염 및 섬유화 폐포염, 간질성 폐 질환, 수혈 반응, 나병, 말라리아, 기생충 질환, 예컨대, 리슈만편모충증(leishmaniasis), 키파노소마증(kypanosomiasis), 주혈흡충증(schistosomiasis), 회충증, 아스페르길루스증, 샘터 증후군(Sampter's syndrome), 카플란 증후군(Caplan's syndrome), 뎅기, 심내막염, 심내막심근 섬유증, 미만성 간질성 폐 섬유증, 간질성 폐 섬유증, 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 낭성 섬유증, 내안구염, 지속융기성 홍반, 태아 적아구증, 호산구성 근막염, 슐만(Shulman) 증후군, 펠티(Felty) 증후군, 필라리아병, 모양체염, 예컨대, 만성 모양체염, 비동시성 모양체염, 홍체모양체염(급성 또는 만성), 또는 푸흐(Fuch) 모양체염, 헤노흐-쇤라인(Henoch-Schonlein) 자반병, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, SCID, 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS), 에코바이러스 감염, 패혈증, 내독소혈증, 췌장염, 갑상선중독증, 파보바이러스 감염, 풍진 바이러스 감염, 백신접종 후 증후군, 선천성 풍진 감염, 엡스타인-바 바이러스 감염, 볼거리, 에반 증후군(Evan's syndrome), 자가면역 생식샘 부전, 시데남 무도병, 스트렙토코커스 감염 후 신장염, 폐쇄성 혈전혈관염, 갑상선중독증, 척수로, 맥락막염, 거대 T 세포 다발근육통, 만성 과민성 폐렴, 건성 각막결막염, 유행성 각막결막염, 특발성 신장염 증후군, 최소 변화 신장병증, 양성 가족성 및 허혈-재관류 손상, 이식 장기 재관류, 망막 자가면역, 관절 염증, 기관지염, 만성 폐쇄성 기도/폐 질환, 규폐증, 아프타, 아프타성 구내염, 동맥경화성 장애, 아스퍼니오게네스(asperniogenese), 자가면역 용혈, 뵈크병(Boeck's disease), 한랭글로불린혈증, 듀피트렌(Dupuytren) 구축, 파코아나필락시스성 안구함몰증, 알레르기성 장염, 나성 결절성 홍반, 특발성 안면 마비, 만성 피로 증후군, 류마티스성 열병, 하만-리치병(Hamman-Rich's disease), 감각신경 청력 손실, 발작성 해모글로빈뇨, 생식샘기능저하증, 국소성 회장염, 백혈구감소증, 감염성 단핵증, 횡단 척수염, 원발성 특발성 점액수종, 신장증, 교감성 안염, 육아종증성 고환염, 췌장염, 급성 다발신경근염, 괴저성 농피증, 퀘르벵(Quervai) 갑상선염, 후천성 비장 위축증, 비-악성 흉선종, 백반증, 독성 쇼크 증후군, 식품 중독, T 세포의 침윤을 수반하는 상태, 백혈구 부착 결핍, 사이토카인 및 T 림프구에 의해 매개된 급성 및 지연된 과민성과 관련된 면역 반응, 백혈구 누출을 수반하는 질환, 다발성 장기 손상 증후군, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 알레르기성 신경염, 자가면역 다발성내분비병증, 난소염, 원발성 점액부종, 자가면역 위축성 위염, 교감성 안염, 류마티스성 질환, 혼합된 결합 조직 질환, 신증후군, 췌도염, 다발내분비 부전, 자가면역 다선성 증후군 I형, 성인 발병 특발성 부갑상선기능저하증(AOIH), 심근병증, 예컨대, 확장된 심근병증, 후천성 수포성 표피박리(EBA), 혈색소증, 심근염, 신증후군, 원발성 경화성 담관염, 화농성 또는 비-화농성 부비동염, 급성 또는 만성 부비동염, 사골, 정면, 턱뼈 또는 나비뼈 부비동염, 호산구 관련 장애, 예컨대, 호산구증가증, 폐 침윤 호산구증가증, 호산구증가증-근육통 증후군, 로플러(Loffler) 증후군, 만성 호산구증가성 폐렴, 열대성 폐 호산구증가증, 기관지폐 아스페르길루스증, 진균종, 또는 호산구를 함유하는 육아종, 아나필락시스, 혈청음성 척추관절염, 다발내분비 자가면역 질환, 경화성 담관염, 공막, 상공막, 만성 점막피부 칸디다증, 브루톤(Bruton) 증후군, 유아기의 일관성 저감마글로불린혈증, 비스코트-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군, 운동실조 모세혈관확장증 증후군, 혈관확장증, 콜라겐 질환과 관련된 자가면역 장애, 류마티즘, 신경학적 질환, 림프절염, 혈압 반응의 감소, 혈관 기능이상, 조직 손상, 심혈관 허혈, 통각과민증, 신장 허혈, 뇌 허혈, 및 혈관형성을 동반하는 질환, 알레르기성 과민성 장애, 사구체신염, 재관류 손상, 허혈성 재관류 장애, 심근 또는 다른 조직의 재관류 손상, 림프종성 기관기관지염, 염증성 피부병, 급성 염증성 성분을 갖는 피부병, 다발성 장기 부전, 수포성 질환, 신장 피질 괴사, 급성 화농성 뇌수막염 또는 다른 중추신경계 염증성 장애, 안구 및 안와 염증성 장애, 과립구 수혈 관련 증후군, 사이토카인에 의해 유도된 독성, 기면증, 급성 중증 염증, 만성 난치성 염증, 신우염, 동맥내막 과형성, 소화성 궤양, 판막염, 폐기종, 원형 탈모, 지방 조직 염증/II형 당뇨병, 비만 관련 지방 조직 염증/인슐린 내성, 및 자궁내막증도 고려된다.
일부 실시양태에서, 자가면역 장애 또는 질환은 I형 및 II형 진성 당뇨병, 당뇨병 전단계, 이식 거부, 다발성 경화증, 다발성 경화증 관련 장애, 미성숙 난소 부전, 피부경화증, 쇼그렌병/증후군, 루푸스, 백반증, 탈모(대머리), 다선성 부전, 그레이브스병, 갑상선기능저하증, 다발근염, 천포창, 크론병, 결장염, 자가면역 간염, 뇌하수체기능저하증, 심근염, 애디슨병, 자가면역 피부 질환, 포도막염, 악성 빈혈, 부갑상선기능저하증 및/또는 류마티스성 관절염을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다. 관심 있는 다른 적응증은 천식, 알레르기성 천식, 원발성 담즙성 간경변증, 간경변증, 시신경척수염 스펙트럼 장애(데빅병, 시신경척수 다발성 경화증(OSMS)), 심상성 천포창, 염증성 장 질환(IBD), 관절염, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 셀리악병, 건선, 자가면역 심근병증, 특발성 확장된 심근병증(IDCM), 중증 근무력증, 포도막염, 강직성 척수염, 면역 매개 근육병증, 전립선암, 항-인지질 증후군(ANCA+), 죽상동맥경화증, 피부근염, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 폐기종, 척수 손상, 외상성 손상, 담배에 의해 유도된 폐 파괴, ANCA 관련 혈관염, 건선, 경화성 담관염, 원발성 경화성 담관염, 및 중추신경계 및 말초신경계의 질환을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 자가면역 장애 또는 질환은 당뇨병, 다발성 경화증, 셀리악병, 원발성 담즙성 간경변증, 천포창, 낙엽상 천포창, 심상성 천포창, 시신경척수염 스펙트럼 장애, (류마티스성 관절염을 포함하는) 관절염, 알레르기성 천식, (크론병 및 궤양성 결장염을 포함하는) 염증성 장 질환, 전신 홍반성 루푸스, 죽상동맥경화증, 만성 폐쇄성 폐 질환, 폐기종, 건선, 자가면역 간염, 포도막염, 쇼그렌 증후군, 피부경화증, 항-인지질 증후군, ANCA 관련 혈관염 및 강직 인간 증후군을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다.
다발성 경화증(MS)은 "파종성 경화증", "파종 뇌척수염" 또는 "알레르기성 뇌척수염"으로서도 공지되어 있다. MS는 뇌 및 척수의 축삭돌기 주위의 지방 미엘린초(myelin sheath)가 손상되어, 탈수초화 및 흉터형성뿐만 아니라 광범위한 징후 및 증상도 유발하는 염증성 질환이다. 다발성 경화증 관련 장애는 예를 들면, 시신경척수염 스펙트럼 장애(NMO), 포도막염, 신경병증성 통증 등을 포함한다.
"미엘린 희소돌기아교세포 당단백질"(MOG)은 중추신경계(CNS)에서 신경의 수초화의 과정에서 중요한 것으로 여겨진 당단백질이다. 인간에서, 이 단백질은 MOG 유전자에 의해 코딩된다. 이 단백질은 구조적 온전성을 미엘린초에게 제공하는 데 필요한 "부착 분자"로서 작용하는 것으로 추측되고 희소돌기아교세포에서 늦게 생성되는 것으로 공지되어 있다. 진뱅크 수탁번호 NM_001008228.2 및 NP_001008229.1은 각각 MOG 유전자의 mRNA 및 단백질 서열을 대표한다. 이들 진뱅크 수탁번호 각각과 관련된 서열은 모든 목적을 위해 참고로 도입된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "암" 및 "암성"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 생장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병, 및 이들의 전이가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 용어 "전이"는 질환 생성 유기체, 또는 악성 또는 암성 세포가 혈관, 림프관 또는 막성 표면에 의해 신체의 다른 부분으로 전달되는 것을 지칭한다. 이러한 암의 비한정적 예로는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포종, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간세포 암종, 및 다양한 유형의 두경부암이 있다. 표 2는 본 개시에서 사용할 암 관련 항원들의 예시적 비한정적 목록이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보조자극"은 미감작 T 세포를, 특정 항원을 갖는 세포에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 항원 특이적 T 세포로 활성화시키는 데 기여하는 이차 신호를 생체내에서 생성하는 분자를 의미한다. 본 개시는 임의의 특이적 보조자극 분자로 한정되지 않는다. 다양한 보조자극 분자들이 당분야에서 잘 공지되어 있다. 보조자극 분자의 일부 비한정적 예는 4-IBBL, OX40L, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, CD30L 및 ICOSL이고, 이들 각각의 수용체 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드도 마찬가지이다. 특정 실시양태에서, 본 개시의 보조자극 분자는 하기 리간드들 및 이들 각각의 수용체들 중 어느 하나 이상일 수 있다: B7-1/CD80, BTLA, B7-2/CD86, CD28, B7-H1/PD-L1, CTLA-4, B7-H2, Gi24/VISTA/B7-H5, B7-H3, ICOS, B7-H4, PD-1, B7-H6, PD-L2/B7-DC, B7-H7, PDCD6, LILRA3/CD85e, LILRB2/CD85d/ILT4, LILRA4/CD85g/ILT7, LILRB3/CD85a/ILT5, LILRB1/CD85j/ILT2, LILRB4/CD85k/ILT3, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, GITR 리간드/TNFSF18, 4-1BB 리간드/TNFSF9, HVEM/TNFRSF14, BAFF/BLyS/TNFSF13B, LIGHT/TNFSF14, BAFF R/TNFRSF13C, 림포톡신-알파/TNF-베타, CD27/TNFRSF7, OX40/TNFRSF4, CD27 리간드/TNFSF7, OX40 리간드/TNFSF4, CD30/TNFRSF8, RELT/TNFRSF19L, CD30 리간드/TNFSF8, TACI/TNFRSF13B, CD40/TNFRSF5, TL1A/TNFSF15, CD40 리간드/TNFSF5, TNF-알파, DR3/TNFRSF25, TNF RII/TNFRSF1B, GITR/TNFRSF18, 2B4/CD244/SLAMF4, CD84/SLAMF5, BLAME/SLAMF8, CD229/SLAMF3, CD2, CRACC/SLAMF7, CD2F-10/SLAMF9, NTB-A/SLAMF6, CD48/SLAMF2, SLAM/CD150, CD58/LFA-3, CD7, DPPIV/CD26, CD96, EphB6, CD160, 인테그린 알파 4 베타 1, CD200, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, CD300a/LMIR1, LAG-3, CRTAM, TIM-1/KIM-1/HAVCR, DAP12, TIM-4, Dectin-1/CLEC7A, TSLP R, ICOSL, 및/또는 이들 각각의 생물학적 균등물.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보조자극 리간드"는 보조자극 분자와 상호작용하는 세포 표면 분자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 분자 및 세포 수준에서 체내의 광범위한 생물학적 과정들을 조절하기 위한 신호전달 분자로서 작용하는, 면역 시스템 내의 다양한 세포들에 의해 분비된 저분자량 단백질을 의미한다. "사이토카인"은 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인의 부류 내에 속하는 개별 면역조절 단백질을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "당뇨병"은 유전적 요인과 환경적 요인의 조합에 의해 야기된 탄수화물 대사의 가변적 장애를 지칭하고 통상적으로 인슐린의 부적절한 분비 또는 사용, 과도한 소변 생성, 혈액 및 소변 내의 과도한 양의 당, 및 갈증, 배고픔 및 체중 손실을 특징으로 한다. 당뇨병은 1형 당뇨병 및 2형 당뇨병을 특징으로 한다. 비-비만 당뇨병("NOD") 마우스는 당뇨병의 연구 및 치료를 위해 허용된 동물 모델이다. 마우스에서 1형 당뇨병(T1D)은 자가반응성 CD8+ T 세포와 관련되어 있다. 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스는 증가하는 목록의 자가항원들을 인식하는 T 세포에 의한 췌장 β 세포의 선택적 파괴로부터 비롯된 인간 T1D와 매우 유사한 T1D의 한 형태를 발생시킨다. T1D의 시작이 명확히 CD4+ 세포의 기여를 요구할지라도, T1D가 CD8+ T 세포에 의존한다는 것을 뒷받침하는 설득력 있는 증거가 있다. NOD 마우스에서 상당한 비율의 췌도 관련 CD8+ 세포들이 "8.3-TCR 유사"로서 지칭되는 CDR3-불변 Vα17-Jα42+ TCR을 사용한다는 것이 발견되었다. MHC 분자 Kd의 환경 하에서 미모톱(mimotope) NRP-A7(조합 펩타이드 라이브러리를 사용함으로써 정의됨)을 인식하는 이 세포는 이미 가장 이른 NOD 췌도 CD8+ 침윤물의 중요한 성분이고, 당뇨병유발성을 나타내고, 기능이 알려져 있지 않은 단백질인 췌도 특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매활성 서브유닛 관련 단백질(IGRP)로부터의 펩타이드를 표적으로 삼는다. 이 펩타이드(NRP-A7과 유사한 IGRP206-214)를 인식하는 CD8+ 세포는 순환계에서 대단히 흔하다(>1/200 CD8+ 세포). 무엇보다도, NOD 마우스에서 당뇨병으로의 췌도염의 진행은 순환 IGRP206-214 반응성 CD8+ 풀의 주기적 팽창, 및 이의 췌도 관련 대응물의 강력한 성숙을 항상 동반한다. 보다 최근에, NOD 마우스에서 췌도 관련 CD8+ 세포가 다수의 IGRP 에피토프들을 인식한다는 것이 밝혀졌는데, 이것은 IGRP가 적어도 뮤린 T1D에서 CD8+ 세포에 대한 우성 자가항원이라는 것을 시사한다. NOD 췌도 관련 CD8+ 세포, 특히 질환 과정에서 초기에 발견되는 CD8+ 세포도 인슐린 에피토프(Ins B15-23)를 인식한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "당뇨병 전단계"는 준임상적 베타 세포 손상을 특징으로 하는 당뇨병 상태 전의 무증상 기간을 의미하고, 이때 환자는 정상 혈장 글루코스 수준을 나타낸다. 이것은 췌도 세포 자가항원(ICA)의 존재도 특징으로 하고, 임상 증상의 발병에 가까워졌을 때 당에 대한 불내성을 동반할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "다발성 경화증 관련 장애"는 MS에 대한 민감성 또는 MS를 함께 제시하는 장애를 의미한다. 이러한 장애의 비한정적 예로는 시신경척수염 스펙트럼 장애(NMO), 포도막염, 신경병증성 통증 경화증, 죽상동맥경화증, 죽상동맥경화증, 파종성 경화증, 전신 경화증, 척수시신경 MS, 원발성 진행성 MS(PPMS) 및 재발 완화성 MS(RRMS), 진행성 전신 경화증 및 실조성 경화증이 있다.
용어 "에피토프" 및 "항원성 결정인자"는 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하거나 인식하는 항원의 부위를 지칭하기 위해 상호교환가능하게 사용된다. B 세포 에피토프는 단백질의 삼차 폴딩에 의해 병치된 인접 아미노산들 또는 비인접 아미노산들 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산들로부터 형성된 에피토프는 변성 용매에의 노출 시 전형적으로 유지되는 반면, 삼차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매를 사용한 처리 시 전형적으로 상실된다. 에피토프는 특유의 공간적 입체구조에서 전형적으로 적어도 3개, 보다 통상적으로 적어도 5개 또는 8개 내지 20개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체구조를 확인하는 방법은 예를 들면, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명을 포함한다. 예를 들면, 문헌(Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996))을 참조한다. T 세포는 CD8 세포의 경우 약 9개의 아미노산 또는 CD4 세포의 경우 약 9개 내지 20개의 아미노산의 연속 에피토프를 인식한다. 에피토프를 인식하는 T 세포는 에피토프에 반응하여 프라이밍된 T 세포에 의한 3H-타이미딘 도입에 의해 확인된 항원 의존적 증식을 측정하는 시험관내 어세이(Burke et al., J. Inf. Dis., 170:1110-1119, 1994), 항원 의존적 사멸(세포독성 T 림프구 어세이, Tigges et al., J. Immunol., 156(10):3901-3910, 1996), 또는 사이토카인 분비에 의해 확인될 수 있다. 세포 매개 면역학적 반응의 존재는 증식 어세이(CD4+ T 세포) 또는 CTL(세포독성 T 림프구) 어세이에 의해 확인될 수 있다.
임의적으로, 항원 또는 바람직하게는 항원의 에피토프는 다른 단백질, 예컨대, MHC 및 MHC 관련 단백질을 갖는 융합 단백질에 화학적으로 접합될 수 있거나 이러한 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "개체", "환자" 및 "대상체"는 동의어로 사용되고 포유동물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간이다. 다른 실시양태에서, 개체는 수의학 의약을 필요로 하는 포유동물이거나 실험실에서 통상적으로 사용되는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 포유동물은 마우스, 래트, 원숭이, 개, 고양이, 소, 말 또는 양이다.
본 개시에서 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 재조합 핵산 분자를 지칭하거나 총 게놈 핵산을 갖지 않는 상태로 단리된 핵산 분자를 지칭한다. 올리고뉴클레오타이드(길이가 100개 이하의 잔기인 핵산), 예를 들면, 플라스미드를 포함하는 재조합 벡터, 코스미드, 파지, 바이러스 등이 용어 "폴리뉴클레오타이드" 내에 포함된다. 일부 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 그 자신의 천연 생성 유전자 또는 단백질 코딩 서열로부터 실질적으로 단리된 조절 서열을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드는 RNA, DNA, 이들의 유사체 또는 이들의 조합일 수 있다. 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산은 하기 길이의 이러한 폴리펩타이드의 전부 또는 일부를 코딩하는 인접 핵산 서열을 함유할 수 있다: 10개, 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 130개, 140개, 150개, 160개, 170개, 180개, 190개, 200개, 210개, 220개, 230개, 240개, 250개, 260개, 270개, 280개, 290개, 300개, 310개, 320개, 330개, 340개, 350개, 360개, 370개, 380개, 390개, 400개, 410개, 420개, 430개, 440개, 441개, 450개, 460개, 470개, 480개, 490개, 500개, 510개, 520개, 530개, 540개, 550개, 560개, 570개, 580개, 590개, 600개, 610개, 620개, 630개, 640개, 650개, 660개, 670개, 680개, 690개, 700개, 710개, 720개, 730개, 740개, 750개, 760개, 770개, 780개, 790개, 800개, 810개, 820개, 830개, 840개, 850개, 860개, 870개, 880개, 890개, 900개, 910개, 920개, 930개, 940개, 950개, 960개, 970개, 980개, 990개, 1000개, 1010개, 1020개, 1030개, 1040개, 1050개, 1060개, 1070개, 1080개, 1090개, 1095개, 1100개, 1500개, 2000개, 2500개, 3000개, 3500개, 4000개, 4500개, 5000개, 5500개, 6000개, 6500개, 7000개, 7500개, 8000개, 9000개 또는 10000개 이상의 뉴클레오타이드, 뉴클레오사이드 또는 염기 쌍. 소정의 종으로부터의 특정 폴리펩타이드가 약간 상이한 핵산 서열을 가짐에도 불구하고 동일하거나 실질적으로 유사한 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 코딩하는, 천연 변이를 함유하는 핵산에 의해 코딩될 수 있다는 것도 예상된다.
폴리뉴클레오타이드는 5개의 뉴클레오타이드 염기들의 특정 서열로 구성된다: 아데닌(A); 사이토신(C); 구아닌(G); 타이민(T); 및 폴리뉴클레오타이드가 RNA일 때 타이민 대신에 우라실(U). 따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 폴리뉴클레오타이드 분자의 알파벳 표시이다. 이 알파벳 표시는 중앙 프로세싱 유닛을 갖는 컴퓨터 내의 데이터베이스 내로 입력될 수 있고, 기능성 유전체학 및 상동성 검색과 같은 생물정보학 적용을 위해 사용될 수 있다.
핵산, 예컨대, DNA 또는 RNA와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "단리된" 또는 "재조합"은 거대분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리되었을 뿐만 아니라 폴리펩타이드로부터도 분리된 분자를 지칭한다. 용어 "단리된 또는 재조합 핵산"은 단편으로서 천연적으로 생성되지 않고 천연 상태에서 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하기 위한 것이다. 용어 "단리된"은 다른 세포 단백질로부터 단리된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 지칭하기 위해서도 본원에서 사용되고, 정제된 폴리펩타이드 및 재조합 폴리펩타이드 둘 다를 포괄하기 위한 것이다. 다른 실시양태에서, 용어 "단리된 또는 재조합"은 세포, 조직, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편(들)이 천연 상태에서 일반적으로 그 자신과 회합되어 있는 세포 성분 및 다른 성분으로부터 분리되어 있다는 것을 의미한다. 예를 들면, 단리된 세포는 유사하지 않은 표현형 또는 유전형의 조직 또는 세포로부터 분리된 세포이다. 단리된 폴리뉴클레오타이드는 그 자신의 천연 또는 자연 환경, 예를 들면, 염색체에서 일반적으로 그 자신과 회합되어 있는 3' 인접 뉴클레오타이드 및 5' 인접 뉴클레오타이드로부터 분리되어 있다. 당분야에서 숙련된 자에게 자명한 바와 같이, 비-천연 생성 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 이들의 단편(들)은 그의 천연 생성 대응물과 구별되기 위해 "단리"를 요구하지 않는다.
핵산 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 "외인성"은 핵산이 재조합 핵산 구축물의 부분이거나 그의 천연 환경에 존재하지 않는다는 것을 시사한다. 예를 들면, 외인성 핵산은 또 다른 종 내로 도입된 한 종의 서열, 즉 이종 핵산일 수 있다. 전형적으로, 이러한 외인성 핵산은 재조합 핵산 구축물을 통해 다른 종 내로 도입된다. 외인성 핵산은 유기체에 천연적으로 존재하고 그 유기체의 세포 내로 재도입된 서열일 수도 있다. 천연 서열을 포함하는 외인성 핵산은 종종 외인성 핵산에 연결된 비-천연 서열, 예를 들면, 재조합 핵산 구축물에서 천연 서열을 플랭킹하는 비-천연 조절 서열(프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터, IRES, 리보좀 스킵핑 서열)의 존재, 또는 인트론 서열의 결여에 의해 천연 생성 서열과 구별될 수 있다. 추가로, 안정하게 형질전환된 외인성 핵산은 전형적으로 천연 서열이 천연적으로 발견되는 위치 이외의 위치에서 삽입된다. 외인성 요소는 예를 들면, 유전적 재조합을 이용함으로써 구축물에 추가될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 기준 서열에 비해 핵산 서열을 기술하기 위해 본원에서 사용될 때 용어 "상동성인", "상동성" 또는 "퍼센트 상동성"은 칼린(Karlin) 및 알트슐(Altschul)(문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268), 1990), 문헌(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)에서 변형됨)에 의해 기재된 식을 이용함으로써 측정될 수 있다. 이러한 식은 문헌(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)의 기본 국소 정렬 검색 수단(BLAST) 프로그램 내로 도입된다. 서열의 퍼센트 상동성은 본원의 출원일 당시 BLAST의 가장 최신 버전을 이용함으로써 측정될 수 있다.
기준 폴리펩타이드 서열에 대한 퍼센트(%) 서열 동일성은 서열들을 정렬하고 필요한 경우 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 부분으로서 고려하지 않은 후 기준 폴리펩타이드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트이다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위한 정렬은 잘 공지되어 있는 다양한 방식들, 예를 들면, 공개적으로 입수될 수 있는 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어를 이용함으로써 달성될 수 있다. 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 알고리즘을 포함하는, 서열들을 정렬하는 데 적절한 파라미터가 결정될 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, % 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용함으로써 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권청(U.S. Copyright Office)(20559 워싱톤 디.시. 소재)에 사용자 문서와 함께 출원되었고, 이 저작권청에 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나, 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터들은 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변경되지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 소정의 아미노산 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 % 아미노산 서열 동일성(대안적으로 소정의 아미노산 서열 B에 대한 특정 % 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다: 100 곱하기 비율 X/Y, 이때 X는 A와 B의 그 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치로서 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 % 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의 % 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 인식될 것이다. 구체적으로 달리 언급되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 % 아미노산 서열 동일성 값들은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써 직전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
"조성물"은 활성 물질과 또 다른 불활성(예를 들면, 검출가능한 물질 또는 표지) 또는 활성 화합물 또는 조성물, 예컨대, 보강제의 조합을 의미하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 보강제를 함유하지 않는다.
"약학 조성물"은 조성물을 시험관내에서, 생체내에서 또는 생체외에서 진단적으로 또는 치료적으로 사용하기에 적합하게 만드는, 활성 물질과 불활성 또는 활성 담체의 조합을 포함하기 위한 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "단백질" 또는 "폴리펩타이드" 또는 "펩타이드"는 적어도 5개의 아미노산 잔기들을 포함하는 분자를 지칭한다.
본 개시의 다른 목적, 특징 및 장점은 하기 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 추가 정의도 하기 설명에서 제공되어 있다. 그러나, 본 개시의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변화 및 변형이 이 상세한 설명으로부터 당분야에서 숙련된 자에게 명확해질 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 개시의 특정 실시예를 표시하지만 예시로써만 제공된다는 것을 이해해야 한다.
본 개시는 신규 어세이, 및 이 어세이를 수행하는 데 필요한 조성물을 제공한다. 이러한 조성물들 중 하나는 외생적으로 도입된 재조합 T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터, 및 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체(MHC) 복합체에 결합하는 보조수용체를 포함하는 단리된 세포이다. 추가 양태에서, 단리된 세포는 외생적으로 도입된 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체를 포함한다. 추가 양태에서, 단리된 세포는 보조자극 분자에 대한 외생적으로 도입된 수용체 및/또는 사이토카인 수용체를 포함한다.
세포
본원에 기재된 효능 어세이에서 사용되는 세포는 진핵 세포이다. 세포는 최소한 1) 어세이될 pMHC-NP에 커플링된 펩타이드-MHC에 특이적으로 결합하는 재조합 또는 천연 TCR; 2) CD3 신호전달 복합체; 3) TCR 경로 의존적 리포터; 및 4) MHC 보조수용체를 발현한다. 일부 세포들 또는 세포주들은 본원에 기재된 어세이를 수행하기에 충분한 수준으로 CD3 신호전달 복합체 및 MHC 보조수용체(예를 들면, CD4 또는 CD8)를 천연적으로 발현할 수 있다. 그러나, 특정 세포 또는 세포주를 기반으로, MHC 보조수용체, 또는 CD3 신호전달 복합체의 하나 이상의 폴리펩타이드가 외인성 폴리뉴클레오타이드에 의해 도입되어, 균질한 방식으로 신호를 증가시킬 수 있거나 신호를 조절할 수 있다. 세포는 재조합 T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터, MHC 보조수용체, 또는 CD3 신호전달 복합체의 하나 이상의 폴리펩타이드 중 하나 이상을 발현하도록 조작된 일차 세포 또는 세포주일 수 있다. 조작될 수 있는 적합한 세포주의 비한정적 예로는 JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM, Molt-4 또는 이들의 조합이 있다. 세포가 임의의 재조합 T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터, MHC 보조수용체, 또는 CD3 신호전달 복합체의 하나 이상의 폴리펩타이드를 내생적으로 발현하지 않는 경우, 그 성분은 세포 또는 세포주 내로 도입된 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD3 신호전달 복합체를 내생적으로 발현하지 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 MHC 보조수용체를 내생적으로 발현하지 않는다. 한 양태에서, 세포는 보조자극 분자 및/또는 사이토카인에 대한 수용체를 내생적으로 발현한다. 일부 실시양태에서, 세포는 보조자극 분자 및/또는 사이토카인에 대한 수용체를 낮은 수준으로 발현하거나 발현하지 않으나, 발현은 T 세포가 활성화될 때 상향조절된다. 세포는 MHC 보조수용체, 또는 CD3 신호전달 복합체의 부분인 폴리펩타이드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 중 어느 하나 이상의 첨가를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, CD3 신호전달 복합체의 부분인 폴리펩타이드는 서열번호 553과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3 신호전달 복합체의 부분인 폴리펩타이드는 서열번호 554와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성인 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, MHC 보조수용체는 서열번호 549 또는 551과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, MHC 보조수용체는 서열번호 550 또는 552와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성인 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.
T 세포 수용체(TCR)
본원에 기재된 효능 어세이를 위해 사용되는 세포 또는 세포주는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 재조합 T 세포 수용체는 3' UTR, 5'UTR, 인트론 서열, 또는 천연 프로모터 또는 인핸서 요소 중 하나 이상을 결여하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 재조합 T 세포 수용체이다. 이 재조합 TCR은 형질도입, 형질감염 또는 감염에 의해 도입된 외인성 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩될 수 있다. 일부 실시양태에서, 외인성 폴리뉴클레오타이드는 세포 또는 세포주의 게놈 내로 삽입된다. T 세포 수용체의 비한정적 예로는 TCR α 및 TCR β를 포함하는 이종이량체, TCR γ 및 TCR δ를 포함하는 이종이량체, 및 단일 쇄 TCR 구축물이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, TCR은 뮤린화된다(즉, TCR은 뮤린 CD4 분자와 상호작용하도록 최적화된다). TCR α의 비한정적 예는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAB31880.1, AAB28318.1, AAB24428.1 및 ADW95878.1, 및 이들 각각의 균등물에서 발견될 수 있다. 이 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포 표면에서의 발현을 위한 작동가능하게 커플링된 조절 신호, 인핸서, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터를 추가로 포함시킬 수 있는, 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 세포 내로 도입된다.
TCR β의 비한정적 예도 진뱅크 수탁번호 AAB31887.1, AKG65861.1, ADW95908.1 및 AAM53411.1, 및 이들 각각의 균등물에서 확인될 수 있다. 이 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 당분야에서 공지된 방법을 이용함으로써 세포 내로 형질도입된다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포 표면에서의 발현을 위한 조절 신호, 인핸서, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 한 실시양태에서, TCR γ 쇄는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAM21533.1, DAA30449.1 및 ABG91733.1, 및 이들 각각의 균등물에서 발견된 하나 이상의 서열을 포함한다. 이 폴리펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포 내로 형질도입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이들은 세포 표면에서의 발현을 위한 조절 신호, 인핸서, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 한 실시양태에서, TCR δ 쇄는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 Q7YRN2.1, AAC48547.1, JC4663 및 NP_001009418.1, 및 이들 각각의 균등물에서 발견된 하나 이상의 서열을 포함한다. 이 폴리펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포 내로 형질도입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이들은 세포 표면에서의 발현을 위한 조절 신호, 인핸서, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 단일 쇄 TCR은 당분야에서 공지되어 있다. 단일 쇄 TCR의 비한정적 예는 전체로서 각각 참고로 도입된 국제 특허출원 공보 제WO1996018105호 및 미국 특허출원 공보 제US20120252742호, 및 이들 각각의 균등물에 개시되어 있다. 이 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용하되 세포 표면에서의 발현을 위한 작동가능하게 커플링된 조절 신호, 인핸서, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터를 추가로 포함시킴으로써 세포 내로 형질도입될 수 있다.
한 양태에서, TCR은 국제 특허출원 공보 제WO1996018105호 및 미국 특허출원 공보 제US2012/02522742호에 개시된 단일 쇄 TCR이다. 이 폴리펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포 내로 형질도입될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이들은 세포 표면에서의 발현을 위한 조절 신호, 인핸서, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터에 작동가능하게 커플링될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법 및 세포주와 함께 사용할 재조합 TCR은 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 따로 번역된다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 단일 폴리펩타이드로서 번역된다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 단일 쇄 TCR로서 단일 폴리펩타이드로서 번역된다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄 사이에 절단 부위를 포함하는 단일 폴리펩타이드로서 번역된다. 일부 실시양태에서, 절단 부위는 리보좀 스킵핑 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 세포의 표면에서 성숙(절단된 분비 리더 서열) 형태로 발현된다.
일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄는 서열번호 528, 530, 534, 536, 539, 541, 544 또는 546 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, TCR 베타 쇄는 서열번호 529, 531, 535, 537, 540, 542, 545 또는 547 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄는 서열번호 528, 530, 534, 536, 539 또는 541 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, TCR 베타 쇄는 서열번호 529, 531, 535, 537, 540 또는 542 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
일부 실시양태에서, TCR은 DRB1*0301/DRA*0101에 결합된 인간 췌도 특이적 글루코스-6-포스파타제 촉매활성 서브유닛 관련 단백질(IGRP) 아미노산 13 내지 25(QHLQKDYRAYYTF)에 특이적이다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄는 서열번호 528 또는 530 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, TCR 베타 쇄는 서열번호 529 또는 531 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄는 서열번호 534 또는 536 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, TCR 베타 쇄는 서열번호 535 또는 537 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
일부 실시양태에서, TCR은 DRB1*0401/DRA*0101에 결합된 인간 전구프로인슐린 아미노산 76 내지 90(SLQPLALEGSLQKRG)에 특이적이다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄는 서열번호 539 또는 541 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하고, TCR 베타 쇄는 서열번호 540 또는 542 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일하다.
추가 양태에서, TCRα 및 TCRβ를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 리보좀 스킵핑 서열을 추가로 코딩하거나 IRES 서열을 포함하고, 리보좀 스킵핑 서열의 비한정적 예로는 2A 리보좀 스킵핑 서열(예를 들면, P2A, E2A, F2A 또는 T2A)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 따라서, 한 양태에서, 리보좀 스킵핑 서열은 P2A, E2A, F2A 또는 T2A 리보좀 스킵핑 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2A 리보좀 스킵핑 서열은 컨센서스 모티프인 Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro을 포함하고, 이때 X는 임의의 아미노산을 표시한다. 2A 펩타이드 서열의 비한정적 예는 예시적 서열목록에 제공되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 및/또는 인핸서 서열을 추가로 포함할 수 있다. 리보좀 스킵핑 서열의 예는 참고로 도입된 국제 특허출원 공보 제WO 2013/057586호에서 발견될 수 있다.
IRES 서열 및 리보좀 스킵핑 서열의 비한정적 예는 표 3 및 4에 제공되어 있다.
일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 단일 폴리펩타이드로서 생성되고, TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄는 서열번호 456 내지 523 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 갖는 리보좀 스킵핑 서열에 의해 분리된다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드는 서열번호 524, 526 또는 543 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드는 서열번호 524 또는 526 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드는 서열번호 524와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단일 폴리펩타이드는 서열번호 526과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄는 단일 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩되고, 이 폴리뉴클레오타이드는 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄 사이에 IRES 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IRES 서열은 서열번호 524 내지 526 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TCR 알파 쇄 및/또는 TCR 베타 쇄는 서열번호 532 또는 557과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성인 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다. 이 폴리뉴클레오타이드는 세포의 게놈 내로 안정하게 삽입될 수 있다.
본원에 기재된 효능 어세이에서 사용된 세포에 의해 발현된 TCR은 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원에 특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 질환 관련 항원은 MHC 분자에 결합된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 질환 관련 항원은 MHC 클래스 I 분자에 결합된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 자가면역 또는 질환 관련 항원은 MHC 클래스 II 분자에 결합된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, TCR은 표 1에 기재된 임의의 폴리펩타이드 항원에 결합한다.
본원에 기재된 효능 어세이에서 사용된 세포에 의해 발현된 TCR은 암 항원에 특이적일 수 있다. 일부 실시양태에서, 암 항원은 MHC 분자에 결합된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 암 항원은 MHC 클래스 I 분자에 결합된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 암 항원은 MHC 클래스 II 분자에 결합된 폴리펩타이드이다. 일부 실시양태에서, 암 항원은 표 2에 기재된 폴리펩타이드이다.
TCR 의존적 리포터
일부 실시양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 TCR 활성화 또는 TCR 경로 활성화의 리포터이다. 한 실시양태에서, 리포터는 세포 농축, 발현, 활성, 국소화, 단백질 변형 또는 단백질-단백질 상호작용 중 하나 이상을 제공한다. 일부 실시양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 루시퍼라제, 베타 락타마제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP), 형광 단백질, 또는 이들의 조합을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성된다. 일부 실시양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP-1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 또는 IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성된다. 일부 실시양태에서, 루시퍼라제는 서열번호 555와 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 루시퍼라제는 서열번호 556과 적어도 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상동성인 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된다.
TCR 의존적 리포터는 업스트림 프로모터에 의해 활성화된다. 프로모터의 비한정적 예는 본원에 기재되어 있고 NFAT 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 및 IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 예는 예시적 서열목록에 제공되어 있다. 추가 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 인핸서 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 양태에서, TCR 의존적 리포터는 정량화될 수 있는 유전자 생성물 리포터를 포함하거나, 대안적으로 이러한 유전자 생성물 리포터로 본질적으로 구성되거나, 나아가 이러한 유전자 생성물 리포터로 구성된다. 정량화될 수 있는 유전자 생성물 리포터의 비한정적 예로는 루시퍼라제, 베타 락타마제, CAT, SEAP, 형광 단백질, 또는 이들의 조합이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 리포터로서 도입할 루시퍼라제 서열의 비한정적 예는 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAR20792.1, AAL40677.1, AAL40676.1 및 AAV35379.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 루시퍼라제 리포터 시스템은 상업적으로 입수될 수 있다(예를 들면, 프로메가 카탈로그 # E1500 또는 E4550). 추가 예는 예시적 서열목록에 제공되어 있다. 베타 락타마제 서열의 비한정적 예는 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AMM70781.1, CAA54104.1 및 AAA23441.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. "CAT"의 비한정적 예는 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 수탁번호 OCR39292.1, WP_072643749.1, CUB58229.1 및 KIX82948.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 이 폴리펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포 내로 형질도입될 수 있다. CAT 어세이는 상업적으로 입수될 수 있다(예를 들면, 써말 피셔(Thermal Fisher)의 FAST CAT® 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 어세이 키트(F-2900)). SEAP 서열의 비한정적 예는 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 ADV10306.1, AAB64404.1, EEB84921.1 및 EFD 70636.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 이 폴리펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포 내로 형질도입될 수 있다. SEAP 활성은 루미노미터(예를 들면, 프로메가의 터너 바이오시스템스 베리타스 마이크로플레이트 루미노미터)에 의해 측정될 수 있다. 형광 단백질의 비한정적 예로는 녹색 형광 단백질(GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP), 청색 형광 단백질(BFP), 황색 형광 단백질(YFP), 청록색 형광 단백질(CFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질, 또는 이들의 조합, 또는 이들의 형광 부분 또는 유도체가 있다. 형광 단백질의 서열은 2017년 1월 12일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AFA52654.1, ACS44348.1 및 AAQ96629.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 이 폴리펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 세포 내로 형질도입될 수 있다. 형광 단백질 프로모터 리포터는 상업적으로 입수될 수 있다(예를 들면, 타카라 카탈로그 # 631089).
MHC 보조수용체
형질전환된 세포는 MHC 리간드, 예를 들면, 클래스 I MHC 리간드 및 클래스 II MHC 리간드에 결합하는 MHC 보조수용체도 발현한다. 일부 실시양태에서, MHC 리간드는 고전적 MHC 클래스 I 단백질, 비고전적 MHC 클래스 I 단백질, 고전적 MHC 클래스 II 단백질, 비고전적 MHC 클래스 II 단백질, MHC 이량체(Fc 융합체), MHC 사량체, MHC 다량체, 또는 중합체 형태의 MHC 단백질을 포함하거나, 이들로 구성되거나, 이들로 본질적으로 구성된다.
한 양태에서, MHC 클래스 I 보조수용체는 CD8 복합체를 포함한다. CD8의 예시적 서열은 2017년 1월 19일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 AAA92533.1, AJP16706.1, AAA79217.1 및 1203216A, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 이 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 세포 내로 형질도입된다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포 표면에서의 발현을 위한 조절 신호, 인핸서, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터에 작동가능하게 커플링될 수 있다.
또 다른 양태에서, MHC 클래스 II 보조수용체는 CD4 분자를 포함한다. 예시적 CD4 단백질 서열은 2017년 1월 19일에 마지막으로 접속된 진뱅크(예를 들면, 진뱅크 수탁번호 CAA72740.1, AMR44293.1, ACG76115.1, AAC36010.1 및 AAB 51309.1, 및 이들 각각의 균등물)에 위치할 수 있다. 이 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 세포 내로 형질도입된다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 세포 표면에서의 발현을 위한 조절 신호, 및 형질도입 및 발현을 위한 벡터에 작동가능하게 커플링될 수 있다.
CD3
추가 양태에서, "CD3"(분화의 클러스터 3) 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 세포 내로 형질도입되고, 내인성 C3을 결여하는 세포는 단백질(들)을 발현한다. 일부 실시양태에서, CD3은 4개의 상이한 쇄들을 포함하거나, 대안적으로 이러한 쇄들로 본질적으로 구성되거나, 이러한 쇄들로 구성된다. 본 개시에 유용한 CD3 쇄의 비한정적 예는 진뱅크, 예를 들면, 진뱅크 수탁번호 CAA72995.1, AAI45927.1, NP_998940.1, AAB24559.1, NP_000723.1, AEQ93556.1 및 EAW67366.1에서 발견될 수 있다. 숙련된 당업자에게 자명한 바와 같이, CD3을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 세포 표면에서의 CD3의 발현을 위한 조절 요소 및 임의적으로 인핸서에 작동가능하게 연결될 수 있고, 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위해 벡터 내에 포함될 수 있다. 이 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드들은 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써 세포 내로 형질도입된다.
한 실시양태에서, TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체는 α 및 β TCR 쇄, CD3γ, δ 및 ε 폴리펩타이드, 및 ζ 쇄의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이들로 구성된다. TCR/CD3 복합체는 상이한 모듈을 형성하는 데 있어서 상이한 역할을 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 복합체는 항원 특이적 인식에 관여한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 주로 CD3 쇄의 세포질 꼬리 내의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프("ITAM")의 존재를 통해 신호 전달도입에 관여한다. 일부 실시양태에서, TCR/CD3 복합체는 항원, 수퍼항원 또는 항체(예를 들면, 수용체 항체)에 의해 자극된 TCR 신호전달 경로에 관여한다. 한 실시양태에서, TCR/CD3 복합체의 외인성 발현은 CD3 음성 세포에서 TCR 신호전달 경로를 용이하게 한다.
보조자극 수용체(들) 및/또는 사이토카인(들)
추가 양태에서, 세포는 선택되는 보조자극 또는 사이토카인 분자에 대한 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 형질도입된다. 보조자극 및 사이토카인 분자의 비한정적 예는 본원에 제공되어 있다.
벡터
벡터 또는 다른 유전자 전달 시스템은 전술된 바와 같이 세포를 폴리뉴클레오타이드로 형질도입하는 데 사용될 수 있다. 한 양태에서, 용어 "벡터"는 비-분열 세포 및/또는 느린 분열 세포를 감염시키고 형질도입하고 표적 세포의 게놈 내로 삽입되는 능력을 보유하는 재조합 벡터를 의미한다. 여러 양태에서, 벡터는 야생형 바이러스 또는 플라스미드, 예를 들면, 플라스미드로부터 유래하거나 이러한 바이러스 또는 플라스미드에 기반을 둔다. 추가 양태에서, 벡터는 야생형 렌티바이러스로부터 유래하거나 이러한 바이러스에 기반을 둔다. 이의 예로는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV) 및 고양이 면역결핍 바이러스(FIV)가 있으나 이들로 한정되지 않는다. 대안적으로, 다른 레트로바이러스, 예컨대, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)가 벡터 골격을 위한 기반으로서 사용될 수 있다고 생각된다. 본 발명에 따른 바이러스 벡터가 특정 바이러스의 성분으로 국한될 필요가 없다는 것은 자명할 것이다. 바이러스 벡터는 2종 이상의 상이한 바이러스들로부터 유래한 성분을 포함할 수 있고, 합성 성분도 포함할 수 있다. 벡터 성분은 원하는 특성, 예컨대, 표적 세포 특이성을 수득하도록 조작될 수 있다.
본 개시의 재조합 벡터는 영장류 및 비-영장류로부터 유래할 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예로는 인간 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 병원체인 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)가 있다. 비-영장류 렌티바이러스 군은 원형 "느린 바이러스" 비스나/매디(visna/maedi) 바이러스(VMV)뿐만 아니라, 관련 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV) 및 보다 최근에 기재된 고양이 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소 면역결핍 바이러스(BIV)도 포함한다. 선행기술 재조합 렌티바이러스 벡터는 당분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제6,924,123호, 제7,056,699호, 제7,07,993호, 제7,419,829호 및 제7,442,551호 참조).
미국 특허 제6,924,123호는 특정 레트로바이러스 서열이 표적 세포 게놈 내로의 삽입을 용이하게 한다는 것을 개시한다. 이 특허는 각각의 레트로바이러스 게놈이 비리온 단백질 및 효소를 코딩하는, gag, pol 및 env로서 지칭된 유전자들을 포함한다고 교시한다. 이 유전자들은 긴 말단 반복부(LTR)로서 지칭된 영역에 의해 양 말단에서 플랭킹된다. LTR은 전구바이러스 삽입 및 전사를 책임진다. 이 영역은 인핸서-프로모터 서열로서도 작용한다. 다시 말해, LTR은 바이러스 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 레트로바이러스 RNA의 캡시드화는 바이러스 게놈의 5' 말단에 위치한 psi 서열을 통해 일어난다. LTR은 그 자신이 U3, R 및 U5로서 지칭된 3개의 요소들로 나누어질 수 있는 동일한 서열이다. U3은 RNA의 3' 말단에 특유한 서열로부터 유래한다. R은 RNA의 양 말단에서 반복된 서열로부터 유래하고, U5는 RNA의 5' 말단에 특유한 서열로부터 유래한다. 상기 3개의 요소들의 크기는 상이한 레트로바이러스들 사이에 상당히 달라질 수 있다. 바이러스 게놈의 경우, 폴리 (A) 추가(종결)의 부위는 우측 LTR에서 R과 U5 사이의 경계에 있다. U3은 전구바이러스의 전사 조절 요소들 중 대부분을 함유하고, 이 전사 조절 요소는 프로모터, 및 세포 전사 활성화제 단백질 및 일부 경우 바이러스 전사 활성화제 단백질에 반응하는 다수의 인핸서 서열들을 포함한다.
구조적 유전자 gag, pol 및 env 그 자체의 경우, gag는 바이러스의 내부 구조적 단백질을 코딩한다. Gag 단백질은 단백질분해에 의해 성숙 단백질 MA(매트릭스), CA(캡시드) 및 NC(뉴클레오캡시드)로 프로세싱된다. pol 유전자는 게놈의 복제를 매개하는, DNA 중합효소, 관련 RNase H 및 인테그라제(integrase)(IN)를 함유하는 역전사효소(RT)를 코딩한다.
바이러스 벡터 입자의 생성을 위해, 벡터 RNA 게놈은 숙주 세포에서 이를 코딩하는 DNA 구축물로부터 발현된다. 벡터 게놈에 의해 코딩되지 않는 입자의 성분은 숙주 세포에서 발현된 추가 핵산 서열(통상적으로 gag/pol 및 env 유전자들 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함하는 "팩키징 시스템")에 의해 트랜스로 제공된다. 바이러스 벡터 입자의 생성을 위해 요구된 서열의 세트는 일시적 형질감염에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나, 숙주 세포 게놈 내로 삽입될 수 있거나, 방식들의 병용에 의해 제공될 수 있다. 이용되는 기법은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 관련 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터 및 알파바이러스 벡터로 구성된 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
비-바이러스 벡터는 시험관내에서, 생체내에서 또는 생체외에서 표적 세포에게 전달될 수 있는 이종 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 플라스미드를 포함할 수 있다. 이종 폴리뉴클레오타이드는 관심 있는 서열을 포함할 수 있고 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있고, 관심 있는 핵산 서열의 전사를 조절할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 벡터는 최종 표적 세포 또는 대상체에서 복제될 수 있을 필요가 없다.
한 실시양태에서, 추가 조절 요소는 프로모터, 인핸서 및/또는 프로모터/인핸서 조합이다. VEGF 단백질을 코딩하는 핵산의 발현을 조절하는 프로모터는 항시성 프로모터일 수 있다. 한 양태에서, 자살 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 항시성 프로모터이다. 항시성 프로모터의 비한정적 예로는 SFFV, CMV, PKG, MDNU3, SV40, Ef1a, UBC 및 CAGG가 있다. 한 양태에서, 인핸서는 우드척(Woodchuck) 조절 후 요소("WPRE")이다(예를 들면, 문헌(Zufferey, R. et al. (1999) J. Virol. 73(4):2886-2992) 참조).
본 개시에 유용한 프로모터는 항시성 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터의 일부 예로는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 프로모터 및 CMV 프로모터가 있다. 한 실시양태에서, 테트라사이클린 활성화제 단백질의 발현을 조절하는 프로모터는 항시성 프로모터이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 또는 일시적으로 발현을 조절하는 프로모터이다. 한 실시양태에서, 프로모터는 포스포글리세레이트 키나제 프로모터(PGK)이다.
추가 양태에서, 벡터는 마커 또는 검출가능한 표지, 예컨대, 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 녹색 형광 단백질(GFP) 및 황색 형광 단백질(YFP) 등을 코딩하는 유전자도 포함한다. 이들은 상업적으로 입수될 수 있고 기술 문헌에 기재되어 있다.
본 발명의 유전자를 전달하는 다른 방법은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 형질감염, 전기천공, 미세주사, 원형질체 융합 또는 리포좀 매개 형질감염을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 본 발명의 벡터로 형질감염되는 숙주 세포는 이. 콜라이 또는 다른 세균, 효모, 진균, 곤충 세포(예를 들면, SF9 곤충 세포에서의 발현을 위해 바큘로바이러스 벡터를 사용함), 또는 마우스, 인간 또는 다른 동물(예를 들면, 포유동물)로부터 유래한 세포를 포함할 수 있다(그러나, 이들로 한정되지 않는다). 클로닝된 DNA에 의해 코딩된 단백질, 융합체, 폴리펩타이드 단편 또는 돌연변이체의 시험관내 발현도 이용될 수 있다. 분자생물학 분야에서 숙련된 자는 매우 다양한 발현 시스템들 및 정제 시스템들을 이용하여 재조합 단백질 및 이의 단편을 생성할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
세포 집단
한 양태에서, 본 개시는 본 개시의 세포, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같이 변형된 JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM, Molt-4를 포함하나 이들로 한정되지 않는 단리된 세포의 집단에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 세포는 CD3 음성 세포이다. CD3 음성 세포의 비한정적 예로는 BW5147(ATCC 번호 TIB-472), Nk-92(ATCC 번호 CRL-2407), Mino(ATCC 번호 PTS-CRL-3000) 및 JeKo-1(ATCC 번호 CRL-3006)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 집단은 실질적으로 균질하다. 또 다른 실시양태에서, 집단은 실질적으로 불균질하다. 일부 실시양태에서, 집단은 복수의 본 개시의 세포들이다. 일부 실시양태에서, 집단은 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 95, 95%, 98% 또는 99% 순수한 적어도 1x102개 내지 1x109개의 세포들을 포함한다.
발현의 모니터링
숙련된 당업자에게 명확한 바와 같이, 형질도입된 폴리펩타이드의 효과적인 발현은 당분야에서 공지되어 있는 방법을 이용함으로써, 예를 들면, 세포 및 세포 집단의 형질도입 및 배양 후 정량적으로 또는 정성적으로 모니터링될 수 있는 검출가능한 표지부착된 항체 또는 이의 단편을 사용함으로써 확인될 수 있다.
세포를 제조하는 방법
또 다른 양태에서, 본 개시는 재조합 T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터 및 MHC 보조수용체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 단리된 세포를 형질도입하는 단계를 포함하거나, 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 단계로 구성된, 단리된 세포를 제조하는 방법에 관한 것이기도 하다. 추가 양태에서, 상기 방법은 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체, 및/또는 보조자극 분자 및/또는 사이토카인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드로 세포를 형질도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 하나 이상의 형질도입된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 재조합 T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터, 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체(MHC) 리간드에 결합하는 보조수용체, 임의적으로 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체, 보조자극 분자 및/또는 사이토카인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 유리한 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하거나, 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 이러한 단계로 구성된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 재조합 T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터, 클래스 I 또는 클래스 II 주조직적합성 복합체(MHC) 리간드에 결합하는 보조수용체, 및/또는 임의적으로 TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체, 및 추가로 임의적으로 보조자극 분자 및/또는 사이토카인을 발현하는 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하거나, 이러한 단계로 본질적으로 구성되거나, 이러한 단계로 구성된다. 한 실시양태에서, 상기 세포는 유세포분석을 포함하는 방법에 의해 단리된다. 단리된 세포는 형질도입된 폴리뉴클레오타이드의 증폭 및 계속된 발현을 위한 조건 하에서 배양됨으로써, 세포의 집단을 제공한다.
일부 양태에서, 본 개시는 나노입자 코어에 임의적으로 커플링된 pMHC 분자의 효능을 측정하는 시험관내 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) T 세포 수용체(TCR), TCR 경로 의존적 리포터, 및 MHC 리간드에 결합하는 보조수용체를 발현하는 형질도입된 세포를, pMHC를 포함하는 유효량의 조성물과 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 수용체로부터 상기 TCR 경로 의존적 리포터 또는 신호를 검출하는 단계를 포함하거나, 대안적으로 이러한 단계들로 본질적으로 구성되거나, 이러한 단계들로 구성된다. 추가 양태에서, 상기 세포는 CD3 복합체 및/또는 보조자극 수용체, 및/또는 사이토카인 수용체를 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 접촉은 시험관내 접촉이다.
한 실시양태에서, 상기 복합체의 적어도 하나의 pMHC는 TCR과 상호작용하고, 이때 상호작용은 TCR 의존적 경로를 활성화시킨다. 일부 실시양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 TCR 활성화 또는 TCR 경로 활성화의 리포터이다. 한 실시양태에서, 리포터의 특성은 세포 농축, 발현, 활성, 국소화, 단백질 변형 또는 단백질-단백질 상호작용을 포함한다. 한 실시양태에서, 리포터는 검출될 수 있고 TCR 활성화 또는 TCR 경로 활성화와 상호관련되어 있는 특성을 가진, 이펙터 세포 유형에 내재된 천연 리포터이다. 일부 실시양태에서, 리포터는 검출될 수 있고 TCR 활성화 또는 TCR 경로 활성화와 상호관련되어 있는 특성을 가진, 이펙터 세포 유형에 외재된 인공 리포터이다.
일부 실시양태에서, 단리된 세포는 전술된 바와 같고, 예를 들면, JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM, Molt-4 또는 일차 T 세포 중 하나 이상을 포함하는 이펙터 세포이다. CD3 음성 세포의 비한정적 예로는 BW5147(ATCC 번호 TIB-472), Nk-92(ATCC 번호 CRL-2407), Mino(ATCC 번호 PTS-CRL-3000) 및 JeKo-1(ATCC 번호 CRL-3006)이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
한 실시양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 루시퍼라제(반딧불이 또는 레닐라), 베타 락타마제, CAT, SEAP, 형광 단백질, 및 정량화가능한 유전자 생성물로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하거나, 이러한 유전자로 본질적으로 구성되거나, 이러한 유전자로 구성된다. 일부 실시양태에서, TCR 경로 의존적 리포터는 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP-1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 또는 IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터를 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 이들로 구성된다. 한 실시양태에서, 리포터는 TCR 경로 의존적 경로의 조절 하에서 발현되는 유전자를 포함하거나, 이러한 유전자로 본질적으로 구성되거나, 이러한 유전자로 구성된다.
한 실시양태에서, TCR-회합된 다중서브유닛 CD3 쇄 신호전달 복합체는 α 및 β TCR 쇄, CD3γ, δ 및 ε 폴리펩타이드, 및 ζ 쇄의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드들을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이들로 구성된다. TCR/CD3 복합체는 상이한 모듈을 형성하는 데 있어서 상이한 역할을 수행할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 복합체는 항원 특이적 인식에 관여한다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 주로 CD3 쇄의 세포질 꼬리 내의 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프("ITAM")의 존재를 통해 신호 전달도입에 관여한다. 일부 실시양태에서, TCR/CD3 복합체는 항원, 수퍼항원 또는 항체(예를 들면, 항-수용체 항체)에 의해 자극된 TCR 신호전달 경로에 관여한다. 한 실시양태에서, TCR/CD3 복합체의 외인성 발현은 CD3 음성 세포에서 TCR 신호전달 경로를 용이하게 한다. CD3 음성 세포의 비한정적 예로는 BW5147(ATCC 번호 TIB-472), Nk-92(ATCC 번호 CRL-2407), Mino(ATCC 번호 PTS-CRL-3000) 및 JeKo-1(ATCC 번호 CRL-3006)이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 추가 양태에서, 세포는 사이토카인 및/또는 별도로 보조자극 분자에 대한 수용체를 내생적으로 발현한다.
효능 어세이 용도
한 양태에서, 효능 어세이는 pMHC-나노입자의 효능, 순도 또는 활성을 측정할 수 있다. 상기 어세이는 예를 들면, pMHC-NP의 상이한 배치(batch) 또는 로트(lot)를 모니터링하여, 로트가 T 세포에 결합할 수 있고/있거나 원하는 면역 반응을 유도할 수 있는 기능성 pMHC를 포함한다는 것을 입증하기 위한 품질 관리 단계로서 이용될 수 있다. 한 양태에서, 효능 어세이는 나노입자 코어에 커플링된 하나 이상의 보조자극 분자 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 임의적으로 포함하거나, 더 나아가 이들로 구성되거나, 대안적으로 더 나아가 이들로 본질적으로 구성된 pMHC-나노입자의 활성을 측정할 수 있다.
어세이에서 시험될 수 있는 나노입자의 경우, 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체들은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 MHC는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 사이토카인들은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 보조자극 분자들은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 나노입자 코어의 직경은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 결합가는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 밀도는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 보조자극 분자의 결합가 및/또는 밀도는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 사이토카인의 결합가 및/또는 밀도는 서로 동일하거나 상이하다. 한 양태에서, 복수의 pMHC 복합체들을 갖는 나노입자들, 및 보조자극 분자 및 임의적으로 사이토카인을 갖는 별개의 복수의 나노입자들을 포함하는 조성물을 어세이한다. 전술된 바와 같이, 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체들은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 MHC는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 사이토카인들은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 보조자극 분자들은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 나노입자 코어의 직경은 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 결합가는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 pMHC 복합체의 밀도는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 보조자극 분자의 결합가 및/또는 밀도는 서로 동일하거나 상이하고/하거나; 각각의 나노입자 코어의 사이토카인의 결합가 및/또는 밀도는 서로 동일하거나 상이하다.
일부 양태에서, 어세이 나노입자에서 시험될 수 있는 나노입자는 본원에서 제공된 복수의 나노입자 복합체들을 포함하는 조성물로 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 담체, 임의적으로 약학 담체도 포함한다.
어세이는 나노입자에 임의적으로 커플링된 pMHC, 예를 들면, pMHC-나노입자의 효능을 측정하는 데 이용될 수 있다. 본원에서 용어 "입자", "나노입자", "마이크로입자", "비드", "마이크로스피어", 및 이의 문법적으로 균등한 용어들은 대상체에게 투여될 수 있는 작은 분리된 입자에 적용된다. 일부 실시양태에서, 상기 입자는 모양이 실질적으로 구형이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 구형"은 입자의 모양이 약 10% 초과의 수준까지 구를 벗어나지 않는다는 것을 의미한다. 본 개시의 다양한 공지된 항원 또는 펩타이드 복합체들은 입자에 적용될 수 있다.
본원에 기재된 효능 어세이에 적합하고 이 어세이를 이용함으로써 분석될 수 있는 펩타이드 MHC 나노입자는 적어도 비한정적 예로써, 전체로서 본원에 모두 참고로 도입된 국제 특허출원 공보 제WO 2008/109852호, 제WO 2012/041968호, 제WO 2012/062904호, 제WO 2013/144811호, 제WO 2014/050286호, 제WO 2015/063616호 및 제WO 2016/198932호, 또는 국제 특허출원 제PCT/IB2017/001508호에 기재된 나노입자들이다.
본원에 기재된 효능 어세이는 적어도 재조합 TCR 및 경로 의존적 리포터로 형질도입된 세포로부터 신호를 정량하는 데 이용될 수 있다. 신호의 정량은 당분야에서 숙련된 자에 의해 많은 방식들로 수행될 수 있고 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 소정의 나노의약 또는 나노입자 제제가 품질 관리 단계를 통과하는지를 확인하기 위해 신호를 정량할 수 있고 미리 설정된 역치와 비교할 수 있다. 역치는 음성 대조군으로부터 정량된 신호의 적어도 약 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900% 또는 1,000%일 수 있다. 음성 대조군은 예를 들면, 재조합 TCR을 갖고 정량된 종류의 리포터를 결여하는 세포; 또는 관련 없는 펩타이드 MHC 복합체를 포함하거나 펩타이드 MHC 복합체를 포함하지 않는 나노의약 또는 나노입자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 효능 어세이는 특정 나노입자 제제의 IC50을 정의하는 데 이용될 수 있다.
나노입자 코어 및 층 조성물
pMHC-NP의 나노입자 코어는 코어, 예를 들면, 고체 코어, 금속 코어, 덴드리머 코어, 중합체 마이셀 나노입자 코어, 나노막대(nanorod), 풀러렌, 나노쉘, 코어쉘, 단백질 기반 나노구조물 또는 지질 기반 나노구조물을 포함하거나, 이들로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이들로 구성된다. 일부 양태에서, 나노입자 코어는 생체흡수될 수 있고/있거나 생체분해될 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 코어는 코어로부터 성장하는 나무 유사 구조를 갖는 고도 분지된 거대분자를 포함하거나, 대안적으로 이러한 거대분자로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 거대분자로 구성된 덴드리머 나노입자 코어이다. 추가 양태에서, 덴드리머 나노입자 코어는 폴리(아미도아민) 기반 덴드리머 또는 폴리-L-라이신 기반 덴드리머를 포함할 수 있거나, 대안적으로 이러한 덴드리머로 본질적으로 구성될 수 있거나, 더 나아가 이러한 덴드리머로 구성될 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 코어는 나노 크기의 코어-쉘 구조물로 조립된 양친매성 블록 공중합체를 포함하거나, 대안적으로 이러한 공중합체로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 공중합체로 구성된 중합체 마이셀 코어이다. 추가 양태에서, 중합체 마이셀 코어는 폴리에틸렌 글리콜-디아스테아로일포스파티딜에탄올아민 블록 공중합체를 사용함으로써 생성된 중합체 마이셀을 포함하거나, 대안적으로 이러한 마이셀로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 마이셀로 구성된다. 추가 양태에서, 나노입자 코어는 금속을 포함하거나, 대안적으로 금속으로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 금속으로 구성된다. 또 다른 양태에서, 나노입자 코어는 리포좀이 아니다. 코어 물질의 추가 예로는 표준 유리 및 특수 유리, 실리카, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 아크릴 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 플루오로중합체, 실리콘, 셀룰로스, 규소, 금속(예를 들면, 철, 금, 은), 광물(예를 들면, 루비), 나노입자(예를 들면, 금 나노입자, 콜로이드성 입자, 산화금속, 황화금속, 셀렌화금속 및 자성 물질, 예컨대, 산화철), 및 이들의 합성물이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 산화철 나노입자 코어는 산화철(II, III)을 포함한다. 코어는 원하는 성질에 따라 균질한 조성의 코어, 또는 2개 이상의 클래스의 물질들의 합성물일 수 있다. 일부 양태에서, 금속 나노입자가 사용될 것이다. 이 금속 입자 또는 나노입자는 Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si 및 In, 및 이들의 전구체, 이들의 이원 합금, 이들의 삼원 합금, 및 이들의 금속간 화합물로부터 형성될 수 있다. 전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제6,712,997호를 참조한다. 일부 실시양태에서, 나노입자가 생체적합하고 생체흡수될 수 있는 한, (이하에 기재된) 코어 및 층의 조성은 달라질 수 있다. 코어는 원하는 성질에 따라 균질한 조성의 코어, 또는 2개 이상의 클래스의 물질들의 합성물일 수 있다. 일부 양태에서, 금속 나노스피어가 사용될 것이다. 이 금속 나노입자는 Fe, Ca, Ga 등으로부터 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 금속 또는 산화금속, 예컨대, 금 또는 산화철을 포함하는 코어를 포함하거나, 대안적으로 이러한 코어로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 코어로 구성된다. 일부 실시양태에서, 복수의 보조자극 분자들 및/또는 복수의 사이토카인들이 나노입자 덴드리머 코어 또는 중합체 마이셀 코어에 커플링된다.
입자는 전형적으로 실질적 구형 코어 및 임의적으로 하나 이상의 층 또는 코팅으로 구성된다. 상기 코어의 크기 및 조성은 본원에 기재된 바와 같이 달라질 수 있다. 코어 이외에, 입자는 관심 있는 적용에 적절한 기능을 제공하기 위해 하나 이상의 층을 가질 수 있다. 존재하는 경우, 층의 두께는 구체적인 적용의 요구에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, 층은 유용한 광학 성질을 부여할 수 있다.
본원에서 화학적 활성 또는 생물학적 활성 층으로서 지칭된 층은 화학적 또는 생물학적 기능도 부여할 수 있다. 이 층은 전형적으로 입자의 외부 표면에 적용되고 pMHC-NP에 기능을 부여할 수 있다. 층 또는 층들의 두께는 (원하는 입자 직경에 따라) 전형적으로 약 0.001 마이크로미터(1 나노미터) 내지 약 10 마이크로미터 이상, 또는 약 1 nm 내지 5 nm, 또는 대안적으로 약 1 nm 내지 약 10 nm, 또는 대안적으로 약 1 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 25 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 20 nm, 및 이들 사이의 범위일 수 있다.
층 또는 코팅은 생체분해가능한 당 또는 다른 중합체를 포함할 수 있거나, 대안적으로 이러한 당 또는 중합체로 본질적으로 구성될 수 있거나, 더 나아가 이러한 당 또는 중합체로 구성될 수 있다. 생체분해가능한 층의 예로는 덱스트란; 폴리(에틸렌 글리콜); 폴리(에틸렌 옥사이드); 만니톨; 폴리락타이드(PLA), 폴리글리콜라이드(PGA) 또는 폴리카프로락톤(PCL) 기반 폴리(에스테르); PHB-PHV 클래스의 폴리(하이드록스알카노에이트); 및 다른 변형된 폴리(사카라이드), 예컨대, 전분, 셀룰로스 및 키토산이 있으나 이들로 한정되지 않는다. 추가로, 나노입자는 화학적 결합 또는 커플링 부위를 위한 화학적 작용기를 부착시키기에 적합한 표면을 갖는 층을 포함할 수 있다.
층은 당분야에서 숙련된 자에게 공지되어 있는 다양한 방식들에 의해 나노입자에서 생성될 수 있다. 예로는 예컨대, 문헌(Iler, Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979); 및 문헌(Brinker and Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990))에 기재된 졸-겔 화학반응 기법이 있다. 나노입자에서 층을 생성하는 추가 방법은 예컨대, 문헌(Partch and Brown, J. Adhesion, 67:259-276, 1998); 문헌(Pekarek et al., Nature, 367:258, (1994)); 문헌(Hanprasopwattana, Langmuir, 12:3173-3179, (1996)); 및 문헌(Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270, (1998)) 및 이들에서 인용된 참고문헌에 기재된 표면 화학반응 및 캡슐화 기법을 포함한다. 증착 기법도 이용될 수 있다(예를 들면, 문헌(Golman and Shinohara, Trends Chem. Engin., 6:1-6, (2000)); 및 미국 특허 제6,387,498호 참조). 다른 방법은 예컨대, 문헌(Sukhorukov et al., Polymers Adv. Tech., 9(10-11):759-767, (1998)); 문헌(Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, (1998)); 문헌(Caruso et al., J. Amer. Chem. Soc., 121(25):6039-6046, (1999)); 미국 특허 제6,103,379호; 및 이들에서 인용된 참고문헌에 기재된 층별 자가조립 기법을 포함한다.
나노입자는 T 세포 집단을 증폭시키고 분화시키고 대상체에게 유효량으로 투여될 때 질환을 치료하는 데 유용한 복수의 질환 관련 항원-MHC 복합체들에 커플링된 나노입자 코어를 포함할 수 있거나, 이러한 나노입자 코어로 본질적으로 구성될 수 있거나, 더 나아가 이러한 나노입자 코어로 구성될 수 있다. 일부 양태에서, (본원에서 나노입자 복합체의 "결합가"로서 지칭된) 나노입자 코어당 pMHC의 수는 전술된 바와 같고 본원에 참고로 도입된 다양한 범위들에 속한다.
일부 양태에서, 나노입자 코어는 코어로부터 성장하는 나무 유사 구조를 갖는 고도로 분지된 거대분자를 포함하거나, 대안적으로 이러한 거대분자로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 거대분자로 구성된 덴드리머 나노입자 코어이다. 추가 양태에서, 덴드리머 나노입자는 폴리(아미도아민) 기반 덴드리머 또는 폴리-L-라이신 기반 덴드리머를 포함할 수 있거나, 대안적으로 이러한 덴드리머로 본질적으로 구성될 수 있거나, 더 나아가 이러한 덴드리머로 구성될 수 있다. 일부 양태에서, 나노입자 코어는 나노 크기의 코어-쉘 구조로 조립된 양친매성 블록 공중합체를 포함하거나, 대안적으로 이러한 공중합체로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 공중합체로 구성된 중합체 마이셀 코어이다. 추가 양태에서, 중합체 마이셀 코어는 폴리에틸렌 글리콜-디아스테아로일포스파티딜에탄올아민 블록 공중합체를 사용함으로써 생성된 중합체 마이셀을 포함할 수 있거나, 대안적으로 이러한 마이셀로 본질적으로 구성될 수 있거나, 더 나아가 이러한 마이셀로 구성될 수 있다. 덴드리머 코어 또는 중합체 마이셀 코어는 본원에 기재된 바와 같이 외부 코팅 또는 층을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 덴드리머 나노입자 또는 덴드리머 나노입자 코어를 갖는 나노입자의 구체적인 합성 수단, 예컨대, 문헌(Crooks et al., "Synthesis, Characterization, and Applications of Dendrimer-Encapsulated Nanoparticles." The Journal of Physical Chemistry B (109): 692-704 (2005))에 개시된 방법은 금속 이온이 덴드리머의 내부 내로 추출된 후 화학적으로 환원되어 3 nm 미만의 치수를 갖는 거의 크기-단분산된 입자를 생성할 것을 요구할 수 있고, 이때 생성된 덴드리머 코어 성분은 나노입자를 제조하기 위한 주형으로서 사용될 뿐만 아니라 나노입자를 안정화시키는 데에도 기여함으로써, 가용성을 조정할 수 있게 하고, 나노입자를 고체 지지체에 고정시키는 수단을 제공한다. 일부 실시양태에서, 복수의 보조자극 분자들 및/또는 복수의 사이토카인들이 나노입자 덴드리머 코어 또는 중합체 마이셀 코어에 커플링된다.
나노입자 코어의 크기는 약 1 nm 내지 약 1 ㎛일 수 있다. 일부 실시양태에서, 나노입자 코어의 직경은 약 1 ㎛ 미만이다. 다른 실시양태에서, 나노입자 코어의 직경은 약 500 nm 미만, 약 400 nm 미만, 약 300 nm 미만, 약 200 nm 미만, 약 100 nm 미만 또는 약 50 nm 미만이다. 추가 실시양태에서, 나노입자 코어의 직경은 약 1 nm 내지 약 10 nm, 15 nm, 20 nm, 25 nm, 30 nm, 40 nm, 50 nm, 75 nm 또는 100 nm이다. 특정 실시양태에서, 나노입자 코어는 약 1 nm 내지 약 100 nm; 약 1 nm 내지 약 75 nm; 약 1 nm 내지 약 50 nm; 약 1 nm 내지 약 25 nm; 약 1 nm 내지 약 25 nm; 약 5 nm 내지 약 100 nm; 약 5 nm 내지 약 50 nm; 약 5 nm 내지 약 25 nm; 약 15 nm 내지 약 25 nm; 또는 약 20 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 나노입자 코어는 약 25 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 25 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 35 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 25 nm, 또는 대안적으로 약 15 nm, 또는 약 20 nm, 또는 약 25 nm, 또는 약 30 nm, 또는 약 35 nm, 또는 약 40 nm의 직경을 갖는다.
층을 갖거나 갖지 않는 pMHC-NP의 직경의 크기는 약 5 nm 내지 약 1 ㎛일 수 있다. 일부 실시양태에서, pMHC-NP 복합체의 직경은 약 1 ㎛ 미만 또는 대안적으로 100 nm 미만이다. 다른 실시양태에서, pMHC-NP 복합체의 직경은 약 500 nm 미만, 약 400 nm 미만, 약 300 nm 미만, 약 200 nm 미만, 약 100 nm 미만, 또는 약 50 nm 미만이다. 추가 실시양태에서, 상기 복합체의 직경은 약 5 nm 또는 10 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 75 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 5 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 10 nm 내지 약 75 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 75 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 30 nm 내지 약 75 nm, 또는 한 양태에서 약 55 nm이다. 특정 실시양태에서, pMHC-NP 복합체의 직경은 약 35 nm 내지 약 60 nm, 약 35 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 35 nm 내지 약 75 nm이다. 한 양태에서, pMHC-NP 복합체의 직경은 약 30 nm 내지 약 50 nm이다.
항원-MHC 복합체
나노입자는 항원-MHC(pMHC) 복합체에 커플링된, 층을 갖거나 갖지 않는 나노입자 코어를 포함한다. 상기 항원은 특정 자가면역 장애, 알레르겐, 감염성 질환 또는 암의 치료를 위해 선택된다.
개별 폴리펩타이드(예를 들면, MHC)와 항원성(예를 들면, 펩타이드) 성분은 공유결합 또는 비-공유결합(예를 들면, 수소결합, 이온결합 또는 소수성 결합)을 통해 복합체를 형성한다. 이러한 복합체의 제조는 다양한 정도의 조작을 요구할 수 있고, 이러한 방법은 문헌에서 잘 공지되어 있다. 일부 양태에서, 항원성 성분은 예를 들면, MHC와 항원성 성분의 혼합에 의해 MHC 성분의 포켓 부분과 비-공유적으로 회합될 수 있고; 이것은 MHC와 항원 사이의 천연 결합 친화성에 의존한다. 대안적으로, 일부 양태에서, MHC 성분은 공지된 커플링제의 도입 또는 광 친화성 표지부착을 포함하나 이들로 한정되지 않는 표준 절차를 이용함으로써 항원성 성분에 공유결합될 수 있다(예를 들면, 문헌(Hall et al., Biochemistry 24:5702-5711 (1985)) 참조). 일부 양태에서, 항원성 성분은 예를 들면, 알파 쇄 및/또는 베타 쇄의 탄수화물 모이어티를 포함하는, 당단백질의 탄수화물 기를 통한 부착을 포함하나 이것으로 한정되지 않는, 문헌에서 논의된 펩타이드 연결 또는 다른 방법을 통해 MHC 성분에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원성 성분은 적절한 MHC 분자의 N-말단 또는 C-말단에 부착될 수 있다. 대안적으로, 일부 실시양태에서, MHC 복합체는 항원성 성분의 서열을, MHC를 코딩하는 서열 내로 도입하여, 이 서열들 둘 다가 그들의 기능적 성질을 보유하도록 함으로써 재조합적으로 형성될 수 있다.
다수의 항원-MHC 복합체들이 동일한 나노입자 코어에 커플링될 수 있고; 이 복합체들, MHC들 및/또는 항원들은 서로 동일할 수 있거나 상이할 수 있고, (본원에서 나노입자 복합체의 "결합가"로서 지칭된) 나노입자 코어당 pMHC의 수는 본원에 기재된 바와 같이 다양한 범위를 갖는다. 상기 결합가는 약 1개 pMHC 복합체 대 1개 나노입자 코어(1:1) 내지 약 6000개 pMHC 복합체 대 1개 나노입자 코어(6000:1), 또는 대안적으로 약 8:1 내지 약 6000:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 6000:1; 또는 대안적으로 약 11:1 내지 약 6000:1, 또는 대안적으로 약 12:1 내지 약 6000:1, 또는 대안적으로 적어도 2:1, 또는 대안적으로 적어도 8:1, 또는 대안적으로 적어도 9:1, 또는 대안적으로 적어도 10:1, 또는 대안적으로 적어도 11:1, 또는 대안적으로 적어도 12:1일 수 있다. 일부 양태에서, 결합가는 약 10:1 내지 약 6000:1, 또는 약 20:1 내지 약 5500:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 5000:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 4000:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 3500:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 3000:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 2500:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 2000:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 1500:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 1000:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 500:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 100:1, 또는 대안적으로 약 20:1 내지 약 50:1, 또는 대안적으로 약 25:1 내지 약 60:1, 또는 대안적으로 약 30:1 내지 약 50:1, 또는 대안적으로 약 35:1 내지 약 45:1, 또는 대안적으로 약 40:1이다. 또 다른 양태에서, 나노입자 코어당 pMHC 복합체의 결합가는 약 10:1 내지 약 100:1, 또는 대안적으로 약 10:1 내지 약 1000:1, 또는 대안적으로 8:1 내지 10:1, 또는 대안적으로 13:1 내지 50:1이다.
본 출원인은 나노입자의 pMHC 밀도가 용량 독립적 방식으로 TR1 세포 형성을 유발하거나 분화시키는 pMHC-NP의 능력을 조절한다는 것도 발견하였다. 밀도는 나노입자의 단위 표면적당 복합체의 수로서 계산된다. pMHC 복합체를 나노입자에 접합시키는 링커를 포함하나 이것으로 한정되지 않는 층을 갖거나 갖지 않는 나노입자의 표면적이 측정될 수 있다. 밀도를 계산하기 위해, 관련 표면적 값은 나노입자 코어 위에 외부 층을 갖거나 갖지 않는, pMHC 복합체를 갖지 않는 입자 구축물의 최종 직경에 기반을 둔다.
이 양태에서, 나노입자당 pMHC 밀도는 나노입자 코어의 표면적의 약 0.025 pMHC/100 nm2 내지 약 100 pMHC/100 nm2, 또는 대안적으로 약 0.406 pMHC/100 nm2 내지 약 50 pMHC/100 nm2, 또는 대안적으로 약 0.05 pMHC/100 nm2 내지 약 25 pMHC/100 nm2이다. 일부 양태에서, 나노입자당 pMHC 밀도는 약 0.2 pMHC/100 nm2 내지 약 25 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 20 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 15 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 14 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 13 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 12 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 11.6 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 11.5 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 11 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 10 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 9 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 8 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 7 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 6 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 5 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 4 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 3 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 2.5 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 2 pMHC/100 nm2, 또는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 1.5 pMHC/100 nm2이다.
또 다른 양태에서, 나노입자는 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 1.3 pMHC/100 nm2, 또는 대안적으로 약 0.5 pMHC/100 nm2 내지 약 0.9 pMHC/100 nm2, 또는 대안적으로 약 0.6 pMHC/100 nm2 내지 약 0.8 pMHC/100 nm2의 본원에서 정의된 pMHC 밀도를 갖고, 나아가 나노입자 코어는 약 25 nm 내지 약 60 nm, 또는 약 25 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 20 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 50 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 40 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 35 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 30 nm, 또는 약 15 nm 내지 약 25 nm, 또는 대안적으로 약 15 nm, 또는 약 20 nm, 또는 약 25 nm, 또는 약 30 nm, 또는 약 35 nm, 또는 약 40 nm의 직경을 갖는다. 한 실시양태에서, 나노입자당 pMHC 복합체의 밀도는 나노입자의 표면적의 약 0.2 pMHC/100 nm2 내지 나노입자의 표면적의 약 0.8 또는 10 pMHC/100 nm2를 포함한다. 또 다른 양태에서, 나노입자당 pMHC 복합체의 밀도는 나노입자의 표면적의 약 0.65 pMHC/100 nm2 내지 나노입자의 표면적의 약 12 pMHC/100 nm2뿐만 아니라, 본원에 개시되고 본원에 참고로 도입된 추가 밀도 범위이다.
일부 양태에서, pMHC 복합체의 분자간 거리는 약 4 nm 내지 약 300 nm, 또는 대안적으로 약 10 nm 내지 약 250 nm, 또는 대안적으로 약 10 nm 내지 약 200 nm, 또는 대안적으로 약 10 nm 내지 약 150 nm, 또는 대안적으로 약 10 nm 내지 약 100 nm, 또는 대안적으로 약 10 nm 내지 약 50 nm, 또는 대안적으로 약 12 nm 내지 약 30 nm, 또는 대안적으로 약 12 nm 내지 약 20 nm이다. 일부 실시양태에서, pMHC 복합체의 분자간 거리는 약 15 nm 내지 약 20 nm이다.
일부 양태에서, 본원은 나노입자 코어를 포합하는 복합체를 제공하는데, 이때 복수의 질환 관련 항원-MHC(pMHC) 복합체들은 상기 코어에 커플링되고; 상기 코어의 직경은 약 15 nm 내지 약 25 nm이고; 나노입자의 pMHC 밀도는 나노입자의 표면적의 약 0.4 pMHC/100 nm2 내지 약 6 pMHC/100 nm2이다. 일부 실시양태에서, 상기 복합체는 나노입자 코어 위에 외부 층을 추가로 포함하는데, 이때 pMHC 복합체는 나노입자 코어 및/또는 외부 층에 커플링되고, 나노입자 코어 및 외부 층의 직경은 약 35 nm 내지 약 75 nm, 또는 대안적으로 약 35 nm 내지 약 70 nm, 또는 약 35 nm 내지 약 65 nm이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 커플링된" 또는 "코팅된"은 개별 폴리펩타이드(예를 들면, MHC)와 항원성(예를 들면, 펩타이드) 성분이 표적 부위, 예를 들면, 면역 세포에 결합하기 전에 조합되어 활성 복합체를 형성하는 상황을 의미한다. 이것은 개별 폴리펩타이드 복합체 성분이 대상체에게 투여되기 전에 시험관내에서 합성되거나 재조합적으로 발현된 후 단리되고 조합되어 복합체를 형성하는 상황; 및 키메라 또는 융합 폴리펩타이드(즉, 복합체의 각각의 분리된 단백질 성분이 단일 폴리펩타이드 쇄에 함유됨)가 온전한 복합체로서 합성되거나 재조합적으로 발현되는 상황을 포함한다. 전형적으로, 폴리펩타이드 복합체를 나노입자에 첨가하여, 약, 적어도 약 또는 기껏해야 약 0.1, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 또는 1500 이상 대 1, 보다 전형적으로 0.1:1, 1:1 내지 50:1 또는 300:1, 및 이들 사이의 범위 내의 분자 수:나노입자 수의 비를 갖는 흡착된 또는 커플링된 폴리펩타이드 복합체를 갖는 나노입자를 생성하는데, 이때 상기 비는 각각의 범위의 선택되는 종점을 제공한다. 나노입자의 폴리펩타이드 함량은 표준 기법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
항원/MHC의 MHC
본원에서 사용된 바와 같이, 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, pMHC 복합체와 관련하여 용어 MHC는 고전적 또는 비고전적 MHC 클래스 I 단백질 및/또는 고전적 또는 비고전적 MHC 클래스 II 단백질, HLA DR, HLA DQ, HLA DP, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E 및 CD1d 중 임의의 좌위, 또는 이들의 단편 또는 생물학적 균등물, 이중 또는 단일 쇄 구축물, 이량체(Fc 융합체), 사량체, 다량체 형태, 및 중합체 형태의 MHCI 또는 MHCII를 의미한다. 일부 실시양태에서, pMHC는 단일 쇄 구축물일 수 있다. 일부 실시양태에서, pMHC는 이중 쇄 구축물일 수 있다.
일부 실시양태에서, MHC 단백질은 이량체 또는 다량체일 수 있다.
일부 실시양태에서, MHC 단백질은 놉-인-홀 기반 MHC-알파-Fc/MHC-베타-Fc 이종이량체 또는 다량체를 포함할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, "놉-인-홀"은 돌출부가 캐비티 내에 위치되어 이종다량체 형성을 촉진하도록 제1 폴리펩타이드의 계면에서 돌출부(또는 "놉")를 요구하고 제2 폴리펩타이드의 계면에서 상응하는 캐비티(또는 "홀")를 요구하는 폴리펩티딜 구조이다. 돌출부는 제1 폴리펩타이드의 계면으로부터의 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄(예를 들면, 페닐알라닌 또는 티로신)로 대체함으로써 구축된다. 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 캐비티는 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 쓰레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩타이드의 계면에서 생성된다. 돌출부와 캐비티는 당분야에서 숙련된 자에 의해 관례적인 방법을 이용함으로써 합성 수단, 예컨대, 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산의 변경 또는 펩타이드 합성에 의해 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩타이드의 계면은 제1 폴리펩타이드의 Fc 도메인에 위치하고; 제2 폴리펩타이드의 계면은 제2 폴리펩타이드의 Fc 도메인에 위치한다.
상기 언급된 바와 같이, "MHC-알파-Fc/MHC-베타-Fc"는 MHC 클래스 II α 쇄 및 항체 Fc 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드, 및 MHC 클래스 II β 쇄 및 항체 Fc 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하는 이종이량체이다. 놉-인-홀 MHC-알파-Fc/MHC-베타-Fc는 하나의 Fc 도메인의 돌출부가 다른 Fc 도메인의 상응하는 캐비티 내에 상보적으로 위치함으로써, 각각의 폴리펩타이드의 Fc 도메인들이 서로 접할 것도 요구한다.
본 개시의 일부 실시양태에서, 특정 항원이 확인되고 적절한 MHC 클래스 I 또는 II 폴리펩타이드의 환경 하에서 항원-MHC-나노입자 복합체로 제시된다. T 세포에게의 항원의 제시는 상이한 항원 프로세싱 경로를 이용하는 2개의 상이한 클래스의 분자들인 MHC 클래스 I(MHC-I) 및 MHC 클래스 II(MHC-II)에 의해 매개된다. 세포내 항원으로부터 유래한 펩타이드는 사실상 모든 세포들에서 발현되는 MHC 클래스 I 분자에 의해 CD8+ T 세포에게 제시되는 반면, 세포외 항원 유래 펩타이드는 MHC-II 분자에 의해 CD4+ T 세포에게 제시된다. 그러나, 이 이분법에 대한 일부 예외가 있다. 여러 연구들은 엔도사이토시스된 미립자 또는 가용성 단백질로부터 생성된 펩타이드가 대식세포뿐만 아니라 수지상 세포에서도 MHC-I 분자 위에 제시된다는 것을 보여주었다. 일부 양태에서, 대상체의 유전적 구성을 평가하여, 어느 MHC 폴리펩타이드가 특정 환자 또는 펩타이드의 특정 세트를 위해 사용되어야 하는지를 확인할 수 있다. 일부 실시양태에서, MHC 클래스 I 성분은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G 또는 CD-1 분자의 전부 또는 일부를 포함할 수 있거나, 이러한 전부 또는 일부로 본질적으로 구성될 수 있거나, 대안적으로 더 나아가 이러한 전부 또는 일부로 구성될 수 있다. MHC 성분이 MHC 클래스 II 성분인 실시양태에서, MHC 클래스 II 성분은 HLA-DR, HLA-DQ 또는 HLA-DP의 전부 또는 일부를 포함할 수 있거나, 이러한 전부 또는 일부로 본질적으로 구성될 수 있거나, 대안적으로 더 나아가 이러한 전부 또는 일부로 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, MHC는 HLA DRB1, HLA DRB3, HLA DRB4, HLA DRB5, HLA DQB1, HLA DQA1, IAg7, I-Ab, I-Ad, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E 또는 CD1d를 포함할 수 있다.
비고전적 MHC 분자도 본 개시의 MHC 복합체에서 사용될 것으로 예상된다. 일부 실시양태에서, 비고전적 MHC 분자는 다형성을 갖지 않고, 종들 사이에 보존되어 있고, 좁고 깊은 소수성 리간드 결합 포켓을 갖는다. 이 결합 포켓은 당지질 및 인지질을 천연 킬러 T(NKT) 세포에게 제시할 수 있다. NKT 세포는 NK 세포 마커와 반-불변 T 세포 수용체(TCR)를 동시에 발현하는 독특한 림프구 집단을 대표한다. 이 세포는 광범위한 질환들과 관련된 면역 반응의 조절에 관여한다.
상기 언급된 바와 같이, 용어 "MHC"는 인간 MHC의 언급에 사용될 때 용어 "인간 백혈구 항원(HLA)"과 상호교환가능하게 사용될 수 있으므로; MHC는 상기 개시된 고전적 MHC 유전자들인 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR뿐만 아니라, 이들의 모든 변이체들, 이소폼들, 이소타입들 및 다른 생물학적 균등물들도 포함하나 이들로 한정되지 않는 모든 HLA 서브타입들을 지칭한다.
본 개시에 따라 사용될 MHC는 당분야에서 공지되어 있는 기법을 통해 생성될 수 있거나, 단리될 수 있거나 정제될 수 있다. MHC를 수득하는 통상의 프로토콜은 전기영동, 또는 전하 또는 크기를 기준으로 하는 다른 분리 기법, 바이오티닐화 또는 다른 태그부착 방법 및 정제, 또는 MHC 단백질을 발현하는 벡터 구축물의 형질감염 또는 유도를 포함하나 이들로 한정되지 않는 단계들을 포함한다. 정제된 동물 항체는 이바이오사이언스(eBioscience), 바이오레전드(Biolegend) 및 톤보 바이오사이언시스(Tonbo Biosciences)와 같은 판매회사들을 포함하는 상업적으로 입수가능한 공급원들을 통해 입수될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 항원-MHC 복합체의 MHC는 고전적 MHCI, 비고전적 MHCI, 고전적 MHCII, 비고전적 MHCII, 이량체(Fc 융합체), MHC 사량체, 다량체 또는 중합체 형태의 MHC일 수 있다. 일부 실시양태에서, MHC 다량체는 당분야에서 잘 기록되어 있는 방법에 따라 생성된다(예를 들면, 문헌(Bakker et al. "MHC Multimer Technology: Current Status and Future Prospects," Current Opinion in Immunology 17(4):428-433 (2005)) 및 이 문헌에서 인용된 참고문헌 참조). 비한정적 예시적 방법은 바이오티닐화제, 예컨대, 스트렙타비딘 또는 아비딘을 사용하여 MHC 단량체를 결합시켜, 골격으로서 이 물질을 갖는 다량체 구조물을 생성하는 단계를 포함한다. 구체적으로, MHC 이량체는 대안적으로 항체 불변 영역 또는 Fc 영역과의 융합을 통해 생성될 수 있고; 이것은 작동 커플링을 통해 직접적으로, 또는 링커, 예를 들면, 시스테인 링커를 통해 달성될 수 있다.
pMHC의 항원
항원 및 항원성 성분의 구체적인 예들이 본원에 개시되어 있을지라도, 본 개시는 이들로 한정되지 않는다. 달리 구체적으로 언급되어 있지 않은 한, 본원에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 이러한 아미노산 서열로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 아미노산 서열로 구성된, 단리되거나 정제된 폴리펩타이드 항원의 균등물, 또는 상기 항원의 아미노산 서열에 대한 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 폴리펩타이드, 또는 상기 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보체에 대한 약 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드, 또는 중간 내지 높은 엄격도의 조건 하에서 상기 항원의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 상보체에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 본원에 포함된다. 본원에 개시된 항원 폴리펩타이드, 또는 개시된 서열에 대한 적어도 약 80% 서열 동일성, 또는 대안적으로 적어도 85%, 또는 대안적으로 적어도 90%, 또는 대안적으로 적어도 95%, 또는 대안적으로 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는, 단리되고 정제된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 균등물, 또는 엄격한 조건 하에서 상기 폴리뉴클레오타이드, 이의 균등물 또는 이의 상보체에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 이 폴리뉴클레오타이드들에 의해 코딩된, 단리되거나 정제된 폴리펩타이드도 제공된다. 상기 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 천연 상태에서 이들과 회합되지 않는 비-천연 생성 물질, 예를 들면, 담체, 약학적으로 허용가능한 담체, 벡터 및 MHC 분자와 조합될 수 있다. 본원에 개시된 항원 이외에, 본원에 참고로 도입된 본 출원인의 국제 특허출원 공보 제WO 2016/198932호에 개시된 항원도 고려된다.
변형된 펩타이드 및 이의 균등물
항원성 폴리펩타이드, 단백질 및 이들의 단편은 다양한 아미노산 결실, 삽입 및/또는 치환에 의해 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드는 대상체에서 면역 반응을 조절할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단백질" 또는 "폴리펩타이드" 또는 "펩타이드"는 적어도 5개의 아미노산 잔기들을 포함하는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 펩타이드의 야생형 버전이 사용되나; 본 개시의 많은 실시양태에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드가 펩타이드/MHC/나노입자 복합체를 생성하는 데 사용된다. 펩타이드/MHC/나노입자 복합체는 면역 반응을 생성하고/하거나 면역 시스템의 T 세포 집단을 변형시키는(즉, 면역 시스템을 재교육시키는) 데 사용될 수 있다. 상기 용어들은 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩타이드" 또는 "변형된 펩타이드"는 화학적 구조, 특히 그의 아미노산 서열이 야생형 단백질 또는 폴리펩타이드에 비해 변경되어 있는 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 적어도 하나의 변형된 활성 또는 기능을 가진다(단백질 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 다수의 활성들 또는 기능들을 가질 수 있다는 것을 인식한다). 구체적으로, 변형된 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 그의 하나의 활성 또는 기능이 변경될 수 있으나, 다른 면에서 야생형 활성 또는 기능, 예컨대, MHC/나노입자 복합체의 환경 하에 있을 때 면역원성 또는 면역 시스템의 다른 세포와 상호작용하는 능력을 여전히 보유할 수 있다는 것이 고려된다.
본 개시의 단백질은 재조합 단백질일 수 있거나 시험관내에서 합성될 수 있다. 대안적으로, 재조합 단백질은 세균 또는 다른 숙주 세포로부터 단리될 수 있다.
아미노산 서열 및 핵산 서열은 추가 잔기, 예컨대, 각각 추가 N-말단 또는 C-말단 아미노산, 또는 5' 또는 3' 핵산 서열을 포함할 수 있지만, 상기 서열이 생물학적 단백질 활성(예를 들면, 면역원성)의 유지를 포함하는, 전술된 기준을 충족시키는 한, 본원에 개시된 서열들 중 하나와 여전히 본질적으로 동일할 수 있다는 것도 이해될 것이다. 특히 말단 서열의 추가는 예를 들면, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 어느 한 부분을 플랭킹하는 다양한 비-코딩 서열들을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.
질환 관련 항원
나노입자는 본원에 기재된 치료 방법에서 유용하다. pMHC-NP의 pMHC 복합체는 치료될 질환을 기반으로 사용하기 위해 선택된다. 예를 들면, 당뇨병 관련 항원은 그 자가면역 질환에서 표적화된 세포, 조직 또는 장기에서 발현되고, 항원이 질환 과정의 유발자 또는 그의 발병기전에 있어서 핵심 참가자가 아닐지라도 자가면역 반응에 의해 야기된 세포, 조직 또는 장기 손상 시 면역 시스템에 노출되고, 제시될 때 당뇨병을 치료하는 데 기여하는 면역 반응을 생성하는 항원 또는 이의 단편이므로; 이 정의를 충족시키는 당뇨병 관련 항원은 당뇨병을 치료하기 위해 선택된다. MS 관련 항원은 MS를 치료하기 위해 선택된다. 당뇨병 관련 항원은 MS를 치료하기 위해 선택되지 않을 것이다. 비한정적 예시적 질환 관련 항원이 본원에 개시되어 있고, 나아가 문헌에 잘 기록되어 있는 기법, 기작 및 방법을 기반으로 특정 질환에 대해 이러한 항원을 확인할 수 있다.
관심 있는 질환의 비한정적 예로는 천식, I형 및 II형 진성 당뇨병, 당뇨병 전단계, 다발성 경화증, 말초 신경병증, 알레르기성 천식, 원발성 담즙성 간경변증, 간경변증, 시신경척수염 스펙트럼 장애, 자가항체 관련 신경학적 증후군, 예컨대, 강직 인간 증후군, 자가면역 뇌염, 기면증, 심상성 천포창, 낙엽상 천포창, 건선, 쇼그렌병/증후군, 염증성 장 질환(IBD), 관절염, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 피부경화증, ANCA 관련 혈관염, 굿파스처 증후군, 가와사키병, 셀리악병, 자가면역 심근병증, 특발성 확장된 심근병증(IDCM), 중증 근무력증, 자가면역 포도막염, 강직성 척수염, 그레이브스병, 면역 매개 근육병증, 항-인지질 증후군(ANCA+), 죽상동맥경화증, 자가면역 간염, 경화성 담관염, 원발성 경화성 담관염, 피부근염, 만성 폐쇄성 폐 질환, 척수 손상, 외상성 손상, 담배에 의해 유도된 폐 파괴, 폐기종, 천포창, 포도막염, 임의의 다른 관련 암 및/또는 중추신경계 및 말초신경계의 질환이 있으나 이들로 한정되지 않는다.
예시적 항원 또는 항원성 성분은 전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허출원 제15/348,959호에 개시된 항원 또는 항원성 성분을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
당뇨병 관련 항원
당뇨병 관련 항원은 PPI, IGRP, GAD, 췌도 세포 자가항원-2(ICA2), 및/또는 인슐린으로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 자가반응성 당뇨병 관련 항원성 펩타이드는 hInsB10-18(HLVEALYLV), hIGRP228-236(LNIDLLWSV), hIGRP265-273(VLFGLGFAI), IGRP206-214(VYLKTNVFL), hIGRP206-214(VYLKTNLFL), NRP-A7(KYNKANAFL), NRP-I4(KYNIANVFL), NRP-V7(KYNKANVFL), YAI/Db(FQDENYLYL) INS B15-23(LYLVCGERG), PPI76-90(K88S)(SLQPLALEGSLQSRG), IGRP13-25(QHLQKDYRAYYTF), GAD555-567(NFFRMVISNPAAT), GAD555-567(557I)(NFIRMVISNPAAT), IGRP23-35(YTFLNFMSNVGDP), B24-C36(FFYTPKTRREAED), PPI76-90(SLQPLALEGSLQKRG)뿐만 아니라, 전체로서 본원에 참고로 도입된 미국 특허출원 공보 제2005/0202032호에 개시된 펩타이드 및 단백질도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 자가반응성 펩타이드 또는 대조군 펩타이드로서 본 개시와 함께 사용될 수 있는 다른 펩타이드는 INS-I9(LYLVCGERI), TUM(KYQAVTTTL) 및 G6Pase(KYCLITIFL)뿐만 아니라 이들 각각의 균등물도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 추가 예로는 전구인슐린L2-10, ALWMRLLPL; 전구인슐린L3-11, LWMRLLPLL; 전구인슐린L6-14, RLLPLLALL; 전구인슐린B5-14, HLCGSHLVEA; 전구인슐린B10-18, HLVEALYLV; 전구인슐린B14-22, ALYLVCGER; 전구인슐린B15-24, LYLVCGERGF; 전구인슐린B17-25, LVCGERGFF; 전구인슐린B18-27, VCGERGFFYT; 전구인슐린B20-27, GERGFFYT; 전구인슐린B21-29, ERGFFYTPK; 전구인슐린B25-C1, FYTPKTRRE; 전구인슐린B27-C5, TPKTRREAEDL; 전구인슐린C20-28, SLQPLALEG; 전구인슐린C25-33, ALEGSLQKR; 전구인슐린C29-A5, SLQKRGIVEQ; 전구인슐린A1-10, GIVEQCCTSI; 전구인슐린A2-10, IVEQCCTSI; 전구인슐린A12-20, SLYQLENYC, 또는 이들의 균등물 및/또는 조합이 있다. 당뇨병 관련 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
MS 관련 항원
본 개시의 항원은 다발성 경화증과 관련된 항원을 포함한다. 이러한 항원은 예를 들면, 미국 특허출원 공보 제2012/0077686호에 개시된 항원들, 및 미엘린 염기성 단백질, 미엘린 관련 당단백질, 미엘린 희소돌기아교세포 단백질, 프로테오지질 단백질, 희소돌기아교세포 미엘린 올리고단백질, 미엘린 관련 희소돌기아교세포 염기성 단백질, 희소돌기아교세포 특이적 단백질, 열 충격 단백질, 희소돌기아교세포 특이적 단백질 NOGO A, 당단백질 Po, 말초 미엘린 단백질 22 및 2'3'-환형 뉴클레오타이드 3'-포스포디에스터레이즈(phosphodiesterase)로부터 유래한 항원들을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 항원은 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질(MOG)로부터 유래한다.
추가 양태에서, MS 및 MS 관련 장애의 치료를 위한 펩타이드 항원은 MOG35-55, MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MOG36-55, EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK; MAG287-295, SLLLELEEV; MAG509-517, LMWAKIGPV; MAG556-564, VLFSSDFRI; MBP110-118, SLSRFSWGA; MOG114-122, KVEDPFYWV; MOG166-175, RTFDPHFLRV; MOG172-180, FLRVPCWKI; MOG179-188, KITLFVIVPV; MOG188-196, VLGPLVALI; MOG181-189, TLFVIVPVL; MOG205-214, RLAGQFLEEL; PLP80-88, FLYGALLLA; MAG287-295, SLLLELEEV; MAG509-517, LMWAKIGPV; MAG556-564, VLFSSDFRI, MOG97-109(TCFFRDHSYQEEA), MOG97-109(E107S)(TCFFRDHSYQSEA), MBP89-101(VHFFKNIVTPRTP), PLP175-192(YIYFNTWTTCQSIAFPSK), PLP94-108(GAVRQIFGDYKTTIC), MBP86-98(PVVHFFKNIVTPR - HLA-DRB1*1501(13머 펩타이드), PLP54-68(NYQDYEYLINVIHAF), PLP249-263(ATLVSLLTFMIAATY), MOG156-170(LVLLAVLPVLLLQIT), MOG201-215(FLRVPCWKITLFVIV), 및 이들의 균등물 및/또는 조합을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다발성 경화증과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
셀리악병(CD) 관련 항원
셀리악병과 관련된 항원은 aGlia로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비한정적 셀리악병 관련 항원은 글리아딘(gliadin)을 포함한다. 다른 비한정적 예시적 셀리악병 관련 항원은 aGlia57-68: QLQPFPQPELPY(12머 펩타이드); aGlia62-72: PQPELPYPQPE(11머 펩타이드); 및 aGlia217-219: SGEGSFQPSQQNP(13머 펩타이드), 이들의 균등물 및 조합을 포함한다. 셀리악병과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
원발성 담즙성 간경변증(PBC) 관련 항원
원발성 담즙성 간경변증과 관련된 항원은 PDC-E2로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 예시적 항원의 비한정적 예로는 PDC-E2122-135: GDLIAEVETDKATV(14머 펩타이드); PDC-E2249-262: GDLLAEIETDKATI(14머 펩타이드); PDC-E2249-263: GDLLAEIETDKATIG(15머 펩타이드); 및 PDC-E2629-643: AQWLAEFRKYLEKPI(15머 펩타이드), 이들의 균등물 및 조합이 있다. 원발성 담즙성 간경변증과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
낙엽상 천포창(PF) 및 심상성 천포창(PV) 관련 항원
PF 및 PV와 관련된 항원은 DG1EC2, 데스모글레인(desmoglein) 3(DG3 또는 DSG3), 및/또는 데스모글레인 1(DG1 또는 DSG1)로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비한정적 예로는 DG1EC2216-235: GEIRTMNNFLDREI(14머 펩타이드); DG397-111: FGIFVVDKNTGDINI(15머 펩타이드); 및 DG3251-265: CECNIKVKDVNDNFP (15머 펩타이드), 이들의 균등물 및 조합이 있다. 낙엽상 천포창 및 심상성 천포창과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
시신경척수염(NMO) 관련 항원
NMO와 관련된 항원은 AQP4 또는 아쿠아포리나(aquaporina) 4로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비한정적 예로는 AQP4129-143: GAGILYLVTPPSVVG(15머 펩타이드); AQP4284-298: RSQVETDDLILKPGV(15머 펩타이드); AQP463-76: EKPLPVDMVLISLC(14머 펩타이드); AQP4129-143: GAGILYLVTPPSVVG(15머 펩타이드); 및 AQP439-53: TAEFLAMLIFVLLSL(15머 펩타이드), 이들의 균등물 및 조합이 있다. NMO와 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
콜라겐에 의해 유도된 관절염 관련 항원
콜라겐에 의해 유도된 관절염과 관련된 항원은 CII로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비한정적 예로는 cCII230-244: APGFPGPRGPPGPQG(15머 펩타이드); cCII632-646: PAGFAGPPGADGQPG(15머 펩타이드); 및 CII259-273: GIAGFKGDQGPKGET(15머 펩타이드), 또는 이들의 균등물 및 조합이 있다. 관절염과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
알레르기성 천식 관련 항원
알레르기성 천식과 관련된 항원은 DERP1 및 DERP2로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 알레르기성 천식과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
결장염 관련 항원
실험적 결장염과 관련된 항원은 박테로이데스 인테그라제(bacteroides integrase), Fla-2/Fla-X 및 YIDX로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 결장염과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
전신 홍반성 루푸스(SLE) 관련 항원
SLE와 관련된 항원은 H4, H2B, H1', dsDNA, RNP, 스미쓰(Smith)(Sm), SSA/Ro, SSB/La(SS-B), 및/또는 히스톤으로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비한정적 예로는 각각의 단백질의 하기 분절들뿐만 아니라 이들의 균등물 및 조합도 있다: H471-94: TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG, H474-88: EHAKRKTVTAMDVVY(15머 펩타이드); H476-90: AKRKTVTAMDVVYAL(15머 펩타이드); H475-89: HAKRKTVTAMDVVYA(15머 펩타이드); H478-92: RKTVTAMDVVYALKR(15머 펩타이드); H480-94: TVTAMDVVYALKRQ(15머 펩타이드); H2B10-24: PKKGSKKAVTKAQKK(15머 펩타이드); 및 H2B16-30: KAVTKAQKKDGKKRK(15머 펩타이드), H1'22-42: STDHPKYSDMIVAAIQAEKNR; 및 H1'27-41: KYSDMIVAAIQAEKN. SLE와 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
고지방식에 의해 유도된 죽상동맥경화증 관련 항원
고지방식에 의해 유도된 죽상동맥경화증과 관련된 항원은 ApoB로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비한정적 예로는 각각의 단백질의 하기 분절들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 있다: ApoB3501-3516: SQEYSGSVANEANVY(15머 펩타이드); ApoB1952-1966: SHSLPYESSISTALE(15머 펩타이드); ApoB978-993: TGAYSNASSTESASY(15머 펩타이드); ApoB3498-3513: SFLSQEYSGSVANEA(15머 펩타이드); ApoB210A: KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH(20머 펩타이드); ApoB210B: KTTKQSFDLSVKAQY(15머 펩타이드); 및 ApoB210C: TTKQSFDLSVKAQYK(15머 펩타이드). 죽상동맥경화증과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
COPD 및 폐기종 관련 항원
COPD 및/또는 폐기종과 관련된 항원은 엘라스틴으로부터 유래한 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 비한정적 예로는 엘라스틴의 하기 분절들이 있다. COPD 및/또는 폐기종과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
건선 관련 항원
건선과 관련된 항원은 표 1에 나열된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 비한정적 예시적 건선 관련 항원은 인간 아다미스(adamis) 유사 단백질 5(ATL5), 카텔리시딘(cathelicidin) 항균 펩타이드(CAP18) 및/또는 ADAMTS 유사 단백질 5(ADMTSL5)를 포함한다.
자가면역 간염 관련 항원
자가면역 간염 관련 항원은 표 1에 개시된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 비한정적 예시적 자가면역 간염 관련 항원은 사이토크롬 P450 2D6(CYP2D6) 및/또는 가용성 간 항원(SLA)을 포함한다.
포도막염 관련 항원
포도막염 관련 항원은 표 1에 개시된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 비한정적 예시적 포도막염 관련 항원은 아레스틴(arrestin), S-아레스틴, 인간 망막 S-항원, 및/또는 상호광수용체(interphotoreceptor) 레티노이드 결합 단백질(IRBP)을 포함한다.
쇼그렌 증후군 관련 항원
쇼그렌 증후군 관련 항원은 표 1에 개시된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 비한정적 예시적 쇼그렌 증후군 관련 항원은 SSA/Ro(TROVE), SSB/La, 및/또는 무스카린성 수용체 3(MR3)을 포함한다.
피부경화증 관련 항원
피부경화증 관련 항원은 동원체(centromere) 자가항원 동원체 단백질 C(CENP-C), DNA 토포이소머라제(topoisomerase) I(TOP1), 및/또는 RNA 중합효소 III을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
항-인지질 증후군 관련 항원
항-인지질 증후군 관련 항원은 표 1에 개시된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 비한정적 예시적 항-인지질 증후군 관련 항원은 베타-2-당단백질 1(BG2P1 또는 APOH)을 포함한다.
ANCA 관련 혈관염 관련 항원
ANCA 관련 혈관염 관련 항원은 표 1에 개시된 항원들뿐만 아니라, 이들의 균등물 및 조합도 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 비한정적 예시적 ANCA 관련 혈관염 관련 항원은 미엘로퍼옥시다제(myeloperoxidase)(MPO), 프로테이나제(proteinase)(PR3), 또는 세균 투과성 증가 인자(BPI)를 포함한다.
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암 관련 항원
일부 양태에서, 질환 관련 항원은 암 관련 항원이다. 추가 양태에서, 암은 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종, 및/또는 이들 또는 다른 암들로부터의 혼합된 유형의 전이이다. 예시적 암 또는 종양 관련 항원은 표 2에 개시된 항원들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
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다른 암 관련 항원은 2015년 5월 6일에 마지막으로 참조된, 본원에 참고로 도입된 온라인 데이터베이스(http://cancerimmunity.org/peptide/)의 표에 요약된 항원들을 포함한다.
본 개시의 조성물에서, ㎖당 약 0.001 mg 내지 약 10 mg의 총 단백질이 조성물에 존재할 것으로 생각된다. 또한, 유효 용량은 pMHC에 의해 측정될 때 약 0.0004 mg/kg 내지 약 2.027 mg/kg이고 0.0004 mg/kg 내지 약 2.027 mg/kg의 범위 내에 있을 것으로 생각된다. 따라서, 조성물 중의 단백질의 농도는 약, 적어도 약 또는 기껏해야 약 0.001, 0.010, 0.050, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0, 50 또는 100 ㎍/㎖ 또는 mg/㎖ 이상(또는 이들로부터 유도될 수 있는 임의의 범위)일 수 있다. 이것 중 약, 적어도 약 또는 기껏해야 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%는 펩타이드/MHC/나노입자 복합체일 수 있다.
추가로, 본원에 참고로 도입된 미국 특허 제4,554,101호(Hopp)는 친수성을 기반으로 일차 아미노산 서열로부터 에피토프를 확인하고 제조하는 것을 교시한다. 당분야에서 숙련된 자는 상기 특허(Hopp)에 개시된 방법을 통해 아미노산 서열 내에서 잠재적 에피토프를 찾을 수 있을 것이고 그의 면역원성을 확인할 수 있을 것이다. 다수의 과학 공개문헌들도 아미노산 서열의 분석으로부터 이차 구조의 예측 및 에피토프의 확인에 전념하였다(Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979). 원하는 경우, 이들 중 임의의 공개문헌을 이용하여 미국 특허 제4,554,101호(Hopp)의 교시를 보충할 수 있다.
사이토카인
일부 양태에서, NP는 적어도 하나의 사이토카인 분자를 추가로 포함하거나, 대안적으로 이러한 사이토카인 분자로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 사이토카인 분자로 구성된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "사이토카인"은 분자 수준 및 세포 수준에서 체내의 광범위한 생물학적 과정들을 조절하는 신호전달 분자로서 작용하는, 면역 시스템 내의 다양한 세포들에 의해 분비된 저분자량 단백질을 포괄한다. "사이토카인"은 림포카인, 인터류킨 또는 케모카인의 클래스 내에 속하는 개별 면역조절 단백질을 포함한다.
비한정적 예는 본원에 개시되어 있다. 예를 들면, IL-1A 및 IL-1B는 인간 인터류킨-1(IL-1) 패밀리의 두 상이한 구성원들이다. 성숙 IL-1A는 섬유모세포 활성화 인자(FAF), 림프구 활성화 인자(LAF), B 세포 활성화 인자(BAF), 백혈구 내인성 매개자(LEM) 등으로서도 공지되어 있는 18 kDa 단백질이다. IL-4는 T 헬퍼-2(Th2) 세포 분화를 유도하고 IL-13과 긴밀히 관련되어 있고 IL-13과 유사한 기능을 갖는 사이토카인이다. IL-5는 Th2 세포 및 비만 세포에 의해 생성된다. 이 물질은 B 세포 생장을 자극하고 면역글로불린 분비를 증가시키는 작용을 한다. 이 물질은 호산구 활성화에도 관여한다. IL-6은 전구염증성 또는 소염성 사이토카인으로서 작용할 수 있는 인터류킨이다. 이 물질은 T 세포 및 대식세포에 의해 분비되어, 염증을 유발하는 외상 또는 다른 조직 손상에 대한 면역 반응을 자극한다. IL-6은 근육 수축에 반응하여 근육으로부터도 생성된다. IL-8은 대식세포 및 다른 유형의 세포, 예컨대, 상피 세포 및 내피 세포에 의해 생성된 케모카인이고 선천성 면역 시스템 반응에서 면역 반응의 중요한 매개자로서 작용한다. IL-12는 미감작 T 세포가 T 헬퍼(Th1 또는 Th2) 세포로 분화하는 것에 관여한다. 이종이량체성 사이토카인으로서, IL-12는 2개의 별개의 유전자들에 의해 코딩된 2개의 서브유닛들인 IL-12A(p35) 및 IL-12B(p40)가 단백질 합성 후 이량체화한 후에 형성된다. IL-12p70은 이 이종이량체성 조성물을 표시한다. 많은 유형의 세포들, 특히 Th2 세포에 의해 분비된 사이토카인인 IL-13은 알레르기성 염증 및 질환의 중요한 매개자이다. IL-17은 T 헬퍼 세포에 의해 생성된 사이토카인이고 IL-23에 의해 유도되어, 지연된 유형의 반응에서 파괴적 조직 손상을 초래한다. IL-17은 세포외 병원체에 의한 면역 시스템의 침습에 반응하고 병원체의 세포 매트릭스의 파괴를 유도하는 전구염증성 사이토카인이다. IP-10, 또는 인터페론 감마에 의해 유도된 단백질 10은 C-X-C 모티프 케모카인 10(CXCL10) 또는 작은 유도성 사이토카인 B10으로서도 공지되어 있다. CXC 케모카인 패밀리에 속하는 작은 사이토카인으로서, IP-10은 IFN-γ에 반응하여 여러 유형의 세포들(단핵구, 내피 세포 및 섬유모세포를 포함함)에 의해 분비된다. 대식세포 염증성 단백질(MIP)은 케모카인의 패밀리에 속한다. 각각 케모카인(C-C 모티프) 리간드 3(CCL3) 및 CCL4로서도 공지되어 있는 인간 MIP의 두 주요 형태인 MIP-1α 및 MIP-1β가 있다. 이들 둘 다는 세균 내독소에 의한 자극 후 대식세포에 의해 생성된다. 콜로니 자극 인자 3(CSF 3)으로서도 공지되어 있는 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF 또는 GCSF)는 콜로니 자극 인자 호르몬이다. G-CSF는 다수의 상이한 조직들에 의해 생성되어 골수를 자극함으로써 과립구 및 줄기 세포를 생성하는 당단백질, 성장 인자 및 사이토카인이다. G-CSF는 호중구 전구체 및 성숙 호중구의 생존, 증식, 분화 및 기능도 자극한다. 표피 성장 인자 또는 EGF는 그의 수용체 EGFR에 높은 친화성으로 결합함으로써 세포 생장, 증식 및 분화의 조절에 있어서 중요한 역할을 하는 성장 인자이다. 혈관 내피 성장 인자(VEGF)는 혈관형성(배아 순환계의 드 노보(de nove) 형성) 및 혈관신생(기존 혈관구조로부터의 혈관의 성장) 둘 다에 관여하는 중요한 신호전달 단백질인 성장 인자의 패밀리이다.
사이토카인 또는 사이토카인들은 pMHC 복합체와 동일한 방식으로 나노입자에 커플링될 수 있다. 본 개시의 한 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인들 및 pMHC 복합체는 나노입자에 따로 부착된다. 본 개시의 또 다른 실시양태에서, 사이토카인 또는 사이토카인들 및 pMHC 복합체는 먼저 함께 복합체를 형성한 후 나노입자와 복합체를 형성한다. 다수의 사이토카인들은 나노입자에 커플링될 수 있고; 이들은 다수의 동일한 사이토카인들 또는 상이한 사이토카인들일 수 있다.
보조자극 분자 성분
일부 양태에서, NP는 적어도 하나의 보조자극 분자를 추가로 포함하거나, 대안적으로 이러한 보조자극 분자로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이러한 보조자극 분자로 구성된다. 보조자극 분자는 미감작 T 세포를, 특정 항원을 갖는 세포에 대한 면역 반응을 생성할 수 있는 항원 특이적 T 세포로 활성화시키는 데 사용되는 이차 신호를 생체내에서 생성하는 분자이다. 본 개시는 임의의 특정 보조자극 분자로 한정되지 않는다. 다양한 보조자극 분자들이 당분야에서 잘 공지되어 있다. 보조자극 분자의 일부 비한정적 예는 4-IBBL, OX40L, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, CD30L 및 ICOSL이다. 하나의 특정 보조자극 분자만이 하나의 나노입자에 커플링될 수 있거나, 다양한 보조자극 분자들이 동일한 나노입자에 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 보조자극 분자는 T 세포의 보조자극 수용체를 작동시킬 수 있는 항체와 같은 단백질이다. 이 경우, 상기 항체는 미감작 T 세포를 활성화시키고 항원 특이적 방식으로 면역 반응을 유도하는 데 필요한 보조자극 신호를 유도할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본원에서 사용된 용어 "보조자극 분자"는 천연 보조자극 신호전달 분자에 대한 아고니스트 효과를 가짐으로써 보조자극 신호를 생성할 수 있는 물질, 예를 들면, CD28 보조자극 반응을 생성하는 항-CD28 또는 CD28 리간드를 지칭할 수도 있다. 일부 양태에서, 보조자극 분자의 결합가는 나노입자 코어당 약 1 내지 약 6000이고/이거나, 보조자극 분자의 결합가는 나노입자 코어당 약 1 내지 약 6000이다.
조성물
일부 양태에서, 본원은 본원에서 제공된 복수의 복합체들을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 담체, 임의적으로 약학 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 조성물은 하나 이상의 보조자극 분자 및/또는 사이토카인에 커플링된 하나 이상의 나노입자 코어를 임의적으로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 조성물은 1) 복수의 항원-MHC 복합체들에 커플링된 복수의 나노입자 코어들로서, 상기 나노입자 코어들의 적어도 한 부분이 하나 이상의 보조자극 분자 및/또는 하나 이상의 사이토카인을 추가로 포함하고, 상기 나노입자 코어들의 제2 부분이 보조자극 분자 및/또는 사이토카인을 추가로 포함하지 않는 것인 복수의 나노입자 코어들, 및 2) 하나 이상의 보조자극 분자 및/또는 사이토카인에 커플링된 복수의 나노입자 코어들을 포함하거나, 대안적으로 이들로 본질적으로 구성되거나, 더 나아가 이들로 구성된다.
나노입자 및 pMHC 복합체를 제조하는 방법
pMHC-NP 및 나노입자는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 2008/109852호, 제WO 2012/041968호, 제WO 2012/062904호, 제WO 2013144811호, 제WO 2014/050286호, 제WO 2015/063616호 및 제WO 2016/198932호, 또는 국제 특허출원 제PCT/IB2017/001508호에 기재된 다양한 방법들에 의해 제조될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 개시의 다양한 실시양태를 예시하기 위해 제공되고 본 개시를 임의의 방식으로 한정하기 위한 것이 아니다. 당분야에서 숙련된 자는 본 개시가 목적을 달성하고 언급된 결과 및 장점뿐만 아니라 본원에 내재된 목적, 결과 및 장점도 수득하도록 잘 맞추어져 있다는 것을 용이하게 인식할 것이다. 본원에 기재된 방법과 함께 본 실시예는 현재 실시양태를 대표하고, 예시하기 위한 것이고, 본 개시의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다. 청구범위에 의해 정의된 본 개시의 사상 내에 포함되는 변화 및 다른 용도는 당분야에서 숙련된 자에게 인식될 것이다.
방법
마우스. 잭슨 랩(Jackson Lab)(메인주 바 하버 소재)으로부터 NOD/Lt 마우스를 입수하였다. 17.4α/8.3β(8.3-NOD) 마우스 및 BDC2.5-NOD 마우스(각각 IGRP206-214 또는 NRP-V7/Kd 및 2.5mi/IAg7에 대한 형질전환 T 세포 수용체를 발현함)는 기재되어 있다19, 20, 21.
pMHC 생성. 2종의 상이한 방법들을 이용하여 재조합 pMHC 클래스 I 복합체를 발현시켰다. 제1 방법은 펩타이드의 존재 하에서 세균에서 발현된 MHC 클래스 I 중쇄 및 경쇄를 리폴딩한 후, 겔 여과 및 음이온 교환 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계를 포함하였다22, 23. 제2 방법은 마이코플라스마 무함유 렌티바이러스에 의해 형질도입된 프리스타일 중국 햄스터 난소(CHO) 세포에서 단일 쇄 구축물로서 고수율로 MHC 클래스 I 복합체를 발현시키는 단계를 포함하고, 이때 상기 단일 쇄 구축물에서 펩타이드 코딩 서열, MHC 클래스 I 경쇄 및 중쇄는 BirA 부위, 및 유리 시스테인으로 종결되는 6xHis 및 스트렙타비딘 태그를 코딩하는 카복시 말단 링커 앞에 위치한 유연한 글리신-세린(GS) 링커24와 순차적으로 연결되어 있다. 스트렙타비딘 태그 및/또는 니켈 컬럼을 사용하여 배양 상청액으로부터 분비된 단백질을 정제하고 NP 코팅에 직접 사용하였거나, 플루오로크롬-접합된 스트렙타비딘을 사용하여 바이오티닐화함으로써 pMHC 사량체를 생성하였다.
복합체의 펩타이드-MHCα 및 MHCβ 쇄가 리보좀 스킵핑 P2A 서열에 의해 분리되어 있는 모노시스트론성 메시지를 코딩하는 렌티바이러스로 형질도입된 프리스타일 CHO 세포에서 재조합 pMHC 클래스 II 단량체를 생성하였다. BirA 부위, 스트렙타비딘 및/또는 6xHis 태그 및 유리 시스테인을 코딩하는 링커를 구축물의 카복실 말단에 추가하였다. 자가조립된 pMHC 클래스 II 복합체를 니켈 친화성 크로마토그래피로 배양 상청액으로부터 정제하고 NP에의 코팅을 위해 사용하였거나, 전술된 바와 같이 바이오티닐화 및 사량체 형성을 위해 프로세싱하였다.
NP 합성. 기재된 바와 같이(Perrault, S.D. et al. (2009) Nano Lett. 9(5):1909-1915) 구연산나트륨으로 염화금산(HAuCl4)을 화학적으로 환원시켜 금 나노입자(GNP)를 합성하였다. 요약하면, 2 ㎖의 1%의 HAuCl4(Sigma Aldrich, 온타리오주 오크빌 소재)을 격렬한 교반 하에서 100 ㎖ H2O에 첨가하였고, 용액을 오일 배쓰에서 가열하였다. 6 ㎖(14 nm GNP의 경우) 또는 2 ㎖(40 nm GNP의 경우)의 1% 구연산나트륨을 끓는 HAuCl4 용액에 첨가하였고, 이 용액을 추가 10분 동안 교반한 후 실온까지 냉각시켰다. pMHC의 수용체로서 카복실(-COOH) 또는 일차 아민(-NH2) 기에 의해 작용화된 1 μM의 티올-폴리에틸렌 글리콜(티올-PEG) 링커((Nanocs, 매사추세츠주 소재)를 첨가하여 GNP를 안정화시켰다. 페길화된 GNP를 물로 세척하여 유리 티올-PEG를 제거하고 농축하고 추가 분석을 위해 물에 저장하였다. 비어(Beer) 법칙에 따라 분광광도 측정으로부터 NP 밀도를 계산하였다.
계면활성제의 존재 하에서 유기 용매에서 철 아세틸아세토네이트를 열 분해하여 SFP 계열 산화철(Fe3O4) NP를 생성한 후, 페길화하여 수성 완충제에서 가용성을 갖게 하였다(Xie, J. et al. (2007) Adv Materials 19(20):3163-3166; Xie, J.P.S. et al. (2006) Pure Appl Chem 78(5):1003-1014; Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56(7):821-82). 요약하면, 2 mmol의 Fe(acac)3(Sigma Aldrich)을 10 ㎖의 벤질 에테르와 올레일아민의 혼합물에 용해시키고 질소 블랭킷의 보호 하에서 환류로 1시간 동안 100까지 가열한 후 2시간 동안 300℃까지 가열하였다. 에탄올을 첨가하여 합성된 NP를 침전시키고 헥산에 재현탁하였다. 산화철 NP의 페길화 후, 100 mg의 상이한 도파민-접합된 PEG(DPA-PEG, 3.5 kDa) 링커(Jenkem Tech USA)를 클로로포름과 디메틸포름아미드(DMF)의 혼합물에 용해시켰다. 그 다음, NP 용액(20 mg Fe)을 DPA-PEG 용액에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 헥산을 첨가하여 페길화된 SFP NP를 하룻밤 동안 침전시키고 물에 재현탁하였다. 미량의 응집체를 고속 원심분리(20,000xg, 30분)로 제거하였다. pMHC 접합을 위해 단분산 SFP NP를 물에 저장하였다. 철의 농도를 2 N 염산(HCl)에서 410 nm에서 분광광도계로 측정하였다. SFP NP의 분자 구조 및 직경(Fe3O4; 8+1 nm 직경)(Xie, J. et al. (2007) Adv Materials 19(20):3163-3166; Xie, J.P.S. et al. (2006) Pure Appl Chem 78(5):1003-1014)을 기반으로, 본 출원인은 1 mg의 철을 함유하는 SFP 용액이 5x1014개의 NP를 함유한다고 추정하였다.
그 후, 본 출원인은 계면활성제의 완전한 부재 하에서 단일 단계로 열 분해함으로써 페길화된 산화철 NP의 형성을 가능하게 하는 신규 산화철 NP 디자인을 개발하였다(PF 계열 산화철 NP). 이 디자인에서, PEG 분자를 제자리 표면 코팅제로서 사용하였다. 전형적인 반응에서, 3 g의 PEG(2 kDa MW)를 100℃에서 끓는 50 ㎖ 환저 플라스크 내에서 서서히 용융시킨 후 7 ㎖의 벤질 에테르 및 2 mmol Fe(acac)3과 혼합하였다. 반응물을 1시간 동안 격렬히 교반하고 추가 2시간 동안 환류로 260℃까지 가열하였다. 반응 혼합물을 실온까지 냉각시키고 원심분리 튜브로 옮기고 30 ㎖ 물과 혼합하였다. 불용성 물질을 30분 동안 2,000xg에서 원심분리로 제거하였다. 아미콘(Amicon)-15 필터(MWCO 100 kDa, Millipore, 매사추세츠주 빌러리카 소재)를 통한 한외여과로 유리 PEG 분자를 제거하였다. 시험된 모든 PEG 분자들은 아닐지라도 대부분의 PEG 분자들에 의해 산화철 NP가 생성되었다. 산화철 NP의 크기는 열 분해 반응에서 사용된 PEG 링커의 작용기에 따라 달라졌다. 자성(MACS) 컬럼(Miltenyi Biotec, 캘리포니아주 오번 소재) 또는 IMag 세포 분리 시스템(BD BioSciences, 온타리오주 미시소가 소재)을 이용하여 NP를 용이하게 정제할 수 있었다. 정제된 산화철 NP를 임의의 검출가능한 응집 없이 실온 또는 4℃의 물에 저장하였다. SFP NP에 대해 전술된 바와 같이 NP 밀도를 계산하였다.
pMHC와 NP의 접합. 원위 일차 아민(-NH2) 또는 카복실(-COOH) 기를 갖는 PEG 링커에 의해 생성된, pMHC와 NP의 접합을, 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC)의 존재 하에서 아미드 결합의 형성을 통해 달성하였다. -COOH 기를 갖는 NP(GNP-C, SFP-C 및 PF-C)를 먼저 20 mM의 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산(MES) 완충제(pH 5.5)에 용해시켰다. 그 다음, N-하이드록시설포석신이미드 나트륨 염(설포-NHS; 10 mM) 및 EDC(1 mM)(Thermo scientific, 매사추세츠주 왈쌈 소재)를 NP 용액에 첨가하였다. 실온에서 20분 동안 교반한 후, NP 용액을 pMHC 단량체 용액(20 mM 보레이트 완충제 중의 용액, pH 8.2)에 적가하였다. 혼합물을 추가 4시간 동안 교반하였다. pMHC를 NH2-작용화된 NP(GNP-N, SFP-N 및 PF-N)에 접합시키기 위해, 100 mM 염화나트륨(NaCl)을 함유하는 20 mM MES 완충제(pH 5.5)에 pMHC 복합체를 먼저 용해시켰다. 그 다음, 설포-NHS(10 mM) 및 EDC(5 mM)를 pMHC 용액에 첨가하였다. 활성화된 pMHC 분자를 20 mM 보레이트 완충제(pH 8.2) 중의 NP 용액에 첨가하고 실온에서 4시간 동안 교반하였다.
pMHC를 말레이미드-작용화된 NP(SFP-M 및 PF-M)에 접합시키기 위해, 유리 C-말단 시스테인을 코딩하도록 조작된 pMHC 분자를, 2 mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및 150 mM NaCl을 함유하는 40 mM 포스페이트 완충제(pH 6.0)에서 NP와 혼합하고, 실온에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 말레이미드 기와 시스테인 잔기 사이의 탄소-황 결합의 형성을 통해 pMHC를 NP에 공유결합시켰다.
클릭 화학반응을 이용하여 pMHC를, 아지드 기에 의해 작용화된 NP(SFP-Z)에 접합시켰다. 이 반응을 위해, 먼저 실온에서 pMHC 분자를 디벤조사이클로옥틴-N-하이드록시석신이미딜 에스테르(DBCO-NHS, Click Chemistry Tools, 아리조나주 스캇데일 소재)와 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. 유리 DBCO 분자를 하룻밤 동안 투석으로 제거하였다. 그 다음, pMHC-DBCO 접합체를 2시간 동안 SFP-Z와 함께 인큐베이션하여, pMHC 분자와 NP 사이에 트리아졸 결합을 형성하였다.
300 kDa 분자량 컷오프 막(Spectrum labs)을 통해 4℃에서 PBS(pH 7.4)에 대해 광범위하게 투석함으로써, 상이한 pMHC-NP 접합 반응에서 접합되지 않은 pMHC 복합체를 제거하였다. 대안적으로, pMHC-접합된 산화철 NP를 자기 분리로 정제하였다. 접합된 NP를, 아미콘 울트라-15 유닛(100 kDa MWCO)을 통한 한외여과로 농축하고 PBS에 저장하였다.
NP 특징규명. 투과 전자 현미경관찰(TEM, Hitachi H7650)을 통해 접합되지 않은 NP 및 pMHC-접합된 NP의 코어 크기 및 분산도를 먼저 평가하였다. 동적 광 산란(DLS, Zetasizer, 영국 말버른 소재)을 이용하여 NP 및 pMHC-NP의 수력학적 크기를 측정하였다. 작은 각도 전자 빔 회절(SEBD)을 이용하여 PF 계열의 NP의 산화철 코어의 화학적 성질을 평가하였다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 이용하여 표면 화학적 성질을 평가하였다. 천연 및 변성 PAGE, 브래드포드 어세이, 아미노산 분석 및 도트-효소-연결된 면역흡착 어세이(도트-ELISA)를 통해 pMHC-접합된 NP를 분석하였다.
푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR). 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR)을 이용하여 PF 계열 산화철 NP 디자인의 표면 화학적 성질을 평가하였다. 니콜렛(Nicolet) FTIR 분광광도계를 ATR(약화된 총 반사) 모드로 이용하여 대조군 PEG 및 PF-NP 표면에 고착된 PEG의 FTIR 스펙트럼을 수득하였다. 각각의 스펙트럼을 4 cm-1 분광 해상도에서 256회 스캔의 평균으로서 기록하였다. (C-H 비대칭 스트레칭 진동, C-O-C 진동 및 CH2 락킹 진동에 의해 표시된) PEG 골격의 분자 진동 시그너처 및 이의 원위 pMHC-수용체 작용기를 확인하였다.
아가로스 겔 전기영동. 페길화 또는 pMHC 코팅의 함수로서 NP 전하의 변화를 신속히 평가하기 위해, 0.8% 아가로스 겔에서 NP에 대한 전기영동을 수행하였다. 페길화된 NP는 전체 표면 전하에 따라 음극 또는 양극으로 이동하였다.
천연 및 변성 폴리아크릴아미드 겔 전기영동. pMHC-접합된 NP에 대한 천연 PAGE 및 SDS-PAGE(10%) 분석을 수행하여, 유리(접합되지 않은) pMHC가 pMHC-NP 제제에 부재한다는 것을 확인하였고 온전한 삼분자 pMHC 복합체가 NP 표면에 존재한다는 것을 확인하였다.
pMHC 결합가 측정. 개별 NP에 접합된 pMHC 단량체의 수(pMHC 결합가)를 평가하기 위해, 본 출원인은 브래드포드 어세이(Thermo Scientific), 아미노산 분석(가수분해된 pMHC-NP 제제에서 17개의 상이한 아미노산들의 HPLC 기반 정량)(University of Toronto) 및 도트-효소-연결된 면역흡착 어세이(도트-ELISA)를 포함하는 상이한 방법들을 이용하여 pMHC-NP 제제의 pMHC 농도를 측정하였고, 값을 pMHC 분자 수 대 NP 수의 비로 전환시켰다. 요약하면, "도트-ELISA" 방법에서, pMHC-접합된 NP, 접합되지 않은 NP 및 pMHC 단량체 용액(표준물)을 PBS에 순차적으로 희석하고 멀티웰 필터 플레이트(PALL Corporation) 내의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막에 흡수시켰다. 상기 플레이트를 실온에서 반건조한 후, pMHC 특이적 일차 항체(즉, pMHC 클래스 I-코팅된 NP에 대한 항-β2M 항체 및 항-Kd 항체, 각각 클론 2M2 및 SF1-1.1; BioLegend, 캘리포니아주 샌디에고 소재)와 함께 인큐베이션한 후, HRP-접합된 이차 항체 또는 AP-접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 효소 발색 반응이 일어났을 때, 웰의 내용물을 통상적인 ELISA 플레이트의 웰로 옮겼고 플레이트 판독기를 이용하여 450 nm에서 그의 흡광도를 측정하였다. 이 상이한 방법들에 의해 생성된 값들이 유사하였기 때문에, (접합되지 않은 NP를 블랭크로서 사용하는) 브래드포드 어세이는 용이함 및 단순함을 이유로 선택되는 방법이 되었다.
TCR/mCDA로 형질감염된 JurMA 세포에서의 TCR 신호전달. cDNA 말단의 신속한 증폭을 위한 5' RACE 시스템 버전 2.0 키트(Thermo Fisher Scientific, 미국 왈쌈 소재) 및 TCRα 또는 TCRβ 특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여, BDC2.5-TCR을 코딩하는 TCRα cDNA 및 TCRβ cDNA를 BDC2.5-CD4+ T 세포로부터 유래한 mRNA로부터 생성하였다. 수득된 PCR 생성물을 pCR8 플라스미드 내로 클로닝하고 시퀀싱하였다. 그 다음, TCRα cDNA와 TCRβ cDNA가 P2A 리보좀 스킵핑 서열에 의해 분리되어 있는 단일 오픈 리딩 프레임으로서 전체 길이 cDNA를 IRES-eGFP 카세트의 업스트림에서 레트로바이러스 벡터 내로 서브클로닝하였다.
TCRα-P2A-TCRβ 융합 단백질의 폴리펩타이드 서열은 하기 제공된 예시적 서열목록에 제공되어 있다.
TCRα-P2A-TCRβ 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 서열은 하기 제공된 예시적 서열목록에 제공되어 있다.
인간 CD3+/TCR β - JurMA 리포터 세포주(NFAT에 의해 유도된 루시퍼라제를 발현하도록 조작됨)를, 레트로바이러스 생성 GP+envAm12 세포주와 공배양함으로써 뮤린 CD4를 코딩하는 레트로바이러스로 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 증폭시키고 파시픽 블루(Pacific Blue)-접합된 항-mCD4(GK1.5)(BioLegend, 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 염색하고 BD FACSAria II(BD Biosciences, 뉴저지주 소재)로 분류하였다. 그 다음, CD4+ Jurkat/MA 세포를 BDC2.5-TCRαβ 및 IRES-eGFP를 코딩하는 레트로바이러스로 형질도입하였다. eGFP 및 mCD4 이중 양성 세포를 유세포분석으로 분류하고 PE-표지부착된 BDC2.5/IAg7 pMHC 사량체로 염색하여 그의 특이성을 확인하였다.
루시퍼라제의 NFAT-유도된 발현을 측정하기 위해, 야생형 JurMA 세포 및 BDC2.5/mCD4+ JurMA 세포를 20 ng/㎖ PMA(Sigma-Aldrich) 플러스 0.5 μM 이오노마이신(Sigma-Aldrich), 10 ㎍/㎖의 항-hCD3ε mAb(OKT3, BD Biosciences) 또는 12.5 ㎍/㎖의 BDC2.5/IAg7-코팅된 PF-M의 존재 또는 부재 하에서 10% FBS(Sigma-Aldrich), 20 mM L-글루타민(Sigma-Aldrich), 10 mM 피루브산나트륨(Thermo Fisher Scientific, 매사추세츠주 왈쌈 소재) 및 항생제로 보충된 200 ㎕의 DMEM(Sigma-Aldrich, 미조리주 세인트 루이스 소재)에서 500,000개 세포/웰의 밀도로 48웰 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 자극 후 상이한 시간에서 웰로부터 회수하고 96웰 플레이트로 옮기고 PBS로 3회 세척하였다. 105개의 세포를 신규 96웰 플레이트로 옮기고, 20 ㎕의 세포 배양 용해 시약(Promega, 위스콘신주 매디슨 소재)으로 용해시키고, 인젝터와 함께 Veritas™ 마이크로플레이트 루미노미터(Promega)를 이용하여 불투명한 백색 플레이트(Greiner Bio One International GmbH, 오스트리아 크렘스먼스터 소재)에서 100 ㎕의 루시퍼라제 어세이 시약(Promega)과 함께 인큐베이션하였다. 루시퍼라제 활성은 자극받지 않은 세포의 루시퍼라제 활성으로 표준화된 상대적 발광 유닛(RLU)으로서 표현되었다.
시험관내에서의 pMHC-NP의 아고니스트 활성. TCR 형질전환 마우스로부터의 FACS-분류된 비장 CD8+ 또는 CD4+ 세포(2.5x105개 세포/㎖)를 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 다양한 pMHC-접합된 NP 또는 대조군 NP 농도와 함께 인큐베이션하였다. 상청액을 ELISA로 IFNγ에 대해 어세이하였다.
항-CD3/항-CD28 mAb-코팅된 비드(Life Technologies; 1:1의 비드 대 세포 비), PPI76-90(88S)/DRB1*0401-코팅된 PF-M(50 ㎍의 펩타이드/MHC/㎖) 또는 동일한 수의 대조군인 시스테인-코팅된 PF-M을 함유하는 500 ㎕의 완전한 RPMI-1640 배지에서 48웰 플레이트 내의 5x105개 클론 T 세포를 배양함으로써 아고니스트 mAb 및 pMHC-코팅된 NP에 대한 인간 T 세포 클론의 반응성을 평가하였다. 2일째 날, 루미넥스(Luminex)에 의한 사이토카인 함량 분석을 위해 상청액을 회수하였고 RNA 추출을 위해 세포 펠렛을 수거하였다. 다른 실험에서, T 세포 클론을 최대 5일 동안 PPI76-90(88S)/DRB1*0401-코팅된 PF-M 또는 시스테인-코팅된 PF-M과 함께 인큐베이션하였다. 0일째 날, 2일째 날, 3일째 날, 4일째 날 및 5일째 날, 세포를 회수하여 RNA 추출을 위해 사용하였다.
pMHC-NP/세포 접합체의 투과 전자 현미경관찰(TEM). 바이오틴-스트렙타비딘 CD4+ 또는 CD8+ T 림프구 농축 키트(BDC ImagTM, BD Biosciences)를 사용함으로써 TCR 형질전환 동물로부터 단리된 BDC2.5-CD4+ T 세포 및 8.3-CD8+ T 세포(5x106/㎖)를 4℃에서 30분 동안 2.5mi/IAg7-코팅된 PF-M NP 및 NRP-V7/Kd-코팅된 PF-M NP와 함께 인큐베이션하였다(15-20 ㎍/㎖의 pMHC). 배양물을 표시된 시간 동안 37℃에서 더 인큐베이션하고 냉각된 PBS로 세척하여 결합되지 않은 PF-M NP를 제거하고 고정시키고, 히타키(Hitachi) H7650을 이용한 TEM 영상화를 위해 박편(70 nm)으로 만들었다.
초고해상도 현미경관찰. 정제된 8.3-CD8+ T 세포를 30분 동안 4℃에서 또는 1시간 동안 37℃에서 NRP-V7/Kd-PF-M-알렉사-647 NP와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 냉각된 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후, 얼음 위에서 15분 동안 2% PFA로 고정시켰다. 세척 후, 세포를 5분 동안 실온에서 1 ㎍/㎖ DAPI로 염색하고 올려놓고 초고해상도 현미경(ELYRA 131, Zeiss) 하에 관찰하였다. 영상 프로세싱 및 클러스터 직경의 정량적 분석을 ZEN 2012 소프트웨어로 수행하였다(n=100).
pMHC-NP/세포 접합체의 스캐닝 전자 현미경관찰(SEM) 및 X-선 분광측정. 티오글리콜레이트에 의해 유도된 복막 대식세포 및 골수 유래 DC를 전술된 바와 같이 준비하였다. 바이오틴-스트렙타비딘 CD4+ 또는 CD8+ T 림프구 농축 키트(BDC ImagTM, BD Biosciences)를 이용하여 BDC2.5-NOD 또는 8.3-NOD 마우스 비장으로부터 BDC2.5-CD4+ T 세포 및 8.3-CD8+ T 세포를 음성적으로 선택하였다. 세포를 커버슬립 위에 플레이팅하였고, 30분 동안 4℃에서 비접합된 또는 시스테인-접합된 PF-M, BDC2.5mi/IAg7-PF-M 또는 NRP-V7/Kd-PF-M과 함께 인큐베이션한 후, 37℃에서 60분 또는 180분 동안 더 인큐베이션하였거나 인큐베이션하지 않았다. 인큐베이션 후, 세포를 0.05 M 카코딜레이트 완충제(CB)(pH 7.4)로 세척한 후, 하룻밤 동안 4℃에서 2.5% 글루타르알데하이드로 고정시켰다. 표본을 등급이 나뉜 에탄올로 순차적으로 탈수시키고 건조를 위해 3분 동안 헥사메틸디실라잔에 담구었다. 샘플을 금 코팅으로 XL30 SEM(Philips, 네덜란드 소재) 하에서 관찰하였다. 에너지 분산 X-선 분광측정(EDS)을 이용하여 원소 분석을 수행하였다.
실시예 1 - 나노입자(NP) 표면의 분자 pMHC 밀도 대 pMHC 기반 나노의약의 생물학적 활성
펩타이드-주조직적합성 복합체(pMHC)의 결합가 및 pMHC-나노입자(NP) 농도가 어떻게 이 화합물들의 생물학적 활성에 기여하는지를 이해하기 위해, 본 출원인은 T 세포 수용체(TCR) 형질전환 8.3-NOD 마우스로부터 동족(NRP-V7/Kd/IGRP206-214 특이적) CD8+ T 세포를 일시적으로 활성화시키는 다양한 NRP-V7/Kd-NP 제제들의 능력을 비교하였다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 8.3-CD8+ T 세포는 광범위한 pMHC-NP 또는 pMHC 농도에 걸쳐 8개 pMHC/NP로 코팅된 SFP-NP의 존재 하에서 배양되었을 때 소량의 인터페론 감마(IFNγ)를 생성하였으나, 더 높은 pMHC 결합가, 심지어 11개 pMHC/NP만큼 낮은 결합가로 코팅된 NP에 반응하여 실질적으로 더 높은 양의 IFNγ를 생성하였다. 이 관찰결과는 SFP-NP의 아고니스트 활성에 대한 pMHC 결합가의 역치가 9개 pMHC/NP와 11개 pMHC/NP 사이에 있다는 것을 암시하였다(도 1a 및 1b). 이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, pMHC-NP 농도의 증가는 "역치" 또는 "역치 초과" pMHC 결합가를 갖는 pMHC-NP의 아고니스트 성질을 향상시킬 수 있다.
이 관찰결과를 확인하기 위해, 다음으로 본 출원인은 SFP-NP보다 더 크기 때문에 더 큰 pMHC 코팅 용량을 갖는 PF-NP를 사용하였다. 13개 이하의 pMHC/NP를 갖는 pMHC-PF NP는 훨씬 더 높은 pMHC 결합가(61개 pMHC/NP, 도 1c 및 1d, 및 제시되지 않은 데이터)를 표시하는 PF-NP에 비해 약 8x1012개 NP/㎖까지 매우 약한 생물학적 활성을 가졌거나 생물학적 활성을 갖지 않았다. 이것은 아고니스트 활성을 위해 요구된 pMHC의 역치가 NP 크기에 따라 증가한다(즉, 약 8 nm SFP-NP의 경우 8개 초과의 pMHC부터 약 20 nm PF-NP의 경우 13개 초과의 pMHC까지)는 생각을 뒷받침하였다. 아고니스트 활성에 대한 NP 크기 및 pMHC 결합가의 역효과는 pMHC 밀도(pMHC/NP의 표면적)에 대한 역할을 암시하였다. 이것은 도 1e 및 1f에 더 예시되어 있는데, 여기서 본 출원인은 (상이한 크기의 NP들을 동일한 농도로 사용할 때 총 pMHC '적재량'의 절대적 차이를 보상하기 위해) 다양한 NP 또는 pMHC 농도에 걸쳐 유사한 수의 pMHC로 코팅된 SFP-NP와 PF-NP의 생물학적 활성을 비교하였다.
실시예 2 - 역치 초과의 pMHC 밀도에서 생물학적 활성의 신속한 증가
이 데이터는 생물학적 활성 역치가 NP에서 개별 pMHC 단량체들을 분리하는 거리에 상응하는 상수로 정의된다는 것을 암시한다. 본 출원인은 pMHC-밀도 역치를 확인하기 위해 상이한 크기의 NP들의 최대 역치 결합 성능과 예측된 역치 결합 성능을 비교하였다. 이론적 pMHC 밀도 역치는 8 nm NP의 경우 11개의 pMHC에 상응하거나 20 nm NP의 경우 22개의 pMHC에 상응하는 0.004468 pMHC/nm2에 있다. 이 값들은 약 16.88 nm의 계산된 분자간 거리에 상응한다. T 세포 항원 수용체(TCR) 복합체는 CD3γ-CD3ε-TCRαβ-CD3ζ-CD3ζ-TCRαβ-CD3δ-CD3ε 복합체 내에서 최대 2개의 TCRαβ 이종이량체들을 함유할 것으로 생각된다(Rojo, J.M. ET AL. (1991) Immunol Today 12(10):377-378; Fernandez-Miguel, G. et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4):1547-1552). 이 구조는 3D 재구축에 기반을 둔 TCR 복합체의 추정된 폭(12 nm)과 잘 맞고(Arechaga, I. et al. (2010) Int Immunol 22(11):897-903), 아고니스트 역치에 도달하기 위한 16.88 nm의 계산된 pMHC간 거리와 일치한다. 본 출원인은 약 3.62 nm의 최소 가능한 분자간 거리를 계산하였는데, 이 거리는 TCRαβ 나노클러스터 내의 개별 TCR들에 걸쳐 있는 추정된 3 내지 6 nm 거리와 잘 부합되고; 이 거리는 NP의 pMHC와 T 세포의 동족 TCR의 거의 완벽한 정렬을 허용할 것이다(도 2a). 이 클러스터에서 인접 TCR 이종이량체들을 라이게이션시킬 수 있는 pMHC-NP는 TCR 신호전달을 이끌어내는 데 효율적이다. 이 모델은 가깝게 나란히 놓인 pMHC들로 코팅된 작은 NP가 최적 면역학적 성질을 갖는 이유를 설명한다. pMHC 밀도는 큰 TCR 마이크로클러스터의 지속된 조립을 촉진하여, 신속하고 강력하고 연장된 TCR 신호전달을 유발할 수 있기 때문에 Treg 세포 전환을 조절한다(도 2b).
광범위한 결합가에 걸쳐 pMHC 클래스 II 단량체로 코팅된 PF-NP의 TCR 유발 효능을 비교함으로써, pMHC 클래스 I-코팅된 NP를 사용하여 생성한 데이터에 기반을 둔 가설을 시험하였다. BDC2.5-TCR 형질전환 NOD 마우스로부터 단리된 CD4+ T 세포는 최대 22개의 동족 (BDC2.5mi/IAg7) pMHC 복합체들로 코팅된 PF-M NP(0.0045 pMHC/nm2, 도 1g)에 반응하여 소량의 IFNγ를 생성하였다. 놀랍게도, 10 및 5 ㎍의 pMHC/㎖(용량-반응 효과가 정체기에 도달하는 농도)에서 수득된 IFNγ 분비 데이터를 작도함으로써, IFNγ 분비의 크기는 약 22개 pMHC(예측된 역치 결합가)로 시작하여 약 32개 pMHC/NP(0.0065 pMHC/nm2, 본원에서 "최소 최적 결합가"로서 지칭됨)로 종결되는, pMHC 결합가의 상대적으로 작은 증가에 반응하여 기하급수적으로 증가한다(도 1h). 이 최소 최적 결합가를 초과하는 pMHC 결합가/밀도의 실질적인 증가는 유의미하게 더 높은 효능을 야기하지 않는다(도 1h).
실시예 3 - pMHC 밀도는 pMHC-NP에 의해 유도된 TCR 신호전달의 크기를 조절한다 .
이 생물학적 효과가 TCR 신호전달의 효율의 pMHC 밀도 의존적 차이에 의해 설명될 수 있는지를 확인하기 위해, 본 출원인은 (내인성 TCRβ 쇄 발현을 결여하고 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열에 의해 유도되는 루시퍼라제 리포터를 보유하는) Jurkat/MA(JurMA) 인간 T 세포주(Scholten, K.B. et al. (2005) Clin Immunol 114(2):119-129)를, BDC2.5 TCRαβ 이종이량체 및 뮤린 CD4 보조수용체를 코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 도 1i에 나타낸 바와 같이, BDC2.5-TCR/mCD4-JurMA 세포는 14시간에서 정점에 도달하고 그 후에 점진적으로 감소한 훨씬 더 느린 반응을 유발한 최적 농도의 아고니스트 항-인간 CD3ε mAb 또는 PMA/이오노마이신에 비해 지속된 시간(>24시간) 동안 BDC2.5mi/IAg7-코팅된 PF-M에 신속히(2시간 이내) 강력하게 반응하였다. 특히, 광범위한 BDC2.5mi/IAg7 결합가로 코팅된 PF-M NP를 사용한 실험은 루시퍼라제 발현의 크기(TCR 신호전달의 직접적인 판독)가 일차 BDC2.5-CD4+ T 세포의 사용 시 관찰된 동력학과 현저히 유사한 동력학을 따른다는 것을 표시하였는데, 이것은 역치 pMHC 밀도 및 역치 초과의 pMHC 밀도가 협력적 TCR 신호전달을 다소 촉진한다는 것을 시사한다(도 1j).
미감작 일차 TCR 형질전환 T 세포를 사용할 때 (a) 협력적 신호전달 효과, 및 (b) 역치 및 최소 최적 밀도를 정의하는 특정 pMHC 결합가/밀도의 관점 둘 다에서 pMHC-밀도-반응 곡선과 매우 유사한 S자형 곡선(도 1j)을 제시하는 본 개시의 어세이를 관찰하는 것도 예상되지 않는다. 이것은 외인성 TCR/보조수용체 쌍을 과다발현하는 형질감염된 세포주의 경우 완전히 놀라운 결과이다. 당분야에서 숙련된 자는 형질감염된 뮤린 TCR 및 CD4 분자의 분자 수 및 정확한 화학양론을 일치시키는 것이 어렵다는 점, 및 숙주 세포주가 인간으로부터 유래한 세포주(그의 CD3 쇄 성분을 포함함)인 반면, 시험된 pMHC 및 TCR/CD4 분자가 뮤린이라는 점을 고려할 때 상기 형질감염된 세포로부터 (S자형 곡선과 대조되는) 선형 반응을 예상하였을 것이다.
실시예 4 - pMHC-NP는 뮤린 동족 T 세포에서 항원 수용체 클러스터링을 유발한다 .
본 출원인은 pMHC-NP가 전문 항원 제시 세포(APC)를 통해 pMHC를 동족 T 세포에게 전달함으로써 Treg 세포 전환을 촉진하기보다는 오히려 이 T 세포에서 TCR을 직접 라이게이션시킴으로써 Treg 세포 전환을 촉진한다는 것을 보여주었다(Clemente-Casares, X. et al. (2016) Nature 530(7591):434-440). 다른 자극에 비해 pMHC-NP로 챌린지된 TCR/mCD4-형질감염된 JurMA 세포에서의 NFAT-유도된 루시퍼라제의 신속한 지속된 생성에 커플링된, 상기 실험에 의해 밝혀진 pMHC 밀도 효과(도 1j)는 pMHC-NP가 (저친화성 단량체 pMHC/TCR 상호작용의 일시적인 성질과 대조적으로) 연장된 TCR 라이게이션을 유도함으로써 작동할 것임을 암시하였다.
TCR은 직경/길이가 최대 약 200 nm이고 최대 30개의 가깝게 회합된 TCR들(나노클러스터)로 구성된 선형 클러스터(Schamel, W.W. et al. (2013) Immunol Rev 251(1):13-20) 또는 비-선형 조립체(Lillemeier, B.F. et al. (2010) Nat Immunol 11(1):90-96)로서 미감작 T 세포의 표면에서 조직화된다(Zhong, L. et al. (2009) PLoS One 4(6):e5945). 이 TCR 조립체의 나노클러스터 구조는 전문 APC의 동족 pMHC에 대한 T 세포의 물리적 결합력을 증가시켜 기능적 민감성을 증가시키고 가깝게 나란히 놓인 TCR 유닛들 사이에 협력적 세포내 신호전달을 촉진할 것으로 생각된다. TCR 나노클러스터 형성은 항시적이고, pMHC 라이게이션으로부터 비롯된 TCR 마이크로클러스터 형성(지속된 TCR 신호전달을 유발함)보다 앞선다는 것을 보여주는 증거가 있다(일반적으로 크기가 300 내지 800 nm이고 최대 70개의 TCR들을 함유함)(Lillemeier, B.F. et al. (2010) Nat Immunol 11(1):90-96; Yokosuka, T. et al. (2005) Nat Immunol 6(12):1253-1262; Choudhuri, K. et al. (2010) FEBS Lett 584(24):4823-4831; Sherman, E. et al. (2011) Immunity 35(5):705-720).
전술된 pMHC 밀도 효과를 이해하기 위해, 본 출원인은 동족 T 세포에 대한 (역치 초과의 pMHC 밀도로) pMHC-코팅된 NP의 결합 기하구조 및 동력학을 조사하였다. TEM 연구는 pMHC-NP가 약 100 내지 150 nm에 걸쳐 있는 여러 NP들의 클러스터(섬)로서 동족 CD8+ 또는 CD4+ T 세포에 결합한다는 것을 보여주었다(도 3a 및 3b). 이 결합 기하구조는 4℃에서 30분 이내에 이미 확인되었고, 그 후 37℃에서 인큐베이션하였을 때 (약 400 nm의 직경/길이까지) 클러스터 성장이 확인되었고, 결합 후 약 3시간에서 시작하는, 세포내 소포 내로의 NP의 내재화로 끝났다(도 3a 및 3b). pMHC-NP가 비-동족 T 세포와 함께 인큐베이션되었을 때 NP의 결합 또는 내재화 중 어느 것도 관찰되지 않았기 때문에, 이 클러스터링된 맞물림은 항원 특이적이었다(도 3c). 이 결과는 클러스터링된 pMHC-NP가 동족 T 세포의 표면에 존재한다는 것을 확인시켜주는 초고해상도 현미경관찰(도 3d) 및 스캐닝 전자 현미경관찰(SEM)(도 4a 및 4b)에 의해 입증되었다.
종합하면, 이 데이터들은 pMHC-NP가 TCR 나노클러스터 결합 및 마이크로클러스터 유발 디바이스로서 작용한다는 것을 암시함으로써, 이 과정이 Treg 세포 전환을 담당하거나 적어도 Treg 세포 전환에 기여할 가능성을 상승시켰다. Treg 전환이 pMHC 밀도의 직접적인 함수이기 때문에, 본 출원인은 pMHC 밀도의 변경이 TCR 마이크로클러스터 형성에 임의의 영향을 미치는지를 조사하였다. 본 출원인은 역치 미만의 밀도, 역치 밀도 및 역치 초과의 밀도로 pMHC를 갖는 BDC2.5mi-IAg7-NP 제제들을 비교하였다. 놀랍게도, 역치 미만의 밀도로 코팅된 NP는 클러스터를 형성하지 않으면서 동족 CD4+ T 세포에 결합하였고 최종적으로 이 T 세포에 의해 내재화되었다(도 3e 및 3g). 대조적으로, 역치 밀도로 코팅된 NP는 클러스터의 형성을 용이하게 유발하였고, 이 클러스터의 크기는 역치 초과의 밀도로 코팅된 NP의 사용 시 증가하였다(도 3a, 3f 및 3g).
상기 데이터는 동족 T 세포에 대한 pMHC 기반 나노의약의 결합 기하구조가 관찰된 pMHC 밀도 효과를 설명한다는 것을 시사한다. NP 표면에서 가깝게 나란히 놓인 pMHC 단량체들은 개별 NP에서 일시적으로 해리된 pMHC 단량체들의 반복된 재맞물림을 용이하게 함으로써, TCR 내재화를 지연시키고 개별 TCR-pMHC 상호작용의 t1/2s를 늘릴 것이다(Zhong, L. et al. (2009) PLoS One 4(6): e5945; Huppa, J.B. et al. (2010) Nature 463(7283):963-967). 그 다음, 생성된 신호전달 사건에 의해 유발된 세포골격 재배열은 큰 TCR 마이크로클러스터로의 근위 pMHC-NP-TCR 유닛의 지속된 조립을 촉진하여(Bunnell, S.C. et al. (2002) J Cell Biol 158(7):1263-1275), TCR 신호전달의 지속시간 및 크기를 더 증폭시킬 것이다(Yokosuka, T. et al. (2005) Nat Immunol 6(12):1253-1262). 높은 pMHC 밀도는 막 클러스터의 개별 NP 내에서 및 개별 NP들 사이에서 입체구조적 변화 및 pMHC-결합된 TCR로부터 그의 결합되지 않은 이웃으로의 관련 다운스트림 신호전달 사건의 협력적 전파(Gil, D. et al. (2002) Cell 109(7):901-912; Minguet, S. et al. (2007) Immunity 26(1):43-54)도 용이하게 할 것이다(Martinez-Martin, N. et al. (2009) Science Signaling 2(83):ra43). 이 해석은 T 세포 활성화의 동력학적 교정(McKeithan, T.W. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92(11):5042-5046) 및 일련의 TCR 맞물림 모델들(Valitutti, S. et al. (1995) Nature 375(6527):148-151) 둘 다와 잘 맞는다.
이 화합물들의 예상되지 않은 pMHC 밀도 및 항원 수용체 클러스터링 의존적 신호전달 성질의 발견은 항원 수용체 발현 리포터 세포주, 예컨대, 본원에 기재된 세포주 또는 유사한 세포주가 효능 및 배치(batch) 방출 어세이에서 사용될 수 있게 한다.
실시예 5 - 루시퍼라제 기반 효능 어세이를 위한 예시적 프로토콜
임의의 소정의 pMHC-나노입자 제제의 효능을 측정하는 데 사용하기 위한 예시적 효능 어세이가 본 실시예에 상세히 기재된다. 이 경우, 세포는 NFAT 프로모터의 조절 하에서 루시퍼라제 유전자를 포함한다. JurMA 세포가 인간 세포주이고 이 실시예에서 어세이된 pMHC의 MHC 성분이 마우스 I-Ag7이기 때문에 뮤린 CD4가 발현된다. (JurMA 세포가 인간 CD4의 내인성 발현을 나타내기 때문에) JurMA 세포주가 인간 MHC뿐만 아니라 마우스 MHC와도 함께 작동한다는 것이 예상되고 후속 실시예에서 확인된다.
1. 1) 20 ng/㎖ PMA(Sigma-Aldrich, 카탈로그 # P8139) 플러스 0.5 μM 이오노마이신(Sigma-Aldrich, 카탈로그 # I3909-1ML), 10 ㎍/㎖의 항-hCD3ε mAb(OKT3, BD Biosciences)(양성 대조군); 2) 10개 내지 48개 pMHC/NP의 다양한 결합가를 갖는 12.5 또는 5.0 ㎍/㎖의 pMHC-코팅된 PF-M NP; 또는 3) 시스테인으로 코팅된 NP(pMHC-NP와 동등한 철 농도를 갖는 음성 대조군)의 존재 하에서 10% 태아 소 혈청(FBS)(Sigma-Aldrich, 카탈로그 # F6178)으로 보충된 200 ㎕의 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)(Sigma-Aldrich, 카탈로그 # D6429-500ML) 중의 500,000개의 BDC2.5/mCD4+ JurMA 세포를 96웰 플레이트에 (삼중으로) 첨가한다. 9% CO2를 공급하면서 37℃에서 CO2 인큐베이터 내에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다. 대조군으로서 야생형 JurMA 세포를 사용하여 이 설정을 반복한다.
2. 다음 날, 세포를 5분 동안 1200 rpm에서 원심분리하고 배지를 제거한다. 그 후, 200 ㎕의 PBS를 첨가하고 세포를 3회 세척한다.
3. 세포 펠렛을 100 ㎕의 용해 완충제 1x(세포 배양 용해 시약, Promega, 카탈로그 # E1531)에 재현탁하고 약하게 진탕하면서 30분 동안 인큐베이션한다.
4. 20 ㎕의 용해물을 수거하여 불투명한 백색 96웰 플레이트(Greiner Bio-one 참조 # 655075)로 옮긴다.
5. 웰당 100 ㎕의 루시퍼라제 어세이 시약(Promega, 카탈로그 # E1500)을 첨가한 후, Veritas™ 마이크로플레이트 루미노미터를 이용하여 즉시 판독한다(이 기계의 인젝터는 웰당 100 ㎕의 루시퍼라제 어세이 시약을 자동적으로 첨가한다. 주사 후 판독 과정의 반복을 위해 상기 플레이트는 다음 웰로 전진한다). 생성된 광을 10초(적분 시간) 동안 측정한다. 지연 시간은 2초이다.
이 방법은 하기 실시예에서 제시된 바와 같이 많은 상이한 유형의 나노입자 조성물들의 효능 및 활성에 대한 어세이에 일반적으로 적용될 수 있다.
실시예 6 - 어세이간 가변성의 측정
어세이간 가변성을 측정하기 위해, 본 출원인은 동일한 특이성을 갖는 pMHC-NP(즉, 코어에 부착된 동일한 pMHC 복합체)를 제조하였고 SD50(반로그 도표에서 측정될 때 절반 최대 활성을 제공하는 농도)에 대해 어세이하였다. 이 실험은 I-Ag7(BDC 2.5mi)에 결합된 GAD524-543에 특이적인 재조합 TCR 및 재조합 마우스 CD4로 형질감염된 JurMA 세포를 사용하였다. 결과는 도 5에 요약되어 있고 7회 실험으로 수득한 본 데이터가 8.91 플러스/마이너스 1 마이크로그램/㎖(평균 플러스/마이너스 평균의 표준 편차)라는 것을 보여준다. 리포터가 사실상 TCR 근위 신호전달 사건이 아니고 당분야에서 숙련된 자가 제시된 가변성보다 더 많은 어세이 대 어세이 가변성을 예상할 것이기 때문에 본 출원인의 어세이에 의해 시험되고 관찰된 재현성은 예상외의 결과이다. 그러나, 이 데이터 계산은 엄격한 반응을 보여주고 이러한 정량적 어세이가 통상적이되 덜 정량적이거나 반정량적인 어세이(예를 들면, TCR 신호전달 리포터의 업스트림에서 신호전달 중간체의 인산화의 강도의 측정)보다 훨씬 더 바람직하다는 것을 확립한다. 낮은 실험간 가변성 및 생물학적 활성을 책임지는 pMHC 밀도 역치의 충실한 재현과 커플링된 정량이라는 장점은 본 개시의 조성물 및 품질의 뛰어난 고도 민감한 배치 대 배치 비교를 제공할 수 있다.
실시예 7 - 나바심(Navacim) 시험관내 T 세포 자극 기능에 대한 항-나바심 항체의 잠재적 효과를 평가하기 위한 세포 기반 효능 어세이
생체내 전달 후, 면역능력 숙주가 pMHC-NP의 다양한 성분들에 대한 체액성 반응을 생성할 잠재력이 존재한다. pMHC-NP는 그의 표면에 코팅된 pMHC 단량체 내에 존재하는 단백질 정제 태그, 예컨대, 6xHis 태그뿐만 아니라, pMHC-NP의 구조적 성분인 PEG도 포함한다. 본 실시예는 pMHC-NP의 다양한 성분들(pMHC, PEG, His 태그)에 대해 유도된 항체가 T 세포와 맞물리고 T 세포에서 TCR 신호전달을 유도하는 pMHC-NP의 능력에 대한 인지가능한 효과를 갖는지를 판단한다. 앞의 결과는 항-PEG(AGP4) 및 항-His(6G2A9) 항체와 입자의 결합을 차단하는, pMHC-NP에의 인간 혈청 노출의 능력을 입증하였다. 따라서, 이 어세이는 항-His, 항-PEG 또는 항-MHC 단일클론 항체, 또는 토끼 과면역 혈청에 노출된 후 동족 JurMA T 세포를 자극하는, 인간 혈청에 사전노출된 입자 및 노출되지 않은 입자 둘 다의 능력을 시험할 것이다.
시약 및 실험 설계
항-pMHC mAb
Figure pct00014
정제된 항-마우스/래트 MHC 클래스 II RT1B mAb(클론 OX-6)(PBS 중의 1 mg/㎖, Bio-Rad 카탈로그 # MCA46R)
Figure pct00015
정제된 항-PEG mAb(클론 AGP4)(PBS 중의 1.4 mg/㎖, 항-PEG, 카탈로그 # AGP4-PABM-A)
Figure pct00016
정제된 항-His 태그 mAb(클론 6G2A9)(PBS 중의 0.5 mg/㎖, Genscript, 카탈로그 # A00186)
Figure pct00017
정제된 마우스 IgG(클론 MOPC21)(PBS 중의 0.5 mg/㎖, BD Biosciences 카탈로그 # 554121)
혈청
Figure pct00018
항-PEG 과면역 토끼 혈청
Figure pct00019
항-BDC2.5mi pMHC 과면역 토끼 혈청
Figure pct00020
면역 전 토끼 혈청
Figure pct00021
인간 혈청(Sigma, 카탈로그 # H4522)
pMHC-NP
Figure pct00022
BDC2.5mi-PFM-112017(Fe: 2.15 mg/㎖, pMHC: 0.97 mg/㎖, 결합가 42 pMHC/NP)
Figure pct00023
시스테인-PFM-111417(Fe: 1.52 mg/㎖)
루시퍼라제 검출 방법:
Figure pct00024
세포 배양 용해 완충제를 갖는 프로메가 반딧불이 루시퍼라제 어세이 키트(Promega 카탈로그 # E1500)
Figure pct00025
시약 인젝터를 갖는 스펙트라맥스(Spectramax) i3x 플레이트 판독 루미노미터
실시예 5(루시퍼라제 기반 효능 어세이를 위한 예시적 프로토콜)를 따라 효능 어세이를 수행하였다.
결과
인간 혈청 사전노출이 있거나 없었을 때, 예상된 바와 같이, mAb 또는 항혈청에 대해 유도된 항-MHC-II(항-BDC2.5mi/IAg7)는 시험관내 효능 어세이에서 나바심 활성을 역가 의존적 방식으로 현저히 억제할 수 있었다. 이 처리는 어세이의 검증을 돕기 위한 양성 억제 대조군으로서 포함되었다.
도 6a 내지 6d에 나타낸 바와 같이, 인간 혈청 사전노출이 있거나 없었을 때, 음성 대조군(마우스 IgG 또는 토끼 면역 전 혈청)에 비해 항-His 태그, 항-PEG mAb 또는 토끼 항-PEG 과면역 혈청의 사용 시 pMHC-NP 활성의 억제는 관찰되지 않았다. 인간 혈청 사전노출의 부재 하에서, 항-PEG mAb는 pMHC-NP T 림프구 자극에 대한 강한 증강 효과를 실제로 보였다(이것은 항-PEG 과면역 혈청의 사용 시 확인되지 않기 때문에 아마도 pMHC-NP 복합체의 오량체 구조에 의한 가교결합에 기인할 것이다). 이 효과는 인간 혈청에의 나바심의 사전노출에 의해 차단되었는데, 이 결과는 혈청 노출이 항-PEG 항체 결합을 차단하였다는 본 발명자들의 종래 발견과 일치하였다. 따라서, 인간 혈청에의 나바심의 노출은 JurMA 어세이에서 그의 효능을 감소시키지 않는다.
실시예 8 - IGRP 13-25 /DR3 pMHC 이종이량체는 동족 TCR을 발현하는 조작된 세포주에 결합한다 .
T 세포 수용체에 결합하는 시스테인-트랩 지퍼 부재 놉-인-홀 IGRP13-25 pMHC-DR3 이종이량체의 능력을 시험하였다. 이를 위해, IGRP13-25 pMHC-DR3에 특이적인 인간 T 세포 수용체로부터의 알파 및 베타 쇄를 발현하는 리포터 세포주를 사용하였다.
IGRP-TCR을 코딩하는 레트로바이러스를 사용한 JURMA-hCD4 세포주의 형질도입 프로토콜
GP+EnvAM12 팩키징 세포주의 생성. 본 발명자들은 IGRP-TCR 및 GFP 리포터를 발현하는 레트로바이러스를 gag/pol 및 VSV 팩키징 구축물과 함께 사용하여 293T 세포를 형질감염시켰다. 3일 후, VSV-슈도타이핑된 농축된 상청액을 수거하고 분취하고 냉동시켰다. 3개의 분취물을 사용하여, 스핀 감염(2700 rpm, 1시간)으로 양쪽성 팩키징 세포주 GP+envAm12(ATCC CRL-9641)를 형질도입하였다. 5회 스핀 감염 후, 필요한 경우 형질도입된 GP+envAm12를 GFP의 발현에 대해 분류하였다.
IGRP-TCR을 코딩하는 레트로바이러스를 사용한 JURMA-hCD4 세포주의 형질도입
형질도입되고 분류된 GP+envAm12를 3 ㎖의 최종 부피로 6웰 플레이트에 웰당 3백만 개의 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 8 ㎍/㎖의 폴리브렌으로 보충된 3 ㎖의 최종 부피로 100,000개의 JURMA-hCD4를 미리 플레이팅된 형질도입된 GP+envAm12와 공배양하였다. 배지를 2일 또는 3일마다 교체하면서 2주 동안 이 공배양을 유지하였다. 공배양 후, JURMA-hCD4 세포를 수거하고 유세포분석으로 분석하고 높은 형질전이유전자 발현에 대해 분류하였다. 그 다음, 세포를 PE로 표지부착된 이종이량체로 염색하였다. 도 7a는 음성 대조군으로서 염색되지 않은 세포를 보여주고, 도 7d는 관련 없는 사량체로 염색된 세포를 보여주고, 도 7b는 시스테인-트랩 및 류신 지퍼 기술을 이용함으로써 발현된 이종이량체로부터 만들어진 사량체를 사용한 염색을 보여주고, 도 7c는 류신 지퍼 없이 시스테인-트랩 및 놉-인-홀 기술을 이용함으로써 발현된 이종이량체로부터 만들어진 사량체를 보여준다. 이들 중 어느 한 기술을 이용함으로써 만들어진 이종이량체들 사이의 염색은 강력하였다. 이 데이터들은 지퍼 부재 시스테인-트랩 놉-인-홀 기술을 이용함으로써 만들어진 이종이량체가 T 세포 수용체에 결합할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 9 - IGRP 13-25 /DR3 놉-인-홀 pMHC 이종이량체는 시험관내에서 리포터 세포주를 자극한다 .
NFAT 프로모터의 조절 하에서 인간 IGRP13-25 TCR 및 루시퍼라제를 발현하는 JurMA 세포를 사용하여, 시스테인-트랩 놉-인-홀 안정화된 이종이량체가 산화철 나노입자에 부착되었을 때 T 세포 신호전달을 자극하는 능력을 시험하였다. 도 8a 및 도 8b에 제시된 이 결과는 시스테인-트랩 놉-인-홀 안정화된 이종이량체가 산화철 나노입자에 부착되었을 때 T 세포 신호전달을 유도할 수 있다는 것을 시사한다.
본 개시가 일부 실시양태 및 임의적 특징에 의해 구체적으로 개시되어 있지만, 본원에 구현되고 개시된 본 개시의 변형, 개선 및 변경은 당분야에서 숙련된 자에 의존할 수 있고 이러한 변형, 개선 및 변경이 본 개시의 범위 내에 있는 것으로 간주된다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 제공된 물질, 방법 및 예는 일부 실시양태를 대표하고, 예시하기 위한 것이고, 본 개시의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
본 개시는 본원에 넓게 포괄적으로 기재되어 있다. 포괄적인 본 개시 내에 속하는 각각의 더 좁은 종 및 아속 군들도 본 개시의 일부를 형성한다. 이것은 제거된 물질이 본원에 구체적으로 언급되어 있든 아니면 언급되어 있지 않던 관계없이 임의의 보호대상을 속으로부터 제거한다는 단서 또는 부정적 한정과 함께 본 개시의 포괄적인 설명을 포함한다.
추가로, 본 개시의 특징 또는 양태가 마쿠시 군의 관점으로 기재된 경우, 당분야에서 숙련된 자는 본 개시가 마쿠시 군의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위군의 관점으로도 기재된다는 것을 인식할 것이다.
본 개시가 대안들 중 하나만 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 뒷받침할지라도, 대안들 중 하나만을 지칭하도록 명시적으로 표시되어 있거나 대안들이 상호배타적이지 않은 한, 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 "및/또는"을 의미하기 위해 사용된다.
본 명세서 및 청구범위에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는"(및 임의의 형태의 포함하는, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하고"), "가진"(및 임의의 형태의 가진, 예컨대, "가진다" 및 "갖고"), "포괄하는"(및 임의의 형태의 포괄하는, 예컨대, "포괄한다" 및 "포괄하고") 또는 "함유하는"(및 임의의 형태의 함유하는, 예컨대, "함유한다" 및 "함유하고")은 포괄적이거나 한정되지 않고 언급되지 않은 추가 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
본 개시 전체에서, 다양한 공개문헌들, 특허들 및 공개된 특허 명세서들은 확인 인용에 의해 참조된다. 본원에서 언급된 모든 공개문헌들, 특허출원들, 특허들 및 다른 참조문헌들은 각각이 개별적으로 참고로 도입되는 것처럼 동일한 정도로 전체로서 명백히 참고로 도입된다. 모순이 있는 경우, 정의를 포함하는 본 명세서가 우선할 것이다.
예시적 서열목록
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SEQUENCE LISTING <110> UTI LIMITED PARTNERSHIP <120> ASSAY TO MEASURE THE POTENCY OF RECEPTOR-LIGAND INTERACTIONS IN NANOMEDICINES <130> 42363-712.601 <140> PCT/IB2018/000510 <141> 2018-04-05 <150> 62/483,298 <151> 2017-04-07 <160> 559 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Gly Phe Pro Gly Pro Arg Gly Pro Pro Gly Pro Gln Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Pro Ala Gly Phe Ala Gly Pro Pro Gly Ala Asp Gly Gln Pro Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ile Ala Gly Phe Lys Gly Asp Gln Gly Pro Lys Gly Glu Thr 1 5 10 15 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Asn Ile Asp Leu Leu Trp Ser Val 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Leu Phe Gly Leu Gly Phe Ala Ile 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Val Tyr Leu Lys Thr Asn Leu Phe 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Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln 1 5 10 15 Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 465 <211> 26 <212> PRT <213> Ljungan virus <400> 465 Met His Asn Asp Glu Met Asp Tyr Ser Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln 1 5 10 15 Cys Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 466 <211> 26 <212> PRT <213> Ljungan virus <400> 466 Met His Ser Asp Glu Met Asp Phe Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln 1 5 10 15 Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 467 <211> 26 <212> PRT <213> Ljungan virus <400> 467 Tyr His Asp Lys Asp Met Asp Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln 1 5 10 15 Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 468 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 468 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 469 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 469 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 470 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 470 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 471 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 471 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Met Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 472 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 472 Leu Thr Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 473 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 473 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 474 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 474 Leu Leu Ser Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 475 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 475 Met Cys Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 476 <211> 19 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 476 Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 477 <211> 19 <212> PRT <213> Equine rhinitis A virus <400> 477 Cys Thr Asn Tyr Ser Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 478 <211> 20 <212> PRT <213> Equine rhinitis B virus <400> 478 Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Leu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 479 <211> 20 <212> PRT <213> Human endogenous retrovirus <400> 479 Gly Ala Thr Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 480 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus 1 <400> 480 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 481 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus 2 <400> 481 Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 482 <211> 22 <212> PRT <213> Porcine teschovirus 3 <400> 482 Gly Pro Gly Ala Ser Ser Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala 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<210> 507 <211> 19 <212> PRT <213> Providence virus <400> 507 Gly Asp Pro Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Gly Asp Ile Glu Lys Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 508 <211> 20 <212> PRT <213> Bovine rotavirus <400> 508 Ser Lys Phe Gln Ile Asp Arg Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 509 <211> 20 <212> PRT <213> Porcine rotavirus <400> 509 Ala Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Val Glu Leu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 510 <211> 20 <212> PRT <213> Human rotavirus <400> 510 Ser Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile Glu Leu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 511 <211> 20 <212> PRT <213> Bombyx mori <400> 511 Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Ile Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 512 <211> 20 <212> PRT <213> Lymantria dispar <400> 512 Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 513 <211> 20 <212> PRT <213> Dendrolimus punctatus <400> 513 Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 514 <211> 20 <212> PRT <213> Trypanosoma brucei <400> 514 Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Val Ser Gly Asp Val Glu Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 515 <211> 20 <212> PRT <213> Trypanosoma brucei <400> 515 Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 516 <211> 20 <212> PRT <213> Trypanosoma brucei <400> 516 Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 517 <211> 20 <212> PRT <213> Trypanosoma brucei <400> 517 Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Ile Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 518 <211> 20 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <400> 518 Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile Glu Gln 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 519 <211> 21 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Any amino acid <400> 519 Tyr Ile Pro Asp Phe Gly Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro Xaa 20 <210> 520 <211> 21 <212> PRT <213> Bordetella bronchiseptica <400> 520 Val His Cys Ala Gly Arg Gly Gly Pro Val Arg Leu Leu Asp Lys Glu 1 5 10 15 Gly Asn Pro Gly Pro 20 <210> 521 <211> 21 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Any amino acid <400> 521 Asp Leu Glu Leu Glu Thr Val Gly Ser His Gln Ala Asp Ala Glu Thr 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro Xaa 20 <210> 522 <211> 21 <212> PRT <213> Drosophila melanogaster <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Any amino acid <400> 522 Thr Ala Ala Asp Lys Ile Gln Gly Ser Trp Lys Met Asp Thr Glu Gly 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro Xaa 20 <210> 523 <211> 20 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 523 Pro Ile Thr Asn Arg Pro Arg Asn Ser Gly Leu Ile Asp Thr Glu Ile 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 524 <211> 583 <212> DNA <213> Encephalomyocarditis virus <400> 524 cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60 tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120 gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180 aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240 aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300 ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360 cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420 ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta 480 cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540 ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cac 583 <210> 525 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 525 ctgggcggtc aacaagtgcg ggcctggctc agcgcggggg ggcgcggaga ccgcgaggcg 60 accgggagcg gctgggttcc cggctgcgcg cccttcggcc aggccgggag ccgcgccagt 120 cggagccccc ggcccagcgt ggtccgcctc cctctgggcg tccacctgcc cggagtactg 180 ccagcgggca tgaccgaccc accaggggcg ccgccgccgg cgctcgcagg ccgcggatga 240 agaagaaaac ccggcgccgc tcgacccgga gcgaggagtt gacccggagc gaggagttga 300 ccctgagtga ggaagcgacc tggagtgaag aggcgaccca gagtgaggag gcgacccagg 360 gcgaag 366 <210> 526 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 526 aaaagaagga aaaagaagga aaagaaggaa aaagaaggct gcaggcggct gcagaaaaga 60 aggaaaaaga aggaaaagaa ggaaaaagaa gg 92 <210> 527 <211> 611 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 527 Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro 1 5 10 15 Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln 20 25 30 Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn 35 40 45 Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys 50 55 60 Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys 65 70 75 80 Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala 85 90 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Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 548 atgcattcct tacatgtttc actagtgttc ctctggcttc aactaggtgg ggtgagcagc 60 caggagaagg tacagcagag cccagaatct ctcacagtcc cagagggagc catggcctcc 120 ctcaactgca ctatcagcga cagtgcttct cagtccatct ggtggtacca acagaatcct 180 gggaaaggcc ccaaagcact aatatccata ttctctaatg gcaacaagaa agaaggcaga 240 ttgacagttt acctcaatag agccagcctg catgtttccc tgcacatcag agactcccat 300 cccagtgact ccgccgtcta cctctgtgca gcgagccttg cgggcagctg gcaactcatc 360 tttggatctg gaacccaact gacagttatg cctgacatcc agaacccaga acctgctgtg 420 taccagttaa aagatcctcg gtctcaggac agcaccctct gcctgttcac cgactttgac 480 tcccaaatca atgtgccgaa aaccatggaa tctggaacgt tcatcactga caaaactgtg 540 ctggacatga aagctatgga ttccaagagc aatggggcca ttgcctggag caaccagaca 600 agcttcacct gccaagatat cttcaaagag accaacgcca cctaccccag ttcagacgtt 660 ccctgtgatg ccacgttgac cgagaaaagc tttgaaacag atatgaacct aaactttcaa 720 aacctgtcag ttatgggact ccgaatcctc ctgctgaaag tagccggatt taacctgctc 780 atgacgctga ggctgtggtc cagtgccacg aacttctctc 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tctaaaacgg 720 attaccaggg atttcagtcg atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct cccggtttta 780 atgaatacga ttttgtacca gagtcctttg atcgtgacaa aacaattgca ctgataatga 840 actcctctgg atctactggg ttacctaagg gtgtggccct tccgcataga actgcctgcg 900 tcagattctc gcatgccaga gatcctattt ttggcaatca aatcattccg gatactgcga 960 ttttaagtgt tgttccattc catcacggtt ttggaatgtt tactacactc ggatatttga 1020 tatgtggatt tcgagtcgtc ttaatgtata gatttgaaga agagctgttt ttacgatccc 1080 ttcaggatta caaaattcaa agtgcgttgc tagtaccaac cctattttca ttcttcgcca 1140 aaagcactct gattgacaaa tacgatttat ctaatttaca cgaaattgct tctgggggcg 1200 cacctctttc gaaagaagtc ggggaagcgg ttgcaaaacg cttccatctt ccagggatac 1260 gacaaggata tgggctcact gagactacat cagctattct gattacaccc gagggggatg 1320 ataaaccggg cgcggtcggt aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt gtggatctgg 1380 ataccgggaa aacgctgggc gttaatcaga gaggcgaatt atgtgtcaga ggacctatga 1440 ttatgtccgg ttatgtaaac aatccggaag cgaccaacgc cttgattgac aaggatggat 1500 ggctacattc tggagacata gcttactggg acgaagacga acacttcttc atagttgacc 1560 gcttgaagtc tttaattaaa tacaaaggat accaggtggc ccccgctgaa ttggagtcga 1620 tattgttaca acaccccaac atcttcgacg cgggcgtggc aggtcttccc gacgatgacg 1680 ccggtgaact tcccgccgcc gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg acggaaaaag 1740 agatcgtgga ttacgtcgcc agtcaagtaa caaccgcgaa aaagttgcgc ggaggagttg 1800 tgtttgtgga cgaagtaccg aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga aaaatcagag 1860 agatcctcat aaaggccaag aagggcggaa agtccaaatt gtaa 1904 <210> 557 <211> 876 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 557 ctgggagcaa acaccgtgga tggtggaatc actcagtccc caaagtacct gttcagaaag 60 gaaggacaga atgtgaccct gagttgtgaa cagaatttga accacgatgc catgtactgg 120 taccgacagg acccagggca agggctgaga ttgatctact actcacagat agtaaatgac 180 tttcagaaag gagatatagc tgaagggtac agcgtctctc gggagaagaa ggaatccttt 240 cctctcactg tgacatcggc ccaaaagaac ccgacagctt tctatctctg tgccagtggg 300 ggacgggtct atcagcccca gcattttggt gatgggactc gactctccat cctagaggat 360 ctgagaaatg tgactccacc caaggtctcc ttgtttgagc catcaaaagc agagattgca 420 aacaaacaaa aggctaccct cgtgtgcttg gccaggggct tcttccctga ccacgtggag 480 ctgagctggt gggtgaatgg caaggaggtc cacagtgggg tcagcacgga ccctcaggcc 540 tacaaggaga gcaattatag ctactgcctg agcagccgcc tgagggtctc tgctaccttc 600 tggcacaatc ctcgcaacca cttccgctgc caagtgcagt tccatgggct ttcagaggag 660 gacaagtggc cagagggctc acccaaacct gtcacacaga acatcagtgc agaggcctgg 720 ggccgagcag actgtgggat tacctcagca tcctatcaac aaggggtctt gtctgccacc 780 atcctctatg agatcctgct agggaaagcc accctgtatg ctgtgcttgt cagtacactg 840 gtggtgatgg ctatggtcaa aagaaagaat tcatga 876 <210> 558 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (1)..(1) <223> Val or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Any amino acid <400> 558 Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro 1 5 <210> 559 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic 6xHis tag <400> 559 His His His His His His 1 5

Claims (62)

  1. a) i. T 세포 수용체(TCR) 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 포함하는 재조합 TCR, 및
    ii. T 세포 수용체 경로 의존적 리포터
    를 포함하는 적어도 하나의 세포로서, 상기 재조합 TCR이 주조직적합성(MHC) 분자에 결합된 질환 관련 항원에 특이적인 것인 적어도 하나의 세포; 및
    b) 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원을 포함하는 나노의약
    을 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터가 능동적으로 전사되는 것인 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원이 10:1 이상의 비로 나노입자에 커플링되는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 나노입자가 약 1 나노미터 내지 약 100 나노미터의 직경을 갖는 것인 조성물.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 나노입자가 금속 코어를 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 관련 항원이 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원인 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원이 I형 진성 당뇨병 항원, 천식 또는 알레르기성 천식 항원, 다발성 경화증 항원, 말초 신경병증 항원, 원발성 담즙성 간경변증 항원, 시신경척수염 스펙트럼 장애 항원, 강직 인간 증후군 항원, 자가면역 뇌염 항원, 심상성 천포창 항원, 낙엽상 천포창 항원, 건선 항원, 쇼그렌병/증후군 항원, 염증성 장 질환 항원, 관절염 또는 류마티스성 관절염 항원, 전신 홍반성 루푸스 항원, 피부경화증 항원, ANCA 관련 혈관염 항원, 굿파스처(Goodpasture) 증후군 항원, 가와사키병 항원, 셀리악(celiac)병, 자가면역 심근병증 항원, 중증 근무력증 항원, 자가면역 포도막염 항원, 그레이브스병 항원, 항-인지질 증후군 항원, 자가면역 간염 항원, 경화성 담관염 항원, 원발성 경화성 담관염 항원, 만성 폐쇄성 폐 질환 항원, 또는 포도막염 관련 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터가 루시퍼라제 유전자, 베타 락타마제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자, 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 유전자, 형광 단백질 유전자, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 전사를 활성화시키는 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터가 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 세포가 JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM 또는 Molt-4로부터 선택되는 것인 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 관련 항원이 서열번호 1 내지 352 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합인 조성물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 관련 항원이 서열번호 353 내지 455 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합인 조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 단일 폴리펩타이드로서 번역되는 것인 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 단일 폴리펩타이드의 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄가 리보좀 스킵핑(skipping) 서열에 의해 분리되는 것인 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 리보좀 스킵핑 서열이 서열번호 456 내지 523 중 어느 하나에 기재된 것인 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 단일 폴리펩타이드가 서열번호 527, 533 또는 538 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 별개의 폴리펩타이드로서 번역되는 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄가 서열번호 528, 530, 534, 536, 539 또는 541 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, TCR 베타 쇄가 서열번호 529, 531, 535, 537, 540 또는 542 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 세포의 표면에서 발현되는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것인 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드가 IRES 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  22. 제21항에 있어서, IRES 핵산 서열이 서열번호 524 내지 526 중 어느 하나에 기재된 것인 조성물.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 532 또는 557 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 상동성인 핵산 서열을 포함하는 것인 조성물.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 나노의약의 효능 또는 활성을 측정하는 데 있어서 시험관내에서 사용하기 위한 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 나노의약이 인간 개체에서 사용하기 위한 것인 용도.
  26. 주조직적합성 분자에 결합된 질환 관련 항원에 특이적인 재조합 T 세포 수용체(TCR) 및 T 세포 수용체 경로 의존적 리포터를 포함하는 세포.
  27. 제26항에 있어서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터가 능동적으로 전사되는 것인 세포.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 질환 관련 항원이 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원인 세포.
  29. 제28항에 있어서, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원이 I형 진성 당뇨병 항원, 천식 또는 알레르기성 천식 항원, 다발성 경화증 항원, 말초 신경병증 항원, 원발성 담즙성 간경변증 항원, 시신경척수염 스펙트럼 장애 항원, 강직 인간 증후군 항원, 자가면역 뇌염 항원, 심상성 천포창 항원, 낙엽상 천포창 항원, 건선 항원, 쇼그렌병/증후군 항원, 염증성 장 질환 항원, 관절염 또는 류마티스성 관절염 항원, 전신 홍반성 루푸스 항원, 피부경화증 항원, ANCA 관련 혈관염 항원, 굿파스처 증후군 항원, 가와사키병 항원, 셀리악병, 자가면역 심근병증 항원, 중증 근무력증 항원, 자가면역 포도막염 항원, 그레이브스병 항원, 항-인지질 증후군 항원, 자가면역 간염 항원, 경화성 담관염 항원, 원발성 경화성 담관염 항원, 만성 폐쇄성 폐 질환 항원, 또는 포도막염 관련 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 것인 세포.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터가 루시퍼라제 유전자, 베타 락타마제 유전자, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자, 분비형 배아 알칼리성 포스파타제(SEAP) 유전자, 형광 단백질 유전자, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자의 전사를 활성화시키는 것인 세포.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터가 활성화된 T 세포의 핵 인자(NFAT) 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, NF-κB 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, AP1 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, IL-2 전사 인자 결합 DNA 서열 또는 프로모터, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 세포.
  32. 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM 또는 Molt-4로부터 선택되는 세포.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 관련 항원이 서열번호 1 내지 352 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합인 세포.
  34. 제26항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 관련 항원이 서열번호 353 내지 455 중 어느 하나로 구성된 폴리펩타이드 및 이들의 조합인 세포.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 단일 폴리펩타이드로서 번역되는 것인 세포.
  36. 제35항에 있어서, 단일 폴리펩타이드의 TCR 알파 쇄와 TCR 베타 쇄가 리보좀 스킵핑 서열에 의해 분리되는 것인 세포.
  37. 제36항에 있어서, 리보좀 스킵핑 서열이 서열번호 456 내지 523 중 어느 하나에 기재된 것인 세포.
  38. 제35항에 있어서, 단일 폴리펩타이드가 서열번호 527, 533 또는 538 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
  39. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 별개의 폴리펩타이드로서 번역되는 것인 세포.
  40. 제26항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄가 서열번호 528, 530, 534, 536, 539 또는 541 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, TCR 베타 쇄가 서열번호 529, 531, 535, 537, 540 또는 542 중 어느 하나와 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
  41. 제26항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄가 세포의 표면에서 발현되는 것인 세포.
  42. 제26항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, TCR 알파 쇄 및 TCR 베타 쇄를 코딩하는 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 세포.
  43. 제42항에 있어서, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드가 IRES 핵산 서열을 포함하는 것인 세포.
  44. 제43항에 있어서, IRES 핵산 서열이 서열번호 524 내지 526 중 어느 하나에 기재된 것인 세포.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 외인성 폴리뉴클레오타이드가 서열번호 532 또는 557 중 어느 하나에 기재된 핵산 서열과 적어도 80%, 90%, 95% 또는 100% 상동성인 핵산 서열을 포함하는 것인 세포.
  46. 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항의 세포의 집단.
  47. 제26항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 나노의약의 효능 또는 활성을 측정하는 데 있어서 시험관내에서 사용하기 위한 세포 또는 세포의 집단.
  48. 제47항에 있어서, 나노의약이 인간 개체에서 사용하기 위한 것인 용도.
  49. 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 질환 관련 항원을 포함하는 나노의약의 아고니스트 활성을 측정하는 시험관내 방법으로서,
    a) 나노의약을 제26항 내지 제45항 중 어느 한 항의 세포 또는 제46항의 세포의 집단과 접촉시키는 단계; 및
    b) T 세포 수용체 경로 의존적 리포터에 의해 생성된 신호를 검출하는 단계
    를 포함하는 시험관내 방법.
  50. 제49항에 있어서, 나노의약이 복수의 나노입자들을 포함하는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 복수의 나노입자들이 나노입자에 커플링된 MHC 분자에 결합된 복수의 질환 관련 항원들을 포함하는 복수의 나노입자들을 포함하는 것인 방법.
  52. 제51항에 있어서, 질환 관련 항원이 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 자가면역 또는 염증성 질환 관련 항원이 I형 진성 당뇨병 항원, 천식 또는 알레르기성 천식 항원, 다발성 경화증 항원, 말초 신경병증 항원, 원발성 담즙성 간경변증 항원, 시신경척수염 스펙트럼 장애 항원, 강직 인간 증후군 항원, 자가면역 뇌염 항원, 심상성 천포창 항원, 낙엽상 천포창 항원, 건선 항원, 쇼그렌병/증후군 항원, 염증성 장 질환 항원, 관절염 또는 류마티스성 관절염 항원, 전신 홍반성 루푸스 항원, 피부경화증 항원, ANCA 관련 혈관염 항원, 굿파스처 증후군 항원, 가와사키병 항원, 셀리악병, 자가면역 심근병증 항원, 중증 근무력증 항원, 자가면역 포도막염 항원, 그레이브스병 항원, 항-인지질 증후군 항원, 자가면역 간염 항원, 경화성 담관염 항원, 원발성 경화성 담관염 항원, 만성 폐쇄성 폐 질환 항원, 또는 포도막염 관련 항원, 및 이들의 조합으로 구성된 목록으로부터 선택되는 것인 방법.
  54. 제49항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 나노입자들이 1 나노미터 내지 약 100 나노미터의 직경을 갖는 복수의 나노입자들을 포함하는 것인 방법.
  55. 제49항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 수용체 경로 의존적 리포터 신호를 정량하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 정량이 최대 반응의 약 50%인 반응을 개시하는 나노의약의 농도를 결정하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 최대 반응은, 복수의 농도의 나노의약을 세포 또는 세포의 집단과 접촉시킬 때 세포 또는 세포의 집단과 접촉된 나노의약의 최고 농도에서 개시된 반응인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 복수의 농도의 나노의약을 동일한 어세이에서 세포 또는 세포의 집단과 접촉시키는 것인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 정량이 음성 대조군의 적어도 약 200%인 반응을 개시하는 나노의약의 농도를 측정하는 것을 포함하고, 여기서, 상기 음성 대조군은, 세포 또는 세포의 집단의 재조합 T 세포 수용체(TCR)와 특이적으로 상호작용하지 않는 나노의약을 포함하는 것인 방법.
  59. 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 신호가 효소에 의해 생성되는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 효소가 루시퍼라제 또는 퍼옥시다제인 방법.
  61. 제49항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 신호가 형광 신호인 방법.
  62. 제49항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 제조 공정에서 품질 관리 단계로서 이용되는 방법.
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