BR112019021022A2 - ensaio para medir a potência de interações receptor-ligante em nanomedicamentos - Google Patents

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Abstract

é descrita nesse relatório descritivo uma célula isolada que compreende um receptor de célula t recombinante (tcr) e um repórter dependente da via de tcr, em que o receptor de célula t recombinante é específico para um antígeno relevante para doenças ligado a uma molécula de mhc. também são descritos métodos de uso para a célula isolada como um ensaio para determinar a função ou potência de um complexo de peptídeo-histocompatibilidade principal (pmhc) acoplado a uma nanopartícula (pmhc-np) que pode ser usado como um medicamento para o tratamento de uma doença autoimune ou câncer.

Description

ENSAIO PARA MEDIR A POTÊNCIA DE INTERAÇÕES RECEPTOR—LIGANTE EM NANOMEDICAMENTOS
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Esse pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido U.S. Provisório N° de Série 62/483.298, depositado em 7 de abril de 2017, que é incorporado por referência nesse relatório descritivo em sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[002] Doenças autoimunes como, por exemplo, diabetes tipo 1 (T1D), esclerose múltipla e artrite reumatóide, resultam de respostas autoimunes crônicas que envolvem células T e células B que reconhecem numerosos epítopos antigênicos em listas incompletamente definidas de autoantígenos (Santamaria, P. (2010) Immunity 32: 437-445; Babbe, H. e cols. (2000) J. Exp. Med. 192: 393-404; Firestein, G.S. (2003) Nature 423: 356-361). A eliminação ou supressão de todas as especificidades de células T autorreativas policlonais (conhecidas e desconhecidas) em cada distúrbio autoimune individual sem comprometimento da imunidade sistêmica não é possível atualmente.
[003] Foi descoberto recentemente que nanopartículas acopladas com moléculas de antígeno-complexo de histocompatibilidade principal (pMHC) podem desencadear a reprogramação e expansão de células T reguladoras tipo 1 (TR1) in vivo. Veja o Pedido PCT N° PCT/IB2016/000 691 . No entanto, não existe nenhum método de alto rendimento para medir a potência biológica e expansiva das nanopartículas acopladas a pMHC in vitro ou complexos de pMHC não acoplados a uma nanopartícula, considerando a necessidade de clones de células T antígeno-específicas estáveis, a variabilidade
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2/222 interexperimental altamente variável associada ao uso de células primárias, e a pobre reprodutibilidade quantitativa interexperimental de leituras distais ao evento que dispara o receptor de antigeno. Além disso, os métodos na técnica (por exemplo, eventos de sinalização de TCR proximal semiquantitativa, como medidos por meio de western blotting) não podem simular intimamente o relacionamento complexo entre densidade de pMHC em nanoparticulas e atividade biológica ao longo de uma faixa de concentrações. Como resultado, esses métodos não podem prever fidedignamente se uma preparação particular é de qualidade suficiente para gerar respostas biológicas ótimas. Portanto, há uma necessidade na técnica pelo desenvolvimento de métodos in vitro para medição da potência agonista ou expansiva de uma pMHC. Essa revelação satisfaz essa necessidade e também fornece vantagens relacionadas.
SUMÁRIO
[004] Doenças autoimunes como, por exemplo, diabetes tipo 1 (T1D), esclerose múltipla e artrite reumatóide, resultam de respostas autoimunes crônicas que envolvem células T e células B que reconhecem numerosos epitopos antigênicos em listas incompletamente definidas de autoantigenos (Santamaria, P. (2010) Immunity 32:437-445; Babbe, H. e cols. (2000) J. Exp. Med. 192:393-404; Firestein, G.S. (2003) Nature 423:356-361). A eliminação ou supressão de todas as especificidades de células T autorreativas policlonais (conhecidas e desconhecidas) em cada distúrbio autoimune individual sem comprometimento da imunidade sistêmica não é possivel atualmente.
[005] A transferência adotiva de células T reguladoras
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3/222 (Treg) policlonais FOXP3+CD4+CD25+ expandidas ex vivo foi proposta como uma alternativa à abordagem terapêutica (Sakaguchi, S. e cols. (2006) Immunol. Rev. 212: 8-27) . O potencial para imunossupressão assistente, a ausência de estratégias eficazes para expansão de células Treg antígenoespecíficas in vitro e a instabilidade de linhagem de células Treg FOXP3+ impediram a tradução clínica dessa abordagem (Zhou, X. e cols. (2009) Nature Immunol. 10: 1.000-1.007; Komatsu, N. e cols. (2014) Nature Med. 20: 62-68; BaileyBucktrout, S.L. e cols. (2013) Immunity 39: 949-962). Células T TrI FOXP3 CD4'CD25 , que produzem as citocinas IL-10 e IL21 e expressam os marcadores de superfície CD49b e LAG-3 e o fator de transcrição c-Maf 8, constituem outro subconjunto de células T reguladoras recentemente explorado para o tratamento de doenças inflamatórias humanas (McLarnon, A. (2012) Nature Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9: 559; Desreumaux, P. e cols. (2012) Gastroenterology 143: 1.2071.217; Roncarolo, M.G. e cols. (2011) Immunol. Rev. 241: 145-163) . No entanto, como ocorre com células Treg FOXP3 + , não há abordagens farmacológicas que possam expandir células Inl-Hke autoantígeno- ou doença-específicas in vivo.
[006] O Requerente demonstrou previamente que a liberação sistêmica de nanopartículas revestidas com peptídeos relevantes para doenças autoimunes (Patente U.S. N° 8.354.110), relevantes para o trato gastrintestinal (WO 2013/144811) ou relevantes para o câncer ou para tumores (Patente U.S. N° 9.511.151) ligados a moléculas de complexo de histocompatibilidade principal desencadeiam a geração e expansão de células reguladoras antígeno-específicas em diferentes modelos em camundongo, incluindo camundongos
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4/222 humanizados com linfócitos de pacientes, levando à resolução de fenômenos autoimunes estabelecidos (veja também WO 2016/198932 e Clemente-Casares, X. e cols. (2016) Expanding Antigen-Specific Reguladory Networks to Treat Autoimmunity, Nature 530: 434-440) . No entanto, não existe nenhum método de alto rendimento para medir a potência biológica e expansiva das nanoparticulas acopladas a pMHC in vitro ou complexos de pMHC não acoplados a uma nanoparticula, considerando a necessidade de clones de células T antigenoespecificas estáveis, os desafios técnicos e a variabilidade interexperimental altamente variável associada ao uso de células primárias, e a pobre reprodutibilidade quantitativa interexperimental de leituras distais ao evento que dispara o receptor de antigeno.
[007] Os dados apresentados nesse relatório descritivo fornecem resultados inesperados, na medida em que as interações primárias TCR-peptideo MHC são modeladas com precisão in vitro por uma linhagem de célula transduzida/ transfectada com um repórter via-dependente e o complexo de receptores (TCR mais co-receptor de CD4 ou CD8) que responde com seu ligante natural (moléculas de peptideo MHC Classe II ou de peptideo MHC Classe I). Veja a FIG. 1 I versus J. Os métodos e composições descritas nessa revelação são geralmente aplicáveis à medição da potência de um nanomedicamento que compreende um ligante ou receptor que interage com uma célula que expressa seu receptor ou ligante cognato. Por exemplo, os métodos e composições descritas nesse relatório descritivo podem ser usadas para o design de nanomedicamentos que compreendem uma nanoparticula descrita nesse relatório descritivo e um ligante para um receptor que
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5/222 pode ser posicionado para modificar e reprogramar in vivo respostas celulares. Por exemplo, função de célula-beta é influenciada positivamente por ligação a E, P e N-caderinas. Os métodos e composições descritas nesse relatório descritivo permitem o desenvolvimento e testagem de composições de matéria que compreendem uma nanoparticula e E, P ou N-caderina. Essas composições podem ser combinadas com uma linhagem de célula apropriada, por exemplo, uma linhagem de célula Min6 (linhagem de célula-beta responsiva à glicose) , com um repórter de célula-beta que pode ser escolhido por sua resposta à glicose.
[008] Em modalidades especificas, essa revelação fornece composições e métodos para medir a atividade agonista ou antagonista ou potência de um complexo de pMHC que está opcionalmente ligado a uma nanoparticula. Em um aspecto, é fornecida uma célula isolada transduzida com um ou mais polinucleotídeos que codificam: um receptor de célula T recombinante (TCR); um repórter dependente da via de TCR; e um co-receptor que se liga a um ligante do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) Classe I ou Classe II. Em um aspecto adicional, as células expressam um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR. Ainda em outra modalidade adicional, as células são transduzidas com um ou mais polinucleotídeos que codificam receptores ou ligantes para um ou mais de uma molécula coestimulatória e/ou uma citocina.
[009] Exemplos não limitantes de ligantes de MHC são selecionados do grupo de receptores que se ligam a: uma proteina MHC Classe I clássica, uma proteina MHC Classe I não clássica, uma proteina MHC Classe II clássica, uma
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6/222 proteína MHC Classe II não clássica, um dímero de MHC (fusões de Fc), um tetrâmero de MHC, ou uma forma polimérica de uma proteína MHC. Em um aspecto o polinucleotídeo codifica um co-receptor de MHC Classe I como, por exemplo, CD8. Em outro aspecto, o polinucleotídeo codifica um co-receptor de MHC Classe II como, por exemplo, CD4. Os polinucleotídeos estão, opcionalmente, ligados operativamente a elementos reguladores que dirigem a expressão dos polinucleotídeos e, ainda opcionalmente, um elemento intensificador.
[010] Em um aspecto, o polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica o receptor de célula T codifica TCRa e/ou TCRp que opcionalmente contém elementos reguladores ligados operativamente ao polinucleotídeo (ou polinucleotídeos) que codifica TCRa e/ou TCRp. Esses polinucleotídeos podem opcionalmente compreender uma sequência de salto de ribossomo. Em um aspecto, a sequência de salto de ribossomo compreende, ou ainda consiste basicamente em ou, alternativamente, consiste em uma sequência de salto de ribossomo 2A. Exemplos não limitantes da sequência de salto de ribossomo 2A compreendem ou, alternativamente, consistem basicamente em ou, ainda adicionalmente, consistem em uma sequência de salto de ribossomo F2A, T2A ou P2A, ou uma combinação destas.
[011] Em um aspecto adicional, o repórter dependente da via de TCR é um repórter de ativação de TCR ou ativação da via de TCR que pode opcionalmente fornecer uma ou mais medições de expressão gênica, atividade, localização de proteína, modificação de proteína ou interação proteínaproteína. Em um aspecto adicional, o repórter dependente da via de TCR compreende ou, alternativamente, consiste
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7/222 basicamente em, ou ainda adicionalmente consiste em uma proteína selecionada do grupo de uma luciferase, uma betalactamase, CAT, SEAP, ou uma proteína fluorescente. Ainda em outro aspecto adicional, o repórter dependente da via de TCR compreende uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT).
[012] Em outra modalidade, a célula foi transduzida com um polinucleotídeo que codifica um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR que está, opcionalmente, acoplado operativamente a sequências reguladoras para expressão do complexo de sinalização de CD3 na superfície das células, por exemplo, promotores e/ou intensificadores. Em uma modalidade, a célula não expressa endogenamente um complexo de sinalização de CD3.
[013] As células são úteis para determinar a ativação potencial de qualquer antígeno, cujos exemplos incluem, sem limitação, antígenos autoimunes ou relevantes para câncer que estão opcionalmente acoplados à MHC (pMHC). As pMHCs estão opcionalmente acopladas a um núcleo de nanopartícula ou outro carreador. Em um aspecto, a pMHC está complexada a um núcleo de nanopartícula, opcionalmente por meio de um vinculador ao núcleo ou por meio de um revestimento no núcleo. O número de pMHC por núcleo de nanopartícula pode variar, por exemplo, de cerca de 10:1 até cerca de 1.000:1, e varia entre 10:1 até cerca de 1.000:1. O núcleo de nanopartícula pode opcionalmente ainda compreender diversas moléculas coestimulatórias e/ou citocinas, como for apropriado.
[014] Em um aspecto particular, a pMHC, a citocina e/ou
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8/222 a molécula coestimulatória está complexada ao núcleo de nanopartícuia por meio de um revestimento no núcleo. 0 revestimento pode ser, por exemplo, um polímero, opcionalmente um revestimento de polietileno glicol (PEG), e o número de pMHC, da citocina e/ou da molécula coestimulatória, por núcleo pode ser medido por densidade ou pelo número de pMHC por área de superfície do núcleo de nanopartícuia revestida com o polímero. Qualquer densidade pode ser medida, por exemplo, de cerca de 0,025 pMHC/100 nm2 até cerca de 100 pMHC/100 nm2 por área de superfície do núcleo de nanopartícula, e varia entre 0,025 pMHC/100 nm2 até cerca de 100 pMHC/100 nm2 por área de superfície do núcleo de nanopartícula.
[015] Qualquer célula eucariótica apropriada pode ser transduzida com polinucleotídeos que codificam os elementos necessários; exemplos não limitantes dessas incluem JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM ou Molt-4. As células podem ser de qualquer espécie apropriada, animal, mamífera, por exemplo, humana. Em um aspecto adicional, quando a célula deve ser transduzida com um polinucleotídeo que codifica o complexo de sinalização da cadeia CD3, a célula não expressa endogenamente o complexo de sinalização da cadeia CD3.
[016] É ainda fornecida uma população das células identificadas nesse relatório descritivo, em que, em um aspecto, é substancialmente homogênea. Métodos para o cultivo das células e populações de células são ainda fornecidos nesse relatório descritivo.
[017] A revelação também fornece métodos para preparação das células isoladas, como descrito nesse relatório descritivo. Em um aspecto, o método compreende ou,
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9/222 alternativamente, consiste basicamente em, ou ainda consiste na transdução de uma célula isolada com um ou mais polinucleotídeos que codificam: um receptor de célula T recombinante (TCR); e um repórter dependente da via de TCR; e um co-receptor que se liga a um ligante de complexo de histocompatibilidade principal Classe I ou Classe II (MHC). Em uma modalidade, o método compreende ou, alternativamente, consiste basicamente em, ou ainda consiste na transdução de uma célula isolada com um polinucleotídeo que codifica complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR. 0 método ainda compreende o cultivo das células sob condições que favorecem a expressão dos (um ou mais) polinucleotídeos que codificam um receptor de célula T recombinante (TCR), um repórter dependente da via de TCR e um receptor que se liga aos ligantes de complexo de histocompatibilidade principal Classe I ou Classe II (MHC). Em outra modalidade, o método ainda compreende o cultivo das células sob condições que favorecem a expressão de um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR.
[018] Em uma modalidade adicional, os métodos ainda compreendem ou, alternativamente, consistem basicamente em, ou ainda adicionalmente consistem na transdução de uma célula com um ou mais polinucleotídeos que expressam receptores ou ligantes para um ou mais de: diversas moléculas coestimulatórias, diversos anticorpos coestimulatórios, diversos anticorpos inibidores de bloqueio do receptor, e/ou diversas citocinas.
[019] Células que expressam os receptores e os produtos da expressão de polinucleotídeos transduzidos podem ser
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10/222 identificados por qualquer método apropriado conhecido na técnica usando, por exemplo, ligantes e/ou anticorpos marcados de forma detectável que se ligam aos produtos da expressão por métodos conhecidos na técnica como, por exemplo, citometria de fluxo.
[020] Mediante transdução das células, as células são desenvolvidas sob condições que favorecem a expressão dos polinucleotídeos e para a produção de uma população de células.
[021] As células e populações de células são úteis em um método de medição in vítro da atividade agonista ou antagonista de uma composição que compreende um complexo antígeno-MHC (pMHC) (opcionalmente ligado a um núcleo de nanopartícula) e, opcionalmente, uma molécula coestimulatória e/ou uma citocina, por contato da composição com uma célula isolada como descrita nesse relatório descritivo que favorece a ligação dos receptores aos seus ligantes, e depois detecção de qualquer sinal do repórter via de TCR-dependente sinal produzido pelo repórter. Como é evidente para aqueles habilitados na técnica, a composição e célula são selecionadas para interação provável, por exemplo, a composição contém uma molécula de TCR específica para pMHC Classe II e a célula expressa um co-receptor de MHC Classe II, por exemplo, CD4.
[022] Em um aspecto, após o contato da célula com a composição, qualquer sinal do repórter produzido pelas células ou população é quantificado. A resposta medida pode ser catalogada e depois comparada com o sinal quantificado com uma medição predeterminada e/ou pós-determinada da atividade agonista ou antagonista para monitorar a eficácia
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11/222 de uma terapia contra outras terapias ou composições. Quando a composição compreende uma molécula coestimulatória e as células e populações de células expressam os receptores apropriados, a resposta medida pode ser catalogada e depois comparada com o sinal quantificado com uma medição predeterminada e/ou pós-determinada da atividade antagonista para monitorar a eficácia de uma terapia contra outras terapias ou composições.
[023] Dessa forma, certos aspectos da revelação estão relacionados a uma combinação que compreende pelo menos uma célula transduzida isolada ou população de células transduzidas, como descrito nesse relatório descritivo, um complexo isolado, em que o complexo isolado compreende ou, alternativamente, consiste basicamente em, ou ainda consiste em, núcleos de nanoparticula acoplados a diversos complexos de pMHC, em que os núcleos de nanoparticula opcionalmente ainda compreendem, ou ainda consistem ou, alternativamente, ainda consistem basicamente em uma ou mais moléculas coestimulatórias e/ou uma ou mais citocinas acopladas ao núcleo de nanoparticula.
[024] Para essas composições que contêm vários dos complexos, os complexos de pMHC em cada núcleo de nanoparticula são os mesmos ou diferentes uns dos outros; e/ou as MHCs dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as citocinas em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as moléculas coestimulatórias em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou os diâmetros dos núcleos de nanoparticula são os mesmos ou diferentes uns dos
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12/222 outros; e/ou as valências dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as densidades dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as valências ou densidades das moléculas coestimulatórias em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as valências ou densidades das citocinas em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras.
[025] Em um aspecto, é descrita nesse relatório descritivo uma composição que compreende: (a) pelo menos uma célula que compreende (i) um receptor de célula T recombinante (TCR) que compreende uma cadeia alfa de TCR e uma cadeia beta de TCR; e (ii) um repórter dependente da via do receptor de célula T, em que o TCR recombinante é específico para um antígeno relevante para doenças ligado a uma molécula de histocompatibilidade principal (MHC); e (b) um nanomedicamento, que compreende um antígeno relevante para doenças ligado a uma molécula de MHC acoplada a uma nanopartícula. Em certas modalidades, o repórter dependente da via do receptor de célula T é transcrito ativamente. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças ligado à molécula de MHC está acoplado à nanopartícula em uma proporção de 10:1 ou maior. Em certas modalidades, a nanopartícula possui um diâmetro entre 1 nanômetro e 100 nanômetros. Em certas modalidades, a nanopartícula compreende um núcleo de metal. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças é um antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças autoimunes ou
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13/222 inflamatórias é selecionado da lista que consiste em um antígeno de asma ou asma alérgica, um antígeno de diabetes mellitus Tipo I, um antígeno de esclerose múltipla, um antígeno de neuropatia periférica, um antígeno de cirrose biliar primária, um antígeno de distúrbio do espectro da neuromielite óptica, um antígeno da síndrome da pessoa rígida, um antígeno de encefalite autoimune, um antígeno de pênfigo vulgar, um antígeno de pênfigo foliáceo, um antígeno de psoríase, um antígeno de doença/síndrome de Sjõgren, um antígeno de doença inflamatória intestinal, um antígeno de artrite ou artrite reumatóide, um antígeno de lúpus eritematoso sistêmico, um antígeno de esclerodermia, um antígeno de vasculite associada a ANCA, um antígeno da síndrome de Goodpasture, um antígeno de doença de Kawasaki, um antígeno de doença celíaca, um antígeno de cardiomiopatia autoimune, um antígeno de miastenia grave, um antígeno de uveíte autoimune, um antígeno de doença de Grave, um antígeno de síndrome antifosfolipídeo, um antígeno de hepatite autoimune, um antígeno de colangite esclerosante, um antígeno de colangite esclerosante primária, antígeno de doença pulmonar obstrutiva crônica, ou um antígeno relevante para uveíte, e combinações destes. Em certas modalidades, o repórter dependente da via do receptor de célula T ativa a transcrição de um gene selecionado do grupo que consiste em um gene de luciferase, um gene de beta-lactamase, um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT), um gene de fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), um gene de proteína fluorescente, e combinações destes. Em certas modalidades, o repórter dependente da via do receptor de célula T consiste em uma sequência de polinucleotídeos selecionada da lista
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14/222 compreende uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição NF-κΒ, uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de AP1, uma sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição IL-2, e combinações destes. Em certas modalidades, a (pelo menos uma) célula é selecionada de JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM ou Molt-4. Em certas modalidades, o antigeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 1 a 352 e combinações destes. Em certas modalidades, o antigeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 353 a 455 e combinações destes. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como um polipeptídeo único. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR do polipeptídeo único são separadas por uma sequência de salto de ribossomo. Em certas modalidades, a sequência de salto de ribossomo é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 456 a 523. Em certas modalidades, o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 527, 533 ou 538. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como polipeptídeos separados. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR, em que a cadeia alfa de TCR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 528, 530, 534, 536 539, 541, e a cadeia beta de TCR compreende uma sequência de
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15/222 aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 529, 531, 535, 537, 540 ou 542. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são expressas na superfície da célula. Em certas modalidades, a célula compreende pelo menos um polinucleotídeo exógeno que codifica a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR. Em certas modalidades, o (pelo menos um) polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucleicos de IRES. Em certas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos de IRES é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524 a 526. Em certas modalidades, o polinucleotídeo compreende uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% homóloga àquela apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 532 ou 557. Em certas modalidades, a composição é para uso in vitro na determinação de uma potência ou atividade de um nanomedicamento. Em certas modalidades, o nanomedicamento é para uso em um indivíduo humano.
[026] Em outro aspecto, é descrita nesse relatório descritivo uma célula que compreende um receptor de célula T recombinante (TCR) e um repórter dependente da via do receptor de célula T, em que o receptor de célula T recombinante é especifico para um antigeno relevante para doenças ligado a uma molécula de histocompatibilidade principal. Em certas modalidades, o repórter dependente da via do receptor de célula T é transcrito ativamente. Em certas modalidades, o antigeno relevante para doenças é um antigeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias. Em certas modalidades, o antigeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é selecionado da lista que
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16/222 consiste em um antígeno de asma ou asma alérgica, um antígeno de diabetes mellitus Tipo I, um antígeno de esclerose múltipla, um antígeno de neuropatia periférica, um antígeno de cirrose biliar primária, um antígeno de distúrbio do espectro da neuromielite óptica, um antígeno da síndrome da pessoa rígida, um antígeno de encefalite autoimune, um antígeno de pênfigo vulgar, um antígeno de pênfigo foliáceo, um antígeno de psoríase, um antígeno de doença/síndrome de Sjõgren, um antígeno de doença inflamatória intestinal, um antígeno de artrite ou artrite reumatóide, um antígeno de lúpus eritematoso sistêmico, um antígeno de esclerodermia, um antígeno de vasculite associada a ANCA, um antígeno da síndrome de Goodpasture, um antígeno de doença de Kawasaki, um antígeno de doença celíaca, um antígeno de cardiomiopatia autoimune, um antígeno de miastenia grave, um antígeno de uveíte autoimune, um antígeno de doença de Grave, um antígeno de síndrome antifosfolipídeo, um antígeno de hepatite autoimune, um antígeno de colangite esclerosante, um antígeno de colangite esclerosante primária, antígeno de doença pulmonar obstrutiva crônica, ou um antígeno relevante para uveíte, e combinações destes. Em certas modalidades, o repórter dependente da via do receptor de célula T ativa a transcrição de um gene selecionado do grupo que consiste em um gene de luciferase, um gene de beta-lactamase, um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT), um gene de fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), um gene de proteína fluorescente, e combinações destes. Em certas modalidades, o repórter dependente da via do receptor de célula T compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada da lista que consiste em uma sequência de DNA ou promotor de
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17/222 ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição NF-κΒ, uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de AP1, uma sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição IL-2, e combinações destes. Em certas modalidades, a célula é selecionada de JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM ou Molt-4. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 1 a 352 e combinações destes. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 353 a 455 e combinações destes. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como um polipeptídeo único. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR do polipeptídeo único são separadas por uma sequência de salto de ribossomo. Em certas modalidades, a sequência de salto de ribossomo é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 456 a 523. Em certas modalidades, o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 527, 533 ou 538. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como polipeptídeos separados. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR, em que a cadeia alfa de TCR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 528, 530, 534, 536 539, 541, e a cadeia beta de TCR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100%
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18/222 idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 529, 531, 535, 537, 540 ou 542. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são expressas na superfície da célula. Em certas modalidades, a célula compreende pelo menos um polinucleotídeo exógeno que codifica a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR. Em certas modalidades, o (pelo menos um) polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucléicos de IRES. Em certas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de IRES é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524 a 526. Em certas modalidades, o (pelo menos um) polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucléicos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% homóloga àquela apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 532 ou 557. Em certas modalidades a célula é uma população de células. Em certas modalidades, a célula ou a população de células são para uso in vitro na determinação de uma potência ou atividade de um nanomedicamento. Em certas modalidades, o nanomedicamento é para uso em um indivíduo humano.
[027] Em outro aspecto, é descrito nesse relatório descritivo um método de medição in vitro da atividade agonista de um nanomedicamento que compreende um antigeno relevante para doenças ligado a uma molécula de MHC acoplada a uma nanoparticula, o método compreendendo: (a) o contato do nanomedicamento com a célula ou população de células descrita nesse relatório descritivo; e (b) detecção de um sinal produzido pelo repórter dependente da via do receptor de célula T. Em certas modalidades, o nanomedicamento compreende diversas nanoparticulas. Em certas modalidades, as diversas nanoparticulas compreendem diversas nanoparticulas que compreendem diversos antigenos relevantes
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19/222 para doenças ligados a uma molécula de MHC acoplada à nanopartícuia. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças é um antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é selecionado da lista que consiste em um antígeno de diabetes mellitus Tipo I, um antígeno de asma ou asma alérgica, um antígeno de esclerose múltipla, um antígeno de neuropatia periférica, um antígeno de cirrose biliar primária, um antígeno de distúrbio do espectro da neuromielite óptica, um antígeno da síndrome da pessoa rígida, um antígeno de encefalite autoimune, um antígeno de pênfigo vulgar, um antígeno de pênfigo foliáceo, um antígeno de psoríase, um antígeno de doença/síndrome de Sjõgren, um antígeno de doença inflamatória intestinal, um antígeno de artrite ou artrite reumatóide, um antígeno de lúpus eritematoso sistêmico, um antígeno de esclerodermia, um antígeno de vasculite associada a ANCA, um antígeno da síndrome de Goodpasture, um antígeno de doença de Kawasaki, um antígeno de doença celíaca, um antígeno de cardiomiopatia autoimune, um antígeno de miastenia grave, um antígeno de uveíte autoimune, um antígeno de doença de Grave, um antígeno de síndrome antifosfolipídeo, um antígeno de hepatite autoimune, um antígeno de colangite esclerosante, um antígeno de colangite esclerosante primária, antígeno de doença pulmonar obstrutiva crônica, ou um antígeno relevante para uveíte, e combinações destes. Em certas modalidades, as diversas nanopartícuias compreendem diversas nanopartículas com um diâmetro de 1 nanômetro até cerca de 100 nanômetros. Em certas modalidades, o método ainda compreende a
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20/222 quantificação do sinal do repórter dependente da via do receptor de célula T. Em certas modalidades, a quantificação compreende a determinação de uma concentração do nanomedicamento que inicia uma resposta que é cerca de 50% de uma resposta máxima, em que a resposta máxima é a resposta iniciada na maior concentração de nanomedicamento que entrou em contato com a célula ou população de células quando várias concentrações do nanomedicamento entram em contato com a célula ou população de células. Em certas modalidades, as várias concentrações do nanomedicamento entram em contato com a célula ou população de células no mesmo ensaio. Em certas modalidades, a quantificação compreende a determinação de uma concentração do nanomedicamento que inicia uma resposta que é pelo menos cerca de 200%, de um controle negativo; em que o controle negativo compreende um nanomedicamento que não interage especificamente com o receptor de célula T recombinante (TCR) da célula ou da população de células. Em certas modalidades, o sinal é produzido por uma enzima. Em certas modalidades, a enzima é luciferase ou peroxidase. Em certas modalidades, o sinal é um sinal fluorescente. Em certas modalidades, o método é utilizado como uma etapa de controle de qualidade em um processo de fabricação.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[028] Os desenhos seguintes formam parte do presente relatório descritivo e estão incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da presente revelação. A revelação pode ser melhor compreendida por referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas apresentadas nesse relatório
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21/222 descritivo .
[029] As FIGS. 1A-1J mostram efeitos do tamanho de NP e valência de pMHC sobre a atividade agonista de célula T e sinalização de TCR. A FIG. 1A mostra a produção de IFNy por células T 8.3-CD8+ em resposta a NRP-V7/Kd-SFP, em função da valência de pMHC e números de NP. A FIG. 1B mostra as propriedades agonistas dos NRP-V7/Kd-SFPs da FIG. Ia, em função da concentração de pMHC no ensaio. As FIGS. lc—ld mostram a produção de IFNy por células T 8.3-CD8+ em resposta a PF conjugada com duas valências de NRP-V7/Kd diferentes, em função da concentração de pMHC-NP (FIG. 1C) ou de pMHC no ensaio (FIG. ld) . As FIGS. 1E—F mostram a comparação das propriedades agonistas de NPs pequenas (SFP) vs. maiores (PF) revestidas com valências baixas de NRP-V7/Kd, em função da concentração de pMHC-NP (FIG. 1E) ou de pMHC (FIG. 1F) . Os dados nas FIGS. 1A—1F correspondem aos valores médios ± SEM da secreção de IFNy em poços em triplicata (barras de erro eram normalmente menores do que o tamanho dos símbolos usados para exibir os dados) e cada painel corresponde a um experimento representativo dos pelo menos três experimentos independentes. Controles negativos envolveram o uso de NPs não conjugadas ou conjugadas a Cys na concentração alta de NPs (ou seja, 50 x 1011 NPs/ml em a) , gerando valores de IFNy de zero. A FIG. 1G mostra a comparação das propriedades agonistas de NPs PF conjugadas com 10 valências de BDC2.5mi/lAT7 diferentes em células T BDC2.5-CD4 + , em função da concentração de pMHC-NP (superior) ou de pMHC (inferior). Os dados mostrados correspondem a um experimento. Dados para 5 e 10 pg de pMHC foram repetidos mais duas vezes com resultados similares. Como um controle negativo, o
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Requerente usou NPs conjugadas a Cys em uma concentração de ferro equivalente àquela de 10 pg pMHC/ml das 10 preparações de pMHC/NP (95 x 1011 NP/ml) , gerando valores de IFNy de zero. A FIG. 1H mostra o relacionamento entre valência e densidade de BDC2.5mi/IA9? (eixos horizontais inferior e superior, respectivamente) em NPs PF (agrupadas de acordo com densidades sublimiares, limiares, ótimas minimas e supralimiares) e atividade agonista em células T BDC2.5-CD4+ a 10 pg/ml (esquerda) e 5 pg/ml (direita) (concentrações de pMHC que geram atividade agonista quase máxima). Os valores P entre valência sublimiar/limiar vs. ótima minima /valências supralimiares foram calculados por meio do teste de U de Mann-Whitney. A FIG. II mostra atividade de luciferase (média ± SEM de triplicatas) em células JurMA que expressam BDC2.5-TCR/mCDA/NFAT-luciferase em resposta à estimulação por vários periodos de tempo com BDC2.5mi/IA9?PF-M (12,5 pg/ml), mAb anti-hCD3e solúvel (10 pg/ml) e PMA/ionomicina. RLU (unidades relativas de luz) . Como um controle negativo, o Requerente usou NPs conjugadas a Cys em uma concentração de ferro equivalente àquela de 5 pg pMHC/ml das 10 preparações de pMHC/NP (45,5 x 1011 NP/ml), gerando 1,05 RLU. Os dados mostrados são representativos de pelo menos três experimentos independentes por condição de estimulação. Os valores P entre condições foram calculados por meio de ANOVA de duas vias. A FIG. 1J mostra o relacionamento entre valência e densidade de BDC2.õmi/IA^7 (eixos horizontais inferior e superior, respectivamente) em NPs PF (agrupadas de acordo com densidades sublimiares, limiares, ótimas minimas e supralimiares) e atividade agonista em células JurMA que expressam BDC2.5
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TCR/mCD4/NFAT-luciferase a 5 pg/ml. Os valores P foram calculados por meio do teste de U de Mann-Whitney.
[030] As FIGS. 2A e 2B mostram a representação esquemática de ligação de pMHC-NP às células T cognatas. FIG. 2A, Painel superior: representação esquemática de um nanoagrupamento de TCR, composto por 16 unidades que transpõem 140 nm (supondo um tamanho globular de 4 nm de TCRap e espaçamento de 5 nm) , que se ligam a 4 pMHC-NPs densamente revestidas (que carregam monômeros de pMHC espaçados por 4 nm cada). O desenho do painel inferior ilustra como essas 4 pMHC-NPs interagem com ilhas (esquerda) ou nanoagrupamentos (direita) de TCR, como visualizado da perspective de NP. A FIG. 2B ilustra pMHC-NPs revestidas em valências supralimiares, limiares e infralimiares (esquerda) e suas habilidades relativas para provocar a sinalização de TCR nos agrupamentos, levando em conta a avidez de ligação global, taxas de associação e dissociação de pMHC-TCR, e tanto a revisão cinética quanto a sinalização cooperativa de modelos de TCR. pMHC-NPs capazes de ligar heterodimeros de TCR contíguos nesses agrupamentos são eficientes para provocar a sinalização de TCR. Esses modelos explicam por que NPs pequenas revestidas com pMHCs dispostas intimamente possuem propriedades imunológicas ótimas.
[031] As FIGS. 3A-3G mostram ligação e agrupamento de pMHC-NPs em células T cognatas em função da densidade de pMHC. As FIG. 3A e 3B mostram imagens 2D por TEM de células T BDC2.5mi-CD4+ (FIG. 3a) ou 8.3-CD8+ (FIG. 3b) incubadas com BDC2.5mi/IA9?- ou NRP-V7/Kd-PF-M, respectivamente, revestidas em densidades supralimiares de pMHC (46 pMHCs/NP). Os dois painéis da direita na FIG. 3a e os quatro painéis da direita
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24/222 na FIG. 3b mostram a presença de NPs em vesículas intracelulares após incubação de 3 horas a 37°C. A FIG. 3C mostra imagens 2D por TEM de células T BDC2.5mi-CD4+ e 8.3CD8+ incubadas com NRP-V7/Kd-PF-M e BDC2.5mi/lA^-PF-M não cognatas, respectivamente. FIG. 3D, Painel da esquerda: imagem 3D: microscopia de super-resolução de células T 8.3CD8+ incubadas com NRP-V7/Kd-PF-M-Alexa-647 a 4°C por 30 min. Painéis do meio e da direita: 2D imagens: células T incubadas a 4°C por 30 min e a 4°C por 30 min, seguido por 37°C for 1 hora. O gráfico de histogramas mostra que os agrupamentos de NP aumentam de diâmetro com o tempo e temperatura de incubação (179,1 ± 4,6 nm para 401,7 ± 4,2 nm; n = 100 agrupamentos/condição; valores P calculados por U de MannWhitney). Cinza claro: NRP-V7/Kd-PF-MAlexa-647; Cinza escuro: DAPI. Barra: 1 pm. As FIGS. 3E e 3F mostram imagens 2D por TEM de células T BDC2.5mi-CD4+ incubadas com preparações de BDC2.5mi/IA9?-PF-M que carregam valências sublimiares de 10 pMHCs/NP; (e) ou limiares (24 pMHCs/NP); (f) de pMHC. Quatro painéis da esquerda na FIG. 3E e FIG. 3F mostram ausência (e) ou presença (f) de microagrupamentos na membrana da célula T. Dois painéis da direita na FIG. 3E e FIG. 3F mostram a presença de vesículas intracelulares. A FIG. 3G mostra tamanho médio de microagrupamentos em células cultivadas na presença de pMHC-NPs revestidas a (59,5 ± 6,5 nm) , (271,2 ± 17,3 nm) e (370 ± 21,3 nm) ; (n = 50-60 agrupamentos em 9-15 células/condição) . Os valores P foram calculados por U de Mann-Whitney. Os experimentos descritos nessa figura são repetíveis e podem ser reproduzidos com resultados consistentes.
[032] As FIGS. 4A e 4B mostram o agrupamento sustentado
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25/222 de pMHC-NPs em célula T cognata com microscopia de varredura eletrônica (SEM) . A FIG. 4A mostra imagens 3D por SEM de células T 8.3-CD8+ na ausência (esquerda) ou presença (direita) de NRP-V7/Kd-PF-M. Ampliação, 100.000X; Barra: 500 nm. Linhas tracejadas pretas correspondem a agrupamentos de pMHC-NP representativos. A FIG. 4B mostra análise espectral por EDS. Três áreas da membrana contendo agrupamento (a-c) e livres de agrupamento (d-f) representativas mostradas em uma imagem por SEM ampliada foram analisadas por meio de EDS e os dados tabulados como histogramas. O valor P foi obtido com o teste de U de Mann-Whitney.
[033] A FIG. 5 mostra os resultados de variabilidade interensaios de um ensaio de potência.
[034] A FIG. 6 mostra os resultados usando um ensaio de potência para determinar o efeito de soro e anticorpos com componente anti-pMHC-NP sobre a habilidade de pMHC para estimular uma linhagem de célula T. pMHC-NP foram préincubadas com soro humano, como mostrado nas FIG. 6C e FIG. 6D, ou sem, como mostrado na FIG. 6A ou 6B; e subsequentemente incubadas com o anticorpo indicado ou soro hiperimune (H.I.) de coelho. Cada anticorpo foi incubado com a pMHC e célula, como indicado, em diluições (da esquerda para a direita) de 1:10, 1:100 e 1:1.000 para soro na FIG. 6B e FIG. 6D, e proporções molares (da esquerda para a direita) de Ab:pMHC de 1:1, 1:4 e 1:16. Barras indicam desvio-padrão.
[035] A FIG. 7A—D mostra citometria de fluxo de células JURMA marcadas com GFP que expressam um TCR específico para DR complexada com o polipeptídeo IGRP13-25. A FIG. 7A mostra a linhagem de célula propriamente dita; a FIG. 7B mostra a
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26/222 linhagem de célula incubada com DR3 IGRP13-25 marcada com PE feita por tecnologia-padrão de dimerização de zíper de leucina; a FIG. 7C mostra linhagem de célula incubada com DR3 IGRP13-25 marcada com PE feita usando tecnologia de dimerização knob-in-hole e cys-trap, desprovida de um ziper de leucina; a FIG. 7D mostra linhagem de célula incubada com heterodimeros irrelevantes de MHC Classe II marcada com PE.
[036] As FIG. 8A e 8B mostram a estimulação de células JURMA que expressam um TCR especifico para DR complexada com o polipeptídeo IGRP13-25 conjugado a uma nanopartícula.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[037] Em um aspecto, é descrita nesse relatório descritivo uma composição que compreende: (a) pelo menos uma célula que compreende (i) um receptor de célula T recombinante (TCR) que compreende uma cadeia alfa de TCR e uma cadeia beta de TCR; e (ii) um repórter dependente da via do receptor de célula T, em que o TCR recombinante é específico para um antígeno relevante para doenças ligado a uma molécula de histocompatibilidade principal (MHC); e (b) um nanomedicamento, que compreende um antígeno relevante para doenças ligado a uma molécula de MHC acoplada a uma nanopartícula.
[038] Em outro aspecto, é descrita nesse relatório descritivo uma célula que compreende um receptor de célula T recombinante (TCR) e um repórter dependente da via do receptor de célula T, em que o receptor de célula T recombinante é específico para um antígeno relevante para doenças ligado a uma molécula de histocompatibilidade principal.
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[039] Em outro aspecto, é descrito nesse relatório descritivo um método de medição in vitro da atividade agonista de um nanomedicamento que compreende um antígeno relevante para doenças ligado a uma molécula de MHC acoplada a uma nanopartícula, o método compreendendo: (a) o contato do nanomedicamento com a célula ou população de células descrita nesse relatório descritivo; e (b) detecção de um sinal produzido pelo repórter dependente da via do receptor de célula T.
[040] Ao longo e dentro dessa revelação, é feita referência à literatura técnica e de patentes para descrever mais totalmente o Estado da arte com o qual essa revelação está relacionada. Algumas publicações são identificadas por um número arábico e a informação bibliográfica completa para a publicação é encontrada na seção de referências, que precede imediatamente as reivindicações. Todas as publicações são incorporadas por referência nesse relatório descritivo para descrever mais totalmente o Estado da arte ao qual essa revelação pertence.
[041] Deve ser subentendido que essa revelação não está limitada às modalidades particulares descritas, na medida em que estas, evidentemente, variam. Também deve ser subentendido que a terminologia usada nesse relatório descritivo tem a finalidade única de descrever modalidades particulares, e não visa ser limitante, na medida em que o escopo da presente revelação será limitado apenas pelas reivindicações em anexo.
[042] Deve ser observado que, como usadas nesse relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas no singular um, uma, o e a incluem referentes no plural,
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28/222 salvo quando o contexto determine claramente o contrário. Dessa forma, por exemplo, referência a um excipiente inclui diversos excipientes. 0 termo pelo menos um significa ou mais .
[043] Ao longo desse pedido, o termo cerca de é usado para indicar que um valor inclui o desvio-padrão do erro para o dispositivo ou método que está sendo empregado para determinar o valor. O termo cerca de, quando usado antes de uma designação numérica, por exemplo, temperatura, tempo, quantidade e concentração, incluindo uma faixa, indica aproximações que podem variar por (+) ou (-) por até 10%.
[044] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados nesse relatório descritivo possuem o mesmo significado comumente subentendido por aqueles habilitados na técnica à qual essa revelação pertence. Como usados nesse relatório descritivo, os termos seguintes possuem os significados seguintes.
[045] Como usado nesse relatório descritivo, o termo que compreende ou compreende visa significar que as composições e métodos incluem os elementos citados, mas não excluindo outros. O termo que consiste basicamente em, quando usado para definir composições e métodos, deve significar excluindo outros elementos de qualquer significância essencial para a combinação para a finalidade estabelecida. Dessa forma, uma composição que consiste basicamente nos elementos como definidos nesse relatório descritivo excluiria outros materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e inéditas da revelação reivindicada, por exemplo, composições para o tratamento ou prevenção de esclerose múltipla. O termo que
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29/222 consiste em deve significar excluindo elementos mais do que residuais de outros ingredientes e etapas substanciais do método. Modalidades definidas por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo dessa revelação.
[046] O termo biocompativel, significa que os componentes do sistema de liberação não causarão lesão ao tecido ou lesão ao sistema biológico humano. Para transmitir biocompatibilidade, polímeros e excipientes que tinham uma história de uso seguro em humanos ou com estado de GRAS (Geralmente Aceitos como Seguros) serão usados preferencialmente. O termo biocompatibilidade significa que os ingredientes e excipientes usados na composição serão, em última análise, bioabsorvidos ou depurados pelo corpo sem efeitos adversos para o corpo. Para que uma composição seja biocompativel, e seja considerada como atóxica, ela não pode causar toxicidade às células. Similarmente, o termo bioabsorvível se refere às nanoparticulas feitas de materiais que passam por bioabsorção in vivo ao longo de um periodo de tempo de modo que o acúmulo de longo prazo do material no paciente seja evitado. Em certas modalidades, a nanoparticula biocompativel é bioabsorvida ao longo de um período de menos do que 2 anos, preferivelmente menos do que um ano e, ainda mais preferivelmente, menos do que seis meses. A taxa de bioabsorção está relacionada ao tamanho da partícula, ao material usado, e a outros fatores bem reconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Uma mistura de materiais biocompatíveis, bioabsorvíveis, pode ser usada para formar as nanoparticulas usadas nessa revelação. Em uma modalidade, óxido de ferro e um polímero bioabsorvível, biocompativel, podem ser combinados. Por exemplo, óxido de
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30/222 ferro e PGLA podem ser combinados para formar uma nanoparticula.
[047] O termo complexo de histocompatibilidade principal ou MHC se refere a uma molécula apresentadora de antigeno em uma célula imune que possui a habilidade para se associar com o antigeno para formar uma célula imune associada ao antigeno. Em algumas modalidades, a MHC é uma molécula Classe I ou Classe II. Em algumas modalidades, a MHC compreende, consiste ou consiste basicamente em proteina MHC Classe I clássica, proteina MHC Classe I não clássica, proteina MHC Classe II clássica, proteina MHC Classe II não clássica, dimeros de MHC (fusões de Fc), tetrâmeros de MHC, ou uma forma polimérica de uma proteina MHC. As MHCs se ligam às moléculas da superfície celular selecionadas de CD4 e CD8 .
[048] Um complexo polipeptideo/antigeno-MHCnanoparticula (complexo de NP ou complexo ou pMHC-NP ou complexo de nanoparticula) se refere à apresentação de um peptideo, carboidrato, lipideo, ou outro segmento, fragmento ou epitopo antigênico de uma molécula ou proteina antigênica (ou seja, autopeptideo ou autoantigeno) apresentado por uma molécula de MHC em uma superfície, por exemplo, um núcleo de nanoparticula.
[049] O núcleo de nanoparticula é o substrato da nanoparticula que inclui ou não camadas ou revestimentos. O complexo de nanoparticula compreende o núcleo com pelo menos o complexo de pMHC acoplado ao núcleo. Núcleos de nanoparticula podem ser feitos de vários materiais e podem ser biocompativeis.
[050] Como usado nesse relatório descritivo, o termo
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31/222 fator nuclear de células T ativadas ou NFAT é um nome geral aplicado a uma família de fatores de transcrição comprovadamente importantes na resposta imune (por exemplo, resposta imune regulada por ativação de célula T). 0 sistema imune pode expressar um ou mais membros dos membros da família NFAT, que incluem, sem limitação, NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4, NFAT5. NFATcl até NFATc4 são regulados por sinalização de cálcio. A sinalização de cálcio é crucial para a ativação de NFAT, pois a calmodulina (CaM) , uma proteína sensora de cálcio bem conhecida, ativa a serina/treonina fosfatase calcineurina (CN) . A importação nuclear de proteínas NFAT é oposta por quinases de manutenção no citoplasma e quinases de exportação no núcleo. Quinases de exportação, por exemplo, PKA e GSK-3p, devem ser inativadas para retenção nuclear de NFAT. Em uma modalidade, os fatores de transcrição NFAT permitem a integração e detecção coincidente de sinais de cálcio com outras vias de sinalização como, por exemplo, ras-MAPK ou PKC.
[051] Como usado nesse relatório descritivo, o termo receptor de célula T ou TCR se refere a uma molécula capaz de reconhecer um peptídeo quando apresentado por uma molécula de MHC. Em algumas modalidades, um TCR é um heterodímero que compreende uma cadeia-α de receptor de célula T (TCR a) e uma cadeia-β de receptor de célula T (TCR β), cada cadeia compreendendo uma região variável (V) e uma região constante (C), domínio transmembrana e domínio citosólico. As regiões V e C são geralmente homólogas às regiões V e C de imunoglobulina e compreendem três regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Ambas as cadeias de TCR estão ancoradas na membrana plasmática da célula que
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32/222 apresenta o TCR. Em algumas modalidades, o TCR é um heterodimero que compreende cadeia-γ de TCR (TCR γ) e cadeiaδ de TCR (TCR δ) . Em algumas modalidades, o TCR é uma construção de TCR de cadeia única. Os exemplos não limitantes de TCR α podem ser encontrados em GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAB31880.1, AAB28318.1, AAB24428.1 e ADW95878.1, e equivalentes de cada um desses. Os exemplos não limitantes de TCR β também podem ser encontrados em GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAB31887.1, AKG65861.1, ADW95908.1 e AAM53411.1, e equivalentes de cada um desses. Em uma modalidade, cadeia-γ de TCR compreende uma ou mais sequências encontradas no GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAM21533.1, DAA30449.1 e ABG91733.1, e equivalentes de cada um desses. Em uma modalidade, cadeia-δ de TCR compreende uma ou mais sequências encontradas no GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank Q7YRN2.1, AAC48547.1, JC4663 e NP_001009418.1, e equivalentes de cada um desses. Os TCRs de cadeia única são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de TCRs de cadeia única são revelados em WO 1996018105 e US 20120252742, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade. Em uma modalidade, o polinucleotídeo e as sequências de polipeptídeos de TCR β estão listadas na Listagem de Sequências Exemplar fornecida abaixo e polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos do TCR β, e equivalentes desses polinucleotídeos.
[052] Em algumas modalidades, um TCR está associado com CD3 e forma um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR (ou o complexo TCR/CD3). Nessas modalidades, a célula é transduzida com um ou mais polinucleotídeos que codificam um complexo TCR/CD3 formado
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33/222 por polipeptídeos que compreendem ou, alternativamente, que consistem basicamente em, ou ainda que consistem em cadeias de TCR α e β, os polipeptídeos de CD3y, δ e e, e as cadeias ζ. Com a formação em módulos diferentes, o complexo TCR/CD3 pode desempenhar diferentes papéis. Em uma modalidade, o complexo está envolvido no reconhecimento antígenoespecífico. Nessas modalidades, o complexo está envolvido na transdução de sinal primariamente por meio da presença de um motivo de ativação de imunorreceptor com baseado em tirosina (ITAM) nas caudas citoplasmáticas das cadeias CD3 e ζ. Em algumas modalidades, o complexo TCR/CD3 está envolvido em uma via de sinalização de TCR estimulada por um antígeno, um superantígeno ou um anticorpo (por exemplo, anticorpo antireceptor) . Em uma modalidade, a expressão exógena do complexo TCR/CD3 facilita a via de sinalização de TCR em células CD3negativas. Exemplos não limitantes de células CD3-negativas incluem, sem limitação, BW5147 (N° ATCC TIB-472), Nk-92 (N° ATCC CRL-2407), Mino (N° ATCC PTS-CRL-3000) e JeKo-1 (N° ATCC CRL-3006).
[053] Como usado nesse relatório descritivo, o termo célula isolada se refere à célula fornecida para avaliar a potência de agentes de teste, incluindo as nanopartículas acopladas com pMHC. Em uma modalidade, a célula é uma célula da linhagem T que é selecionada de JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM ou Molt-4. Elas podem ser de quaisquer espécies apropriadas, por exemplo, animais, mamíferas, humanas, caninas, felinas, equinas, bovinas ou ovinas. Em outra modalidade, as células isoladas são células efetoras como, por exemplo, células imunes. Em algumas modalidades, as células efetoras expressam um receptor de célula T (TCR), o
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34/222 complexo de cadeia multiunidades de CD3 associado ao TCR e/ou um repórter dependente da via de TCR e um receptor de CD4 ou CD8 . Em um aspecto adicional, a célula também expressa um receptor para uma molécula coestimulatória e/ou uma citocina. Em uma certa modalidade, o TCR é murinizado (ou seja, em que o TCR é otimizado para interagir com uma molécula de CD4 muridea).
[054] Como usado nesse relatório descritivo, o termo repórter significa um elemento em ou dentro de uma célula isolada que possui uma característica (por exemplo, atividade, expressão, localização, interação, modificação etc.) que é um ou mais de: dependente de, se correlaciona com ou ativado por alterações fisiológicas ou condições da célula. Por exemplo, repórter dependente da via de TCR se refere a um elemento em ou dentro das células, do qual uma característica é ativada ou dependente da ativação ou modulação da via de TCR. Em algumas modalidades, o repórter dependente da via de TCR é ativado por uma sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição a montante (por exemplo, sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição de NFAT, sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição NF-κΒ, sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de AP1 e sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição IL-2). Em uma modalidade, o repórter (por exemplo, repórter dependente da via de TCR) compreende, consiste basicamente ou ainda consiste em um gene que codifica uma proteina selecionada do grupo que consiste em uma luciferase, uma beta-lactamase, CAT, SEAP, uma proteina fluorescente, um produto gênico quantificável, e/ou a
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35/222 combinação destes.
[055] Como usado nesse relatório descritivo, o termo CD3 (agrupamento de diferenciação 3) se refere ao complexo de proteína associado com o receptor de célula T. Em algumas modalidades, anticorpos dirigidos contra CD3 são capazes de gerar um sinal de ativação em linfócitos T. Outros ligantes de ativação de célula T também podem ser usados incluindo, sem limitação, CD28, CD134, CD137 e CD27. Em algumas modalidades, a CD3 compreende ou, alternativamente, consiste basicamente ou consiste em quatro cadeias distintas. Para mamíferos, as quatro cadeias distintas são: CD3-gama, CD3delta, CD3-épsilon e CD3-zeta. Os exemplos não limitantes de cadeias CD3 podem ser encontrados em GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank CAA72995.1, AAI45927.1, NP_998940.1, AAB24559.1, NP_000723.1, AEQ93556.1 e EAW67366.1.
[056] Como usado nesse relatório descritivo, o termo CD4 (agrupamento de diferenciação 4) se refere a uma glicoproteína encontrada na superfície de células imunes, por exemplo, células T auxiliares (helper), monócitos, macrófagos e células dendríticas. Em algumas modalidades, CD4 atua como um co-receptor para o TCR e recruta a tirosinaquinase (por exemplo, Lck) . Os exemplos não limitantes de CD4 podem ser encontrados em GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAC36010.1, CAA72740.1, AFK73394.1, CAA60883.1 e AAH25782.1. Sequências de polinucleotídeos e de polipeptídeos de CD4 exemplares estão listadas na Listagem de Sequências Exemplar fornecida abaixo.
[057] O termo sequência de salto de ribossomo se refere a qualquer sequência que possa ser introduzida entre duas ou mais sequências gênicas sob o controle do mesmo promotor, de
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36/222 modo que as sequências gênicas sejam traduzidas como polipeptídeos separados (ou seja, traduzidas como sequências bicistrônicas ou multicistrônicas) . Exemplos de sequências de salto de ribossomo incluem, sem limitação, sequências de peptídeo 2A. Em uma modalidade, uma sequência de salto de ribossomo é introduzida entre as sequências gênicas. Em outra modalidade, duas ou mais sequências de salto de ribossomo são introduzidas entre as sequências gênicas.
[058] O termo sequência de salto de ribossomo 2A se refere a uma sequência de peptídeos que compreende o motivo de consenso de Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro, em que X significa qualquer aminoácido. Em uma modalidade, a sequência de salto de ribossomo 2A compreende ou, alternativamente, consiste basicamente ou ainda consiste em tescovírus suíno-1 2A (P2A); T2A, vírus Thosea asigna 2A (T2A) ; vírus da rinite equina A (ERAV) 2A (E2A) ; FMDV 2A (F2A), ou a combinação destes. Exemplos não limitantes de sequências de peptídeo 2A incluem, sem limitação, aquelas sequências fornecidas na Listagem de Sequências Exemplar fornecida abaixo.
[059] As sequências de salto de ribossomo 2A permitem a expressão de múltiplos genes em um vetor de expressão. Por exemplo, um vetor de expressão com a sequência de salto de ribossomo 2A pode expressar todas as quatro proteínas que constituem o complexo de CD3. Em uma modalidade, uma sequência da região codificadora não limitante exemplar do vetor de expressão está listada na Listagem de Sequências Exemplar fornecida abaixo como: sequência de polinucleotídeos de CD3-delta-F2A-gama-T2A-épsilon-P2A-zeta murídea e sequência de polipeptídeos de CD3-delta-F2A-gama
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T2A-épsilon-P2A-zeta murídea, e equivalentes de cada uma dessas.
[060] Em outro aspecto, um vetor de expressão com a sequência de salto de ribossomo 2A pode expressar múltiplas subunidades de TCR. Em algumas modalidades, as sequências não limitantes exemplares da região codificadora do vetor de expressão são fornecidas nos IDS. DE SEQ. Nos: 527 a 531 (IGRP13-25 TCR) , 533 a 537 (IGRP13-25 TCR Murinizado) , 538 a 542 (PPI76-90 TCR) , ou 543 a 547 (BDC 2.5 TCR).
[061] O termo sequência IRES ou sequência de sítio interno de entrada de ribossomos se refere a uma sequência de nucleotídeos que permite a iniciação da tradução no meio de uma sequência de RNA. Em algumas modalidades, a inserção de uma sequência IRES entre duas sequências gênicas (por exemplo, quadros de leitura aberta do repórter) pode dirigir a tradução da região codificadora de proteína a jusante independentemente da estrutura 5'-cap ligada à extremidade 5' da molécula de mRNA. Sequências IRES adequadas são conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, as sequências IRES derivam de poliovírus, rinovírus, vírus da encefalomiocardite, vírus da febre aftosa, vírus da hepatite A, vírus da hepatite C, vírus da febre suína clássica e vírus da diarréia bovina viral. Exemplos não limitantes de sequências IRES podem ser encontrados em www.iresite.org, que é incorporado por referência em sua totalidade. Os exemplos não limitantes de sequências IRES são fornecidos nos IDS. DE SEQ. Nos: 524 a 526 e incluem, sem limitação: sequência IRES de EMCV, sequência IRES de pBagl e sequência IRES sintética, e equivalentes de cada uma dessas.
[062] 0 termo luciferase significa uma proteína que
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38/222 pode catalisar uma reação bioluminescente. Por exemplo, uma luciferase como uma enzima pode produzir um sinal quando fornecida com um substrato (por exemplo, luciferina, aldeído de cadeia longa ou colentrazina), qualquer fonte de energia (por exemplo, ATP) , e oxigênio. Sequências de luciferase adequadas para essa revelação são conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o gene de luciferase é do vaga-lume (por exemplo, Photinus pyralis) . Exemplos não limitantes de sequências de luciferase podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAR20792.1, AAL40677.1, AAL40676.1 e AAV35379.1, e equivalentes de cada um desses. 0 sistema de repórter de luciferase está disponível comercialmente (por exemplo, N° de Catálogo Promega E1500 ou E4550). Polinucleotídeos exemplares que codificam uma proteína de luciferase e o polipeptídeo são fornecidos nos IDS. DE SEQ. Nos: 555 e 556, como fornecido abaixo.
[063] O termo beta-lactamase se refere a uma enzima ou proteína que pode degradar um anel de beta-lactama. Em uma modalidade, beta-lactamase é uma enzima produzida por bactérias, que pode hidrolisar o anel de beta-lactama em um antibiótico betalactâmico, parcial ou completamente. Exemplos não limitantes de sequências de beta-lactamase can podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AMM70781.1, CAA54104.1 e AAA23441.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017.
[064] O termo cloranfenicol acetiltransferase ou CAT se refere a uma enzima ou proteína que pode transferir um grupo acetil de coenzima A acetilada para cloranfenicol ou
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39/222 um derivado relacionado. Exemplos não limitantes de CAT podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso OCR39292.1, WP_072643749.1, CUB58229.1 e KIX82948.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. Os ensaios de CAT estão disponíveis comercialmente (por exemplo, FAST CAT® Chloramphenicol Acetyltransferase Assay Kit (F-2900) de Thermal Fisher).
[065] O termo fosfatase alcalina embrionária secretada ou SEAP se refere a uma enzima codificada por um gene SEAP (por exemplo, N° de Acesso no GenBank NP 001623 e equivalentes deste, acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017), que é usado como um repórter para estudar a atividade promotora ou expressão gênica. Exemplos não limitantes de sequências de SEAP podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank ADV10306.1, AAB64404.1, EEB84921.1 e EFD70636.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. A atividade de SEAP pode ser medida por um luminômetro (por exemplo, Turner BioSystems Veritas Microplate Luminometer de Promega).
[066] O termo proteina fluorescente se refere a qualquer proteina capaz de emitir luz quando excitada com radiação eletromagnética apropriada, e que possui uma sequência de aminoácidos que é natural ou criada por engenharia genética e é derivada da sequência de aminoácidos da proteina fluorescente relacionada à Aequorea. A emissão de luz pela proteina fluorescente pode ser determinada por leitoras fluorescentes (por exemplo, a leitora FL600 Fluorescence Microplate). Exemplos não limitantes de proteina fluorescente incluem Proteina Verde (GFP), Proteina
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Fluorescente Verde Intensificada (eGFP), Proteína Fluorescente Azul (BFP), Proteína Fluorescente Amarela (YFP), Proteína Fluorescente Ciano (CFP), Proteína Fluorescente Vermelha (RFP), ou qualquer outra proteína fluorescente adequada, ou combinação destas, ou partes fluorescentes ou derivados destas. As 'sequências de proteínas fluorescentes podem ser localizadas no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AFA52654.1, ACS44348.1 e AAQ96629.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. Os repórteres promotores de proteína fluorescente estão disponíveis comercialmente (por exemplo, N° de Catálogo TakaRa 63108 9) .
[067] O termo sob o controle transcricional é um termo bem compreendido na técnica e indica que a transcrição de uma sequência de polinucleotídeos, normalmente uma sequência de DNA, depende de estar ligada operativamente a um elemento que contribui para a iniciação, ou promove, a transcrição. O termo ligada operativamente significa que os polinucleotídeos estão dispostos de uma forma que permite que eles funcionem em uma célula.
[068] O termo codifica, como ele é aplicado aos polinucleotídeos, se refere a um polinucleotídeo que é dito que codifica um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para o polipeptídeo e/ou um fragmento deste. A fita anti-senso é o complemento desse ácido nucleico, e a sequência codificadora pode ser deduzida a partir dela.
[069] O termo promotor se refere a uma região de DNA
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41/222 que inicia a transcrição de um gene particular. 0 promotor inclui o promotor central, que é a porção minima do promotor necessária para iniciar adequadamente a transcrição e também pode incluir elementos reguladores como, por exemplo, sitios de ligação ao fator de transcrição. Os elementos reguladores podem promover a transcrição ou inibir a transcrição. Elementos reguladores no promotor podem ser sitios de ligação para ativadores transcricionais ou repressores transcricionais. Um promotor pode ser constitutivo ou induzivel. Um promotor constitutivo se refere àquele que está sempre ativo e/ou constantemente dirige a transcrição de um gene acima de um nivel basal de transcrição. Exemplos não limitantes desses incluem o promotor de fosfoglicerato quinase 1 (PGK); SSFV, CMV, MNDU3, SV40, Efla, UBC e CAGG. Um promotor induzivel é aquele que é capaz de ser induzido por uma molécula ou um fator adicionado à célula ou expresso na célula. Um promotor induzivel ainda pode produzir um nivel basal de transcrição na ausência de indução, mas a indução tipicamente leva a significantemente mais produção da proteina.
[070] Um intensificador é um elemento regulador que aumenta a expressão de uma sequência-alvo. Um promotor/ intensificador é um polinucleotídeo que contém sequências capazes de fornecer funções tanto promotoras quanto intensificadoras. Por exemplo, as repetições terminais longas de retrovirus contêm funções tanto promotoras quanto intensificadoras. O intensificador/promotor pode ser endógeno ou exógeno ou heterólogo. Um intensificador/ promotor endógeno é aquele que está naturalmente ligado com certo gene no genoma. Um intensificador/promotor
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42/222 exógeno ou heterólogo é aquele que é colocado em justaposição a um gene por meio de manipulação genética (ou seja, técnicas de biologia molecular), de modo que a transcrição daquele gene seja dirigida pelo intensificador/promotor ligado. Os polinucleotídeos dessa revelação opcionalmente compreendem uma sequência intensificadora.
[071] Como usado nesse relatório descritivo, o termo promotor de NFAT, sequência de DNA de ligação ao fator de transcrição NFAT ou promotor de fator nuclear de células T ativadas se refere a uma sequência que compreende, consiste basicamente ou ainda consiste em um ou mais elementos de NFAT. Em uma modalidade, a ligação de um promotor de NFAT por um fator de transcrição NFAT (por exemplo, NFATcl, NFATc2, NFATc3, NFATc4 ou NFAT5) aumenta ou promove a transcrição de sequências a jusante (por exemplo, um repórter). As sequências promotoras de NFAT estão geralmente no GenBank, que incluem, sem limitação, as seguintes sequências do GenBank nos Nos de Acesso DQ904462.1, KX591058.1, AF480838.1, e equivalentes de cada um desses, ou uma sequência com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade desses.
[072] Como usado nesse relatório descritivo, o termo promotor de AP-1 ou sequência de DNA de ligação ao fator de transcrição AP-1 se refere a uma sequência que compreende ou, alternativamente, que consiste basicamente em, ou ainda que consiste em um ou mais elementos de ativação transcricional AP-1. Em uma modalidade, a ligação de um promotor de AP-1 por um fator de transcrição AP-1 aumenta ou promove a transcrição de sequências a jusante (por exemplo,
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43/222 um repórter como luciferase ou CAT). 0 promotor de AP-1 pode derivar da espécie humana, de camundongo, rato, peixe-zebra, moscas, ou qualquer outra espécie. Em uma modalidade, o promotor de AP-1 possui uma sequência de ATGAGTCAT, e equivalentes desta, ou uma sequência com pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100% de identidade de sequência equivalente a ATGAGTCAT.
[073] Como usado nesse relatório descritivo, o termo promotor de NF-κΒ ou sequência de DNA de ligação ao fator de transcrição NF-κΒ se refere a uma sequência que compreende ou, alternativamente, que consiste basicamente em, ou ainda que consiste em um ou mais elementos de NF-κΒ. Em uma modalidade, a ligação de fatores de transcrição Rei/NF-κΒ, como um homodímero ou heterodímero, ao promotor de NF-κΒ aumenta ou inicia a transcrição de sequências a jusante (por exemplo, um repórter como luciferase ou CAT) . Algumas modalidades do promotor ou sítio de ligação ao NFkB são revelados na Patente U.S. N° 8.299.237, que é incorporada por referência em sua totalidade.
[074] Como usado nesse relatório descritivo, o termo promotor de IL-2 ou sequência de DNA de ligação ao fator de transcrição IL-2 se refere a uma sequência que compreende ou, alternativamente, que consiste basicamente em, ou ainda que consiste em um ou mais elementos de ativação transcricional de IL-2 que respondem à estimulação de célula T. Em uma modalidade, a ligação de fatores de transcrição ao promotor de IL-2 aumenta ou inicia a transcrição de sequências a jusante (por exemplo, um repórter como luciferase ou CAT) . Em uma modalidade, o promotor de IL-2 deriva de humanos, camundongo, rato ou peixe-zebra. Algumas
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44/222 sequências não limitantes exemplares promotoras de IL-2 são acessíveis no GenBank nos Nos de Acesso AJ006884.1, EF397241.1, AB041341.1, KU058846.1, EF457240.1 e HM802330.1, e equivalentes de cada um desses, acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017.
[075] Como usado nesse relatório descritivo, o termo vetor se refere a um ácido nucleico não cromossômico que compreende um replicon intacto, de tal modo que o vetor possa ser replicado quando colocado dentro de uma célula, por exemplo, por um processo de transformação. Vetores podem ser virais ou não virais. Vetores virais incluem retrovirus, lentivirus, adenovirus, herpesvirus, baculovirus, baculovirus modificados, papovirus, ou virus de ocorrência natural de algum outro modo modificados. Vetores não virais exemplares para a liberação de ácido nucleico incluem DNA naked; DNA complexado com lipideos catiônicos, isoladamente ou em combinação com polímeros catiônicos; lipossomos aniônicos e catiônicos; complexos de DNA-proteina e partículas que compreendem DNA condensado com polímeros catiônicos como, por exemplo, polilisina heterogênea, oligopeptideos de comprimento definido e polietileno imina, em alguns casos contidos em lipossomos; e o uso de complexos ternários que compreendem um virus e polilisina-DNA.
[07 6] Um vetor viral é definido como um virus ou partícula viral produzida recombinantemente que compreende um polinucleotídeo a ser liberado em uma célula hospedeira, in vivo, ex vivo ou in vitro. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores lentivirais, vetores adenovirais, vetores de virus adeno-associado, vetores de alfavirus e semelhantes. Vetores de alfavirus, por exemplo,
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45/222 vetores baseados no vírus de Semliki Forest e vetores baseados no vírus Sindbis, também foram desenvolvidos para uso em terapia gênica e imunoterapia. Veja, Schlesinger e Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5: 434-439 e Ying, e cols. (1999) Nat. Med. 5 (7): 823-827.
[077] Em aspectos nos quais a transferência gênica é mediada por um vetor lentiviral, uma construção de vetor se refere ao polinucleotídeo que compreende o genoma lentiviral ou parte deste, e um gene terapêutico. Como usado nesse relatório descritivo, o termo transferência gênica mediada por lentivírus ou transdução lentiviral carrega o mesmo significado e se refere ao processo pelo qual um gene ou sequências de ácidos nucleicos são transferidas estavelmente na célula hospedeira em consequência da entrada do vírus na célula e integração de seu genoma no genoma da célula hospedeira. O vírus pode entrar na célula hospedeira por meio de seu mecanismo de infecção normal ou ser modificado de modo a se ligar a um receptor ou ligante diferente da superfície da célula hospedeira para entrar na célula. Retrovírus carregam sua informação genética na forma de RNA; no entanto, depois que o vírus infecta uma célula, o RNA é transcrito de forma reversa na forma de DNA que se integra no DNA genômico da célula infectada. A forma de DNA integrado é denominada um pró-vírus. Como usado nesse relatório descritivo, o termo vetor lentiviral se refere a uma partícula viral capaz de introdução de ácido nucleico exógeno em uma célula por meio de um mecanismo de entrada viral ou viral-like. Um vetor lentiviral é um tipo de vetor retroviral bem conhecido na técnica que possui certas vantagens na transdução de células que não estão em divisão
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46/222 quando comparado com outros vetores retrovirais. Veja, Trono D. (2002) Lentiviral Vectors, Nova York: Spring-Verlag Berlin Heidelberg.
[078] Os vetores lentivirais dessa invenção se baseiam ou são derivados de oncorretrovírus (o subgrupo de retrovírus que contém MLV), e lentivírus (o subgrupo de retrovírus que contém HIV). Exemplos incluem ASLV, SNV e RSV, todos tendo sido divididos em componentes de empacotamento e de vetor para sistemas de produção de partícula de vetor lentiviral. A partícula de vetor lentiviral de acordo com a invenção pode se basear em uma versão geneticamente ou de algum outro modo (por exemplo, por escolha específica do sistema de célula de empacotamento) alterada de um retrovírus particular.
[07 9] O fato de a partícula de vetor de acordo com a invenção se basear em um retrovírus particular significa que o vetor é derivado daquele retrovírus particular. O genoma da partícula de vetor compreende componentes daquele retrovírus como um arcabouço. A partícula de vetor contém componentes essenciais do vetor compatíveis com o genoma de RNA, incluindo sistemas de transcrição reversa e integração. Normalmente esses incluirão proteínas gag e pol derivadas do retrovírus particular. Dessa forma, a maioria dos componentes estruturais da partícula de vetor normalmente será derivada daquele retrovírus, embora possa ter sido alterada geneticamente ou de algum outro modo a fim de fornecer propriedades úteis desejadas. No entanto, certos componentes estruturais e, em particular, as proteínas env, podem se originar de um vírus diferente. A gama de hospedeiros do vetor e os tipos de células infectadas ou
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47/222 transduzidas podem ser alterados por utilização de genes de env diferentes no sistema de produção de partícula de vetor para dar à partícula de vetor uma especificidade diferente.
[080] Como usado nesse relatório descritivo, o termo Jurkat se refere a uma linhagem de célula de linfócito humano. Há tipos diferentes de célula Jurkat. Em uma modalidade, a célula Jurkat é capaz de produção de IL-2. A célula Jurkat está disponível comercialmente ou por um repositório de linhagem de células (por exemplo, N° ATCC TIB-152), e métodos e composições para o cultivo da célula são nele descritos.
[081] Como usado nesse relatório descritivo, o termo JurMa ou Jurkat/ΜΑ se refere a uma linhagem de célula Jurkat desprovida de expressão endógena de TCR. Uma modalidade das células JurMa foi estabelecida pelo Dr. Erik Hooijberg Vrije em Universiteit Medisch Centrum, Amsterdam (veja Asai e cols., PLoS One. 8 (2): e56820 (2013), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017.
[082] Como usado nesse relatório descritivo, o termo BW5147 se refere a uma linhagem de célula de linfócito, que pode ser usada para estudar função de célula T. Em algumas modalidades, células BW5147 derivam do linfoma. Há muitos tipos de células BW5147, que estão disponíveis comercialmente ou por um repositório de linhagem de células (por exemplo, N° ATCC TIB-472), e métodos e composições para o cultivo da célula são nele descritos.
[083] Como usado nesse relatório descritivo, o termo HuT-78 se refere a uma linhagem de célula de linfócito. Em uma modalidade, a HuT-78 é uma linhagem de célula de linfoma de célula T. As células HuT-78 estão disponíveis
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48/222 comercialmente (por exemplo, Sigma-Aldrich) ou por um repositório de linhagem de células (por exemplo, N° ATCC TIB-161), e métodos e composições para o cultivo da célula são nele descritos.
[084] Como usado nesse relatório descritivo, o termo CEM se refere a uma linhagem de célula de linfócito. Em uma modalidade, a célula CEM é uma célula de linfoblasto do sangue periférico. As células CEM estão disponíveis por um repositório de linhagem de células (por exemplo, ATCC Nos CRL-2265 ou CCL-119), e métodos e composições para o cultivo da célula são nele descritos.
[085] Como usado nesse relatório descritivo, o termo Molt -4 se refere a uma linhagem de célula de linfócito. Em uma modalidade, a célula Molt-4 é uma célula de leucemia linfoblástica aguda. As células Molt-4 estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Sigma-Aldrich) ou por um repositório de linhagem de células (por exemplo, N° ATCC CRL-1582), e métodos e composições para o cultivo da célula são nele descritos.
[086] O termo valência está relacionado ao o número de pMHCs por núcleo de nanopartícula, ou coestimulatória por nanopartícula, e/ou citocina por núcleo de nanopartícula.
[087] O termo densidade, quando se refere à pMHC por núcleo de nanopartícula, ou coestimulatórias por nanopartícula, e/ou citocina por núcleo de nanopartícula, é calculada como a área de superfície do núcleo de nanopartícula com camadas externas, que também pode incluir vinculadores. A área de superfície é a área de superfície disponível total da construção usada.
[088] O termo antígeno, como usado nesse relatório
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49/222 descritivo, se refere a toda, parte, fragmento ou segmento de uma molécula que pode induzir uma resposta imune em um indivíduo ou a uma expansão de uma célula imune, preferivelmente uma célula T ou B. Em um aspecto, o antígeno é um antígeno relevante para câncer. Em outro aspecto o antígeno é um antígeno relevante para um distúrbio autoimune. Em um aspecto adicional, o antígeno é um alérgeno.
[089] 0 termo alquil se refere aos grupos hidrocarbil monovalentes saturados alifáticos que possuem de 1 a 10 átomos de carbono (ou seja, Ci-Cio alquil) ou 1 a 6 átomos de carbono (ou seja, Ci-Cs alquil) ou 1 a 4 átomos de carbono. Esse termo inclui, apenas como exemplo, grupos hidrocarbil lineares e ramificados como, por exemplo, metil (CH3-) , etil (CH3CH2-) , n-propil (CH3CH2CH2-) , isopropil ((CH3)2CH-), nbutil (CH3CH2CH2CH2-) , isobutil ( (CH3) 2CHCH2-) , sec-butil ( (CH3) (CH3CH2) CH-) , t-butil ((CH3)3C-), n-pentil (CH3CH2CH2CH2CH2-) e neopentil ( (CH3) 3CCH2-) .
[090] O termo alcóxi se refere a -O-alquil.
[091] Um mimético é um análogo de certo ligante ou peptídeo, em que o análogo é substancialmente similar ao ligante. Substancialmente similar significa que o análogo possui um perfil de ligação similar ao ligante, exceto que o mimético possui um ou mais grupos funcionais ou modificações que coletivamente são responsáveis por menos do que cerca de 50%, menos do que cerca de 40%, menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 10%, ou menos do que cerca de 5% do peso molecular do ligante.
[092] O termo células imunes inclui, por exemplo, células sanguíneas brancas (leucócitos) que são derivadas de
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50/222 células-tronco hematopoiéticas (HSC) produzidas na medula óssea, linfócitos (células T, células B, células naturalkiller (NK)) e células de derivação mielóide (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas) . Como usado nesse relatório descritivo, o termo célula B, se refere a um tipo de linfócito na imunidade humoral do sistema imune adaptivo. Células B funcionam principalmente para produzir anticorpos, servem como células apresentadoras de antígeno, liberam citocinas e desenvolvem células B de memória após ativação por interação com antígeno. As células B são distinguidas de outros linfócitos, por exemplo, células T, pela presença de um receptor de célula B na superfície celular. Como usado nesse relatório descritivo, o termo célula T, se refere a um tipo de linfócito que amadurece no timo. As células T têm um papel importante na imunidade mediada por células e são distinguidas de outros linfócitos, por exemplo, células B, pela presença de um receptor de célula T na superfície celular. As células T podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. O termo célula T inclui todos os tipos de células imunes que expressam CD3, incluindo células T-auxiliares (helper) (células CD4 + ) , células T citotóxicas (células CD8 + ) , células T natural-killer, células T reguladoras (Treg) e células T gama-delta. Uma célula citotóxica inclui células T CD8+, células naturalkiller (NK) e neutrófilos, cujas células são capazes de mediar respostas de citotoxicidade.
[093] O termo células T efetoras, como usado nesse relatório descritivo, se refere às células T que podem se ligar especificamente a um antígeno e mediar uma resposta
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51/222 imune (função efetora), sem a necessidade de diferenciação adicional. Exemplos de células T efetoras incluem CTLs, células ThI, células Th2, células efetoras de memória e células T-auxiliares. Em contraste com células T efetoras, células T naive não encontraram seu complexo antigeno/MHC especifico, nem responderam a ele por proliferação e diferenciação em uma célula T efetora. Células T efetoras podem estar em repouso (na fase GO do ciclo celular) ou ativadas (proliferantes).
[094] O termo célula T autorreativa antipatogênica se refere a uma célula T com propriedades antipatogênicas (ou seja, células T que contra-atacam uma doença autoimune como, por exemplo, MS, uma doença ou distúrbio relacionado à MS, ou pré-diabetes) . Essas células T podem incluir células T antiinflamatórias, células T centrais de memória, células T efetoras de memória, células T de memória, células T de baixa avidez, células T auxiliares, células T autorregulatórias, células T citotóxicas, células T natural-killer, células T reguladoras, células TrI, células T supressoras, células T CD4 + , células T CD8+ e semelhantes.
[095] O termo célula T antiinflamatória se refere a uma célula T que promove uma resposta antiinflamatória. A função antiinflamatória da célula T pode ser obtida por meio da produção e/ou secreção de proteínas antiinflamatórias, citocinas, quimiocinas e semelhantes. Proteínas antiinflamatórias também visam englobar sinais antiproliferativos que suprimem respostas imunes. Proteínas antiinflamatórias incluem IL-4, IL-10, IL-13, IL-21, IL-23, IL-27, IFN-a, TGF-β, IL-lra, G-CSF e receptores solúveis para TNF e IL-6.
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[096] O termo diferenciada se refere a quando uma célula de um primeiro tipo é induzida ao desenvolvimento em uma célula de um segundo tipo. Em algumas modalidades, uma célula T cognata é diferenciada em uma célula regulatória TrI. Em algumas modalidades, uma célula T ativada é diferenciada em uma célula TrI . Em algumas modalidades, uma célula T de memória é diferenciada em uma célula TrI . Em algumas modalidades, uma célula B é diferenciada em uma célula B reguladora.
[097] Como usado nesse relatório descritivo, o termo knob-in-hole se refere a uma arquitetura de polipeptidil que necessita de uma protuberância (ou knob) em uma interface de um primeiro polipeptídeo e uma cavidade correspondente (ou um hole) em uma interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de modo a promover a formação de heteromultimero. Protuberâncias são construídas por substituição de cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais maiores (por exemplo, fenilalanina ou tirosina). Cavidades de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo por substituição de cadeias laterais de aminoácidos maiores com aquelas menores (por exemplo, alanina ou treonina). As protuberâncias e cavidades podem ser feitas por meios sintéticos, por exemplo, por alteração do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, ou por síntese de peptídeo, usando métodos de rotina para aqueles habilitados na técnica. Em algumas modalidades, a interface do primeiro polipeptídeo está localizada em um domínio Fc no primeiro polipeptídeo; e a
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53/222 interface do segundo polipeptídeo está localizada em um domínio Fc no segundo polipeptídeo. Heteromultímeros knobin-hole e métodos de sua preparação e uso são revelados nas Patentes U.S. Nos 5.731.168, 5.807.706, 5.821.333, 7.642.228, 7.695.936, 8.216.805 e 8,679,785, todas incorporadas por referência nesse relatório descritivo em sua totalidade.
[098] Como usado nesse relatório descritivo, o termo MHC-alfa-Fc/MHC-beta-Fc se refere um heterodímero que compreende um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma cadeia-α de MHC da Classe II e um domínio Fc de anticorpo; o segundo polipeptídeo compreende uma cadeia-β de MHC da Classe II e um domínio Fc de anticorpo. Um MHC-alfa-Fc/MHCbeta-Fc knob-in-hole ainda exige que os domínios Fc de cada polipeptídeo façam interface entre eles por meio do posicionamento complementar de uma protuberância em um domínio Fc dentro da cavidade correspondente no outro domínio Fc.
[099] O termo isolado significa separado de constituintes celulares e outros, com os quais o polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmentos destes, estão normalmente associados na natureza. Por exemplo, com relação a um polinucleotídeo, um polinucleotídeo isolado é aquele que está separado das sequências 5' e 3' com as quais está normalmente associado no cromossomo. Como é evidente para aqueles na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmento (fragmentos) destes, de ocorrência não natural não necessita de isolamento para distingui-lo de sua contraparte de ocorrência natural. Além disso, um
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54/222 polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmento (fragmentos) destes, concentrado, separado ou diluído é distinguível de sua contraparte de ocorrência natural na medida em que a concentração ou o número de moléculas por volume é maior do que concentrado ou menor do que separado, do que aquela de sua contraparte de ocorrência natural. Um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo ou fragmento (fragmentos) destes, que difere da contraparte de ocorrência natural em sua sequência primária ou, por exemplo, por seu padrão de glicosilação, não precisa estar presente em sua forma isolada, na medida em que é distinguível de sua contraparte de ocorrência natural por sua sequência primária ou, alternativamente, por outra característica como, por exemplo, seu padrão de glicosilação. Uma célula de mamífero, por exemplo, célula T, é isolada caso seja removida do local anatômico do qual é encontrada em um organismo.
[100] Uma célula T autorreativa é uma célula T que reconhece um autoantígeno, que é uma molécula produzida e contida pelo mesmo indivíduo que contém a célula T.
[101] Uma célula T patogênica é uma célula T que é danosa a um indivíduo que contém a célula T, enquanto uma célula T não patogênica não é substancialmente danosa a um indivíduo, e uma célula T antipatogênica reduz, melhora, inibe ou impede o dano de uma célula T patogênica.
[102] Como usados nesse relatório descritivo, os termos células B reguladoras ou células B reguladoras (B-regs) significam aquelas células que são responsáveis pelo efeito antiinflamatório, que é caracterizado pela expressão de CDld, CD5 e pela secreção de IL-10. B-regs também são
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55/222 identificadas por expressão de Tim-1 e podem ser induzidas por meio de ligação de Tim-1 para promover tolerância. Foi demonstrado que a habilidade de B-regs é dirigida por muitos fatores estimulatórios como, por exemplo, receptores tolllike, ligante de CD40e outros. No entanto, a caracterização plena de B-regs está em andamento. B-regs também expressam niveis elevados de CD25, CD86 e TGF-β. Esse subconjunto de células B é capaz de suprimir a proliferação de Thl contribuindo, dessa forma, para a manutenção de autotolerância. A potenciação da função de B-reg deve se tornar o objetivo de muitos fármacos imunomoduladores, contribuindo para um controle melhor de doenças autoimunes. Veja, por exemplo: ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23707422, acessado pela última vez em 31 de outubro de 2013.
[103] Células T Regulatórias do Tipo 1 (TrI) são um subconjunto de células T CD4+ que possuem propriedades regulatórias e são capazes de suprimir respostas imunes antigeno-especificas in vitro e in vivo. Essas células TrI são definidas por seu perfil único de produção de citocina e produzem niveis elevados de IL-10 e TGF-beta, mas não produzem IL-4 ou IL-2. A IL-10 e TGF-beta produzidos por essas células medeiam a inibição de células T primárias naive in vitro. Também há evidências de que células Tr existem in vivo, e a presença de células T CD4(+) altamente produtoras de IL-10 em pacientes com imunodeficiência combinada severa que receberam transplantes alogênico de célula-tronco foi documentada. Células TrI estão envolvidas na regulação de tolerância periférica e elas poderiam potencialmente ser usadas como uma terapia celular para modular as respostas imunes in vivo. Veja, por exemplo:
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56/222 ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10887343, acessado pela última vez em 31 de outubro de 2013.
[104] As células TrI são definidas por sua habilidade para produzir niveis elevados de IL-10 e TGF-beta. Células TrI especificas para diversos antigenos surgem in vivo, mas também podem se diferenciar a partir de células T naive CD4+ na presença de IL-10 in vitro. As células TrI possuem uma capacidade proliferativa baixa, o que pode ser superado por IL-15. As células TrI suprimem respostas T auxiliares naive e de memória do tipo 1 ou 2 por meio da produção de IL-10 e TGF-beta. A caracterização adicional de células TrI no nivel molecular definirá seus mecanismos de ação e esclarecerá seu relacionamento com outros subconjuntos de células TR. O uso de células TrI para identificar novos alvos para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos, e como uma terapia celular para modular a tolerância periférica, pode ser previsto. Veja, por exemplo, ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11722624, acessado pela última vez em 31 de outubro de 2013.
[105] 0 termo uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para obter o objetivo desejado, cujos exemplos não limitantes incluem complexação de receptores de célula T, inicio da resposta imune, modulação da resposta imune, supressão de uma resposta inflamatória e modulação da atividade de célula T ou populações de células T. Em uma modalidade, a quantidade eficaz é aquela que é suficiente para estimular a via de TCR de uma célula-alvo. Em um aspecto, a quantidade eficaz é aquela que funciona para obter um objetivo terapêutico estabelecido, ou seja, uma quantidade terapeuticamente eficaz ou para fornecer uma
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57/222 resposta mensurável. Como descrito nesse relatório descritivo em detalhe, a quantidade eficaz, ou dosagem, depende da finalidade e da composição, e pode ser determinada de acordo com a presente revelação.
[106] Uma quantidade eficaz de composição terapêutica é determinada com base no objetivo desejado. O termo dose unitária ou dosagem se refere às unidades fisicamente distintas adequadas para uso em um indivíduo, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição calculada para produzir as respostas desejadas discutidas acima em associação com sua administração, ou seja, a via e regime apropriados. A quantidade a ser administrada, tanto de acordo com o número de tratamentos quanto com a dose unitária, depende do resultado e/ou proteção desejados. As quantidades precisas da composição também dependem da avaliação do profissional e são peculiares a cada indivíduo. Fatores que afetam a dose incluem estado físico e clínico do indivíduo, a via de administração, o objetivo desejado do tratamento (alívio de sintomas versus cura), e potência, estabilidade e toxicidade da composição particular. Mediante formulação, as soluções serão administradas de uma forma compatível com a formulação da dosagem e em uma quantidade tal que seja terapeuticamente ou profilaticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas em diversas formas de dosagem, por exemplo, no tipo de soluções injetáveis descrito acima.
[107] Um multímero de MHC, como o termo é usado nesse relatório descritivo, significa um complexo de dois ou mais, normalmente quatro, até cerca de cinquenta ou mais monômeros de MHC.
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[108] Como usado nesse relatório descritivo, o termo complexo de multímero se refere a um complexo entre uma população de célula-alvo e um ou mais complexos de pMHC, em que a proteína MHC do complexo de pMHC compreende uma forma multimérica da proteína MHC. Em algumas modalidades, a forma multimérica da proteína MHC inclui dímero, um trímero, um tetrâmero, um pentâmero ou um dextrâmero.
[109] Como usada nesse relatório descritivo, a frase resposta imune ou seu equivalente resposta imunológica, se refere ao desenvolvimento de a resposta mediada por células (mediada por células T antígeno-específicas ou seus produtos de secreção). Uma resposta imune celular é provodada pela apresentação de epítopos polipeptídicos em associação com moléculas de MHC da Classe I ou Classe II, para tratar ou evitar uma infecção viral, expandir células Breg antígenoespecíficas, TC1, células T auxiliares CD4+ e/ou células T citotóxicas CD8 + e/ou geradas por doença, célula T e célula B autorregulatórias e células de memória. A resposta também pode envolver a ativação de outros componentes. Em alguns aspectos, o termo resposta imune pode ser usado para englobar a formação de uma rede regulatória de células imunes. Dessa forma, o termo formação de rede regulatória pode se referir a uma resposta imune provoxada de tal forma que uma célula imune, preferivelmente uma célula T, mais preferivelmente uma célula T reguladora, desencadeie diferenciação adicional de outras células imunes, por exemplo, sem limitação, células B ou células apresentadoras de antígeno - cujos exemplos não limitantes incluem células dendríticas, monócitos e macrófagos. Em certas modalidades, a formação de rede regulatória envolve células B sendo
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59/222 diferenciadas em células B reguladoras; em certas modalidades, a formação de rede regulatória envolve a formação de células apresentadoras de antígeno tolerogênicas.
[110] Como usado nesse relatório descritivo, o termo nanoesfera, NP ou nanopartícula significa uma pequena partícula distinta que é administrada isoladamente ou pluralmente a um indivíduo, amostra de célula ou amostra de tecido, como apropriado. Em certas modalidades, o termo nanopartícula, como usado nesse relatório descritivo, inclui quaisquer camadas em torno do núcleo de nanopartícula e, dessa forma, inclui o núcleo com e sem uma camada como, por exemplo, uma camada vinculadora. Em certas modalidades, as nanopartícuias têm formato substancialmente esférico. Em certas modalidades, a nanopartícula não é um lipossomo ou uma partícula viral. Em modalidades adicionais, a nanopartícula é composta por qualquer material apropriado, por exemplo, um sólido, um núcleo sólido, um metal, um dendrímero, uma micela polimérica, um óxido metálico ou uma proteína, ou fragmento ou combinações destes. O termo substancialmente esférica, como usado nesse relatório descritivo, significa que o formato das partículas não se desvia de uma esfera por mais do que cerca de 10%.
[111] Os termos resposta inflamatória e inflamação, como usados nesse relatório descritivo, indicam a resposta biológica complexa de tecidos vasculares de um indivíduo a estímulos danosos, por exemplo, patógenos, células danificadas ou irritantes, e inclui secreção de citocinas e, mais particularmente, de citocinas pró-inflamatórias, ou seja, citocinas que são produzidas predominantemente por
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60/222 células imunes ativadas e que estão envolvidas na amplificação de reações inflamatórias. Citocinas próinflamatórias exemplares incluem, sem limitação, IL-1, IL6, IL-10, TNF-α, IL-17, IL21, IL23, IL27 e TGF-β. Inflamações exemplarem incluem inflamação aguda e inflamação crônica. A inflamação aguda indica um processo de curto prazo caracterizado pelos sinais clássicos de inflamação (edema, vermelhidão, dor, calor e perda de função) em consequência da infiltração dos tecidos por plasma e leucócitos. Uma inflamação aguda tipicamente ocorre desde que o estimulo prejudicial esteja presente e cessa após o estimulo ter sido removido, degradado ou isolado por cicatrização (fibrose). A inflamação crônica indica uma condição caracterizada por inflamação ativa concomitante, destruição de tecido e tentativas de reparo. A inflamação crônica não é caracterizada pelos sinais clássicos de inflamação aguda listados acima. Ao contrário, um tecido inflamado cronicamente é caracterizado pela infiltração de células imunes mononucleares (monócitos, macrófagos, linfócitos e células plasmáticas), destruição de tecido e tentativas de cicatrização, que incluem angiogênese e fibrose. Uma inflamação pode ser inibida no sentido da presente revelação afetando-se e, em particular, inibindo-se qualquer um dos eventos que formam a resposta biológica complexa associada a uma inflamação em um indivíduo.
[112] Como usado nesse relatório descritivo, o termo antígeno relevante para doença se refere a um antígeno ou fragmento deste selecionado para tratar uma doença selecionada e está envolvido no processo de doença. Por exemplo, um antígeno relevante para o diabetes é um antígeno
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61/222 ou fragmento deste que, quando apresentado, produz uma resposta imune que serve para tratar diabetes; dessa forma, um antígeno relevante para o diabetes que produz esse efeito é selecionado para tratar diabetes. Um antígeno relevante para esclerose múltipla (MS) é selecionado para tratar MS. Um antígeno relevante para o diabetes não seria selecionado para tratar MS. Similarmente, um antígeno relacionado à autoimunidade é um antígeno que é relevante para uma doença autoimune e não seria selecionado para o tratamento de um distúrbio ou doença diferente de autoimunidade, por exemplo, câncer. Antígenos relevantes para doenças exemplares, não limitantes, são revelados nesse relatório descritivo e, além disso, esses antígenos podem ser determinados para uma doença particular com base em técnicas, mecanismos e métodos documentados na literatura.
[113] 0 termo doença ou distúrbio autoimune inclui doenças ou distúrbios que surgem e são dirigidos contra tecidos ou órgãos do próprio indivíduo ou manifestação destes, ou uma condição que resulta destes. Em uma modalidade, ele se refere a uma condição que resulta, ou é agravada, pela produção por células T que são reativas com tecidos e antígenos normais do corpo. Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, sem limitação, artrite (artrite reumatóide, por exemplo, artrite aguda, artrite reumatóide crônica, gota ou artrite gotosa, artrite gotosa aguda, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite induzida por colágeno do tipo II, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, doença de Still, artrite vertebral e artrite reumatóide de surgimento juvenil,
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62/222 osteoartrite, artrite crônica progressiva, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa e espondilite anquilosante) , doenças da pele inflamatórias hiperproliferativas, psoríase, por exemplo, psoríase em placas, psoríase gutata, psoríase pustulosa e psoríase das unhas, atopia, incluindo doenças atópicas como, por exemplo, febre do feno e síndrome de Job, dermatite, incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite esfoliativa, dermatite alérgica, dermatite de contato alérgica, dermatite herpetiforme, dermatite numular, dermatite seborréica, dermatite não específica, dermatite de contato irritante primária e dermatite atópica, síndrome de hiper-IgM ligada ao X, doenças inflamatórias intra-oculares alérgicas, urticária como, por exemplo, urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo urticária autoimune crônica, miosite, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidérmica tóxica, esclerodermia (incluindo esclerodermia sistêmica), esclerose como, por exemplo, esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) como, por exemplo, MS espino-óptica, MS progressiva primária (PPMS) e MS remitente-recorrente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, esclerose atáxica, distúrbio do espectro da neuromielite óptica (NMO, também conhecido como doença de Devic ou síndrome de Devic), doença inflamatória do intestino (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrintestinais de mediação autoimune, colite como, por exemplo, colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrotizante e colite transmural e doença
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63/222 inflamatória do intestino autoimune), inflamação do intestino, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, sindrome do sofrimento respiratório, incluindo sindrome do sofrimento respiratório do adulto ou aguda (ARDS) , meningite, inflamação de toda ou parte da úvea, irite, coroidite, um distúrbio hematológico autoimune, espondilite reumatóide, sinovite reumatóide, angioedema hereditário, dano de nervo craniano como na meningite, herpes gestacional, penfigóide gestacional, prurido do escroto, insuficiência ovariana prematura autoimune, perda auditiva súbita em consequência de uma condição autoimune, doenças mediadas por IgE como, por exemplo, anafilaxia e rinite alérgica e atópica, encefalite como, por exemplo, encefalite de Rasmussen e encefalite limbica e/ou do tronco cerebral, uveite como, por exemplo, uveite anterior, uveite anterior aguda, uveite granulomatosa, uveite não granulomatosa, uveite facogênica, uveite posterior ou uveite autoimune, glomerulonefrite (GN) com e sem sindrome nefrótica como, por exemplo, glomerulonefrite crônica ou aguda como, por exemplo, GN primária, GN de mediação imune, GN membranosa (nefropatia membranosa), GN membranosa idiopática ou nefropatia membranosa idiopática, GN membrano- ou membranosa proliferativa (MPGN) , incluindo Tipo I e Tipo II e GN rapidamente progressiva, nefrite proliferativa, falência endócrina poliglandular autoimune, balanite incluindo balanite circunscrita plasmacelular, balanopostite, eritema anular centrifugo, eritema dyschromicum perstans, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nitido, liquen escleroso e atrófico, liquen simples crônico, liquen espinuloso, liquen plano, ictiose lamelar, hiperceratose
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64/222 epidermolítica, ceratose pré-maligna, pioderma gangrenoso, condições e respostas alérgicas, reação alérgica, eczema, incluindo eczema alérgico ou atópico, eczema esteatótico, eczema disidrótico e eczema vesicular palmoplantar, asma como, por exemplo, asma bronquial, asma brônquica e asma autoimune, condições que envolvem infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, reações imunes contra antigenos estranhos como, por exemplo, grupos sanguíneos AB-0 fetais durante gravidez, doença pulmonar inflamatória crônica, miocardite autoimune, deficiência de adesão de leucócitos, lúpus, incluindo nefrite lúpica, cerebrite lúpica, lúpus pediátrico, lúpus não renal, lúpus extrarenal, lúpus discóide e lúpus discóide eritematoso, alopecia por lúpus, lúpus eritematoso sistêmico (SLE) como, por exemplo, SLE cutâneo ou SLE cutâneo subagudo, síndrome de lúpus neonatal (NLE) e lúpus eritematoso disseminado, diabetes Tipo I, diabetes Tipo II, diabetes autoimune latente em adultos (ou diabetes Tipo 1,5). Também são contempladas respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, sarcoidose, granulomatose, incluindo granulomatose linfomatóide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculites, incluindo vasculite, vasculite de grande vaso (incluindo polimialgia reumática e arterite de célula gigante (de Takayasu)), vasculite de vaso médio (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa/periarterite nodosa), poliarterite microscópica, imunovasculite, vasculite do SNC, vasculite cutânea, vasculite por hipersensibilidade, vasculite necrotizante como, por exemplo, vasculite necrotizante sistêmica e vasculite associada ao ANCA como,
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65/222 por exemplo, vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS) e vasculite de pequeno vaso associada ao ANCA, temporal arterite, anemia aplásica, anemia aplásica autoimune, anemia Coombs-positiva, anemia de Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica autoimune (AIHA), doença de Addison, neutropenia autoimune, pancitopenia, leucopenia, doenças que envolvem diapedese de leucócitos, distúrbios inflamatórios do SNC, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome de lesão de múltiplos órgãos como, por exemplo, aquelas secundárias à septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana basal antiglomerular, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo, síndrome antifosfolipídeo, neurite alérgica, doença/síndrome de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjõgren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide como, por exemplo, penfigóide bolhoso e penfigóide cutâneo, pênfigo (incluindo pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, pênfigo - penfigóide mucomembranoso e pênfigo eritematoso), poliendocrinopatias autoimunes, doença ou síndrome de Reiter, lesão térmica, pré-eclâmpsia, um distúrbio por complexo imune como, por exemplo, nefrite por complexo imune, nefrite mediada por anticorpo, polineuropatias, neuropatia crônica como, por exemplo, polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia autoimune ou de mediação imune como, por exemplo, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), incluindo ITP crônica ou aguda, púrpura trombocitopênica adquirida, esclerite como, por exemplo, ceratoesclerite idiopática, episclerite, doença autoimune dos testículos e
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66/222 ovário, incluindo orquite e ooforite autoimunes, hipotireoidismo primário, hipoparatireoidismo, doenças endócrinas autoimunes, incluindo tireoidite como, por exemplo, tireoidite autoimune, doença de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite de Hashimoto) ou tireoidite subaguda, doença autoimune da tireóide, hipotireoidismo idiopático, doença de Grave, síndromes poliglandulares como, por exemplo, síndromes poliglandulares autoimunes (ou síndromes de endocrinopatias poliglandulares), síndromes paraneoplásicas, incluindo síndromes paraneoplásicas neurológicas como, por exemplo, síndrome miastênica de Lambert-Eaton ou síndrome de Eaton-Lambert, síndrome do homem rígido ou da pessoa rígida, encefalomielite como, por exemplo, encefalomielite alérgica ou encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE), miastenia grave como, por exemplo, miastenia grave associada a timoma, degeneração cerebelar, neuromiotonia, síndrome de mioclono opsoclono ou opsoclono (OMS) e neuropatia sensorial, neuropatia motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite autoimune, hepatite crônica, hepatite lupóide, hepatite de célula gigante, hepatite ativa crônica ou hepatite ativa crônica autoimune, pneumonite intersticial linfóide (LIP), bronquiolite obliterante (não transplante) vs. NSIP, síndrome de Guillain-Barre, doença de Berger (nefropatia por IgA), nefropatia por IgA idiopática, dermatose por IgA linear, dermatose neutrofílica aguda febril, dermatose pustulosa subcórnea, dermatose acantolítica transitória, cirrose como, por exemplo, cirrose biliar primária e pneumonocirrose, síndrome de enteropatia autoimune, doença celíaca, espru celíaco (enteropatia por
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67/222 glúten), espru refratário, espru idiopático, crioglobulinemia, esclerose amiotrófica lateral (ALS; doença de Lou Gehrig), doença da artéria coronária, doença otológica autoimune como, por exemplo, doença autoimune do ouvido interno (AIED), perda auditiva autoimune, policondrite como, por exemplo, policondrite refratária ou recidivada ou recidivada, proteinose pulmonar alveolar, síndrome de Cogan/ceratite intersticial não sifilítica, paralisia de Bell, doença/síndrome de Sweet, rosácea autoimune, dor associada ao zoster, amiloidose, uma linfocitose não cancerosa, uma linfocitose primária, que inclui linfocitose de célula B monoclonal (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significância não determinada, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplásica, canalopatias como, por exemplo, epilepsia, enxaqueca, arritmia, distúrbios musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica e canalopatias do SNC, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose focal ou segmentai ou focal segmentai (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveorretinite, coriorretinite, distúrbio hepatológico autoimune, fibromialgia, falência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, adrenalite, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças desmielinizantes como, por exemplo, doenças desmielinizantes autoimunes e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, síndrome de Dressler, alopecia areata, alopecia total, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, distúrbio da motilidade esofágica, esclerodactilia e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, por exemplo, em consequência de anticorpos antiespermatozóides, doença mista do tecido
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68/222 conjuntivo, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão do fazendeiro, eritema multiforme, sindrome pós-cardiotomia, sindrome de Cushing, pulmão dos criadores de aves, angiite granulomatosa alérgica, angiite linfocitica benigna, sindrome de Alport, alveolite como, por exemplo, alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença pulmonar intersticial, reação à transfusão, lepra, malária, doenças parasiticas como, por exemplo, leishmaniose, tripanossomiase, esquistossomose, ascaridiase, aspergilose, sindrome de Sampter, sindrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose endomiocárdica, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cistica, endoftalmite, eritema elevatum et diutinum, eritroblastose fetal, fascite eosinofilica, sindrome de Shulman, sindrome de Felty, filariose, ciclite como, por exemplo, ciclite crônica, ciclite heterocrômica, iridociclite (aguda ou crônica) ou ciclite de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infecção pelo virus da imunodeficiência humana (HIV), SCID, sindrome de imunodeficiência adquirida (AIDS), infecção por ecovirus, sépsis, endotoxemia, pancreatite, tireotoxicose, infecção por parvovirus, infecção pelo virus da rubéola, sindromes pós-vacinação, infecção por rubéola congênita, infecção pelo virus de Epstein-Barr, caxumba, sindrome de Evan, insuficiência gonadal autoimune, coréia de Sydenham, nefrite pós-estreptocócica, tromboangeite obliterante, tireotoxicose, tabes dorsalis, coroidite, polimialgia de célula gigante, pneumonite por hipersensibilidade crônica, ceratoconjuntivite seca, ceratoconjuntivite epidêmica, sindrome nefritica idiopática, nefropatia com alteração
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69/222 mínima, lesão familiar benigna e por reperfusão de isquemia, reperfusão de órgão transplantado, autoimunidade retiniana, inflamação articular, bronquite, doença da via aérea/pulmonar obstrutiva crônica, silicose, aftas, estomatite aftosa, distúrbios arterioscleróticos, espermiogênese, hemólise autoimune, doença de Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodoso hansênico, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, doença de Hamman-Rich, perda auditiva sensório-neural, hemoglobinúria paroxística, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversa, mixedema idiopático primário, nefrose, oftalmia simpática, orquite granulomatosa, pancreatite, polirradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia esplênica adquirida, timoma não maligno, vitiligo, síndrome de choque tóxico, intoxicação alimentar, condições que envolvem infiltração de células T, deficiência de adesão de leucócitos, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocinas e linfócitos T, doenças que envolvem diapedese de leucócitos, síndrome de lesão de múltiplos órgãos, doenças mediadas por complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana basal antiglomerular, neurite alérgica, poliendocrinopatias autoimunes, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica autoimune, oftalmia simpática, doenças reumáticas, doença mista do tecido conjuntivo, síndrome nefrótica, insulite, falência poliendócrina, síndrome poliglandular autoimune tipo I, hipoparatireoidismo idiopático de surgimento no
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70/222 adulto (ΑΟΙΗ), cardiomiopatia como, por exemplo, cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa adquirida (EBA), hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária, sinusite purulenta ou não purulenta, sinusite aguda ou crônica, sinusite do etmóide, frontal, maxilar ou do esfenóide, um distúrbio relacionado aos eosinófilos como, por exemplo, eosinofilia, eosinofilia com infiltração pulmonar, sindrome de eosinofilia-mialgia, sindrome de Loffler, pneumonia eosinofilica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granulomas que contêm eosinófilos, anafilaxia, espondiloartrite soronegativa, doença poliendócrina autoimune, colangite esclerosante, esclerite, episclerite, candidiase mucocutânea crônica, sindrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transitória da infância, sindrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxiatelangiectasia, angiectasia, distúrbios autoimunes associados com doença do colágeno, reumatismo, doença neurológica, linfadenite, redução na resposta da pressão sanguínea, disfunção vascular, lesão tecidual, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral, e doença que acompanha vascularização, distúrbios de hipersensibilidade alérgica, glomerulonefrite, lesão por reperfusão, distúrbio isquêmico de reperfusão, lesão por reperfusão do miocárdio ou outros tecidos, traqueobronquite linfomatosa, dermatoses inflamatórias, dermatoses com componentes inflamatórios agudos, falência de múltiplos órgãos, doenças bolhosas, necrose cortical renal, meningite aguda purulenta ou outros distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, distúrbios inflamatórios oculares
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71/222 e orbitais, síndromes associadas à transfusão de granulócitos, toxicidade induzida por citocina, narcolepsia, inflamação aguda séria, inflamação crônica intratável, pielite, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulite, enfisema, alopecia areata, inflamação do tecido adiposo/diabetes tipo II, obesidade associada à inflamação do tecido adiposo/resistência à insulina e endometriose.
[114] Em algumas modalidades, o distúrbio ou doença autoimune pode incluir, sem limitação, diabetes mellitus Tipo I e Tipo II, pré-diabetes, rejeição de transplante, esclerose múltipla, um distúrbio relacionado à esclerose múltipla, insuficiência ovariana prematura, esclerodermia, doença/síndrome de Sjõgren, lúpus, vitiligo, alopecia (calvicie), insuficiência poliglandular, doença de Grave, hipotireoidismo, polimiosite, pênfigo, doença de Crohn, colite, hepatite autoimune, hipopituitarismo, miocardite, doença de Addison, doenças autoimunes da pele, uveite, anemia perniciosa, hipoparatireoidismo e/ou artrite reumatóide. Outras indicações de interesse incluem, sem limitação, asma, asma alérgica, cirrose biliar primária, cirrose, distúrbio do espectro de neuromielite óptica (doença de Devic, esclerose múltipla óptico-espinhal (OSMS)), pênfigo vulgar, doença inflamatória do intestino (IBD), artrite, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), doença celiaca, psoríase, cardiomiopatia autoimune, cardiomiopatia dilatada idiopática (IDCM), miastenia grave, uveite, espondilite anquilosante, miopatias de mediação imune, câncer de próstata, síndrome antifosfolipídeo (ANCA+), aterosclerose, dermatomiosite, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), enfisema, lesão medular, lesão traumática,
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72/222 a destruição pulmonar induzida pelo tabaco, vasculite associada ao ANCA, psoríase, colangite esclerosante, colangite esclerosante primária, e doenças dos sistemas nervosos central e periférico.
[115] Em algumas modalidades, o distúrbio ou doença autoimune pode incluir, sem limitação, diabetes, esclerose múltipla, doença celíaca, cirrose biliar primária, pênfigo, pênfigo foliáceo, pênfigo vulgar, distúrbio do espectro da neuromielite óptica, artrite (incluindo artrite reumatóide), asma alérgica, doença inflamatória intestinal (incluindo doença de Crohn e colite ulcerativa), lúpus eritematoso sistêmico, aterosclerose, doença pulmonar obstrutiva crônica, enfisema, psoríase, hepatite autoimune, uveíte, síndrome de Sjõgren, esclerodermia, síndrome antifosfolipídeo, vasculite associada a ANCA e síndrome da pessoa rígida.
[116] A esclerose múltipla (MS) também é conhecida como esclerose disseminada, encefalomielite disseminada ou encefalomielite alérgica. A MS é uma doença inflamatória na qual as bainhas de mielina gordurosas em torno dos axônios do cérebro e medula espinhal são danificadas, levando à desmielinização e cicatrização, bem como um amplo espectro de sinais e sintomas. Os distúrbios relacionados à esclerose múltipla incluem, por exemplo, distúrbio do espectro da neuromielite óptica (NMO), uveíte, dor neuropática e semelhantes .
[117] Acredita-se que a glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG) seja uma glicoproteína importante no processo de mielinização de nervos no sistema nervoso central (SNC). Em humanos, essa proteína é codificada pelo gene MOG.
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Especula-se que sirva como uma molécula de adesão necessária para fornecer integridade estrutural à bainha de mielina e sabe-se que mais tarde se desenvolve no oligodendrócito. Os Números de Acesso no GenBank NM_001008228.2 e NP_001008229.1 representam o mRNA e a sequência de proteínas, respectivamente, do gene MOG. A sequência associada com cada um desses Números de Acesso no GenBank é incorporada por referência para todas as finalidades.
[118] Como usados nesse relatório descritivo, os termos câncer e canceroso se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular não regulado. Exemplos de câncer incluem, sem limitação, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia, e metástases destes. Uma metástase significa a transferência de organismos produtores de doença ou de células malignas ou cancerosas para outras partes do corpo através dos vasos sanguíneos ou linfáticos ou superfícies membranosas. Exemplos não limitantes desses cânceres incluem câncer de célula escamosa, câncer de pulmão de pequena célula, câncer de pulmão de célula não pequena, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gastrintestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer cólon-retal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer do rim, câncer do fígado, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireóide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer da cabeça e pescoço. A
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Tabela 2 é uma lista exemplar não limitante de antígenos relevantes para câncer para uso nessa revelação.
[119] Como usado nesse relatório descritivo, o termo coestimulatória significa moléculas que produzem um sinal secundário in vivo que serve para ativar células T narve em células T antígeno-específicas capazes de produção de uma resposta imune às células que possuem o referido antígeno específico. A presente revelação não está limitada a qualquer molécula coestimulatória específica. As várias moléculas coestimulatórias são bem conhecidas na técnica. Alguns exemplos não limitantes de moléculas coestimulatórias are 4IBBL, OX40L, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, CD30L e ICOSL, bem como seus respectivos receptores e polinucleotídeos que os codificam. Em modalidades específicas, as moléculas coestimulatórias da presente revelação podem ser qualquer um ou mais dos seguintes ligantes e seus respectivos receptores: B7-1/CD80, BTLA, B72/CD86, CD28, B7-H1/PD-L1, CTLA-4, B7-H2, GÍ24/VISTA/B7-H5, B7-H3, ICOS, B7-H4, PD-1, B7-H6, PD-L2/B7-DC, B7-H7, PDCD6, LILRA3/CD85e, LILRB2/CD85d/ILT4, LILRA4/CD85g/ILT7, LILRB3/CD85a/ILT5, LILRB1/CD85j/ILT2, LILRB4/CD85k/ILT3, 41BB/TNFRSF9/CD137, Ligante de GITR/TNFSF18, Ligante de 41BB/TNFSF9, HVEM/TNFRSF14, BAFF/BLyS/TNFSFl3B, LIGHT/TNFSF14, BAFF R/TNFRSF13C, Linfotoxina-alfa/TNF-beta, CD27/TNFRSF7, 0X40/TNFRSF4, CD27 Ligante/TNFSF7, 0X40 Ligante/TNFSF4, CD30/TNFRSF8, RELT/TNFRSF19L, CD30 Ligante/TNFSF8, TACI/TNFRSF13B, CD40/TNFRSF5, TL1A/TNFSF15, CD40 Ligante/TNFSF5, TNF-alfa, DR3/TNFRSF25, TNF RII/TNFRSF1B, GITR/TNFRSF18, 2B4/CD244/SLAMF4, CD84/SLAMF5, BLAME/SLAMF8, CD229/SLAMF3, CD2, CRACC/SLAMF7, CD2F
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10/SLAMF9, NTB-A/SLAMF6, CD48/SLAMF2, SLAM/CD150, CD58/LFA3, CD7, DPPIV/CD26, CD96, EphB6, CD160, Integrina alfa 4 beta 1, CD200, Integrina alfa 4 beta 7/LPAM-l, CD30Oa/LMIRl, LAG-3, CRTAM, TIM-1/KIM-l/HAVCR, DAP12, TIM-4, Dectina1/CLEC7A, TSLP R, ICOSL, e/ou equivalentes biológicos de cada desses.
[120] Como usado nesse relatório descritivo, o termo ligante coestimulatório significa moléculas da superfície celular que interagem com moléculas coestimulatórias.
[121] Como usado nesse relatório descritivo, o termo citocina significa proteínas de baixo peso molecular secretadas por várias células no sistema imune que atuam como moléculas de sinalização para a regulação de uma ampla gama de processos biológicos dentro do corpo nos niveis molecular e celular. Citocinas incluem proteínas de imunomodulação individuais que se enquadram dentro da classe de linfocinas, interleucinas ou quimiocinas.
[122] Como usado nesse relatório descritivo, o termo diabetes significa um distúrbio variável do metabolismo de carboidratos causado por uma combinação de fatores hereditários e ambientais e é normalmente caracterizado por secreção ou utilização inadequada de insulina, por produção excessiva de urina, por quantidades excessivas de açúcar no sangue e na urina, e por sede, fome e perda de peso. O diabetes é caracterizado por diabetes Tipo 1 e diabetes Tipo 2. O camundongo não obeso diabético (NOD) é um modelo animal aceito para o estudo e tratamento de diabetes. O Diabetes Tipo 1 (T1D) em camundongos está associado com células T CD8 + autorreativas. Camundongos não obesos diabéticos (NOD) desenvolvem uma forma de T1D, muito
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76/222 semelhante ao T1D humano, que resulta da destruição seletiva de células-β pancreáticas por células T que reconhecem uma lista crescente de autoantígenos. Embora o início do T1D claramente exija a contribuição de células CD4 + , há fortes evidências de que T1D seja célula T CD8+-dependente. Foi descoberto que uma fração significante das células CD8 + associadas à ilhota em camundongos NOD usa TCRs CDR3invariantes Val7-Ja42+, denominadas 8.3-TCR-líke. Essas células, que reconhecem o mimotopo NRP-A7 (definido usando bibliotecas combinatórias de peptídeos) no contexto da Kd da molécula de MHC, já são um componente significante dos infiltrados mais precoces da ilhota CD8 + de NOD, são diabetogênicas, e visam um peptídeo da proteína relacionada à subunidade catalítica de glicose-6-fosfatase ilhotaespecífica (IGRP), uma proteína de função desconhecida. As células CD8+ que reconhecem esse peptídeo (IGRP206-214, similar a NRP-A7) são excepcionalmente frequentes na circulação (>1/200 células CD8 + ) . Notavelmente, a progressão de insulite para diabetes em camundongos NOD é invariavelmente acompanhada por expansão cíclica do pool circulante de CD8+ IGRP206-2i4-reativa, e por maturação ávida de sua contraparte associada à ilhota. Mais recentemente, foi demonstrado que células CD8 + associadas à ilhota em camundongos NOD reconhecem múltiplos epítopos de IGRP, indicando que IGRP é um autoantígeno dominante para células CD8+, pelo menos no T1D murídeo. Células CD8+ associadas à ilhota de NOD, particularmente aquelas encontradas precocemente no processo de doença, também reconhecem um epítopo de insulina (Ins B1523) ·
[123] Como usado nesse relatório descritivo, o termo
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77/222 pré-diabetes significa um período assintomático que precede uma condição diabética, caracterizado por dano subclínico da célula beta, em que o paciente exibe níveis plasmáticos normais de glicose. Ele também é caracterizado pela presença de autoanticorpos da célula da ilhota (ICAs) e, quando perto do início dos sintomas clínicos, pode ser acompanhado por intolerância à glicose.
[124] Como usado nesse relatório descritivo, o termo distúrbio relacionado à esclerose múltipla significa um distúrbio que se apresenta também com uma suscetibilidade à MS ou com MS. Exemplos não limitantes destes incluem distúrbio do espectro da neuromielite óptica (NMO), uveite, esclerose com dor neuropática, aterosclerose, arteriosclerose, esclerose disseminada, esclerose sistêmica, MS espino-óptica, MS progressiva primária (PPMS) e MS remitente-recorrente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva e esclerose atáxica.
[125] Os termos epítopo e determinante antigênico são usados de forma intercambiável para se referir a um sítio em um antígeno ao qual células B e/ou T respondem ou reconhecem. Epítopos de célula B podem ser formados tanto por aminoácidos contíguos quanto por aminoácidos não contíguos justapostos por enovelamento terciário de uma proteína. Epítopos formados por aminoácidos contíguos são tipicamente retidos mediante exposição a solventes desnaturantes, enquanto epítopos formados por enovelamento terciário são tipicamente perdidos mediante tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3 e, mais comumente, pelo menos 5 ou 8-20 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Métodos de determinação da conformação espacial
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78/222 de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância nuclear magnética bidimensãoal. Veja, por exemplo, Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996). Células T reconhecem epítopos contínuos de cerca de nove aminoácidos para células CD8 ou cerca de 13-15 aminoácidos para células CD4. Células T que reconhecem o epítopo podem ser identificadas por ensaios in vitro que medem a proliferação antígeno-dependente, como determinado por incorporação de 3H-timidina por células T sensibilizadas em resposta a um epítopo (Burke e cols., J. Inf. Dis., 170: 1.110-1.119, 1994), por morte antígeno-dependente (ensaio de linfócito T citotóxico, Tigges e cols., J. Immunol., 156 (10): 3.901-3.910, 1996) ou por secreção de citocina. A presença de uma resposta imunológica mediada por células pode ser determinada por ensaios de proliferação (células T CD4+) ou ensaios de CTL (linfócito T citotóxico).
[126] Opcionaímente, um antígeno ou, preferivelmente, um epítopo de um antígeno, pode ser quimicamente conjugado a, ou expresso como, uma proteína de fusão com outras proteínas como, por exemplo, proteínas MHC e proteínas relacionadas à MHC.
[127] Como usados nesse relatório descritivo, os termos paciente e indivíduo são usados de forma sinônima e se referem a um mamífero. Em algumas modalidades, o paciente é um humano. Em outras modalidades, o indivíduo é um mamífero que necessita de medicina veterinária ou é um mamífero comumente usado em um laboratório. Em algumas modalidades, o mamífero é um camundongo, rato, símio, canino, felino, bovino, equino ou ovino.
[128] Como usado nessa revelação, o termo
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79/222 polinucleotídeo se refere a uma molécula de ácido nucleico que é recombinante ou foi isolada livre de ácido nucleico genômico total. Estão incluídos dentro do termo polinucleotídeo oligonucleotídeos (ácidos nucleicos com 100 resíduos ou menos de comprimento), vetores recombinantes incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fago, vírus e semelhantes. Polinucleotídeos incluem, em certos aspectos, sequências reguladoras, isoladas substancialmente distantes de seus genes ou sequências codificadoras de proteína de ocorrência natural. Polinucleotídeos podem ser RNA, DNA, análogos destes, ou uma combinação destes. Um ácido nucleico que codifica todo ou parte de um polipeptídeo pode conter uma sequência de ácidos nucleicos contígua que codifica todo ou uma porção de um polipeptídeo desse tipo dos seguintes
comprimentos: 10, 20 , 30 , 40, 50, 60, 70 , 80, 90, 100, 110,
120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230,
240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350,
360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460,
470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580,
590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700,
710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820,
830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940,
950, 960, 970, 980, 990, 1.000 , 1 · 010, 1 .020, 1.030, 1 .040,
1.050 , 1 .060, 1.070 , 1 .080, 1.090, 1. 095, 1.10 0, 1 .500,
2.000 , 2. .500, 3.000 , 3 .500, 4.000, 4. 500, 5.00 0, 5 .500,
6.000 , 6. 500, 7.000, , 7 . 500, 8 .000 , 9.000, 10.000 , ou mais
nucleotídeos, nucleosídeos ou pares de bases. Também é contemplado que um polipeptídeo particular de certa espécie pode ser codificado por ácidos nucleicos que contêm variações naturais que possuem sequências de ácidos nucleicos
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80/222 ligeiramente diferentes, mas, no entanto, codificam a mesma proteina, polipeptídeo ou peptídeo, ou uma proteína, polipeptídeo ou peptídeo substancialmente similar.
[129] Um polinucleotídeo é composto por uma sequência específica de quatro bases nucleotídicas: adenina (A); citosina (C) ; guanina (G) ; timina (T) ; e uracil (U) para timina quando o polinucleotídeo é RNA. Dessa forma, o termo sequência de polinucleotídeos é a representação alfabética de uma molécula de polinucleotídeo. Essa representação alfabética pode ser inserida em bancos de dados em um computador que possui uma unidade de processamento central e usado para aplicações de bioinformática como, por exemplo, genômica funcional e pesquisa de homologia.
[130] Os termos isolado ou recombinante, como usados nesse relatório descritivo, com relação aos ácidos nucléicos, por exemplo, DNA ou RNA, se referem às moléculas separadas de outros DNAs ou RNAs, respectivamente, que estão presentes na fonte natural da macromolécula, bem como polipeptídeos. O termo ácido nucleico isolado ou recombinante visa incluir fragmentos de ácido nucleico que não são de ocorrência natural como fragmentos e não seriam encontrados no estado natural. O termo isolado também é usado nesse relatório descritivo para se referir a polinucleotídeos, polipeptídeos e proteínas que estão isolados de outras proteínas celulares e visa englobar polipeptídeos tanto purificados quanto recombinantes. Em outras modalidades, o termo isolado ou recombinante significa separado de constituintes, celulares e outros, com os quais a célula, tecido, polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo, ou fragmentos destes,
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81/222 estão normalmente associados na natureza. Por exemplo, uma célula isolada é uma célula que está separada de tecido ou células de fenótipo ou genótipo diferente. Um polinucleotídeo isolado está separado dos nucleotideos 3' e 5' contíguos com os quais está normalmente associado em seu ambiente nativo ou natural, por exemplo, no cromossomo. Como é evidente para aqueles na técnica, um polinucleotídeo, peptídeo, polipeptídeo, proteína, anticorpo de ocorrência não natural, ou fragmentos destes, não necessita de isolamento para distingui-lo de sua contraparte de ocorrência natural.
[131] 0 termo exógeno, com relação a um ácido nucleico ou polinucleotídeo, indica que o ácido nucleico é parte de uma construção de ácido nucleico recombinante, ou não está em seu ambiente natural. Por exemplo, um ácido nucleico exógeno pode ser uma sequência de uma espécie introduzida em outra espécie, ou seja, um ácido nucleico heterólogo. Tipicamente, esse ácido nucleico exógeno é introduzido na outra espécie por meio de uma construção de ácido nucleico recombinante. Um ácido nucleico exógeno também pode ser uma sequência que é nativa para um organismo e que foi reintroduzida em células daquele organismo. Um ácido nucleico exógeno que inclui uma sequência nativa pode frequentemente ser distinguido da sequência de ocorrência natural pela presença de sequências não naturais ligadas ao ácido nucleico exógeno, por exemplo, sequências reguladoras não nativas (promotores, intensificadores, terminadores transcricionais, IRES, sequências de salto de ribossomo) que flanqueiam uma sequência nativa em uma construção de ácido nucleico recombinante, ou ausência de sequências de intron.
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Além disso, ácidos nucleicos exógenos transformados estavelmente tipicamente são integrados em posições diferentes da posição onde a sequência nativa é encontrada naturalmente. Os elementos exógenos podem ser adicionados a uma construção, por exemplo, usando recombinação genética.
[132] Como usados nesse relatório descritivo, os termos homóloga, homologia ou homologia percentual, quando usados nesse relatório descritivo para descrever uma sequência de ácidos nucleicos, em relação a uma sequência de referência, pode ser determinada usando a fórmula descrita por Karlin e Altschul {Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 2.2642.268, 1990, modificada como um Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5.873-5.877, 1993) . Essa fórmula é incorporada nos programas de ferramenta de pesquisa de alinhamento local básico (BLAST) de Altschul e cols. {J. Mol. Biol. 215: 403410, 1990) . A homologia percentual de sequências pode ser determinada usando a versão mais recente de BLAST, como da data de depósito desse pedido.
[133] O percentual (%) de identidade de sequência com relação a uma sequência de polipeptídeos de referência, é a percentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas (gaps), se necessário, para obter o percentual máximo de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservatívas como parte da identidade de sequência. O alinhamento, para fins de determinação do percentual de identidade de sequência de aminoácidos, pode ser obtido de várias formas que são conhecidas, por exemplo, usando
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83/222 programas de computador disponíveis publicamente como, por exemplo, BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR) software. Parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências são capazes de ser determinados, incluindo algoritmos necessários para obter alinhamento máximo sobre o comprimento completo das sequências que estão sendo comparadas. Para os objetivos desse relatório descritivo, no entanto, os valores do % de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. 0 programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2 foi escrito por Genentech, Inc., e o código-fonte foi depositado com documentação do usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado como U.S. Copyright Registration No. TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente por Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., ou pode ser compilado a partir do códigofonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo UNIX Digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de sequências são configurados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[134] Em situações nas quais ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, o % de identidade de sequência de aminoácidos de certa sequência de aminoácidos A para, com ou contra certa sequência de aminoácidos B (que pode, alternativamente, ser formulado como certa sequência de aminoácidos A que possui ou compreende certo % de identidade de sequência de aminoácidos para, com ou contra certa sequência de aminoácidos B) é calculado da seguinte forma: 100 vezes a fração X/Y, em que X é o número de resíduos
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84/222 de aminoácidos pontuados como combinações idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 naquele alinhamento do programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será observado que, quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos Β, o % de identidade de sequência de aminoácidos de A para B não será igual ao % de identidade de sequência de aminoácidos de B para A. Salvo quando especificamente definido em contrário, todos os valores do % de identidade de sequência de aminoácidos usados nesse relatório descritivo são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente precedente usando o programa de computador ALIGN-2.
[135] 0 termo composição visa significar uma combinação de agente ativo e outro composto ou composição, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou ativo, por exemplo, um adjuvante. Em certas modalidades, a composição não contém um adjuvante.
[136] 0 termo composição farmacêutica visa incluir a combinação de um agente ativo com um carreador, inerte ou ativo, tornando a composição adequada para uso diagnóstico ou terapêutico in vitro, in vivo ou ex vivo.
[137] Como usados nesse relatório descritivo, os termos proteína ou polipeptídeo ou peptídeo se referem a uma molécula que compreende pelo menos cinco resíduos de aminoácidos.
[138] Outros objetivos, características e vantagens da presente revelação ficarão evidentes a partir da descrição detalhada seguinte. Definições adicionais também são fornecidas nesse relatório descritivo. Deve ser
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85/222 subentendido, no entanto, que a descrição detalhada e os exemplos específicos, embora indicando modalidades específicas da revelação, são fornecidos apenas como ilustração, na medida em que várias alterações e modificações dentro do espírito e escopo da revelação ficarão evidentes para aqueles habilitados na técnica a partir dessa descrição detalhada.
[139] Essa revelação fornece um novo ensaio e composições necessárias para realizar o ensaio. Uma composição desse tipo é uma célula isolada que compreende um receptor de célula T recombinante (TCR) introduzido exogenamente, um repórter dependente da via de TCR e um co-receptor que se liga a um complexo de histocompatibilidade principal Classe I ou Classe II (MHC). Em um aspecto adicional, a célula isolada compreende um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR introduzido exogenamente. Ainda em outro aspecto adicional, a célula isolada compreende um receptor introduzido exogenamente para uma molécula coestimulatória e/ou um receptor de citocina.
Células
[140] A célula para ser utilizada em um ensaio de potência descrito nesse relatório descritivo é uma célula eucariótica. A célula expressa minimamente: 1) um TCR, recombinante ou natural, que se liga especificamente a um peptídeo-MHC que está acoplado à pMHC-NP a ser testada; 2) um complexo de sinalização de CD3 3) um repórter dependente da via de TCR; e 4) um co-receptor de MHC. Algumas células ou linhagens de células podem expressar naturalmente um complexo de sinalização de CD3 e um co-receptor de MHC (por exemplo, CD4 ou CD8) em níveis suficientes para a realização
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86/222 do ensaio descrito nesse relatório descritivo. No entanto, com base na célula ou linhagem de célula específica, um coreceptor de MHC, ou um ou mais polipeptídeos do complexo de sinalização de CD3, podem ser introduzidos por um polinucleotídeo exógeno para aumentar o sinal ou regular o sinal de uma forma homogênea. A célula pode ser uma célula ou uma linhagem de célula primária que foi modificada por engenharia genética para expressar um ou mais de um receptor de célula T recombinante (TCR), um repórter dependente da via de TCR, um co-receptor de MHC ou um ou mais polipeptídeos do complexo de sinalização de CD3. Exemplos não limitantes de linhagens de células adequadas que podem ser modificadas por engenharia genética incluem JurMA, Jurkat, BW5147, HuT78, CEM, Molt-4, ou a combinação destas. Se a célula não expressa endogenamente qualquer um de um receptor de célula T recombinante (TCR), um repórter dependente da via de TCR, um co-receptor de MHC ou um ou mais polipeptídeos do complexo de sinalização de CD3, então aquele componente pode ser expresso por um polinucleotídeo introduzido na célula ou linhagem de célula. Em certas modalidades, a célula não expressa endogenamente um complexo de sinalização de CD3. Em certas modalidades, a célula não expressa endogenamente um co-receptor de MHC. Em um aspecto, a célula expressa endogenamente um receptor para uma molécula coestimulatória e/ou uma citocina. Em certas modalidades, a célula expressa em nível baixo ou não expressa um receptor para uma molécula coestimulatória e/ou uma citocina, mas a expressão é supraregulada quando células T são ativadas. A célula pode compreender, além de qualquer um ou mais de um polinucleotídeo exógeno que codifica um co-receptor de MHC,
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87/222 um polipeptídeo que é parte de um complexo de sinalização de CD3. Em certas modalidades, o polipeptídeo que é parte de um complexo de sinalização de CD3 compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao ID. DE SEQ. N° 553. Em certas modalidades, o polipeptídeo que é parte de um complexo de sinalização de CD3 é codificado por um polinucleotídeo pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% homólogo ao ID. DE SEQ. N° 554. Em certas modalidades, o co-receptor de MHC compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao ID. DE SEQ. N° 549 ou 551. Em certas modalidades, o co-receptor de MHC é codificado por um polinucleotídeo pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% homólogo ao ID. DE SEQ. N° 550 ou 552.
Receptor de célula T (TCR)
[141] As células ou linhagens de células utilizadas para o ensaio de potência descrito nesse relatório descritivo expressam um receptor de célula T recombinante (TCR). Um receptor de célula T recombinante é aquele que é codificado por um polinucleotídeo desprovido de um ou mais de uma UTR3', uma UTR-5', uma sequência de íntron, ou promotor ou elementos intensificadores nativos. Esse TCR recombinante pode ser codificado por um polinucleotídeo exógeno introduzido por transdução, transfecção ou infecção. Em certas modalidades, o polinucleotídeo exógeno é integrado no genoma da célula ou linhagem de célula. Exemplos não limitantes de receptores de célula T incluem, sem limitação, um heterodímero que compreende um TCR α e TCR β, um heterodímero que compreende TCR γ e TCR δ, e uma construção de TCR de cadeia única. Em uma certa modalidade, o TCR é
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88/222 murinizado (ou seja, em que o TCR é otimizado para interagir com uma molécula de CD4 murídea). Exemplos não limitantes de TCR α podem ser encontrados em GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAB31880.1, AAB28318.1, AAB24428.1 e ADW95878.1, e equivalentes de cada um desses. Polinucleotídeos que codificam essas proteínas são introduzidos na célula com o uso de métodos conhecidos na técnica e que podem ainda compreender sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular, intensificadores, bem como vetores para transdução e expressão.
[142] Exemplos não limitantes de TCR β também podem ser encontrados nos Nos de Acesso no GenBank AAB31887.1, AKG65861.1, ADW95908.1, e AAM53411.1, e equivalentes de cada um desses. Polinucleotídeos que codificam essas proteínas são transduzidas na célula com o uso de métodos conhecidos na técnica. Os polinucleotídeos podem ser sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular, intensificadores, e também vetores para transdução e expressão. Em uma modalidade, a cadeia-γ de TCR compreende uma ou mais sequências encontradas no GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAM21533.1, DAA30449.1 e ABG91733.1 e equivalentes de cada um desses. Polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos podem ser transduzidos na célula. Os polinucleotídeos podem ser sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular, intensificadores, e também vetores para transdução e expressão. Em uma modalidade, a cadeia-δ de TCR compreende uma ou mais sequências encontradas no GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank Q7YRN2.1, AAC48547.1, JC4663 e
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ΝΡ_Ο010Ο 9418.1, e equivalentes de cada um desses. Polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos podem ser transduzidos na célula. Os polinucleotídeos podem ser sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular, intensificadores, e também vetores para transdução e expressão. Os TCRs de cadeia única são conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes de TCRs de cadeia única são revelados em WO 1996018105 e US 20120252742, e equivalentes de cada um desses, cada um deles incorporado por referência em sua totalidade. Polinucleotídeos que codificam essas proteínas são transduzidas na célula com o uso de métodos conhecidos na técnica e que compreende ainda sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular, intensificadores, bem como vetores para transdução e expressão.
[143] Em um aspecto, o TCR é um TCR de cadeia única como revelado em WO 1996018105 e US 2012/02522742. Polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos podem ser transduzidos na célula. Os polinucleotídeos podem ser sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular, intensificadores, e também vetores para transdução e expressão.
[144] Em certas modalidades, os TCRs recombinantes para uso com os métodos e linhagens de células descritos nesse relatório descritivo compreendem uma cadeia alfa de TCR e uma cadeia beta de TCR. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são traduzidas separadamente. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são traduzidas como um polipeptídeo único. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são
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90/222 traduzidas como um polipeptídeo único como um TCR de cadeia única. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são traduzidas como um polipeptídeo único que compreende um sítio de divagem entre a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR. Em certas modalidades, o sítio de divagem compreende uma sequência de salto de ribossomo. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são expressas na superfície da célula em uma forma madura (sequência-líder secretória clivada) form.
[145] Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 528, 530, 534, 536 539, 541, 544 ou 546 e a cadeia beta de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 529, 531, 535, 537, 540, 542, 545 ou 547. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 528, 530, 534, 536, 539 ou 541, e a cadeia beta de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 529, 531, 535, 537, 540 ou 542.
[146] Em certas modalidades, o TCR é específico para os aminoácidos 13 a 25 (QHLQKDYRAYYTF) da proteína relacionada à subunidade catalítica (IGRP) da glicose-6-fosfatase ilhota humana-específica ligado a DRBl*0301/DRA*0101. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 528 ou 530, e a cadeia beta de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 529 ou 531. Em certas modalidades, a
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91/222 cadeia alfa de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 534 ou 536, e a cadeia beta de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 535 ou 537 .
[147] Em certas modalidades, o TCR é específico para os aminoácidos 76 a 90 (SLQPLALEGSLQKRG) da pré-pró-insulina humana ligado a DRBl*0401/DRA*0101. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 539 ou 541, e a cadeia beta de TCR é pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 54 0 ou 542.
[148] Em um aspecto adicional o polinucleotídeo que codifica TCRa e TCRp ainda codifica uma sequência de salto de ribossomo, cujos exemplos não limitantes incluem, sem limitação, uma sequência de salto de ribossomo 2A (por exemplo, P2A, E2A, F2A ou T2A) ou compreende uma sequência IRES. Portanto, em um aspecto, a sequência de salto de ribossomo compreende uma sequência de salto de ribossomo P2A, E2A, F2A ou T2A. Em algumas modalidades, a sequência de salto de ribossomo 2A compreende o motivo de consenso de Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro, em que X significa qualquer amínoâcido. Exemplos não limitantes de sequências de peptídeo 2A são fornecidos na Listagem de Sequências Exemplar. Os polinucleotídeos podem ainda compreender um promotor e/ou uma sequência intensificadora. Exemplos de sequências de salto de ribossomo podem ser encontrados em WO 2013/057586, que é incorporado por referência.
[149] Exemplos não limitantes de sequências IRES e
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92/222 sequências de salto de ribossomo são fornecidos nas Tabelas 3 e 4 .
[150] Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são produzidas como um polipeptídeo único, e a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são separadas por uma sequência de salto de ribossomo com uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 456 a 523. Em certas modalidades, o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524, 526 ou 543. Em certas modalidades, o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524, 526. Em certas modalidades, o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524. Em certas modalidades, o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 526.
[151] Em certas modalidades a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR são codificadas por um único polinucleotídeo e o polinucleotídeo compreende uma sequência IRES entre a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR. Em certas modalidades, a sequência IRES compreende uma sequência de nucleotídeos apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524 a 526. Em certas modalidades, a cadeia alfa de TCR e/ou a cadeia beta de TCR são codificadas por um polinucleotídeo pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% homólogo ao ID. DE SEQ. N° 532 ou 557. Esse
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93/222 polinucleotídeo pode ser integrado estavelmente no genoma da célula.
[152] 0 TCR expresso pela célula utilizada no ensaio de potência descrito nesse relatório descritivo pode ser específico para um antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é um polipeptídeo ligado a uma molécula de MHC. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é um polipeptídeo ligado a uma molécula de MHC Classe I. Em certas modalidades, o antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é um polipeptídeo ligado a uma molécula de MHC Classe II. Em certas modalidades, o TCR se liga a qualquer antígeno polipeptídico apresentado na Tabela 1.
[153] 0 TCR expresso pela célula utilizada no ensaio de potência descrito nesse relatório descritivo pode ser específico para um antígeno de câncer. Em certas modalidades, o antígeno de câncer é um polipeptídeo ligado a uma molécula de MHC. Em certas modalidades, o antígeno de câncer é um polipeptídeo ligado a uma molécula de MHC Classe I. Em certas modalidades, o antígeno de câncer é um polipeptídeo ligado a uma molécula de MHC Classe II. Em certas modalidades, o antígeno de câncer é um polipeptídeo apresentado na Tabela 2 .
Repórter TCR-dependente
[154] Em algumas modalidades, o repórter dependente da via de TCR é um repórter de ativação de TCR ou ativação da via de TCR. Em uma modalidade, o repórter fornece um ou mais de concentração celular, expressão, atividade, localização,
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94/222 modificação de proteína ou interações proteína-proteína. Em algumas modalidades, o repórter dependente da via de TCR compreende, consiste basicamente ou ainda consiste em uma luciferase, uma beta-lactamase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), uma proteína fluorescente, ou a combinação destes. Em algumas modalidades, o repórter dependente da via de TCR compreende, consiste basicamente ou ainda consiste em uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição NF-κΒ, uma sequência de DNA de AP-1 ou promotor de ligação de fator de transcrição, ou uma sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição IL-2. Em certas modalidades, a luciferase compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica ao ID. DE SEQ. N° 555. Em certas modalidades, a luciferase é codificada por um polinucleotídeo pelo menos 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% homólogo ao ID. DE SEQ. N° 556.
[155] O repórter TCR-dependente é ativado por um promotor a montante. Exemplos não limitantes de promotores são descritos nesse relatório descritivo e incluem, sem limitação, sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição de NFAT, sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição NF-κΒ, sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de AP1, e sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição IL-2 . Exemplos adicionais são fornecidos na Listagem de Sequências Exemplar. Em um aspecto adicional, o
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95/222 polinucleotídeo ainda compreende uma sequência intensificadora.
[156] Em outro aspecto, o repórter TCR-dependente compreende ou, alternativamente, consiste basicamente ou ainda adicionalmente consiste em um repórter do produto gênico quantificável. Exemplos não limitantes dos repórteres do produto gênico quantificáveis incluem, sem limitação, uma luciferase, uma beta-lactamase, CAT, SEAP, uma proteína fluorescente, ou a combinação destes. Exemplos não limitantes de sequências de luciferase para incorporação como um repórter podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAR20792.1, AAL40677.1, AAL40676.1 e AAV35379.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. O sistema de repórter de luciferase está disponível comercialmente (por exemplo, N° de Catálogo Promega E1500 ou E4550) . Exemplos adicionais são fornecidos na Listagem de Sequências Exemplar. Exemplos não limitantes de sequências de betalactamase podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AMM70781.1, CAA54104.1 e AAA23441.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. Exemplos não limitantes de CAT podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso OCR39292.1, WP_072643749.1, CUB58229.1 e KIX82948.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. Polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos podem ser transduzidos na célula. Os ensaios de CAT estão disponíveis comercialmente (por exemplo, FAST CAT® Chloramphenicol Acetiltransferase Assay Kit (F-2900) de Thermal Fisher). Exemplos não limitantes de sequências de
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SEAP podem ser localizados no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank ADV10306.1, AAB64404.1, EEB84921.1 e EFD 70636.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. Polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos podem ser transduzidos na célula. A atividade de SEAP pode ser medida por um luminômetro (por exemplo, Turner BioSystems Veritas Microplate Luminometer de Promega). Exemplos não limitantes de proteína fluorescente incluem Proteína Fluorescente Verde (GFP), Proteína Fluorescente Verde Intensificada (eGFP) , Proteína Fluorescente Azul (BFP) , Proteína Fluorescente Amarela (YFP), Proteína Fluorescente Ciano (CFP), Proteína Fluorescente Vermelha (RFP) , ou qualquer outra proteína fluorescente adequada, ou combinação destas, ou partes fluorescentes ou derivados destas. As sequências de proteínas fluorescentes podem ser localizadas no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AFA52654.1, ACS44348.1 e AAQ96629.1, e equivalentes de cada um desses) acessado pela última vez em 12 de janeiro de 2017. Polinucleotídeos que codificam esses polipeptídeos podem ser transduzidos na célula. Os repórteres promotores de proteína fluorescente estão disponíveis comercialmente (por exemplo, N° de Catálogo TakaRa 631089).
Co-Receptores de MHC
[157] As células transformadas também expressam um coreceptor de MHC que se liga a um ligante de MHC, por exemplo, ligantes de MHC Classe I e Classe II. Em algumas modalidades, os ligantes de MHC compreendem, consistem ou consistem basicamente em proteína MHC Classe I clássica, proteína MHC Classe I não clássica, proteína MHC Classe II clássica,
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97/222 proteína MHC Classe II não clássica, dímeros de MHC (fusões de Fc) , tetrâmeros de MHC, multímeros de MHC, ou uma forma polimérica de uma proteína MHC.
[158] Em um aspecto, o co-receptor de MHC Classe I compreende um complexo de CD8. Sequências de CD8 exemplares podem ser localizadas no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank AAA92533.1, AJP16706.1, AAA79217.1 e 1203216A, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 19 de janeiro de 2017. Polinucleotídeos que codificam essas proteínas são transduzidas na célula com o uso de métodos conhecidos na técnica. Os polinucleotídeos podem ser sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular, intensificadores, e também vetores para transdução e expressão.
[159] Em outro aspecto, o co-receptor de MHC Classe II compreende uma molécula de CD4. Sequências de proteína de CD4 exemplares podem ser localizadas no GenBank (por exemplo, Nos de Acesso no GenBank CAA72740.1, AMR44293.1, ACG76115.1, AAC36010.1 e AAB 51309.1, e equivalentes de cada um desses), acessado pela última vez em 19 de janeiro de 2017. Polinucleotídeos que codificam essas proteínas são transduzidas na célula com o uso de métodos conhecidos na técnica. Os polinucleotídeos podem ser sinais reguladores acoplados operativamente para expressão na superfície celular e também vetores para transdução e expressão.
CD3
[160] Em um aspecto adicional, um polinucleotídeo que codifica moléculas de CD3 (agrupamento de diferenciação 3) é transduzido na célula e a célula, desprovida de CD3 endógena, agora expressa a proteína (ou proteínas). Em
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98/222 algumas modalidades, a CD3 compreende ou, alternativamente, consiste basicamente ou consiste em quatro cadeias distintas. Os exemplos não limitantes de cadeias CD3 podem ser encontrados em GenBank, por exemplo, Nos de Acesso no GenBank CAA72995.1, AAI45927.1, NP_998940.1, AAB24559.1, NP_000723.1, AEQ93556.1 e EAW67366.1 e equivalentes deste, são úteis nessa revelação. Como é evidente para aqueles habilitados na técnica, o polinucleotídeo que codifica CD3 pode estar ligado operativamente aos elementos reguladores para a expressão de CD3 na superfície celular, opcionalmente um intensificador, e incluído dentro de um vetor para expressão dos polinucleotídeos. Polinucleotídeos que codificam essas proteínas são transduzidas na célula com o uso de métodos conhecidos na técnica.
[161] Em uma modalidade, um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR compreende ou, alternativamente, consiste basicamente ou ainda adicionalmente consiste em um polipeptídeo ou polipeptídeos de cadeias de TCR α e β, os polipeptídeos CD3y, δ e e, e as cadeias ζ. Com a formação em módulos diferentes, o complexo TCR/CD3 pode desempenhar diferentes papéis. Em uma modalidade, o complexo está envolvido no reconhecimento antígeno-específico. Em algumas modalidades, o complexo está envolvido na transdução de sinal primariamente por meio da presença de motivo de ativação de imunorreceptor com baseado em tirosina (ITAM) nas caudas citoplasmáticas das cadeias CD3. Em algumas modalidades, o complexo TCR/CD3 está envolvido na via de sinalização de TCR estimulada por um antígeno, um superantígeno ou um anticorpo (por exemplo, anticorpo contra receptor). Em uma modalidade, a expressão
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99/222 exógena do complexo TCR/CD3 facilita a via de sinalização de TCR em células CD3-negativas.
Receptor (ou receptores) coestimulatórios e/ou citocina (ou citocinas)
[162] Em um aspecto adicional, a célula é transduzida com um polinucleotídeo que codifica um receptor para a molécula coestimulatória ou de citocina selecionada. Exemplos não limitantes de moléculas coestimulatórias e de citocina são fornecidos nesse relatório descritivo.
Vetores
[163] Vetores ou outros sistemas de liberação de genes podem ser usados para transduzir as células com os polinucleotídeos como descritos acima. Em um aspecto, o termo vetor significa um vetor recombinante que retém a habilidade para infectar e transduzir células que não estão em divisão e/ou que estão em divisão lenta e integrar no genoma da célula-alvo. Em vários aspectos, o vetor é derivado ou baseado em um vírus ou plasmídeo do tipo selvagem, por exemplo, plasmídeo. Em aspectos adicionais, o vetor é derivado ou baseado em um lentivírus do tipo selvagem. Exemplos desses, incluem, sem limitação, vírus da imunodeficiência humana (HIV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV), vírus da imunodeficiência símia (SIV) e vírus da imunodeficiência felina (FIV). Alternativamente, é contemplado que outros retrovírus podem ser usados como uma base para um arcabouço de vetor como, por exemplo, o vírus da leucemia murídea (MLV). Será evidente que um vetor viral de acordo com a invenção não precisa estar confinado aos componentes de um vírus particular. 0 vetor viral pode compreender componentes derivados de dois ou mais vírus
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100/222 diferentes, e pode também compreender componentes sintéticos. Componentes de vetores podem ser manipulados para obter características desejadas, por exemplo, especificidade de célula-alvo.
[164] Os vetores recombinantes dessa revelação podem ser derivados de primatas e não primatas. Exemplos de lentivírus de primatas incluem o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente etiológico da síndrome de imunodeficiência humana adquirida (AIDS), e o vírus da imunodeficiência símia (SIV). O grupo lentiviral não primata inclui o vírus vírus lento visna/maedi (VMV) protótipo, bem como o vírus da artriteencefalíte caprina (CAEV) relacionado, vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e, o vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o vírus da imunodeficiência bovina (BIV) descritos mais recentemente. Vetores lentivirais recombinantes da técnica estabelecida são conhecidos na técnica, por exemplo, veja as Patentes U.S. Nos 6.924.123; 7.056.699; 7.07993; 7.419.829 e 7.442.551, incorporadas nesse relatório descritivo por referência.
[165] A Patente U.S. N° 6.924.123 revela que certas sequências retrovirais facilitam a integração no genoma da célula-alvo. Essa patente ensina que cada genoma retroviral compreende genes denominados gag, pol e env, que codificam proteínas e enzimas do vírion. Esses genes são flanqueados em ambas as extremidades por regiões denominadas repetições terminais longas (LTRs). As LTRs são responsáveis pela integração pró-viral, e transcrição. Eles também servem como intensificador-promotor sequências. Em outras palavras, as LTRs podem controlar a expressão dos genes virais. A encapsidação dos RNAs retrovirais ocorre em consequência de
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101/222 uma sequência psi localizada na extremidade 5' do genoma viral. As próprias LTRs são sequências idênticas que podem ser divididas em três elementos, que são denominados U3, R e U5. U3 é derivado da sequência única para a extremidade 3' do RNA. R é derivado de uma sequência repetida em ambas as extremidades do RNA, e U5 é derivado da sequência única para a extremidade 5' do RNA. Os tamanhos dos três elementos podem variar consideravelmente entre retrovírus diferentes. Para o genoma viral, o sitio de adição (terminação) de poli (A) está no limite entre R e U5 na LTR do lado direito. U3 contém a maioria dos elementos de controle transcricional do próvirus, que incluem o promotor e múltiplas sequências intensificadoras responsivas às proteínas celulares e, em alguns casos, proteínas ativadoras transcricionais virais.
[166] Com relação aos genes estruturais gag, pol e env propriamente ditos, gag codifica a proteína estrutural interna do vírus. A proteína Gag é processada proteoliticamente nas proteínas MA (matriz), CA (capsídeo) e NC (nucleocapsídeo) maduras. O gene pol codifica a transcriptase reversa (RT), que contém DNA polimerase, RNase H e integrase (IN) associadas, que medeiam a replicação do genoma.
[167] Para a produção de partículas de vetor viral, o genoma de RNA do vetor é expresso por uma construção de DNA que as codifica, em uma célula hospedeira. Os componentes das partículas não codificados pelo genoma do vetor são fornecidos em trans por sequências de ácidos nucleicos adicionais (o sistema de empacotamento, que normalmente inclui um dos genes gag/pol e env ou ambos) expressas na célula hospedeira. O conjunto de sequências necessário para
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102/222 a produção das partículas de vetor viral pode ser introduzido na célula hospedeira por transfecção transitória, ou pode ser integrado no genoma da célula hospedeira, ou pode ser fornecido em uma mistura de formas. As metodologias envolvidas são conhecidas por aqueles habilitados na técnica.
[168] Em uma modalidade, o vetor é um vetor viral. Em uma modalidade relacionada, o vetor viral é selecionado do grupo que consiste em um vetor lentiviral, vetor retroviral, vetor adenoviral, vetor de vírus adeno-associado e vetor de alfavírus. Ainda em outra modalidade adicional, o vetor viral é um vetor lentiviral.
[169] Vetores não virais podem incluir um plasmídeo que compreende um polinucleotídeo heterólogo capaz de ser liberado a uma célula-alvo, in vitro, in vivo ou ex vivo. O polinucleotídeo heterólogo pode compreender uma sequência de interesse e pode estar ligado operativamente a um ou mais elementos reguladores e pode controlar a transcrição da sequência de ácidos nucleicos de interesse. Como usado nesse relatório descritivo, um vetor não precisa ser capaz de replicação na célula-alvo ou indivíduo final.
[170] Em uma modalidade, os elementos reguladores adicionais são promotores, intensificadores e/ou combinações promotor/intensificador. O promotor que regula a expressão do ácido nucleico que codifica a proteína VEGF pode ser um promotor constitutivo. Em um aspecto, o promotor que regula a expressão do gene suicida é um promotor constitutivo. Exemplos não limitantes de promotores constitutivos incluem SFFV, CMV, PKG, MDNU3, SV40, Efla, UBC e CAGG. Em um aspecto, o intensificador é um elemento pós-regulador Woodchuck
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103/222 (WPRE) (veja, por exemplo, Zufferey, R. e cols. (1999) J. Virol. 73 (4): 2.886-2.992).
[171] Promotores úteis nessa revelação podem ser constitutivos ou induzíveis. Alguns exemplos de promotores incluem promotor precoce de SV40, promotor de LTR de vírus do tumor mamário do camundongo, promotor tardio principal de adenovírus, promotor de vírus do herpes simples e o promotor de CMV. Em uma modalidade, o promotor que regula a expressão da proteína ativadora de tetraciclina é um promotor constitutivo. Em outras modalidades, o promotor é um promotor induzível, um promotor tecido-específico ou um promotor que regula a expressão temporalmente. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de fosfoglicerato quinase (PGK).
[172] Em um aspecto adicional, o vetor ainda compreende um marcador ou marcador detectável como, por exemplo, um gene que codifica uma proteína fluorescente verde intensificada (EGFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), proteína fluorescente verde (GFP) e proteína fluorescente amarela (YFP) ou semelhantes. Esses estão disponíveis comercialmente e descritos na técnica.
[173] Outros métodos de liberação de genes da presente invenção incluem, sem limitação, transfecção com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE-dextrana, eletroporação, microinjeção, fusão de protoplasto ou transfecção mediada por lipossomo. As células hospedeiras que são transfectadas com os vetores dessa invenção podem incluir (sem limitação) E. coli ou outras bactérias, leveduras, fungos, células de inseto (usando, por exemplo, vetores baculovirais para expressão em células de inseto SF9), ou células derivadas de camundongos, humanos, ou outros animais (por exemplo,
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104/222 mamíferos). A expressão in vitro de uma proteína, fusão, fragmento de polipeptídeo, ou mutante codificado por DNA clonado, também pode ser usada. Aqueles habilitados na técnica de biologia molecular saberão que uma ampla variedade de sistemas de expressão e sistemas de purificação pode ser usada para produzir proteínas recombinantes e fragmentos destas.
Populações de células
[174] Em um aspecto, a revelação está relacionada a uma população de células isoladas incluindo, sem limitação, as células nessa revelação, por exemplo, JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM, Molt-4, que são modificadas como descrito nesse relatório descritivo. Em outro aspecto, as células são células CD3-negativas. Exemplos não limitantes de células CD3-negativas incluem, sem limitação, BW5147 (N° ATCC TIB472), Nk-92 (N° ATCC CRL-2407), Mino (N° ATCC PTS-CRL-3000) e JeKo-1 (N° ATCC CRL-3006). Em algumas modalidades, a população é substancialmente homogênea. Em outra modalidade, a população é substancialmente heterogênea. Em certas modalidades, uma população é uma pluralidade de células dessa revelação. Em certas modalidades, uma população compreende pelo menos 1 x 102 a 1 x 109 células que são pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 95, 95%, 98% ou 99% puras.
Monitoramento da expressão
[175] Como é evidente para aqueles habilitados na técnica, a expressão eficaz do polipeptídeo transduzido pode ser determinada com o uso de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando anticorpos ou fragmentos destes marcados de forma detectável que podem ser monitorados quantitativamente ou qualitativamente após transdução e
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105/222 cultivo nas células e populações de células.
Métodos para preparação das células
[176] Em outro aspecto, a revelação também está relacionada aos métodos para preparação da célula isolada, que compreendem, ou consistem basicamente ou ainda adicionalmente consistem na transdução de uma célula isolada com um ou mais polinucleotídeos que codificam: um receptor de célula T recombinante (TCR), um repórter dependente da via de TCR, e um co-receptor de MHC. Em um aspecto adicional, o método ainda inclui a transdução da célula com um polinucleotídeo que codifica um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR, e/ou uma molécula coestimulatória e/ou uma citocina. E algumas modalidades, os métodos ainda compreendem, consistem basicamente ou ainda consistem no cultivo das células sob condições que favorecem a expressão dos (um ou mais dos) polinucleotídeos transduzidos, por exemplo, um polinucleotídeo que codifica o receptor de célula T recombinante (TCR), o repórter dependente da via de TCR, o co-receptor que se liga aos ligantes do complexo de histocompatibilidade principal Classe I ou Classe II (MHC), opcionalmente um complexo de sinalização multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR, à molécula coestimulatória e/ou à citocina. Em uma modalidade, os métodos ainda compreendem, consistem basicamente ou ainda consistem no isolamento das células que expressam o receptor de célula T recombinante (TCR), o repórter dependente da via de TCR, o co-receptor que se liga aos ligantes de complexo de histocompatibilidade principal Classe I ou Classe II (MHC) e/ou, opcionalmente, um complexo de sinalização
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106/222 multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR, e ainda opcionalmente a molécula coestimulatória e/ou a citocina. Em uma modalidade, as células são isoladas por um método que compreende citometria de fluxo. As células isoladas são cultivadas sob condições para expansão e expressão continuada dos polinucleotídeos transduzidos, com isso fornecendo uma população de células.
[177] Em certos aspectos, a revelação está relacionada aos métodos in vitro de medição da potência das moléculas de pMHC que estão opcionalmente acopladas aos núcleos de nanoparticula. Os métodos compreendem ou, alternativamente, consistem basicamente ou ainda consistem: (a) no contato de uma célula transduzida que expressa um receptor de célula T (TCR) e um repórter dependente da via de TCR e um co-receptor que se liga a um ligante de MHC, com uma quantidade eficaz de uma composição que compreende pMHC, e (b) na detecção do referido repórter dependente da via de TCR ou um sinal do referido repórter. Em um aspecto adicional, as células ainda compreendem um complexo de CD3 e/ou um receptor coestimulatório e/ou um receptor de citocina.
[178] Em outra modalidade, o contato é in vitro.
[179] Em uma modalidade, pelo menos uma pMHC no complexo interage com o TCR, em que a interação ativa a via TCRdependente. Em algumas modalidades, o repórter dependente da via de TCR é um repórter de ativação de TCR ou ativação da via de TCR. Em uma modalidade, a característica do repórter compreende concentração celular, expressão, atividade, localização, modificação de proteína ou interações proteínaproteína. Em uma modalidade, o repórter é um repórter natural, intrínseco para o tipo de célula efetora, que possui
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107/222 uma característica de ser detectável e se correlaciona com ativação de TCR, ou ativação da via de TCR. Em algumas modalidades, o repórter é um repórter artificial, exógeno para o tipo de célula efetora, que possui uma característica de ser detectável e se correlaciona com ativação de TCR ou ativação da via de TCR.
[180] Em algumas modalidades, as células isoladas são como descritas acima, por exemplo, células efetoras que compreendem um ou mais de JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM, Molt-4, ou células T primárias. Exemplos não limitantes de células CD3-negativas incluem, sem limitação, BW5147 (N° ATCC TIB-472), Nk-92 (N° ATCC CRL-2407), Mino (N° ATCC PTSCRL-3000) e JeKo-1 (N° ATCC CRL-3006).
[181] Em uma modalidade, o repórter dependente da via de TCR compreende, consiste basicamente ou ainda consiste em um gene que codifica uma proteína selecionada do grupo que consiste em uma luciferase (vaga-lume ou Renilla), uma betalactamase, CAT, SEAP, uma proteína fluorescente, e um produto gênico quantificável. Em algumas modalidades, o repórter dependente da via de TCR compreende, consiste basicamente ou ainda consiste em uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição NF-κΒ, uma sequência de DNA de AP-1 ou promotor de ligação de fator de transcrição, ou uma sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição IL-2. Em uma modalidade, o repórter compreende, consiste basicamente ou ainda consiste em um gene, cuja expressão está sob o controle da via TCR-dependente.
[182] Em uma modalidade, um complexo de sinalização
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108/222 multissubunidades da cadeia CD3 associado ao TCR compreende ou, alternativamente, consiste basicamente ou ainda adicionalmente consiste em um polipeptídeo ou polipeptídeos de cadeias de TCR α e β, os polipeptídeos CD3y, δ e e, e as cadeias ζ. Com a formação em módulos diferentes, o complexo TCR/CD3 pode desempenhar diferentes papéis. Em uma modalidade, o complexo está envolvido no reconhecimento antígeno-específico. Em algumas modalidades, o complexo está envolvido na transdução de sinal primariamente por meio da presença de motivo de ativação de imunorreceptor com baseado em tirosina (ITAM) nas caudas citoplasmáticas das cadeias CD3. Em algumas modalidades, o complexo TCR/CD3 está envolvido na via de sinalização de TCR estimulada por um antígeno, um superantígeno ou um anticorpo (por exemplo, anticorpo anti-receptor). Em uma modalidade, a expressão exógena do complexo TCR/CD3 facilita a via de sinalização de TCR em células CD3-negativas. Exemplos não limitantes de células CD3-negativas incluem, sem limitação, BW5147 (N° ATCC TIB-472), Nk-92 (N° ATCC CRL-2407), Mino (N° ATCC PTSCRL-3000) e JeKo-1 (N° ATCC CRL-3006) . Em um aspecto adicional, as células expressam endogenamente receptores para uma citocina e/ou separadamente, uma molécula coestimulatória.
Usos do ensaio de potência
[183] Em um aspecto, o ensaio de potência pode medir a potência, pureza ou atividade de nanopartículas de pMHC. O ensaio pode ser usado como, por exemplo, uma etapa de controle de qualidade para monitorar diferente bateladas ou lotes de pMHC-NP para verificar que o lote compreende pMHCs funcionantes capazes de se ligar às células T e/ou induzir
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109/222 a resposta imune desejada. Em um aspecto, o ensaio de potência pode medir a atividade de nanopartículas de pMHC, que opcionalmente compreendem, ou ainda consistem ou, alternativamente, ainda consistem basicamente em uma ou mais moléculas coestimulatórias e/ou uma ou mais citocinas acopladas ao núcleo de nanoparticula.
[184] Quando às nanopartículas que podem ser testadas no ensaio, os complexos de pMHC em cada núcleo de nanoparticula são os mesmos ou diferentes uns dos outros; e/ou as MHCs dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as citocinas em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as moléculas coestimulatórias em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou os diâmetros dos núcleos de nanoparticula são os mesmos ou diferentes uns dos outros; e/ou as valências dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as densidades dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou a valência e/ou a densidade das moléculas coestimulatórias em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou a valência e/ou a densidade das citocinas em cada núcleo de nanoparticula são as mesmas ou diferentes umas das outras. Em um aspecto, uma composição é testada, em que a composição que compreende nanopartículas que possuem vários complexos de pMHC e depois uma pluralidade separada de nanopartículas que são coestimulatórias e, opcionalmente, citocinas. Como acima, os complexos de pMHC em cada núcleo de nanoparticula são os mesmos ou diferentes uns dos outros; e/ou as MHCs dos
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110/222 complexos de pMHC em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as citocinas em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as moléculas coestimulatórias em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou os diâmetros dos núcleos de nanopartícula são os mesmos ou diferentes uns dos outros; e/ou as valências dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou as densidades dos complexos de pMHC em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou a valência e/ou a densidade das moléculas coestimulatórias em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras; e/ou a valência e/ou a densidade das citocinas em cada núcleo de nanopartícula são as mesmas ou diferentes umas das outras.
[185] Em certos aspectos, as nanopartículas que podem ser testadas no ensaio, as nanopartículas são fornecidas em uma composição que compreende vários dos complexos de nanopartícula fornecidos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, as composições ainda compreendem um carreador, opcionaímente um carreador farmacêutico.
[186] O ensaio pode ser usado para determinar a potência de pMHCs que estão opcionaímente acopladas às nanopartículas, por exemplo, nanopartículas de pMHC. Os termos partícula, nanopartícula, micropartícula, glóbulo, microesfera, e equivalentes gramaticais destes, se aplicam nesse relatório descritivo a pequenas partículas distintas que são administráveis a um indivíduo. Em certas modalidades, as partículas têm formato substancialmente esférico. O termo substancialmente esférico, como usado
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111/222 nesse relatório descritivo, significa que o formato das partículas não se desvia de uma esfera por mais do que cerca de 10%. Vários complexos de antígenos ou peptídeos conhecidos da revelação podem ser aplicados às partículas.
[187] Nanopartícuias de MHC-peptídeo que são compatíveis e capazes de serem analisadas usando o ensaio de potência descrito nesse relatório descritivo são pelo menos aquelas como descritas, apenas como exemplo não limitante, em WO 2008/109852, WO 2012/041968, WO 2012/062904, WO 2013144811, WO 2014/050286, WO 2015/063616, WO 2016/198932, ou PCT/IB2017/001508, todos incorporados por referência nesse relatório descritivo em suas totalidades.
[188] O ensaio de potência descrito nesse relatório descritivo pode ser usado para quantificar um sinal de uma célula que foi pelo menos transduzida com um TCR recombinante e um repórter via-dependente. A quantificação do sinal pode ser realizada e utilizada de várias formas por aqueles habilitados na técnica. Em certas modalidades, o sinal pode ser quantificado e comparado com um limiar pré-definido para determinar se certa preparação de um nanomedicamento ou nanopartícuia é aprovada em uma etapa de controle de qualidade. O limiar pode ser pelo menos cerca de 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 70%, 800%, 900 % ou 1.000% do sinal quantificado de um controle negativo. Um controle negativo pode ser, por exemplo, uma célula com um TCR recombinante e desprovida de um repórter do tipo quantificado; ou um nanomedicamento ou nanopartícula que compreende um peptídeo complexo de MHC irrelevante ou nenhum complexo peptídeo-MHC. Em certas modalidades, ensaio de potência pode ser usado para definir uma IC50 de uma preparação de nanopartículas
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112/222 particular .
Composições do núcleo e de camadas da nanopartícula
[189] 0 núcleo de nanopartícula da pMHC-NP compreende, ou consiste basicamente ou ainda adicionalmente consiste em um núcleo, por exemplo, um núcleo sólido, um núcleo de metal, um núcleo de dendrímero, um núcleo de nanopartícula de micela polimérica, um nanobastão, um fulereno, uma nanocasca, um núcleo/casca, uma nanoestrutura à base de proteína ou uma nanoestrutura à base de lipídeo. Em alguns aspectos, o núcleo de nanopartícula é bioabsorvível e/ou biodegradável. Em alguns aspectos, o núcleo de nanopartícula é um núcleo de nanopartícula de dendrímero que compreende ou, alternativamente, que consiste basicamente, ou ainda que consiste em uma macromolécula altamente ramificada que possui uma estrutura em forma de árvore que cresce a partir de um núcleo. Em aspectos adicionais, o núcleo de nanopartícula de dendrímero pode compreender ou, alternativamente, consistir basicamente, ou ainda adicionalmente consistir em um dendrímero à base de poli (amidoamina) ou um dendrímero à base de poli-L-lisina. Em certos aspectos, o núcleo de nanopartícula é um núcleo de micela polimérica que compreende ou, alternativamente, que consiste basicamente, ou ainda que consiste em um copolímero em bloco anfifílico montado em uma estrutura núcleo-casca em escala nano. Em aspectos adicionais, o núcleo de micela polimérica compreende ou, alternativamente, consiste basicamente, ou ainda adicionalmente consiste em uma micela polimérica produzida usando copolímero em bloco de polietileno glicol-diaestearoilfosfatidiletanolamina. Em um aspecto adicional, o núcleo de nanopartícula compreende ou,
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113/222 alternativamente, consiste basicamente ou ainda adicionalmente consiste em um metal. Em outro aspecto, o núcleo de nanopartícula não é um lipossomo. Exemplos adicionais de núcleo materiais incluem, sem limitação, vidros comuns e especializados, sílica, poliestireno, poliéster, policarbonato, polímeros acrílicos, poliacrilamida, poliacrilonitrila, poliamida, fluorpolímeros, silicone, celuloses, silício, metais (por exemplo, ferro, ouro, prata), minerais (por exemplo, rubi), nanopartícuias (por exemplo, nanopartículas de ouro, partículas coloidais, óxidos de metal, sulfetos de metal, selenetos de metal, e materiais magnéticos como, por exemplo, óxido de ferro), e compósitos destes. Em algumas modalidades, um núcleo de nanopartícula de óxido de ferro compreende óxido de ferro (II, III) · 0 núcleo poderia ser de composição homogênea, ou um compósito de duas ou mais classes de materiais, dependendo das propriedades desejadas. Em certos aspectos, serão usadas nanopartículas de metal. Essas partículas ou nanopartículas de metal podem ser formadas por Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Co, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si e In, seus precursores, suas ligas binárias, suas ligas ternárias e seus compostos intermetálicos. Veja a Patente U.S. N° 6.712.997, que é incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Em certas modalidades, as composições do núcleo e camadas (descritas abaixo) podem variar, desde que as nanopartículas sejam biocompatíveis e bioabsorvíveis. 0 núcleo poderia ser de composição homogênea ou um compósito de duas ou mais classes de material, dependendo das propriedades desejadas. Em certos aspectos, serão usadas nanoesferas de metal. Essas
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114/222 nanopartícuias de metal podem ser formadas por Fe, Ca, Ga e semelhantes. Em certas modalidades, a nanopartícula compreende ou, alternativamente, consiste basicamente ou ainda adicionalmente consiste em um núcleo que compreende metal ou óxido de metal como, por exemplo, óxido de ouro ou ferro. Em algumas modalidades, diversas moléculas coestimulatórias e/ou diversas citocinas são acopladas a um núcleo de dendrímero ou núcleo de micela polimérica de nanopartícula.
[190] As partículas tipicamente consistem em um núcleo substancialmente esférico e, opcionalmente, uma ou mais camadas ou revestimentos. O núcleo pode variar em tamanho e composição, como descrito nesse relatório descritivo. Além do núcleo, a partícula pode ter uma ou mais camadas para fornecer funcionalidades apropriadas para as aplicações de interesse. As espessuras das camadas, se presentes, podem variar dependendo das necessidades das aplicações específicas. Por exemplo, as camadas podem transmitir propriedades ópticas úteis.
[191] As camadas também podem transmitir funcionalidades químicas ou biológicas, denominadas nesse relatório descritivo camadas quimicamente ativas ou biologicamente ativas. Essas camadas tipicamente são aplicadas na superfície externa da partícula e podem transmitir funcionalidades às pMHC-NPs. A camada ou camadas podem tipicamente variar em espessura de cerca de 0,001 micrômetros (1 nanômetro) até cerca de 10 micrômetros ou mais (dependendo do diâmetro de partícula desejado) ou de cerca de 1 nm até 5 nm ou, alternativamente, de cerca de 1 nm até cerca de 10 nm ou, alternativamente, de cerca de 1 nm até cerca de 40
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115/222 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 25 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 20 nm, e faixas entre esses valores.
[192] A camada ou revestimento pode compreender ou, alternativamente, consistir basicamente, ou ainda adicionalmente consistir em um açúcar ou outro polímero biodegradável. Exemplos de camadas biodegradáveis incluem, sem limitação, dextrana; poli(etileno glicol); poli(etileno óxido); manitol; poli(ésteres) baseados em polilactídeo (PLA), poliglicolídeo (PGA), policaprolactona (PCL); poli(hidroxalcanoato) de a classe PHB-PHV; e outros poli(sacarídeos) modificados como, por exemplo, amido, celulose e quitosana. Adicionalmente, a nanopartícula pode incluir uma camada com superfícies adequadas para adesão de funcionalidades químicas para sítios de ligação ou acoplamento químico.
[193] As camadas podem ser produzidas nas nanopartículas de diversas forma conhecidas por aqueles habilitados na técnica. Exemplos incluem técnicas de química sol-gel, como descritas em Iler, Chemistry of Sílica, John Wiley & Sons, 1979; Brinker e Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990). Abordagens adicionais para a produção de camadas em nanopartículas incluem técnicas de química de superfície e de encapsulação, como descritas em Partch e Brown, J. Adhesion, 67: 259-276, 1998; Pekarek e cols., Nature, 367: 258, (1994); Hanprasopwattana, Langmuir, 12: 3.173-3.179, (1996); Davies, Advanced Materials, 10: 1.264-1.270, (1998); e referências neles citadas. Técnicas de deposição por vapor também podem ser usadas; veja, por exemplo, Golman e Shinohara, Trends Chem. Engin., 6: 1-6, (2000); e Patente U.S. N° 6.387.498. Ainda outras abordagens incluem técnicas
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116/222 de automontagem de camada-por-camada, como descritas em Sukhorukov e cols., Polymers Adv. Tech., 9 (10-11): 759-767, (1998); Caruso e cols., Macromolecules, 32 (7): 2.317-2.328, (1998); Caruso e cols., J. Amer. Chem. Soe., 121 (25): 6.0396.046, (1999); Patente U.S. N° 6.103.379, e referências neles citadas.
[194] As nanoparticulas podem compreender, consistir basicamente ou ainda adicionalmente consistir em um núcleo de nanoparticula acoplado a diversos complexos de antígeno relevante para doenças-MHC que são úteis para expansão e diferenciação de populações de células T e tratamento de doença, quando administrados em uma quantidade eficaz a um indivíduo. Em alguns aspectos, o número de pMHCs por núcleo de nanopartícuia (denominadas nesse relatório descritivo a valência do complexo de nanopartícula) possui diversas faixas, como descrito acima e incorporado por referência nesse relatório descritivo.
[195] Em alguns aspectos, o núcleo de nanopartícula é um núcleo de nanopartícula de dendrímero que compreende ou, alternativamente, que consiste basicamente, ou ainda que consiste em uma macromolécula altamente ramificada que possui uma estrutura em forma de árvore que cresce a partir de um núcleo. Em aspectos adicionais, a nanopartícula de dendrímero pode compreender ou, alternativamente, consistir basicamente, ou ainda adicionalmente consistir em um dendrímero à base de poli(amidoamina) ou um dendrímero à base de polí-L-lísina. Em certos aspectos, o núcleo de nanopartícula é um núcleo de micela polimérica que compreende ou, alternativamente, que consiste basicamente, ou ainda que consiste em um copolímero em bloco anfifílico montado em uma
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117/222 estrutura núcleo-casca em escala nano. Em aspectos adicionais, o núcleo de micela polimérica pode compreender ou, alternativamente, consistir basicamente, ou ainda adicionalmente consistir em uma micela polimérica produzida usando copolímero em bloco de polietileno glicoldiaestearoilfosfatidiletanolamina. 0 núcleo de dendrímero ou núcleo de micela polimérica pode ainda compreender um revestimento ou camada externa, como descrito nesse relatório descritivo.
[196] Em certas modalidades, meios de síntese específicos de nanopartícuias de dendrímero ou nanopartículas com um núcleo de nanopartícula de dendrímero podem exigir que íons metálicos sejam extraídos no interior de dendrímeros e depois subsequentemente quimicamente reduzidos para gerar partículas de tamanho quase monodisperso que possuem dimensões de menos do que 3 nm, por exemplo, o método revelado em Crooks e cols., Synthesis, Characterization, and Applications of Dendrimer-Encapsulated Nanoparticles, The Journal of Physical Chemistry B (109): 692-704 (2005), em que o componente do núcleo de dendrímero resultante serve não apenas como um modelo para preparação da nanopartícula, mas também para estabilizar a nanopartícula, tornando possível fazer um ajuste fino da solubilidade, e fornece um meio para imobilização da nanopartícula em suportes sólidos. Em algumas modalidades, diversas moléculas coestimulatórias e/ou diversas citocinas são acopladas a um núcleo de nanopartícula de dendrímero ou a um núcleo de micela polimérica.
[197] O tamanho do núcleo de nanopartícula pode variar de cerca de 1 nm até cerca de 1 pm. Em certas modalidades,
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118/222 o núcleo de nanopartícula é menor do que cerca de 1 pm em diâmetro. Em outras modalidades, o núcleo de nanopartícula é menor do que cerca de 500 nm, menor do que cerca de 400 nm, menor do que cerca de 300 nm, menor do que cerca de 200 nm, menor do que cerca de 100 nm ou menor do que cerca de 50 nm em diâmetro. Em modalidades adicionais, o núcleo de nanopartícula é de cerca de 1 nm até cerca de 10 nm, 15 nm, 2 0 nm, 2 5 nm, 3 0 nm, 4 0 nm, 50 nm, 7 5 nm ou 100 nm em diâmetro. Em modalidades específicas, o núcleo de nanopartícula possui um diâmetro de cerca de 1 nm até cerca de 100 nm; de cerca de 1 nm até cerca de 75 nm; de cerca de 1 nm até cerca de 50 nm; de cerca de 1 nm até cerca de 25 nm; de cerca de 1 nm até cerca de 25 nm; de cerca de 5 nm até cerca de 100 nm; de cerca de 5 nm até cerca de 50 nm; de cerca de 5 nm até cerca de 25 nm; de cerca de 15 nm até cerca de 25 nm; ou cerca de 20 nm. Em algumas modalidades, o núcleo de nanopartícula possui um diâmetro de cerca de 25 nm até cerca de 60 nm, ou de cerca de 25 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 20 nm até cerca de 40 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 40 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 35 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 30 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 25 nm ou, alternativamente, cerca de 15 nm ou cerca de 20 nm ou cerca de 25 nm ou cerca de 30 nm ou cerca de 35 nm ou cerca de 4 0 nm.
[198] O tamanho da pMHC-NP, com ou sem a camada, pode variar de cerca de 5 nm até cerca de 1 pm em diâmetro. Em certas modalidades, o complexo pMHC-NP é menor do que cerca de 1 pm ou, alternativamente, menor do que 100 nm em diâmetro. Em outras modalidades, o complexo pMHC-NP é menor
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119/222 do que cerca de 500 nm, menor do que cerca de 400 nm, menor do que cerca de 300 nm, menor do que cerca de 200 nm, menor do que cerca de 100 nm ou menor do que cerca de 50 nm em diâmetro. Em modalidades adicionais, o complexo é de cerca de 5 nm ou 10 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 5 nm até cerca de 7 5 nm, ou de cerca de 5 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 5 nm até cerca de 60 nm, ou de cerca de 10 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 10 nm até cerca de 60 nm, ou de cerca de 10 nm até cerca de 70 nm, ou de cerca de 10 nm até cerca de 75 nm, ou de cerca de 20 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 20 nm até cerca de 60 nm, ou de cerca de 20 nm até cerca de 70 nm, ou de cerca de 20 nm até cerca de 75 nm, ou de cerca de 30 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 30 nm até cerca de 60 nm, ou de cerca de 30 nm até cerca de 70 nm, ou de cerca de 30 nm até cerca de 75 nm ou, em um aspecto, cerca de 55 nm em diâmetro. Em modalidades específicas, o complexo pMHC-NP é de cerca de 35 nm até cerca de 60 nm, de cerca de 35 nm até cerca de 70 nm, ou de cerca de 35 nm até cerca de 7 5 nm em diâmetro. Em um aspecto, o complexo pMHC-NP é de cerca de 30 nm até cerca de 50 nm em diâmetro.
Complexos antígeno-MHC
[199] As nanopartículas compreendem um núcleo de nanoparticula, com ou sem uma camada, acoplado a um complexo antígeno-MHC (pMHC). Os antígenos são selecionados para o tratamento do distúrbio autoimune, alérgeno, doença infecciosa ou câncer particular.
[200] O polipeptídeo individual (por exemplo, MHC) e os componentes antigênicos (por exemplo, peptídeo) formam um complexo por meio de ligação covalente ou não covalente (por
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120/222 exemplo, por meio de ligações hidrogênio, ligações iônicas ou ligações hidrofóbicas). A preparação desses complexos pode exigir graus variáveis de manipulação e esses métodos são bem conhecidos na literatura. Em alguns aspectos, componentes antigênicos podem ser associados não covalentemente com a porção de bolso do componente de MHC, por exemplo, por misturação da MHC e dos componentes antigênicos; isso se baseia na afinidade de ligação natural entre uma MHC e um antígeno. Alternativamente, em alguns aspectos, o componente de MHC pode ser ligado covalentemente ao componente antigênico com o uso de procedimentos padronizados incluindo, sem limitação, a introdução de agentes de acoplamento conhecidos ou marcação por fotoafinidade (veja, por exemplo, Hall e cols., Biochemistry 24: 5.702-5.711 (1985)). Em certos aspectos, um componente antigênico pode ser acoplado operativamente ao componente de MHC por meio de ligações peptídicas ou outros métodos discutidos na literatura incluindo, sem limitação, adesão por meio de grupos carboidrato nas glicoproteínas incluindo, por exemplo, as porções de carboidrato das cadeias-alfa e/ou -beta. Em modalidades particulares, o componente antigênico pode ser anexado à extremidade do terminal-N ou do terminalC de uma molécula de MHC apropriada. Alternativamente, em certas modalidades, o complexo de MHC pode ser formado recombinantemente por incorporação da sequência do componente antigênico em uma sequência que codifica uma MHC, de modo que ambos retenham suas propriedades funcionais.
[201] Múltiplos complexos antígeno-MHC podem ser acoplados ao mesmo núcleo de nanopartícula; esses complexos, MHCs e/ou antigenos podem ser iguais ou diferentes uns dos
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121/222 outros e o número de pMHCs por núcleo de nanopartícula (denominadas nesse relatório descritivo a valência do complexo de nanopartícula) tendo várias faixas, como descrito nesse relatório descritivo. A valência pode variar entre cerca de 1 complexo de pMHC para 1 núcleo de nanopartícula (1:1) até cerca de 6.000 complexos de pMHC para 1 núcleo de nanopartícula (6.000:1) ou, alternativamente, entre cerca de 8:1 até cerca de 6.000:1 ou, alternativamente, entre cerca de 10:1 até 6.000:1; ou, alternativamente, de cerca de 11:1 até cerca de 6.000:1 ou, alternativamente, entre cerca de 12:1 até cerca de 6.000:1 ou, alternativamente, pelo menos 2:1 ou, alternativamente, pelo menos 8:1 ou, alternativamente, pelo menos 9:1 ou, alternativamente, pelo menos 10:1 ou, alternativamente, pelo menos 11:1 ou, alternativamente, pelo menos 12:1. Em alguns
aspectos, a valência é de cerca de 10 : 1 até cerca de 6.000:1,
ou de cerca de 20:1 até cerca de 5500 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até cerca de 5000 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até cerca de 4000 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até cerca de 3500 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até cerca de 3000 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até cerca de 2500 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até cerca de 2000 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até cerca de 1500 : 1 ou, alternativamente,
de cerca de 10:1 até 1.000:1 ou, alternativamente, de cerca
de 10:1 até cerca de 500:1 ou, alternativamente, de cerca de
10: 1 até cerca de 100 : 1 ou, alternativamente, de cerca de
20: 1 até cerca de 50 : 1 ou, alternativamente, de cerca de
25: 1 até cerca de 60 : 1 ou, alternativamente, de cerca de
30: 1 até cerca de 50 : 1 ou, alternativamente, de cerca de
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122/222
35:1 até cerca de 45:1 ou, alternativamente, cerca de 40:1. Em outro aspecto, a valência dos complexos de pMHC por núcleo de nanoparticula é de cerca de 10:1 até cerca de 100:1 ou, alternativamente, de cerca de 10:1 até cerca de 1.000:1 ou, alternativamente, de 8:1 até 10:1 ou, alternativamente, de 13:1 até 50:1.
[202] O Requerente também descobriu que a densidade de pMHC na nanoparticula regula a habilidade das pMHC-NPs para desencadear ou diferenciar a formação de célula TrI de uma forma dose-independente. A densidade é calculada como o número de complexos por área de superfície unitária da nanoparticula. A área de superfície da nanoparticula pode ser determinada com ou sem as camadas incluindo, sem limitação, vinculadores que conjugam o complexo de pMHC à nanoparticula. Para fins de cálculo da densidade, o valor da área de superfície relevante se baseia no diâmetro final da construção de partícula sem o complexo de pMHC, com ou sem a camada externa no núcleo de nanoparticula.
[203] Nesses aspectos, a densidade de pMHC por nanoparticula é de cerca de 0,025 pMHC/100 nm2 até cerca de 100 pMHC/100 nm2 da área de superfície do núcleo de nanoparticula ou, alternativamente, de cerca de 0,406 pMHC/100 nm2 até cerca de 50 pMHC/100 nm2 ou, alternativamente, de cerca de 0,05 pMHC/100 nm2 até cerca de 25 pMHC/100 nm2. Em certos aspectos, a densidade de pMHC por nanoparticula é de cerca de 0,2 pMHC/100 nm2 até cerca de 25 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100 nm2 até cerca de 20 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100 nm2 até cerca de 15 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100 nm2 até cerca de 14 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100 nm2 até cerca
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123/222 de 13 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100 nm2 até cerca
de 12 i dMHC/100 nm 2, ou de cerca de 0,4 p MHC/100 nm2 até
cerca de 11.6 pMHC/100 nm2, ou de cerca de i 3,4 pMHC/100 nm2
até cerca de 11. 5 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 11 . pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 10 1 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 9 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 8 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 7 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 6 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 5 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 4 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 3 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 2, 5 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 2 pMHC/100 nm2, ou de cerca de 0,4 pMHC/100
nm2 até cerca de 1, ,5 pMHC/100 nm2.
[204] Ainda em outro aspecto, a nanopartícula possui uma densidade de pMHC como definida nesse relatório descritivo de cerca de 0,4 pMHC/100 nm2 até cerca de 1,3 pMHC/100 nm2 ou, alternativamente, de cerca de 0,5 pMHC/100 nm2 até cerca de 0,9 pMHC/100 nm2 ou, alternativamente, de cerca de 0,6 pMHC/100 nm2 até cerca de 0,8 pMHC/100 nm2, e ainda em que o núcleo de nanopartícula possui um diâmetro de cerca de cerca de 25 nm até cerca de 60 nm, ou de cerca de 25 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 20 nm até cerca de 40 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 50 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 40 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 35 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 30 nm, ou de cerca de 15 nm até cerca de 25 nm ou, alternativamente, cerca de 15 nm ou cerca de 20 nm ou cerca de 25 nm ou cerca de 30 nm ou cerca
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124/222 de 35 nm ou cerca de 40 nm. Em uma modalidade, a densidade dos complexos de pMHC por nanopartícula compreende cerca de 0,2 pMHC/100 nm2 da área de superfície da nanopartícula até cerca de 0,8 ou 10 pMHC/100 nm2 da área de superfície da nanopartícula. Em outro aspecto, a densidade dos complexos de pMHC por nanopartícula é cerca de 0,65 pMHC/100 nm2 da área de superfície da nanopartícula até cerca de 12 pMHC/100 nm2 da área de superfície da nanopartícula, além de faixas de densidade adicionais reveladas nesse relatório descritivo e incorporadas nesse relatório descritivo por referência.
[205] Em alguns aspectos, a distância intermolecular dos complexos de pMHC é de cerca de 4 nm até cerca de 300 nm ou,
alternativamente, cerca de 10 nm até cerca de 250 nm ou,
alternativamente, cerca de 10 nm até cerca de 200 nm ou,
alternativamente, cerca de 10 até cerca de 150 nm ou,
alternativamente, cerca de 10 nm até cerca de 100 nm ou,
alternativamente, cerca de 10 nm até cerca de 50 nm ou,
alternativamente, cerca de 12 nm até cerca de 30 nm ou,
alternativamente, cerca de 12 nm até cerca de 20 nm. Em
algumas modalidades, a distância intermolecular dos complexos de pMHC é de cerca de 15 nm até cerca de 20 nm.
[206] Em alguns aspectos, é fornecido nesse relatório descritivo um complexo que compreende um núcleo de nanopartícula, em que diversos complexos de antígeno relevante para doenças-MHC (pMHC) são acoplados ao núcleo; o diâmetro do núcleo é de cerca de 15 nm até cerca de 25 nm; e em que a densidade de pMHC na nanopartícula é de cerca de 0,4 pMHC/100 nm2 até cerca de 6 pMHC/100 nm2 da área de superfície da nanopartícula. Em algumas modalidades, o complexo ainda compreende uma camada externa no núcleo de
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125/222 nanopartícuia, em que o complexo de pMHC está acoplado ao núcleo de nanopartícula e/ou à camada externa, e em que o diâmetro do núcleo de nanopartícula e da camada externa é de cerca de 35 nm até cerca de 75 nm ou, alternativamente, de cerca de 35 nm até cerca de 70 nm ou cerca de 35 nm até cerca de 65 nm.
[207] O termo acoplado operativamente ou revestido, como usado nesse relatório descritivo, se refere a uma situação em que o polipeptídeo individual (por exemplo, MHC) e componentes antigênicos (por exemplo, peptídeo) são combinados para formar o complexo ativo antes da ligação no local-alvo, por exemplo, uma célula imune. Isso inclui a situação em que os componentes do complexo de polipeptídeo individuais são sintetizados ou expressos recombinantemente e subsequentemente isolados e combinados para formar um complexo, in vitro, antes da administração a um indivíduo; a situação em que um polipeptídeo quimérico ou de fusão (ou seja, cada componente distinto de proteína do complexo está contido em uma cadeia polipeptídica única) é sintetizado ou expresso recombinantemente como um complexo intacto. Tipicamente, complexos de polipeptídeos são adicionados às nanopartícuias para gerar nanopartículas com complexos polipeptídicos adsorvidos ou acoplados que possuem uma proporção de número de moléculas:número de nanopartícula de cerca de, pelo menos cerca de, ou no máximo cerca de 0,1, 0.5, 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.500 ou mais até: 1, mais tipicamente 0,1:1, 1:1 até 50:1 ou 300:1, e faixas entre esses valores nas quais as proporções fornecem os
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126/222 resultados finais selecionados de cada faixa. 0 teor de polipeptídeo das nanopartículas pode ser determinado com o uso de técnicas padronizadas.
A MHC do antígeno/MHC
[208] Como usado nesse relatório descritivo e salvo quanto especificamente observado em contrário, o termo MHC no contexto de um complexo de pMHC, significa uma proteína MHC Classe I clássica ou não clássica e/ou uma proteína MHC Classe II clássica ou não clássica, quaisquer loci de HLA DR, HLA DQ, HLA DP, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, CDld, OU um fragmento ou equivalente biológico destes, construções de cadeias duplas ou de cadeia única, dímeros (fusões de Fc) , tetrâmeros, formas multiméricas, e uma forma polimérica de MHCI ou MHCII. Em algumas modalidades, a pMHC pode ser uma construção de cadeia única. Em algumas modalidades, a pMHC pode ser uma construção de cadeias duplas.
[209] Em algumas modalidades, a proteína MHC pode ser um dímero ou um multímero.
[210] Em algumas modalidades, a proteína MHC pode compreender um heterodímero ou multímero MHC-alfa-Fc/MHCbeta-Fc do tipo knob-in-hole.
[211] Como observado acima, knob-in-hole é uma arquitetura de polipeptidil que exige uma protuberância (ou knob) em uma interface de um primeiro polipeptídeo e e uma cavidade correspondente (ou um hole) em uma interface de um segundo polipeptídeo, de tal modo que a protuberância possa ser posicionada na cavidade de modo a promover a formação de heteromultímero. Protuberâncias são construídas por substituição de cadeias laterais de aminoácidos pequenas da interface do primeiro polipeptídeo com cadeias laterais
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127/222 maiores (por exemplo, fenilalanina ou tirosina). Cavidades de tamanho idêntico ou similar às protuberâncias são criadas na interface do segundo polipeptídeo por substituição de cadeias laterais de aminoácidos maiores com aquelas menores (por exemplo, alanina ou treonina). As protuberâncias e cavidades podem ser feitas por meios sintéticos, por exemplo, por alteração do ácido nucleico que codifica os polipeptídeos, ou por síntese de peptídeo, usando métodos de rotina para aqueles habilitados na técnica. Em algumas modalidades, a interface do primeiro polipeptídeo está localizada em um domínio Fc no primeiro polipeptídeo; e a interface do segundo polipeptídeo está localizada em um domínio Fc no segundo polipeptídeo.
[212] Como observado acima, MHC-alfa-Fc/MHC-beta-Fc é um heterodímero que compreende um primeiro polipeptídeo e um second polipeptídeo, em que o primeiro polipeptídeo compreende uma cadeia-α de MHC da classe II e um domínio Fc de anticorpo; o segundo polipeptídeo compreende uma cadeiaβ de MHC da classe II e um domínio Fc de anticorpo. Um MHCalf a-Fc/MHC-beta-Fc knob-in-hole ainda exige que os domínios Fc de cada polipeptídeo façam interface entre eles por meio do posicionamento complementar de uma protuberância em um domínio Fc dentro da cavidade correspondente no outro domínio Fc.
[213] Em certas modalidades da revelação, um antígeno particular é identificado e apresentado no complexo antígeno-MHC-nanopart1cuia no contexto de um polipeptídeo de MHC da classe I ou II apropriado. A apresentação de antígenos às células T é mediada por duas classes distintas de moléculas, MHC da classe I (MHC-I) e MHC da classe II (MHC
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II), que utilizam vias de processamento de antígeno distintas. Peptídeos derivados de antígenos intracelulares são apresentados às células T CD8+ por moléculas de MHC da classe I, que são expressas em praticamente todas as células, enquanto peptídeos derivados de antígenos extracelulares são apresentados às células T CD4 + por moléculas de MHC-II. No entanto, há certas exceções a essa dicotomia. Vários estudos demonstraram que peptídeos gerados a partir de proteínas particuladas ou solúveis endocitosadas são apresentados on moléculas de MHC-I em macrófagos, bem como em células dendríticas. Em certos aspectos, a constituição genética de um indivíduo pode ser avaliada para determinar qual polipeptídeo de MHC deve ser usado para um paciente particular e um conjunto de peptídeos particular. Em certas modalidades, o componente de MHC da classe 1 pode compreender, consistir basicamente ou, alternativamente, ainda consistir todo ou em parte em uma molécula de HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G ou CD-I. Em modalidades nas quais o componente de MHC é um componente de MHC da classe II, o componente de MHC da classe II pode compreender, consistir basicamente ou, alternativamente, ainda consistir todo ou em parte em um HLA-DR, HLA-DQ ou HLA-DP. Em certas modalidades, a MHC pode compreender HLA DRB1, HLA DRB3, HLA DRB4, HLA DRB5, HLA DQB1, HLA DQA1, IAg7, I-Ab, I-Ad, HLADQ, HLA-DP, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E ou CDld.
[214] Moléculas de MHC não clássicas também são contempladas para uso em complexos de MHC da revelação. Em algumas modalidades, moléculas de MHC não clássicas são não polimórficas, conservadas entre espécies e possuem bolsas de ligação ao ligante hidrofóbicas estreitas, profundas. Essas
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129/222 bolsas de ligação são capazes de apresentação de glicolipídeos e fosfolipídeos às células T Natural Killer (NKT). Células NKT representam uma população de linfócitos única que co-expressa marcadores de célula NK e um receptor de célula T (TCR) semi-invariante. Elas estão implicadas na regulação de respostas imunes associadas com uma ampla gama de doenças.
[215] Como observado acima, o termo MHC pode ser usado de forma intercambiável com o termo antigeno leucocitário humano (HLA) quando usado em referência à MHC humana; dessa forma, MHC se refere a todos os subtipos de HLA incluindo, sem limitação, os genes de MHC clássica revelados acima: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR, além de todas as variantes, isoformas, isótipos, e outros equivalentes biológicos destes.
[216] MHCs para uso de acordo com a presente revelação podem ser produzidas, isoladas ou purificadas por meio de metodologias conhecidas na técnica. Protocolos comuns para obtenção de MHCs envolvem etapas como, por exemplo, sem limitação, eletroforese ou outras técnicas de separação baseada na carga ou tamanho, biotinilação ou outros métodos de marcação e purificação, ou transfecção e indução de construções de vetor que expressam proteínas MHC. Anticorpos animais purificados também estão disponíveis por fontes comercialmente disponíveis, incluindo varejistas como, por exemplo, eBioscience, Biolegend ou Tonbo Biosciences.
[217] Em certas modalidades, a MHC dos complexos antígeno-MHC pode ser MHCI clássica, MHCI não clássica, MHCII clássica, MHCII não clássica, dímeros (fusões de Fc) , tetrâmeros de MHC, ou uma forma polimérica de MHC. Em algumas
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130/222 modalidades, multímeros de MHC são gerados de acordo com métodos bem documentados na técnica; veja, por exemplo, Bakker e cols. MHC Multimer Technology: Current Status and Future Prospects, Current Opinion in Immunology, Vol. 17, N° 4 páginas 428-433 (2005) e referências nele citadas. Métodos exemplares não limitantes incluem o uso de um agente de biotinilação como, por exemplo, sem limitação, estreptavidina ou avidina, para ligar monômeros de MHC, criando uma estrutura multimérica com o agente como um arcabouço. Dimeros de MHC, especificamente, podem alternativamente ser produzidos por meio de fusão com regiões constantes ou regiões Fc de anticorpo; isso pode ser obtido por meio de acoplamento operativo diretamente ou por meio de um vinculador, por exemplo, um vinculador de cisterna.
Os antígenos da pMHC
[218] Embora exemplos específicos de antigenos e componentes antigênicos sejam revelados nesse relatório descritivo, a revelação não é por eles limitada. Salvo quando especificamente definido em contrário, estão incluídos nesse relatório descritivo equivalentes dos antígenos polipeptídicos isolados ou purificados, que compreendem, ou consistem basicamente ou ainda consistem nas sequências de aminoácidos, como descritas nesse relatório descritivo, ou um polipeptídeo que possui pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência ou, alternativamente, pelo menos 85% ou, alternativamente, pelo menos 90% ou, alternativamente, pelo menos 95% ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência para as sequências de aminoácidos dos antígenos, ou polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que possuem cerca de 80% de identidade de
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131/222 sequência ou, alternativamente, pelo menos 85% ou, alternativamente, pelo menos 90% ou, alternativamente, pelo menos 95% ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência para o polinucleotídeo que codifica as sequências de aminoácidos do antígeno, ou seu complemento, ou um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob condições de rigor moderado a elevado para um polinucleotídeo que codifica a sequência de aminoácidos dos antígenos, ou seu complemento. Também são fornecidos polinucleotídeos isolados e purificados que codificam o polipeptídeos de antígeno revelados nesse relatório descritivo, ou aminoácidos que possuem pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência para eles ou, alternativamente, pelo menos 85% ou, alternativamente, pelo menos 90% ou, alternativamente, pelo menos 95% ou, alternativamente, pelo menos 98% de identidade de sequência para as sequências reveladas, ou um equivalente, ou um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas para o polinucleotídeo, seu equivalente ou seu complemento e polipeptídeos isolados ou purificados codificados por esses polinucleotídeos. Os polipeptídeos e polinucleotídeos podem ser combinados com substâncias de ocorrência não natural com as quais não estão associados na natureza, por exemplo, carreadores, carreadores farmaceuticamente aceitáveis, vetores e moléculas de MHC. Além dos antígenos revelados nesse relatório descritivo, os antígenos revelados em WO 2016/198932 do Requerente, são incorporados nesse relatório descritivo por referência.
Peptídeos modificados e equivalentes destes
[219] Os polipeptídeos antigênicos, proteínas e
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132/222 fragmentos destes podem ser modificados por várias deleções, inserções e/ou substituições de aminoácidos. Em modalidades particulares, polipeptídeos e/ou peptídeos modificados são capazes de modular uma resposta imune em um indivíduo. Como usado nesse relatório descritivo, o termo proteína ou polipeptídeo ou peptídeo se refere a uma molécula que compreende pelo menos cinco resíduos de aminoácidos. Em algumas modalidades, uma versão do tipo selvagem de uma proteína ou peptídeo é empregada; no entanto, em muitas modalidades da revelação, uma proteína ou polipeptídeo modificado é empregado para gerar um complexo peptídeo/MHC/nanopartícuia. Um complexo peptídeo/MHC/nanopartícuia pode ser usado para gerar uma resposta imune e/ou para modificar a população de células T do sistema imune (ou seja, reeducar o sistema imune). Os termos descritos acima podem ser usados de forma intercambiável nesse relatório descritivo. Uma proteína modificada ou polipeptídeo modificado ou peptídeo modificado se refere a uma proteína ou polipeptídeo cuja estrutura química, particularmente sua sequência de aminoácidos, está alterada com relação à proteína ou polipeptídeo do tipo selvagem. Em algumas modalidades, uma proteína ou polipeptídeo ou peptídeo modificado possui pelo menos uma atividade ou função modificada (reconhecendo que proteínas ou polipeptídeos ou peptídeos podem ter múltiplas atividades ou funções). É especificamente contemplado que uma proteína ou polipeptídeo ou peptídeo modificado pode ser alterado com relação a uma atividade ou função, embora retenha uma atividade ou função do tipo selvagem em outros aspectos como, por exemplo, imunogenicidade ou habilidade
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133/222 para interagir com outras células do sistema imune, quando no contexto de um complexo MHC/nanopartícula.
[220] As proteínas da revelação podem ser recombinantes ou sintetizadas in vitro. Alternativamente, uma proteína recombinante pode ser isolada de bactérias ou de outra célula hospedeira.
[221] Também será subentendido que sequências de aminoácidos e de ácidos nucléicos podem incluir resíduos adicionais, por exemplo, aminoácidos do terminal-N ou -C ou sequências de ácidos nucléicos 5 ' ou 3 ' adicionais, respectivamente, e ainda serem basicamente como apresentadas em uma das sequências reveladas nesse relatório descritivo, desde que a sequência atenda aos critérios apresentados acima, incluindo a manutenção da atividade biológica da proteína (por exemplo, imunogenicidade) . A adição de sequências terminais particularmente se aplica às sequências de ácidos nucléicos que, por exemplo, podem incluir várias sequências não codificadoras que flaqueiam as porções 5' ou 3' da região codificadora.
Antígenos relevantes para doença
[222] As nanoparticulas são úteis nos métodos terapêuticos, como descrito nesse relatório descritivo. O complexo de pMHC do pMHC-NP é selecionado para uso com base na doença a ser tratada. Por exemplo, um antígeno relevante para o diabetes é um antígeno ou fragmento deste que é expresso na célula, tecido ou órgão visado naquela doença autoimune e que é exposto ao sistema imune após dano da célula, tecido ou órgão causado pela resposta autoimune, mesmo se o antígeno não é o gatilho do processo de doença ou um participante crucial em sua patogênese e, quando
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134/222 apresentado, produz uma resposta imune que serve para tratar diabetes; dessa forma, um antígeno relevante para o diabetes que atende a essa definição é selecionado para tratar diabetes. Um antígeno relevante para MS é selecionado para tratar MS. Um antígeno relevante para o diabetes não seria selecionado para tratar MS. Antígenos relevantes para doença exemplares, não limitantes, são revelados nesse relatório descritivo e, além disso, esses antígenos podem ser determinados para uma doença particular com base em técnicas, mecanismos e métodos bem documentados na literatura.
[223] Exemplos não limitantes de doenças de interesse incluem, sem limitação, asma, diabetes mellitus Tipo I e Tipo II, pré-diabetes, esclerose múltipla, neuropatia periférica, asma alérgica, cirrose biliar primária, cirrose, distúrbio do espectro da neurite óptica, síndromes neurológicas associadas a autoanticorpos como, por exemplo, síndrome da pessoa rígida, encefalite autoimune, narcolepsia, pênfigo vulgar, pênfigo foliáceo, psoríase, doença/síndrome de Sjõgren, doença inflamatória do intestino (IBD), artrite, artrite reumatóide, lúpus eritematoso sistêmico (SLE), esclerodermia, vasculite associada ao ANCA, síndrome de Goodpasture, doença de Kawasaki, doença celíaca, cardiomiopatia autoimune, cardiomiopatia dilatada idiopática (IDCM), miastenia grave, uveíte autoimune, espondilite anquilosante, doença de Grave, miopatias de mediação imune, síndrome antifosfolipídeo (ANCA+), aterosclerose, hepatite autoimune, colangite esclerosante, colangite esclerosante primária, dermatomiosite, doença pulmonar obstrutiva crônica, lesão da medula espinhal, lesão traumática, destruição pulmonar induzida pelo tabaco, enfisema, pênfigo,
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135/222 uveíte, qualquer outro câncer e/ou doenças dos sistemas nervosos central e periférico relevantes.
[224] Antígenos ou componentes antigênicos exemplares incluem, sem limitação, aqueles revelados no Pedido U.S. N° 15/348.959, que é incorporado nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade.
Antígenos relevantes para o diabetes
[225] Antígenos relevantes para o diabetes incluem, sem limitação, aqueles derivados de PPI, IGRP, GAD, autoantígeno da célula da ilhota-2 (ICA2), e/ou insulina. Peptídeos antigênicos autorreativos, relevantes para o diabetes incluem, sem limitação, hlnsBio-is (HLVEALYLV) , hIGRP228-236 (LNIDLLWSV) , hIGRP265-2?3 (VLFGLGFAI), IGRP206-214 (VYLKTNVFL) , hIGRP206-2i4 (VYLKTNLFL) , NRP-A7 (KYNKANAFL) , NRP-I4 (KYNIANVFL) , NRP-V7 (KYNKANVFL) , YAI/Db (FQDENYLYL) INS B1523 (LYLVCGERG), PPI76-90 (ksss) (SLQPLALEGSLQSRG) , IGRP13-25 (QHLQKDYRAYYTF) , GAD555-567 (NFFRMVISNPAAT) , GAD555-567 <557i) : (NFIRMVISNPAAT) , IGRP23-35 (YTFLNFMSNVGDP) , B24-C36 (FFYTPKTRREAED) , PPI76-90 (SLQPLALEGSLQKRG) , além dos peptídeos e proteínas revelados na Publicação U.S. 2005/0202032, que é incorporada nesse relatório descritivo por referência em sua totalidade. Outros peptídeos que podem ser usados em conjunto com essa revelação como peptídeos autorreativos ou como peptídeos de controle incluem, sem limitação, INS-I9 (LYLVCGERI), TUM (KYQAVTTTL) e G6Pase (KYCLITIFL), bem como equivalentes de cada desses. Exemplos adicionais incluem Pró-insulinaL2-io, ALWMRLLPL; PróinsulinaL3-n, LWMRLLPLL; Pró-insulinaL6-i4, RLLPLLALL; PróinsulinaB5-i4, HLCGSHLVEA; Pró-insulinaBio-is, HLVEALYLV; PróinsulinaBi4-22, ALYLVCGER; Pró-insulinaBi5-24, LYLVCGERGF; PróPetição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 142/245
136/222 insulinaBi7-25, LVCGERGFF; Pró-insulinaBi8-27, VCGERGFFYT; PróinsulinaB2o-2?, GERGFFYT; Pró-insulinaB2i-29, ERGFFYTPK; PróinsulinaB25-ci, FYTPKTRRE; Pró-insulinaB2?-c5, TPKTRREAEDL; Próinsulinac20-28, SLQPLALEG; Pró-insulinac25-33, ALEGSLQKR; Próinsulinac29-A5, SLQKRGIVEQ; Pró-insulinaAi-io, GIVEQCCTSI; PróinsulinaA2-io, IVEQCCTSI; Pró-insulinaAi.2-20, SLYQLENYC ou equivalentes e/ou combinações destes. Antigenos relevantes para diabetes incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antigenos relevantes para MS
[226] Os antigenos da revelação incluem antigenos relacionados à esclerose múltipla. Esses antigenos incluem, por exemplo, aqueles revelados na Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2012/0077686, e antigenos derivados de proteína básica de mielina, glicoproteína associada à mielina, proteína de oligodendrócito de mielina, proteína de proteolipídeo, oligoproteína de mielina de oligodendrócito, proteína básica de oligodendrócito associada à mielina, proteína oligodendrócito-específica, proteínas de choque térmico, proteínas oligodendrócito-específicas NOGO A, glicoproteína Po, proteína de mielina periférica 22, ou nucleotídeo 2'3'-cíclico 3'-fosfodiesterase . Em certas modalidades, o antígeno é derivado da glicoproteína de mielina de oligodendrócito (MOG).
[227] Ainda em aspectos adicionais, antigenos peptídicos para o tratamento de MS e distúrbios relacionados à MS incluem, sem limitação: MOG35-55, MEVGWYRSPFSRWHLYRNGK; MOG36-55, EVGWYRSPFSRWHLYRNGK; MAG287-295, SLLLELEEV; MAG509-517, LMWAKIGPV; MAG556-564, VLFSSDFRI; MBPno-ns, SLSRFSWGA; MOG114122, KVEDPFYWV; MOG166-175, RTFDPHFLRV; MOG172-I80, FLRVPCWKI;
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MOG179-188, KITLFVIVPV; MOG188-196, VLGPLVALI; MOGisi-189, TLFVIVPVL; MOG205-214, RLAGQFLEEL; PLPso-88, FLYGALLLA MAG287-295, SLLLELEEV; MAG509-517, LMWAKIGPV; MAG556-564, VLFSSDFRI, MOG97-109 (TCFFRDHSYQEEA) , MOG97-109 (E107S) (TCFFRDHSYQSEA) , MBP89-ioi (VHFFKNIVTPRTP) , PLP175-192 (YIYFNTWTTCQSIAFPSK), PLP94-108 (GAVRQIFGDYKTTIC, MBP86-98 (PWHFFKNIVTPR - HLA-DRB1 * 15 01 (13mer peptídeo), PLP54-68 (NYQDYEYLINVIHAF) , PLP249-263 (ATLVSLLTFMIAATY) , MOG156-170 (LVLLAVLPVLLLQIT) , MOG201215(FLRVPCWKITLFVIV) , e equivalentes e/ou combinações destes. Antígenos relevantes para esclerose múltipla incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para a doença celíaca (CD)
[228] Antígenos relevantes para doença celíaca incluem, sem limitação, aqueles derivados de aGlia. Antígenos não limitantes relevantes para doença celíaca incluem gliadina. Outros antígenos relevantes para doença celíaca exemplares não limitantes incluem: aGlia57-6s: QLQPFPQPELPY (12mer peptídeo); aGlia62-72 : PQPELPYPQPE (llmer peptídeo); aGlia2i7219; e SGEGSFQPSQQNP (13mer peptídeo) , equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para doena celíaca incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para cirrose bílíar primária (PBC)
[229] Antígenos relevantes para cirrose biliar primária incluem, sem limitação, aqueles derivados de PDC-E2. Exemplos não limitantes de antígenos exemplares incluem: PDC-E2122-135 : GDLIAEVETDKATV (peptídeo de 14mer); PDC-E2249262: GDLLAEIETDKATI (peptídeo de 14mer) ; PDC-E2249-263 : GDLLAEIETDKATIG (peptídeo de 15mer) ; e PDC-E2629-643 :
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AQWLAEFRKYLEKPI (peptídeo de 15mer), equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para cirrose biliar primária incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para pênfigo foliáceo (PF) e pênfigo vulgar (PV)
[230] Antígenos relevantes para PF e PV incluem, sem limitação, aqueles derivados de DG1EC2, desmogleína 3 (DG3 ou DSG3) e/ou desmogleína 1 (DG1 ou DSG1) . Exemplos não limitantes incluem: DG1EC2216-235 : GEIRTMNNFLDREI (peptídeo de 14mer); DG397-ih: FGIFWDKNTGDINI (peptídeo de 15mer) ; e
DG3251-265 : CECNIKVKDVNDNFP (peptídeo de 15mer) , equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para pênfigo foliáceo e pênfigo vulgar incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para neuromíelíte óptica (NMO)
[231] Antígenos relevantes para NMO incluem, sem limitação, aqueles derivados de AQP4 ou aquaporina 4. Exemplos não limitantes incluem: AQP4129-143 : GAGILYLVTPPSWG (peptídeo de 15mer) ; AQP4284-298 : RSQVETDDLILKPGV (peptídeo de 15mer) ; AQP463-?6: EKPLPVDMVLISLC (peptídeo de 14mer) ; AQP4129143: GAGILYLVTPPSWG (peptídeo de 15mer) ; e AQP439-53:
TAEFLAMLIFVLLSL (peptídeo de 15mer), equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para NMO incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para artrite induzida por colágeno
[232] Antígenos relevantes para artrite induzida por colágeno incluem, sem limitação, aqueles derivados de CII.
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Exemplos não limitantes incluem: CCII230-244: APGFPGPRGPPGPQG (peptídeo de 15mer) ; CCII 632-646 : PAGFAGPPGADGQPG (peptídeo de 15mer) ; e CII259-273: GIAGFKGDQGPKGET (peptídeo de 15mer), ou equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para artrite incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para asma alérgica
[233] Antígenos relevantes para asma alérgica incluem, sem limitação, aqueles derivados de DERP-1 e DERP2. Antígenos relevantes para asma alérgica incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para colíte
[234] Antígenos relevantes para colíte experimental incluem, sem limitação, aqueles derivados de integrase de bacteróides, Fla-2/Fla-X, e YIDX. Antígenos relevantes para colíte incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para o lúpus eritematoso sistêmico (SLE)
[235] Antígenos relevantes para SLE incluem, sem limitação, aqueles derivados de H4, H2B, Hl', dsDNA, RNP, Smith (Sm), SSA/Ro, SSB/La (SS-B) e/ou histonas. Exemplos não limitantes incluem os seguintes segmentos de cada proteína: H47i-94: TYTEHAKRKTVTAMDWYALKRQG; H474-88 : EHAKRKTVTAMDWY (peptídeo de 15mer) ; H476-9o: AKRKTVTAMDWYAL (peptídeo de 15mer) ; H475-89 : HAKRKTVTAMDWYA (peptídeo de 15mer) ; H478-92 : RKTVTAMDWYALKR (peptídeo de 15mer) ; H48o-94: TVTAMDWYALKRQ (peptídeo de 15mer) ; H2Bio-24: PKKGSKKAVTKAQKK (peptídeo de 15mer) ; e H2Bi6-3o: KAVTKAQKKDGKKRK (peptídeo de
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15mer), Η1'22-42: STDHPKYSDMIVAAIQAEKNR; e H1 '27-41:
KYSDMIVAAIQAEKN, bem como equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes SLE incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para aterosclerose induzida por dieta rica em gorduras
[236] Antígenos relevantes para aterosclerose induzida por dieta rica em gorduras incluem, sem limitação, aqueles derivados de ApoB. Exemplos não limitantes incluem os seguintes segmentos de cada proteína: ApoBasoi-ssis: SQEYSGSVANEANVY (peptídeo de 15mer) ; ApoBi952-i966 :
SHSLPYESSISTALE (peptídeo de 15mer) ; ApoB9?8-993 :
TGAYSNASSTESASY (peptídeo de 15mer) ; ApoB3498-35i3:
SFLSQEYSGSVANEA (peptídeo de 15mer) ; ApoB2iOA: KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH (peptídeo de 20mer) ; ApoB2iOB: KTTKQSFDLSVKAQY (peptídeo de 15mer) ; e ApoB2ioc: TTKQSFDLSVKAQYK (peptídeo de 15mer) bem como equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para aterosclerose incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para DPOC e enfisema
[237] Antígenos relevantes para DPOC e/ou enfisema incluem, sem limitação, aqueles derivados de elastina. Exemplos não limitantes incluem os seguintes segmentos de elastina. Antígenos relevantes para DPOC e/ou enfisema incluem, sem limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes.
Antígenos relevantes para psoriase
[238] Antígenos relevantes para psoriase incluem, sem
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141/222 limitação, aqueles listados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes. Outros antígenos relevantes para psoríase exemplares não limitantes incluem proteína Adamts-líke humana 5 (ATL5), peptídeo antimicrobiano catelicidina (CAP18) e/ou proteína ADAMTSlike 5 (ADMTSL5).
Antígenos relevantes para hepatite autoimune
[239] Antígenos relevantes para hepatite autoimune incluem, sem limitação, aqueles revelados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes. Outros antígenos relevantes para hepatite autoimune exemplares não limitantes incluem citocromo P450 2D6 (CYP2D6) e/ou antígeno solúvel do fígado (SLA).
Antígenos relevantes para uveíte
[240] Antígenos relevantes para uveíte incluem, sem limitação, aqueles revelados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes. Outros antígenos relevantes para uveíte exemplares não limitantes incluem arrestina, S-arrestina, antígeno retiniano humano S e/ou proteína de ligação ao retinóide de interfotorreceptor (IRBP).
Antígenos relevantes para síndrome de Sjôgren
[241] Antígenos relevantes para síndrome de Sjõgren incluem, sem limitação, aqueles revelados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes. Outros antígenos relevantes para a síndrome de Sjõgren exemplares não limitantes incluem SSA/Ro (TROVE), SSB/La e/ou receptor muscarínico 3 (MR3).
Antígenos relevantes para esclerodermía
[242] Antígenos relevantes para esclerodermia incluem,
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142/222 sem limitação, proteína do centrômero de autoantígeno do centrômero C (CENP-C), DNA topoisomerase I (TOP1) e/ou RNA polimerase III.
Antígenos relevantes para a síndrome antifosfolipídeo
[243] Antígenos relevantes para a síndrome antifosfolipídeo incluem, sem limitação, aqueles revelados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para a síndrome antifosfolipídeo exemplares não limitantes incluem beta-2-glicoproteína 1 (BG2P1 ou APOH).
Antígenos relevantes para a vasculite associada ao ANCA
[244] Antígenos relevantes para a vasculite associada ao ANCA incluem, sem limitação, aqueles revelados na Tabela 1, bem como equivalentes e combinações destes. Antígenos relevantes para vasculite associada ao ANCA exemplares não limitantes incluem mieloperoxidase (MPO), proteinase (PRTN3) ou fator de aumento da permeabilidade bacteriana (BPI).
Tabela 1. Antígenos relacionados a doenças
Antígeno de doença Peptídeos antigênicos Sequência de aminoácidos N° DO ID. DE SEQ.
Antígenos relevantes para artrite induzida por colágeno cCII(230-244) APGFPGPRGPPGPQG 1
cCII(632-646) PAGFAGPPGADGQPG 2
CII (259-273) GIAGFKGDQGPKGET 3
Peptídeos antigênicos relevantes para hlnsB(10-18) HLVEALYLV 4
hIGRP(228-236) LNIDLLWSV 5
hIGRP(265-273) VLFGLGFAI 6
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o diabetes hIGRP(206-214) VYLKTNLFL 7
IGRP(206-214) VYLKTNVFL 8
IGRP(13-25) QHLQKDYRAYYTF 9
IGRP(23-35) YTFLNFMSNVGDP 10
NRP-A7 KYNKANAFL 11
NRP-I4 KYNIANVFL 12
NRP-V7 KYNKANVFL 13
YAI/Db FQDENYLYL 14
INS B(15-23) LYLVCGERG 15
INS-I9 LYLVCGERI 16
PPI (76-90) SLQPLALEGSLQKRG 17
PPI (76-90) (88S) SLQPLALEGSLQSRG 18
GAD(555-567) NFFRMVISNPAAT 19
GAD(555-567) (5571) NFIRMVISNPAAT 20
Pró-insulina(B24- C36) FFYTPKTRREAED 21
TUM KYQAVTTTL 22
G6Pase KYCLITIFL 23
Pró-insulina(L2-10) ALWMRLLPL 24
Pró-insulina(L3-11) LWMRLLPLL 25
Pró-insulina(L6-14 RLLPLLALL 26
Pró-insulina(B5-14) HLCGSHLVEA 27
Pró-insulina(BI0-18) HLVEALYLV 28
Pró-insulina(B14-22) ALYLVCGER 29
Pró-insulina(B15-24) LYLVCGERGF 30
Pró-insulina(B17-25) LVCGERGFF 31
Pró-insulina(B18-27) VCGERGFFYT 32
Pró-insulina(B20-27) GERGFFYT 33
Pró-insulina(B21-29) ERGFFYTPK 34
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Pró-insulina(B25-C1) FYTPKTRRE 35
Pró-insulina(B27-C5) TPKTRREAEDL 36
Pró-insulina(C20-28) SLQPLALEG 37
Pró-insulina(C25-33) ALEGSLQKR 38
Pró-insulina(C29-A5) SLQKRGIVEQ 39
Pró-insulina(Al-10) GIVEQCCTSI 40
Pró-insulina(A2-10) IVEQCCTSI 41
Pró-insulina(A12-20) SLYQLENYC 42
Antígenos relacionados à esclerose múltipla MOG(35-55) ME VGWYRS P F S RWHL Y RNGK 43
MOG(6-20) IGPRHPIRALVGDEV 44
MOG(36-55) EVGWYRSPFSRWHLYR NGK 45
MOG(114-122) KVEDPFYWV 46
MOG(166-175) RTFDPHFLRV 47
MOG(172-180) FLRVPCWKI 48
MOG(179-188) KITLFVIVPV 49
MOG(188-196) VLGPLVALI 50
MOG(181-189) TLFVIVPVL 51
MOG(205-214) RLAGQFLEEL 52
MOG(97-109) TCFFRDHSYQEEA 53
MOG(97-109) (E107S) TCFFRDHSYQSEA 54
MOG(223-237) ALIICYNWLHRRLAG 55
MOG(156-170) LVLLAVLPVLLLQIT 56
MOG(201-215) FLRVPCWKITLFVIV 57
MOG(38-52) RHPIRALVGDEVELP 58
MOG(203-217) RVPCWKITLFVIVPV 59
MAG(287-295) SLLLELEEV 60
MAG(509-517) LMWAKIGPV 61
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 151/245
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MAG(556-564) VLFSSDFRI 62
MAG(509-517) LMWAKIGPV 63
MAG(556-564) VLFSSDFRI 64
MBP(110-118) SLSRFSWGA 65
MBP (13-32) KYLATASTMDHARHGFL PRH 66
MBP(83-99) ENPWHFFKNIVTPRTP 67
MBP(111-129) LSRFSWGAEGQRPGFGY GG 68
MBP(146-170) AQGTLSKIFKLGGRDSR SGSPMARR 69
MBP (85-97) NPWHFFKNIVTP 70
MBP(89-101) VHFFKNIVTPRTP 71
MBP(86-98) PWHFFKNIVTPR 72
PLP(175-192) YIYFNTWTTCQSIAFPS K 73
PLP(94-108) GAVRQIFGDΥΚΤΊΊ C 74
PLP(54-68) NYQDYEYLINVIHAF 75
PLP(80-88) FLYGALLLA 76
PLP(249-263) ATLVSLLTFMIAATY 77
PLP(250-264) TLVSLLTFMIAATYN 78
PLP(88-102) AEGFYTTGAVRQIFG 79
PLP(139-154) HCLGKWLGHPDKFVGI 80
* Sequências de MBP para Isoforma de MBP 6
Antígenos relevantes para doença celíaca (CD) aGlia(57-68) QLQPFPQPELPY 81
aGlia(62-72) PQPELPYPQPE 82
aGlia(217-229) SGEGSFQPSQQNP 83
Antígenos PDC-E2(122-135) GDLIAEVETDKATV 84
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 152/245
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relevantes para cirrose biliar primária (PBC) PDC-E2(249-262) GDLLAEIETDKATI 85
PDC-E2(249-263) GDLLAEIETDKATIG 86
PDC-E2 (629-643) AQWLAEFRKYLEKPI 87
PDC-E2(72-86) RLLLQLLGSPGRRYY 88
PDC-E2(353-367) GRVFVSPLAKKLAVE 89
PDC-E2 (422-436) DIPISNIRRVIAQRL 90
PDC-E2(629-643) AQWLAEFRKYLEKPI 91
PDC-E2 (80-94) SPGRRYYSLPPHQKV 92
PDC-E2 (353-367) GRVFVSPLAKKLAVE 93
PDC-E2(535-549) ETIANDWSLATKAR 94
Antigenos relevantes para pênfigo foliáceo (PF) e pênfigo vulgar (PV) DSG1(216-229) GEIRTMNNFLDREQ 95
DSG1(216-229; 2291) GEIRTMNNFLDREI 96
DSG1(48-62) KREWIKFAAACREGE 97
DSG1(206-222) MFIINRNTGEIRTMN 98
DSG1(363-377) SQYKLKASAISVTVL 99
DSG1(3-17) WSFFRWAMLFIFLV 100
DSG1(192-206) SKIAFKIIRQEPSDS 101
DSG1(326-340) TNVGILKWKPLDYE 102
DSG1(1-15) MDWSFFRWAMLFIF 103
DSG1(35-49) KNGTIKWH SIRRQKR 104
DSG1(325-339) RTNVGILKWKPLDY 105
DSG3(97-111) FGIFWDKNTGDINI 106
DSG3(251-265) CECNIKVKDVNDNFP 107
DSG3(351-365) NKAEFHQSVISRYRV 108
DSG3(453-467) DSTFIVNKTITAEVL 109
DSG3(540-554) SITTLNATSALLRAQ 110
DSG3(280-294) ILSSELLRFQVTDLD 111
DSG3(326-340) EGILKWKALDYEQL 112
DSG3(367-381) STPVTIQVINVREGI 113
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 153/245
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DSG3(13-27) AIFVWILVHGELRI 114
DSG3(323-337) RTNEGILKWKALDY 115
DSG3438-452) D S KTAEIKFVKNMNR 116
Antígenos relevantes para distúrbio do espectro da neurite óptica (NMO) AQP4(129-143) GAGILYLVTPPSWG 117
AQP4(284-298) RSQVETDDLILKPGV 118
AQP4(63-76) EKPLPVDMVLISLC 119
AQP4(129-143) GAGILYLVTPPSWG 120
AQP4(39-53) TAEFLAMLIFVLLSL 121
Antígenos relevantes para asma alérgica DERP-1(16-30) LRQMRTVTPIRMQGG 122
DERP-1(171-185) AVNIVGYSNAQGVDY 123
DERP-1(110-124) RFGISNYCQIYPPNV 124
DERP-2(26-40) PCIIHRGKPFQLEAV 125
DERP-2(107-121) TVKVMGD D GVLACAI 126
Antígenos relevantes para doença inflamatória do intestino ou colite Antígeno de integrase de bacteróides (183— 197) EAINQGYMHADAYPF 127
Antígeno de integrase de bacteróides (146— 160) KDLTYTFLRDFEQYL 128
Antígeno de integrase de bacteróides (175— 189) RQLRTLVNEAINQGY 129
Antígeno de integrase de MDKIRYRLVYNRQNT 130
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 154/245
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bacteróides (1-15)
Antígeno de integrase de bacteróides (30-44) LNQRKIYLKTNVYLK 131
Antígeno de integrase de bacteróides (70-84) EYILYLQGIELGYWK 132
Antígeno de integrase de bacteróides (337— 351) TCATLLIHQGVAITT 133
Antígeno de integrase de bacteróides (171— 185) AKHMRQLRTLVNEAI 134
Antígeno de integrase de bacteróides (4-18) IRYRLVYNRQNTLNR 135
Antígeno de integrase de bacteróides (256— 270) ENFIRINGKRWLYFK 136
Fla-2/Fla-X(366-380) TGAAATYAIDSIADA 137
Fla-2/Fla-X(164-178) NATFSMDQLKFGDTI 138
Fla-2/Fla-X(261-275) DRTWS SI GAYKL IQ 139
Fla-2/Fla-X(1-15) MWQHNLRAMNSNRM 140
Fla-2/Fla-X(51-65) KMRKQIRGL S QAS LN 141
Fla-2/Fla-X(269-283) GAYKLIQKELGLASS 142
Fla-2/Fla-X(4-18) QHNLRAMNSNRMLGI 143
Fla-2/Fla-X(271-285) YKLIQKELGLASSIG 144
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 155/245
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YIDX(93-107) HNIQVADDARFVLNA 145
YIDX(98-112) AD DARFVLNAGKKKF 146
YIDX(23-37) GCISYALVSHTAKGS 147
YIDX(78-92) ADDIVKMLNDPALNR 148
YIDX(195-209) LPVTVTLDIITAPLQ 149
YIDX(22-36) SGCISYALVSHTAKG 150
YIDX(80-94) DIVKMLNDPALNRHN 151
YIDX(101-115) ARFVLNAGKKKFTGT 152
Antígenos relevantes para lúpus eritematoso sistêmico (SLE) H4(71-94) TYTEHAKRKTVTAMDW YALKRQG 153
H4(74-88) EHAKRKTVTAMDWY 154
H4(76-90) AKRKTVTAMDWYAL 155
H4(75-89) HAKRKTVTAMDWYA 156
H4(78-92) RKTVTAMDWYALKR 157
H4(80-94) TVTAMDWYALKRQ 158
H2B(10-24) PKKGSKKAVTKAQKK 159
H2B (16-30) KAVTKAQKKDGKKRK 160
H1 ' (22-42) STDHPKYSDMIVAAIQA EKNR 161
H1 ' (27-41) KYSDMIVAAIQAEKN 162
Antígenos relevantes para aterosclerose ApoB(3501-3516) SQEYSGSVANEANVY 163
ApoB(1952-1966) SHSLPYESSISTALE 164
ApoB(978-993) TGAYSNASSTESASY 165
ApoB(3498-3513) SFLSQEYSGSVANEA 166
ApoB(210A) KTTKQSFDLSVKAQYKK NKH 167
ApoB(210B) KTTKQSFDLSVKAQY 168
ApoB(210C) TTKQSFDLSVKAQYK 169
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 156/245
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Antígenos relevantes para doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e/ou enfisema ELN(89-103) GALVP GGVADAAAAY 170
ELN(698-712) AAQFGLVGAAGLGGL 171
ELN(8-22) APRPGVLLLLLSILH 172
ELN(94-108) GGVADAAAAYKAAKA 173
ELN(13-27) VLLLLLSILHPSRPG 174
ELN(695-709) AAKAAQFGLVGAAGL 175
ELN(563-577) VAAKAQLRAAAGLGA 176
ELN(558-572) KSAAKVAAKAQLRAA 177
ELN(698-712) AAQFGLVGAAGLGGL 178
ELN(566-580) KAQLRAAAGLGAGIP 179
ELN(645-659) VP GALAAAKAAKYGA 180
Antigenos relevantes para psoríase CAP18(64-78) RPTMDGDPDTPKPVS 181
CAP18(34-48) SYKEAVLRAIDGINQ 182
CAP18(47-61) NQRSSDANLYRLLDL 183
CAP18(151-165) KRIVQRIKDFLRNLV 184
CAP18(149-163) EFKRIVQRIKDFLRN 185
CAP18(152-166) RIVQRIKDFLRNLVP 186
CAP18(131-145) RFALLGDFFRKSKEK 187
CAP18(24-38) QRIKDFLRNLVPRTE 188
ADAMTSL5(245-259) DGRYVLNGHWWSPP 189
ADAMTSL5(267-281) THWYTRDTGPQETL 190
ADAMTSL5(372-386) RLLHYCGSDFVFQAR 191
ADAMTSL5(289-303) HDLLLQVLLQEPNPG 192
ADAMTSL5(396-410) ETRYEVRIQLVYKNR 193
ADAMTSL5(433-447) HRDYLMAVQRLVSPD 194
ADAMTSL5(142-156) EGHAFYHSFGRVLDG 195
ADAMTSL5(236-250) RNHLALMGGDGRYVL 196
ADAMTSL5(301-315) NPGIEFEFWLPRERY 197
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 157/245
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ADAMTSL5(203-217) VQRVFRDAGAFAGYW 198
ADAMTSL5(404-418) QLVYKNRSPLRAREY 199
Antígenos relevantes para hepatite autoimune CYP2D6(193-207) RRFEYDDPRFLRLLD 200
CYP2D6(76-90) TPVWLNGLAAVREA 201
CYP2D6(293-307) ENLRIWADLFSAGM 202
CYP2D6(313-332) TLAWGLLLMILHPDVQR RVQ 203
CYP2D6(393-412) TTLITNLSSVLKDEAVW EKP 204
CYP2D6(199-213) DPRFLRLLDLAQEGL 205
CYP2D6(450-464) RMELFLFFTSLLQHF 206
CYP2D6(301-315) DLFSAGMVTTSTTLA 207
CYP2D6(452-466) ELFLFFTSLLQHFSF 208
CYP2D6(59-73) DQLRRRFGDVFSLQL 209
CYP2D6(130-144) EQRRFSVSTLRNLGL 210
CYP2D6(193-212) RRFEYDDPRFLRLLDLA QEG 211
CYP2D6(305-324) AGMVT T S T TLAWGLLLM ILH 212
CYP2D6(305-325) AGMVT T S T TLAWGLLLM ILHP 213
CYP2D6(131-145) QRRFSVSTLRNLGLG 214
CYP2D6(216-230) ESGFLREVLNAVPVL 215
CYP2D6(238-252) GKVLRFQKAFLTQLD 216
CYP2D6(199-213) DPRFLRLLDLAQEGL 217
CYP2D6(235-252) GKVLRFQKAFLTQLD 218
CYP2D6(293-307) ENLRIWADLFSAGM 219
CYP2D6(381-395) DIEVQGFRIPKGTTL 220
CYP2D6(429-443) KPEAFLPFSAGRRAC 221
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 158/245
152/222
SLA(334-348) YKKLLKERKEMFSYL 222
SLA(196-210) DELRTDLKAVEAKVQ 223
SLA(115-129) NKITNSLVLDIIKLA 224
SLA(373-386) NRLDRCLKAVRKER 225
SLA(186-197) LIQQGARVGRID 226
SLA(317-331) SPSLDVLITLLSLGS 227
SLA(171-185) DQKSCFKSMITAGFE 228
SLA(417-431) YTFRGFMSHTNNYPC 229
SLA(359-373) YNERLLHTPHNPISL 230
SLA(215-229) DCILCIHSTTSCFAP 231
SLA(111-125) SSLLNKITNSLVLDI 232
SLA(110-124) GSSLLNKITNSLVLD 233
SLA(299-313) NDSFIQEISKMYPGR 234
SLA(342-356) KEMFSYLSNQIKKLS 235
SLA(49-63) STLELFLHELAIMDS 236
SLA(119-133) NSLVLDIIKLAGVHT 237
SLA(260-274) SKCMHLIQQGARVGR 238
SLA(26-40) RSHEHLIRLLLEKGK 239
SLA(86-100) RRHYRFIHGIGRSGD 240
SLA(331-345) SNGYKKLLKERKEMF 241
Autoimmune hepatiterelevante antígeno (217-236) WSSHYSRRFTPEIAKR PKV 242
Antígenos relevantes para uveíte SAG(199-214) QFFMSDKPLHLAVSLN 243
SAG(199-213) QFFMSDKPLHLAVSL 244
SAG(77-91) DVIGLTFRRDLYFSR 245
SAG(250-264) NWLYSSDYYVKPVA 246
SAG(172-186) SSVRLLIRKVQHAPL 247
SAG(354-368) EVPFRLMHPQPEDPA 248
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 159/245
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SAG(239-253) KKIKAF VE QVANWL 249
SAG(102-116) STPTKLQESLLKKLG 250
SAG(59-73) KKVYVTLTCAFRYGQ 251
SAG(280-294) KTLTLLPLLANNRER 252
SAG(291-306) NRERRGIALDGKIKHE 253
SAG(195-209) EAAWQFFMSDKPLHL 254
SAG(200-214) QFFMSDKPLHLAVSL 255
Antígenos relevantes para síndrome de Sjõgren- TR0VE2(127-141) TFIQFKKDLKESMKC 256
TR0VE2(523-537) DTGALDVIRNFTLDM 257
TR0VE2(243-257) EVIHLIEEHRLVREH 258
TR0VE2(484-498) REYRKKMDIPAKLIV 259
TR0VE2(347-361) EEILKALDAAFYKTF 260
TR0VE2(369-383) KRFLLAVDVSASMNQ 261
TR0VE2(426-440) SSA/RO(426-440) 262
TR0VE2(267-281) EVWKALLQEMPLTAL 263
TR0VE2(178-192) SHKDLLRLSHLKPSS 264
TR0VE2(358-372) YKTFKTVEPTGKRFL 265
TR0VE2(221-235) ETEKLLKYLEAVEKV 266
TR0VE2(318-332) RIHPFHILIALETYK 267
TR0VE2(407-421) E KD S YWAF S D EMVP 268
TR0VE2(459-473) TPADVFIVFTDNETF 269
TR0VE2(51-65) QKLGLENAEALIRLI 270
TR0VE2(312-326) KLLKKARIHPFHILI 271
SS-B(241-255) DDQTCREDLHILFSN 272
SS-B(101-115) TDEYKNDVKNRSVYI 273
SS-B(153-167) SIFWFD SIE S AKKF 274
SS-B(178-192) TDLLILFKDDYFAKK 275
SS-B(19-33) HQIEYYFGDFNLPRD 276
SS-B(37-51) KEQIKLDEGWVPLEI 277
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 160/245
154/222
SS-B(133-147) DKGQVLNIQMRRTLH 278
SS-B(50-64) EIMIKFNRLNRLTTD 279
SS-B (32-46) RDKFLKEQIKLDEGW 280
SS-B(153-167) SIF WFD SIE S AKKF 281
SS-B(83-97) SEDKTKIRRSPSKPL 282
SS-B(136-150) QVLNIQMRRTLHKAF 283
SS-B(297-311) RNKEVTWEVLEGEVE 284
SS-B(59-73) NRLTTDFNVIVEALS 285
SS-B(151-165) KGSIFWFDSIESAK 286
SS-B(86-100) KTKIRRSPSKPLPEV 287
SS-B(154-168) IF WFD SIE S AKKFV 288
Antígenos relevantes para esclerodermia ΊΌΡ1 (346-360) KERIANFKIEPPGLF 289
ΊΌΡ1(420-434) QGSIKYIMLNPSSRI 290
ΊΌΡ1(750-764) QREKFAWAIDMADED 291
ΊΌΡ1(419-433) IQGSIKYIMLNPSSR 292
ΊΌΡ1(591-605) YNASITLQQQLKELT 293
ΊΌΡ1(695-709) EQLMKLEVQATDREE 294
ΊΌΡ1(305-319) SQYFKAQTEARKQMS 295
ΊΌΡ1(346-360) KERIANFKIEPPGLF 296
ΊΌΡ1(419-433) IQGSIKYIMLNPSSR 297
ΊΌΡ1(425-439) YIMLNPSSRIKGEKD 298
ΊΌΡ1(614-628) KIL S YNRANRAVAIL 299
CENP-C(297-311) KLIEDEFIIDESDQS 300
CENP-C(857-871) KVYKTLDTPFFSTGK 301
CENP-C(887-901) QDILVFYVNFGDLLC 302
CENP-C(212-226) KVMLKKIEIDNKVSD 303
CENP-C(643-657) EDNIMTAQNVPLKPQ 304
CENP-C(832-846) TREIILMDLVRPQDT 305
CENP-C(167-181) TSVSQNVIPSSAQKR 306
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 161/245
155/222
CENP-C(246-260) RIRDSEYEIQRQAKK 307
CENP-C(846-860) TYQFFVKHGELKVYK 308
CENP-C(149-163) DEEFYLSVGSPSVLL 309
CENP-C(833-847) REIILMDLVRPQDTY 310
CENP-C(847-861) YQFFVKHGELKVYKT 311
Antígenos relevantes para síndrome antifosfolipídeo APOH(235-249) HDGYSLDGPEEIECT 312
APOH(306-320) KCSYTEDAQCIDGTI 313
APOH(237-251) GYSLDGPEEIECTKL 314
APOH(295-309) KVSFFCKNKEKKCSY 315
APOH(28-42) DLPFSTWPLKTFYE 316
APOH(173-187) ECLPQHAMFGNDTIT 317
APOH(264-278) CKVPVKKATWYQGE 318
APOH(295-309) KVSFFCKNKEKKCSY 319
APOH(49-63) YSCKPGYVSRGGMRK 320
APOH(269-283) KKATWYQGERVKIQ 321
APOH(295-309) KVSFFCKNKEKKCSY 322
APOH321-355 EVPKCFKEHSSLAFW 323
APOH322-336 VPKCFKEHSSLAFWK 324
APOH324-338 KCFKEHSSLAFWKTD 325
Antígenos relevantes para vasculite associada a ANCA MPO(506-520) QPFMFRLDNRYQPME 326
MPO(302-316) RIKNQADCIPFFRSC 327
MPO(7-21) SSLRCMVDLGPCWAG 328
MPO(689-703) QQRQALAQISLPRII 329
MPO(248-262) RSLMFMQWGQLLDHD 330
MPO (444-458) QEARKIVGAMVQIIT 331
MPO(513-527) DNRYQPMEPNPRVPL 332
MPO(97-111) ELLSYFKQPVAATRT 333
MPO(616-630) QLGTVLRNLKLARKL 334
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156/222
MPO(462-476) YLP LVLGP TAMRKYL 335
MPO(617-631) LGTVLRNLKLARKLM 336
MPO(714-728) KNNIFMSNSYPRDFV 337
PRTN3(44-58) SLQMRGNPGSHFCGG 338
PRTN3(234-248) TRVALYVDWIRSTLR 339
PRTN3(59-73) TLIHPSFVLTAAHCL 340
PRTN3(117-131) NDVLLIQLSSPANLS 341
PRTN3(164-178) DPPAQVLQELNVTW 342
PRTN3(71-85) HCLRDIPQRLVNWL 343
PRTN3(241-255) DWIRSTLRRVEAKGR 344
PRTN3(59-73) TLIHPSFVLTAAHCL 345
PRTN3(183-197) RP HNIC TFVP RRKAG 346
PRTN3(62-76) HPSFVLTAAHCLRDI 347
PRTN3(118-132) DVLLIQLSSPANLSA 348
PRTN3(239-253) YVDWIRSTLRRVEAK 349
Antigenos relevantes para sindrome da pessoa rigida GAD(212-226) EYVTLKKMREIIGWP 350
GAD(555-569) NFFRMVISNPAATHQ 351
GAD(297-311) DSVILIKCDERGKMI 352
Antigenos relevantes para câncer
[245] Em certos aspectos, o antígeno relevante para doença é um antígeno relevante para câncer. Em aspectos adicionais, o câncer é carcinoma, sarcoma, mieloma, leucemia, linfoma, e/ou tipos mistos de metástases desses ou de outros cânceres. Antigenos relevantes para câncer ou tumor exemplares incluem, sem limitação, aqueles revelados na Tabela 2.
Tabela 2. Antigenos relacionados ao câncer ID. DE SEQ. N°
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Lys Ile Ser Vai Ser Leu Pro Leu Ser Leu Ser Gin Ser Vai Cys 353
Gin Leu Ser Lys Asp Thr Ser Vai Leu Thr Phe Thr Phe Cys 354
Cys Ser Asp Ala His Pro Gly Asp Ser Ser Gly Asp Ser Ser Gly Leu Asn 355
Arg Gly Glu Vai Arg Gin Phe Thr Leu Arg His Trp Leu Lys Vai 356
Gly Asp Tyr Leu Asn Asp Glu Ala Leu Trp Asn Lys Cys 357
Gly Lys Vai Ile Asp Asp Asn Asp His Leu Ser Gin Glu Ile Cys 358
Leu Met Ala Asn Ser Thr Trp Gly Tyr Pro Phe His Asp Gly 359
Leu Asn Vai Vai Pro Trp Asn Leu Thr Leu Phe Ser Ile Leu 360
Thr His Ser Phe Thr Ala Phe Lys Arg His Vai Cys 361
Asn Leu Ser Leu Pro Pro Ser Leu Ser Leu Ser Ile Cys 362
Glu Arg Pro Ser Ser Vai Leu Thr Ile Tyr Asp Ile Gly Ile Gin Cys 363
Cys Tyr Gin Gin Tyr Thr Asn Leu Gin Glu Arg Pro Ser Ser Vai 364
Thr Vai Glu Pro Glu Thr Gly Asp Pro Vai Thr Leu Arg Leu Cys 365
Cys Ser Arg Lys Lys Arg Ala Asp Lys Lys Glu Asn Gly Thr Lys Leu Leu 366
Phe Leu Leu Vai Leu Gly Phe Ile Ile 367
Vai Leu Pro Ser Vai Ala Met Phe Leu 368
Leu Vai Leu Gly Phe Ile Ile Ala Leu 369
Lys Vai Vai Thr Ser Ser Phe Vai Vai 370
Leu Vai Pro Gly Thr Lys Phe Tyr Ile 371
Leu Leu Pro Ile Arg Thr Leu Pro Leu 372
Tyr Leu Vai Lys Lys Gly Thr Ala Thr 373
Ser Leu Phe Ala Glu Thr Ile Trp Vai 374
Met Leu Ile Ala Met Tyr Phe Tyr Thr 375
Leu Met Trp Thr Leu Pro Vai Met Leu 376
Met Leu Ile Vai Tyr Ile Phe Glu Cys 377
Tyr Ile Phe Glu Cys Ala Ser Cys Ile 378
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Leu Vai Leu Met Leu Ile Vai Tyr Ile 379
Ala Leu Cys Arg Arg Arg Ser Met Vai 380
Leu Leu Ser Gly Leu Ser Leu Phe Ala 381
Phe Leu Leu Vai Vai Gly Leu Ile Vai 382
Leu Vai Vai Gly Leu Ile Vai Ala Leu 383
Lys Vai Vai Lys Ser Asp Phe Vai Vai 384
Thr Leu Pro Vai Gin Thr Leu Pro Leu 385
Asp Leu His Vai Ile Ser Asn Asp Vai 386
Vai Leu Vai His Pro Gin Trp Vai Leu 387
Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser 388
Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser 389
Lys Leu Gin Cys Vai Asp Leu His Vai 390
Glu Leu Ala His Tyr Asp Vai Leu Leu 391
Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu 392
Thr Leu Arg Vai Asp Cys Thr Pro Leu 393
Met Met Asn Asp Gin Leu Met Phe Leu 394
Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Vai 395
Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Vai 396
Vai Leu Ala Lys Glu Leu Lys Phe Vai 397
Ile Leu Leu Trp Gin Pro Ile Pro Vai 398
Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys Vai 399
Pro Leu Glu Arg Phe Ala Glu Leu Vai 400
Lys Gin Gly Asn Phe Asn Ala Trp Vai 401
Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Vai Thr 402
Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala 403
Asn Leu Phe Glu Thr Pro Vai Glu Ala 404
Gly Leu Gin His Trp Vai Pro Glu Leu 405
Vai Gin Phe Vai Ala Ser Tyr Lys Vai 406
Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala 407
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Leu Leu Leu Leu Thr Vai Leu Thr Vai 408
Leu Leu Leu Thr Vai Leu Thr Vai Vai 409
Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu 410
Leu Leu Vai Leu Vai Cys Vai Leu Vai 411
Ala Leu Leu Vai Leu Vai Cys Vai Leu 412
Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Vai 413
Asn Leu Thr Ile Ser Asp Vai Ser Vai 414
Ala Leu Ala Ser Thr Ala Pro Pro Vai 415
Ala Ile Leu Cys Trp Thr Phe Trp Vai 416
Phe Ile Leu Met Phe Ile Vai Tyr Ala 417
Leu Thr Ala Glu Cys Ile Phe Phe Vai 418
Met Leu Gin Asp Asn Cys Cys Gly Vai 419
Ile Leu Cys Trp Thr Phe Trp Vai Leu 420
Lys Ile Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Leu 421
Phe Vai Gly Ile Cys Leu Phe Cys Leu 422
Vai Leu Leu Ser Vai Ala Met Phe Leu 423
Leu Leu Ser Vai Ala Met Phe Leu Leu 424
Ile Leu Gly Ser Leu Pro Phe Phe Leu 425
Ile Leu Asn Ala Tyr Leu Vai Arg Vai 426
Phe Leu Leu Vai Gly Phe Ala Gly Ala 427
Asn Leu Gin Pro Gin Leu Ala Ser Vai 428
Cys Met Phe Asp Ser Lys Glu Ala Leu 429
Tyr Leu Tyr Vai Leu Vai Asp Ser Ala 430
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gin Vai 431
Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Vai 432
Gly Leu Vai Met Asp Glu His Leu Vai 433
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Vai 434
Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala Cys 435
Tyr Leu Ala Phe Arg Asp Asp Ser Ile 436
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Trp Leu Pro Lys Lys Cys Ser Leu Cys 437
Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu 438
Met Leu Vai Gly Ile Cys Leu Ser Ile 439
Phe Glu Leu Gly Leu Vai Ala Gly Leu 440
Lys Met Vai Arg Phe Ser Tyr Ser Vai 441
Cys Leu Asn Glu Gly Thr Cys Met Leu 442
Met Leu Ala Gly Ile Cys Leu Ser Ile 443
Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu 444
Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu 445
Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Vai 446
Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Vai 447
Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Vai 448
Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Vai 449
Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile 450
Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile 451
Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr 452
Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile 453
Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu 454
Tyr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Vai 455
[246] Outros antígenos relevantes para câncer incluem aqueles resumidos nas Tabelas nesse banco de dados online http://cancerimmunity.org/peptide/ e incorporado nesse relatório descritivo por referência, acessado pela última vez em 6 de maio de 2015.
[247] É contemplado que, em composições da revelação, há entre cerca de 0,001 mg e cerca de 10 mg de proteína total por ml na composição. Também é contemplado que uma dose eficaz é de cerca de 0,0004 mg/kg até cerca de 2,027 mg/kg, como medida por pMHC, e varia entre 0,0004 mg/kg até cerca de 2,027 mg/kg. Dessa forma, a concentração de proteína em
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161/222 uma composição pode ser cerca de, pelo menos, cerca de ou, no máximo, cerca de 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 50, 100 pg/ml ou mg/ml ou mais (ou qualquer faixa derivável desses valores). Dessa, cerca de, pelo menos cerca de ou, no
máximo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,
29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43,
44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,
59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73,
74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98, 99, 100 % podem ser
de complexo peptídeo/MHC/nanopartícula.
[248] Além disso, a Patente U.S. N° 4.554.101 (Hopp), que é incorporada nesse relatório descritivo por referência, ensina a identificação e preparação de epitopos de sequências de aminoácidos primárias com base na hidrofilicidade. Por meio dos métodos revelados em Hopp, aqueles habilitados na técnica seriam capazes de identificar epitopos potenciais de dentro de uma sequência de aminoácidos e confirmar sua imunogenicidade. Várias publicações cientificas também foram dedicadas à previsão da estrutura secundária e à identificação de epitopos, a partir de análises de sequências de aminoácidos (Chou e Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979) . Qualquer uma dessas pode ser usada, se desejado, para suplementar os ensinamentos de Hopp na Patente U.S. N° 4.554.101.
Citocinas
[249] Em certo aspecto, as NPs ainda compreendem ou,
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162/222 alternativamente, consistem basicamente ou ainda consistem em pelo menos uma molécula de citocina. Como usado nesse relatório descritivo, o termo citocina engloba proteínas de baixo peso molecular secretadas por várias células no sistema imune que atuam como moléculas de sinalização para regulação de uma ampla gama de processos biológicos dentro do corpo nos níveis molecular e celular. Citocinas incluem proteínas imunomoduladoras individuais que se enquadram dentro da classe de linfocinas, interleucinas ou quimiocinas.
[250] Exemplos não limitantes são revelados nesse relatório descritivo. Por exemplo, IL-1A e IL-1B são dois membros distintos da família de interleucina humana-1 (IL1) . A IL-1A madura é uma proteína de 18 kDa, também conhecida como fator de ativação de fibroblasto (FAF), fator de ativação de linfócito (LAF), fator de ativação de célula B (BAF), mediador endógeno de leucócito (LEM) etc. IL-4 é uma citocina que induz diferenciação de célula T auxiliar-2 (Th2), e está intimamente relacionada e possui funções similares à IL-13. IL-5 é produzida por células Th2 e mastócitos. Ela atua para estimular o crescimento de células B e aumentar a secreção de imunoglobulina. Ela também está envolvida na ativação de eosinófilos. IL-6 é uma interleucina que pode atuar como uma citocina pró-inflamatória ou antiinflamatória. Ela é secretada por células T e macrófagos para estimular a resposta imune ao trauma ou a outro dano tecidual que leva à inflamação. IL-6 também é produzida pelo músculo em resposta à contração muscular. IL-8 é uma quimiocina produzida por macrófagos e outros tipos de células como, por exemplo, células epiteliais e células endoteliais,
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163/222 e atua como um mediador importante da reação imune na resposta do sistema imune inato. IL-12 está envolvida na diferenciação de células T naive em células T auxiliares (Thl ou Th2) . Como uma citocina heterodimérica, IL-12 é formada após duas subunidades codificada por dois genes separados, IL-12A (p35) e IL-12B (p40), dimerizarem após a sintese de proteina. IL-12p70 indica essa composição heterodimérica. IL-13, uma citocina secretada por muitos tipos de células, especialmente células Th2, é um mediador importante de inflamação e doença alérgica. IL-17 é uma citocina produzida por células T auxiliares e é induzida por IL-23, resultando em dano tecidual destrutivo em reações do tipo retardadas. IL-17 funciona como uma citocina próinflamatória que responde à invasão do sistema imune por patógenos extracelulares e induz destruição da matriz celular do patógeno. IP-10, ou proteina induzida por Interferon gama-10, também conhecida como quimiocina de motivo C-X-C 10 (CXCL10) ou pequena citocina indutivel B10. Como uma pequena citocina que pertence à familia de quimiocina CXC, IP-10 é secretada por vários tipos de células (incluindo monócitos, células endoteliais e fibroblastos) em resposta ao IFN-γ. As Proteínas Inflamatórias de Macrófagos (MIP) pertencem à família de quimiocinas. Há duas formas principais de MIP humana, MIP-Ία e MIP-Ιβ, que também são conhecidas como ligante de quimiocina (motivo C-C) 3 (CCL3) e CCL4, respectívamente. Ambas são produzidas por macrófagos após estimulação com endotoxinas bacterianas. O fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF ou GCSF), também conhecido como fator estimulante de colônia 3 (CSF 3), é um hormônio de fator estimulante de colônia. G-CSF é
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164/222 uma glicoproteína, fator de crescimento e citocina produzidos por diversos tecidos diferentes para estimular a medula óssea a produzir granulócitos e células-tronco. G-CSF também estimula a sobrevida, proliferação, diferenciação e função de precursores de neutrófilos e neutrófilos maduros. 0 fator de crescimento epidérmico, ou EGF, é um fator de crescimento que tem um papel importante na regulação do crescimento, proliferação e diferenciação celular por ligação com alta afinidade ao seu receptor EGFR. 0 fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é uma familia de fatores de crescimento que são proteínas de sinalização importantes envolvidas tanto na vasculogênese (a formação de novo do sistema circulatório embrionário) quanto na angiogênese (o crescimento de vasos sanguíneos a partir da vasculatura pré-existente).
[251] A citocina ou citocinas podem ser acopladas à nanopartícula da mesma forma que o complexo de pMHC. Em uma modalidade da presente revelação, a citocina ou citocinas e o complexo de pMHC são anexados separadamente à nanopartícula. Em outra modalidade da revelação, a citocina ou moléculas de citocina e o complexo de pMHC primeiro são complexados juntos e são então subsequentemente complexados com a nanopartícula. Múltiplas citocinas podem ser acopladas à nanopartícula; essas podem ser várias da mesma citocina ou citocinas diferentes.
Componentes de molécula coestimulatória
[252] Em certos aspectos, as NPs adicionalmente compreendem ou, alternativamente, consistem basicamente, ou ainda consistem em pelo menos uma molécula coestimulatória. Moléculas coestimulatórias são moléculas que produzem um
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165/222 sinal secundário in vivo que serve para ativar células T nalve em células T antígeno-específicas capazes de produzir uma resposta imune às células que possuem o referido antígeno especifico. A presente revelação não está limitada a qualquer molécula coestimulatória especifica. As várias moléculas coestimulatórias são bem conhecidas na técnica. Alguns exemplos não limitantes de moléculas coestimulatórias são 4IBBL, OX40L, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, CD30L e ICOSL. Apenas uma molécula coestimulatória especifica pode ser acoplada a uma nanopartícula ou diversas moléculas coestimulatórias podem ser acopladas à mesma nanopartícula. Em certas modalidades, a molécula coestimulatória é uma proteína como, por exemplo, um anticorpo que é capaz de ser agonista para um receptor coestimulatório em uma célula T. Nesse caso, o anticorpo é capaz de indução de um sinal coestimulatório que é necessário para ativar células T narve e induzir uma resposta imune de uma forma antígenoespecífica. Adicional ou alternativamente, o termo molécula coestimulatória, como usado nesse relatório descritivo, também pode se referir a um agente capaz de gerar um sinal coestimulatório por ter um efeito agonista sobre uma molécula de sinalização coestimulatória nativa, por exemplo, antiCD28 ou ligante de CD28, gerando uma resposta coestimulatória de CD28. Em alguns aspectos, a valência das moléculas coestimulatórias é de cerca de 1 até cerca de 6.000, e/ou a valência das moléculas coestimulatórias é de cerca de 1 até cerca de 6.000, cada uma por núcleo de nanopartícula.
Composições
[253] Em certos aspectos, são fornecidas nesse relatório descritivo composições que compreendem vários dos complexos
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166/222 fornecidos nesse relatório descritivo. Em algumas modalidades, as composições ainda compreendem um carreador, opcionalmente um carreador farmacêutico. Em algumas modalidades, as composições fornecidas nesse relatório descritivo podem opcionalmente compreender um ou mais núcleos de nanoparticula acoplados a uma ou mais moléculas coestimulatórias e/ou citocinas. Consequentemente, em algumas modalidades, as composições compreendem ou, alternativamente, consistem basicamente, ou ainda adicionalmente consistem em: 1) diversos núcleos de nanoparticula acoplados a diversos complexos antígeno-MHC, em que pelo menos uma porção dos núcleos de nanoparticula ainda compreende uma ou mais moléculas coestimulatórias e/ou uma ou mais citocinas, e uma segunda porção dos núcleos de nanoparticula não compreende uma molécula coestimulatória e/ou uma citocina, e 2) diversos núcleos de nanoparticula acoplados a uma ou mais moléculas coestimulatórias e/ou citocinas.
Métodos de produção de nanopartículas e complexos de pMHC
[254] pMHC-NPs e nanopartículas podem ser feitas por diversos métodos, como descrito, por exemplo, em WO 2008/109852, WO 2012/041968, WO 2012/062904, WO 2013144811, WO 2014/050286, WO 2015/063616, WO 2016/198932 ou PCT/IB2017/001508 .
EXEMPLOS
[255] Os exemplos seguintes são dados com o objetivo de ilustrar várias modalidades da revelação e não visam limitar a presente revelação de modo algum. Aqueles habilitados na técnica observarão facilmente que a presente revelação está
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167/222 bem adaptada para realizar os objetivos e obter as finalidades e vantagens mencionadas, bem como aqueles objetivos, finalidades e vantagens inerentes nesse relatório descritivo. Os presentes exemplos, juntamente com os métodos descritos nesse relatório descritivo, são atualmente representativos de modalidades e exemplares, e não são considerados como limitações do escopo da revelação. Alterações neles e outros usos que estão englobados dentro do espirito da revelação, como definido pelo escopo das reivindicações, ocorrerão àqueles habilitados na técnica.
Métodos
[256] Camundongos. Camundongos NOD/Lt eram do Jackson Lab (Bar Harbor, ME) . Camundongos 17.4α/8.3β (8.3-NOD) e BDC2.5-NOD (que expressam receptores de célula T transgênicos para IGRP206-214 ou NRP-V7/Kd e 2.5mi/IA9?, respectivamente) foram descritos 19' 20' 21.
[257] Produção de pMHC. Dois métodos diferentes foram usados para expressar complexos de pMHC Classe I recombinante. 0 primeiro envolvia o reenovelamento das cadeias pesadas e leves de MHC Classe I expressas em bactérias na presença de peptídeo, seguido por purificação por meio de filtração em gel e cromatografia por troca de ânion 22' 23 . 0 segundo envolvia a expressão de complexos de MHC Classe I em rendimentos elevados em células de ovário de hamster chinês (CHO) freestyle transduzidas com lentivirus livre de micoplasma como construções de cadeia única nas quais a sequência codificadora de peptídeo, as cadeias leves e pesadas de MHC Classe I são sequencialmente atadas com vinculadores flexíveis de Glicina-Serina (GS) 24, seguido por um vinculador carbóxi-terminal que codifica um sítio BirA,
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168/222 e etiquetas 6xHis e strep que terminam com uma cisterna livre. As proteínas secretadas foram purificadas dos sobrenadantes da cultura usando etiquetas strep e/ou colunas de níquel e usadas diretamente para revestimento de NP ou foram biotiniladas para produzir tetrâmeros de pMHC usando estreptavidina conjugada a fluorcromo.
[258] Monômeros de pMHC Classe II recombinante foram produzidos em células CHO freestyle transduzidas com lentivírus que codificam uma mensagem monocistrônica na qual as cadeias de peptídeo-MHCa e MHCp do complexo foram separadas pela sequência de salto de ribossomo P2A. Um vinculador que codifica um sítio BirA, etiquetas strep e/ou 6xHis, e uma Cys livre foi adicionada à extremidade do terminal carbóxi da construção. Os complexos de pMHC Classe II automontados foram purificados dos sobrenadantes da cultura por cromatografia por afinidade em níquel e usados para revestimento sobre NPs ou processados para biotinilação e formação de tetrâmero como descrito acima.
[259] Síntese de NP. Nanopartículas de ouro (GNPs) foram sintetizadas por redução química de ácido cloroáurico (HAuClé) com citrato de sódio como descrito (Perrault, S.D. e cols. (2009) Nano Lett. 9 (5) : 1.909-1.915) . Resumidamente, 2 ml de HAuClé 1% (Sigma Aldrich, Oakville, ON) foram adicionados a 100 ml H2O sob agitação vigorosa e a solução aquecida em um banho de óleo. Seis (para GNPs de 14 nm) ou dois ml (para GNPs de 40 nm) de citrato de sódio 1% foram adicionados à solução em ebulição de HAUCI4, que foi agitada por mais 10 min e depois resfriada até a temperatura ambiente. As GNPs foram estabilizadas pela adição de 1 μΜ de vinculadores de tiol-polietileno glicol (tiol-PEG) (Nanocs,
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MA) funcionalizados com grupos carboxil (-COOH) ou amina primária (-NH2) como aceptores de pMHC. GNPs peguiladas foram lavadas com água para remover tiol-PEG livre, concentradas e armazenadas em água para análise posterior. A densidade de NP foi calculada por medições de espectrofotometria de acordo com a lei de Beer.
[260] As NPs de óxido de ferro (FesCY) série SFP foram produzidas por decomposição térmica de acetilacetonato de ferro em solventes orgânicos na presença de tensoativos, e depois tornadas solventes em tampões aquosos por peguilação (Xie, J. e cols. (2007) Adv. Materials 19 (20): 3.163-3.166; Xie, J.P.S. e cols. (2006) Pure Appl. Chem. 78 (5): 1.0031.014; Xu, C. e cols. (2007) Polymer International 56 (7): 821-82). Resumidamente, 2 mmol de Fe(acac)3 (Sigma Aldrich) foram dissolvidos em uma mistura de 10 ml de éter benzilico e oleilamina e aquecidos até 100°C por 1 hora, seguido por 300°C por 2 horas com refluxo sob a proteção de uma manta de nitrogênio. As NPs sintetizadas foram precipitadas por adição de etanol e ressuspensas em hexano. Para peguilação das NPs de óxido de ferro, 100 mg de diferentes vinculadores de PEG conjugado à dopamina (DPA-PEG, 3,5 kDa) (Jenkem Tech, EUA) foram dissolvidos em uma mistura de clorofórmio e dimetilformamida (DMF) . A solução de NP (20 mg de Fe) foi então adicionada à solução de DPA-PEG e agitada por 4 horas em temperatura ambiente. NPs SFP peguiladas foram precipitadas de um dia para o outro por adição de hexano e ressuspensas em água. Quantidades residuais de agregados foram removidas por centrifugação em alta velocidade (20.000xg, 30 min) . As NPs SFP monodispersas foram armazenadas em água para conjugação de pMHC. A concentração
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170/222 de ferro foi determinada espectrofotometricamente a 410 nm em 2 N ácido clorídrico (HC1). Com base na estrutura molecular e diâmetro de NPs SFP (FesCú; 8+1 nm de diâmetro) (Xie, J. e cols. (2007) Adv. Materials 19 (20): 3.163-3.166; Xie, J.P.S. e cols. (2006) Pure Appl. Chem. 78 (5): 1.0031.014), o Requerente estimou que soluções SFP contendo 1 mg de ferro contêm 5 x 1014 NPs.
[261] O Requerente subsequentemente desenvolveu um novo design de NP de óxido de ferro que permitia a formação, também por decomposição térmica, mas em uma única etapa, de NPs de óxido de ferro peguiladas na ausência completa de tensoativos (NPs de óxido de ferro série PF). Nesse design, moléculas de PEG foram usadas como agente de revestimento de superfície in situ. Em uma reação típica, 3 g de PEG (MW de 2 kDa) foram derretidos lentamente em um frasco de fundo redondo de 50 ml em ebulição a 100°C e depois misturados com 7 ml de éter benzilico e 2 mmol de Fe(acac)3. A reação foi vigorosamente agitada por 1 hora e aquecida até 260°C com refluxo por mais 2 horas. A mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente, transferida para um tubo de centrifugação e misturada com 30 ml de água. Materiais insolúveis foram removidos por centrifugação a 2.000xg por 30 min. As moléculas de PEG livres foram removidas por ultrafiltração através de filtros Amicon-15 (MWCO 100 kDa, Millipore, Billerica, MA) . NPs de óxido de ferro foram geradas com a maioria, embora nem todas as moléculas de PEG testadas. Os tamanhos das NPs de óxido de ferro variaram dependendo dos grupos funcionais dos vinculadores de PEG usados nas reações de decomposição térmica. As NPs podiam ser facilmente purificadas usando colunas magnéticas (MACS)
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171/222 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) ou um sistema de separação de células IMag (BD BioSciences, Mississauga, ON) . As NPs de óxido de ferro purificadas foram armazenadas em água em temperatura ambiente ou 4°C sem nenhuma agregação detectável. A densidade de NP foi calculada como descrito acima para NPs SFP.
[262] Conjugação de pMHC às NPs. A conjugação de pMHC às NPs produzias com vinculadores de PEG que carregam grupos distais de amina primária (-NH2) ou carboxil (-COOH) foi obtida por meio da formação de ligações amida na presença de cloridrato de l-etil-3-[3-dimetilaminopropil]carbodiimida (EDC) · NPs (GNP-C, SFP-C e PF-C) com grupos -COOH primeiro foram dissolvidas em 20 mM de tampão de ácido 2-(Nmorfolino)etanossulfônico (MES), pH 5,5. Sal sódico de Nhidroxissulfossuccinimida (sulfo-NHS; 10 mM) e EDC (1 mM) (Thermo scientific, Waltham, MA) foram então adicionados à solução de NP. Após 20 min de agitação em temperatura ambiente, a solução de NP foi adicionada gota a gota à solução de monômero de pMHC (em 20 mM de tampão borato, pH 8,2) . A mistura foi agitada por mais 4 horas. Para conjugar as pMHCs às NPs NH2-funcionalizadas (GNP-N, SFP-N e PF-N), complexos de pMHC primeiro foram dissolvidos em 20 mM de tampão MES, pH 5,5, contendo 100 mM de cloreto de sódio (NaCl). Sulfo-NHS (10 mM) e EDC (5 mM) foram então adicionados à solução de pMHC. As moléculas de pMHC ativadas foram adicionadas à solução de NP em 20 mM de tampão borato (pH 8,2), e agitadas por 4 horas em temperatura ambiente.
[263] Para conjugar pMHC às NPs maleimidafuncionalizadas (SFP-M e PF-M), moléculas de pMHC modificadas geneticamente para codificar uma Cys livre do
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172/222 terminal-C foram misturadas com NPs em 40 mM de tampão fosfato, pH 6,0, contendo 2 mM de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), 150 mM de NaCl, e incubadas de um dia para o outro em temperatura ambiente. As pMHCs foram ligadas covalentemente com NPs por meio da formação de uma ligação carbono-enxofre entre grupos maleimida e o residuo de Cys.
[264] A quimica Click foi usada para conjugar pMHC às NPs funcionalizadas com grupos azida (SFP-Z). Para essa reação, moléculas de pMHC primeiro foram incubadas com dibenzociclooctino-N-hidroxissuccinimidil éster (DBCO-NHS, Click Chemistry Tools, Scottdale, AZ) por 2 horas em temperatura ambiente. Moléculas de DBCO livres foram removidas por diálise de um dia para o outro. Conjugados pMHC-DBCO foram então incubados com SFP-Z por 2 horas, resultando na formação de ligações triazol entre moléculas de pMHCs e NPs.
[265] Complexos de pMHC não conjugados nas diferentes reações de conjugação de pMHC-NP foram removidos por diálise intensa contra PBS, pH 7,4, a 4°C através de membranas com valor de corte de peso molecular de 300 kDa (Spectrum Labs). Alternativamente, NPs de óxido de ferro conjugadas a pMHC foram purificadas por separação magnética. As NPs conjugadas foram concentradas por ultrafiltração através de unidades Amicon Ultra-15 (100 kDa MWCO) e armazenadas em PBS.
[266] Caracterização de NP. O tamanho do núcleo e a dispersibilidade de NPs não conjugadas e conjugadas a pMHC primeiro foram avaliados por meio de microscopia eletrônica de transmissão (TEM, Hitachi H7650). Espalhamento de luz dinâmico (DLS, Zetasizer, Malvern, UK) foi usado para
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173/222 determinar o tamanho hidrodinâmico de NPs e pMHC-NPs. A natureza química do núcleo de óxido de ferro da série PF de NPs foi avaliada usando difração de feixe de elétrons de ângulo pequeno (SEBD). As propriedades químicas de superfície foram avaliadas usando espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). NPs conjugadas a pMHC foram analisadas por meio de PAGE nativo e desnaturante, ensaio de Bradford, análise de amínoâcido e dot-ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (dot-ELISA).
[267] Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). As propriedades químicas de superfície dos designs de NP de óxido de ferro da série PF foram avaliadas usando espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FTIR). Os espectros de FTIR de PEG de controle e PEG ancorado na superfície de PF-NP foram obtidos usando um espectrofotômetro FTIR Nicolet em um modo ATR (reflexão total atenuada) . Cada um dos espectros foi registrado como a média de 256 varreduras a 4 cm 1 de resolução espectral. As assinaturas de vibração molecular do arcabouço de PEG (representado por vibração ao estiramento assimétrico C-H, vibração C-O-C e vibração rotacional CH2) e seus grupos funcionais distais aceptores de pMHC foram identificadas.
[268] Eletroforese em gel de agarose. Para avaliar rapidamente alterações na carga da NP em função de peguilação ou revestimento de pMHC, as NPs foram submetidas à eletroforese em géis de agarose 0,8%. NPs peguiladas migraram para polos negativos ou positivos, dependendo da carga de superfície global.
[269] Eletroforese em gel de poliacrilamida nativo e
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174/222 desnaturante. NPs conjugadas a pMHC foram submetidas a análises por PAGE-nativo e SDS-PAGE (10%) para confirmar a ausência de pMHC livre (pMHC não conjugada) nas preparações de pMHC-NP e para confirmar a presença de complexos de pMHC trimoleculares intactos na superfície da NP.
[270] Medições da valência de pMHC. Para avaliar o número de monômeros de pMHC conjugados em NPs individuais (valência de pMHC), o Requerente mediu a concentração de pMHC das preparações de pMHC-NP usando diferentes abordagens, incluindo ensaio de Bradford (Thermo Scientific), análise de aminoácido (quantificação baseada em HPLC de 17 aminoácidos diferentes em preparações de pMHC-NP hidrolisadas) (University of Toronto) e dot-ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (dot-ELISA), e os valores convertidos em proporções de número molecular de pMHC em número de NP. Resumidamente, na abordagem de dot-ELISA, NPs conjugadas a pMHC e não conjugadas e soluções de monômero de pMHC (como padrões) foram diluídas serialmente em PBS e absorvidas a uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) em uma placa de filtro multipoços (PALL Corporation). Foi permitido que a placa quase secasse em temperatura ambiente e depois ela foi incubada com anticorpos primários específicos para pMHC (ou seja, anticorpos anti-p2M e anti-Kd para NPs revestidas com pMHC Classe I, clones 2M2 e SF1-1.1, respectivamente; BioLegend, San Diego, CA) , seguido por anticorpos secundários conjugados à HRP ou AP. Após desenvolvimento de reações enzimáticas de cor, o conteúdo dos poços foi transferido para poços de uma placa de ELISA convencional e sua absorbância medida a 450 nm usando uma leitora de placas. Como os valores gerados por esses métodos diferentes eram
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175/222 similares, o ensaio de Bradford (usando NPs não conjugadas como vazios) se tornou o método de escolha pela facilidade e simplicidade.
[271] Sinalização de TCR em células JurMA transfectadas com TCR/mCDA. Os cDNAs de TCRa e TCRp que codificam o BDC2.5TCR foram gerados por mRNA derivado de célula T BDC2.5-CD4H— usando o kit 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, versão 2.0 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) e iniciadores de oligonucleotídeo TCRa ou TCRp-especrficos. Os produtos de PCR resultantes foram clonados no plasmídeo pCR8 e sequenciados. Os cDNAs de comprimento total foram então subclonados em um vetor retroviral a montante de um cassete IRES-eGFP, como um quadro de leitura aberta único no qual os cDNAs de TCRa e TCRp eram separados por uma sequência de salto de ribossomo P2A.
[272] A sequência de polipeptídeos da proteína de fusão TCRa-P2A-TCRp é fornecida na Listagem de Sequências Exemplar fornecida abaixo.
[273] A sequência de polinucleotídeos que codifica a proteína de fusão TCRa-P2A-TCRp é fornecida na Listagem de Sequências Exemplar fornecida abaixo.
[274] A linhagem de célula JurMA humana CD3+/TCR β repórter (modificada geneticamente para expressar luciferase dirigida por NFAT) foi transduzida com um retrovírus que codifica CD4 murídea por cocultura com a linhagem de célula GP+envAml2 produtora de retrovírus. As células transduzidas foram expandidas, coradas com anti-mCD4 (GK1.5) conjugado a Azul Pacífico (BioLegend, San Diego, CA) e separadas com um FACSAria II BD (BD Biosciences, NJ) . As células Jurkat/MA CD4+ foram então transduzidas com um retrovírus que codifica
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176/222 o BDC2.5-TCRap e IRES-eGFP. Células duplo-positivas para eGFP e mCD4 foram separadas por citometria de fluxo e coradas com tetrâmeros de pMHC BDC2.5/IAg7 marcados com PE para confirmar sua especificidade.
[275] Para medir a expressão de luciferase dirigida por NFAT, células JurMA do tipo selvagem e BDC2.5/mCD4+ foram plaqueadas em uma placa de 48 poços a 500.000 células/poço em 200 μΐ de DMEM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado com FBS 10% (Sigma-Aldrich) , 20 mM de L-glutamina (SigmaAldrich) , 10 mM de piruvato de sódio (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e antibióticos, na presença ou ausência de 20 ng/ml de PMA (Sigma-Aldrich) mais 0,5 μΜ de lonomicina (Sigma-Aldrich) , 10 pg/ml de mAb anti-hCD3£ (OKT3, BD Biosciences) ou 12,5 pg/ml de PF-M revestida com BDC2.5/IA97. As células foram coletadas dos poços em tempos diferentes após estimulação, transferidas para uma placa de 96 poços, e lavadas 3 vezes com PBS. 105 células foram transferidas para uma nova placa de 96 poços, Usadas em 20 μΐ de Reagente de Lise de Cultura de Células (Promega, Madison, WI) e incubadas com 100 μΐ de Reagente de Ensaio de Luciferase (Promega) em placas opacas brancas (Greiner Bio One International GmbH, Kremsmunster, Áustria) usando um Luminômetro de Microplaca Veritas™ (Promega) com injetores. A atividade de luciferase foi expressa como unidades de luminescência relativa (RLUs), normalizadas para a atividade de luciferase de células não estimuladas.
[276] Atividade agonista de pMHC-NPs ín vítro. Células esplênicas CD8+ ou CD4+ separadas por FACS de camundongos transgênicos-TCR (2,5 x 105 células/ml) foram incubadas com uma gama de concentrações de NPs conjugadas a pMHC ou de
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177/222 controle por 24-48 h a 37°C. Os sobrenadantes foram testados quanto ao IFNy por ELISA.
[277] A responsividade de clones de células T humanas aos mAbs agonistas e NPs revestidas com pMHC foi avaliada por cultivo de 5 x 105 células T clonais em placas de 48 poços, em 500 μΐ de meio RPMI-1640 completo contendo micropartículas revestidas com mAb anti-CD3/anti-CD28 (Life Technologies; em uma proporção de micropartícula-para-célula de 1:1), PF-M revestida com PPI76-90 <88s>/DRBl*0401 (50 pg de peptrdeo/MHC/ml) ou um número idêntico de controle, PF-M revestida com Cys . No Dia 2, os sobrenadantes foram coletados para análises do teor de citocina por Luminex e péletes de células coletados para extração de RNA. Em outros experimentos, clones de células T foram incubados com PF-M revestida com PPI76-90<88s)/DRBl*0401 ou PF-M revestida com Cys por até 5 dias. As células foram coletadas nos dias 0, 2, 3, 4 e 5 e usadas para extração de RNA.
[278] Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) de conjugados pMHC-NP/célula. Células T BDC2.5-CD4+ e 8.3-CD8+ (5 x 106/ml) , isoladas de animais transgênicos-TCR usando kits de enriquecimento de linfócitos CD4+ ou CD8+ biotinaestreptavidina (BDC ImagTM, BD Biosciences), foram incubadas com PF-M NPs revestidas com 2.5mi/IA9?- e NRP-V7/Kd por 30 min a 4°C (15-20 pg/ml de pMHC). As culturas foram adicionalmente incubadas a 37°C pelas durações de tempo indicadas, lavadas com PBS gelado para remover PF-M NPs não ligadas, fixadas e cortadas (70 nm) para imageamento por TEM com um Hitachi H7650.
[279] Microscopia de super-resolução. Células T 8.3-CD8+ purificadas foram incubadas com NPs NRP-V7/Kd-PF-M-Alexa-647
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178/222 a 4°C por 30 min ou a 37°C por mais 1 hora. As células foram lavadas três vezes com PBS gelado pH 7,4, e depois fixadas em PFA 2% por 15 min no gelo. Após a lavagem, as células foram coradas por 1 pg/ml de DAPI em temperatura ambiente por 5 min, montadas e observadas sob um Microscópio de SuperResolução (ELYRA 131, Zeiss). O processamento de imagens e a análise quantitativa do diâmetro de agrupamento foram feitos com o software ZEN 2012 (n = 100).
[280] Microscopia de varredura eletrônica (SEM) e espectrometria de raios-X de conjugados pMHC-NP/célula. Macrófagos peritoneais induzidos por tioglicolato e DCs derivadas da medula óssea foram preparados como descrito acima. Células T BDC2.5-CD4+ e 8.3-CD8+ foram selecionadas negativamente de baços de camundongos BDC2.5-NOD ou 8.3-NOD usando kits de enriquecimento de linfócitos T CD4+ ou CD8 + biotina-estreptavidina (BD ImagTM, BD Biosciences). As células foram plaqueadas em uma laminula e incubadas com PFM não conjugada ou conjugada à Cys, BDC2.5mi/IA9?-PF-M ou NRP-V7/Kd-PF-M a 4°C por 30 min com/sem incubações adicionais de 60 ou 180 min a 37°C. Após incubação, as células foram lavadas com 0,05 M de tampão de cacodilato (CB) pH 7,4, e depois fixadas com glutaraldeído 2,5% a 4°C de um dia para o outro. As amostras foram submetidas à desidratação sequencial em etanol graduado e imersas em hexametildisilazano por 3 min para secagem. As amostras foram observadas sob SEM XL30 (Philips, Holanda) por revestimento de ouro. A análise de elementos foi realizada usando espectrometria de raios-X de energia dispersiva (EDS).
Exemplo 1 - Densidade molecular de pMHC na superfície de nanopartícula (NP) versus a atividade biológica de
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179/222 nanomedicamentos à base de pMHC
[281] Para compreender como a valência de complexos de peptídeo-histocompatibilidade principal (pMHC) e a concentração de nanopartícula de pMHC (NP) contribuem para a atividade biológica desses compostos, o Requerente comparou a habilidade de várias preparações de NRP-V7/Kd-NP para ativar transitoriamente células T CD8+ cognatas (NRPV7/Kd/IGRP206-214-específicas) de camundongos 8.3-NOD transgênicos para o receptor de célula T (TCR). Como mostrado na FIG. IA, células T 8.3-CD8+ produziram pequenas quantidades de interferon gama (IFNy) quando cultivadas na presença de SFP-NPs revestidas com 8 pMHCs/NP, mas quantidades substancialmente maiores de IFNy em resposta a NPs revestidas com valências de pMHC maiores, até mesmo apenas 11 pMHCs/NP, ao longo de uma ampla gama de concentrações de pMHC-NP ou pMHC. Essa observação sugeria que há um limiar de valência de pMHC para atividade agonista de SFP-NPs, situada entre 9 e 11 pMHCs/NP (FIGS. IA e 1B). Sem estar limitado pela teoria, aumentos nas concentrações de pMHC-NP podem aumentar as propriedades agonistas de pMHCNPs que carregam valências de pMHC limiares ou supralimiares.
[282] Para confirmar essa observação, a seguir o Requerente usou PF-NPs, que são maiores do que SFP-NPs e, dessa forma, possuem maior capacidade de revestimento de pMHC. pMHC-NPs PF que carregam 13 ou menos pMHCs/NP tinham atividade biológica muito fraca ou ausente até aproximadamente 8 χ 1012 NPs/ml, quando comparadas com PFNPs, que exibem uma valência de pMHC bem maior (61 pMHCs/NP, FIGS. 1C e 1D, e dados não mostrados). Isso apoiava a idéia
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180/222 de que o limiar de pMHC necessário para atividade agonista aumenta com o tamanho de NP (ou seja, de >8 pMHCs para SFPNPs de aproximadamente 8 nm para >13 pMHCs para PF-NPs de aproximadamente 20 nm). Os efeitos inversos do tamanho de NP e valência de pMHC sobre a atividade agonista sugeria um papel para a densidade de pMHC (pMHCs/área de superfície de NP). Isso é ilustrado ainda mais na FIGS. 1E e 1F, em que o Requerente comparou a atividade biológica de NPs-SFP e -PF revestidas com um número similar de pMHCs ao longo de uma gama de concentrações de NP ou pMHC (para compensar as diferenças absolutas na carga total DE pMHC quando se utilizam concentrações idênticas de NPs de tamanho diferente).
Exemplo 2- Aumentos rápidos na atividade biológica acima das densidades limiares de pMHC
[283] Esses dados sugeriam que o limiar da atividade biológica é definido por uma constante que corresponde à distância que separa monômeros de pMHC individuais na NP. O Requerente comparou as capacidades de ligação limiares máximas e previstas de NPs de diferentes tamanhos, para identificar um limiar de densidade de pMHC. O limiar teórico da densidade de pMHC se situa em 0,004468 pMHCs/nm2, que corresponde a 11 pMHCs para uma NP de 8 nm ou 22 pMHCs para uma NP de 20 nm. Esses valores correspondem a uma distância intermolecular calculada de aproximadamente 16,88 nm. Acredita-se que o complexo de receptor de antígeno de célula T (TCR) contenha até dois heterodímeros de TCRap dentro de um complexo CD3y-CD3e-TCR«3-CD3/-CD3/-TCR«3-CD3õ-CD3e (Rojo, J.M. e cols. (1991) Immunol. Today 12 (10): 377-378; Fernandez-Miguel, G. e cols. (1999) Proc. Natl. Acad. Sei.
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USA 96 (4): 1.547-1.552). Essa estrutura é compatível com a largura estimada do complexo de TCR com base em reconstrução 3D (12 nm) (Arechaga, I. e cols. (2010) Int. Immunol. 33 (11) : 897-903), e consistente com a distância inter-pMHC calculada de 1,88 nm para alcançar o limiar agonista. O Requerente calculou a distância intermolecular mínima possível em aproximadamente 3, 62 nm, o que combina bem com a distância estimada de 3-6 nm que transpõe TCRs individuais dentro de nanoagrupamentos de TCRap; essa distância permitiria um alinhamento quase perfeito de pMHC nas NPs e TCRs cognatos em células T (FIG. 2A) . pMHC-NPs capazes de ligação a heterodímeros de TCR contíguos nesses agrupamentos são eficientes para provocar a sinalização de TCR. Esses modelos explicam por que NPs pequenas revestidas com pMHCs dispostas intimamente possuem propriedades imunológicas ótimas. A densidade de pMHC controla a conversão de célula Treg, pois pode promover a montagem sustentada de microagrupamentos grandes de TCR, levando à sinalização de TCR rápida, robusta e prolongada (FIG. 2B).
[284] A hipótese baseada em dados gerados usando NPs revestidas com pMHC Classe I foi testada por comparação da potência de disparo de TCR de PF-NPs revestidas com monômeros de pMHC Classe II, ao longo de uma ampla gama de valências. Células T CD4+ isoladas de camundongos NOD transgênicos BDC2.5-TCR produziram pequenas quantidades de ΙΕΝγ em resposta às NPs PF-M revestidas com até 22 complexos de pMHC cognatos (BDC2.5mi/IAg7) (0,0045 pMHCs/nm2, FIG. 1G) . Notavelmente, por tabulação dos dados de secreção de ΙΕΝγ obtidos a 10 e 5 pg de pMHC/ml (as concentrações nas quais o efeito dose-resposta atinge um platô), a magnitude da
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182/222 secreção de ΙΕΝγ aumenta exponencialmente em resposta a aumentos relativamente pequenos na valência de pMHC, começando em aproximadamente 22 pMHCs (a valência limiar prevista) e terminando em aproximadamente 32 pMHCs/NP (0,0065 pMHCs/nm2, denominada nesse relatório descritivo a valência mínima ótima) (FIG. 1H). Aumentos substanciais na valência/densidade de pMHC acima dessa valência mínima ótima não resultam em potência significantemente maior (FIG. 1H).
Exemplo 3 - A densidade de pMHC controla a magnitude da sinalização de TCR induzida por pMHC-NP
[285] Para verificar se esses efeitos biológicos poderíam ser responsáveis por diferenças de densidade de pMHCdependentes na eficiência de sinalização de TCR, o Requerente transduziu a linhagem de célula T Jurkat/MA humana (JurMA) (desprovida de expressão endógena da cadeia de TCRp e que carrega um repórter de luciferase dirigido por sequências de DNA de ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT)) (Scholten, K.B. e cols. (2005) Clin. Immunol. 114 (2) : 119-129) com lentivírus que codificam o heterodímero de TCRap BDC2.5 e o co-receptor de CD4 murídea. Como mostrado na FIG. II, células BDC2.5-TCR/mCD4JurMA responderam rapidamente (dentro de 2 h) , vigorosamente e por um período de tempo sustentado (> 24 h) à PF-M revestida com BDC2.5mi/IA9?, comparado com concentrações ótimas de um mAb agonista para anti-CD3e humana ou PMA/ionomicina, o que desencadeou uma resposta bem mais lenta que atingiu um pico em 14 h e progressivamente diminuiu posteriormente. Notavelmente, experimentos que utilizam PF-M NPs revestidas com uma ampla gama de valências de BDC2.5mi/IA9? indicaram que a magnitude da expressão de luciferase (uma leitura
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183/222 direta da sinalização de TCR) seguia uma cinética acentuadamente similar àquela observada com células T primárias BDC2.5-CD4 + , indicando que densidades limiares e supralimiares de pMHC de algum modo promovem a sinalização cooperativa de TCR (FIG. 1J).
[286] Também é inesperado observar que o ensaio dessa revelação que apresenta uma curva sigmóide (FIG. 1J) que mimetiza intimamente a curva de densidade de pMHC-resposta quando se utilizam células T primárias naive transgênicas para TCR, tanto em termos (a) do formato consistente com efeitos de sinalização cooperativa, quanto (b) das valências/densidades de pMHC específicas que definem densidades limiares e ótimas mínimas. Isso é completamente surpreendente para uma linhagem de célula transfectada que superexpressa os pares TCR/co-receptor exógenos. Aqueles habilitados na técnica esperariam respostas lineares (ao contrário de uma curva em formato sigmóide) pelas células transfectadas, considerando a dificuldade de combinar o número molecular e a estequiometria precisa das moléculas de TCR e CD4 murídeas transfectadas, e considerando que a linhagem de célula hospedeira é de origem humana (incluindo seus componentes da cadeia CD3), enquanto as moléculas de pMHC e TCR/CD4 testada eram murídeas.
Exemplo 4 - pMHC-NPs desencadeiam agrupamento de receptor ao antígeno em células T murídeas cognatas
[287] 0 Requerente demonstrou que pMHC-NPs promovem conversão de célula Treg ligando diretamente TCRs em células T cognatas, ao invés de liberar pMHCs a essas células T por meio de uma célula apresentadora de antígeno professional (APC) (Clemente-Casares, X. e cols. (2016) Nature 530 (7591):
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434-440). O efeito da densidade de pMHC revelado pelos experimentos acima, acoplado à produção rápida e sustentada de luciferase dirigida por NFAT em células JurMA transfectadas com TCR/mCD4 atacadas por pMHC-NP, comparado com outros estímulos (FIG. 1J), sugeria que pMHC-NPs podem operar por indução de ligação ao TCR prolongada (ao contrário da natureza transitória de interações de baixa afinidade de pMHC/TCR monomérico).
[288] TCRs estão organizados na superfície de células T naive como agrupamentos lineares (Schamel, W.W. e cols. (2013) Immunol. Rev. 251 (1) : 13-20) ou montagens não lineares (Lillemeier, B.F. e cols. (2010) Nat. Immunol. 11 (1): 90-96) de até aproximadamente 200 nm em diâmetro/comprimento e formadas por até 30 TCRs intimamente associados (nanoagrupamentos) (Zhong, L. e cols. (2009) PLoS One 4(6) : e5945) . Acredita-se que a arquitetura de nanoagrupamento dessas montagens de TCR aumente a avidez fisica e, dessa forma, a sensibilidade funcional, de células T para pMHC cognata em APCs professionais e promova sinalização intracelular cooperativa entre as unidades de TCR intimamente dispostas. Há evidências de que a formação de nanoagrupamento de TCR é constitutiva e precede a formação de microagrupamento de TCR (levando à sinalização de TCR sustentada) que resulta da ligação à pMHC (que geralmente varia de 300-800 nm no tamanho e contém até 70 TCRs) (Lillemeier, B.F. e cols. (2010) Nat. Immunol. 11 (1): 9096; Yokosuka, T. e cols. (2005) Nat. Immunol. 6 (12): 1.2531.262; Choudhuri, K. e cols. (2010) FEBS Lett. 584 (24) : 4.823-4.831; Sherman, E. e cols. (2011) Immunity 35 (5) : 705-720).
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[289] Para ter uma percepção sobre o efeito da densidade de pMHC descrito acima, o Requerente investigou a geometria e a cinética de ligação de NPs revestidas com pMHC (em densidades supralimiares de pMHC) às células T cognatas. Estudos por TEM revelaram que pMHC-NPs se ligam às células T CD8+ ou CD4+ cognatas como agrupamentos (ilhas) de várias NPs que transpõem aproximadamente 100-150 nm (FIGS. 3A e 3B) . Essa geometria de ligação, que já era observada dentro de 30 min a 4°C, foi seguida por crescimento do agrupamento (até diâmetros/comprimentos de aproximadamente 400 nm) mediante incubação a 37°C (FIGS. 3A, 3B e 3G) , e culminava na internalização das NPs em vesículas intracelulares, começando em aproximadamente 3 horas após a ligação (FIGS. 3A e 3B) . Esse engajamento agrupado era antígeno-específico, na medida em que nem a ligação nem a internalização de NPs eram observadas quando pMHC-NPs foram incubadas com células T não cognatas (FIG. 3C) . Esses resultados foram substanciados por microscopia de super-resolução (FIG. 3D) e microscopia de varredura eletrônica (SEM) (FIGS. 4A e 4B) , confirmando a presença de pMHC-NPs agrupadas na superfície de células T cognatas.
[290] Considerados em conjunto, esses dados sugeriam que pMHC-NPs funcionam como nanoagrupamento de dispositivos de ligação ao TCR e desencadeamento de microagrupamento, trazendo a possibilidade de que esse processo pode ser responsável, ou pelo menos contribui, para a conversão de célula Treg· Como a conversão de Treg é uma função direta da densidade de pMHC, o Requerente investigou se variações na densidade de pMHC tinham algum efeito sobre a formação de microagrupamento de TCR. O Requerente comparou preparações
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186/222 de BDC2.5mi-IA9?-NP que carregam pMHCs em densidades sublimiares, limiares e supralimiares. Notavelmente, NPs revestidas em densidades sublimiares se ligaram e foram eventualmente internalizadas por células T CD4 + cognatas, mas sem a formação de agrupamentos (FIGS. 3E e 3G) . Em contraste, NPs revestidas em densidades limiares rapidamente desencadearam a formação de agrupamentos, e os tamanhos desses agrupamentos aumentaram com o uso de NPs revestidas em densidades supralimiares (FIGS. 3A, 3F e 3G).
[291] Os dados acima indicam que a geometria de ligação de nanomedicamentos à base de pMHC às células T cognatas é responsável pelos efeitos da densidade de pMHC observados. Monômeros de pMHC dispostos intimamente na superfície da NP facilitariam o reengajamento repetido de monômeros de pMHC dissociados transitoriamente em NPs individuais e, dessa forma, retardando a internalização de TCR e prolongando a ti/2s de interações TCR-pMHC individuais (Zhong, L. e cols. (2009) PLoS One 4 (6) : e5945; Huppa, J.B. e cols. (2010) Nature 463 (7283) : 963-967) . Os rearranjos citoesqueléticos desencadeados pelos eventos de sinalização resultantes então promoveriam a montagem sustentada de unidades de pMHC-NP-TCR proximais em microagrupamentos de TCR grandes (Bunnell, S.C. e cols. (2002) J. Cell Biol. 158 (7): 1.263-1.275), amplificando ainda mais a duração e magnitude da sinalização de TCR (Yokosuka, T. e cols. (2005) Nat. Immunol. 6 (12) : 1.253-1.262). Densidades de pMHC elevadas também facilitariam a propagação cooperativa de alterações conformacionais e eventos de sinalização a jusante associados por TCRs ligados à pMHC para seus vizinhos não ligados (Gil, D. e cols. (2002) Cell 109(7): 901-912;
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Minguet, S. e cols. (2007) Immunity 26 (1) : 43-54), tanto dentro quanto entre NPs individuais em agrupamentos de membrana (Martinez-Martin, N. e cols. (2009) Science Signaling 2 (83) : ra43) . Essa interpretação é compatível tanto com a revisão cinética (McKeithan, T.W. (1995) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92 (11) : 5.042-5.046) quanto com modelos seriais de engajamento de TCR (Valitutti, S. e cols. (1995) Nature 375 (6527): 148-151) de ativação de célula T.
[292] A descoberta das propriedades não previstas de sinalização dependentes tanto da densidade de pMHC quanto do agrupamento de receptor de antígeno desses compostos permite o uso de linhagens de células repórteres que expressam receptor de antígeno, tais como aquelas descritas nesse relatório descritivo ou similares, em ensaios de potência e de liberação de batelada.
Exemplo 5 - Protocolo de exemplo para um ensaio de potência baseado em luciferase
[293] Um ensaio de potência de exemplo para uso na determinação da potência de qualquer preparação de nanopartícuias de pMHC particular é detalhado nesse exemplo. As células, nesse caso, compreendem um gene de luciferase sob o controle do promotor de NFAT. CD4 murídea é expressa, já que as células JurMA são uma linhagem de célula humana, e o componente de MHC da pMHC testada nesse exemplo é ο IA'-'7 de camundongo. É contemplado e mostrado em exemplos subsequentes que a linhagem de célula JurMA funciona com MHC humana tão bem quanto de camundongo (já que células JurMA exibem expressão endógena de CD4 humana).
[294] 1. Em uma placa de 96 poços (em triplicata) , adicionar 500.000 células JurMA BDC2.5/mCD4+ em 200 μΐ de
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188/222 meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, N° de Catálogo D6429-500ML), suplementado com soro fetal bovino 10% (FBS) (Sigma-Aldrich, N° de Catálogo F6178) na presença de: 1) 20 ng/ml de PMA (Sigma-Aldrich, N° de Catálogo P8139) mais 0,5 μΜ de lonomicina (Sigma-Aldrich, N° de Catálogo I3909-1ML), 10 pg/ml de mAb anti-hCD3e (OKT3, BD Biosciences) (como um controle positivo); 2) 12,5 ou 5,0 pg/ml de pMHC revestida em PF-M NP de várias valências, variando de 10-48 pMHCs/NP; ou 3) NP revestida com cisterna (como controle negativo que possui concentração de ferro equivalente à pMHC-NP) . Incubar de um dia para o outro em uma incubadora de CO2 a 37°C com fornecimento de CO2 9%. Como uma réplica de controle, essa configuração com células JurMA do tipo selvagem.
[295] 2. No dia seguinte, centrifugar as células a 1.200 rpm 5 minutos e remover o meio. A seguir, adicionar 200 μΐ de PBS e lavar as células 3 vezes.
[296] 3. Ressuspender o pélete de células em 100 μΐ de Tampão de Lise lx (Cell Culture Lysis Reagent, Promega, N° de Catálogo E1531) e incubar por 30 minutos com agitação suave.
[297] 4. Recolher 20 μΐ do lisado e transferi-lo para uma placa de 96 poços branca opaca (Greiner Bio-one Ref. #655075).
[298] 5. Adicionar 100 μΐ de Reagente de Ensaio de Luciferase (Promega, N° de Catálogo E1500) por poço, e depois lê-lo imediatamente por utilização de um Luminômetro de Microplacas Veritas™ (o injetor desse instrumento adiciona automaticamente 100 μΐ de Reagente de Ensaio de Luciferase por poço. A placa é avançada até o poço seguinte para uma
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189/222 repetição do processo injetar-depois-ler) . A luz produzida é medida por um período de 10 segundos (tempo de integração). O tempo de retardo é de 2 segundos.
[299] Esse método é geralmente aplicável a um ensaio para potência e atividade de muitos tipos diferentes de composições de nanopartículas, como é mostrado nos exemplos seguintes.
Exemplo 6 - Medição da variabilidade interensaios
[300] Para medir a variabilidade interensaios, o Requerente preparou pMHC-NPs que possuem a mesma especificidade (ou seja, os mesmos complexos de pMHC anexados ao núcleo) e testou para SD50 (concentração que gera metade da atividade máxima, como medida em um gráfico Semilog). Esses experimentos utilizaram células JurMA transfectadas com um TCR recombinante específico para GAD524-543 ligado a IAg7(BDC 2.5mi) e uma CD4 de camundongo recombinante. Os resultados estão resumidos na FIG. 5 e mostram que os dados atuais com 7 experimentos são 8,91 mais/menos 1 micrograma/ml (média mais/menos desvio-padrão da média). A reprodutibilidade testada e observada com o ensaio do Requerente é inesperada, pois o repórter não é realmente um evento de sinalização de TCR proximal, e aqueles habilitados na técnica esperariam mais ensaios para testar a variabilidade do que o mostrado. No entanto, esse cálculo de dados mostra respostas apertadas e estabelece que esse ensaio quantitativo é bem mais preferido do que o convencional, mas ensaios menos quantitativos ou semiquantitativos (por exemplo, medições da intensidade da fosforilação de intermediários de sinalização a montante do repórter de sinalização de TCR) . A vantagem da quantificação, acoplada
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190/222 com baixa variabilidade interexperimental e reprodução confiável de limiares de densidade de pMHC responsáveis por atividade biológica, pode fornecer comparação de bateladapara-batelada excelente e altamente sensível da composição e qualidade dessa revelação.
Exemplo 7 - Ensaio baseado em células de potência para avaliar efeitos potenciais de anticorpos anti-Navacim em função estimulatória de célula T in vitro de Navacim.
[301] Após a liberação in vivo, existe potencial para que um hospedeiro imunocompetente gere uma resposta humoral contra vários componentes de pMHC-NPs. Esses incluem etiquetas de purificação de proteína como, por exemplo, a etiqueta 6x His presente dentro dos monômeros de pMHC revestidos em sua superfície, bem como PEG, que é um componente estrutural da pMHC-NP. Esse exemplo mede se anticorpos dirigidos contra os vários componentes de pMHCNPs (pMHC, PEG, etiqueta de His) possuem um efeito apreciável sobre a habilidade de pMHC-NP para engajar e induzir a sinalização de TCR em células T. Resultados prévios demonstram a habilidade da exposição do soro humano às pMHCNPs para bloquear a ligação de anticorpos anti-PEG (AGP4) e anti-His (6G2A9) ás partículas. Portanto, esse ensaio testará partículas pré-expostas e não expostas ao soro humano quanto à sua habilidade para estimular células T JurMA cognatas após exposição aos anticorpos monoclonais anti-His, anti-PEG ou anti-MHC ou soro hiperimune de coelho.
Reagentes e configuração experimental mAbs ant i-pMHC
- mAb purificado anti-MHC Classe II de camundongo/rato RT1B (clone OX-6) (1 mg/ml em PBS, Bio-Rad, N° de
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Catálogo MCA46R)
- mAb anti-PEG purificado (clone AGP4) (1,4 mg/ml em
PBS, Anti-PEG, N° de Catálogo AGP4-PABM-A)
- mAb anti-etiqueta de His purificado (clone 6G2A9) (0,5 mg/ml em PBS, Genscript, N° de Catálogo A00186)
- IgG de camundongo purificada (clone MOPC21) (0,5 mg/ml em PBS, BD Biosciences, N° de Catálogo 554121)
Soro
- Soro hiperimune de coelho anti-PEG
- Soro hiperimune de coelho anti- pMHC BDC2.5mi
- Soro de coelho pré-imune
- Soro humano (Sigma, N° de Catálogo H4522) pMHC—NPs
- BDC2.5mi-PFM-l12017 (Fe: 2,15 mg/ml, pMHC: 0,97 mg/ml,
Valência 42 pMHC/NP)
- Cys-PFM-111417 (Fe: 1,52 mg/ml)
Método de detecção de luciferase:
- Kit de ensaio de luciferase de vaga-lume Promega com tampão de lise de cultura de células (Promega, N° de Catálogo E1500)
- Luminômetro de leitura de placas Spectramax i3x com injetores de reagente
[302] O ensaio de potência foi realizado seguindo o protocolo de Exemplo do Exemplo 5 para um ensaio de potência à base de luciferase).
Resultados
[303] Com ou sem pré-exposição ao soro humano, como esperado, mAb anti-MHC-II (anti-BDC2.5mi/IAg7) direcionado ou anti-soros foram capazes de inibir acentuadamente a atividade de Navacim no ensaio de potência in vitro de uma
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192/222 forma titulação-dependente. Esses tratamentos foram incluídos como controles positivos de inibição para ajudar a validar o ensaio.
[304] Como mostrado na FIG. 6A a 6D, nenhuma inibição de atividade de pMHC-NP foi observada com mAbs anti-etiqueta de His, anti-PEG ou soro hiperimune de coelho anti-PEG, comparados com os controles negativos (IgG de camundongo ou soro de coelho pré-imune), com ou sem pré-exposição ao soro humano. Na ausência de pré-exposição ao soro humano, mAbs anti-PEG realmente mostraram um potente efeito de potencialização na estimulação de linfócitos T pMHC-NP (possivelmente em função da reticulação pela estrutura pentamérica do complexo pMHC-NP, já que isso não é observado com soro hiperimune anti-PEG). Esse efeito era bloqueado por pré-exposição de Navacims ao soro humano, consistente com nossos achados prévios que que a exposição ao soro bloqueava a ligação do anticorpo anti-PEG. Dessa forma, a exposição de Navacims ao soro humano não reduz sua potência no ensaio de JurMA
Exemplo 8 - Heterodímeros de pMHC IGRP13-25/DR3 se ligam às linhagens de células modificadas geneticamente que expressam TCR cognato
[305] A habilidade de heterodímeros de pMHC-DR3 IGRP13-25 imobilizados com cys, sem zíper, knob-in-hole, para se ligarem a um receptor de célula T foi testada. Para isso, a foi usada uma linhagem de célula repórter que expressa a cadeia alfa e beta por um receptor de célula T humano específico para IGRP13-25 pMHC-DR3.
Protocolo de transdução da linhagem de célula JURMA-hCD4 com retrovirus que codifica IGRP-TCR
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[306] A geração da linhagem de célula de empacotamento GP+EnvAM12. Fizemos a transfecção de células 293T com um retrovírus que expressa IGRP-TCR e um repórter de GFP, juntamente com construções de compactação gag/pol e VSV. Três dias depois, sobrenadantes enriquecidos em VSVpseudotipado foram coletados, divididos em alíquotas e congelados. Essas alíquotas foram usadas para transduzir a linhagem de célula de empacotamento anfotrópica GP+envAml2 (ATCC CRL-9641) por infecção por centrifugação (2.700 rpm por 1 h) . Após 5 infecções por centrifugação, células GP+envAml2 transduzidas foram separadas para expressão de GFP, se necessário.
Transdução de linhagem de célula JURMA-hCD4 com retrovírus que codifica IGRP-TCR
[307] Três milhões de células GP+envAml2 transduzidas e separadas foram plaqueadas por poço de uma placa de 6 poços em um volume final de 3 ml. No dia seguinte, 100.000 células JURMA-hCD4 foram cocultivadas com as células GP+envAml2 transduzidas pré-plaqueadas em um volume final de 3 ml suplementado com 8 pg/ml de polibreno. Essa cocultura foi mantida durante duas semanas, trocando os meios a cada 2 ou 3 dias. Após cocultura, células JURMA-hCD4 foram colhidas e analisadas por citometria de fluxo e separadas para expressão transgênica elevada. As células foram então coradas com heterodímeros marcados com PE. A FIG. 7A retrata células não coradas como um controle negativo, a FIG. 7D retrata células coradas com tetrâmero irrelevante, a FIG. 7B retrata coloração com tetrâmeros feitos de heterodímeros expressos usando tecnologia cys-trap e zíper de leucina, a FIG. 7C retrata tetrâmeros feitos de heterodímeros expressos usando
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194/222 tecnologia cys, trap e knob-in-hole, sem um ziper de leucina. A coloração entre heterodimeros feitos usando qualquer uma dessas tecnologias era robusta. Esses dados demonstram que heterodimeros feitos usando uma tecnologia sem ziper, cys-trapped e knob-in-hole são capazes de se ligar ao receptor de célula T.
Exemplo 9 - Heterodimeros de pMHC IGRP13-25/DR3 knobin-hole estimulam linhagens de células repórter in vitro
[308] A habilidade de heterodimeros estabilizados cystrapped, knob-in-hole, quando anexados às nanoparticulas de óxido de ferro para estimular a sinalização de célula T, foi testada usando células JurMA que expressam um TCR IGRP1325 humano e luciferase sob o controle do promotor de NFAT. Esses resultados mostrados na FIG. 8A e FIG. 8B indicam que heterodimeros estabilizados cys-trapped, knob-in-hole, quando anexados às nanoparticulas de óxido de ferro, são capazes de induzir sinalização de célula T.
[30 9] Deve ser subentendido que, embora a presente revelação tenha sido especificamente revelada por certas modalidades e características opcionais, modificações, aprimoramentos e variações das revelações exemplificadas reveladas nesse relatório descritivo podem ser utilizados por aqueles habilitados na técnica, e que essas modificações, aprimoramentos e variações são considerados incluídos no escopo dessa revelação. Os materiais, métodos e exemplos aqui fornecidos são representativos de certas modalidades, são exemplares, e não são limitações do escopo da revelação.
[310] A revelação foi descrita de forma ampla e genericamente nesse relatório descritivo. Cada uma das
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195/222 espécies mais estreitas e agrupamentos subgenéricos englobados dentro da revelação genérica também formam parte da revelação. Isso inclui a descrição genérica da revelação, com uma condição ou limitação negativa que remova qualquer matéria do gênero, independentemente se o material removido é ou não especificamente citado nesse relatório descritivo.
[311] Além disso, quando características ou aspectos da revelação são descritos em termos de grupos de Markush, aqueles habilitados na técnica reconhecerão que a revelação também é dessa forma descrita em termos de qualquer membro ou subgrupo individual de membros do grupo de Markush.
[312] 0 uso do termo ou nas reivindicações visa significar e/ou, a menos que explicitamente indicado para se referir apenas às alternativas ou que as alternativas sejam mutualmente exclusivas, embora a revelação suporte uma definição que se refere apenas às alternativas e e/ou.
[313] Como usadas nesse relatório descritivo e nas reivindicações, as palavras que compreende (e qualquer forma de que compreende, por exemplo, compreendem e compreende), que possui (e qualquer forma de que possui, por exemplo, possuem e possui), que inclui (e qualquer forma de que inclui, por exemplo, inclui e incluem) ou que contém (e qualquer forma de que contém, por exemplo, contém e contêm) são inclusivas ou em aberto, e não excluem elementos ou etapas do método adicionais, não citados.
[314] Ao longo dessa revelação, várias publicações, patentes e relatórios descritivos de patentes publicados são citados por uma citação de identificação. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras
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196/222 referências mencionadas nesse relatório descritivo são expressamente incorporadas por referência em sua totalidade, no mesmo grau como se cada uma fosse incorporada por referência individualmente. Em caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo definições, prevalecerá.
Listagem de Sequências Exemplar
Tabela 3. Sequências de salto de ribossomo
Fonte Sequência ID. DE SEQ. N°
Picornavírus EMC-B -119aa GIFNAHYAGYFADLLIHDIETNPG 456
EMC-D GIFNAHYAGYFADLLIHDIETNPGP 457
EMC-PV21 RIFNAHYAGYFADLLIHDIETNPGP 458
MENGO HVFETHYAGYFSDLLIHDVETNPGP 459
TME-GD7 -109aa- KAVRGYHAD YYKQRLIHDVEMNP GP 460
TME-DA RAVRAYHAD YYKQRLIHDVEMNP GP 461
TME-BEAN KAVRGYHAD YYRQRLIHDVE TNP GP 462
Vírus Theilerlike KHVRE YHAAYYKQRLMHDVE TNP GP 463
Vírus Ljungan (174F) MHSDEMDFAGGKFLNQCGDVETNPGP 464
Vírus Ljungan (145SL) MHNDEMDYSGGKFLNQCGDVESNPGP 465
Vírus Ljungan (87-012) MHSDEMDFAGGKFLNQCGDVETNPGP 466
Vírus Ljungan (Ml 146) YHDKDMDYAGGKFLNQCGDVETNPGP 467
FMD-A10 LLNFDLLKLAGDVESNPGP 468
FMD-A12 LLNFDLLKLAGDVESNPGP 469
FMD-C1 LLNFDLLKLAGDVESNPGP 470
FMD-OIG LLNFDLLKLAGDMESNPGP 471
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FMD-OIK LTNFDLLKLAGDVESNPGP 472
FMD-0 (Taiwan) LLNFDLLKLAGDVESNPGP 473
FMD-O/SK LLSFDLLKLAGDVESNPGP 474
FMD-SAT3 MCNFDLLKLAGDVESNPGP 475
FMD-SAT2 LLNFDLLKLAGDVESNPGP 476
ERAV CTNYSLLKLAGDVESNPGP 477
ERBV GATNFS LLKLAGDVELNP GP 478
ERV-3 GATNFD LLKLAGDVE S NP GP 479
PTV-1 GPGATNFSLLKQAGDVEENPGP 480
PTV-2 GPGATNFSLLKQAGDVEENPGP 481
PTV-3 GPGASSFSLLKQAGDVEENPGP 482
PTV-4 GPGASNFSLLKQAGDVEENPGP 483
PTV-5 GPGAANFSLLRQAGDVEENPGP 484
PTV-6 GPGATNFSLLKQAGDVEENPGP 485
PTV-7 GPGATNFSLLKQAGDVEENPGP 486
PTV-8 GPGATNFSLLKQAGDIEENPGP 487
PTV-9 GPGATNFSLLKQAGDVEENPGP 488
ptv-io GPGATNFSLLKQAGDVEENPGP 489
PTV-11 GPGATNFSLLKRAGDVEENPGP 490
Virus de insetos CrPV FLRKRTQLLMSGDVESNPGP 491
DCV EAARQMLLLLSGDVETNPGP 492
ABPV GSWTDILLLLSGDVETNPGP 493
Isolado da Polônia de ABPV 1 GSWTDILLLLSGDVETNPGP 494
Isolado da Hungria de ABPV 1 GSWTDILLLWSGDVETNPGP 495
IFV TRAEIEDELIRAGIESNPGP 496
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TaV RAEGRGSLLTCGDVEENPGP 497
EEV QGAGRGSLVTCGDVEENPGP 498
APV NYPMPEALQKIIDLESNPPP 499
KBV GTWE SVLNLLAGDIELNP GP 500
PnPV (a) AQGWVPDLTVDGDVESNPGP 501
PnPV (b) IGGGQKDLTQDGDIESNPGP 502
Vírus Ectropis obliqua picorna-like (a) AQGWAPDLTQDGDVESNPGP 503
(b) IGGGQRDLTQDGDIESNPGP 504
Vírus Providence (a) VGDRGSLLTCGDVESNPGP 505
(b) SGGRGSLLTAGDVEKNPGP 506
(c) GDPIEDLTDDGDIEKNPGP 507
Rotavírus Tipo C Rotavírus bovino SKFQIDRILISGDIELNPGP 508
Rotavírus suíno AKFQIDKILISGDVELNPGP 509
Rotavírus humano SKFQIDKILISGDIELNPGP 510
Reovírus (cipovírus 1) Bombyx mori FRSNYDLLKLCGDIESNPGP 511
Lymantria díspar FRSNYDLLKLCGDVESNPGP 512
Dendrolimus punctatus FRSNYDLLKLCGDVESNPGP 513
Tr pansoma spp. Sequências repetidas T. brucei TSR1 S S11RTKMLVSGDVEENP GP 514
(CAB95325.1) SSIIRTKMLLSGDVEENPGP 515
(CAB95342.1) SSIIRTKMLLSGDVEENPGP 516
(CAB95559.1) SSIIRTKILLSGDVEENPGP 517
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Endonuclease de T. cruzi AP CDAQRQKLLLSGDIEQNPGP 518
Sequências procarióticas T. marítima aguA YIPDFGGFLVKADSEFNPGPX 519
B. bronchiséptica VHCAGRGGPVRLLDKEGNP GP 520
Sequências eucarióticas (celulares): mor-lF de camundongo DLELETVGSHQADAETNPGPX 521
Sequências eucarióticas (celulares): D. melanogaster mod(mdg4) TAADKIQGSWKMDTEGNPGPX 522
Canal de cálcio de A. nidulans MIDI PITNRPRNSGLIDTEINPGP 523
Tabela 4. Sequências de IRES
Fonte Sequência ID. DE SEQ. N°
Sequência de IRES de EMCV CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGA AGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATA TGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGT GAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGC ATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGC AAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCT GGAAGC Τ T C Τ T GAAGAC AAAC AAC GT C T GT AGC GAC C CTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGT GCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACC TGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGT TGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAA 524
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 206/245
200/222
GCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGT ACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTAC ACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAAC GTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCT T T GAAAAACAC GATGATAATATGGCCAC
Sequência de IRES pBagl CTGGGCGGTCAACAAGTGCGGGCCTGGCTCAGCGCGG GGGGGC GC GGAGAC C GC GAGGC GAC C GGGAGC GGC T G GGTTCCCGGCTGCGCGCCCTTCGGCCAGGCCGGGAGC CGCGCCAGTCGGAGCCCCCGGCCCAGCGTGGTCCGCC TCCCTCTGGGCGTCCACCTGCCCGGAGTACTGCCAGC GGGCATGACCGACCCACCAGGGGCGCCGCCGCCGGCG CTCGCAGGCCGCGGAT GAAGAAGAAAAC CCGGCGCCG C T C GAC C C GGAGC GAGGAGT T GAC C C GGAGC GAGGAG T T GAC C C T GAGT GAGGAAGC GAC C T GGAGT GAAGAGG C GAC C CAGAGT GAGGAGGC GAC C CAGGGC GAAG 525
Sequência de IRES de sintética AAAAGAAGGAAAAAGAAGGAAAAGAAGGAAAAAGAAG GCTGCAGGCGGCTGCAGAAAAGAAGGAAAAAGAAGGA AA AGAAGGAAAA AGAAGG 526
Tabela 5. Sequências de polipeptídeos e de polinucleotídeos
Notes Sequência ID. DE SEQ. N°
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 207/245
201/222
TCR de IGRP MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSL SVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLI SISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDS AVYFCAATNSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPA VYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSII PEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIG FRILLLKVAGFNLLMTLRLWSSGSGATNFSLLKQAGD VEENPGPMSNQVLCCWLCFLGANTVDGGITQSPKYL FRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYY SQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNP TAFYLCASGGRVYQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPE VAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWV NGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSA TFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIV SAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATL YAVLVSALVLMAMVKRKDF 527
IGRPTCRa MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSL SVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLI SISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDS AVYFCAATNSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPDPA VYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYIT DKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSII PEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIG FRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 528
TCRb de IGRP MSNQVLCCWLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQN VTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDF QKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCA SGGRVYQPQHFGDGTRLSILEDLNKVFPPEVAVFEPS EAEISHTQKAT LVC LAT GE F P D HVE L S WWVNGKEVH S 529
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 208/245
202/222
GVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPR NHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGR ADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSA LVLMAMVKRKDF
Sem sinal de IGRPTCRa DQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISIS SIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLS LHIVPSQPGDSAVYFCAATNSGGSNYKLTFGKGTLLT VNPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNV SQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDF ACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDT NLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 530
Sem sinal de de TCRb de IGRP DGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQ DPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESF PLTVTSAQKNPTAFYLCASGGRVYQPQHFGDGTRLSI LEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGF FPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSR YCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWT QDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATI LYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 531
Sequência de polinucleotídeos de TCR de IGRP ATGGCCATGCTCCTGGGGGCATCAGTGCTGATTCTGT GGC T T C AGC C AGAC T GGGT AAAC AGT C AAC AGAAGAA TGATGACCAGCAAGTTAAGCAAAATTCACCATCCCTG AGC GT C CAGGAAGGAAGAAT TTCTATTCT GAAC T GT G ACTATACTAACAGCATGTTTGATTATTTCCTATGGTA CAAAAAATAC C C T GC T GAAGGT C CTACATTCCTGATA TCTATAAGTTCCATTAAGGATAAAAATGAAGATGGAA GATTCACTGTCTTCT TAAACAAAAGT GC CAAGCAC C T CTCTCTGCACATTGTGCCCTCCCAGCCTGGAGACTCT GCAGTGTACTTCTGTGCAGCAACAAATAGTGGAGGTA GCAAC TATAAAC T GACAT T T GGAAAAGGAAC T C T C T T 532
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 209/245
203/222
AACCGTGAATCCAAATATCCAGAACCCTGACCCTGCC GTGTACCAGCT GAGAGAC T C TAAAT C CAGT GACAAGT CTGTCTGCCTATTCACCGATTTTGATTCTCAAACAAA TGTGTCACAAAGTAAGGATTCTGATGTGTATATCACA GACAAAAC T GT GC TAGACAT GAGGT C TAT GGAC T T CA AGAGC AAC AGT GC TGTGGCCT GGAGC AAC AAAT C T GA CTTTGCATGTGCAAACGCCTTCAACAACAGCATTATT CCAGAAGACACCTTCTTCCCCAGCCCAGAAAGTTCCT GT GAT GT CAAGC T GGT C GAGAAAAGC T T T GAAACAGA T AC GAAC C TAAAC T T T C AAAAC C T GT C AGT GAT T GGG TTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATC TGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCGGCTCCGG AGC C AC GAAC T T C T C T C T GT T AAAGC AAGC AGGAGAC GTGGAAGAAAACCCCGGTCCCATGAGCAACCAGGTGC TCTGCTGTGTGGTCCTTTGTTTCCTGGGAGCAAACAC CGTGGATGGTGGAATCACTCAGTCCCCAAAGTACCTG T T C AGAAAGGAAGGAC AGAAT GT GAC C C T GAGT T GT G AAC AGAAT T T GAAC C AC GAT GC C AT GT AC T GGT AC C G ACAGGAC C CAGGGCAAGGGC T GAGAT T GAT C TAC TAC TCACAGATAGTAAAT GAC T T T CAGAAAGGAGATATAG C T GAAGGGT AC AGC GT C T C T C GGGAGAAGAAGGAAT C CTTTCCTCTCACTGTGACATCGGCCCAAAAGAACCCG ACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAGTGGGGGACGGGTCT ATCAGCCCCAGCATTTTGGTGAT GGGAC T C GAC T C T C CAT C C TAGAGGAC C T GAACAAGGT GT T C C CAC C C GAG GTCGCTGTGTTT GAGC CAT CAGAAGCAGAGAT C T C C C ACACCCAAAAGGCCACACTGGTGTGCCTGGCCACAGG CTTCTTCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTG AATGGGAAGGAGGTGCACAGTGGGGTCAGCACGGACC CGC AGC C C C T C AAGGAGC AGC C C GC C C T C AAT GAC T C
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 210/245
204/222
C AGAT AC T GC C T GAGC AGC C GC C T GAGGGT C T C GGC C ACCTTCTGGCAGAACCCCCGCAACCACTTCCGCTGTC AAGT C CAGTTCTACGGGCTCTC GGAGAAT GA
polipeptídeo de TCR de IGRP murinizado MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSL SVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLI SISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDS AVYFCAATNSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPEPA VYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFIT DKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNA TYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRIL LLKVAGFNLLMTLRLWSSGSGATNFSLLKQAGDVEEN PGPMSNQVLCCWLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKE GQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIV NDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFY LCASGGRVYQPQHFGDGTRLSILEDLRNVTPPKVSLF EPS ΚΑΕIANKQKATLVCLARGFFP DHVEL SWWVNGKE VHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRN HFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRA DCGITSASYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSTL WMAMVKRKNS 533
TCRa de IGRP murinizado MAMLLGASVLILWLQPDWVNSQQKNDDQQVKQNSPSL SVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYKKYPAEGPTFLI SISSIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLSLHIVPSQPGDS AVYFCAATNSGGSNYKLTFGKGTLLTVNPNIQNPEPA VYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFIT DKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNA TYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRIL LLKVAGFNLLMTLRLWS S 534
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 211/245
205/222
TCRb de IGRP murinizado MSNQVLCCWLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQN VTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDF QKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCA SGGRVYQPQHFGDGTRLSILEDLRNVTPPKVSLFEPS ΚΑΕIANKQKATLVCLARGFFP DHVEL SWWVNGKEVH S GVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFR CQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCG IT S AS YQQGVL S AT IL YEILLGKATL YAVLVS TLWM AMVKRKNS 535
Sem sinal de TCRa de IGRP murinizado DQQVKQNSPSLSVQEGRISILNCDYTNSMFDYFLWYK KYPAEGPTFLISIS SIKDKNEDGRFTVFLNKSAKHLS LHIVPSQPGDSAVYFCAATNSGGSNYKLTFGKGTLLT VNPNIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINV PKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSF TCQDIFKETNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNF QNLSVMGLRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 536
Sem sinal de TCRb de IGRP murinizado DGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQ DPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESF PLTVTSAQKNPTAFYLCASGGRVYQPQHFGDGTRLSI LE D LRNVT PPKVSLFEPS ΚΑΕIANKQKATLVCLARGF FPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLS SRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSP KPVTQNISAEAWGRADCGITSASYQQGVLSATILYEI LLGKATLYAVLVSTLWMAMVKRKNS 537
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 212/245
206/222
polipeptídeo de TCR de PPI METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGE NATMNC S YKT SINNLQWYRQNS GRGLVHLILIRSNER EKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCAT GRMDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMR SMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPS PESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKV AGFNLLMTLRLWSSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPM DSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQEV TLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPID DSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFCA SSEQLSGNTIYFGEGSWLTWEDLNKVFPPEVAVFEP S EAEIS ΗTQKATLVCLATGEFP DHVEL SWWVNGKEVH SGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNP RNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWG RADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVS ALVLMAMVKRKD F 538
TCRa de PPI METLLGVSLVILWLQLARVNSQQGEEDPQALSIQEGE NATMNC S YKT SINNLQWYRQNS GRGLVHLILIRSNER EKHSGRLRVTLDTSKKSSSLLITASRAADTASYFCAT GRMDSSYKLIFGSGTRLLVRPDIQNPDPAVYQLRDSK SSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMR SMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPS PESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKV AGFNLLMTLRLWSS 539
TCRb de PPI MDSWTFCCVSLCILVAKHTDAGVIQSPRHEVTEMGQE VTLRCKPISGHNSLFWYRQTMMRGLELLIYFNNNVPI DDSGMPEDRFSAKMPNASFSTLKIQPSEPRDSAVYFC ASSEQLSGNTIYFGEGSWLTWEDLNKVFPPEVAVFE PSEAEISHTQKAT LVC LAT GE F P D HVE L S WWVNGKEV 540
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 213/245
207/222
HSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQN PRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAW GRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLV SALVLMAMVKRKDF
Sem sinal de TCRa de PPI QQGEEDPQALSIQEGENATMNCSYKTSINNLQWYRQN SGRGLVHLILIRSNEREKHSGRLRVTLDTSKKSSSLL ITASRAADTASYFCATGRMDSSYKLIFGSGTRLLVRP DIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQS KDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACA NAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLN FQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS 541
Sem sinal de TCRb de PPI GVIQSPRHEVTEMGQEVTLRCKPISGHNSLFWYRQTM MRGLELLIYFNNNVPIDDSGMPEDRFSAKMPNASFST LKIQPSEPRDSAVYFCASSEQLSGNTIYFGEGSWLTV VED LNKVF P P EVAVF EPSEAEISHTQKAT LVC LAT GE FPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSR YCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWT QDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATI LYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF 542
TCR de BDc2.5 MHSLHVSLVFLWLQLGGVSSQEKVQQSPESLTVPEGA MAS LNC ΤIS D SAS QSIWWYQQNP GKGPKALISIF SNG NKKEGRLTVYLNRASLHVSLHIRDSHPSDSAVYLCAA SLAGSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNPEPAVYQLKDPRS QDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKA MDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPC DATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNL LMTLRLWSSATNFSLLKQAGDVEENPGPMGSIFLSCL AVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYL GHNAMYWYRQ SAKKP LEFMF S Y S YQKLMDNQTAS S RE QPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCASSQGGTTNS 543
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 214/245
208/222
DYTFGSGTRLLVIEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANK QKAT LVC LARGF F P D HVE L S WWVNGKEVH S GVS T D P Q AYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHG LSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRADCGITSASYH QGVL SATILYEILLGKATLYAVLVS GLVLMAMVKRKN S
TCRa de BDc2.5 MHSLHVSLVFLWLQLGGVSSQEKVQQSPESLTVPEGA MAS LNC TIS D SAS QSIWWYQQNP GKGPKALISIF SNG NKKEGRLTVYLNRASLHVSLHIRDSHPSDSAVYLCAA SLAGSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNPEPAVYQLKDPRS QDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKA MDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVPC DATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGLRILLLKVAGFNL LMTLRLWSS 544
TCRb de BDC2.5 MGSIFLSCLAVCLLVAGPVDPKIIQKPKYLVAVTGSE KILICEQYLGHNAMYWYRQSAKKPLEFMFSYSYQKLM DNQTASSRFQPQSSKKNHLDLQITALKPDDSATYFCA SSQGGTTNSDYTFGSGTRLLVIEDLRNVTPPKVSLFE P S ΚΑΕIANKQKATLVCLARGFFP DHVEL SWWVNGKEV HSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNH FRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRAD CGITSASYHQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSGLV LMAMVKRKNS 545
Sem sinal de TCRa de BDc2.5 QSPESLTVPEGAMASLNCTISDSASQSIWWYQQNPGK GPKALISIF SNGNKKEGRLTVYLNRASLHVSLHIRD S HPSDSAVYLCAASLAGSWQLIFGSGTQLTVMPDIQNP EPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGT 546
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 215/245
209/222
FITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKE TNATYPSSDVPCDATLTEKSFETDMNLNFQNLSVMGL RILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
Sem sinal de TCRb de BDC2.5 KIIQKPKYLVAVTGSEKILICEQYLGHNAMYWYRQSA KKPLEFMFSYSYQKLMDNQTASSRFQPQSSKKNHLDL QITALKPDDSATYFCASSQGGTTNSDYTFGSGTRLLV IEDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGF FPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLS SRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSP KPVTQNISAEAWGRADCGITSASYHQGVLSATILYEI LLGKATLYAVLVSGLVLMAMVKRKNS 547
Sequência de polinucleotídeos de BDC2.5mi-TCRalfa_P2A-TCR-beta ATGCATTCCTTACATGTTTCACTAGTGTTCCTCTGGC TTCAACTAGGTGGGGTGAGCAGCCAGGAGAAGGTACA GCAGAGC C CAGAAT CTCTCACAGTCC CAGAGGGAGC C ATGGCCTCCCTCAACTGCACTATCAGCGACAGTGCTT CTCAGTCCATCTGGTGGTACCAACAGAATCCTGGGAA AGGCCCCAAAGCACTAATATCCATATTCTCTAATGGC AAC AAGAAAGAAGGC AGAT T GAC AGT T TACCTCAATA GAGCCAGCCTGCATGTTTCCCTGCACATCAGAGACTC CCATCCCAGTGACTCCGCCGTCTACCTCTGTGCAGCG AGCCTTGCGGGCAGCTGGCAACTCATCTTTGGATCTG GAAC C CAAC T GACAGT TAT GC C T GACAT C CAGAAC C C AGAACCTGCTGTGTACCAGTTAAAAGATCCTCGGTCT CAGGACAGCACCCTCTGCCTGTTCACCGACTTTGACT CC C AAAT C AAT GT GC C GAAAAC C AT GGAAT C T GGAAC GTTCATCACT GACAAAAC T GT GC T GGACAT GAAAGC T AT GGAT T C C AAGAGC AAT GGGGC C AT T GC C T GGAGC A AC CAGACAAGC TTCACCTGC CAAGATAT C T T CAAAGA GACCAACGCCACCTACCCCAGTTCAGACGTTCCCTGT GATGCCACGTT GAC C GAGAAAAGC T T T GAAACAGATA 548
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 216/245
210/222
TGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTTATGGGACT CCGAATCCTCCTGCTGAAAGTAGCCGGATTTAACCTG CTCATGACGCTGAGGCTGTGGTCCAGTGCCACGAACT TC T C T C T GT TAAAGCAAGCAGGAGAC GT GGAAGAAAA CCCCGGTCCCATGGGCTCCATTTTCCTCAGTTGCCTG GCCGTTTGTCTCCTGGTGGCAGGTCCAGTCGACCCGA AAATTATCCAGAAACCAAAATATCTGGTGGCAGTCAC AGGGAGCGAAAAAATCCTGATATGCGAACAGTATCTA GGCCACAATGCTATGTATTGGTATAGACAAAGTGCTA AGAAGCCTCTAGAGTTCATGTTTTCCTACAGCTATCA AAAAC T TAT GGACAAT CAGAC T GC C T CAAGT C GC T T C CAAC C T CAAAGT T CAAAGAAAAAC CAT T TAGAC C T T C AGAT CACAGC T C TAAAGC C T GAT GAC TCGGCCACATA C T T C T GT GC C AGC AGC C AAGGGGGGAC AAC AAAC T C C GACTACACCTTCGGCTCAGGGACCAGGCTTTTGGTAA T AGAGGAT C T GAGAAAT GT GAC T C C AC C C AAGGT C T C C T T GT T T GAGC CAT CAAAAGCAGAGAT T GCAAACAAA CAAAAGGCTACCCTCGTGTGCTTGGCCAGGGGCTTCT TCCCTGACCACGTGGAGCTGAGCTGGTGGGTGAATGG CAAGGAGGTCCACAGTGGGGTCAGCACGGACCCTCAG GC C TACAAGGAGAGCAAT TATAGCTACTGCCT GAGCA GCCGCCTGAGGGTCTCTGCTACCTTCTGGCACAATCC TCGCAACCACTTCCGCTGCCAAGTGCAGTTCCATGGG C T T T C AGAGGAGGAC AAGT GGC C AGAGGGC T C AC C C A AACCTGTCACACAGAACATCAGTGCAGAGGCCTGGGG CCGAGCAGACTGTGGAATCACTTCAGCATCCTATCAT CAGGGGGTTCTGTCTGCAACCATCCTCTATGAGATCC TACTGGGGAAGGCCACCCTATATGCTGTGCTGGTCAG TGGCCTGGTGCTGATGGCCATGGTCAAGAGAAAAAAT TCCTGA
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 217/245
211/222
Sequência de polipeptídeos de CD4 humana MNRGVPFRHLLLVLQLALLPAATQGKKWLGKKGDTV ELTCTASQKKSIQFHWKNSNQIKILGNQGSFLTKGPS KLNDRADSRRSLWDQGNFPLIIKNLKIEDSDTYICEV EDQKEEVQLLVFGLTANSGTHLLQGQSLTLTLESPPG SSPSVQCRSPRGKNIQGGKTLSVSQLELQDSGTWTCT VLQNQKKVEFKIDIWLAFQKASSIVYKKEGEQVEFS FPLAFTVEKLTGSGELWWQAERASSSKSWITFDLKNK EVSVKRVTQDPKLQMGKKLPLHLTLPQALPQYAGSGN LTLALEAKTGKLHQEVNLWMRATQLQKNLTCEVWGP T S P KLML S LKLENKEAKVS KREKAVWVLNP EAGMWQC LLSDSGQVLLESNIKVLPTWSTPVQPMALIVLGGVAG LLLFIGLGIFFCVRCRHRRRQAERMSQIKRLLSEKKT CQCPHRFQKTCSPI 549
Sequência de ATGAACCGGGGAGTCCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGG TGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGCAGCCACTCAGGG AAAGAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTG GAAC T GAC CTGTACAGCTTCC CAGAAGAAGAGCATAC AAT T C CAC T GGAAAAAC T C CAAC CAGATAAAGAT T C T GGGAAATCAGGGCTCCTTCTTAACTAAAGGTCCATCC AAGC T GAAT GATCGCGCT GAC T CAAGAAGAAGC C T T T GGGAC CAAGGAAAC TTTCCCCTGATCAT CAAGAAT C T
polinucleotídeos de CD4 humana T AAGAT AGAAGAC T C AGAT AC T T AC AT C T GT GAAGT G GAGGAC CAGAAGGAGGAGGT GCAAT TGCTAGTGTTCG GATTGACTGCCAACTCTGGTACCCACCTGCTTCAGGG GCAGAGCCTGACCCTGACCTTGGAGAGCCCCCCTGGT AGTAGCCCCTCAGTGCAATGTAGGAGTCCAAGGGGTA AAAACATACAGGGGGGGAAGACCCTCTCCGTGTCTCA GCTGGAGCTCCAGGATAGTGGCACCTGGACGTGCACT GT C T T GCAGAAC CAGAAGAAGGT GGAGT T CAAAATAG ACATCGTGGTGCTAGCTTTCCAGAAGGCCTCCAGCAT 550
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 218/245
212/222
AGT C TATAAGAAAGAGGGGGAACAGGT GGAGT T C T C C TTCCCACTCGCCTTTACAGTT GAAAAGC T GAC GGGCA GTGGCGAGCTGTGGTGGCAGGCGGAGAGGGCTTCCTC C T C C AAGT C T T GGAT C AC C T T T GAC C T GAAGAAC AAG GAAGTGTCTGTAAAACGGGTTACCCAGGACCCTAAGC TCCAGATGGGCAAGAAGCTCCCGCTCCACCTCACCCT GCCCCAGGCCTTGCCTCAGTATGCTGGCTCTGGAAAC CTCACCCTGGCCCTT GAAGC GAAAACAGGAAAGT T GC AT C AGGAAGT GAAC CTGGTGGTGAT GAGAGC C AC T C A GCTCCAGAAAAATTTGACCTGTGAGGTGTGGGGACCC ACCTCCCCTAAGCTGATGCTGAGCTTGAAACTGGAGA ACAAGGAGGCAAAGGT C T C GAAGC GGGAGAAGGC GGT GTGGGTGCTGAACCCTGAGGCGGGGATGTGGCAGTGT CTGCTGAGTGACTCGGGACAGGTCCTGCTGGAATCCA ACATCAAGGTTCTGCCCACATGGTCCACCCCGGTGCA GCCAATGGCCCTGATTGTGCTGGGGGGCGTCGCCGGC CTCCTGCTTTTCATTGGGCTAGGCATCTTCTTCTGTG TCAGGTGCCGGCACCGAAGGCGCCAAGCAGAGCGGAT GT C T CAGAT CAAGAGAC T C C T CAGT GAGAAGAAGAC C TGCCAGTGCCCTCACCGGTTTCAGAAGACATGTAGCC CCATTTGAGTCGACAAGGGCGAATTAATTCAGATCTT ACGTAGCTAGCGGATCCCAATTGCTCGAGCGGGATCA ATTCCGCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGC TTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTAT TTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGC CCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCT AGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTC TGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGG
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 219/245
213/222
Sequência de polipeptídeos de CD4 de camundongo MCRAISLRRLLLLLLQLSQLLAVTQGKTLVLGKEGES AELPCESSQKKITVFTWKFSDQRKILGQHGKGVLIRG GSPSQFDRFDSKKGAWEKGSFPLIINKLKMEDSQTYI CELENRKEEVELWVFKVTFSPGTSLLQGQSLTLTLDS NSKVSNPLTECKHKKGKWSGSKVLSMSNLRVQDSDF WNCTVTLDQKKNWFGMTLSVLGFQSTAITAYKSEGES AEFSFPLNFAEENGWGELMWKAEKDSFFQPWISFSIK NKEVSVQKSTKDLKLQLKETLPLTLKIPQVSLQFAGS GNLTLTLDKGTLHQEVNLWMKVAQLNNTLTCEVMGP TSPKMRLTLKQENQEARVSEEQKWQWAPETGLWQC LL S E GD KVKMD S RIQ VL S RGVNQ T VE L AC VLGG S F GE LGFLGLCILCCVRCRHQQRQAARMSQIKRLLSEKKTC QCPHRMQKSHNLI 551
Petição 870200060096, de 15/05/2020, pág. 220/245
214/222
Sequência de polinucleotídeos de CD4 de camundongo ATGTGCCGAGCCATCTCTCTTAGGCGCTTGCTGCTGC TGCTGCTGCAGCTGTCACAACTCCTAGCTGTCACTCA AGGGAAGAC GCTGGTGCT GGGGAAGGAAGGGGAAT CA GCAGAAC TGCCCTGC GAGAGT T C C CAGAAGAAGAT CA C AGT C T T C AC C T GGAAGT T C T C T GAC C AGAGGAAGAT TCTGGGGCAGCATGGCAAAGGTGTATTAATTAGAGGA GGTTCGCCTTCGCAGTTTGATCGTTTTGATTCCAAAA AAGGGGCATGGGAGAAAGGATCGTTTCCTCTCATCAT CAATAAAC T TAAGAT GGAAGAC T C T CAGAC T TATAT C TGTGAGCTGGAGAACAGGAAAGAGGAGGTGGAGTTGT GGGTGTTCAAAGTGACCTTCAGTCCGGGTACCAGCCT GT T GCAAGGGCAGAGC C T GAC C C T GAC C T T GGATAGC AACTCTAAGGTCTCTAACCCCTTGACAGAGTGCAAAC ACAAAAAGGGTAAAGTTGTCAGTGGTTCCAAAGTTCT CTCCATGTCCAACCTAAGGGTTCAGGACAGCGACTTC TGGAAC T GC AC C GT GAC C C T GGAC C AGAAAAAGAAC T GGTTCGGCATGACACTCTCAGTGCTGGGTTTTCAGAG CACAGC TATCACGGCC TATAAGAGT GAGGGAGAGT CA GCGGAGTTCTCCTTCCCACTCAACTTTGCAGAGGAAA AC GGGT GGGGAGAGC T GAT GT GGAAGGCAGAGAAGGA TTCTTTCTTCCAGCCCTGGATCTCCTTCTCCATAAAG AAC AAAGAGGT GT C C GT AC AAAAGT C C AC C AAAGAC C TCAAGC T C CAGC T GAAGGAAAC GCTCCCACTCACCCT CAAGATACCCCAGGTCTCGCTTCAGTTTGCTGGTTCT GGC AAC C T GAC T C T GAC T C T GGAC AAAGGGAC AC T GC ATCAGGAAGTGAACCTGGTGGTGATGAAAGTGGCTCA GC T CAACAATAC T T T GAC C T GT GAGGT GAT GGGAC C T AC C T C T C C CAAGAT GAGAC T GAC C C T GAAGCAGGAGA AC CAGGAGGC CAGGGTCTCT GAGGAGCAGAAAGTAGT TCAAGTGGTGGCCCCTGAGACAGGGCTGTGGCAGTGT 552
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C T AC T GAGT GAAGGT GAT AAGGT C AAGAT GGAC T C C A GGAT CCAGGTTTTATC C AGAGGGGT GAAC C AGAC AGT GTTCCTGGCTTGCGTGCTGGGTGGCTCCTTCGGCTTT CTGGGTTTCCTTGGGCTCTGCATCCTCTGCTGTGTCA GGTGCCGGCACCAACAGCGCCAGGCAGCACGAATGTC TCAGAT CAAGAGGC T C C T CAGT GAGAAGAAGAC C T GC CAGT GC CCCCACCGGAT GCAGAAGAGC CATAATCTCA TCTGAAGCGGCCGCGTCGACTCGAGCGGGATCAATTC CGCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGG AATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTC CACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGG AAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGG GTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTT GAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGG
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Sequência de polipeptídeos de CD3-delta-F2A-gamaT2A-épsilon-P2Azeta murídea: MEHSGILASLILIAVLPQGSPFKIQVTEYEDKVFVTC NTSVMHLDGTVEGWFAKNKTLNLGKGVLDPRGIYLCN GTEQLAKWSSVQVHYRMCQNCVELDSGTMAGVIFID LIATLLLALGIYCFAGHETGRPSGAAEVQALLKNEQL YQPLRDREDTQYSRLGGNWPRNKKSGPVKQTLNFDLL KLAGDVESNPGPMEQRKGLAGLFLVISLLQGTVAQTN KAKNLVQVDGSRGDGSVLLTCGLTDKTIKWLKDGSII SPLNATKNTWNLGNNAKDPRGTYQCQGAKETSNPLQV YYRMCENCIELNIGTISGFIFAEVISIFFLALGVYLI AGQDGVRQSRASDKQTLLQNEQLYQPLKDREYDQYSH LQGNQLRKKRSEGRGSLLTCGDVEENPGPMRWNTFWG ILCLSLLAVGTCQDDAENIEYKVSISGTSVELTCPLD SDENLKWEKNGQELPQKHDKHLVLQDFSEVEDSGYYV CYTPASNKNTYLYLKARVCEYCVEVDLTAVAIIIIVD ICITLGLLMVIYYWSKNRKAKAKPVTRGTGAGSRPRG QNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRAVGSAT NE S LLKQAGDVEENP GPMKWKVSVLACILHVRFP GAE AQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVIITALYLRAKFSR SAETAANLQDPNQLYNELNLGRREEYDVLEKKRARDP EMGGKQQRRRNPQEGVYNALQKDKMAEAYSEIGTKGE RRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQTLAPR 553
Sequência de polinucleotídeos de CD3-delta-F2A-gama- T2A-épsilon-P2Azeta murídea: ATGGAACACAGCGGGATTCTGGCTAGTCTGATACTGA TTGCTGTTCTCCCCCAAGGGAGCCCCTTCAAGATACA AGT GAC C GAATAT GAGGACAAAGTAT T T GT GAC C T GC AAT AC C AGC GT C AT GC AT C T AGAT GGAAC GGT GGAAG GAT GGT T T GC AAAGAAT AAAAC AC T C AAC T T GGGC AA AGGCGTTCTGGACCCACGAGGGATATATCTGTGTAAT GGGACAGAGCAGCTGGCAAAGGTGGTGTCTTCTGTGC AAGTCCATTACCGAATGTGCCAGAACTGTGTGGAGCT AGACTCGGGCACCATGGCTGGTGTCATCTTCATTGAC 554
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CTCATCGCAACTCTGCTCCTGGCTTTGGGCATCTACT GC T T T GCAGGACAT GAGAC C GGAAGGC CTTCTGGGGC TGC T GAGGT T C AAGC AC T GC T GAAGAAT GAGC AGC T G TATCAGCCTCTTC GAGAT C GT GAAGATAC C CAGTACA GC C GT C T T GGAGGGAAC T GGC C C C GGAACAAGAAAT C CGGACCGGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTC AAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCAGGGCCCA TGGAGCAGAGGAAGGGTCTGGCTGGCCTCTTCCTGGT GATCTCTCTTCTTCAAGGCACTGTAGCCCAGACAAAT AAAGCAAAGAATTTGGTACAAGTGGATGGCAGCCGAG GAGACGGTTCTGTACTTCTGACTTGTGGCTTGACTGA CAAGACTATCAAGTGGCTTAAAGACGGGAGCATAATA AGT C C T C TAAAT GCAAC TAAAAACACAT GGAAT C T GG GCAACAATGCCAAAGACCCTCGAGGCACGTATCAGTG TCAAGGAGCAAAGGAGACGTCAAACCCCCTGCAAGTG TATTACAGAATGTGTGAAAACTGCATTGAGCTAAACA TAGGCACCATATCCGGCTTTATCTTCGCTGAGGTCAT CAGCATCTTCTTCCTTGCTCTTGGTGTATATCTCATT GC GGGACAGGAT GGAGT T C GC CAGT CAAGAGC T T CAG ACAAGCAGACTCTGTTGCAAAATGAACAGCTGTACCA GC C C C T CAAGGAC C GGGAATAT GAC CAGTACAGC CAT C T C CAAGGAAAC CAAC T GAGGAAGAAGAGAT C T GAGG GCAGAGGAAGT C TGC TAACAT GC GGT GAC GT C GAGGA GAATCCTGGCCCAATGCGGTGGAACACTTTCTGGGGC ATCCTGTGCCTCAGCCTCCTAGCTGTTGGCACTTGCC AGGAC GAT GC C GAGAACAT T GAATACAAAGT C T C CAT C T C AGGAAC C AGT GT AGAGT T GAC GT GC C C T C T AGAC AGTGACGAGAACTTAAAATGGGAAAAAAATGGCCAAG AGC T GC C T C AGAAGC AT GAT AAGC AC C T GGT GC T C C A GGAT T T C T C GGAAGT C GAGGAC AGT GGC T AC T AC GT C
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TGCTACACACCAGCCTCAAATAAAAACACGTACTTGT ACCTGAAAGCTCGAGTGTGTGAGTACTGTGTGGAGGT GGACCTGACAGCAGTAGCCATAATCATCATTGTTGAC ATCTGTATCACTCTGGGCTTGCTGATGGTCATTTATT AC T GGAGCAAGAATAGGAAGGC CAAGGC CAAGC C T GT GACCCGAGGAACCGGTGCTGGTAGCAGGCCCAGAGGG C AAAAC AAGGAGC GGCCACCACCTGTTCC C AAC C C AG ACTATGAGCCCATCCGCAAAGGCCAGCGGGACCTGTA TTCTGGCCT GAAT CAGAGAGCAGT C GGATCCGCCACG AAC T T C T C T C T GT T AAAGC AAGC AGGAGAC GT GGAAG AAAACCCCGGTCCCATGAAGTGGAAAGTGTCTGTTCT CGCCTGCATCCTCCACGTGCGGTTCCCAGGAGCAGAG GCACAGAGCTTTGGTCTGCTGGACCCCAAACTCTGCT AC T T GC TAGAT GGAAT CCTCTTCATCTAC GGAGT CAT C AT C AC AGC C C T GT AC C T GAGAGC AAAAT T C AGC AGG AGT GC AGAGAC T GC T GC C AAC C T GC AGGAC C C C AAC C AGC T C T AC AAT GAGC TCAATCTAGGGC GAAGAGAGGA ATAT GAC GT C T T GGAGAAGAAGC GGGC T C GGGAC C CA GAGAT GGGAGGCAAACAGCAGAGGAGGAGGAAC C C C C AGGAAGGC GT AT AC AAT GC AC T GCAGAAAGAC AAGAT GGC AGAAGC C T AC AGT GAGAT C GGC AC AAAAGGC GAG AGGC GGAGAGGCAAGGGGCAC GATGGCCTTTACCAGG GTCTCAGCACTGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCT GCATATGCAGACCCTGGCCCCTCGCTAA
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Sequência de polipeptídeos de uma proteína luciferase MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVP GTIAFTDAHIEVNITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNT NHRIWCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNE RELLNSMNISQPTWFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQK IIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPES FDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHA RDPIFGNQIIPDTAILSWPFHHGFGMFTTLGYLICG FRWLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFA KSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHL PGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKWPFFE AKWDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEA TNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKY KGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELP AAVWLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGWF VDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKSKL 555
Sequência de polinucleotídeos que codifica uma proteína luciferase AAAGGAGGAAAAAC T GT T T C AT AC AGAAGGC GT GGAG GAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTGGAGGAAAAAC TGTTTCATACAGAAGGCGTATTTTGACACCCCCATAA TATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTT GTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACT C AC AGT AAC C T C AAC TCCTGCCACAGGTACC GAGC T C AAGT T T GTACAAAAAAGCAGGC TGCCACCAT GGAAGA CGCCAAAAACATAAAGAAAGGCCCGGCGCCATTCTAT CC GC T AGAGGAT GGAAC C GC T GGAGAGC AAC T GC AT A AGGC T AT GAAGAGAT AC GCCCTGGTTCCT GGAAC AAT TGCTTTTACAGATGCACATATCGAGGTGAACATCACG TACGCGGAATACTTCGAAATGTCCGTTCGGTTGGCAG AAGCTATGAAACGATATGGGCTGAATACAAATCACAG AATCGTCGTATGCAGTGAAAACTCTCTTCAATTCTTT ATGCCGGTGTTGGGCGCGTTATTTATCGGAGTTGCAG 556
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TTGCGCCCGC GAAC GACAT Τ TATAAT GAAC GT GAAT T GCTCAACAGTATGAACATTTCGCAGCCTACCGTAGTG ΤΤTGTΤTCCAAAAAGGGGTTGCAAAAAATΤΤTGAACG TGCAAAAAAAATTACCAATAATCCAGAAAATTATTAT CAT GGAT T C TAAAAC GGAT TAC CAGGGAT Τ T CAGT C G ATGTACACGTTCGTCACATCTCATCTACCTCCCGGTT TTAATGAATACGATTTTGTACCAGAGTCCTTTGATCG TGAC AAAAC AAT TGCACTGATAAT GAAC TCCTCTGGA TCTACTGGGTTACCTAAGGGTGTGGCCCTTCCGCATA GAAC T GC C T GC GT CAGAT TCTCGCATGC CAGAGAT C C TATTTTTGGCAATCAAATCATTCCGGATACTGCGATT TTAAGTGTTGTTCCATTCCATCACGGTTTTGGAATGT TTACTACACTCGGATATTTGATATGTGGATTTCGAGT CGTCTTAATGTATAGATTTGAAGAAGAGCTGTTTTTA CGATCCCTTCAGGATTACAAAATTCAAAGTGCGTTGC TAGTAC CAAC CCTATTTTCATTCTTCGC CAAAAGCAC TC T GAT T GACAAATAC GATTTATCTAATTTACAC GAA ATTGCTTCTGGGGGCGCACCTCTTTCGAAAGAAGTCG GGGAAGC GGT T GC AAAAC GCTTCCATCTTCC AGGGAT AC GACAAGGATAT GGGCTCACT GAGAC TACAT CAGC T AT T C T GAT T AC AC C C GAGGGGGAT GAT AAAC C GGGC G CGGTCGGTAAAGTTGTTCCATTTTTTGAAGCGAAGGT TGTGGATCTGGATACCGGGAAAACGCTGGGCGTTAAT C AGAGAGGC GAAT T AT GT GT C AGAGGAC CTATGATTA TGTCCGGTTATGTAAACAATCCGGAAGCGACCAACGC C Τ T GAT T GAC AAGGAT GGATGGCTACATTCT GGAGAC ATAGC Τ TAC T GGGAC GAAGAC GAACAC TTCTTCATAG Τ T GAC C GC Τ T GAAGT C Τ Τ TAAT TAAATACAAAGGATA CCAGGTGGCCCCCGCTGAATTGGAGTCGATATTGTTA CAACACCCCAACATCTTCGACGCGGGCGTGGCAGGTC
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TTCCCGACGATGACGCCGGTGAACTTCCCGCCGCCGT TGTTGTTTT GGAGC AC GGAAAGAC GAT GAC GGAAAAA GAGATCGTGGATTACGTCGCCAGTCAAGTAACAACCG CGAAAAAGTTGCGCGGAGGAGTTGTGTTTGTGGACGA AGT AC C GAAAGGT C T T AC C GGAAAAC T C GAC GC AAGA AAAAT CAGAGAGAT C C T CATAAAGGC CAAGAAGGGC G GAAAGTCCAAATTGTAA
Sequência de polinucleotídeos que codifica TCR murinizado de IGRP CTGGGAGCAAACACCGTGGATGGTGGAATCACTCAGT CCCCAAAGTACCTGTTCAGAAAGGAAGGACAGAATGT GAC C C T GAGT T GT GAACAGAAT T T GAAC CAC GAT GC C ATGTACTGGTACCGACAGGACCCAGGGCAAGGGCTGA GAT T GAT C TAC TAC T CACAGATAGTAAAT GAC T T T CA GAAAGGAGATATAGCTGAAGGGTACAGCGTCTCTCGG GAGAAGAAGGAATCCTTTCCTCTCACTGTGACATCGG CCCAAAAGAACCCGACAGCTTTCTATCTCTGTGCCAG TGGGGGACGGGTCTATCAGCCCCAGCATTTTGGTGAT GGGAC T C GAC TCTCCATCC T AGAGGAT C T GAGAAAT G TGACTCCACCCAAGGTCTCCTTGTTTGAGCCATCAAA AGCAGAGAT T GCAAACAAACAAAAGGC TACCCTCGTG TGCTTGGCCAGGGGCTTCTTCCCTGACCACGTGGAGC TGAGCTGGTGGGTGAATGGCAAGGAGGTCCACAGTGG GGT C AGC AC GGAC CCTCAGGCC T AC AAGGAGAGC AAT TATAGCTACTGCCTGAGCAGCCGCCTGAGGGTCTCTG CTACCTTCTGGCACAATCCTCGCAACCACTTCCGCTG CCAAGTGCAGTTCCATGGGCTTTCAGAGGAGGACAAG TGGC C AGAGGGC T C AC C C AAAC C T GT C AC AC AGAAC A TCAGTGCAGAGGCCTGGGGCCGAGCAGACTGTGGGAT TACCTCAGCATCCTATCAACAAGGGGTCTTGTCTGCC ACCATCCTCTAT GAGAT C C T GC TAGGGAAAGC CAC C C TGTATGCTGTGCTTGTCAGTACACTGGTGGTGATGGC 557
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TATGGTCAAAAGAAAGAATTCATGA
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Claims (62)

1. Composição caracterizada por compreender:
a) pelo menos uma célula que compreende:
i. um receptor de célula T recombinante (TCR) que compreende uma cadeia alfa de TCR e uma cadeia beta de TCR; e ii. um repórter dependente da via do receptor de célula T, em que o TCR recombinante é especifico para um antigeno relevante para doenças ligado a uma molécula de histocompatibilidade principal (MHC); e
b) um nanomedicamento, que compreende um antigeno relevante para doenças ligado a uma molécula de MHC acoplada a uma nanoparticula.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o repórter dependente da via do receptor de célula T é transcrito ativamente.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o antigeno relevante para doenças ligado à molécula de MHC está acoplado à nanoparticula em uma proporção de 10:1 ou maior.
4. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizada pelo fato de que a nanoparticula possui um diâmetro entre cerca de 1 nanômetro e cerca de 100 nanômetros.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizada pelo fato de que a nanoparticula compreende um núcleo de metal.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o antigeno relevante para doenças é um antigeno relevante para
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2/13 doenças autoimunes ou inflamatórias.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é selecionado da lista que consiste em um antígeno de diabetes mellitus Tipo I, um antígeno de asma ou asma alérgica, um antígeno de esclerose múltipla, um antígeno de neuropatia periférica, um antígeno de cirrose biliar primária, um antígeno de distúrbio do espectro da neuromielite óptica, um antígeno da síndrome da pessoa rígida, um antígeno de encefalite autoimune, um antígeno de pênfigo vulgar, um antígeno de pênfigo foliáceo, um antígeno de psoríase, um antígeno de doença/síndrome de Sjõgren, um antígeno de doença inflamatória intestinal, um antígeno de artrite ou artrite reumatoide, um antígeno de lúpus eritematoso sistêmico, um antígeno de esclerodermia, um antígeno de vasculite associada a ANCA, um antígeno da síndrome de Goodpasture, um antígeno de doença de Kawasaki, um antígeno de doença celíaca, um antígeno de cardiomiopatia autoimune, um antígeno de miastenia grave, um antígeno de uveíte autoimune, um antígeno de doença de Grave, um antígeno de síndrome antifosfolipídeo, um antígeno de hepatite autoimune, um antígeno de colangite esclerosante, um antígeno de colangite esclerosante primária, antígeno de doença pulmonar obstrutiva crônica, ou um antígeno relevante para uveíte, e combinações destes.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o repórter dependente da via do receptor de célula T ativa a transcrição de um gene selecionado do grupo que consiste em um gene de luciferase, um gene de beta-lactamase, um gene de
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3/13 cloranfenicol acetiltransferase (CAT), um gene de fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), um gene de proteína fluorescente, e combinações destes.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o repórter dependente da via do receptor de célula T compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada da lista que consiste em uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de NF-κΒ, uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de AP1, uma sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição de IL-2, e combinações destes.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a (pelo menos uma) célula é selecionada de JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM ou Molt-4.
11. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o antígeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 1 a 352 e combinações destes.
12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o antígeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 353 a 455 e combinações destes.
13. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a
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4/13 cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como um polipeptídeo único.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR do polipeptídeo único são separadas por uma sequência de salto de ribossomo.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a sequência de salto de ribossomo é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 456 a 523.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 527, 533 ou 538 .
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como polipeptídeos separados.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 528, 530, 534, 536 539, 541, e a cadeia beta de TCR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 529, 531, 535, 537, 540 ou 542.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são expressas na
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5/13 superfície da célula.
20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a célula compreende pelo menos um polinucleotídeo exógeno que codifica a cadeia alfa de TCR e a cadeia beta de TCR.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucleicos de IRES.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos de IRES é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524 a 526.
23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% homóloga àquela apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 532 ou 557.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada por ser usada in vitro na determinação de uma potência ou atividade de um nanomedicamento.
25. Uso, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o nanomedicamento é para uso em um indivíduo humano.
26. Célula caracterizada por compreender um receptor de célula T recombinante (TCR) e um repórter dependente da via do receptor de célula T, em que o receptor de célula T recombinante é especifico para um antigeno relevante para
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6/13 doenças ligado a uma molécula de histocompatibilidade principal.
27. Célula, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o repórter dependente da via do receptor de célula T é transcrito ativamente.
28. Célula das reivindicações 26 ou 27, caracterizada pelo fato de que o antígeno relevante para doenças é um antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias.
29. Célula, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que o antígeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é selecionado da lista que consiste em um antígeno de diabetes mellitus Tipo I, um antígeno de asma ou asma alérgica, um antígeno de esclerose múltipla, um antígeno de neuropatia periférica, um antígeno de cirrose biliar primária, um antígeno de distúrbio do espectro da neuromielite óptica, um antígeno da síndrome da pessoa rígida, um antígeno de encefalite autoimune, um antígeno de pênfigo vulgar, um antígeno de pênfigo foliáceo, um antígeno de psoríase, um antígeno de doença/síndrome de Sjõgren, um antígeno de doença inflamatória intestinal, um antígeno de artrite ou artrite reumatoide, um antígeno de lúpus eritematoso sistêmico, um antígeno de esclerodermia, um antígeno de vasculite associada a ANCA, um antígeno da síndrome de Goodpasture, um antígeno de doença de Kawasaki, um antígeno de doença celíaca, um antígeno de cardiomiopatia autoimune, um antígeno de miastenia grave, um antígeno de uveíte autoimune, um antígeno de doença de Grave, um antígeno de síndrome antifosfolipídeo, um antígeno de hepatite autoimune, um antígeno de colangite esclerosante, um antígeno de colangite esclerosante primária, antígeno de
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7/13 doença pulmonar obstrutiva crônica, ou um antígeno relevante para uveíte, e combinações destes.
30 . Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 6 a 2 9, caracterizada pelo fato de que o repórter dependente da via do receptor de célula T ativa a transcrição de um gene selecionado do grupo que consiste em um gene de luciferase, um gene de beta-lactamase, um gene de cloranfenicol acetiltransferase (CAT), um gene de fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), um gene de proteína fluorescente, e combinações destes.
31. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 30, caracterizada pelo fato de que o repórter dependente da via do receptor de célula T compreende uma sequência de polinucleotídeos selecionada da lista que consiste em uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de fator nuclear de células T ativadas (NFAT), uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de NF-κΒ, uma sequência de DNA ou promotor de ligação ao fator de transcrição de AP1, uma sequência de DNA ou promotor de ligação de fator de transcrição de IL-2, e combinações destes.
32 . Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 31, caracterizada pelo fato de que a célula é selecionada de JurMA, Jurkat, BW5147, HuT-78, CEM ou Molt4 .
33. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 32, caracterizada pelo fato de que o antígeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 1 a 352 e combinações destes.
34. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações
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8/13
26a 33, caracterizada pelo fato de que o antígeno relevante para doenças é um polipeptídeo que consiste em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 353 a 455 e combinações destes.
35. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como um polipeptídeo único.
36. Célula, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR do polipeptídeo único são separadas por uma sequência de salto de ribossomo.
37. Célula, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que a sequência de salto de ribossomo é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 456 a 523.
38. Célula, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo único compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 527, 533 ou 538 .
39. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 34, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são traduzidas como polipeptídeos separados.
40. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 39, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 528, 530, 534, 536 539, 541, e a cadeia beta de TCR compreende uma sequência de aminoácidos pelo menos 80%, 90%, 95% ou
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100% idêntica a qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos : 529, 531, 535, 537, 540 ou 542.
41. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 40, caracterizada pelo fato de que a cadeia alfa de TCR e cadeia beta de TCR são expressas na superfície da célula.
42. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 41, caracterizada pelo fato de que a célula compreende pelo menos um polinucleotídeo exógeno que codifica the cadeia alfa de TCR e the cadeia beta de TCR.
43. Célula, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucleicos de IRES.
44. Célula, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos de IRES é apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos: 524 a 526.
45. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 42 a 44, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo exógeno compreende uma sequência de ácidos nucleicos pelo menos 80%, 90%, 95% ou 100% homóloga àquela apresentada em qualquer um dos IDS. DE SEQ. Nos : 532 ou 557.
46. População de células, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 45.
47. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 45, ou população de células, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada por ser usada in vitro na determinação de uma potência ou atividade de um nanomedicamento.
48. Uso, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado
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10/13 pelo fato de que o nanomedicamento é para uso em um indivíduo humano.
49. Método in vitro de medição da atividade agonista de um nanomedicamento que compreende um antigeno relevante para doenças ligado a uma molécula de MHC acoplada a uma nanoparticula, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
a) o contato do nanomedicamento com a célula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 26 a 45 ou a população de células, conforme definida na reivindicação 46; e
b) detecção de um sinal produzido pelo repórter dependente da via do receptor de célula T.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o nanomedicamento compreende diversas nanopartículas.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que as diversas nanopartículas compreendem diversas nanopartículas que compreendem diversos antígenos relevantes para doenças ligados a uma molécula de MHC acoplada à nanoparticula.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o antigeno relevante para doenças é um antigeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o antigeno relevante para doenças autoimunes ou inflamatórias é selecionado da lista que consiste em um antigeno de diabetes mellitus Tipo I, um antigeno de asma ou asma alérgica, um antigeno de esclerose
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11/13 múltipla, um antigeno de neuropatia periférica, um antigeno de cirrose biliar primária, um antigeno de distúrbio do espectro da neuromielite óptica, um antigeno da síndrome da pessoa rígida, um antigeno de encefalite autoimune, um antigeno de pênfigo vulgar, um antigeno de pênfigo foliáceo, um antigeno de psoríase, um antigeno de doença/síndrome de Sjõgren, um antigeno de doença inflamatória intestinal, um antigeno de artrite ou artrite reumatoide, um antigeno de lúpus eritematoso sistêmico, um antigeno de esclerodermia, um antigeno de vasculite associada a ANCA, um antigeno da síndrome de Goodpasture, um antigeno de doença de Kawasaki, um antigeno de doença celíaca, um antigeno de cardiomiopatia autoimune, um antigeno de miastenia grave, um antigeno de uveíte autoimune, um antigeno de doença de Grave, um antigeno de síndrome antifosfolipídeo, um antigeno de hepatite autoimune, um antigeno de colangite esclerosante, um antigeno de colangite esclerosante primária, antigeno de doença pulmonar obstrutiva crônica, ou um antigeno relevante para uveíte, e combinações destes.
54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 53, caracterizado pelo fato de que as diversas nanopartícuias compreendem diversas nanopartículas com um diâmetro de 1 nanômetro até cerca de 100 nanômetros.
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 54, caracterizado ainda por compreender a quantificação do sinal do repórter dependente da via do receptor de célula T.
56. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a quantificação compreende a determinação de uma concentração do nanomedicamento que
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12/13 inicia uma resposta que é cerca de 50% de uma resposta máxima, em que a resposta máxima é a resposta iniciada na maior concentração de nanomedicamento que entrou em contato com a célula ou população de células quando várias concentrações do nanomedicamento entram em contato com a célula ou população de células.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que quando as várias concentrações do nanomedicamento entram em contato com a célula ou população de células no mesmo ensaio.
58. Método, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a quantificação compreende a determinação de uma concentração do nanomedicamento que inicia uma resposta que é pelo menos cerca de 200%, de um controle negativo, em que o controle negativo compreende um nanomedicamento que não interage especificamente com o receptor de célula T recombinante (TCR) da célula ou da população de células.
59. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 58, caracterizado pelo fato de que o sinal é produzido por uma enzima.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a enzima é luciferase ou peroxidase.
61. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 58, caracterizado pelo fato de que o sinal é um sinal fluorescente.
62 . Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 a 61, caracterizado pelo fato de que o método é utilizado como uma etapa de controle de qualidade em um processo de
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13/13 fabricação .
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