CN110945120A - 测量纳米药物中受体-配体相互作用的效力的测定 - Google Patents

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Abstract

本文描述了一种分离的细胞，其包含重组T细胞受体(TCR)和TCR途径依赖性报道分子，其中所述重组T细胞受体对与MHC分子结合的疾病相关抗原具有特异性。还描述了用于所述分离的细胞的测定方法，该测定方法用于确定偶联至纳米颗粒的肽‑主要组织相容性复合体(pMHC)(pMHC‑NP)的功能或效力，其可用作治疗自身免疫性疾病或癌症的药物。

Description

测量纳米药物中受体-配体相互作用的效力的测定
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年4月7日提交的第62/483,298号美国临时申请的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。
背景技术
自身免疫性疾病如1型糖尿病(T1D)、多发性硬化和类风湿性关节炎由慢性自身免疫应答引起，该免疫应答涉及识别不完全定义的自身抗原列表上的许多抗原表位的T细胞和B细胞(Santamaria,P.(2010)Immunity 32:437-445；Babbe,H.等人(2000)J.Exp.Med.192:393-404；Firestein,G.S.(2003)Nature 423:356-361)。消除或抑制每个单个自身免疫病症中的所有多克隆自身反应性T细胞特异性(已知和未知的)而不损害全身免疫目前是不可能的。
最近发现，与抗原-主要组织相容性复合体(pMHC)分子偶联的纳米颗粒可以在体内触发1型调节T(TR1)细胞的重新编程和扩充。参见PCT申请PCT/IB2016/000691。然而，鉴于需要稳定的抗原特异性T细胞克隆、与使用原代细胞相关的高度可变的实验间差异以及抗原受体触发事件远端读数的定量实验间再现性较差，目前尚无高通量方法可测量体外与pMHC偶联的纳米颗粒或未与纳米颗粒偶联的pMHC复合体的生物学和扩充效力。另外，本领域中的方法(例如，通过Western印迹法测量的半定量近端TCR信号传导事件)无法在一定浓度范围内很好地模拟纳米颗粒上的pMHC密度与生物活性之间的复杂关系。结果，这些方法无法忠实地预测特定制品的质量是否足以产生最佳的生物反应。因此，本领域需要开发用于测量pMHC的激动或扩充效力的体外方法。本公开满足了这一需求并且还提供了相关的优势。
发明内容
自身免疫性疾病如1型糖尿病(T1D)、多发性硬化和类风湿性关节炎由慢性自身免疫应答引起，该免疫应答涉及识别不完全定义的自身抗原列表上的许多抗原表位的T细胞和B细胞(Santamaria,P.(2010)Immunity 32:437-445；Babbe,H.等人(2000)J.Exp.Med.192:393-404；Firestein,G.S.(2003)Nature 423:356-361)。消除或抑制每个单个自身免疫病症中的所有多克隆自身反应性T细胞特异性(已知和未知的)而不损害全身免疫目前是不可能的。
已提出离体扩充的多克隆FOXP3+CD4+CD25+调节T(Treg)细胞的过继转移作为备选的治疗方法(Sakaguchi,S.等人(2006)Immunol.Rev.212:8-27)。旁观者免疫抑制的可能性、用于体外扩充抗原特异性Treg细胞的有效策略的缺乏以及FOXP3+Treg细胞的谱系不稳定性阻碍了这种方法的临床转化(Zhou,X.等人(2009)Nature Immunol.10:1000-1007；Komatsu,N.等人(2014)Nature Med.20:62-68；Bailey-Bucktrout,S.L.等人(2013)Immunity 39:949-962)。产生细胞因子IL-10和IL-21并且表达表面标志物CD49b和LAG-3以及转录因子c-Maf 8的TR1FOXP3-CD4+CD25-T细胞构成了最近用于治疗人类炎性疾病的另一种调节T细胞亚组(McLarnon,A.(2012)Nature Rev.Gastroenterol.Hepatol.9:559；Desreumaux,P.等人(2012)Gastroenterology 143:1207-1217；Roncarolo,M.G.等人(2011)Immunol.Rev.241:145-163)。然而，与FOXP3+Treg细胞一样，没有可在体内扩充自身抗原或疾病特异性TR1样细胞的药理学方法。
申请人先前已经表明，全身递送用与主要组织相容性复合体分子结合的自身免疫性疾病相关(美国专利8,354,110)、胃肠相关(WO 2013/144811)或癌症或肿瘤相关(美国专利9,511,151)肽包被的纳米颗粒，在不同的小鼠模型(包括用来自患者的淋巴细胞进行人源化的小鼠)中触发抗原特异性调节细胞的生成和扩充，从而导致对建立的自身免疫现象进行解析(另见WO 2016/198932和Clemente-Casares,X.等人(2016)“Expanding antigen-specific regulatory networks to treat autoimmunity,”Nature 530:434-440)。然而，鉴于需要稳定的抗原特异性T细胞克隆、与使用原代细胞相关的技术挑战和高度可变的实验间差异以及抗原受体触发事件远端读数的定量实验间再现性较差，目前尚无高通量方法可测量体外与pMHC偶联的纳米颗粒或未与纳米颗粒偶联的pMHC复合体的生物学和扩充效力。
此处提供的数据提供了出乎意料的结果，因为通过用途径依赖性报道分子和以其天然配体(肽MHC II类或肽MHC I类分子)发生响应的受体复合体(TCR加CD4或CD8共受体)转导/转染的细胞系，在体外准确地模拟了主要TCR-MHC肽的相互作用。参见图1I与图1J。本公开中描述的方法和组合物通常适用于测量包含与表达其同源受体或配体的细胞相互作用的配体或受体的纳米药物的效力。例如，本文所述的方法和组合物可用来设计包含本文所述的纳米颗粒和受体的配体的纳米药物，其可被部署以对体内细胞应答进行改变和重编程。例如，β细胞功能受到与E、P和N-钙粘蛋白结合的积极影响。本文所述的方法和组合物允许开发并测试包含纳米颗粒和E、P或N-钙粘蛋白的物质组合物。这类组合物可以与适当的细胞系如Min6细胞系(葡萄糖响应性β-细胞系)、与可以针对其对葡萄糖的响应而选择的β-细胞报道分子相配合。
在特定的实施方案中，本公开提供了用于测量任选地与纳米颗粒结合的pMHC复合体的激动或拮抗活性或“效力”的组合物和方法。在一方面，提供了用一种或多种多核苷酸转导的分离的细胞，该多核苷酸编码：重组T细胞受体(TCR)；TCR途径依赖性报道分子；和结合I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)配体的共受体。在进一步的方面，所述细胞表达TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体。在更进一步的实施方案中，用一种或多种多核苷酸转导细胞，该多核苷酸编码一种或多种共刺激分子和/或细胞因子的受体或配体。
MHC配体的非限制性实例选自与以下物质结合的受体：经典MHC I类蛋白质、非经典MHC I类蛋白质、经典MHC II类蛋白质、非经典MHC II类蛋白质、MHC二聚体(Fc融合体)，MHC四聚体或MHC蛋白质的聚合形式。在一方面，所述多核苷酸编码MHC I类共受体，如CD8。在另一方面，所述多核苷酸编码MHC II类共受体，如CD4。所述多核苷酸任选地可操作地连接至驱动所述多核苷酸表达的调节元件，并且进一步任选地可操作地连接至增强子元件。
在一方面，编码T细胞受体的多核苷酸编码TCRα和/或TCRβ，后者任选地包含与编码TCRα和/或TCRβ的多核苷酸可操作地连接的调节元件。这些多核苷酸可任选地进一步包含核糖体跳跃序列。在一方面，该核糖体跳跃序列包含2A核糖体跳跃序列，或进一步基本上由其组成，或由其组成。2A核糖体跳跃序列的非限制性实例包括F2A、T2A或P2A核糖体跳跃序列或其组合，或基本上由组成，或进一步由其组成。
在进一步的方面，所述TCR途径依赖性报道分子是TCR激活或TCR途径激活的报道分子，其可以任选地提供对基因表达、活性、蛋白质定位、蛋白质修饰或蛋白质-蛋白质相互作用的一个或多个测量。在进一步的方面，所述TCR途径依赖性报道分子包含选自萤光素酶、β内酰胺酶、CAT、SEAP或荧光蛋白的蛋白质，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在更进一步的方面，所述TCR途径依赖性报道分子包含活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列或启动子。
在另一个实施方案中，所述细胞已经用编码TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体的多核苷酸转导，该多核苷酸任选地可操作地偶联至用于在细胞表面表达该CD3信号传导复合体的调节序列，例如启动子和/或增强子。在一个实施方案中，所述细胞不内源性表达CD3信号传导复合体。
所述细胞可用于确定任何抗原的活化潜力，这类抗原的实例包括但不限于任选地与MHC偶联的自身免疫或癌症相关的抗原(pMHC)。pMHC任选地偶联至纳米颗粒核心或其它载体。在一方面，任选地经由与核心的连接体或经由核心上的涂层，pMHC与纳米颗粒核心复合。每个纳米颗粒核心上pMHC的数目可以在例如约10:1至约1000:1之间不等，并且范围在10:1至约1000:1之间。所述纳米颗粒核心可以适当地进一步任选地包含多个共刺激分子和/或细胞因子。
在一个特定方面，所述pMHC、细胞因子和/或共刺激分子经由纳米颗粒核心上的涂层与所述核心复合。所述涂层可以是例如聚合物，任选地是聚乙二醇(PEG)涂层，并且每个核心上pMHC、细胞因子和/或共刺激分子的数目可以通过用聚合物包被的纳米颗粒核心的单位表面积上pMHC的“密度”或数目来测量。可以测量任何密度，例如，纳米颗粒核心的单位表面积上约0.025pMHC/100nm2至约100pMHC/100nm2，并且范围在纳米颗粒核心的单位表面积上0.025pMHC/100nm2至约100pMHC/100nm2之间。
任何合适的真核细胞都可以用编码必需元件的多核苷酸进行转导；这类细胞的非限制性实例包括JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM或Molt-4。所述细胞可以是任何合适的物种、动物、哺乳动物的细胞，例如人细胞。在进一步的方面，当欲用编码CD3链信号传导复合体的多核苷酸转导细胞时，该细胞不内源性表达该CD3链信号传导复合体。
进一步提供了本文确定的细胞的群体，其中在一方面是基本上均质的。本文进一步提供了培养所述细胞和细胞群体的方法。
本公开还提供了制备如本文所述的分离的细胞的方法。在一方面，该方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：用一种或多种多核苷酸转导分离的细胞，所述多核苷酸编码：重组T细胞受体(TCR)；和TCR途径依赖性报道分子；以及结合I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)配体的共受体。在一个实施方案中，该方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：用编码TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体的多核苷酸转导分离的细胞。该方法进一步包括在一定条件下培养所述细胞，该条件有利于表达编码重组T细胞受体(TCR)、TCR途径依赖性报道分子和结合I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)配体的受体的一种或多种多核苷酸。在另一个实施方案中，该方法进一步包括在有利于表达TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体的条件下培养所述细胞。
在进一步的实施方案中，所述方法进一步包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：用一种或多种表达针对以下一种或多种物质的受体或配体的多核苷酸转导细胞：多种共刺激分子，多种共刺激抗体，多种抑制性受体阻断性抗体，和/或多种细胞因子。
表达受体的细胞和所转导的多核苷酸的表达产物可以通过本领域已知的任何适当方法来鉴定，例如通过本领域已知的方法，如流式细胞术，使用结合该表达产物的可检测地标记的配体和/或抗体来鉴定。
在细胞转导后，所述细胞在有利于表达所述多核苷酸和产生细胞群体的条件下生长。
所述细胞和细胞群体可用于测量包含抗原-MHC复合体(pMHC)(任选地与纳米颗粒核心结合)和可选的共刺激分子和/或细胞因子的组合物的激动或拮抗活性的体外方法，其包括使该组合物与有利于受体与其配体结合的如本文所述的分离的细胞接触，然后检测由报道分子产生的任何TCR途径依赖性报道分子信号。对技术人员显而易见的是，针对可能的相互作用选择组合物和细胞，例如，该组合物包含pMHC II类特异性TCR分子，并且该细胞表达MHC II类共受体，例如CD4。
在一方面，在细胞与组合物接触后，对由该细胞或群体产生的任何报道分子信号进行定量。可以对测得的反应进行分类，然后将其与采用激动或拮抗活性的预先确定(pre-determined)和/或事后确定(post-determined)测量所定量的信号进行比较，以监测疗法相对于其它疗法或组合物的有效性。当所述组合物包含共刺激分子并且所述细胞和细胞群体表达合适的受体时，可以对测得的反应进行分类，然后将其与采用拮抗活性的预先确定和/或事后确定测量所定量的信号进行比较，以监测疗法相对于其它疗法或组合物的有效性。
因此，本公开的某些方面涉及一种组合，其包含至少一种如本文所述的分离的转导细胞或转导细胞群体、分离的复合体，其中该分离的复合体包含与多个pMHC复合体偶联的纳米颗粒核心，或基本上由其组成，或进一步由其组成，其中所述纳米颗粒核心任选地进一步包含与纳米颗粒核心偶联的一个或多个共刺激分子和/或一个或多个细胞因子，或进一步由其组成，或进一步基本上由其组成。
对于这些含有多个复合体的组合物，每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的MHC彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的细胞因子彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的共刺激分子彼此相同或不同；和/或纳米颗粒核心的直径彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的价位彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的密度彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的共刺激分子的价位或密度彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的细胞因子的价位或密度彼此相同或不同。
在一方面，本文描述了一种组合物，其包含：(a)至少一种细胞，其包含(i)包含TCRα链和TCRβ链的重组T细胞受体(TCR)；和(ii)T细胞受体途径依赖性报道分子，其中所述重组TCR对与主要组织相容性(MHC)分子结合的疾病相关抗原具有特异性；以及(b)纳米药物，其包含偶联至纳米颗粒的与MHC分子结合的疾病相关抗原。在某些实施方案中，所述T细胞受体途径依赖性报道分子被活跃地(actively)转录。在某些实施方案中，所述与MHC分子结合的疾病相关抗原以10:1或更高的比例偶联至所述纳米颗粒。在某些实施方案中，所述纳米颗粒的直径为1纳米至100纳米。在某些实施方案中，所述纳米颗粒包含金属核心。在某些实施方案中，所述疾病相关抗原是自身免疫或炎性疾病相关抗原。在某些实施方案中，所述自身免疫或炎性疾病相关抗原选自哮喘或变应性哮喘抗原、I型糖尿病抗原、多发性硬化抗原、周围神经病抗原、原发性胆汁性肝硬化抗原、视神经脊髓炎谱系障碍抗原、僵人综合征抗原、自身免疫性脑炎抗原、寻常型天疱疮抗原、落叶型天疱疮抗原、银屑病抗原、舍格伦病/综合征抗原、炎性肠病抗原、关节炎或类风湿性关节炎抗原、系统性红斑狼疮抗原、硬皮病抗原、ANCA相关性血管炎抗原、古德帕斯丘综合征抗原、川崎病抗原、乳糜泻、自身免疫性心肌病抗原、重症肌无力抗原、自身免疫性葡萄膜炎抗原、格雷夫斯病抗原、抗磷脂综合征抗原、自身免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原发性硬化性胆管炎抗原、慢性阻塞性肺疾病抗原或葡萄膜炎相关抗原及其组合。在某些实施方案中，所述T细胞受体途径依赖性报道分子激活选自萤光素酶基因、β内酰胺酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、分泌型胚性碱性磷酸酶(SEAP)基因、荧光蛋白基因及其组合的基因的转录。在某些实施方案中，所述T细胞受体途径依赖性报道分子由选自活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP1转录因子结合DNA序列或启动子、IL-2转录因子结合DNA序列或启动子及其组合的多核苷酸序列组成。在某些实施方案中，所述至少一种细胞选自JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM或Molt-4。在某些实施方案中，所述疾病相关抗原是由SEQ ID NO:1至352中的任一个及其组合组成的多肽。在某些实施方案中，所述疾病相关抗原是由SEQ ID NO:353至455中的任一个及其组合组成的多肽。在某些实施方案中，所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单个多肽。在某些实施方案中，所述单个多肽的TCRα链和TCRβ链被核糖体跳跃序列隔开。在某些实施方案中，所述核糖体跳跃序列在SEQ ID NO:456至523中的任一个中示出。在某些实施方案中，所述单个多肽包含与SEQ ID NO:527、533或538中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单独的多肽。在某些实施方案中，所述TCRα链包含与SEQ ID NO:528、530、534、536、539、541中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，并且所述TCRβ链包含与SEQ ID NO:529、531、535、537、540或542中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述TCRα链和TCRβ链在所述细胞的表面表达。在某些实施方案中，所述细胞包含至少一种编码所述TCRα链和所述TCRβ链的外源多核苷酸。在某些实施方案中，所述至少一种外源多核苷酸包含IRES核酸序列。在某些实施方案中，所述IRES核酸序列在SEQ ID NO:524至526中的任一个中示出。在某些实施方案中，所述至少一种外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:532或557中的任一个所示的核酸序列至少80％、90％、95％或100％同源的核酸序列。在某些实施方案中，所述组合物在体外用于确定纳米药物的效力或活性。在某些实施方案中，所述纳米药物用于人类个体。
在另一方面，本文描述了一种包含重组T细胞受体(TCR)和T细胞受体途径依赖性报道分子的细胞，其中所述重组T细胞受体对与主要组织相容性分子结合的疾病相关抗原具有特异性。在某些实施方案中，所述T细胞受体途径依赖性报道分子被活跃地转录。在某些实施方案中，所述疾病相关抗原是自身免疫或炎性疾病相关抗原。在某些实施方案中，所述自身免疫或炎性疾病相关抗原选自哮喘或变应性哮喘抗原、I型糖尿病抗原、多发性硬化抗原、周围神经病抗原、原发性胆汁性肝硬化抗原、视神经脊髓炎谱系障碍抗原、僵人综合征抗原、自身免疫性脑炎抗原、寻常型天疱疮抗原、落叶型天疱疮抗原、银屑病抗原、舍格伦病/综合征抗原、炎性肠病抗原、关节炎或类风湿性关节炎抗原、系统性红斑狼疮抗原、硬皮病抗原、ANCA相关性血管炎抗原、古德帕斯丘综合征抗原、川崎病抗原、乳糜泻、自身免疫性心肌病抗原、重症肌无力抗原、自身免疫性葡萄膜炎抗原、格雷夫斯病抗原、抗磷脂综合征抗原、自身免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原发性硬化性胆管炎抗原、慢性阻塞性肺疾病抗原或葡萄膜炎相关抗原及其组合。在某些实施方案中，所述T细胞受体途径依赖性报道分子激活选自萤光素酶基因、β内酰胺酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、分泌型胚性碱性磷酸酶(SEAP)基因、荧光蛋白基因及其组合的基因的转录。在某些实施方案中，所述T细胞受体途径依赖性报道分子包含选自活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP1转录因子结合DNA序列或启动子、IL-2转录因子结合DNA序列或启动子及其组合的多核苷酸序列。在某些实施方案中，所述细胞选自JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM或Molt-4。在某些实施方案中，所述疾病相关抗原是由SEQ ID NO:1至352中的任一个及其组合组成的多肽。在某些实施方案中，所述疾病相关抗原是由SEQ ID NO:353至455中的任一个及其组合组成的多肽。在某些实施方案中，所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单个多肽。在某些实施方案中，所述单个多肽的TCRα链和TCRβ链被核糖体跳跃序列隔开。在某些实施方案中，所述核糖体跳跃序列在SEQ ID NO:456至523中的任一个中示出。在某些实施方案中，所述单个多肽包含与SEQ ID NO:527、533或538中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单独的多肽。在某些实施方案中，所述TCRα链和TCRβ链，其中所述TCRα链包含与SEQ ID NO:528、530、534、536、539、541中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，并且所述TCRβ链包含与SEQ ID NO:529、531、535、537、540或542中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述TCRα链和TCRβ链在所述细胞的表面表达。在某些实施方案中，所述细胞包含至少一种编码所述TCRα链和所述TCRβ链的外源多核苷酸。在某些实施方案中，所述至少一种外源多核苷酸包含IRES核酸序列。在某些实施方案中，所述IRES核酸序列在SEQ ID NO:524至526中的任一个中示出。在某些实施方案中，所述至少一种外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:532或557中的任一个所示的核酸序列至少80％、90％、95％或100％同源的核酸序列。在某些实施方案中，所述细胞是细胞群体。在某些实施方案中，所述细胞或细胞群体在体外用于确定纳米药物的效力或活性。在某些实施方案中，所述纳米药物用于人类个体。
在另一方面，本文描述了一种测定纳米药物的激动活性的体外方法，该纳米药物包含偶联至纳米颗粒的与MHC分子结合的疾病相关抗原，该方法包括：(a)使所述纳米药物与本文所述的细胞或细胞群体接触；以及(b)检测由T细胞受体途径依赖性报道分子产生的信号。在某些实施方案中，所述纳米药物包含多个纳米颗粒。在某些实施方案中，所述多个纳米颗粒包括包含偶联至所述纳米颗粒的与MHC分子结合的多个疾病相关抗原的多个纳米颗粒。在某些实施方案中，所述疾病相关抗原是自身免疫或炎性疾病相关抗原。在某些实施方案中，所述自身免疫或炎性疾病相关抗原选自I型糖尿病抗原、哮喘或变应性哮喘抗原、多发性硬化抗原、周围神经病抗原、原发性胆汁性肝硬化抗原、视神经脊髓炎谱系障碍抗原、僵人综合征抗原、自身免疫性脑炎抗原、寻常型天疱疮抗原、落叶型天疱疮抗原、银屑病抗原、舍格伦病/综合征抗原、炎性肠病抗原、关节炎或类风湿性关节炎抗原、系统性红斑狼疮抗原、硬皮病抗原、ANCA相关性血管炎抗原、古德帕斯丘综合征抗原、川崎病抗原、乳糜泻、自身免疫性心肌病抗原、重症肌无力抗原、自身免疫性葡萄膜炎抗原、格雷夫斯病抗原、抗磷脂综合征抗原、自身免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原发性硬化性胆管炎抗原、慢性阻塞性肺疾病抗原或葡萄膜炎相关抗原及其组合。在某些实施方案中，所述多个纳米颗粒包括直径为1纳米至约100纳米的多个纳米颗粒。在某些实施方案中，所述方法进一步包括对所述T细胞受体途径依赖性报道分子信号进行定量。在某些实施方案中，所述定量包括确定引发最大反应的约50％的反应时所述纳米药物的浓度，其中所述最大反应是当多种浓度的纳米药物与细胞或细胞群体接触时，与所述细胞或细胞群体接触的所述纳米药物在最高浓度下引发的反应。在某些实施方案中，所述多种浓度的所述纳米药物与所述细胞或细胞群体在同一测定中进行接触。在某些实施方案中，所述定量包括确定引发阴性对照的至少约200％的反应的所述纳米药物的浓度，其中所述阴性对照包含不与所述细胞或细胞群体的所述重组T细胞受体(TCR)特异性相互作用的纳米药物。在某些实施方案中，所述信号由酶产生。在某些实施方案中，所述酶是萤光素酶或过氧化物酶。在某些实施方案中，所述信号是荧光信号。在某些实施方案中，所述方法被用作制备过程中的质量控制步骤。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并被包含在内，以进一步说明本公开的某些方面。通过与本文提出的具体实施方案的详细描述相结合，参考这些附图中的一幅或多幅，可以更好地理解本公开内容。
图1A-1J显示了NP大小和pMHC价位对T细胞激动活性和TCR信号传导的影响。图1A显示了随pMHC价位和NP数目的变化，8.3-CD8+T细胞响应于NRP-V7/Kd-SFP的IFNγ产生。图1B显示了在该测定中随pMHC浓度的变化，来自图1A的NRP-V7/Kd-SFP的激动性质。图1C-1D显示了在该测定中随pMHC-NP(图1C)或pMHC浓度(图1D)的变化，8.3-CD8+T细胞响应于以两种不同的NRP-V7/Kd价位缀合的PF的IFNγ产生。图1E-F显示了随pMHC-NP(图1E)或pMHC浓度(图1E)的变化，以低NRP-V7/Kd价位包被的较小(SFP)与较大(PF)NP的激动性质的比较。图1A-1F中的数据对应于一式三份孔中IFNγ分泌的平均值+SEM值(误差条通常小于用来显示数据的符号的大小)，并且每幅图对应于至少三个独立实验中的一个代表。阴性对照涉及在高浓度的NP下(即，a中的50x 1011NP/mL)使用未缀合的或与Cys缀合的NP，从而产生零IFNγ值。图1G显示了随pMHC-NP(上图)或pMHC(下图)浓度的变化，以10种不同的BDC2.5mi/IAg7价位结合的PF NP在BDC2.5-CD4+T细胞上的激动性质的比较。示出的数据对应于一个实验。5和10μg pMHC的数据再重复两次，结果相似。作为阴性对照，申请人使用了在相当于10μgpMHC/mL的10pMHC/NP制品(95x1011 NP/mL)的铁浓度下与Cys缀合的NP，从而产生零IFNγ值。图1H显示了在10μg/mL(左)和5μg/mL(右)(产生接近最大激动活性的pMHC的浓度)下，PFNP(根据亚阈值、阈值、最小最佳和阈值上密度进行分组)上的BDC2.5mi/IAg7价位和密度(分别为下水平轴和上水平轴)与BDC2.5-CD4+T细胞上的激动活性之间的关系。亚阈值/阈值与最小最佳价位/阈值上价位之间的P值通过Mann-Whitney U来计算。图11显示了表达BDC2.5-TCR/mCDA/NFAT-萤光素酶的JurMA细胞响应于不同时间长度的BDC2.5mi/IAg7-PF-M(12.5μg/mL)、可溶性抗-hCD3εmAb(10μg/mL)和PMA/离子霉素刺激的萤光素酶活性(一式三份的平均值+SEM)。RLU(相对光单位)。作为阴性对照，申请人使用在相当于5μg pMHC/mL的10pMHC/NP制品(45.5x 1011NP/mL)的铁浓度下与Cys缀合的NP，从而产生1.05RLU。示出的数据代表每种刺激条件至少三个独立的实验。条件之间的P值通过双向ANOVA来计算。图1J显示了在5μg/mL下，PF NP(根据亚阈值、阈值、最小最佳和阈值上密度进行分组)上的BDC2.5mi/IAg7价位和密度(分别为下水平轴和上水平轴)与表达BDC2.5-TCR/mCD4/NFAT-萤光素酶的JurMA细胞上的激动活性之间的关系。P值通过Mann-Whitney U来计算。
图2A和2B显示了pMHC-P与同源T细胞结合的示意图。图2A，上图：TCR纳米簇的示意图，其由16个单元组成，横跨140nm(假设TCRαβ球形大小为4nm，间距为5nm)，与4个密集包被的pMHC-NP(携带的pMHC单体各自间隔4nm)结合。下图的卡通从NP的视角说明了这4个pMHC-NP是如何与TCR岛(左)或纳米簇(右)相互作用的。图2B示出了以阈值上、阈值和阈值下价位(左)包被的pMHC-NP及其在簇中引发TCR信号传导的相对能力，其中考虑了总体结合亲合力，pMHC-TCR缔合和解离速率，以及动力学校正和协同TCR信号传导模型两者。能够连接这些簇中的连续TCR异二聚体的pMHC-NP在引发TCR信号传导方面是有效的。这些模型解释了为什么用紧密排列的pMHC包被的小NP具有最佳的免疫学性质。
图3A-3G显示了随pMHC密度的变化，pMHC-NP在同源T细胞上的持续结合和聚簇。图3A和3B显示了分别与以阈值上pMHC密度(46pMHC/NP)包被的BDC2.5mi/IAg7-或NRP-V7/Kd-PF-M一起孵育的BDC2.5mi-CD4+(图3A)或8.3-CD8+T细胞(图3B)的2D TEM图像。图3A中的右侧两幅图和图3B中的右侧四幅图显示了在37℃下孵育3hr后在细胞内囊泡中存在NP。图3C显示了分别与非同源NRP-V7/Kd-PF-M和BDC2.5mi/IAg7-PF-M一起孵育的BDC2.5mi-CD4+和8.3-CD8+T细胞的2D TEM图像。图3D，左图：3D图像：与NRP-V7/Kd-PF-M-Alexa-647在4℃下孵育30min的8.3-CD8+T细胞的超高分辨率显微镜检查。中图和右图：2D图像：T细胞在4℃下孵育30min，以及在4℃下孵育30min，然后在37℃下孵育1hr。直方图显示，NP簇的直径随孵育时间和温度的增加而增加(179.1±4.6nm至401.7±4.2nm；n＝100个簇/条件；P值通过Mann-Whitney U来计算)。浅灰色：NRP-V7/Kd-PF-MAlexa-647；深灰色：DAPI。线条：1μm。图3E和3F显示了与携带亚阈值10pMHC/NP(E)或阈值(24pMHC/NP)(F)pMHC价位的BDC2.5mi/IAg7-PF-M制品一起孵育的BDC2.5mi-CD4+T细胞的2D TEM图像。图3E和图3F中的左侧四幅图显示在T细胞膜上不存在(E)或存在(F)微簇。图3E和图3F的右侧两幅图显示存在细胞内囊泡。图3G显示了在以(59.5±6.5nm)、(271.2±17.3nm)和(370±21.3nm)包被的pMHC-NP的存在下培养的细胞中微簇的平均大小；(在9-15个细胞/条件下，n＝50-60个簇)。P值通过Mann-Whitney U来计算。该图中描述的实验是可重复的，并且其重复可以获得一致的结果。
图4A和4B显示了用扫描电子显微镜检查(SEM)所观察到的，pMHC-NP在同源T细胞上的持续聚簇。图4A示出了在不存在(左)或存在(右)NRP-V7/Kd-PF-M的情况下8.3-CD8+T细胞的3D SEM图像。放大倍数：100,000倍；线条：500nm。黑色虚线对应于代表性的pMHC-NP簇。图4B显示了EDS光谱分析。通过EDS分析了在放大SEM图像中示出的三个代表性含簇(a-c)和无簇膜区域(d-f)，并将数据绘制为直方图。P值通过Mann-Whitney U检验来获得。
图5显示了效力测定的测定间差异结果。
图6显示了使用效力测定来确定血清和抗-pMHC-NP成分抗体对pMHC刺激T细胞系的能力的影响的结果。pMHC-NP与人血清一起预孵育(如图6C和图6D所示)，或者在不存在人血清的情况下预孵育(如图6A或6B所示)；然后与指定的抗体或兔超免疫(H.I)血清一起孵育。每种抗体与所示的pMHC和细胞一起孵育，血清稀释度(从左到右)为1:10、1:100和1:1000(在图6B和图6D中)，Ab:pMHC的摩尔比(从左到右)为1:1、1:4和1:16。线条表示标准偏差。
图7A-D显示了GFP标记的JURMA细胞的流式细胞术，所述JURMA细胞表达对与IGRP13-25多肽复合的DR具有特异性的TCR。图7A显示细胞系本身；图7B显示与通过标准亮氨酸拉链二聚化技术制备的PE标记的DR3 IGRP13-25一起孵育的细胞系；图7C显示与采用杵臼和cys阱二聚化技术制备但缺少亮氨酸拉链的PE标记的DR3 IGRP13-25一起孵育的细胞系；图7D显示与无关的PE标记的MHC II类异二聚体一起孵育的细胞系。
图8A和8B显示了JURMA细胞的刺激，所述细胞表达的TCR对与纳米颗粒缀合的与IGRP13-25多肽复合的DR具有特异性。
具体实施方式
在一方面，本文描述了一种组合物，其包含：(a)至少一种细胞，其包含(i)包含TCRα链和TCRβ链的重组T细胞受体(TCR)；和(ii)T细胞受体途径依赖性报道分子，其中所述重组TCR对与主要组织相容性(MHC)分子结合的疾病相关抗原具有特异性；以及(b)纳米药物，其包含偶联至纳米颗粒的与MHC分子结合的疾病相关抗原。
在另一方面，本文描述了包含重组T细胞受体(TCR)和T细胞受体途径依赖性报道分子的细胞，其中所述重组T细胞受体对与主要组织相容性分子结合的疾病相关抗原具有特异性。
在另一方面，本文描述了一种测定纳米药物的激动活性的体外方法，该纳米药物包含偶联至纳米颗粒的与MHC分子结合的疾病相关抗原，该方法包括：(a)使所述纳米药物与本文所述的细胞或细胞群体接触；以及(b)检测由T细胞受体途径依赖性报道分子产生的信号。
贯穿本公开并在本公开之内，参考技术和专利文献以便更充分地描述本公开所涉及的技术水平。一些出版物用阿拉伯数字标识，并且该出版物的完整著录信息可见于紧临权利要求书之前的参考部分中。所有出版物均通过引用并入本文，以便更充分地描述本公开所属领域的技术水平。
应当理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以有所变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并非旨在限制，因为本公开的范围仅由所附权利要求来限制。
必须指出，如本文所用且在所附权利要求中，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种赋形剂”包括多种赋形剂。术语“至少一个”意思是一个或多个。
在整个本申请中，术语“约”用来表示，数值包括用来测定该值的装置或方法的误差的标准偏差。当术语“约”用在数字表示例如温度、时间、量和浓度(包括范围)之前时，其表示近似值，它可变化(+)或(-)最高10％。
除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。如本文所用的，以下术语具有以下含义。
如本文所用的，术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所提到的元素，但不排除其它元素。“基本上由...组成”当用来定义组合物和方法时，应指排除对于所描述的目的而言对组合有任何重要影响的其它元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物将不排除不会实质影响要求保护的公开内容的基本和新颖特性的其它材料或步骤，如用于治疗或预防多发性硬化的组合物。“由...组成”应指排除超过痕量的其它成分元素和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一种定义的实施方案均在本公开的范围内。
“生物相容的”意指递送系统的组分不会引起组织损伤或对人类生物系统的损伤。为了赋予生物相容性，将优先使用在人类中具有安全使用历史或具有GRAS(通常被认为是安全的)状态的聚合物和赋形剂。生物相容性意指组合物中使用的成分和赋形剂最终将被身体“生物吸收”或清除，而不会对身体造成不利影响。对于生物相容的且被认为无毒的组合物，它必须不引起对细胞的毒性。类似地，术语“生物可吸收的”是指由这样的材料制成的纳米颗粒，该材料在一段时间内经历体内生物吸收，使得该材料在患者中的长期积累得到避免。在某个实施方案中，生物相容纳米颗粒在少于两年、优选少于一年、甚至更优选少于六个月的时间段内被生物吸收。生物吸收速率与颗粒的大小、所用的材料以及熟练技术人员公认的其它因素有关。生物可吸收、生物相容的材料的混合物可用来形成本公开中使用的纳米颗粒核心。在一个实施方案中，氧化铁和生物相容的、生物可吸收的聚合物可以组合。例如，氧化铁和PGLA可以组合以形成纳米颗粒。
术语“主要组织相容性复合体”或“MHC”是指免疫细胞上的抗原呈递分子，其具有与抗原缔合以形成抗原缔合的免疫细胞的能力。在一些实施方案中，MHC是I类或II类分子。在一些实施方案中，MHC包含经典MHC I类蛋白质、非经典MHC I类蛋白质、经典MHC II类蛋白质、非经典MHC II类蛋白质、MHC二聚体(Fc融合体)、MHC四聚体或MHC蛋白质的聚合形式，由其组成，或基本上由其组成。MHC结合选自CD4和CD8的细胞表面分子。
多肽/抗原-MHC纳米颗粒复合体(“NP-复合体”或“复合体”或“pMHC-NP”或“纳米颗粒复合体”)是指在表面如纳米颗粒核心上由MHC分子所呈递的肽、碳水化合物、脂质，或者抗原分子或蛋白质(即，自体肽或自身抗原)的其它抗原区段、片段或表位。
“纳米颗粒核心”是包含或不包含层或涂层的纳米颗粒基底。纳米颗粒复合体包含核心，至少有MHC复合体与该核心偶联。纳米颗粒核心可以由多种材料中的任何一种制成，并且可以是生物相容的。
如本文所用的，术语“活化T细胞核因子”或“NFAT”是应用于在免疫应答(例如，激活T细胞调节的免疫应答)中显示出重要性的转录因子家族的通用名称。免疫系统可以表达NFAT家族成员中的一个或多个成员，包括但不限于NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4和NFAT5。NFATc1至NFATc4受钙信号传导的调节。钙信号传导对NFAT激活至关重要，因为钙调蛋白(CaM)——一种众所周知的钙传感蛋白质——激活丝氨酸/苏氨酸磷酸酶钙依赖磷酸酶(CN)。NFAT蛋白的核输入与细胞质中的维持激酶和细胞核中的输出激酶相对立。为了使NFAT核保留，必须使诸如PKA和GSK-3β等输出激酶失活。在一个实施方案中，NFAT转录因子使得能够将钙信号与其它信号传导途径如ras-MAPK或PKC整合并同时检测。
如本文所用的，术语“T细胞受体”或“TCR”是指当由MHC分子呈递时能够识别肽的分子。在一些实施方案中，TCR是包含T细胞受体α链(TCRα)和T细胞受体β链(TCRβ)的异二聚体，每条链包含可变(V)区和恒定(C)区、跨膜域和胞质域。V区和C区通常与免疫球蛋白V区和C区同源，并包含三个互补决定区(CDR)。这两条TCR链都锚定在呈递TCR的细胞的质膜中。在一些实施方案中，TCR是包含TCRγ链(TCRγ)和TCRδ链(TCRδ)的异二聚体。在一些实施方案中，TCR是单链TCR构建体。TCRα的非限制性实例可见于GenBank中，例如GenBank登录号AAB31880.1、AAB28318.1、AAB24428.1和ADW95878.1，及其各自的等同物。TCRβ的非限制性实例也可见于GenBank中，例如GenBank登录号AAB31887.1、AKG65861.1、ADW95908.1和AAM53411.1，及其各自的等同物。在一个实施方案中，TCRγ链包含一个或多个可见于GenBank中的序列，例如GenBank登录号AAM21533.1、DAA30449.1和ABG91733.1，及其各自的等效项。在一个实施方案中，TCRδ链包含一个或多个可见于GenBank中的序列，例如GenBank登录号Q7YRN2.1、AAC48547.1、JC4663和NP_001009418.1，及其各自的等同物。单链TCR是本领域已知的。单链TCR的非限制性实例在WO1996018105和US20120252742中公开，其各自通过引用整体并入本文。在一个实施方案中，TCRβ的多核苷酸和多肽序列在下面提供的示例性序列表中列出，包括编码TCRβ的多肽的多核苷酸以及这些多核苷酸的等同物。
在一些实施方案中，TCR与CD3缔合并形成TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体(或TCR/CD3复合体)。在这些实施方案中，用一种或多种编码由多肽形成的TCR/CD3复合体的多核苷酸转导细胞，该复合体包含以下部分，或基本上由以下部分组成，或进一步由以下部分组成：α和βTCR链，CD3γ、δ和ε多肽，和ζ链。在不同的模块中形成时，TCR/CD3复合体可以承担不同的作用。在一个实施方案中，该复合体参与抗原特异性识别。在这些实施方案中，该复合体主要通过在CD3和ζ链的胞质尾中存在基于免疫受体酪氨酸的活化基序(“ITAM”)而参与信号转导。在一些实施方案中，TCR/CD3复合体参与由抗原、超抗原或抗体(例如，抗受体抗体)刺激的TCR信号传导途径。在一个实施方案中，TCR/CD3复合体的外源表达促进了CD3阴性细胞中的TCR信号传导途径。CD3阴性细胞的非限制性实例包括但不限于BW5147(ATCC号TIB-472)、Nk-92(ATCC号CRL-2407)、Mino(ATCC号PTS-CRL-3000)和JeKo-1(ATCC号CRL-3006)。
如本文所用的，术语“分离的细胞”是指用于评估测试剂(包括与pMHC偶联的纳米颗粒)的效力的细胞。在一个实施方案中，该细胞是选自JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM或Molt-4的T谱系细胞。它们可以来自任何合适的物种，例如动物、哺乳动物、人、犬、猫、马、牛或绵羊。在另一个实施方案中，分离的细胞是效应细胞，如免疫细胞。在一些实施方案中，该效应细胞表达T细胞受体(TCR)、TCR缔合的CD3多单位链复合体和/或TCR途径依赖性报道分子以及CD4或CD8受体。在进一步的方面，该细胞还表达共刺激分子和/或细胞因子的受体。在某些实施方案中，该TCR是鼠源化的(murinized)(即，其中TCR被优化以与鼠CD4分子相互作用)。
如本文所用的，术语“报道分子”是指分离的细胞之上或之内的元件，其特征(例如，活性、表达、定位、相互作用、修饰等)处于以下一种或多种情况：依赖于该细胞的生理变化或条件，与该细胞的生理变化或条件相关，或被该细胞的生理变化或条件激活。例如，“TCR途径依赖性报道分子”是指细胞上或细胞内的元件，其特征被TCR途径的激活或调节而激活或依赖于TCR途径的激活或调节。在一些实施方案中，TCR途径依赖性报道分子被上游转录因子结合DNA序列或启动子(例如，NFAT转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP1转录因子结合DNA序列或启动子以及IL-2转录因子结合DNA序列或启动子)激活。在一个实施方案中，该报道分子(例如，TCR途径依赖性报道分子)包含编码选自萤光素酶、β内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白、可定量的基因产物和/或其组合的基因，基本上由其组成，或由其组成。
如本文所用的，术语“CD3”(分化簇3)是指与T细胞受体缔合的蛋白质复合体。在一些实施方案中，针对CD3的抗体能够在T淋巴细胞中产生激活信号。也可以使用其它T细胞激活配体，包括但不限于CD28、CD134、CD137和CD27。在一些实施方案中，CD3包含四条不同的链，或基本上由四条不同的链组成，或由四条不同的链组成。对于哺乳动物，这四条不同的链是：CD3gamma、CD3delta、CD3epsilon和CD3zeta。CD3链的非限制性实例可见于GenBank中，例如GenBank登录号CAA72995.1、AAI45927.1、NP_998940.1、AAB24559.1、NP_000723.1、AEQ93556.1和EAW67366.1。
如本文所用的，术语“CD4”(分化簇4)是指在免疫细胞例如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的表面上发现的糖蛋白。在一些实施方案中，CD4充当TCR的共受体并募集酪氨酸激酶(例如，Lck)。CD4的非限制性实例可见于GenBank中，例如，GenBank登录号AAC36010.1、CAA72740.1、AFK73394.1、CAA60883.1和AAH25782.1。CD4的示例性多核苷酸和多肽序列在下面提供的示例性序列表中列出。
术语“核糖体跳跃序列”是指可被引入到处于同一启动子控制下的两个或更多个基因序列之间的任何序列，从而使该基因序列被翻译成单独的多肽(即翻译成双顺反子或多顺反子序列)。核糖体跳跃序列的实例包括但不限于2A肽序列。在一个实施方案中，在基因序列之间引入一个核糖体跳跃序列。在另一个实施方案中，在基因序列之间引入两个或更多个核糖体跳跃序列。
术语“2A核糖体跳跃序列”是指包含共有基序Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro的肽序列，其中X代表任意氨基酸。在一个实施方案中，2A核糖体跳跃序列包含以下序列，或基本上由以下序列组成，或进一步由以下序列组成：猪捷申病毒-1 2A(P2A)；T2A，扁刺蛾(Thosea asigna)病毒2A(T2A)；马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)；FMDV 2A(F2A)或其组合。2A肽序列的非限制性实例包括但不限于以下提供的示例性序列表中提供的那些序列。
2A核糖体跳跃序列允许在一个表达载体中表达多个基因。例如，具有2A核糖体跳跃序列的表达载体可以表达组成CD3复合体的所有四种蛋白质。在一个实施方案中，表达载体的非限制性示例性编码区序列在以下提供的示例性序列表中列出为：鼠CD3delta-F2A-gamma-T2A-epsilon-P2A-zeta的多核苷酸序列和鼠CD3delta-F2A-gamma-T2A-epsilon-P2A-zeta的多肽序列，及其各自的等同物。
在另一方面，具有2A核糖体跳跃序列的表达载体可以表达TCR的多个亚基。在一些实施方案中，表达载体的非限制性示例性编码区序列在SEQ ID NO:527至531(IGRP13-25TCR)、533至537(鼠源化IGRP13-25TCR)、538至542(PPI76-90 TCR)或543至547(BDC 2.5TCR)中提供。
术语“IRES序列”或“内部核糖体进入位点序列”是指允许在RNA序列的中间进行翻译起始的核苷酸序列。在一些实施方案中，将IRES序列插入两个基因序列(例如，报道基因开放阅读框)之间可以不依赖于与mRNA分子的5’端结合的5’-帽结构而驱动下游蛋白质编码区的翻译。合适的IRES序列是本领域已知的。在一些实施方案中，IRES序列来源于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、经典猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒。IRES序列的非限制性实例可见于www.iresite.org，其通过引用整体并入本文。IRES序列的非限制性实例在SEQ ID NO:524至526中提供，并且包括但不限于：EMCV IRES序列、pBag1 IRES序列和合成IRES序列，及其各自的等同物。
术语“萤光素酶”是指可以催化生物发光反应的蛋白质。例如，萤光素酶作为酶，当提供有底物(例如，萤光素、长链醛或colentrazine)、能量来源(例如，ATP)和氧时，可以产生信号。用于本公开的合适的萤光素酶序列是本领域已知的。在一个实施方案中，萤光素酶基因来自萤火虫(例如，Photinus pyralis)。萤光素酶序列的非限制性实例可见于GenBank中(例如，GenBank登录号AAR20792.1、AAL40677.1、AAL40676.1和AAV35379.1，及其各自的等同物。萤光素酶报告系统是可商购获得的(例如，Promega目录号E1500或E4550)。编码萤光素酶蛋白质的示例性多核苷酸和多肽在SEQ ID NO:555和556中提供，如下所提供。
术语“β内酰胺酶”是指可以分解β-内酰胺环的酶或蛋白质。在一个实施方案中，β-内酰胺酶是由细菌产生的酶，其可以部分或完全水解β-内酰胺抗生素中的β-内酰胺环。β内酰胺酶序列的非限制性实例可见于GenBank中(例如，GenBank登录号AMM70781.1、CAA54104.1和AAA23441.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。
术语“氯霉素乙酰转移酶”或“CAT”是指可以将乙酰基从乙酰化的辅酶A转移到氯霉素或相关衍生物的酶或蛋白质。“CAT”的非限制性实例可见于GenBank中(例如，登录号OCR39292.1、WP_072643749.1、CUB58229.1和KIX82948.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。CAT测定是可商购获得的(例如，来自Thermal Fisher的FAST
Figure BDA0002309626940000221
氯霉素乙酰转移酶测定试剂盒(F-2900))。
术语“分泌型胚性碱性磷酸酶”或“SEAP”是指由SEAP基因(例如，GenBank登录号NP001623及其等同物，于2017年1月12日最后一次访问)编码的酶，其用作研究启动子活性或基因表达的报道分子。SEAP序列的非限制性实例可见于GenBank中(例如，GenBank登录号ADV10306.1、AAB64404.1、EEB84921.1和EFD70636.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。SEAP活性可以用光度计(例如，来自Promega的Turner BioSystemsVeritas Microplate Luminometer)来测量。
术语“荧光蛋白”是指当被适当的电磁辐射激发时能够发光的任何蛋白质，并且其具有天然的或工程化的氨基酸序列，且衍生自多管水母(Aequorea)相关荧光蛋白的氨基酸序列。来自荧光蛋白的发射光可以用荧光读取仪(例如，FL600荧光微孔板读取仪)来确定。荧光蛋白的非限制性实例包括绿色蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)，或其它任何合适的荧光蛋白，或其组合，或荧光部分或其衍生物。荧光蛋白的序列可见于GenBank中(例如GenBank登录号AFA52654.1、ACS44348.1和AAQ96629.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。荧光蛋白启动子报道分子可商购获得(例如，TakaRa目录号631089)。
“在转录控制下”是本领域公知的术语，并且表示多核苷酸序列(通常是DNA序列)的转录依赖于其可操作地连接至有助于转录起始或促进转录的元件。“可操作地连接”是指多核苷酸以允许它们在细胞中起作用的方式排列。
当应用于多核苷酸时，术语“编码”是指被称为“编码”多肽的多核苷酸，如果其处于天然状态或通过本领域技术人员熟知的方法操作时，其可以被转录和/或翻译产生多肽和/或其片段的mRNA。反义链是这类核酸的互补物，并且可以从其推导出编码序列。
术语“启动子”是指启动特定基因转录的DNA区域。启动子包括核心启动子，其为正确启动转录所需的启动子的最小部分，并且还可以包括调节元件，如转录因子结合位点。调节元件可以促进转录或抑制转录。启动子中的调节元件可以是转录激活物或转录阻遏物的结合位点。启动子可以是组成型或诱导型的。组成型启动子是指始终活跃的和/或不断指导基因转录高于基础转录水平的启动子。此类启动子的非限制性实例包括磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子；SSFV、CMV、MNDU3、SV40、Ef1a、UBC和CAGG。诱导型启动子是能够被添加到细胞中或在细胞中表达的分子或因子诱导的启动子。在不存在诱导的情况下，诱导型启动子可能仍会产生基础水平的转录，但是诱导通常会导致蛋白质的显著更多的产生。
增强子是增加靶序列表达的调节元件。“启动子/增强子”是包含能够提供启动子和增强子功能的序列的多核苷酸。例如，逆转录病毒的长末端重复序列包含启动子和增强子功能。增强子/启动子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。“内源”增强子/启动子是与基因组中的给定基因天然连接的增强子/启动子。“外源”或“异源”增强子/启动子是通过基因操作(即分子生物学技术)与基因并列放置的增强子/启动子，使得该基因的转录由连接的增强子/启动子指导。本公开的多核苷酸任选地包含增强子序列。
如本文所用的，术语“NFAT启动子”、“NFAT转录因子结合DNA序列”或“活化T细胞核因子启动子”是指包含一个或多个NFAT元件、基本上由一个或多个NFAT元件组成或由一个或多个NFAT元件组成的序列。在一个实施方案中，NFAT启动子与NFAT转录因子(例如，NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4或NFAT5)的结合增加或促进了下游序列(例如，报道基因)的转录。NFAT启动子序列通常在GenBank中，其包括但不限于来自GenBank的以下登录号的序列：DQ904462.1、KX591058.1、AF480838.1，及其各自的等同物，或其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性的序列。
如本文所用的，术语“AP-1启动子”或“AP-1转录因子结合DNA序列”是指包含一个或多个AP-1转录激活元件，或基本上由一个或多个AP-1转录激活元件组成，或进一步由一个或多个AP-1转录激活元件组成的序列。在一个实施方案中，AP-1启动子与AP-1转录因子的结合增加或促进了下游序列(例如，报道基因，如萤光素酶或CAT)的转录。AP-1启动子可以来源于人类、小鼠、大鼠、斑马鱼、苍蝇或其它任何物种。在一个实施方案中，AP-1启动子具有序列ATGAGTCAT及其等同物，或与ATGAGTCAT具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％序列同一性的序列。
如本文所用的，术语“NF-κB启动子”或“NF-κB转录因子结合DNA序列”是指包含一个或多个NF-κB元件，或基本上由一个或多个NF-κB元件组成，或进一步由一个或多个NF-κB元件组成的序列。在一个实施方案中，Rel/NF-kB转录因子(作为同二聚体或异二聚体)与NF-κB启动子的结合增加或启动了下游序列(例如，报道基因，如萤光素酶或CAT)的转录。NF-kB启动子或结合位点的一些实施方案在美国专利8,299,237中公开，其通过引用整体并入本文。
如本文所用的，术语“IL-2启动子”或“IL-2转录因子结合DNA序列”是指包含一个或多个对T细胞刺激有反应的IL-2转录激活元件，或基本上由其组成，或进一步由其组成的序列。在一个实施方案中，转录因子与IL-2启动子的结合增加或启动了下游序列(例如，报道基因，如萤光素酶或CAT)的转录。在一个实施方案中，IL-2启动子来源于人类、小鼠、大鼠或斑马鱼。一些非限制性示例性IL-2启动子序列可从GenBank以登录号AJ006884.1、EF397241.1、AB041341.1、KU058846.1、EF457240.1和HM802330.1及其各自的等同物获得，于2017年1月12日最后一次访问。
如本文所用的，术语“载体”是指包含完整复制子的非染色体核酸，使得当该载体被置于细胞内时可以例如通过转化过程来复制。载体可以是病毒的或非病毒的。病毒载体包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、疱疹病毒、杆状病毒、修饰的杆状病毒、乳多空病毒(papovirus)或以其它方式修饰的天然存在的病毒。用于递送核酸的示例性非病毒载体包括裸DNA；单独或与阳离子聚合物组合的与阳离子脂质复合的DNA；阴离子和阳离子脂质体；包含与阳离子聚合物缩合的DNA的DNA-蛋白质复合物和颗粒，所述阳离子聚合物例如是异源聚赖氨酸、限定长度寡肽和聚乙烯亚胺，在一些情况下包含在脂质体中；以及包含病毒和聚赖氨酸-DNA的三元复合物的使用。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含待体内、离体或体外递送至宿主细胞中的多核苷酸。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体、甲病毒载体等。甲病毒载体，如基于Semliki Forest病毒的载体和基于辛德毕斯病毒的载体，也已被开发用于基因治疗和免疫治疗。参见，Schlesinger和Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439，以及Ying等人(1999)Nat.Med.5(7):823-827。
在由慢病毒载体介导基因转移的方面，载体构建体是指包含慢病毒基因组或其一部分和治疗性基因的多核苷酸。如本文所用的，“慢病毒介导的基因转移”或“慢病毒转导”具有相同的含义，并且是指借助于进入细胞并将基因组整合到宿主细胞基因组中的病毒而将基因或核酸序列稳定地转移到宿主细胞中的过程。病毒可以通过其正常的感染机制进入宿主细胞，也可以经过修饰，使其与不同的宿主细胞表面受体或配体结合而进入细胞。逆转录病毒以RNA形式携带其遗传信息；然而，一旦病毒感染细胞，RNA就会逆转录为DNA形式，该DNA形式整合到被感染细胞的基因组DNA中。整合的DNA形式称为原病毒。如本文所用的，慢病毒载体是指能够通过病毒或病毒样进入机制将外源核酸引入细胞中的病毒颗粒。“慢病毒载体”是本领域公知的一种类型的逆转录病毒载体，与其它逆转录病毒载体相比，其在转导非分裂细胞方面具有某些优势。参见，Trono D.(2002)Lentiviral vectors,New York:Spring-Verlag Berlin Heidelberg。
本发明的慢病毒载体基于或衍生自致癌逆转录病毒(含有MLV的逆转录病毒的亚组)和慢病毒(含有HIV的逆转录病毒的亚组)。实例包括ASLV、SNV和RSV，所有这些都已被分为慢病毒载体颗粒生产系统的包装和载体组分。根据本发明的慢病毒载体颗粒可以基于特定逆转录病毒的以遗传方式或以其它方式(例如通过包装细胞系统的特定选择)改变的形式。
所谓根据本发明的载体颗粒“基于”特定的逆转录病毒，意思是该载体衍生自该特定的逆转录病毒。载体颗粒的基因组包含来自该逆转录病毒的组分作为骨架。载体颗粒包含与RNA基因组相容的必需载体组分，包括逆转录和整合系统。通常，这些将包括源自特定逆转录病毒的gag和pol蛋白。因此，载体颗粒的大多数结构组分通常来源于该逆转录病毒，尽管它们可能已经通过遗传方式或以其它方式进行了改变，以提供所需的有用性质。然而，某些结构组分，尤其是env蛋白，可以源自不同的病毒。可以通过在载体颗粒生产系统中使用不同的env基因来改变被感染或转导的载体宿主范围和细胞类型，以赋予载体颗粒不同的特异性。
如本文所用的，术语“Jurkat”是指人淋巴细胞细胞系。有不同类型的Jurkat细胞。在一个实施方案中，Jurkat细胞能够产生IL-2。Jurkat细胞可商购获得或从细胞系储存库中获得(例如，ATCC号TIB-152)，并且在其中描述了培养该细胞的方法和组合物。
如本文所用的，术语“JurMa”或“Jurkat/MA”是指缺乏内源TCR表达的Jurkat细胞系。JurMa细胞的一个实施方案由Universiteit Medisch Centrum,Amsterdam的ErikHooijberg Vrije博士建立(参见Asai等人,PLoS One.8(2):e56820(2013)，于2017年1月12日最后一次访问。
如本文所用的，术语“BW5147”是指可用于研究T细胞功能的淋巴细胞系。在一些实施方案中，BW5147细胞源自淋巴瘤。有许多类型的BW5147细胞，它们可商购获得或从细胞系储存库中获得(例如，ATCC号TIB-472)，并且在其中描述了培养该细胞的方法和组合物。
如本文所用的，术语“HuT-78”是指淋巴细胞系。在一个实施方案中，HuT-78是T细胞淋巴瘤细胞系。HuT-78细胞可商购获得(例如，Sigma-Aldrich)或从细胞系储存库中获得(例如，ATCC号TIB-161)，并且在其中描述了培养该细胞的方法和组合物。
如本文所用的，术语“CEM”是指淋巴细胞系。在一个实施方案中，CEM细胞是外周血淋巴母细胞。CEM细胞可从细胞系储存库中获得(例如，ATCC号CRL-2265或CCL-119)，并且在其中描述了培养该细胞的方法和组合物。
如本文所用的，术语“Molt-4”是指淋巴细胞系。在一个实施方案中，Molt-4细胞是急性淋巴母细胞白血病细胞。Molt-4细胞可商购获得(例如，Sigma-Aldrich)或从细胞系储存库中获得(例如，ATCC号CRL-1582)，并且在其中描述了培养该细胞的方法和组合物。
“价位”涉及每个纳米颗粒核心的pMHC或每个纳米颗粒的共刺激分子和/或每个纳米颗粒核心的细胞因子的数目。
“密度”当指每个纳米颗粒核心的pMHC或每个纳米颗粒的共刺激分子和/或每个纳米颗粒核心的细胞因子时，其被计算为具有外层的纳米颗粒核心的表面积，其还可包括连接体。表面积是所用构建体的总可用表面积。
如本文所用的，“抗原”是指可诱导受试者中的免疫应答或免疫细胞、优选T或B细胞的扩充的分子的全部、部分、片段或区段。在一方面，该抗原是癌症相关抗原。在另一方面，该抗原是自身免疫病相关抗原。在进一步的方面，该抗原是变应原。
术语“烷基”是指具有1至10个碳原子(即，C1-C10烷基)或1至6个碳原子(即，C1-C6烷基)或1至4个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。举例来说，该术语包括直链和支链烃基，如甲基(CH3-)、乙基(CH3CH2-)、正丙基(CH3CH2CH2-)、异丙基((CH3)2CH-)、正丁基(CH3CH2CH2CH2-)、异丁基((CH3)2CHCH2-)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH-)、叔丁基((CH3)3C-)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2-)和新戊基((CH3)3CCH2-)。
术语“烷氧基”是指–O-烷基。
“模拟物”是给定配体或肽的类似物，其中该类似物基本上类似于该配体。“基本上类似”意指该类似物具有类似于该配体的结合曲线，不同之处在于该模拟物具有总共占该配体分子量的小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％或小于约5％的一个或多个官能团或修饰。
“免疫细胞”包括，例如，衍生自在骨髓中产生的造血干细胞(HSC)的白血细胞(白细胞)、淋巴细胞(T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)和髓系来源的细胞(嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞)。如本文所用的，术语“B细胞”是指适应性免疫系统的体液免疫中的一种淋巴细胞类型。B细胞主要用于生成抗体，用作抗原呈递细胞，释放细胞因子，并在通过抗原相互作用激活之后形成记忆B细胞。B细胞通过在细胞表面上存在B细胞受体而区别于其它淋巴细胞，如T细胞。如本文所用的，术语“T细胞”是指在胸腺中成熟的淋巴细胞类型。T细胞在细胞介导的免疫中发挥重要作用，并且通过在细胞表面上存在T细胞受体而区别于其它淋巴细胞，如B细胞。T细胞可以从可商购获得的来源中分离或得到。“T细胞”包括表达CD3的所有类型的免疫细胞，包括T辅助细胞(CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(CD8+细胞)、自然杀伤T细胞、T调节细胞(Treg)和γ-δT细胞。“细胞毒性细胞”包括CD8+T细胞、自然杀伤(NK)细胞和嗜中性粒细胞，所述细胞能够介导细胞毒性应答。
如本文所用的，术语“效应T细胞”是指不需要进一步分化就可以特异性结合抗原并介导免疫应答(效应功能)的T细胞。效应T细胞的实例包括CTL、TH1细胞、TH2细胞、效应记忆细胞和T辅助细胞。与效应T细胞相反，幼稚T细胞尚未遇见其特异性抗原——MHC复合体，也未通过增殖并分化为效应T细胞来对它产生响应。效应T细胞可以是静息的(在细胞周期的G0期)或活化的(正在增殖)。
术语“抗致病自身反应性T细胞”是指具有抗致病性质的T细胞(即，抵抗自身免疫性疾病如MS、MS相关疾病或病症或前驱糖尿病的T细胞)。这些T细胞可包括抗炎T细胞、中心记忆T细胞、效应记忆T细胞、记忆T细胞、低亲合力T细胞、T辅助细胞、自身调节T细胞、细胞毒性T细胞、自然杀伤T细胞、调节T细胞、TR1细胞、抑制性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞等。
术语“抗炎T细胞”是指促进抗炎应答的T细胞。T细胞的抗炎功能可通过产生和/或分泌抗炎蛋白质、细胞因子、趋化因子等来实现。抗炎蛋白质还旨在包括抑制免疫应答的抗增殖信号。抗炎蛋白质包括IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-α、TGF-β、IL-1ra、G-CSF以及TNF和IL-6的可溶性受体。
术语“分化的”是指第一种类型的细胞被诱导成为第二种类型的细胞。在一些实施方案中，同源T细胞分化为调节TR1细胞。在一些实施方案中，活化T细胞分化为TR1细胞。在一些实施方案中，记忆T细胞分化为TR1细胞。在一些实施方案中，B细胞分化为调节B细胞。
如本文所用的，“杵臼(knob-in-hole)”是指需要在第一多肽的界面处的凸起(或“杵”)和在第二多肽的界面处的相应空腔(或“臼”)的多肽基架构，使得该凸起可以定位在该空腔中以促进异多聚体形成。通过用较大的侧链(例如，苯丙氨酸或酪氨酸)代替第一多肽的界面处的小氨基酸侧链来构建凸起。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替大氨基酸侧链，在第二多肽的界面中创建与该凸起相同或类似大小的空腔。凸起和空腔可由本领域技术人员使用常规方法通过合成手段来制备，如通过改变编码多肽的氨基酸或通过肽合成。在一些实施方案中，第一多肽的界面位于第一多肽中的Fc结构域上；且第二多肽的界面位于第二多肽中的Fc结构域上。杵臼异多聚体及其制备方法和用途在美国专利5,731,168、5,807,706、5,821,333、7,642,228、7,695,936、8,216,805和8,679,785中公开，所有这些专利均通过引用整体并入本文。
如本文所用的，“MHC-α-Fc/MHC-β-Fc”是指包含第一多肽和第二多肽的异二聚体，其中第一多肽包含MHC II类α链和抗体Fc结构域；第二多肽包含MHC II类β链和抗体Fc结构域。杵臼MHC-α-Fc/MHC-β-Fc进一步要求每个多肽的Fc结构域通过将一个Fc结构域上的凸起互补定位在另一个Fc结构域上的相应空腔内而相互接合。
术语“分离的”意指与细胞组分或其它组分分开，这些组分在正常情况下在自然界中与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段相关联。例如，关于多核苷酸，分离的多核苷酸是与在染色体中通常关联的5′和3′序列分离的多核苷酸。对本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来将它与其天然存在的对应物区分开。另外，“浓缩的”、“分离的”或“稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段与其天然存在的对应物的区别可在于单位体积的分子浓度或分子数大于“浓缩的”或小于“分离的”其天然存在的对应物的分子浓度或分子数。在一级序列上或例如由于其糖基化模式而不同于天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要以其分离形式存在，因为它通过其一级序列或通过另一种特征如其糖基化模式而可区别于其天然存在的对应物。如果将哺乳动物细胞如T细胞从生物体中它被发现的解剖部位移取，则该细胞被分离。
“自身反应性T细胞”是识别“自身抗原”的T细胞，该自身抗原是含有该T细胞的相同个体产生和含有的分子。
“致病T细胞”是对含有T细胞的受试者有害的T细胞，而非致病T细胞对受试者基本上无害，并且抗致病T细胞减少、改善、抑制或消除致病T细胞的伤害。
如本文所用的，术语调节B细胞或B调节细胞(“B-reg”)是指那些引起抗炎作用的细胞，该抗炎作用的特征在于CD1d和CD5的表达和IL-10的分泌。B-reg还根据Tim-1的表达来鉴定，并且可通过Tim-1连接来诱导以促进耐受性。B-reg的能力被显示被诸如toll样受体、CD40配体等许多刺激因子来驱动。然而，B-reg的全面表征正在进行中。B-reg还表达高水平的CD25、CD86和TGF-β。B细胞的该亚组能够抑制Th1增殖，因此有助于维持自身耐受性。B-reg功能的增强应成为许多免疫调节药物的目的，以有助于更好地控制自身免疫性疾病。参见，例如：ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23707422，于2013年10月31日最后一次访问。
1型T调节(TR1)细胞是具有调节性质并且能够在体外和体内抑制抗原特异性免疫应答的CD4+T细胞的亚组。这些TR1细胞通过它们产生细胞因子的独特性质来定义，并产生高水平的IL-10和TGF-β，而非IL-4或IL-2。这些细胞产生的IL-10和TGF-β介导体外原代幼稚T细胞的抑制。还有证据表明TR细胞存在于体内，并且已记录了在接受同种异体干细胞移植的严重联合免疫缺陷患者中存在高水平的产生IL-10的CD4(+)T细胞。TR1细胞参与外周耐受性的调节，并且它们可潜在地用作细胞疗法以调节体内免疫应答。参见，例如：ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10887343，于2013年10月31日最后一次访问。
TR1细胞通过其产生高水平的IL-10和TGF-β的能力来定义。对多种抗原具有特异性的Tr1细胞在体内产生，但也可以在IL-10的存在下在体外由幼稚CD4+T细胞分化而成。TR1细胞具有低增殖能力，这可被IL-15克服。TR1细胞经由IL-10和TGF-β的产生抑制幼稚和记忆T辅助细胞1型或2型应答。TR1细胞在分子水平上的进一步表征将定义其作用机制并阐明它们与TR细胞的其它亚组的关系。可以预见使用TR1细胞来鉴定用于开发新治疗剂的新型靶标，以及作为细胞疗法来调节外周耐受性。参见，例如，ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11722624，于2013年10月31日最后一次访问。
“有效量”是足以实现预期目的的量，这种目的的非限制性实例包括：T细胞受体的复合、免疫应答的启动、免疫应答的调节、炎症应答的抑制和T细胞活性或T细胞群体的调节。在一个实施方案中，有效量是足以刺激靶细胞的TCR途径的量。在一方面，有效量是用于实现所述治疗目的的量，即，治疗有效量，或提供可测量的应答的量。如本文详细描述的，有效量或剂量取决于目的和组合物，并且可根据本公开内容来确定。
治疗组合物的有效量根据预期目标来确定。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合于在受试者中使用的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的组合物，该预定量经计算以产生与其施用，即，适当的途径和方案有关的上述所需应答。根据治疗次数和单位剂量两者，待施用的量取决于所需的结果和/或保护。该组合物的精确量还取决于医生的判断并且是每个个体所特有的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、给药途径、预期治疗目标(减轻症状与治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。一经配制，溶液将以与剂量制剂相容的方式且以治疗上或预防上有效的量来施用。所述制剂容易以多种剂型来施用，如上述可注射溶液的类型。
如本文使用的术语“MHC多聚体”意指两个或更多个，通常四个，直到约五十个或更多个MHC单体的复合体。
如本文所用的，“多聚体复合体”是指靶细胞群体与一个或多个pMHC复合体之间的复合体，其中该pMHC复合体的MHC蛋白质包含MHC蛋白质的多聚体形式。在一些实施方案中，MHC蛋白质的多聚体形式包括二聚体、三聚体、四聚体、五聚体或六聚体。
如本文所用的，短语“免疫应答”或其等同短语“免疫学应答”是指细胞介导的应答(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导)的发展。细胞免疫应答由与I类或II类MHC分子缔合的多肽表位的呈递而引发，以治疗或预防病毒感染，并且/或者扩充抗原特异性Breg细胞、TC1、CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞和/或疾病生成的自身调节T细胞和B细胞“记忆”细胞。该应答还可包括其它组分的激活。在一些方面，术语“免疫应答”可用来包括免疫细胞的调节网络的形成。因此，术语“调节网络形成”可指引发的免疫应答，使得免疫细胞，优选T细胞，更优选T调节细胞，触发包括但不限于B细胞或抗原呈递细胞的其它免疫细胞的进一步分化，其非限制性实例包括树突细胞、单核细胞和巨噬细胞。在某些实施方案中，调节网络形成涉及正在分化为调节B细胞的B细胞；在某些实施方案中，调节网络形成涉及致耐受性的抗原呈递细胞的形成。
如本文所用的，“纳米球”、“NP”或“纳米颗粒”意指小的离散颗粒，其根据情况以单数或复数形式施用于受试者、细胞样本或组织样本。在某些实施方案中，如本文所用的术语“纳米颗粒”包括纳米颗粒核心周围的任何层，因此包括具有和不具有层如连接体层的核心。在某些实施方案中，纳米颗粒的形状基本上呈球形。在某些实施方案中，纳米颗粒不是脂质体或病毒颗粒。在进一步的实施方案中，纳米颗粒由诸如固体、固体核心、金属、树状聚体、聚合物胶束、金属氧化物或蛋白质或其片段或组合等任何合适的材料组成。如本文所用的术语“基本上呈球形”意指颗粒的形状不偏离球形超过约10％。
如本文所用的术语“炎症应答”和“炎症”表示个体的血管组织对有害刺激如病原体、受损细胞或刺激物的复杂生物反应，并且包括分泌细胞因子，并且更具体地说是促炎性细胞因子，即主要由活化免疫细胞产生并参与炎症反应放大的细胞因子。示例性促炎性细胞因子包括但不限于IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17、IL21、IL23、IL27和TGF-β。示例性炎症包括急性炎症和慢性炎症。急性炎症表示以由血浆和白细胞浸润组织而引起的典型炎症体征(肿胀、发红、疼痛、发热或功能缺失)为特征的短期过程。急性炎症通常在出现有害刺激时发生，而一旦刺激被移除、分解或被瘢痕形成(纤维化)隔开，急性炎症就会停止。慢性炎症表示以并发的活动性炎症、组织破坏和修复尝试为特征的状况。慢性炎症不以上面列出的急性炎症的典型体征为特征。相反，慢性发炎组织的特征在于单核免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和浆细胞)的浸润、组织破坏和愈合尝试，其包括血管发生和纤维化。通过影响、特别是抑制形成与个体炎症相关的复杂生物反应的任何一种事件，可以在本公开的意义上抑制炎症。
如本文所用的，术语“疾病相关的”抗原意指被选择用来治疗所选疾病的抗原或其片段，并且参与疾病过程。例如，糖尿病相关抗原是这样的抗原或其片段，当呈递时产生用来治疗糖尿病的免疫应答；因此，选择产生这种作用的糖尿病相关抗原来治疗糖尿病。选择多发性硬化(MS)相关抗原来治疗MS。不选择糖尿病相关抗原来治疗MS。类似地，自身免疫相关的抗原是与自身免疫性疾病有关的抗原，且不被选择用于治疗除自身免疫以外的病症或疾病，例如癌症。本文公开了非限制性的示例性疾病相关抗原，并且另外，可根据文献中记录的技术、机制以及方法针对特定的疾病确定这样的抗原。
“自身免疫性疾病或病症”包括由个体的自身组织或器官引起并针对该自身组织或器官的疾病或病症，或其表现形式，或由此产生的病况。在一个实施方案中，它是指由对正常身体组织和抗原具有反应性的T细胞引起、产生或由其加剧的病况。自身免疫性疾病或病症的实例包括但不限于关节炎(类风湿性关节炎如急性关节炎、慢性类风湿性关节炎、痛风或痛风性关节炎、急性痛风性关节炎、急性免疫性关节炎、慢性炎性关节炎、退行性关节炎、II型胶原诱发性关节炎、感染性关节炎、莱姆关节炎、增生性关节炎、银屑病关节炎、斯蒂尔病、脊椎关节炎和青少年发作型类风湿性关节炎、骨关节炎、慢性进行性关节炎(arthritis chronica progrediente)、变形性关节炎、慢性原发性多关节炎、反应性关节炎和强直性脊柱炎)，炎性过度增生性皮肤病，银屑病，如斑块状银屑病、滴状银屑病、脓疱性银屑病和指甲的银屑病，特应性，包括特应性疾病，如枯草热和Job综合征，皮炎，包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、变应性皮炎、变应性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激性接触性皮炎和特应性皮炎，x连锁高IgM综合征，变应性眼内炎性疾病，荨麻疹，如慢性变应性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自身免疫性荨麻疹，肌炎，多肌炎/皮肌炎，青少年皮肌炎，中毒性表皮坏死松解症，硬皮病(包括系统性硬皮病)，硬化，如系统性硬化，多发性硬化(MS)，如脊柱光学MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)，进行性系统性硬化，动脉粥样硬化，动脉硬化，弥漫性硬化，运动失调性硬化，视神经脊髓炎谱系障碍(NMO，也称为德维克病或德维克综合征)，炎性肠病(IBD)(例如克罗恩病、自身免疫介导的胃肠疾病、结肠炎，如溃疡性结肠炎、溃疡结肠炎、镜下结肠炎、胶原性结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎、透壁性结肠炎，以及自身免疫性炎性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，全部或部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫性血液病，类风湿性脊椎炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，脑膜炎的脑神经损伤，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙痒、自身免疫性卵巢功能早衰，由于自身免疫状况引起的突发性听觉丧失，IgE介导的疾病，如过敏反应和变应性和特应性鼻炎，脑炎，如Rasmussen脑炎和边缘和/或脑干脑炎，葡萄膜炎，如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽肿性葡萄膜炎、非肉芽肿性葡萄膜炎、晶状体抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，伴有和不伴有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)，如慢性或急性肾小球肾炎，如原发性GN、免疫介导的GN、膜性GN(膜性肾病)、特发性膜性GN或特发性膜性肾病、膜性或膜增生性GN(MPGN)，包括I型和II型，以及快速进行性GN、增生性肾炎，自身免疫性多腺内分泌衰竭，龟头炎，包括浆细胞性局限性龟头炎、龟头包皮炎，离心性环状红斑，持久性色素异常性红斑，多形性红斑(eythema multiform)，环状肉芽肿，光泽苔藓，硬化萎缩苔藓，慢性单纯性苔藓，小棘苔藓，扁平苔藓，片层状鱼鳞藓，表皮松懈角化过度症，恶变前角化症，坏疽性脓皮病，变应性状况和应答，变态反应，湿疹，包括变应性或特应性湿疹、干性湿疹、汗疱湿疹和水疱样掌跖湿疹，哮喘，如细支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫性哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎症应答的病况，针对外来抗原如妊娠期间的胎儿ABO血型的免疫反应，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮，包括狼疮肾炎、狼疮脑炎、小儿狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮和盘状红斑狼疮、脱发性狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)，如皮肤SLE或亚急性皮肤SLE、新生儿狼疮综合征(NLE)和播散性红斑狼疮，I型糖尿病，II型糖尿病，成人潜伏性自身免疫性糖尿病(或1.5型糖尿病)。还想到与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应有关的免疫应答，结节病，肉芽肿病，包括淋巴瘤样肉芽肿病、韦格纳肉芽肿病，粒细胞缺乏，血管炎病，包括血管炎、大血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu)动脉炎)、中血管血管炎(包括川畸病和结节性多动脉炎/结节性动脉周围炎)、显微镜下多动脉炎、免疫性血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、超敏性血管炎、坏死性血管炎，如系统性坏死性血管炎，和ANCA相关性血管炎，如Churg-Strauss血管炎或综合征(CSS)和ANCA相关性小血管血管炎，颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫性再生障碍性贫血，Coombs阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，艾迪生病，自身免疫性中性白细胞减少症，全血细胞减少症，白细胞减少，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，阿尔茨海默病，帕金森病，多器官损伤综合征，如继发于败血症、创伤或出血的那些综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基膜疾病，抗磷脂抗体综合征，抗磷脂综合征，变应性神经炎，贝赫切特病/综合征，卡斯尔曼综合征，古德帕斯丘综合征，雷诺综合征，舍格伦综合征，史-约综合征，类天疱疮，如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮和红斑型天疱疮)，自身免疫性多内分泌腺疾病，赖特尔病或综合征，热损伤，先兆子痫，免疫复合物病症，如免疫复合物肾炎，抗体介导的肾炎，多发性神经病，慢性神经病，如IgM多发性神经病或IgM介导的神经病，自身免疫性或免疫介导的血小板减少，如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，获得性血小板减少性紫癜，巩膜炎，如特发性角膜-巩膜炎，巩膜外层炎，睾丸和卵巢的自身免疫性疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺功能减退症，甲状旁腺功能减退症，自身免疫性内分泌病，包括甲状腺炎，如自身免疫性甲状腺炎、桥本病、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)或亚急性甲状腺炎，自身免疫性甲状腺疾病，特发性甲状腺功能减退症，格雷夫斯病，多腺性综合征，如自身免疫性多腺性综合征(或多腺性内分泌病综合征)，类肿瘤综合征，包括神经病类肿瘤综合征，如兰-伊肌无力综合征或伊-兰综合征，僵人综合征，脑脊髓炎，如变应性脑脊髓炎或过敏性脑脊髓炎和实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力，如胸腺瘤相关性重症肌无力，小脑退化，神经性肌强直，视性眼阵挛或眼球斜视痉挛综合征(OMS)和感觉神经病，多病灶运动神经病，希恩综合征，自身免疫性肝炎，慢性肝炎，类狼疮性肝炎，巨细胞性肝炎，慢性活动性肝炎或自身免疫性慢性活动性肝炎，淋巴样间质性肺炎(LIP)，闭塞性细支气管炎(非移植)与NSIP、格林-巴利综合征，贝尔热病(Berger's disease)(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线状IgA皮肤病，急性发热性嗜中性皮肤病，角层下脓疱性皮肤病，暂时性棘层松解性皮肤病，硬化，如原发性胆汁性肝硬化和肺硬变，自身免疫性肠病综合征，腹或腹腔疾病，乳糜泻(麸质肠病)，难治性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷球蛋白血症，肌萎缩侧索硬化(ALS；Lou Gehrig病)，冠状动脉疾病，自身免疫性耳病，如自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性听力损失，多软骨炎，如难治性或复发的或复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉着症，寇甘综合征/非梅毒性间质性角膜炎，贝尔麻痹，斯威特病/综合征，自身免疫性酒渣鼻，带状疱疹相关性疼痛，淀粉样变性，非癌性淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单克隆丙球蛋白病和意义未明的单克隆丙球蛋白病，MGUS)，周围神经病，副肿瘤综合征，通道病变，如癫痫、偏头痛、心律失常、肌肉病症、耳聋、失明、周期性瘫痪和CNS的通道病变，孤独症，炎性肌病，局灶性或节段性或局灶性节段性肾小球硬化症(FSGS)，内分泌性眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫性肝脏病症，纤维肌痛，多发性内分泌衰竭，施密特综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病，如自身免疫性脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘性多神经病，德雷斯勒综合征，斑秃(alopecia greata)，全秃，CREST综合征(钙质沉着症、雷诺现象，食管活动不良、指端硬化和毛血管扩张)，男性和女性自身免疫性不育，例如，由抗精子抗体引起的，混合性结缔组织病，南美洲锥虫病，风湿热，复发性流产，农民肺，多形性红斑，心脏切开后综合征，库欣综合征，养鸟迷肺病(bird-fancier's lung)，变应性肉芽肿性脉管炎，良性淋巴细胞脉管炎，奥尔波特综合征，肺泡炎，如变应性肺泡炎和纤维化肺泡炎，间质性肺病，输血反应，麻风，疟疾，寄生虫病，如利什曼病，锥虫病(kypanosomiasis)，血吸虫病、蛔虫病、曲霉病，Sampter综合征，Caplan综合征，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性肺间质纤维化，肺间质纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，眼内炎，持久隆起性红斑(erythema elevatum etdiutinum)，胎儿成红细胞增多症，嗜酸性筋膜炎，舒尔曼综合征，费尔蒂综合征，丝虫病(flariasis)，睫状体炎，如慢性睫状体炎、异时性睫状体炎、虹膜睫状体炎(急性或慢性)或Fuch睫状体炎，Henoch Schonlei紫癜，人类免疫缺陷病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，埃可病毒感染，脓毒症，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺毒症(thyroxicosis)，细小病毒感染、风疹病毒感染，疫苗接种后综合征，先天性风疹感染、EB病毒感染，流行性腮腺炎，埃文斯综合征，自身免疫性腺衰竭，西登哈姆舞蹈病，链球菌感染后肾炎，闭塞性血栓性脉管炎(thromboangitis ubiterans)，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨细胞性多肌痛，慢性过敏性肺炎，干燥性角结膜炎，流行性角结膜炎，特发性肾病综合征，微小病变肾病，良性家族性和缺血再灌注损伤，移植器官再灌注，视网膜自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺疾病，矽肺，口疮，口疮性口炎，动脉硬化病症，asperniogenese，自身免疫性溶血、伯克病、冷球蛋白血症、Dupuytren挛缩，晶状体蛋白过敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)，变应性肠炎，麻风结节性红斑、特发性面神经麻痹，慢性疲劳综合征，发热肌痛，哈-里病，感音神经性听觉丧失，阵发性血红蛋白尿(haemoglobinuria paroxysmatica)，性腺功能减退，局限性回肠炎，白细胞减少症，传染性单核细胞增多症，横贯脊髓炎，原发性特发性粘液性水肿，肾病，交感性眼炎(ophthalmiasymphatica)，肉芽肿性睾丸炎，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮病，Quervain甲状腺炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的病况，白细胞粘附缺陷，与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型超敏反应相关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多器官损伤综合征，抗原-抗体复合物介导的疾病，抗肾小球基膜病，变应性神经炎，自身免疫性多内分泌腺疾病，卵巢炎，原发性粘液性水肿，自身免疫性萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿性疾病，混合性结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌腺衰竭，I型自身免疫性多内分泌腺综合征，成人发作型特发性甲状旁腺功能减退(AOIH)，心肌病，如扩张型心肌病、获得性大疱性表皮松解(EBA)，血色素沉着症，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，化脓性或非化脓性鼻窦炎，急性或慢性鼻窦炎，筛骨、额骨、上颌骨或蝶窦炎，嗜酸性粒细胞相关疾病，如嗜酸性粒细胞增多，肺嗜酸性粒细胞增多性浸润，嗜酸性粒细胞增多肌痛综合征，吕弗勒综合征，慢性嗜酸细胞性肺炎，热带性肺嗜酸细胞浸润症，支气管肺曲霉病，曲霉肿或含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿，过敏反应，血清阴性脊柱关节病，多内分泌自身免疫性疾病，硬化性胆管炎，巩膜、巩膜外层、慢性皮肤粘膜念珠菌病，布鲁顿综合征，婴儿一过性低丙种球蛋白血症，威-奥综合征，共济失调-毛细血管扩张综合征，血管扩张，与胶原病相关的自身免疫病症，风湿病，神经系统疾病，淋巴结炎，血压反应减少，血管功能障碍、组织损伤、心血管缺血、痛觉过敏、肾缺血，脑缺血以及伴随血管生成的疾病，变应性超敏反应病症、肾小球肾炎、再灌注损伤、缺血再灌注病症，心肌或其它组织再灌注损伤，淋巴瘤性气管支气管炎，炎性皮肤病，具有急性炎性组分的皮肤病，多器官衰竭，大疱性疾病，肾皮质坏死，急性化脓性脑膜炎或其它中枢神经系统炎性病症，眼部和眼眶的炎性病症，粒细胞输注相关综合征，细胞因子诱发的毒性，发作性睡病，急性严重炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉增生，消化性溃疡，瓣膜炎，肺气肿，斑秃，脂肪组织炎症/II型糖尿病，肥胖症相关的脂肪组织炎症/胰岛素抗性，以及子宫内膜异位症。
在一些实施方案中，所述自身免疫病症或疾病可包括但不限于I型和II型糖尿病、前驱糖尿病、移植排斥、多发性硬化、多发性硬化相关的病症、卵巢功能早衰、硬皮病、舍格伦病/综合征、狼疮、白癜风、脱发(秃顶)、多腺体衰竭、格雷夫斯病、甲状腺功能减退症、多肌炎、天疱疮、克罗恩病、结肠炎、自身免疫性肝炎、垂体功能减退症、心肌炎、艾迪生病、自身免疫性皮肤病、葡萄膜炎、恶性贫血、甲状旁腺功能减退症和/或类风湿性关节炎。其它感兴趣的适应症包括但不限于哮喘、变应性哮喘、原发性胆汁性肝硬化、硬化、视神经脊髓炎谱系障碍(德维克病、视神经脊髓型多发性硬化(OSMS))、寻常型天疱疮、炎性肠病(IBD)、关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、乳糜泻、银屑病、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力(Myasthyenia Gravis)、葡萄膜炎、强直性脊柱炎、免疫介导性肌病、前列腺癌、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、皮肌炎、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、肺气肿、脊髓损伤、创伤性损伤、烟草诱发的肺破坏、ANCA相关性血管炎、银屑病、硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎，以及中枢神经系统和周围神经系统疾病。
在一些实施方案中，所述自身免疫病症或疾病可包括但不限于糖尿病、多发性硬化、乳糜泻、原发性胆汁性肝硬化、天疱疮、落叶型天疱疮、寻常型天疱疮、视神经脊髓炎谱系障碍、关节炎(包括类风湿性关节炎)、变应性哮喘、炎性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、系统性红斑狼疮、动脉粥样硬化、慢性阻塞性肺疾病、肺气肿、银屑病、自身免疫性肝炎、葡萄膜炎、舍格伦综合征、硬皮病、抗磷脂综合征、ANCA相关性血管炎和僵人综合征。
多发性硬化(MS)也被称为“弥漫性硬化”、“弥漫性脑脊髓炎”或“变应性脑脊髓炎”。MS是一种炎性疾病，其中脑和脊髓轴突周围的脂肪髓鞘受损，导致脱髓鞘和瘢痕形成以及广泛的体征和症状。多发性硬化相关的病症包括例如视神经脊髓炎谱系障碍(NMO)、葡萄膜炎、神经性疼痛等。
“髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白”(MOG)是一种被认为在中枢神经系统(CNS)的神经髓鞘形成过程中至关重要的糖蛋白。在人类中该蛋白质由MOG基因编码。据推测，它充当必要的“粘附分子”，为髓鞘提供结构完整性，并且已知在少突胶质细胞上晚期形成。GenBank登录号NM_001008228.2和NP_001008229.1分别代表MOG基因的mRNA和蛋白质序列。与这些GenBank登录号中的每一个相关的序列通过引用并入以用于所有目的。
如本文所用的，术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的生理状态，其特征通常在于不受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病及其转移。“转移”意指致病生物体或恶性细胞或癌细胞通过血液或淋巴管或膜表面转移至身体的其它部位。这类癌症的非限制性实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈癌。表2是用于本公开的癌症相关抗原的示例性非限制性列表。
如本文所用的，术语“共刺激”是指在体内产生次级信号的分子，该次级信号用于将幼稚T细胞激活成能够对具有所述特异性抗原的细胞产生免疫应答的抗原特异性T细胞。本公开不限于任何特定的共刺激分子。各种共刺激分子是本领域公知的。共刺激分子的一些非限制性实例是4-IBBL、OX40L、CD40、IL-15/IL-15Ra、CD28、CD80、CD86、CD30L和ICOSL，以及它们各自的受体和编码它们的多核苷酸。在具体的实施方案中，本公开的共刺激分子可以是以下配体和它们各自的受体中的任何一种或多种：B7-1/CD80、BTLA、B7-2/CD86、CD28、B7-H1/PD-L1、CTLA-4、B7-H2、Gi24/VISTA/B7-H5、B7-H3、ICOS、B7-H4、PD-1、B7-H6、PD-L2/B7-DC、B7-H7、PDCD6、LILRA3/CD85e、LILRB2/CD85d/ILT4、LILRA4/CD85g/ILT7、LILRB3/CD85a/ILT5、LILRB1/CD85j/ILT2、LILRB4/CD85k/ILT3、4-1BB/TNFRSF9/CD137、GITR配体/TNFSF18、4-1BB配体/TNFSF9、HVEM/TNFRSF14、BAFF/BLyS/TNFSF13B、LIGHT/TNFSF14、BAFF R/TNFRSF13C、淋巴毒素-alpha/TNF-beta、CD27/TNFRSF7、OX40/TNFRSF4、CD27配体/TNFSF7、OX40配体/TNFSF4、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD30配体/TNFSF8、TACI/TNFRSF13B、CD40/TNFRSF5、TL1A/TNFSF15、CD40配体/TNFSF5、TNF-alpha、DR3/TNFRSF25、TNF RII/TNFRSF1B、GITR/TNFRSF18、2B4/CD244/SLAMF4、CD84/SLAMF5、BLAME/SLAMF8、CD229/SLAMF3、CD2、CRACC/SLAMF7、CD2F-10/SLAMF9、NTB-A/SLAMF6、CD48/SLAMF2、SLAM/CD150、CD58/LFA-3、CD7、DPPIV/CD26、CD96、EphB6、CD160、整联蛋白alpha 4beta 1、CD200、整联蛋白alpha 4beta 7/LPAM-1、CD300a/LMIR1、LAG-3、CRTAM、TIM-1/KIM-1/HAVCR、DAP12、TIM-4、Dectin-1/CLEC7A、TSLP R、ICOSL和/或其各自的生物等同物。
如本文所用的，术语“共刺激配体”是指与共刺激分子相互作用的细胞表面分子。
如本文所用的，术语“细胞因子”包括由免疫系统中的各种细胞分泌的低分子量蛋白质，所述蛋白质用作用于在分子和细胞水平上调节体内广泛范围的生物过程的信号分子。“细胞因子”包括属于淋巴因子、白细胞介素或趋化因子类别的单独的免疫调节蛋白质。
如本文所用的，术语“糖尿病”意指由遗传和环境因素的组合引起的碳水化合物代谢的可变紊乱，并且其特征通常在于胰岛素分泌或利用不充分、尿产生过量、血液和尿中的糖过量，以及口渴、饥饿和体重减轻。糖尿病分为1型糖尿病和2型糖尿病。非肥胖糖尿病(“NOD”)小鼠是一种用于研究和治疗糖尿病的公认的动物模型。小鼠中的1型糖尿病(T1D)与自身反应性CD8+T细胞相关。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠发展成T1D的形式，非常类似于人T1D，它是由识别越来越多的自身抗原的T细胞选择性破坏胰腺β细胞而产生的。虽然T1D的启动明确需要CD4+细胞的贡献，但有令人信服的证据表明T1D是CD8+T细胞依赖性的。已经发现，NOD小鼠中的大部分胰岛相关的CD8+细胞使用CDR3不变的Vα17-Jα42+TCR，其被称为“8.3-TCR样”。在MHC分子Kd的背景中识别模拟表位NRP-A7(使用组合肽文库定义)的这些细胞已经是最早的NOD胰岛CD8+浸润物的重要组分，是致糖尿病的，并且靶向来自胰岛特异性的葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)的肽，IGRP是一种功能未知的蛋白质。识别该肽(IGRP206-214，类似于NRP-A7)的CD8+细胞在循环中非常常见(>1/200CD8+细胞)。值得注意的是，在NOD小鼠中胰岛炎发展为糖尿病总是伴随着循环IGRP206-214反应性CD8+池的周期性扩大，以及其胰岛相关对应物的急性成熟。最近，已经证明，NOD小鼠中的胰岛相关CD8+细胞识别多个IGRP表位，这表明IGRP是CD8+细胞的主要自身抗原，至少在鼠T1D中是这样。NOD胰岛相关CD8+细胞，特别是在疾病过程早期发现的那些细胞，也识别胰岛素表位(InsB15-23)。
如本文所用的，术语“前驱糖尿病”意指以亚临床β细胞损伤为特征的在糖尿病病况之前的无症状期，其中患者表现出正常的血浆葡萄糖水平。前驱糖尿病还以存在胰岛细胞自身抗体(ICA)为特征，并且在接近临床症状发作时可能伴有对葡萄糖的不耐受。
如本文所用的，术语“多发性硬化相关的病症”意指与对MS的易感性或与MS共存的病症。这类病症的非限制性实例包括视神经脊髓炎谱系障碍(NMO)、葡萄膜炎、神经性疼痛、硬化、动脉粥样硬化、动脉硬化、弥漫性硬化、系统性硬化、脊柱光学MS、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)、进行性系统性硬化和运动失调性硬化。
术语“表位”和“抗原决定簇”可互换使用，是指B和/或T细胞响应或识别的抗原上的位点。B细胞表位可以由连续氨基酸或通过蛋白质三级折叠并列的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而通过三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理时丢失。表位通常包含至少3个，且更通常包含至少5个或8-20个独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x射线晶体分析法和2维核磁共振。参见，例如，Glenn E.Morris,Epitope Mapping Protocols(1996)。对于CD8细胞，T细胞识别约九个氨基酸的连续表位，或者对于CD4细胞，识别约9-20个氨基酸的连续表位。识别表位的T细胞可通过测量抗原依赖性增殖的体外测定来鉴定，如通过致敏T细胞响应于表位的3H-胸苷掺入(Burke等人,J.Inf.Dis.,170:1110-1119,1994)、通过抗原依赖性杀伤(细胞毒性T淋巴细胞测定，Tigges等人,J.Immunol.,156(10):3901-3910,1996)或通过细胞因子分泌所确定的。细胞介导的免疫应答的存在可通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。
任选地，抗原或优选抗原表位可与其它蛋白质如MHC和MHC相关蛋白质化学缀合，或表达为含有该蛋白质的融合蛋白。
如本文所用的，术语“个体”、“患者”和“受试者”同义使用，并且指哺乳动物。在一些实施方案中，该个体是人。在其它实施方案中，该个体是需要兽医医疗的哺乳动物或通常在实验室中使用的哺乳动物。在一些实施方案中，该哺乳动物是小鼠、大鼠、猴、犬、猫、牛、马或绵羊。
如本公开中所使用的，术语“多核苷酸”是指重组的或已经分离的不含总基因组核酸的核酸分子。在术语“多核苷酸”中包括寡核苷酸(长度为100个或更少残基的核酸)、重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。在某些方面，多核苷酸包括从其天然存在的基因或蛋白质编码序列中基本分离的调节序列。多核苷酸可以是RNA、DNA、其类似物或它们的组合。编码全部或部分多肽的核酸可含有以下长度的编码这类多肽的全部或一部分的连续核酸序列：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000个或更多个核苷酸、核苷或碱基对。还想到来自给定物种的特定多肽可由含有天然变异的核酸来编码，所述核酸具有略微不同的核酸序列，但编码相同或基本相似的蛋白质、多肽或肽。
多核苷酸由五种核苷酸碱基的特定序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；以及当多核苷酸是RNA时用尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”是多核苷酸分子的字母表示。这种字母表示可输入到具有中央处理单元的计算机的数据库中，并用于生物信息学应用，如功能基因组学和同源性检索。
如本文关于核酸如DNA或RNA所用的术语“分离的”或“重组的”是指分别与存在于大分子以及多肽的天然来源中的其它DNA或RNA分离的分子。术语“分离或重组的核酸”意在包括并非以片段形式天然存在的且不会在自然状态中发现的核酸片段。术语“分离的”在本文中也用于指与其它细胞蛋白质分离的多核苷酸、多肽和蛋白质，并且意在包括纯化的和重组的多肽。在其它实施方案中，术语“分离的或重组的”意指与细胞组分以及其它组分分开，这些组分在正常情况下在自然界中与细胞、组织、多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段相关联。例如，分离的细胞是与具有不同表型或基因型的组织或细胞分离的细胞。分离的多核苷酸与在其原始或天然环境中例如在染色体上通常关联的3’和5’连续核苷酸分离。对本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段不需要“分离”来将它与其天然存在的对应物区分开。
关于核酸或多核苷酸所用的“外源”表示该核酸是重组核酸构建体的一部分，或者不在其天然环境中。例如，外源核酸可以是来自一个物种、引入到另一个物种中的序列，即异源核酸。通常，经由重组核酸构建体将这样的外源核酸引入其它物种中。外源核酸也可以是生物体天然的并且已经被重新引入该生物体的细胞中的序列。包含天然序列的外源核酸通常可以通过在重组核酸构建体中存在与外源核酸连接的非天然序列，例如天然序列侧翼的非天然调节序列(启动子、增强子、转录终止子、IRES、核糖体跳跃序列)，或缺乏内含子序列，而区别于天然存在的序列。另外，稳定转化的外源核酸通常被整合在天然发现天然序列的位置以外的位置。例如，可以使用遗传重组将外源元件添加至构建体。
如本文所用的，术语“同源的”、“同源性”或“同源性百分比”在本文中用来相对于参考序列描述核酸序列时，可以使用Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268,1990，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877,1993中修改)描述的公式来确定。该公式被并入Altschul等人(J.Mol.Biol.215:403-410,1990)的基本局部比对搜索工具(BLAST)程序中。序列的百分同源性可以使用到本申请的申请日为止最新版本的BLAST来确定。
相对于参考多肽序列的序列同一性百分比(％)是在对齐序列并在必要时引入空位以获得最大序列同一性百分比后，并且不把任何保守置换视为序列同一性的一部分，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。旨在确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过已知的各种方式来实现，例如使用可公开获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。能够确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的算法。然而，对于本发明而言，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性百分比值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.开发，并且其源代码已与用户文档一起提交于美国版权局，Washington D.C.,20559，并以美国版权注册号TXU510087进行了注册。ALIGN-2程序可从Genentech,Inc.,South San Francisco,Calif.公开获得，也可以从源代码进行编译。ALIGN-2程序应针对在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用进行编译。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，未进行改变。
在使用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与或相对于给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性百分比(或者可以表述为给定氨基酸A具有或包含与或相对于给定氨基酸序列B的特定氨基酸序列同一性百分比)如下计算：分数X/Y乘以100，其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A与B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基数目，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列同一性百分比将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另有特别说明，否则本文使用的所有氨基酸序列同一性百分比值均使用ALIGN-2计算机程序按上一段所描述的那样获得。
“组合物”旨在表示活性剂和另一种惰性(例如，可检测试剂或标记物)或活性化合物或组合物如佐剂的组合。在某些实施方案中，该组合物不包含佐剂。
“药物组合物”旨在包括活性剂与惰性或活性的载体的组合，使得该组合物适合于体外、体内或离体的诊断性或治疗性用途。
如本文所用的，“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指包含至少五个氨基酸残基的分子。
根据以下详细描述，本公开的其它目的、特征和优点将变得显而易见。其中还提供了另外的定义。然而，应当理解，详细描述和具体实例在说明本公开的具体实施方案时，仅作为示例给出，因为本领域技术人员从该详细描述中将会容易得到在本公开的精神和范围内的各种改变和修改。
本公开提供了新型测定和进行该测定所必需的组合物。一种这样的组合物是分离的细胞，其包含外源引入的重组T细胞受体(TCR)、TCR途径依赖性报道分子和结合I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)复合体的共受体。在进一步的方面，所述分离的细胞包含外源引入的TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体。在更进一步的方面，所述分离的细胞包含外源引入的共刺激分子的受体和/或细胞因子受体。
细胞
将要在本文所述的效力测定中使用的细胞是真核细胞。该细胞最低限度地表达：1)特异性结合与待测pMHC-NP偶联的肽-MHC的重组或天然TCR；2)CD3信号传导复合体；3)TCR途径依赖性报道分子；和4)MHC共受体。一些细胞或细胞系可以以足以进行本文所述测定的水平天然表达CD3信号传导复合体和MHC共受体(例如，CD4或CD8)。然而，基于特定的细胞或细胞系，MHC共受体或CD3信号传导复合体的一种或多种多肽可以被外源多核苷酸引入，从而以均一的方式增加信号或调节信号。该细胞可以是原代细胞或经过工程改造以表达以下一种或多种的细胞系：重组T细胞受体(TCR)、TCR途径依赖性报道分子、MHC共受体或CD3信号传导复合体的一种或多种多肽。可以被工程改造的适当细胞系的非限制性实例包括JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4或其组合。如果细胞不内源性表达重组T细胞受体(TCR)、TCR途径依赖性报道分子、MHC共受体或CD3信号传导复合体的一种或多种多肽中的任何一种，则可以从引入该细胞或细胞系中的多核苷酸表达该组分。在某些实施方案中，该细胞不内源性表达CD3信号传导复合体。在某些实施方案中，该细胞不内源性表达MHC共受体。在一方面，该细胞内源性表达共刺激分子和/或细胞因子的受体。在某些实施方案中，该细胞以低水平表达或不表达共刺激分子和/或细胞因子的受体，但是当T细胞被激活时，其表达被上调。该细胞可以包含添加编码MHC共受体、作为CD3信号传导复合体一部分的多肽的外源多核苷酸中的任何一种或多种。在某些实施方案中，作为CD3信号传导复合体一部分的多肽包含与SEQ ID NO:553至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，作为CD3信号传导复合体一部分的多肽由与SEQ ID NO:554至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同源的多核苷酸编码。在某些实施方案中，所述MHC共受体包含与SEQ ID NO:549或551至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述MHC共受体由与SEQ ID NO:550或552至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同源的多核苷酸编码。
T细胞受体(TCR)
用于本文所述的效力测定的细胞或细胞系表达重组T细胞受体(TCR)。重组T细胞受体是由缺少3’UTR、5’UTR、内含子序列或天然启动子或增强子元件中的一种或多种的多核苷酸编码的受体。该重组TCR可由通过转导、转染或感染引入的外源多核苷酸编码。在某些实施方案中，该外源多核苷酸被整合到细胞或细胞系的基因组中。T细胞受体的非限制性实例包括但不限于包含TCRα和TCRβ的异二聚体，包含TCRγ和TCRδ的异二聚体，以及单链TCR构建体。在某些实施方案中，TCR是鼠源化的(即，其中TCR被优化以与鼠CD4分子相互作用)。TCRα的非限制性实例可见于GenBank，例如GenBank登录号AAB31880.1、AAB28318.1、AAB24428.1和ADW95878.1，及其各自的等同物。使用本领域已知的方法将编码这些蛋白质的多核苷酸引入细胞中，所述多核苷酸可以进一步包含用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号、增强子以及用于转导和表达的载体。
TCRβ的非限制性实例也可见于GenBank登录号AAB31887.1、AKG65861.1、ADW95908.1和AAM53411.1，及其各自的等同物。使用本领域已知的方法将编码这些蛋白质的多核苷酸转导到细胞中。所述多核苷酸可以是用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号、增强子以及用于转导和表达的载体。在一个实施方案中，TCRγ链包含一个或多个可见于GenBank中的序列，例如GenBank登录号AAM21533.1、DAA30449.1和ABG91733.1，及其各自的等同物。编码这些多肽的多核苷酸可以被转导到细胞中。所述多核苷酸可以是用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号、增强子以及用于转导和表达的载体。在一个实施方案中，TCRδ链包含一个或多个可见于GenBank中的序列，例如GenBank登录号Q7YRN2.1、AAC48547.1、JC4663和NP_001009418.1，及其各自的等同物。编码这些多肽的多核苷酸可以被转导到细胞中。所述多核苷酸可以是用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号、增强子以及用于转导和表达的载体。单链TCR是本领域已知的。单链TCR的非限制性实例公开于WO1996018105和US20120252742，及其各自的等同物，其中每一篇均通过引用整体并入。使用本领域已知的方法将编码这些蛋白质的多核苷酸转导到细胞中，并且进一步包括用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号、增强子以及用于转导和表达的载体。
在一方面，所述TCR是如WO 1996018105和US 2012/02522742中公开的单链TCR。编码这些多肽的多核苷酸可以被转导到细胞中。所述多核苷酸可以是用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号、增强子以及用于转导和表达的载体。
在某些实施方案中，用于本文所述的方法和细胞系的重组TCR包含TCRα链和TCRβ链。在某些实施方案中，TCRα链和TCRβ链被分别翻译。在某些实施方案中，TCRα链和TCRβ链被翻译成单个多肽。在某些实施方案中，TCRα链和TCRβ链被翻译成作为单链TCR的单个多肽。在某些实施方案中，TCRα链和TCRβ链被翻译成在TCRα链与TCRβ链之间包含切割位点的单个多肽。在某些实施方案中，该切割位点包含核糖体跳跃序列。在某些实施方案中，TCRα链和TCRβ链以成熟(分泌的前导序列被切割)的形式在细胞表面表达。
在某些实施方案中，TCRα链与SEQ ID NO:528、530、534、536539、541、544或546中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，并且TCRβ链与SEQ ID NO:529、531、535、537、540、542、545或547中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在某些实施方案中，TCRα链与SEQ ID NOs:528、530、534、536 539或541中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，并且TCRβ链与SEQ ID NO:529、531、535、537、540或542中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些实施方案中，所述TCR对与DRB1*0301/DRA*0101结合的人胰岛特异性葡萄糖-6-磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)氨基酸13至25(QHLQKDYRAYYTF)具有特异性。在某些实施方案中，TCRα链与SEQ ID NO:528或530中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，并且TCRβ链与SEQ ID NO:529或531中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。在某些实施方案中，TCRα链与SEQ ID NO:534或536中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，并且TCRβ链与SEQ ID NO:535或537中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在某些实施方案中，TCR对与DRB1*0401/DRA*0101结合的人前胰岛素原氨基酸76至90(SLQPLALEGSLQKRG)具有特异性。在某些实施方案中，TCRα链与SEQ ID NO:539或541中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同，并且TCRβ链与SEQ ID NO:540或542中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同。
在进一步的方面，编码TCRα和TCRβ的多核苷酸进一步编码核糖体跳跃序列，该序列的非限制性实例包括但不限于2A核糖体跳跃序列(例如，P2A、E2A、F2A或T2A)或包含IRES序列。因此，在一方面，该核糖体跳跃序列包括P2A、E2A、F2A或T2A核糖体跳跃序列。在一些实施方案中，2A核糖体跳跃序列包含共有基序Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro，其中X代表任意氨基酸。2A肽序列的非限制性实例在示例性序列表中提供。所述多核苷酸可进一步包含启动子和/或增强子序列。核糖体跳跃序列的实例可见于WO 2013/057586中，其通过引用而并入。
表3和表4提供了IRES序列和核糖体跳跃序列的非限制性实例。
在某些实施方案中，TCRα链和TCRβ链作为单个多肽产生，并且TCRα链和TCRβ链被具有SEQ ID NO:456至523中任一个所示的氨基酸序列的核糖体跳跃序列隔开。在某些实施方案中，该单个多肽包含与SEQ ID NO:524、526或543中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，该单个多肽包含与SEQ IDNO:524、526中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，该单个多肽包含与SEQ ID NO:524中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，该单个多肽包含与SEQ ID NO:526中的任何一个至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，TCRα链和TCRβ链由单个多核苷酸编码，并且该多核苷酸在TCRα链与TCRβ链之间包含IRES序列。在某些实施方案中，该IRES序列包含SEQ ID NO:524至526中的任何一个所示的核苷酸序列。在某些实施方案中，TCRα链和/或TCRβ链由与SEQ ID NO:532或557至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同源的多核苷酸编码。该多核苷酸可以稳定地整合到细胞的基因组中。
在本文所述的效力测定中使用的细胞所表达的TCR可以对自身免疫或炎性疾病相关抗原具有特异性。在某些实施方案中，该自身免疫或疾病相关抗原是与MHC分子结合的多肽。在某些实施方案中，该自身免疫或疾病相关抗原是与MHC I类分子结合的多肽。在某些实施方案中，该自身免疫或疾病相关抗原是与MHC II类分子结合的多肽。在某些实施方案中，所述TCR与表1中所示的任何多肽抗原结合。
在本文所述的效力测定中使用的细胞所表达的TCR可以对癌症抗原具有特异性。在某些实施方案中，该癌症抗原是与MHC分子结合的多肽。在某些实施方案中，该癌症抗原是与MHC I类分子结合的多肽。在某些实施方案中，该癌症抗原是与MHC II类分子结合的多肽。在某些实施方案中，该癌症抗原是表2中所示的多肽。
TCR依赖性报道分子
在一些实施方案中，所述TCR途径依赖性报道分子是TCR激活或TCR途径激活的报道分子。在一个实施方案中，该报道分子提供细胞浓度、表达、活性、定位、蛋白质修饰或蛋白质-蛋白质相互作用中的一种或多种。在一些实施方案中，该TCR途径依赖性报道分子包含以下蛋白质，基本上由以下蛋白质组成，或进一步由以下蛋白质组成：萤光素酶、β内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、分泌型胚性碱性磷酸酶(SEAP)、荧光蛋白或其组合。在一些实施方案中，该TCR途径依赖性报道分子包含以下序列，基本上由以下序列组成，或进一步由以下序列组成：活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP-1转录因子结合DNA序列或启动子或者IL-2转录因子结合DNA序列或启动子。在某些实施方案中，萤光素酶包含与SEQ ID NO:555至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。在某些实施方案中，萤光素酶由与SEQ ID NO:556至少80％、90％、95％、97％、98％、99％或100％同源的多核苷酸编码。
所述TCR依赖性报道分子被上游启动子激活。启动子的非限制性实例在本文中描述，并且包括但不限于NFAT转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP1转录因子结合DNA序列或启动子以及IL-2转录因子结合DNA序列或启动子。其它实例在示例性序列表中提供。在进一步的方面，所述多核苷酸进一步包含增强子序列。
在另一方面，所述TCR依赖性报道分子包含可定量的基因产物报道分子，或基本上由可定量的基因产物报道分子组成，或进一步由可定量的基因产物报道分子组成。可定量的基因产物报道分子的非限制性实例包括但不限于萤光素酶、β内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白或其组合。作为报道分子并入的萤光素酶序列的非限制性实例可见于GenBank(例如，GenBank登录号AAR20792.1、AAL40677.1、AAL40676.1和AAV35379.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。萤光素酶报告系统可商购获得(例如Promega目录号E1500或E4550)。其它实例在示例性序列表中提供。β内酰胺酶序列的非限制性实例可见于GenBank中(例如，GenBank登录号AMM70781.1、CAA54104.1和AAA23441.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。“CAT”的非限制性实例可见于GenBank中(例如，登录号OCR39292.1、WP_072643749.1、CUB58229.1和KIX82948.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。编码这些多肽的多核苷酸可以被转导到细胞中。CAT分析可商购获得(例如来自Thermal Fisher的FAST
Figure BDA0002309626940000531
氯霉素乙酰转移酶测定试剂盒(F-2900)。SEAP序列的非限制性实例可见于GenBank中(例如，GenBank登录号ADV10306.1、AAB64404.1、EEB84921.1和EFD 70636.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。编码这些多肽的多核苷酸可以被转导到细胞中。SEAP活性可以用光度计(例如，来自Promega的Turner BioSystems Veritas Microplate Luminometer)来测量。荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(eGFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、红色荧光蛋白(RFP)，或其它任何合适的荧光蛋白，或其组合，或荧光部分或其衍生物。荧光蛋白的序列可见于GenBank中(例如GenBank登录号AFA52654.1、ACS44348.1和AAQ96629.1，及其各自的等同物)，于2017年1月12日最后一次访问。荧光蛋白启动子报道分子可商购获得(例如，TakaRa目录号631089)。
MHC共受体
经转化的细胞还表达结合MHC配体例如I类和II类MHC配体的MHC共受体。在一些实施方案中，该MHC配体包含经典MHC I类蛋白质、非经典MHC I类蛋白质、经典MHC II类蛋白质、非经典MHC II类蛋白质、MHC二聚体(Fc融合体)、MHC四聚体或MHC蛋白质的聚合形式，由其组成，或基本上由其组成。
在一方面，MHC I类共受体包含CD8复合体。CD8的示例性序列可见于GenBank中(例如，GenBank登录号AAA92533.1、AJP16706.1、AAA79217.1和1203216A，及其各自的等同物)，于2017年1月19日最后一次访问。使用本领域已知的方法将编码这些蛋白质的多核苷酸转导到细胞中。所述多核苷酸可以是用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号、增强子以及用于转导和表达的载体。
在另一方面，MHC II类共受体包含CD4分子。示例性的CD4蛋白质序列可见于GenBank中(例如GenBank登录号CAA72740.1、AMR44293.1、ACG76115.1、AAC36010.1和AAB51309.1，及其各自的等同物)，于2017年1月19日最后一次访问。使用本领域已知的方法将编码这些蛋白质的多核苷酸转导到细胞中。所述多核苷酸可以是用于在细胞表面表达的可操作地偶联的调节信号以及用于转导和表达的载体。
CD3
在进一步的方面，将编码“CD3”(分化簇3)分子的多核苷酸转导到细胞中，于是缺少内源CD3的该细胞现在表达蛋白质。在一些实施方案中，CD3包含四条不同的链，或基本上由四条不同的链组成，或由四条不同的链组成。CD3链的非限制性实例可见于GenBank中，例如GenBank登录号CAA72995.1、AAI45927.1、NP_998940.1、AAB24559.1、NP_000723.1、AEQ93556.1和EAW67366.1，及其等同物，可用于本公开中。对本领域技术人员显而易见的是，可以将编码CD3的多核苷酸可操作地连接至用于在细胞表面上表达CD3的调节元件，任选地增强子，并包括在用于表达多核苷酸的载体内。使用本领域已知的方法将编码这些蛋白质的多核苷酸转导到细胞中。
在一个实施方案中，TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体包含以下部分，或基本上由以下部分组成，或进一步由以下部分组成：α和βTCR链的一个或多个多肽，CD3γ、δ和ε多肽，和ζ链。在不同的模块中形成时，TCR/CD3复合体可以承担不同的作用。在一个实施方案中，该复合体参与抗原特异性识别。在一些实施方案中，该复合体主要通过在CD3链的胞质尾中存在基于免疫受体酪氨酸的活化基序(“ITAM”)而参与信号转导。在一些实施方案中，TCR/CD3复合体参与由抗原、超抗原或抗体(例如，受体抗体)刺激的TCR信号传导途径。在一个实施方案中，TCR/CD3复合体的外源表达促进了CD3阴性细胞中的TCR信号传导途径。
共刺激受体和/或细胞因子
在进一步的方面，用编码所选共刺激或细胞因子分子的受体的多核苷酸转导细胞。本文提供了共刺激分子和细胞因子分子的非限制性实例。
载体
可以使用载体或其它基因递送系统用如上所述的多核苷酸转导细胞。在一方面，术语“载体”是指保留感染和转导非分裂和/或缓慢分裂细胞并整合到靶细胞基因组中的能力的重组载体。在几个方面，该载体衍生自或基于野生型病毒或质粒，例如质粒。在进一步的方面，该载体衍生自或基于野生型慢病毒。这类病毒的实例包括但不限于人类免疫缺陷病毒(HIV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。或者，预期可以使用其它逆转录病毒作为载体骨架的基础，如鼠白血病病毒(MLV)。显然，根据本发明的病毒载体不必局限于特定病毒的组分。病毒载体可以包含来源于两种或更多种不同病毒的组分，并且也可以包含合成组分。可以对载体组分进行操作，以获得所需的特性，如靶细胞特异性。
本公开的重组载体可以来源于灵长类和非灵长类。灵长类慢病毒的实例包括人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒组包括原型“慢病毒”visna/maedi病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和最近描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。现有技术的重组慢病毒载体在本领域中是已知的，例如，参见美国专利6,924,123、7,056,699、7,07,993、7,419,829和7,442,551，其通过引用并入本文。
美国专利6,924,123公开了某些逆转录病毒序列促进向靶细胞基因组中的整合。该专利教导，每个逆转录病毒基因组包含被称为gag、pol和env的基因，它们编码病毒体蛋白质和酶。这些基因的两端的侧翼是被称为长末端重复序列(LTR)的区域。LTR负责原病毒整合和转录。它们还用作增强子-启动子序列。换句话说，LTR可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化借助于位于病毒基因组5'端的psi序列而发生。LTR本身是相同的序列，可以分为三个元件，分别称为U3、R和U5。U3衍生自对RNA 3'端独特的序列。R衍生自在RNA两端均重复的序列，而U5衍生自对RNA 5'端独特的序列。在不同的逆转录病毒之间，这三个元件的大小可能会有很大差异。对于病毒基因组，聚(A)添加(终止)位点在右侧LTR中的R和U5之间的边界处。U3包含原病毒的大多数转录控制元件，其中包括对细胞转录激活蛋白以及在一些情况下对病毒转录激活蛋白有响应的启动子和多个增强子序列。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白通过蛋白水解加工为成熟蛋白质MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码逆转录酶(RT)，其包含DNA聚合酶、关联的RNA酶H和整合酶(IN)，它们介导基因组的复制。
为了产生病毒载体颗粒，载体RNA基因组在宿主细胞中从编码它的DNA构建体表达。载体基因组未编码的颗粒组分由在宿主细胞中表达的其它核酸序列(“包装系统”，其通常包括gag/pol和env基因中的任一个或两个)反式提供。可以通过瞬时转染将产生病毒载体颗粒所需的一组序列引入宿主细胞中，或者可以将它们整合到宿主细胞基因组中，或者它们可以以多种方式提供。所涉及的技术是本领域技术人员已知的。
在一个实施方案中，所述载体是病毒载体。在一个相关的实施方案中，该病毒载体选自慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体和甲病毒载体。在更进一步的实施方案中，该病毒载体是慢病毒载体。
非病毒载体可以包括质粒，该质粒包含能够在体外、体内或离体递送至靶细胞的异源多核苷酸。该异源多核苷酸可以包含目的序列，并且可以可操作地连接至一个或多个调节元件，并且可以控制目的核酸序列的转录。如本文所用的，载体不必能够在最终靶细胞或受试者中复制。
在一个实施方案中，另外的调节元件是启动子、增强子和/或启动子/增强子组合。调节编码VEGF蛋白的核酸表达的启动子可以是组成型启动子。在一方面，调节自杀基因表达的启动子是组成型启动子。组成型启动子的非限制性实例包括SFFV、CMV、PKG、MDNU3、SV40、Ef1a、UBC和CAGG。在一方面，增强子是土拨鼠后调节元件(“WPRE”)(参见，例如，Zufferey,R.等人(1999)J.Virol.73(4):2886-2992)。
在本公开中有用的启动子可以是组成型的或诱导型的。启动子的一些实例包括SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子、腺病毒主要晚期启动子、单纯疱疹病毒启动子和CMV启动子。在一个实施方案中，调节四环素激活蛋白表达的启动子是组成型启动子。在其它实施方案中，该启动子是诱导型启动子、组织特异性启动子或在时间上调节表达的启动子。在一个实施方案中，该启动子是磷酸甘油酸激酶启动子(PGK)。
在进一步的方面，所述载体进一步包含标志物或可检测标记，如编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、红色荧光蛋白(RFP)、绿色荧光蛋白(GFP)和黄色荧光蛋白(YFP)等的基因。这些可商购获得并且在技术领域中描述。
递送本发明基因的其它方法包括但不限于磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖转染、电穿孔、显微注射、原生质体融合或脂质体介导的转染。用本发明的载体转染的宿主细胞可以包括(但不限于)大肠杆菌或其它细菌、酵母、真菌、昆虫细胞(使用例如杆状病毒载体在SF9昆虫细胞中表达)，或源自小鼠、人类或其它动物(例如哺乳动物)的细胞。也可以使用由克隆DNA编码的蛋白质、融合体、多肽片段或突变体的体外表达。分子生物学领域的技术人员将会理解，众多表达系统和纯化系统可用来产生重组蛋白及其片段。
细胞群体
在一方面，本公开涉及分离的细胞的群体，包括但不限于本公开中的细胞，例如，如本文所述修饰的JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4。在另一方面，该细胞是CD3阴性细胞。CD3阴性细胞的非限制性实例包括但不限于BW5147(ATCC号TIB-472)、Nk-92(ATCC号CRL-2407)、Mino(ATCC号PTS-CRL-3000)和JeKo-1(ATCC号CRL-3006)。在一些实施方案中，该群体是基本上均质的。在另一个实施方案中，该群体是基本上异质的。在某些实施方案中，群体是多个本公开的细胞。在某些实施方案中，群体包含至少1x102至1x109个细胞，其纯度至少为50％、60％、70％、80％、95、95％、98％或99％。
监测表达
对本领域技术人员显而易见的是，被转导的多肽的有效表达可以使用本领域已知的方法来确定，例如，使用可检测的标记的抗体或其片段，其可以在转导并在细胞和细胞群体上培养后被定量或定性地监测。
制备细胞的方法
在另一方面，本公开还涉及制备分离的细胞的方法，其包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：用一种或多种多核苷酸转导分离的细胞，所述多核苷酸编码：重组T细胞受体(TCR)、TCR途径依赖性报道分子和MHC共受体。在进一步的方面，该方法进一步包括用编码TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体和/或共刺激分子和/或细胞因子的多核苷酸转导所述细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括以下步骤，基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：在一定条件下培养所述细胞，该条件有利于表达一种或多种转导的多核苷酸，例如编码重组T细胞受体(TCR)、TCR途径依赖性报道分子、结合I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)配体的共受体、可选的TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体，共刺激分子和/或细胞因子的多核苷酸。在一个实施方案中，该方法进一步包括以下步骤，基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：分离表达重组T细胞受体(TCR)、TCR途径依赖性报道分子、结合I类或II类主要组织相容性复合体(MHC)配体的共受体，和/或可选的TCR缔合的多亚基CD3链信号传导复合体，以及进一步可选的共刺激分子和/或细胞因子的细胞。在一个实施方案中，通过包括流式细胞术的方法分离所述细胞。所分离的细胞在用于扩充和持续表达所转导的多核苷酸的条件下进行培养，从而提供了细胞群体。
在某些方面，本公开涉及测定任选地偶联至纳米颗粒核心的pMHC分子的效力的体外方法。所述方法包括以下步骤，或基本上由以下步骤组成，或进一步由以下步骤组成：(a)使表达T细胞受体(TCR)和TCR途径依赖性报道分子以及结合MHC配体的共受体的转导细胞与有效量的包含pMHC的组合物接触，以及(b)检测所述TCR途径依赖性报道分子或来自所述报道分子的信号。在进一步的方面，所述细胞进一步包含CD3复合体和/或共刺激受体和/或细胞因子受体。
在另一个实施方案中，所述接触是体外的。
在一个实施方案中，所述复合体上的至少一个pMHC与TCR相互作用，其中该相互作用激活TCR依赖性途径。在一些实施方案中，所述TCR途径依赖性报道分子是TCR激活或TCR途径激活的报道分子。在一个实施方案中，该报道分子的特征包括细胞浓度、表达、活性、定位、蛋白质修饰或蛋白质-蛋白质相互作用。在一个实施方案中，该报道分子是效应细胞类型所固有的天然报道分子，其具有可检测的并与TCR激活或TCR途径激活相关的特征。在一些实施方案中，该报道分子是效应细胞类型外源的人工报道分子，其具有可检测的特征并与TCR激活或TCR途径激活相关的特征。
在一些实施方案中，所述分离的细胞如上所述，例如包含JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4或原代T细胞中的一种或多种的效应细胞。CD3阴性细胞的非限制性实例包括但不限于BW5147(ATCC号TIB-472)、Nk-92(ATCC号CRL-2407)、Mino(ATCC号PTS-CRL-3000)和JeKo-1(ATCC号CRL-3006)。
在一个实施方案中，所述TCR途径依赖性报道分子包含以下基因，基本上由以下基因组成，或进一步由以下基因组成：编码选自萤光素酶(萤火虫或海肾(Renilla))、β内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白和可定量的基因产物的蛋白质的基因。在一些实施方案中，所述TCR途径依赖性报道分子包含以下序列，基本上由以下序列组成，或进一步由以下序列组成：活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP-1转录因子结合DNA序列或启动子或者IL-2转录因子结合DNA序列或启动子。在一个实施方案中，该报道分子包含以下基因，基本上由以下基因组成，或进一步由以下基因组成，该基因的表达在TCR途径依赖性途径的控制下。
在一个实施方案中，所述TCR关联的多亚基CD3链信号传导复合体包含以下部分，或基本上由以下部分组成，或进一步由以下部分组成：α和βTCR链的一个或多个多肽，CD3γ、δ和ε多肽，和ζ链。在不同的模块中形成时，TCR/CD3复合体可以承担不同的作用。在一个实施方案中，该复合体参与抗原特异性识别。在一些实施方案中，该复合体主要通过在CD3链的胞质尾中存在基于免疫受体酪氨酸的活化基序(“ITAM”)而参与信号转导。在一些实施方案中，TCR/CD3复合体参与由抗原、超抗原或抗体(例如，抗受体抗体)刺激的TCR信号传导途径。在一个实施方案中，TCR/CD3复合体的外源表达促进了CD3阴性细胞中的TCR信号传导途径。CD3阴性细胞的非限制性实例包括但不限于BW5147(ATCC号TIB-472)、Nk-92(ATCC号CRL-2407)、Mino(ATCC号PTS-CRL-3000)和JeKo-1(ATCC号CRL-3006)。在进一步的方面，所述细胞内源性表达细胞因子和/或单独地共刺激分子的受体。
效力测定应用
在一方面，效力测定可以测定pMHC-纳米颗粒的效力、纯度或活性。该测定可以用作例如质量控制步骤，以监测不同批或批次的pMHC-NP，以验证该批次包含能够结合T细胞和/或诱导所需免疫应答的功能性pMHC。在一方面，该效力测定可以测定pMHC-纳米颗粒的活性，该pMHC-纳米颗粒任选地包含与纳米颗粒核心偶联的一个或多个共刺激分子和/或一个或多个细胞因子，或进一步由其组成，或进一步基本上由其组成。
对于可以在所述测定中测试的纳米颗粒，每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的MHC彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的细胞因子彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的共刺激分子彼此相同或不同；和/或纳米颗粒核心的直径彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的价位彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的密度彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的共刺激分子的价位和/或密度彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的细胞因子的价位和/或密度彼此相同或不同。在一方面，测定了组合物，其中该组合物包含具有多个pMHC复合体的纳米颗粒，因而具有共刺激分子和可选的细胞因子的单独的多个纳米颗粒。如上所述，每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的MHC彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的细胞因子彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的共刺激分子彼此相同或不同；和/或纳米颗粒核心的直径彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的价位彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的pMHC复合体的密度彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的共刺激分子的价位和/或密度彼此相同或不同；和/或每个纳米颗粒核心上的细胞因子的价位和/或密度彼此相同或不同。
在某些方面，可以在所述测定中测试的纳米颗粒以包含多个本文提供的纳米颗粒复合体的组合物的形式提供。在一些实施方案中，该组合物进一步包含载体，任选地药物载体。
所述测定可用来确定任选地偶联至纳米颗粒的pMHC例如pMHC-纳米颗粒的效力。本文的术语“颗粒”、“纳米颗粒”、“微粒”、“珠子”、“微球”及其语法等同语适用于可施用于受试者的小的离散颗粒。在某些实施方案中，所述颗粒的形状基本上呈球形。如本文所用的术语“基本上呈球形”意指颗粒的形状不偏离球形超过约10％。本公开的各种已知的抗原或肽复合体可应用于所述颗粒。
非限制性地举例来说，相容的并且能够使用本文所述的效力测定进行分析的肽MHC纳米颗粒至少是WO 2008/109852、WO 2012/041968、WO 2012/062904、WO 2013144811、WO 2014/050286、WO 2015/063616、WO 2016/198932或PCT/IB2017/001508中描述的那些，其全部通过引用整体并入本文。
本文所述的效力测定可用来对来自已至少用重组TCR和途径依赖性报道分子转导的细胞的信号进行定量。信号的定量可由本领域技术人员以多种方式进行和利用。在某些实施方案中，可以对信号进行定量并将其与预设阈值进行比较，以确定纳米药物或纳米颗粒的给定制品是否通过了质量控制步骤。该阈值可以是从阴性对照定量的信号的至少约150％、200％、300％、400％、500％、600％、70％、800％、900％或1,000％。阴性对照可以是，例如，具有重组TCR且缺少定量的此类报道分子的细胞；或包含无关肽MHC复合体或不包含肽MHC复合体的纳米药物或纳米颗粒。在某些实施方案中，效力测定可用来定义特定纳米颗粒制品的IC50。
纳米颗粒核心和层组成
所述pMHC-NP的纳米颗粒核心包含例如固体核心、金属核心、树状聚体核心、聚合物胶束纳米颗粒核心、纳米棒、富勒烯、纳米壳、核壳、基于蛋白质的纳米结构或基于脂质的纳米结构，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些方面，该纳米颗粒核心是生物可吸收的和/或生物可降解的。在一些方面，该纳米颗粒核心是树状聚体纳米颗粒核心，它包含具有从核心生长的树状结构的高度分支大分子，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的方面，该树状聚体纳米颗粒核心可包含基于聚(酰胺基胺)的树状聚体或基于聚-L-赖氨酸的树状聚体，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在某些方面，该纳米颗粒核心是聚合物胶束核心，它包含装配成纳米级核壳结构的两亲性嵌段共聚物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的方面，该聚合物胶束核心包含使用聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物产生的聚合物胶束，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的方面，该纳米颗粒核心包含金属，或基本上由金属组成，或进一步由金属组成。在另一方面，该纳米颗粒核心不是脂质体。核心材料的其它实例包括但不限于标准和特制玻璃、二氧化硅、聚苯乙烯、聚酯、聚碳酸酯、丙烯酸类聚合物、聚丙烯酰胺、聚丙烯腈、聚酰胺、含氟聚合物、硅酮、纤维素、硅、金属(例如铁、金、银)、矿物质(例如，红宝石)、纳米颗粒(例如，金纳米颗粒、胶体颗粒、金属氧化物、金属硫化物、金属硒化物和磁性材料如氧化铁)及其复合材料。在一些实施方案中，氧化铁纳米颗粒核心包含铁(II，III)氧化物。该核心根据所需的性质可具有均匀的组成，或两种或更多种类别材料的复合材料。在某些方面，将使用金属纳米颗粒。这些金属颗粒或纳米颗粒可由Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si和In、其前体、它们的二元合金、它们的三元合金以及它们的金属间化合物形成。参见美国专利6,712,997，其通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，核心和层的组成(以下所述)可以变化，条件是纳米颗粒是生物相容的和生物可吸收的。该核心根据所需的性质可具有均匀的组成，或两种或更多种类别材料的复合材料。在某些方面，将使用金属纳米球。这些金属纳米颗粒可由Fe、Ca、Ga等形成。在某些实施方案中，纳米颗粒包含含有金属或金属氧化物如金或铁氧化物的核心，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在一些实施方案中，多个共刺激分子和/或多个细胞因子偶联至纳米颗粒树状聚体核心或聚合物胶束核心。
所述颗粒通常由基本上呈球形的核心和可选的一个或多个层或涂层组成。如本文所述，核心的大小和组成可以变化。除了核心以外，所述颗粒还可具有一个或多个层，以提供适合于感兴趣的应用的功能性。层(若存在)的厚度可根据具体应用的需要而不同。例如，层可以赋予有用的光学性质。
层还可以赋予化学或生物功能性，在本文中称为化学活性层或生物活性层。这些层通常施加在颗粒的外表面上，并且可向pMHC-NP赋予功能性。一个或多个层的厚度的范围通常为约0.001微米(1纳米)至约10微米或更大(取决于所需的颗粒直径)，或约1nm至5nm，或约1nm至约10nm，或约1nm至约40nm，或约15nm至约25nm，或约15nm至约20nm，以及在其中的范围。
所述层或涂层可包含生物可降解的糖或其它聚合物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。生物可降解的层的实例包括但不限于葡聚糖；聚(乙二醇)；聚(环氧乙烷)；甘露醇；基于聚乳酸(PLA)、聚乙交酯(PGA)、聚己内酯(PCL)的聚(酯)；PHB-PHV类的聚(羟基链烷酸酯)；和其它改性多糖，如淀粉、纤维素和壳聚糖。另外，该纳米颗粒可包含具有适当表面的层，该表面适合于附接用于化学结合或偶联位点的化学官能性。
可以用本领域技术人员已知的多种方式在纳米颗粒上产生层。实例包括溶胶-凝胶化学技术，如Iler,Chemistry of Silica,John Wiley&Sons,1979；Brinker和Scherer,Sol-gel Science,Academic Press,(1990)中所述。在纳米颗粒上产生层的其它方法包括表面化学和包封技术，如Partch和Brown,J.Adhesion,67:259-276,1998；Pekarek等人,Nature,367:258,(1994)；Hanprasopwattana,Langmuir,12:3173-3179,(1996)；Davies,Advanced Materials,10:1264-1270,(1998)；及其中的参考文献所述。还可以使用气相沉积技术；参见，例如，Golman和Shinohara,Trends Chem.Engin.,6:1-6,(2000)；和美国专利6,387,498。其它技术还包括逐层自装配技术，如Sukhorukov等人,Polymers Adv.Tech.,9(10-11):759-767,(1998)；Caruso等人,Macromolecules,32(7):2317-2328,(1998)；Caruso等人,J.Amer.Chem.Soc.,121(25):6039-6046,(1999)；美国专利6,103,379及其中引用的参考文献所述。
所述纳米颗粒可以包含以下组分，基本上由以下组分组成，或进一步由以下组分组成：与多个疾病相关抗原-MHC复合体偶联的纳米颗粒核心，所述复合体可用于扩充并分化T细胞群体，以及在以有效量施用于受试者时治疗疾病。在一些方面，每个纳米颗粒核心的pMHC的数目(在本文中称为纳米颗粒复合体的“价位”)具有如上所述的多个范围，并通过引用并入本文。
在一些方面，所述纳米颗粒核心是树状聚体纳米颗粒核心，其包含具有从核心生长的树状结构的高度分支大分子，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的方面，该树状聚体纳米颗粒可包含基于聚(酰胺基胺)的树状聚体或基于聚-L-赖氨酸的树状聚体，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在某些方面，该纳米颗粒核心是聚合物胶束核心，其包含装配成纳米级核壳结构的两亲性嵌段共聚物，或基本上由其组成，或进一步由其组成。在进一步的方面，该聚合物胶束核心可包含使用聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物产生的聚合物胶束，或基本上由其组成，或进一步由其组成。该树状聚体核心或聚合物胶束核心可进一步包含如本文所述的外涂层或层。
在某些实施方案中，树状聚体纳米颗粒或具有树状聚体纳米颗粒核心的纳米颗粒的具体合成方法，可能需要将金属离子提取到树状聚体的内部，随后进行化学缩减，以产生尺寸小于3nm的几乎大小单分散的颗粒，如Crooks等人,"Synthesis,Characterization,and Applications of Dendrimer-Encapsulated Nanoparticles".The Journal ofPhysical Chemistry B(109):692–704(2005)中公开的方法，其中得到的树状聚体核心组分不仅用作制备纳米颗粒的模板，而且还用于稳定纳米颗粒，使得调节溶解性成为可能，以及提供将纳米颗粒固定在固体支持物上的方法。在一些实施方案中，多个共刺激分子和/或多个细胞因子偶联至纳米颗粒树状聚体核心或聚合物胶束核心。
纳米颗粒核心的大小范围可以是约1nm至约1μm。在某些实施方案中，纳米颗粒核心的直径小于约1μm。在其它实施方案中，纳米颗粒核心的直径小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm或小于约50nm。在进一步的实施方案中，纳米颗粒核心的直径为约1nm至约10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm或100nm。在具体的实施方案中，纳米颗粒核心的直径为约1nm至约100nm；约1nm至约75nm；约1nm至约50nm；约1nm至约25nm；约1nm至约25nm；约5nm至约100nm；约5nm至约50nm；约5nm至约25nm；约15nm至约25nm；或约20nm。在一些实施方案中，纳米颗粒核心的直径为约25nm至约60nm，或约25nm至约50nm，或约20nm至约40nm，或约15nm至约50nm，或约15nm至约40nm，或约15nm至约35nm，或约15nm至约30nm，或约15nm至约25nm，或约15nm，或约20nm，或约25nm，或约30nm，或约35nm，或约40nm。
具有或不具有层的pMHC-NP的大小范围可以是直径约5nm至约1μm。在某些实施方案中，pMHC-NP复合体的直径小于约1μm或小于100nm。在其它实施方案中，pMHC-NP复合体的直径小于约500nm、小于约400nm、小于约300nm、小于约200nm、小于约100nm或小于约50nm。在进一步的实施方案中，复合体的直径为约5nm或10nm至约50nm，或约5nm至约75nm，或约5nm至约50nm，或约5nm至约60nm，或约10nm至约50nm，或约10nm至约60nm，或约10nm至约70nm，或约10nm至约75nm，或约20nm至约50nm，或约20nm至约60nm，或约20nm至约70nm，或约20nm至约75nm，或约30nm至约50nm，或约30nm至约60nm，或约30nm至约70nm，或约30nm至约75nm，或者在一方面，直径为约55nm。在具体的实施方案中，pMHC-NP复合体的直径为约35nm至约60nm，或约35nm至约70nm，或约35nm至约75nm。在一方面，pMHC-NP复合体的直径为约30nm至约50nm。
抗原-MHC复合体
所述纳米颗粒包含与抗原-MHC(pMHC)复合体偶联的具有或不具有层的纳米颗粒核心。选择抗原以供治疗特定自身免疫性疾病、变应原、传染病或癌症。
单独的多肽(例如，MHC)和抗原(例如，肽)组分通过共价或非共价结合(例如，通过氢键、离子键或疏水键)形成复合体。这类复合体的制备可能需要不同程度的操作并且这类方法是文献中公知的。在一些方面，抗原组分可通过例如将MHC与抗原组分混合而与MHC组分的口袋部分非共价缔合；这依靠MHC与抗原之间的天然结合亲和力。或者，在一些方面，可使用包括但不限于引入已知偶联剂或光亲和标记的标准程序，使MHC组分与抗原组分共价结合(参见例如，Hall等人,Biochemistry 24:5702-5711(1985))。在某些方面，抗原组分可以经由肽连接或文献中讨论的其它方法与MHC组分可操作地偶联，所述方法包括但不限于经由糖蛋白上的碳水化合物基团(包括例如α和/或β链的碳水化合物部分)附接。在特定的实施方案中，抗原组分可附接至合适的MHC分子的N-末端或C-末端。或者，在某些实施方案中，MHC复合体可通过将抗原组分的序列并入编码MHC的序列中而重组形成，使得两者均保留它们的功能性质。
多个抗原-MHC复合体可偶联至同一纳米颗粒核心；这些复合体、MHC和/或抗原可以是彼此相同或不同的，并且每个纳米颗粒核心的pMHC的数目(在本文中称为纳米颗粒复合体的“价位”)具有本文所述的多个范围。该价位的范围可以是约1个pMHC复合体比1个纳米颗粒核心(1:1)至约6000个pMHC复合体比1个纳米颗粒核心(6000:1)，或约8:1至约6000:1，或约10:1至约6000:1，或约11:1至约6000:1，或约12:1至约6000:1，或至少2:1，或至少8:1，或至少9:1，或至少10:1，或至少11:1，或至少12:1。在一些方面，该价位为约10:1至约6000:1，或约20:1至约5500:1，或约10:1至约5000:1，或约10:1至约4000:1，或约10:1至约3500:1，或约10:1至约3000:1，或约10:1至约2500:1，或约10:1至约2000:1，或约10:1至约1500:1，或约10:1至1000:1，或约10:1至约500:1，或约10:1至约100:1，或约20:1至约50:1，或约25:1至约60:1，或约30:1至约50:1，或约35:1至约45:1，或约40:1。在另一方面，每个纳米颗粒核心的pMHC复合体的价位为约10:1至约100:1，或约10:1至约1000:1，或8:1至10:1，或13:1至50:1。
申请人还发现，纳米颗粒上的pMHC密度以不依赖于剂量的方式调节pMHC-NP触发或分化TR1细胞形成的能力。密度被计算为纳米颗粒的单位表面积上复合体的数目。纳米颗粒的表面积可以在具有或不具有层的情况下测定，包括但不限于将pMHC复合体与纳米颗粒缀合的连接体。为了计算密度的目的，在纳米颗粒核心上具有或不具有外层的情况下，相关的表面积值基于不具有pMHC复合体的颗粒构建体的最终直径。
在这些方面，每个纳米颗粒的pMHC密度为约0.025pMHC/100nm2至约100pMHC/100nm2纳米颗粒核心表面积，或约0.406pMHC/100nm2至约50pMHC/100nm2，或约0.05pMHC/100nm2至约25pMHC/100nm2。在某些方面，每个纳米颗粒的pMHC密度为约0.2pMHC/100nm2至约25pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约20pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约15pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约14pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约13pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约12pMHC/100nm2，或约0.4p MHC/100nm2至约11.6pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约11.5pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约11pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约10pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约9pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约8pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约7pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约6pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约5pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约4pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约3pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约2.5pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约2pMHC/100nm2，或约0.4pMHC/100nm2至约1.5pMHC/100nm2。
在另一方面，所述纳米颗粒具有如本文所定义的pMHC密度，其为约0.4pMHC/100nm2至约1.3pMHC/100nm2，或约0.5pMHC/100nm2至约0.9pMHC/100nm2，或约0.6pMHC/100nm2至约0.8pMHC/100nm2，并且进一步其中所述纳米颗粒核心的直径为约25nm至约60nm，或约25nm至约50nm，或约20nm至约40nm，或约15nm至约50nm，或约15nm至约40nm，或约15nm至约35nm，或约15nm至约30nm，或约15nm至约25nm，或约15nm，或约20nm，或约25nm，或约30nm，或约35nm，或约40nm。在一个实施方案中，每个纳米颗粒的pMHC复合体的密度包括约0.2pMHC/100nm2纳米颗粒表面积至约0.8或10pMHC/100nm2纳米颗粒表面积。在另一方面，每个纳米颗粒的pMHC复合体的密度是约0.65pMHC/100nm2纳米颗粒表面积至约12pMHC/100nm2纳米颗粒表面积，以及本文公开的另外的密度范围，并通过引用并入本文。
在一些方面，所述pMHC复合体的分子间距离为约4nm至约300nm，或约10nm至约250nm，或约10nm至约200nm，或约10至约150nm，或约10nm至约100nm，或约10nm至约50nm，或约12nm至约30nm，或约12nm至约20nm。在一些实施方案中，所述pMHC复合体的分子间距离为约15nm至约20nm。
在一些方面，本文提供了一种包含纳米颗粒核心的复合体，其中多个疾病相关抗原-MHC(pMHC)复合体与核心偶联；该核心的直径为约15nm至约25nm；并且其中所述纳米颗粒上的pMHC密度为约0.4pMHC/100nm2至约6pMHC/100nm2纳米颗粒表面积。在一些实施方案中，该复合体进一步在纳米颗粒核心上包含外层，其中所述pMHC复合体与纳米颗粒核心和/或外层偶联，并且其中该纳米颗粒核心和外层的直径为约35nm至约75nm，或约35nm至约70nm，或约35nm至约65nm。
如本文所用的术语“可操作地偶联”或“包被”是指在靶位点例如免疫细胞处结合之前将单独的多肽(例如，MHC)和抗原(例如，肽)组分组合以形成活性复合体的情况。这包括在施用于受试者之前，在体外合成或重组表达单独的多肽复合体组分并随后分离和组合形成复合体的情况；将嵌合或融合多肽(即，复合体的每个离散蛋白质组分被包含在单一多肽链中)合成或重组表达为完整的复合体的情况。通常，将多肽复合体添加至纳米颗粒中以产生具有吸附或偶联的多肽复合体的纳米颗粒，所述多肽复合体具有约、至少约或至多约0.1:1、0.5:1、1:1、3:1、5:1、7:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、50:1、100:1、125:1、150:1、175:1、200:1、225:1、250:1、275:1、300:1、325:1、350:1、375:1、400:1、425:1、450:1、475:1、500:1、600:1、700:1、800:1、900:1、1000:1、1500:1或更多，更通常为0.1:1、1:1至50:1或300:1，以及其间的范围的分子数:纳米颗粒数的比例，其中所述比例提供每个范围的所选终点。纳米颗粒的多肽含量可使用标准技术来确定。
抗原/MHC的MHC
如本文所用且除非明确指出，在pMHC复合体语境中的术语MHC意指经典或非经典MHC I类蛋白质和/或经典或非经典MHC II类蛋白质，HLA DR、HLA DQ、HLA DP、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、CD1d的任何基因座，或其片段或生物等同物，双链或单链构建体，二聚体(Fc融合体)、四聚体、多聚体形式，以及MHCI或MHCII的聚合形式。在一些实施方案中，pMHC可以是单链构建体。在一些实施方案中，pMHC可以是双链构建体。
在一些实施方案中，MHC蛋白质可以是二聚体或多聚体。
在一些实施方案中，MHC蛋白质可包含基于杵臼的MHC-α-Fc/MHC-β-Fc异二聚体或多聚体。
如上所述，“杵臼”是需要在第一多肽的界面处的凸起(或“杵”)和在第二多肽的界面处的相应空腔(或“臼”)的多肽架构，使得该凸起可以定位在空腔中以促进异多聚体形成。通过用较大的侧链(例如，苯丙氨酸或酪氨酸)代替第一多肽的界面处的小氨基酸侧链来构建凸起。通过用较小的氨基酸侧链(例如，丙氨酸或苏氨酸)代替大氨基酸侧链，在第二多肽的界面中创建与该凸起相同或类似大小的空腔。凸起和空腔可使用对本领域技术人员而言常规的方法通过合成手段来制备，如通过改变编码多肽的氨基酸或通过肽合成。在一些实施方案中，第一多肽的界面位于第一多肽中的Fc结构域上；第二多肽的界面位于第二多肽上的Fc结构域上。
如上所述，“MHC-α-Fc/MHC-β-Fc”是包含第一多肽和第二多肽的异二聚体，其中第一多肽包含MHC II类α链和抗体Fc结构域；第二多肽包含MHC II类β链和抗体Fc结构域。杵臼MHC-α-Fc/MHC-β-Fc进一步要求每个多肽的Fc结构域通过将一个Fc结构域上的凸起互补定位在另一个Fc结构域上的相应空腔内而相互接合。
在本公开的某些实施方案中，鉴定特定抗原并将其在合适的MHC I或II类多肽的背景中在抗原-MHC纳米颗粒复合体中呈递。向T细胞呈递抗原由两类不同的分子介导：MHCI类(MHC-I)和MHC II类(MHC-II)，它们利用不同的抗原处理途径。衍生自细胞内抗原的肽通过几乎在所有细胞上表达的MHC I类分子呈递给CD8+T细胞，而细胞外抗原衍生的肽通过MHC-II分子呈递给CD4+T细胞。然而，这种二分法存在某些例外。几项研究已经显示，由吞噬的颗粒或可溶性蛋白质产生的肽在巨噬细胞以及树突细胞中呈递在MHC-I分子上。在某些方面，可评估受试者的遗传组成，以确定哪个MHC多肽将用于特定患者和特定的肽组。在某些实施方案中，MHC 1类组分可包含HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G或CD-1分子的全部或部分，基本上由其组成，或进一步由其组成。在MHC组分是MHC II类组分的实施方案中，MHC II类组分可包含HLA-DR、HLA-DQ或HLA-DP的全部或部分，基本上由其组成，或进一步由其组成。在某些实施方案中，MHC可包含HLA DRB1、HLA DRB3、HLA DRB4、HLA DRB5、HLADQB1、HLA DQA1、IAg7、I-Ab、I-Ad、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E或CD1d。
非经典MHC分子也被考虑用于本公开的MHC复合体。在一些实施方案中，非经典MHC分子是非多态的，在物种间保守，并具有窄的、深的、疏水性的配体结合口袋。这些结合口袋能够将糖脂和磷脂呈递给自然杀伤T(NKT)细胞。NKT细胞代表共表达NK细胞标志物和半不变式T细胞受体(TCR)的独特淋巴细胞群体。它们参与与广泛范围的疾病相关的免疫应答的调节。
如上所述，当关于人MHC使用时，术语“MHC”可与术语“人白细胞抗原”(HLA)互换使用；因此，MHC是指所有HLA亚型，包括但不限于以上公开的经典MHC基因：HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，以及其所有变体、亚型、同种型以及其它生物等同物。
供根据本公开使用的MHC可通过本领域已知的技术产生、分离或纯化。用于获得MHC的常见方案包括步骤，包括但不限于电泳或基于电荷或大小的其它分离技术、生物素化或其它标记方法和纯化，或转染和诱导表达MHC蛋白质的载体构建体。纯化的动物抗体也可通过商购可得的来源获得，包括零售商如eBioscience、Biolegend和Tonbo Biosciences。
在某些实施方案中，抗原-MHC复合体的MHC可以是经典MHCI、非经典MHCI、经典MHCII、非经典MHCII、二聚体(Fc融合体)、MHC四聚体、多聚体或MHC的聚合形式。在一些实施方案中，MHC多聚体根据本领域充分记录的方法产生，参见，例如，Bakker等人"MHCMultimer Technology:Current Status and Future Prospects,"Current Opinion inImmunology,17(4):428-433(2005)及其中引用的参考文献。非限制性示例性方法包括使用生物素化剂如链霉亲和素或抗生物素蛋白来结合MHC单体，以产生具有该生物素化剂作为骨架的多聚体结构。具体地，MHC二聚体可以备选地通过与抗体恒定区或Fc区融合而产生；这可以通过直接操作性偶联或通过连接体例如半胱氨酸连接体进行操作性偶联来完成。
pMHC的抗原
尽管本文公开了抗原和抗原组分的具体实例，但是本公开不限于此。除非另有明确说明，否则本文包括分离或纯化的多肽抗原的等同物，该多肽抗原包含本文所述的氨基酸序列，或基本上由本文所述的氨基酸序列组成，或进一步由本文所述的氨基酸序列组成，或与该抗原的氨基酸序列具有至少约80％序列同一性、或至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的多肽，或由与编码该抗原的氨基酸序列的多核苷酸具有至少约80％序列同一性、或至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的多核苷酸编码的多肽，或其互补体，或由在中度至高度严格条件下与编码该抗原的氨基酸序列的多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽。还提供了编码本文公开的抗原多肽的分离和纯化的多核苷酸，或与公开的序列具有至少约80％序列同一性、或至少85％、或至少90％、或至少95％或至少98％序列同一性的氨基酸，或等同物，或在严格条件下与该多核苷酸杂交的多核苷酸、其等同物或其互补体，以及由这些多核苷酸编码的分离或纯化的多肽。所述多肽和多核苷酸可以与非天然存在的物质(在自然界中不与它们关联)例如载剂、药学上可接受的载剂、载体(vector)和MHC分子组合。除了本文公开的抗原外，还包括申请人的WO 2016/198932中公开的抗原，该文件通过引用并入本文。
经修饰的肽及其等同物
抗原多肽、蛋白质及其片段可以通过各种氨基酸缺失、插入和/或置换来修饰。在特定的实施方案中，经修饰的多肽和/或肽能够调节受试者中的免疫应答。如本文所用的，“蛋白质”或“多肽”或“肽”是指包含至少五个氨基酸残基的分子。在一些实施方案中，采用野生型形式的蛋白质或肽；然而，在本公开的许多实施方案中，利用经修饰的蛋白质或多肽来产生肽/MHC/纳米颗粒复合体。可使用肽/MHC/纳米颗粒复合体来产生免疫应答和/或修饰免疫系统的T细胞群体(即重新训练(re-educate)免疫系统)。上述术语在本文中可互换使用。“经修饰的蛋白质”或“经修饰的多肽”或“经修饰的肽”是指其化学结构、特别是其氨基酸序列相对于野生型蛋白质或多肽发生改变的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，经修饰的蛋白质或多肽或肽具有至少一种改变的活性或功能(认识到蛋白质或多肽或肽可具有多种活性或功能)。特别考虑到，在MHC/纳米颗粒复合体的背景下，经修饰的蛋白质或多肽或肽可以在一种活性或功能方面发生变化，而在其它方面保留野生型活性或功能，如免疫原性或与免疫系统的其它细胞相互作用的能力。
本公开的蛋白质可以是重组的，或者体外合成的。或者，重组蛋白可以分离自细菌或其它宿主细胞。
还应理解，氨基酸和核酸序列可包含额外的残基，如分别包含额外的N-或C-末端氨基酸，或者5’或3’核酸序列，但仍然基本如本文所公开的序列之一所示，只要所述序列满足上文给出的标准(包括保持蛋白质生物活性(例如免疫原性))即可。末端序列的添加特别适用于核酸序列，该核酸序列例如可包含位于编码区5’或3’部分中任一个的侧翼的多种非编码序列。
疾病相关抗原
所述纳米颗粒可用于如本文所述的治疗方法中。基于待治疗的疾病选择pMHC-NP的pMHC复合体以供使用。例如，糖尿病相关抗原是一种抗原或其片段，其在该自身免疫性疾病中靶向的细胞、组织或器官中表达，在由自身免疫应答引起细胞、组织或器官损伤时暴露于免疫系统，即使该抗原不是疾病过程的触发物或其发病机制中的关键参与者，并且当呈递时，该抗原产生用于治疗糖尿病的免疫应答；因此，选择符合这一定义的糖尿病相关抗原来治疗糖尿病。选择MS相关抗原来治疗MS。不选择糖尿病相关抗原来治疗MS。本文公开了非限制性的示例性疾病相关抗原，并且另外，可根据文献中充分记录的技术、机制以及方法针对特定的疾病确定这样的抗原。
感兴趣的疾病的非限制性实例包括但不限于哮喘、I型和II型糖尿病、前驱糖尿病、多发性硬化、周围神经病变、变应性哮喘、原发性胆汁性肝硬化、硬化、视神经脊髓炎谱系障碍、自身抗体相关的神经系统综合征如僵人综合征、自身免疫性脑炎、发作性睡病、寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、银屑病、舍格伦病/综合征、炎性肠病(IBD)、关节炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、ANCA相关性血管炎、古德帕斯丘综合征、川畸病、乳糜泻、自身免疫性心肌病、特发性扩张型心肌病(IDCM)、重症肌无力、自身免疫性葡萄膜炎、强直性脊柱炎、格雷夫斯病、免疫介导性肌病、抗磷脂综合征(ANCA+)、动脉粥样硬化、自身免疫性肝炎、硬化性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、皮肌炎、慢性阻塞性肺疾病、脊髓损伤、创伤性损伤、烟草诱发的肺破坏、肺气肿、天疱疮、葡萄膜炎、其它任何相关的癌症和/或中枢神经系统和周围神经系统的疾病。
示例性的抗原或抗原组分包括但不限于美国申请15/348,959中公开的那些，该文献通过引用整体并入本文。
糖尿病相关抗原
糖尿病相关抗原包括但不限于来源于PPI、IGRP、GAD、胰岛细胞自身抗原-2(ICA2)和/或胰岛素的那些抗原。自身反应性糖尿病相关抗原肽包括但不限于hInsB10-18(HLVEALYLV)、hIGRP228-236(LNIDLLWSV)、hIGRP265-273(VLFGLGFAI)、IGRP206-214(VYLKTNVFL)、hIGRP206-214(VYLKTNLFL)、NRP-A7(KYNKANAFL)、NRP-I4(KYNIANVFL)、NRP-V7(KYNKANVFL)、YAI/Db(FQDENYLYL)INS B15–23(LYLVCGERG)、PPI76-90(K88S)(SLQPLALEGSLQSRG)、IGRP13-25(QHLQKDYRAYYTF)、GAD555-567(NFFRMVISNPAAT)、GAD555-567(557I):(NFIRMVISNPAAT)、IGRP23-35(YTFLNFMSNVGDP)、B24-C36(FFYTPKTRREAED)、PPI76-90(SLQPLALEGSLQKRG)，以及美国公开2005/0202032中公开的肽和蛋白质，该文献通过引用整体并入本文。可以与本公开结合用作自身反应性肽或作为对照肽的其它肽包括但不限于INS-I9(LYLVCGERI)、TUM(KYQAVTTTL)和G6Pase(KYCLITIFL)，及其各自的等同物。其它实例包括胰岛素原L2-10,ALWMRLLPL；胰岛素原L3-11,LWMRLLPLL；胰岛素原L6-14，RLLPLLALL；胰岛素原B5-14，HLCGSHLVEA；胰岛素原B10-18，HLVEALYLV；胰岛素原B14-22，ALYLVCGER；胰岛素原B15-24，LYLVCGERGF；胰岛素原B17-25，LVCGERGFF；胰岛素原B18-27，VCGERGFFYT；胰岛素原B20-27，GERGFFYT；胰岛素原B21-29，ERGFFYTPK；胰岛素原B25-C1，FYTPKTRRE；胰岛素原B27-C5，TPKTRREAEDL；胰岛素原C20-28，SLQPLALEG；胰岛素原C25-33，ALEGSLQKR；胰岛素原C29-A5，SLQKRGIVEQ；胰岛素原A1-10，GIVEQCCTSI；胰岛素原A2-10，IVEQCCTSI；胰岛素原A12-20，SLYQLENYC，或其等同物和/或组合。与糖尿病相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
MS相关抗原
本公开的抗原包括与多发性硬化相关的抗原。这类抗原包括例如美国专利申请公开2012/0077686中公开的那些抗原，以及来源于髓鞘碱性蛋白、髓磷脂相关糖蛋白、髓磷脂少突胶质细胞蛋白、蛋白脂质蛋白、少突胶质细胞髓鞘寡聚蛋白、髓鞘相关少突胶质细胞碱性蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、热休克蛋白、少突胶质细胞特异性蛋白、NOGO A、糖蛋白Po、周围髓磷脂蛋白22或2'3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶的抗原。在某些实施方案中，该抗原来源于髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白(MOG)。
在更进一步的方面，用于治疗MS和MS相关病症的肽抗原包括但不限于：MOG35-55，MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MOG36-55，EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK；MAG287-295，SLLLELEEV；MAG509-517，LMWAKIGPV；MAG556-564，VLFSSDFRI；MBP110-118，SLSRFSWGA；MOG114-122，KVEDPFYWV；MOG166-175，RTFDPHFLRV；MOG172-180，FLRVPCWKI；MOG179-188，KITLFVIVPV；MOG188-196，VLGPLVALI；MOG181-189，TLFVIVPVL；MOG205-214，RLAGQFLEEL；PLP80-88，FLYGALLLA MAG287-295，SLLLELEEV；MAG509-517，LMWAKIGPV；MAG556-564，VLFSSDFRI，MOG97-109(TCFFRDHSYQEEA)，MOG97-109(E107S)(TCFFRDHSYQSEA)，MBP89-101(VHFFKNIVTPRTP)，PLP175-192(YIYFNTWTTCQSIAFPSK)，PLP94-108(GAVRQIFGDYKTTIC，MBP86-98(PVVHFFKNIVTPR–HLA-DRB1*1501(13mer肽)，PLP54-68(NYQDYEYLINVIHAF)，PLP249-263(ATLVSLLTFMIAATY)，MOG156-170(LVLLAVLPVLLLQIT)，MOG201-215(FLRVPCWKITLFVIV)，及其等同物和/或组合。与多发性硬化有关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
乳糜泻(CD)相关抗原
与乳糜泻相关的抗原包括但不限于来源于aGlia的那些抗原。非限制性乳糜泻相关抗原包括麦醇溶蛋白。其它非限制性示例性乳糜泻相关抗原包括：aGlia57-68：QLQPFPQPELPY(12mer肽)；aGlia62-72：PQPELPYPQPE(11mer肽)；aGlia217-219；和SGEGSFQPSQQNP(13mer肽)，其等同物和组合。与乳糜泻相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
原发性胆汁性肝硬化(PBC)相关抗原
与原发性胆汁性肝硬化相关的抗原包括但不限于来源于PDC-E2的那些抗原。示例性抗原的非限制性实例包括：PDC-E2122-135：GDLIAEVETDKATV(14mer肽)；PDC-E2249-262：GDLLAEIETDKATI(14mer肽)；PDC-E2249-263：GDLLAEIETDKATIG(15mer肽)；和PDC-E2629-643：AQWLAEFRKYLEKPI(15mer肽)，及其等同物和组合。与原发性胆汁性肝硬化相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
落叶型天疱疮(PF)和寻常型天疱疮(PV)相关抗原
与PF和PV相关的抗原包括但不限于来源于DG1EC2、桥粒芯蛋白3(DG3或DSG3)和/或桥粒芯蛋白1(DG1或DSG1)的那些抗原。非限制性实例包括：DG1EC2216-235：GEIRTMNNFLDREI(14mer肽)；DG397-111：FGIFVVDKNTGDINI(15mer肽)；和DG3251-265：CECNIKVKDVNDNFP(15mer肽)，及其等同物和组合。与落叶型天疱疮和寻常型天疱疮相有关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
视神经脊髓炎(NMO)相关抗原
与NMO相关的抗原包括但不限于来源于AQP4或水通道蛋白(aquaporina)4的那些抗原。非限制性实例包括：AQP4129-143：GAGILYLVTPPSVVG(15mer肽)；AQP4284-298：RSQVETDDLILKPGV(15mer肽)；AQP463-76：EKPLPVDMVLISLC(14mer肽)；AQP4129-143：GAGILYLVTPPSVVG(15mer肽)；和AQP439-53：TAEFLAMLIFVLLSL(15mer肽)，及其等同物和组合。与NMO相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
胶原诱发性关节炎相关抗原
与胶原诱发性关节炎相关的抗原包括但不限于来源于CII的那些抗原。非限制性实例包括：cCII230-244：APGFPGPRGPPGPQG(15mer肽)；cCII632-646：PAGFAGPPGADGQPG(15mer肽)；和CII259-273：GIAGFKGDQGPKGET(15mer肽)，或其等同物和组合。与关节炎相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
变应性哮喘相关抗原
与变应性哮喘相关的抗原包括但不限于来源于DERP1和DERP2的抗原。与变应性哮喘相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
结肠炎相关抗原
与实验性结肠炎相关的抗原包括但不限于来源于拟杆菌整合酶、Fla-2/Fla-X和YIDX的那些抗原。与结肠炎相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
系统性红斑狼疮(SLE)相关抗原
与SLE相关的抗原包括但不限于来源于H4、H2B、H1’、dsDNA、RNP、Smith(Sm)、SSA/Ro、SSB/La(SS-B)和/或组蛋白的那些抗原。非限制性实例包括每种蛋白质的以下区段：H471-94：TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG,H474-88：EHAKRKTVTAMDVVY(15mer肽)；H476-90：AKRKTVTAMDVVYAL(15mer肽)；H475-89：HAKRKTVTAMDVVYA(15mer肽)；H478-92：RKTVTAMDVVYALKR(15mer肽)；H480-94：TVTAMDVVYALKRQ(15mer肽)；H2B10-24：PKKGSKKAVTKAQKK(15mer肽)；和H2B16-30：KAVTKAQKKDGKKRK(15mer肽),H1′22-42：STDHPKYSDMIVAAIQAEKNR；和H1′27-41：KYSDMIVAAIQAEKN，及其等同物和组合。与SLE相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
高脂饮食诱发的动脉粥样硬化相关抗原
与高脂饮食诱发的动脉粥样硬化相关的抗原包括但不限于来源于ApoB的那些抗原。非限制性实例包括每种蛋白质的以下区段：ApoB3501-3516：SQEYSGSVANEANVY(15mer肽)；ApoB1952-1966：SHSLPYESSISTALE(15mer肽)；ApoB978-993：TGAYSNASSTESASY(15mer肽)；ApoB3498-3513：SFLSQEYSGSVANEA(15mer肽)；ApoB210A：KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH(20mer肽)；ApoB210B：KTTKQSFDLSVKAQY(15mer肽)；和ApoB210C：TTKQSFDLSVKAQYK(15mer肽)，及其等同物和组合。与动脉粥样硬化相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
COPD和肺气肿相关抗原
与COPD和/或肺气肿相关的抗原包括但不限于来源于弹性蛋白的那些抗原。非限制性实例包括弹性蛋白的以下区段。与COPD和/或肺气肿相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。
银屑病相关抗原
与银屑病相关的抗原包括但不限于表1中列出的抗原，及其等同物和组合。其它非限制性示例性银屑病相关抗原包括人adamis样蛋白5(ATL5)、抗菌肽(cathelicidin)抗微生物肽(CAP18)和/或ADAMTS样蛋白5(ADMTSL5)。
自身免疫性肝炎相关抗原
自身免疫性肝炎相关抗原包括但不限于表1中公开的抗原，及其等同物和组合。其它非限制性示例性自身免疫性肝炎相关抗原包括细胞色素P450 2D6(CYP2D6)和/或可溶性肝抗原(SLA)。
葡萄膜炎相关抗原
葡萄膜炎相关抗原包括但不限于表1中公开的抗原，及其等同物和组合。其它非限制性示例性葡萄膜炎相关抗原包括抑制蛋白、S-抑制蛋白、人视网膜S抗原和/或光感受器间类视黄醇结合蛋白(IRBP)。
舍格伦综合征相关抗原
舍格伦综合征相关抗原包括但不限于表1中公开的抗原，及其等同物和组合。其它非限制性示例性舍格伦综合征相关抗原包括SSA/Ro(TROVE)、SSB/La和/或毒蕈碱受体3(MR3)。
硬皮病相关抗原
硬皮病相关抗原包括但不限于着丝粒自身抗原着丝粒蛋白C(CENP-C)、DNA拓扑异构酶I(TOPI)和/或RNA聚合酶III。
抗磷脂综合征相关抗原
抗磷脂综合征相关抗原包括但不限于表1中公开的抗原，及其等同物和组合。非限制性示例性抗磷脂综合征相关抗原包括β-2-糖蛋白1(BG2P1或APOH)。
ANCA相关性血管炎相关抗原
ANCA相关性血管炎相关抗原包括但不限于表1中公开的抗原，及其等同物和组合。非限制性示例性ANCA相关性血管炎相关抗原包括髓过氧化物酶(MPO)、蛋白酶(PR3)或细菌通透性增加因子(BPI)。
Figure BDA0002309626940000791
Figure BDA0002309626940000801
Figure BDA0002309626940000811
Figure BDA0002309626940000821
Figure BDA0002309626940000831
Figure BDA0002309626940000841
Figure BDA0002309626940000851
Figure BDA0002309626940000861
Figure BDA0002309626940000871
Figure BDA0002309626940000881
Figure BDA0002309626940000891
癌症相关抗原
在某些方面，所述疾病相关抗原是癌症相关抗原。在进一步的方面，该癌症是癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和/或来自这些或其它癌症的混合类型的转移。示例性的癌症或肿瘤相关抗原包括但不限于表2中公开的那些抗原。
Figure BDA0002309626940000892
Figure BDA0002309626940000901
Figure BDA0002309626940000911
其它癌症相关抗原包括于在线数据库http://cancerimmunity.org/peptide/的表格中总结的那些抗原，并且通过引用并入本文，于2015年5月6日最后一次引用。
预期在本公开的组合物中，每ml组合物中存在约0.001mg至约10mg的总蛋白质。还考虑到如通过pMHC测定的，有效剂量为约0.0004mg/kg至约2.027mg/kg，并且范围为0.0004mg/kg至约2.027mg/kg。因此，组合物中蛋白质的浓度可以是约、至少约或至多约0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100μg/ml或mg/ml或更多(或其中可得出的任何范围)。这其中，约、至少约或至多约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％可以是肽/MHC/纳米颗粒复合体。
另外，通过引用并入本文的美国专利4,554,101(Hopp)教导了以亲水性为基础从一级氨基酸序列鉴定并制备表位。通过Hopp中公开的方法，本领域技术人员能够从氨基酸序列鉴定可能的表位，并确认它们的免疫原性。许多科学出版物也致力于从氨基酸序列分析中预测二级结构，并鉴定表位(Chou&Fasman,1974a,b；1978a,b；1979)。如果需要，可以使用这些技术中的任意技术来补充Hopp在美国专利4,554,101中的教导。
细胞因子
在某些方面，所述NP进一步包含至少一个细胞因子分子，或者基本上由至少一个细胞因子分子组成，或进一步由至少一个细胞因子分子组成。如本文所用的，术语“细胞因子”包括由免疫系统中的各种细胞分泌的低分子量蛋白质，所述蛋白质用作用于在分子和细胞水平上调节体内广泛范围的生物过程的信号分子。“细胞因子”包括属于淋巴因子、白细胞介素或趋化因子类别的单独的免疫调节蛋白质。
本文公开了非限制性实例。例如，IL-1A和IL-1B是人白细胞介素-1(IL-1)家族的两个不同成员。成熟的IL-1A是一种18kDa的蛋白质，又称成纤维细胞激活因子(FAF)、淋巴细胞激活因子(LAF)、B细胞激活因子(BAF)、白细胞内源性介质(LEM)等。IL-4是诱导T辅助细胞-2(Th2)细胞分化的细胞因子，并且与IL-13密切相关且具有与IL-13相似的功能。IL-5由Th2细胞和肥大细胞产生。IL-5用来刺激B细胞生长并增加免疫球蛋白分泌。IL-5还参与嗜酸性粒细胞激活。IL-6是可用作促炎性或抗炎性细胞因子的白细胞介素。它由T细胞和巨噬细胞分泌，以刺激对创伤或导致炎症的其它组织损伤的免疫应答。IL-6也由肌肉响应于肌肉收缩而产生。IL-8是由巨噬细胞和其它细胞类型如上皮细胞和内皮细胞产生的趋化因子，并且用作先天性免疫系统应答中免疫反应的重要介质。IL-12参与幼稚T细胞向T辅助(Th1或Th2)细胞的分化。作为异二聚体细胞因子，IL-12在由两个单独的基因IL-12A(p35)和IL-12B(p40)编码的两个亚基在蛋白质合成后二聚化之后形成。IL-12p70表示该异二聚体组合物。IL-13是由许多细胞类型、特别是Th2细胞分泌的细胞因子，是变应性炎症和疾病的重要介质。IL-17是由T辅助细胞产生的细胞因子并且由IL-23诱导，导致迟发型反应中的破坏性组织损伤。IL-17充当促炎性细胞因子，它响应于细胞外病原体对免疫系统的侵袭并诱导病原体细胞基质的破坏。IP-10或干扰素γ诱导蛋白10也被称为C-X-C基序趋化因子10(CXCL10)或小诱导型细胞因子B10。作为属于CXC趋化因子家族的小细胞因子，IP-10由几种细胞类型(包括单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞)响应于IFN-γ而分泌。巨噬细胞炎性蛋白质(MIP)属于趋化因子的家族。有两种主要形式的人MIP：MIP-1α和MIP-1β，也分别被称为趋化因子(C-C基序)配体3(CCL3)和CCL4。两者均由巨噬细胞在用细菌内毒素刺激之后产生。粒细胞集落刺激因子(G-CSF或GCSF)也被称为集落刺激因子3(CSF 3)，是一种集落刺激因子激素。G-CSF是由许多不同组织产生的糖蛋白、生长因子和细胞因子，以刺激骨髓产生粒细胞和干细胞。G-CSF还刺激嗜中性粒细胞前体和成熟嗜中性粒细胞的存活、增殖、分化和功能。表皮生长因子或EGF是一种生长因子，它通过以高亲和力与其受体EGFR结合，在调节细胞生长、增殖和分化中发挥重要作用。血管内皮生长因子(VEGF)是生长因子家族，它是参与血管发生(胚胎循环系统的从头形成)和血管生成(来自预先存在的脉管系统的血管生长)的重要信号蛋白质。
一个或多个细胞因子可以按照与pMHC复合体相同的方式与纳米颗粒偶联。在本公开的一个实施方案中，一个或多个细胞因子和pMHC复合体单独地附接至纳米颗粒。在本公开的另一个实施方案中，一个或多个细胞因子分子和pMHC复合体先复合在一起，随后与纳米颗粒复合。多个细胞因子可与纳米颗粒偶联；这些细胞因子可以是多个相同的细胞因子或不同的细胞因子。
共刺激分子组分
在某些方面，NP另外包含至少一个共刺激分子，或基本上由至少一个共刺激分子组成，或进一步由至少一个共刺激分子组成。共刺激分子是在体内产生次级信号的分子，该次级信号用于将幼稚T细胞激活成能够对具有所述特异性抗原的细胞产生免疫应答的抗原特异性T细胞。本公开不限于任何具体的共刺激分子。各种共刺激分子是本领域公知的。共刺激分子的一些非限制性实例是4-IBBL、OX40L、CD40、IL-15/IL-15Ra、CD28、CD80、CD86、CD30L和ICOSL。只有一种特定的共刺激分子可以与一个纳米颗粒偶联，或者多种共刺激分子可以与相同的纳米颗粒偶联。在某些实施方案中，该共刺激分子是蛋白质，如能够使T细胞上的共刺激受体激动的抗体。在这种情况下，该抗体能够诱导共刺激信号，该信号是激活幼稚T细胞和以抗原特异性方式诱导免疫应答所必需的。此外或者备选地，如本文所用的术语“共刺激分子”也可指能够通过对天然共刺激信号分子的激动作用产生共刺激信号的试剂，例如产生SD28共刺激反应的抗-CD28或CD28配体。在一些方面，每个纳米颗粒核心的共刺激分子的价位为约1至约6000，并且/或者每个纳米颗粒核心的共刺激分子的价位为约1至约6000。
组合物
在某些方面，本文提供了包含多个本文提供的复合体的组合物。在一些实施方案中，该组合物进一步包含载体，任选地药物载体。在一些实施方案中，本文提供的组合物可任选地包含与一个或多个共刺激分子和/或细胞因子偶联的一个或多个纳米颗粒核心。因此，在一些实施方案中，该组合物包含以下组分，或基本上由以下组分组成，或进一步由以下组分组成：1)与多个抗原-MHC复合体偶联的多个纳米颗粒核心，其中该纳米颗粒核心的至少一部分进一步包含一个或多个共刺激分子和/或一个或多个细胞因子，且该纳米颗粒核心的第二部分不进一步包含共刺激分子和/或细胞因子，以及2)与一个或多个共刺激分子和/或细胞因子偶联的多个纳米颗粒核心。
纳米颗粒和复合体的制备方法
pMHC-NP和纳米颗粒可以通过例如WO 2008/109852、WO 2012/041968、WO 2012/062904、WO 2013144811、WO 2014/050286、WO 2015/063616、WO 2016/198932或PCT/IB2017/001508中描述的多种方法来制备。
实施例
给出以下实施例是为了说明本公开的多种实施方案的目的，而并非意图以任何方式限制本公开。本领域技术人员将容易理解，本公开非常适合于实现所述目标并且获得所提及的目的和优点以及本文固有的那些目标、目的和优点。本发明的实施例以及本文描述的方法目前代表了实施方案，并且是示例性的，并非旨在限制本公开的范围。本领域技术人员将会想到包含在由权利要求的范围限定的本公开的精神内的变化和其它用途。
方法
小鼠。NOD/Lt小鼠来自Jackson Lab(Bar Harbor,ME)。17.4α/8.3β(8.3-NOD)和BDC2.5-NOD小鼠(分别表达IGRP206-214或NRP-V7/Kd和2.5mi/IAg7的转基因T细胞受体)已有描述19,20,21。
pMHC产生。使用两种不同的方法表达重组pMHC I类复合体。第一种方法涉及在肽的存在下重新折叠在细菌中表达的MHC I类重链和轻链，随后通过凝胶过滤和阴离子交换色谱法进行纯化22,23。第二种方法涉及在无支原体慢病毒转导的自由式中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中以高产率将MHC I类复合体表达为单链构建体，其中肽编码序列、MHC I类轻链和重链依次用柔性甘氨酸-丝氨酸(GS)连接体24栓接，随后是羧基末端连接体，其编码BirA位点和6xHis和strep标签，结束于游离半胱氨酸。使用strep标签和/或镍柱从培养上清液中纯化分泌的蛋白质，并将其直接用于NP包被或使用荧光染料缀合的链霉亲和素进行生物素化以产生pMHC四聚体。
重组pMHC II类单体在用编码单顺反子信息的慢病毒转导的自由式CHO细胞中产生，其中复合体的肽-MHCα和MHCβ链被核糖体跳跃P2A序列隔开。将编码BirA位点、strep和/或6xHis标签以及游离Cys的连接体添加至构建体的羧基末端。通过镍亲和色谱法从细胞培养上清液中纯化自装配的pMHC II类复合体，并将其用于包被到NP上，或者如上所述进行处理以用于生物素化和四聚体形成。
NP合成。如(Perrault,S.D.等人(2009)Nano Lett 9(5):1909-1915)所述，通过柠檬酸钠化学还原氯金酸(HAuCl4)来合成金纳米颗粒(GNP)。简言之，在剧烈搅拌下将2mL1％的HAuCl4(Sigma Aldrich,Oakville,ON)添加至100mL H2O中，并将该溶液在油浴中加热。将6mL(对于14nm GNP)或2mL(对于40nm GNP)1％柠檬酸钠添加至沸腾的HAuCl4溶液中，将其再搅拌10min，然后冷却至室温。通过添加1μM的用羧基(-COOH)或伯胺(-NH2)基团官能化的巯基-聚乙二醇(巯基-PEG)连接体(Nanocs,MA)作为MHC的受体来稳定GNP。聚乙二醇化的GNP用水洗涤以除去游离的巯基-PEG，浓缩，并储存在水中以供进一步分析。NP密度根据比尔定律由分光光度法测量来计算。
SFP系列氧化铁(Fe3O4)NP如下产生：在表面活性剂的存在下在有机溶剂中进行乙酰丙酮铁的热分解，然后通过聚乙二醇化在水性缓冲液中提供溶剂(Xie,J.等人(2007)AdvMater 19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.78:1003-1014；Xu,C.等人(2007)Polymer International 56:821-826)。简言之，将2mmol Fe(acac)3(Sigma Aldrich)溶解于10mL二苄醚和油酰胺的混合物中，并且加热至100℃保持1小时，随后在氮气层保护下回流加热至300℃保持2小时。通过添加乙醇使合成的NP沉淀，并将其重悬于己烷中。对于氧化铁NP的聚乙二醇化，将100mg不同的多巴胺缀合的PEG(DPA-PEG，3.5kDa)连接体(JenkemTech USA)溶解于氯仿与二甲基甲酰胺(DMF)的混合物中。然后将该NP溶液(20mg Fe)添加至DPA-PEG溶液中，并在室温下搅拌4小时。通过添加己烷使聚乙二醇化的SFP NP沉淀过夜，并将其重悬于水中。通过高速离心(20,000xg，30min)去除痕量的聚集体。将单分散SFP NP储存于水中以供pMHC缀合。铁的浓度通过在2N盐酸(HCl)中在410nm下以分光光度法测定。基于SFP NP的分子结构和直径(Fe3O4；直径8+1nm)(Xie,J.等人(2007)Adv Mater 19:3163；Xie,J.等人(2006)Pure Appl.Chem.78:1003-1014)，申请人估计含有1mg铁的SFP溶液含有5x1014个NP。
申请人随后开发了一种新的氧化铁NP设计，该设计允许也是通过热分解但在一步中，形成完全不存在表面活性剂的聚乙二醇化的氧化铁NP(PF系列氧化铁NP)。在该设计中，使用PEG分子作为原位表面包被剂。在典型的反应中，将3g PEG(2kDa MW)在50mL圆底沸腾烧瓶中于100℃缓慢融化，然后与7mL苄醚和2mmol Fe(acac)3混合。将反应剧烈搅拌1小时，并在回流下加热至260℃再保持2小时。将反应混合物冷却至室温，转移至离心管中，并与30mL水混合。通过以2,000xg离心30min除去不溶物。通过Amicon-15过滤器(MWCO 100kDa，Millipore,Billerica,MA)超滤除去游离的PEG分子。对于大多数(尽管不是全部)测试的PEG分子，生成氧化铁NP。氧化铁NP的大小根据热分解反应中使用的PEG连接体的官能团而不同。可以使用磁性(MACS)柱(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)或IMag细胞分离系统(BDBioSciences,Mississauga,ON)轻松纯化NP。纯化的氧化铁NP在室温或4℃下储存在水中，没有任何可检测到的聚集。如上文针对SFP NP所述计算NP密度。
pMHC与NP的缀合。通过在1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)的存在下形成酰胺键，实现了pMHC与采用携带远端伯胺(–NH2)或羧基(-COOH)的PEG连接体产生的NP的缀合。首先将具有-COOH基团的NP(GNP-C、SFP-C和PF-C)溶解在20mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(pH 5.5)中。然后将N-羟基磺基琥珀酰亚胺钠盐(磺基-NHS；10mM)和EDC(1mM)(Thermo scientific,Waltham,MA)加入到NP溶液中。在室温下搅拌20min后，将NP溶液逐滴添加到pMHC单体溶液(在20mM硼酸盐缓冲液(pH 8.2)中)中。将混合物再搅拌4小时。为了将pMHC与NH2官能化的NP(GNP-N、SFP-N和PF-N)缀合，首先将pMHC复合体溶解在含有100mM氯化钠(NaCl)的20mM MES缓冲液(pH 5.5)中。然后将磺基-NHS(10mM)和EDC(5mM)添加到pMHC溶液中。将激活的pMHC分子添加到20mM硼酸盐缓冲液(pH 8.2)中的NP溶液中，并在室温下搅拌4小时。
为了将pMHC与马来酰亚胺官能化的NP(SFP-M和PF-M)缀合，将经过工程改造以编码游离C-末端Cys的pMHC分子与NP在含有2mM乙二胺四乙酸(EDTA)、150mM NaCl的40mM磷酸盐缓冲液(pH 6.0)中混合，并在室温下孵育过夜。通过在马来酰亚胺基团与Cys残基之间形成碳-硫键，pMHC与NP共价结合。
使用点击化学将pMHC缀合至用叠氮基(SFP-Z)官能化的NP上。对于该反应，首先将pMHC分子与二苯并环辛炔-N-羟基琥珀酰亚胺酯(DBCO-NHS，Click Chemistry Tools,Scottdale,AZ)在室温下孵育2小时。通过透析过夜除去游离的DBCO分子。然后将pMHC-DBCO缀合物与SFP-Z一起孵育2小时，从而在pMHC分子与NP之间形成三唑键。
通过用分子量截止值为300kDa的膜(Spectrum labs)，在4℃下对pH 7.4的PBS进行充分透析，去除不同pMHC-NP缀合反应中未缀合的pMHC复合体。或者，通过磁性分离来纯化pMHC缀合的氧化铁NP。通过Amicon Ultra-15装置(100kDa MWCO)超滤来浓缩缀合的NP，并保存在PBS中。
NP表征。首先通过透射电子显微镜检查(TEM，Hitachi H7650)评估未缀合的和pMHC缀合的NP的核心大小和分散度。使用动态光散射(DLS，Zetasizer,Malvern,UK)确定NP和pMHC-NP的流体动力学大小。使用小角度电子束衍射(SEBD)评价PF系列NP的氧化铁核心的化学性质。使用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)评价表面化学性质。通过非变性和变性PAGE、Bradford分析、氨基酸分析和斑点酶联免疫吸附测定(dot-ELISA)分析了pMHC缀合的NP。
傅立叶变换红外光谱法(FTIR)。使用傅里叶变换红外光谱法(FTIR)评价了PF系列氧化铁NP设计的表面化学性质。使用Nicolet FTIR分光光度计在ATR(衰减全反射)模式下获得了对照PEG和锚定在PF-NP表面上的PEG的FTIR光谱。将每个光谱记录为在4cm-1光谱分辨率下256次扫描的平均值。鉴定了PEG主链(由C-H不对称拉伸振动、C-O-C振动和CH2摇摆振动表示)及其远端pMHC-受体官能团的分子振动特征。
琼脂糖凝胶电泳。为了快速评价随聚乙二醇化或pMHC包被而变化的NP电荷的变化，将NP在0.8％琼脂糖凝胶上进行电泳。聚乙二醇化的NP迁移至负极或正极，这取决于总体表面电荷。
非变性和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。对pMHC缀合的NP进行非变性PAGE和SDS-PAGE(10％)分析，以确认在pMHC-NP制品中不存在游离的(未缀合的pMHC)，并确认在NP表面上存在完整的三分子pMHC复合体。
pMHC价位测量。为了评价缀合到单个NP上的pMHC单体的数目(pMHC价位)，申请人使用包括Bradford分析(Thermo Scientific)、氨基酸分析(水解的pMHC-NP制品中17种不同氨基酸的基于HPLC的定量)(University of Toronto)和斑点酶联免疫吸附测定(dot-ELISA)在内的不同方法测定了pMHC-NP制品的pMHC浓度，并将其值转换为pMHC分子数与NP数之比。简而言之，在“斑点ELISA”方法中，将pMHC缀合的和未缀合的NP和pMHC单体溶液(作为标准品)在PBS中系列稀释，并吸收到多孔滤板(PALL Corporation)中的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。使板在室温下半干，然后与pMHC特异性第一抗体(即，分别为用于pMHC I类包被的NP的抗-β2M和抗-Kd抗体，克隆2M2和SF1-1.1；BioLegend，San Diego,CA)一起孵育，然后与HRP缀合的或AP缀合的第二抗体一起孵育。进行酶促显色反应后，将孔的内容物转移到常规ELISA板的孔中，并使用酶标仪在450nm处测量其吸光度。由于通过这些不同方法产生的值相似，因此Bradford分析(使用未缀合的NP作为空白)成为简便易行的选择方法。
TCR/mCDA转染的JurMA细胞中的TCR信号传导。使用5’RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends，2.0版试剂盒(Thermo Fisher Scientific，Waltham,USA)和TCRα或TCRβ特异性寡核苷酸引物，从BDC2.5-CD4+T细胞来源的mRNA生成编码BDC2.5-TCR的TCRα和TCRβcDNA。将得到的PCR产物克隆到pCR8质粒中并测序。然后将全长cDNA亚克隆到逆转录病毒载体中IRES-eGFP盒的上游，作为单个开放阅读框，其中TCRα和TCRβcDNA由P2A核糖体跳跃序列隔开。
TCRα-P2A-TCRβ融合蛋白的多肽序列在下面提供的示例性序列表中提供。
编码TCRα-P2A-TCRβ融合蛋白的多核苷酸的序列在下面提供的示例性序列表中提供。
通过与产生逆转录病毒的GP+envAm12细胞系共培养，用编码鼠CD4的逆转录病毒转导人CD3+/TCRβ–JurMA报告细胞系(经工程改造以表达NFAT驱动的萤光素酶)。将转导的细胞扩充，用太平洋蓝缀合的抗-mCD4(GK1.5)(BioLegend，San Diego,CA)染色，并用BDFACSAria II(BD Biosciences,NJ)进行分选。然后用编码BDC2.5-TCRαβ和IRES-eGFP的逆转录病毒转导CD4+Jurkat/MA细胞。通过流式细胞仪对eGFP和mCD4双阳性细胞进行分选，并用PE标记的BDC2.5/IAg7pMHC四聚体进行染色以确认其特异性。
为了测量NFAT驱动的萤光素酶表达，将野生型和BDC2.5/mCD4+JurMA细胞以500,000个细胞/孔接种在48孔板中的200μl DMEM(Sigma-Aldrich，St.Louis,MO)中，其中补充有10％FBS(Sigma-Aldrich)、20mM L-谷氨酰胺(Sigma-Aldrich)、10mM丙酮酸钠(ThermoFisher Scientific，Waltham,MA)和抗生素，存在或不存在20ng/ml PMA(Sigma-Aldrich)加0.5μM离子霉素(Sigma-Aldrich)、10μg/mL抗-hCD3s mAb(OKT3，BD Biosciences)或12.5μg/mL BDC2.5/IAg7包被的PF-M。在刺激后的不同时间从孔中收集细胞，转移到96孔板中，并用PBS洗涤3次。将105个细胞转移至新的96孔板中，在20μl Cell Culture Lysis Reagent(Promega，Madison,WI)中裂解，并与100μl萤光素酶测定试剂(Promega)在不透明的白色板中孵育(Greiner Bio One International GmbH，Kremsmünster,Austria)，其中使用带有注射器的VeritasTM Microplate Luminometer(Promega)。萤光素酶活性被表示为对未刺激细胞的萤光素酶活性进行归一化的相对发光单位(RLU)。
pMHC-NP在体外的激动活性。将来自TCR转基因小鼠的FACS分选的脾CD8+或CD4+细胞(2.5x105个细胞/mL)与一系列pMHC缀合的或对照NP浓度在37℃下孵育24-48h。通过ELISA测定上清液的IFNγ。
通过在48孔板中的500μl含有抗-CD3/抗-CD28 mAb包被的珠子(LifeTechnologies；珠子与细胞之比为1:1)、PPI76-90(88S)/DRB1*0401包被的PF-M(50μg肽/MHC/ml)或相同数目的对照(Cys包被的PF-M)的完全RPMI-1640培养基中培养5x105个克隆T细胞，评估了人T细胞克隆对激动mAb和pMHC包被的NP的响应性。第2天，收集上清液以通过Luminex进行细胞因子含量分析，并收集细胞沉淀物用于RNA提取。在其它实验中，将T细胞克隆与PPI76-90(88S)/DRB1*0401包被的PF-M或Cys包被的PF-M一起孵育最多5天。在第0、2、3、4和5天收集细胞，并用于RNA提取。
pMHC-NP/细胞缀合物的透射电子显微镜检查(TEM)。使用生物素-链霉亲和素CD4+或CD8+T淋巴细胞富集试剂盒(BDC ImagTM，BD Biosciences)从TCR转基因动物中分离的BDC2.5-CD4+和8.3-CD8+T细胞(5x106/mL)与2.5mi/IAg7包被的和NRP-V7/Kd包被的PF-M NP一起在4℃下(15-20μg/mL pMHC)孵育30min。将培养物在37℃下进一步孵育指定的时间长度，用冷PBS洗涤以除去未结合的PF-M NP，固定并切片(70nm)以用Hitachi H7650进行TEM成像。
超分辨率显微镜检查。将纯化的8.3-CD8+T细胞与NRP-V7/Kd-PF-M-Alexa-647 NP一起在4℃下孵育30min或在37℃下孵育另外一小时。将细胞用冷PBS pH 7.4洗涤3次，然后在2％PFA中在冰上固定15min。洗涤后，将细胞在室温下用1μg/mL DAPI染色5min，封固，并在超分辨率显微镜(ELYRA 131，Zeiss)下观察。使用ZEN 2012软件进行图像处理和簇直径的定量分析(n＝100)。
pMHC-NP/细胞缀合物的扫描电子显微镜检查(SEM)和X射线光谱分析。如上所述制备巯基乙酸酯诱导的腹膜巨噬细胞和骨髓来源的DC。使用生物素-链霉亲和素CD4+或CD8+T淋巴细胞富集试剂盒(BD ImagTM，BD Biosciences)从BDC2.5-NOD或8.3-NOD小鼠脾脏中负选择BDC2.5-CD4+和8.3-CD8+T细胞。将细胞接种在盖玻片上，并与未缀合的或Cys缀合的PF-M、BDC2.5mi/IAg7-PF-M或NRP-V7/Kd-PF-M一起在4℃下孵育30min，进行/不进行在37℃下再孵育60或180min。孵育后，将细胞用0.05M二甲砷酸盐缓冲液(CB)pH 7.4洗涤，然后在4℃下用2.5％戊二醛固定过夜。将样本在分级乙醇中依次脱水，然后浸入六甲基二硅氮烷中3min以干燥。在XL30 SEM(Philips，Netherlands)下通过金涂覆观察样品。使用能量色散X射线光谱法(EDS)进行元素分析。
实施例1-纳米颗粒(NP)表面上的分子pMHC密度与基于pMHC的纳米药物的生物活性
为了了解肽-主要组织相容性复合体(pMHC)的价位和pMHC-纳米颗粒(NP)浓度如何影响这些化合物的生物活性，申请人比较了各种NRP-V7/Kd-NP制品瞬时激活来自T细胞受体(TCR)-转基因8.3-NOD小鼠的同源(NRP-V7/Kd/IGRP206-214特异性)CD8+T细胞的能力。如图1A所示，当在用8pMHC/NP包被的SFP-NP的存在下培养时，8.3-CD8+T细胞产生少量的干扰素γ(IFNγ)，但是响应于用较高pMHC价位包被的NP，甚至低至11pMHC/NP，在很宽的pMHC-NP或pMHC浓度范围内，产生的IFN-γ的量明显更高。该观察结果提示，对于SFP-NP的激动活性，存在pMHC价位的阈值，介于9至11pMHC/NP之间(图1A和1B)。不受理论的束缚，pMHC-NP浓度的增加可以增强具有“阈值”或“阈值上”pMHC价位的pMHC-NP的激动性质。
为了证实这一观察结果，申请人接下来使用了PF-NP，它比SFP-NP更大，因此具有更大的pMHC包被能力。与显示更高pMHC价的PF-NP(61pMHC/NP，图1C和1D，数据未示出)相比，携带13或更少pMHC/NP的pMHC-PF NP具有非常弱的生物活性或没有生物活性，直到约8x1012 NP/mL。这支持了以下想法，即激动活性所需的pMHC阈值随NP大小的增加而增加(即，从约8nm SFP-NP的>8pMHC到约20nm PF-NP的>13pMHC)。NP大小和pMHC价位对激动活性的反作用提示了pMHC密度(pMHC/NP表面积)的作用。这在图1E和1F中进一步示出，其中申请人比较了在一定的NP或pMHC浓度范围内用相似数目的pMHC包被的SFP-NP和PF-NP的生物活性(以补偿当使用相同浓度的不同大小的NP时总pMHC“负荷”的绝对差异)。
实施例2-高于阈值pMHC密度时生物活性的快速增加
这些数据提示，生物活性阈值由一个常数定义，该常数对应于NP上各个pMHC单体的间隔距离。申请人比较了不同大小的NP的最大和预期阈值结合能力，以确定pMHC-密度阈值。理论pMHC密度阈值为0.004468pMHC/nm2，对应于对于8nm NP的11个pMHC或对于20nm NP的22个pMHC。这些值对应于约16.88nm的计算分子间距离。T细胞抗原受体(TCR)复合体被认为在CD3γ-CD3ε-TCRαβ-CD3ζ-CD3ζ-TCRαβ-CD3δ-CD3ε复合体内包含最多两个TCRαβ异二聚体(Rojo,J.M.等人(1991)Immunol Today 12(10):377-378；Fernandez-Miguel,G.等人(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96(4):1547-1552)。这种结构与基于3D重建估算的TCR复合体的宽度(12nm)相匹配(Arechaga,I.等人(2010)Int Immunol 22(11):897-903)，并与计算出的pMHC间距离16.88nm相一致，以达到激动阈值。申请人计算了约3.62nm的最小可能分子间距离，这与跨TCRαβ纳米簇内各个TCR的估计距离3-6nm相吻合；这个距离将允许NP上的pMHC与T细胞上的同源TCR接近完美的对齐(图2A)。能够连接这些簇中的连续TCR异二聚体的pMHC-NP在引发TCR信号传导方面有效。这些模型解释了为什么用紧密排列的pMHC包被的小NP具有最佳的免疫学性质。pMHC密度控制Treg细胞的转化，因为它能够促进大TCR微簇的持续装配，从而导致快速、稳健和延长的TCR信号传导(图2B)。
通过在宽价位范围内比较用pMHC II类单体包被的PF-NP的TCR触发效力，检验了基于使用pMHC I类包被的NP生成的数据的假设。从BDC2.5-TCR转基因NOD小鼠中分离的CD4+T细胞响应于用最高达22个同源(BDC2.5mi/IAg7)pMHC复合体包被的PF-M NP(0.0045pMHC/nm2，图1G)产生少量IFNγ。值得注意的是，通过绘制在10和5μg pMHC/mL(剂量响应效应处于平台期的浓度)下获得的IFNγ分泌数据，响应于pMHC价位相对较小的增加——始于约22pMHC/NP(预测的阈值价位)并且止于约32pMHC/NP(0.0065pMHC/nm2，在本文中称为“最小最佳价位”)，IFNγ分泌的量级呈指数式增加(图1H)。高于该最小最佳价位的pMHC价位/密度的实质性增加不会导致显著更高的效力(图1H)。
实施例3-pMHC密度控制pMHC-NP诱导的TCR信号传导的量级
为了确定这些生物学效应是否可以用pMHC密度依赖性的TCR信号传导效率差异来解释，申请人用编码BDC2.5 TCRαβ异二聚体和鼠CD4共受体的慢病毒转导了Jurkat/MA(JurMA)人T细胞系(缺乏内源性TCRβ链表达，并携带由活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列驱动的萤光素酶报道基因)(Scholten,K.B.等人(2005)Clin Immunol 114(2):119-129)。如图1I所示，BDC2.5-TCR/mCD4-JurMA细胞对BDC2.5mi/IAg7包被的PF-M响应迅速(在2h内)、有力且持续一段时间(>24h)，与之相比，最佳浓度的激动抗人CD3εmAb或PMA/离子霉素则触发慢得多的响应，在14h时达到峰值，然后逐渐下降。值得注意的是，使用以宽范围BDC2.5mi/IAg7价位包被的PF-M NP进行的实验表明，萤光素酶表达的量级(TCR信号传导的直接读出)所遵循的动力学与使用原代BDC2.5-CD4+T细胞所见的动力学非常相似，表明阈值和阈值上pMHC密度以某种方式促进协同TCR信号传导(图1J)。
同样出乎意料的是，观察到本公开的测定呈现S形曲线(图1J)，其在以下两个方面都很好地模拟了当使用幼稚原代TCR-转基因T细胞时的pMHC-密度-响应曲线：(a)与协同信号传导效应一致的形状，以及(b)定义阈值和最小最佳密度的特定pMHC价位/密度。对于过度表达外源TCR/共受体对的转染细胞系来说，这完全是令人惊讶的。鉴于难以匹配转染的鼠TCR和CD4分子的分子数和精确的化学计量，并且考虑到宿主细胞系是人类来源的(包括其CD3链组分)，而测试的pMHC和TCR/CD4分子是鼠类来源的，本领域技术人员将从转染的细胞获得预期的线性(与S形曲线相反)响应。
实施例4-pMHC-NP在鼠同源T细胞上触发抗原受体聚簇
申请人已经证明，pMHC-NP通过直接将TCR连接在同源T细胞上，而不是通过经由专职抗原呈递细胞(APC)将pMHC递送到这些T细胞，来促进Treg细胞转化(Clemente-Casares,X.等人(2016)Nature530(7591):434-440)。上述实验揭示的pMHC密度效应，加上与其它刺激相比在pMHC-NP攻击的TCR/mCD4转染的JurMA细胞中NFAT驱动的萤光素酶的快速持续产生(图1J)，提示了pMHC-NP可能通过诱导延长的TCR连接(与低亲和力单体pMHC/TCR相互作用的瞬时性质相反)而起作用。
TCR在幼稚T细胞表面上组织成线性簇(Schamel,W.W.等人(2013)Immunol Rev251(1):13-20)或非线性装配体(Lillemeier,B.F.等人(2010)Nat Immunol 11(1):90-96)，其直径/长度最高达约200nm，并且由最多30个紧密缔合的TCR组成(纳米簇)(Zhong,L.等人(2009)PLoS One 4(6):e5945)。这些TCR装配体的纳米簇架构被认为可以增加T细胞对专职APC上的同源pMHC的物理亲合力，从而提高其功能敏感性，并促进紧密排列的TCR单元之间的协同细胞内信号传导。有证据表明，TCR纳米簇的形成是组成性的，并且早于由pMHC连接(大小通常在300-800nm的范围内，并且含有最多70个TCR)导致的TCR微簇形成(导致持续的TCR信号传导)(Lillemeier,B.F.等人(2010)Nat Immunol 11(1):90-96；Yokosuka,T.等人(2005)Nat Immunol 6(12):1253-1262；Choudhuri,K.等人(2010)FEBS Lett 584(24):4823-4831；Sherman,E.等人(2011)Immunity 35(5):705-720)。
为了深入了解上述pMHC密度效应，申请人研究了pMHC包被的NP(在阈值上pMHC密度)与同源T细胞的结合几何学和动力学。TEM研究揭示，pMHC-NP以跨越约100-150nm的若干个NP的簇(岛)结合同源CD8+或CD4+T细胞(图3A和3B)。这种结合几何学在4℃下30min内就已经看到，随后是在37℃下孵育时的簇生长(达到约400nm的直径/长度)(图3A、3B和3G)，并且终止于NP在细胞内囊泡中的内化，这在结合后约3小时就已开始(图3A和3B)。这种聚簇的接合是抗原特异性的，因为当pMHC-NP与非同源T细胞一起孵育时，既没有观察到结合，也没有观察到NP的内化(图3C)。这些结果通过超分辨率显微镜检查(图3D)和扫描电子显微镜检查(SEM)(图4A和4B)得到证实，证实了聚簇的pMHC-NP在同源T细胞表面上的存在。
综上所述，这些数据提示，pMHC-NP作为TCR纳米簇结合和微簇触发装置起作用，从而提出了该过程可能引起或至少贡献于Treg细胞转化的可能性。由于Treg转化是pMHC密度的直接函数，因此申请人研究了pMHC密度的变化是否对TCR微簇的形成有任何影响。申请人比较了以亚阈值、阈值和阈值上密度携带pMHC的BDC2.5mi-IAg7-NP制品。显著地，以亚阈值密度包被的NP与同源CD4+T细胞结合并最终被其内化，但是没有形成簇(图3E和3G)。相反，以阈值密度包被的NP容易触发簇的形成，而使用以阈值上密度包被的NP增加了这些簇的大小(图3A、3F和3G)。
以上数据表明，基于pMHC的纳米药物与同源T细胞的结合几何学解释了所观察到的pMHC密度效应。在NP表面上紧密排列的pMHC单体将促进单个NP上瞬时解离的pMHC单体的重复再接合，从而延迟TCR内化并延长单个TCR-pMHC相互作用的t1/2s(Zhong,L.等人(2009)PLoS One 4(6)：e5945；Huppa,J.B.等人(2010)Nature 463(7283):963-967)。由产生的信号传导事件触发的细胞骨架重排然后将促进近端pMHC-NP-TCR单元持续装配成大TCR微簇(Bunnell,S.C.等人(2002)J Cell Biol 158(7):1263-1275)，进一步增大了TCR信号传导的持续时间和量级(Yokosuka,T.等人(2005)Nat Immunol 6(12):1253-1262)。高pMHC密度也将促进构象变化和相关的下游信号传导事件从pMHC结合的TCR协同传播到其未结合的相邻TCR(Gil,D.等人(2002)Cell 109(7):901-912；Minguet,S.等人(2007)Immunity 26(1):43-54)，这在膜簇上的各个NP之内和之间(Martinez-Martin,N.等人(2009)ScienceSignaling 2(83):ra43)。这种解释与T细胞激活的动力学校正(McKeithan,T.W.(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92(11):5042-5046)和系列TCR接合模型(Valitutti,S.等人(1995)Nature 375(6527):148-151)均匹配。
这些化合物的意料之外的pMHC密度和抗原受体聚簇依赖性信号传导性质的发现使得能够在效力和批次释放测定中使用表达抗原受体的报告细胞系，如本文所述的那些或类似的细胞系。
实施例5-基于萤光素酶的效力测定的示例方案
在该实施例中详述了用于确定任何给定的pMHC-纳米颗粒制品的效力的示例性效力测定。在这种情况下，细胞包含在NFAT启动子控制下的萤光素酶基因。表达了鼠CD4，因为JurMA细胞是人细胞系，并且在该实施例中测定的pMHC的MHC组分是小鼠I-Ag7。预期并在随后的实施例中显示，JurMA细胞系与人MHC以及小鼠一起使用(因为JurMA细胞表现出人CD4的内源性表达)。
1.在96孔板中(一式三份)，在200μl Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Sigma-Aldrich，目录号D6429-500ML)中添加500,000个500,000BDC2.5/mCD4+JurMA细胞，该培养基中补充有10％胎牛血清(FBS)(Sigma-Aldrich，目录号F6178)，并且存在以下任一种：1)20ng/mL PMA(Sigma-Aldrich，目录号P8139)加0.5μM离子霉素(Sigma-Aldrich，目录号I3909-1ML)、10μg/mL抗-hCD3εmAb(OKT3，BD Biosciences)(作为阳性对照)；2)12.5或5.0μg/mL的pMHC包被的PF-M NP，具有10-48pMHC/NP范围内的不同价位；或3)半胱氨酸包被的NP(作为阴性对照，具有与pMHC-NP相当的铁浓度)。在具有9％CO2供应的CO2培养箱中37℃孵育过夜。作为对照，用野生型JurMA细胞复制该设置。
2.次日，将细胞以1200rpm离心5min，除去培养基。之后，添加200μL PBS并洗涤细胞3次。
3.将细胞沉淀物重悬于100μL裂解缓冲液1x(Cell Culture Lysis Reagent，Promega目录号E1531)中，并在轻轻摇动下孵育30min。
4.取出20μL裂解物，并将其转移至不透明的白色96孔板(Greiner Bio-one参考号655075)中。
5.每孔加入100μL萤光素酶测定试剂(Promega，目录号E1500)，然后立即使用VeritasTM Microplate Luminometer读取(该仪器的注射器自动向每孔添加100μL萤光素酶测定试剂。该板前进至下一个孔，以重复注入然后读取的过程)。测量产生的光持续10秒(积分时间)。延迟时间为2秒。
该方法通常适用于许多不同类型的纳米颗粒组合物的效力和活性的测定，如以下实施例所示。
实施例6-测量测定间差异
为了测量测定间差异，申请人制备了具有相同特异性的pMHC-NP(即，附接至核心的相同pMHC复合体)并测定了SD50(产生半数最大活性时的浓度，如在半对数图中所测量的)。这些实验采用以与Ag7(BDC 2.5mi)结合的GAD524-543特异性重组TCR和重组小鼠CD4转染的JurMA细胞。结果总结在图5中，并且显示目前7个实验的数据为8.91+/-1微克/mL(平均值+/-平均值的标准偏差)。申请人的测定所测试并观察到的再现性是出乎意料的，因为报道分子实际上不是TCR近端信号传导事件，并且本领域技术人员将预期比所显示的差异更大的测定间差异。然而，该数据计算显示出紧密的响应，并确定了这种定量测定更优于常规的、但较差定量或半定量的测定(例如，TCR信号传导报道分子上游的信号传导中间体的磷酸化强度的测量)。定量的优势，加上低实验间差异和导致生物活性的pMHC密度阈值的忠实再现，可以提供本公开的组成和质量之间极佳且高度灵敏的批次间比较。
实施例7-基于细胞的效力测定，用以评估抗Navacim抗体对Navacim体外T细胞刺激功能的潜在影响。
体内递送后，具有免疫能力的宿主存在针对pMHC-NP的各种组分产生体液应答的潜力。这些包括蛋白质纯化标签，如在其表面包被的pMHC单体内存在的6x His标签，以及PEG，它是pMHC-NP的结构组分。该实施例评估了针对pMHC-NP各种组分(pMHC、PEG、His标签)的抗体是否对pMHC-NP参与并诱导T细胞中TCR信号传导的能力有明显影响。先前的结果表明，人血清暴露于pMHC-NP能够阻断抗-PEG(AGP4)和抗-His(6G2A9)抗体与颗粒的结合。因此，该测定将测试在暴露于抗-His、抗-PEG或抗-MHC单克隆抗体或兔超免疫血清后，人血清预先暴露和未暴露的颗粒刺激同源JurMA T细胞的能力。
试剂和实验布置
抗-pMHC mAb
·纯化的抗小鼠/大鼠MHC II类RT1B mAb(克隆OX-6)(在PBS中1mg/mL，Bio-Rad目录号MCA46R)
·纯化的抗-PEG mAb(克隆AGP4)(在PBS中1.4mg/mL，抗PEG，目录号AGP4-PABM-A)
·纯化的抗-His标签mAb(克隆6G2A9)(在PBS中0.5mg/mL，Genscript，目录号A00186)
·纯化的小鼠IgG(克隆MOPC21)(在PBS中0.5mg/mL，BD Biosciences目录号554121)
血清
·抗-PEG超免疫兔血清
·抗-BDC2.5mi pMHC超免疫兔血清
·免疫前的兔血清
·人血清(Sigma，目录号H4522)
pMHC-NP
·BDC2.5mi-PFM-112017(Fe：2.15mg/mL，pMHC：0.97mg/mL，价位42pMHC/NP)
·Cys-PFM-111417(Fe：1.52mg/mL)
萤光素酶检测方法：
·带有细胞培养物裂解缓冲液的Promega萤火虫萤光素酶测定试剂盒(Promega目录号E1500)
·带有试剂注射器的Spectramax i3x读板光度计
按照实施例5-基于萤光素酶的效力测定的示例方案，进行效力测定。
结果
在具有或没有人血清预暴露的情况下，正如预期的，抗-MHC-II(抗-BDC2.5mi/IAg7)mAb或抗血清在体外效力测定中均能以效价依赖性方式显著抑制Navacim活性。这些处理作为阳性抑制对照被包括在内，以帮助验证该测定。
如图6A至6D所示，在具有或没有人血清预暴露的情况下，与阴性对照(小鼠IgG或兔免疫前血清)相比，采用抗-His标签、抗-PEG mAb或兔抗-PEG超免疫血清未观察到对pMHC-NP活性的抑制。在没有人血清预暴露的情况下，抗-PEG mAb实际上显示出对pMHC-NP T淋巴细胞刺激的强增强作用(可能是由于pMHC-NP复合体的五聚体结构的交联，因为抗-PEG超免疫血清中未见此现象)。Navacim预先暴露于人血清阻断了这种效应，这与我们之前的发现(血清暴露会阻断抗-PEG抗体结合)相一致。因此，Navacim暴露于人血清不会降低其在JurMA测定中的效力
实施例8-IGRP13-25/DR3 pMHC异二聚体与表达同源TCR的工程细胞系结合
测试了有cys阱的、无拉链的、杵臼IGRP13-25 pMHC-DR3异二聚体结合T细胞受体的能力。为此，使用了表达来自IGRP13-25 pMHC-DR3特异性人T细胞受体的α和β链的报告细胞系。
采用编码IGRP-TCR的逆转录病毒的JURMA-hCD4细胞系的转导方案
GP+EnvAM12包装细胞系的产生。我们用表达IGRP-TCR和GFP报道分子以及gag/pol和VSV包装构建体的逆转录病毒转染了293T细胞。三天后，收获富集VSV假型的上清液，将其等分并冷冻。通过旋转感染(2700rpm，1h)使用这些等分试样转导两亲性包装细胞系GP+envAm12(ATCC CRL-9641)。经5次旋转感染后，如果需要，针对GFP的表达来分选经转导的GP+envAm12。
用编码IGRP-TCR的逆转录病毒转导JURMA-hCD4细胞系
将3百万个经转导并分选的GP+envAm12接种到6孔板的每个孔中，最终体积为3ml。次日，将100,000个JURMA-hCD4与预接种的经转导GP+envAm12共培养，最终体积为3ml，补充有8ug/ml的聚凝胺。在两周内保持这种共培养，每隔2或3天更换培养基。共培养后，收获JURMA-hCD4细胞，通过流式细胞术进行分析，并针对高转基因表达进行分选。然后用PE标记的异二聚体对细胞进行染色。图7A描绘了作为阴性对照的未染色的细胞。图7D描绘了用无关四聚体染色的细胞，图7B描绘了由使用cys阱和亮氨酸拉链技术表达的异二聚体制备的四聚体的染色，图7C描绘了由使用cys阱和杵臼技术表达的异二聚体制备的四聚体，没有亮氨酸拉链。使用任一技术制备的异二聚体的染色都较是稳固的。这些数据表明，使用无拉链、有cys阱的杵臼技术制备的异二聚体能够结合T细胞受体。
实施例9-IGRP13-25/DR3杵臼pMHC异二聚体在体外刺激报告细胞系
使用在NFAT启动子控制下表达人IGRP13-25 TCR和萤光素酶的JurMA细胞，测试了有cys阱的、杵臼稳定的异二聚体在附接至氧化铁纳米颗粒时刺激T细胞信号传导的能力。图8A和图8B示出的这些结果表明，当附接至氧化铁纳米颗粒时，有cys阱的、杵臼稳定的异二聚体能够诱导T细胞信号传导。
应当理解，尽管已通过某些实施方案和可选的特征具体公开了本公开，但是本领域技术人员可以对本文公开的呈现在本文中的公开内容进行修改、改进和变化，而且这样的修改、改进和变化被认为在本公开的范围之内。本文提供的材料、方法和实施例代表了某些实施方案，是示例性的，并非旨在对本公开的范围进行限制。
本文已经对本公开进行了广泛且一般性的描述。落入一般性公开内容内的每个较窄的种类和亚组也构成本公开的一部分。这包括对本公开的一般性描述，遵从从该类属除去任何主题的附带条件或否定限制，而不管去除的材料是否被本文具体叙述。
此外，当以马库什组的方式描述本公开的特征或方面时，本领域技术人员将认识到，本公开也因此可以以马库什组中的任何单个成员或成员的亚组的形式进行描述。
权利要求中使用的术语“或”用来表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，但是本公开支持仅指替代方案以及“和/或”的定义。
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在整个本公开内容中，多种出版物、专利和公开的专利说明书通过标识引用作为参考。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其它参考文献都通过引用明确地整体并入本文，其程度如同各自均通过单独引用而并入。在冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。
示例性序列表
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序列表
<110> 优迪有限合伙公司
<120> 测量纳米药物中受体-配体相互作用的效力的测定
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<213> 智人
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Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gln Glu Glu Ala
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<213> 智人
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Thr Cys Phe Phe Arg Asp His Ser Tyr Gln Ser Glu Ala
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<213> 智人
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Ala Leu Ile Ile Cys Tyr Asn Trp Leu His Arg Arg Leu Ala Gly
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20
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Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr
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Pro
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Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg
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Gly Ala Val Arg Gln Ile Phe Gly Asp Tyr Lys Thr Thr Ile Cys
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Gly Ala Tyr Lys Leu Ile Gln Lys Glu Leu Gly Leu Ala Ser Ser
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Pro Lys Lys Gly Ser Lys Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys
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<210> 160
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Lys Ala Val Thr Lys Ala Gln Lys Lys Asp Gly Lys Lys Arg Lys
1 5 10 15
<210> 161
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Ser Thr Asp His Pro Lys Tyr Ser Asp Met Ile Val Ala Ala Ile Gln
1 5 10 15
Ala Glu Lys Asn Arg
20
<210> 162
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Lys Tyr Ser Asp Met Ile Val Ala Ala Ile Gln Ala Glu Lys Asn
1 5 10 15
<210> 163
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Ser Gln Glu Tyr Ser Gly Ser Val Ala Asn Glu Ala Asn Val Tyr
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Ser His Ser Leu Pro Tyr Glu Ser Ser Ile Ser Thr Ala Leu Glu
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<211> 15
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Thr Gly Ala Tyr Ser Asn Ala Ser Ser Thr Glu Ser Ala Ser Tyr
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<213> 智人
<400> 166
Ser Phe Leu Ser Gln Glu Tyr Ser Gly Ser Val Ala Asn Glu Ala
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<213> 智人
<400> 167
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Lys Asn Lys His
20
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<213> 智人
<400> 168
Lys Thr Thr Lys Gln Ser Phe Asp Leu Ser Val Lys Ala Gln Tyr
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<213> 智人
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Thr Thr Lys Gln Ser Phe Asp Leu Ser Val Lys Ala Gln Tyr Lys
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<213> 智人
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Gly Ala Leu Val Pro Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr
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<213> 智人
<400> 171
Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu
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<211> 15
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<213> 智人
<400> 172
Ala Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Leu His
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<213> 智人
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Gly Gly Val Ala Asp Ala Ala Ala Ala Tyr Lys Ala Ala Lys Ala
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<211> 15
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<213> 智人
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Val Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ile Leu His Pro Ser Arg Pro Gly
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<213> 智人
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Ala Ala Lys Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu
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Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala
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Lys Ser Ala Ala Lys Val Ala Ala Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala
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Ala Ala Gln Phe Gly Leu Val Gly Ala Ala Gly Leu Gly Gly Leu
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<213> 智人
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Lys Ala Gln Leu Arg Ala Ala Ala Gly Leu Gly Ala Gly Ile Pro
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Ser Tyr Lys Glu Ala Val Leu Arg Ala Ile Asp Gly Ile Asn Gln
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Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
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Arg Phe Ala Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Thr Pro Val Val Val Leu Asn Gly Leu Ala Ala Val Arg Glu Ala
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<213> 智人
<400> 202
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<213> 智人
<400> 203
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<213> 智人
<400> 204
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Trp Glu Lys Pro
20
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 206
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<213> 智人
<400> 207
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<213> 智人
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Glu Leu Phe Leu Phe Phe Thr Ser Leu Leu Gln His Phe Ser Phe
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<213> 智人
<400> 209
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<213> 智人
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20
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<211> 20
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Met Ile Leu His
20
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<211> 21
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Met Ile Leu His Pro
20
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<211> 15
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Gln Arg Arg Phe Ser Val Ser Thr Leu Arg Asn Leu Gly Leu Gly
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<211> 15
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<213> 智人
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Glu Ser Gly Phe Leu Arg Glu Val Leu Asn Ala Val Pro Val Leu
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<211> 15
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<213> 智人
<400> 216
Gly Lys Val Leu Arg Phe Gln Lys Ala Phe Leu Thr Gln Leu Asp
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<213> 智人
<400> 217
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<213> 智人
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Gly Lys Val Leu Arg Phe Gln Lys Ala Phe Leu Thr Gln Leu Asp
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 222
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<213> 智人
<400> 223
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<213> 智人
<400> 224
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<213> 智人
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Asn Arg Leu Asp Arg Cys Leu Lys Ala Val Arg Lys Glu Arg
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<400> 226
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<400> 229
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 智人
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Lys Glu Met Phe Ser Tyr Leu Ser Asn Gln Ile Lys Lys Leu Ser
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<213> 智人
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20
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<400> 244
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<211> 15
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<400> 249
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Lys Lys Val Tyr Val Thr Leu Thr Cys Ala Phe Arg Tyr Gly Gln
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<213> 智人
<400> 368
Val Leu Pro Ser Val Ala Met Phe Leu
1 5
<210> 369
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 369
Leu Val Leu Gly Phe Ile Ile Ala Leu
1 5
<210> 370
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 370
Lys Val Val Thr Ser Ser Phe Val Val
1 5
<210> 371
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 371
Leu Val Pro Gly Thr Lys Phe Tyr Ile
1 5
<210> 372
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 372
Leu Leu Pro Ile Arg Thr Leu Pro Leu
1 5
<210> 373
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 373
Tyr Leu Val Lys Lys Gly Thr Ala Thr
1 5
<210> 374
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 374
Ser Leu Phe Ala Glu Thr Ile Trp Val
1 5
<210> 375
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 375
Met Leu Ile Ala Met Tyr Phe Tyr Thr
1 5
<210> 376
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 376
Leu Met Trp Thr Leu Pro Val Met Leu
1 5
<210> 377
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 377
Met Leu Ile Val Tyr Ile Phe Glu Cys
1 5
<210> 378
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 378
Tyr Ile Phe Glu Cys Ala Ser Cys Ile
1 5
<210> 379
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 379
Leu Val Leu Met Leu Ile Val Tyr Ile
1 5
<210> 380
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 380
Ala Leu Cys Arg Arg Arg Ser Met Val
1 5
<210> 381
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 381
Leu Leu Ser Gly Leu Ser Leu Phe Ala
1 5
<210> 382
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 382
Phe Leu Leu Val Val Gly Leu Ile Val
1 5
<210> 383
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 383
Leu Val Val Gly Leu Ile Val Ala Leu
1 5
<210> 384
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 384
Lys Val Val Lys Ser Asp Phe Val Val
1 5
<210> 385
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 385
Thr Leu Pro Val Gln Thr Leu Pro Leu
1 5
<210> 386
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 386
Asp Leu His Val Ile Ser Asn Asp Val
1 5
<210> 387
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 387
Val Leu Val His Pro Gln Trp Val Leu
1 5
<210> 388
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 388
Phe Leu Arg Pro Gly Asp Asp Ser Ser
1 5
<210> 389
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 389
Ala Leu Gly Thr Thr Cys Tyr Ala Ser
1 5
<210> 390
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 390
Lys Leu Gln Cys Val Asp Leu His Val
1 5
<210> 391
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 391
Glu Leu Ala His Tyr Asp Val Leu Leu
1 5
<210> 392
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 392
Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu
1 5
<210> 393
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 393
Thr Leu Arg Val Asp Cys Thr Pro Leu
1 5
<210> 394
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 394
Met Met Asn Asp Gln Leu Met Phe Leu
1 5
<210> 395
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 395
Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val
1 5
<210> 396
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 396
Leu Leu His Glu Thr Asp Ser Ala Val
1 5
<210> 397
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 397
Val Leu Ala Lys Glu Leu Lys Phe Val
1 5
<210> 398
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 398
Ile Leu Leu Trp Gln Pro Ile Pro Val
1 5
<210> 399
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 399
Asp Leu Phe Gly Ile Trp Ser Lys Val
1 5
<210> 400
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 400
Pro Leu Glu Arg Phe Ala Glu Leu Val
1 5
<210> 401
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 401
Lys Gln Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val
1 5
<210> 402
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 402
Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr
1 5
<210> 403
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 403
Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala
1 5
<210> 404
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 404
Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala
1 5
<210> 405
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 405
Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu
1 5
<210> 406
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 406
Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys Val
1 5
<210> 407
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 407
Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala
1 5
<210> 408
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 408
Leu Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val
1 5
<210> 409
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 409
Leu Leu Leu Thr Val Leu Thr Val Val
1 5
<210> 410
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 410
Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu
1 5
<210> 411
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 411
Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val
1 5
<210> 412
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 412
Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu
1 5
<210> 413
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 413
Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val
1 5
<210> 414
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 414
Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val
1 5
<210> 415
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 415
Ala Leu Ala Ser Thr Ala Pro Pro Val
1 5
<210> 416
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 416
Ala Ile Leu Cys Trp Thr Phe Trp Val
1 5
<210> 417
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 417
Phe Ile Leu Met Phe Ile Val Tyr Ala
1 5
<210> 418
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 418
Leu Thr Ala Glu Cys Ile Phe Phe Val
1 5
<210> 419
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 419
Met Leu Gln Asp Asn Cys Cys Gly Val
1 5
<210> 420
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 420
Ile Leu Cys Trp Thr Phe Trp Val Leu
1 5
<210> 421
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 421
Lys Ile Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Leu
1 5
<210> 422
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 422
Phe Val Gly Ile Cys Leu Phe Cys Leu
1 5
<210> 423
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 423
Val Leu Leu Ser Val Ala Met Phe Leu
1 5
<210> 424
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 424
Leu Leu Ser Val Ala Met Phe Leu Leu
1 5
<210> 425
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 425
Ile Leu Gly Ser Leu Pro Phe Phe Leu
1 5
<210> 426
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 426
Ile Leu Asn Ala Tyr Leu Val Arg Val
1 5
<210> 427
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 427
Phe Leu Leu Val Gly Phe Ala Gly Ala
1 5
<210> 428
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 428
Asn Leu Gln Pro Gln Leu Ala Ser Val
1 5
<210> 429
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 429
Cys Met Phe Asp Ser Lys Glu Ala Leu
1 5
<210> 430
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 430
Tyr Leu Tyr Val Leu Val Asp Ser Ala
1 5
<210> 431
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 431
Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val
1 5
<210> 432
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 432
Lys Met Ala Arg Phe Ser Tyr Ser Val
1 5
<210> 433
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 433
Gly Leu Val Met Asp Glu His Leu Val
1 5
<210> 434
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 434
Phe Leu Pro Gly Cys Asp Gly Leu Val
1 5
<210> 435
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 435
Cys Met Leu Gly Ser Phe Cys Ala Cys
1 5
<210> 436
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 436
Tyr Leu Ala Phe Arg Asp Asp Ser Ile
1 5
<210> 437
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 437
Trp Leu Pro Lys Lys Cys Ser Leu Cys
1 5
<210> 438
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 438
Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Met Leu
1 5
<210> 439
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 439
Met Leu Val Gly Ile Cys Leu Ser Ile
1 5
<210> 440
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 440
Phe Glu Leu Gly Leu Val Ala Gly Leu
1 5
<210> 441
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 441
Lys Met Val Arg Phe Ser Tyr Ser Val
1 5
<210> 442
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 442
Cys Leu Asn Glu Gly Thr Cys Met Leu
1 5
<210> 443
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 443
Met Leu Ala Gly Ile Cys Leu Ser Ile
1 5
<210> 444
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 444
Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu
1 5
<210> 445
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 445
Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu
1 5
<210> 446
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 446
Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met Glu Val
1 5
<210> 447
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 447
Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val
1 5
<210> 448
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 448
Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Val
1 5
<210> 449
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 449
Ser Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val
1 5
<210> 450
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 450
Ala Ile Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile
1 5
<210> 451
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 451
Phe Ile Arg Ala His Thr Pro Tyr Ile
1 5
<210> 452
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 452
Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr
1 5
<210> 453
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 453
Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile
1 5
<210> 454
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 454
Ser His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu
1 5
<210> 455
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 455
Tyr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Ser Val
1 5
<210> 456
<211> 24
<212> PRT
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 456
Gly Ile Phe Asn Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly
20
<210> 457
<211> 25
<212> PRT
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 457
Gly Ile Phe Asn Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 458
<211> 25
<212> PRT
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 458
Arg Ile Phe Asn Ala His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ala Asp Leu Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Ile Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 459
<211> 25
<212> PRT
<213> 门哥病毒
<400> 459
His Val Phe Glu Thr His Tyr Ala Gly Tyr Phe Ser Asp Leu Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 460
<211> 25
<212> PRT
<213> Theiler脑脊髓炎病毒
<400> 460
Lys Ala Val Arg Gly Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 461
<211> 25
<212> PRT
<213> Theiler脑脊髓炎病毒
<400> 461
Arg Ala Val Arg Ala Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Met Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 462
<211> 25
<212> PRT
<213> Theiler脑脊髓炎病毒
<400> 462
Lys Ala Val Arg Gly Tyr His Ala Asp Tyr Tyr Arg Gln Arg Leu Ile
1 5 10 15
His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 463
<211> 25
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：
Theiler样病毒
<400> 463
Lys His Val Arg Glu Tyr His Ala Ala Tyr Tyr Lys Gln Arg Leu Met
1 5 10 15
His Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 464
<211> 26
<212> PRT
<213> 永安河病毒
<400> 464
Met His Ser Asp Glu Met Asp Phe Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 465
<211> 26
<212> PRT
<213> 永安河病毒
<400> 465
Met His Asn Asp Glu Met Asp Tyr Ser Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 466
<211> 26
<212> PRT
<213> 永安河病毒
<400> 466
Met His Ser Asp Glu Met Asp Phe Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 467
<211> 26
<212> PRT
<213> 永安河病毒
<400> 467
Tyr His Asp Lys Asp Met Asp Tyr Ala Gly Gly Lys Phe Leu Asn Gln
1 5 10 15
Cys Gly Asp Val Glu Thr Asn Pro Gly Pro
20 25
<210> 468
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 468
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 469
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 469
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 470
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 470
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 471
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 471
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Met Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 472
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 472
Leu Thr Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 473
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 473
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 474
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 474
Leu Leu Ser Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 475
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 475
Met Cys Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 476
<211> 19
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒
<400> 476
Leu Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 477
<211> 19
<212> PRT
<213> 马鼻炎A病毒
<400> 477
Cys Thr Asn Tyr Ser Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 478
<211> 20
<212> PRT
<213> 马鼻炎B病毒
<400> 478
Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 479
<211> 20
<212> PRT
<213> 人内源性逆转录病毒
<400> 479
Gly Ala Thr Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 480
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒1
<400> 480
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 481
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒2
<400> 481
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 482
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒3
<400> 482
Gly Pro Gly Ala Ser Ser Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 483
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒4
<400> 483
Gly Pro Gly Ala Ser Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 484
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒5
<400> 484
Gly Pro Gly Ala Ala Asn Phe Ser Leu Leu Arg Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 485
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒6
<400> 485
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 486
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒7
<400> 486
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 487
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒8
<400> 487
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Ile
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 488
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒9
<400> 488
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 489
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒10
<400> 489
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 490
<211> 22
<212> PRT
<213> 猪捷申病毒11
<400> 490
Gly Pro Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Arg Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 491
<211> 20
<212> PRT
<213> 蟋蟀麻痹病毒
<400> 491
Phe Leu Arg Lys Arg Thr Gln Leu Leu Met Ser Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 492
<211> 20
<212> PRT
<213> 果蝇C病毒
<400> 492
Glu Ala Ala Arg Gln Met Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 493
<211> 20
<212> PRT
<213> 急性蜜蜂麻痹病毒
<400> 493
Gly Ser Trp Thr Asp Ile Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 494
<211> 20
<212> PRT
<213> 急性蜜蜂麻痹病毒
<400> 494
Gly Ser Trp Thr Asp Ile Leu Leu Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 495
<211> 20
<212> PRT
<213> 急性蜜蜂麻痹病毒
<400> 495
Gly Ser Trp Thr Asp Ile Leu Leu Leu Trp Ser Gly Asp Val Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 496
<211> 20
<212> PRT
<213> 传染性蚕软化病病毒
<400> 496
Thr Arg Ala Glu Ile Glu Asp Glu Leu Ile Arg Ala Gly Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 497
<211> 20
<212> PRT
<213> 番茄不孕病毒
<400> 497
Arg Ala Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 498
<211> 20
<212> PRT
<213> 马脑病病毒
<400> 498
Gln Gly Ala Gly Arg Gly Ser Leu Val Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 499
<211> 20
<212> PRT
<213> 豆无网长管蚜病毒
<400> 499
Asn Tyr Pro Met Pro Glu Ala Leu Gln Lys Ile Ile Asp Leu Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Pro Pro
20
<210> 500
<211> 20
<212> PRT
<213> 喀什米尔蜜蜂病毒
<400> 500
Gly Thr Trp Glu Ser Val Leu Asn Leu Leu Ala Gly Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 501
<211> 20
<212> PRT
<213> 榕透翅毒蛾小RNA样病毒
<400> 501
Ala Gln Gly Trp Val Pro Asp Leu Thr Val Asp Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 502
<211> 20
<212> PRT
<213> 榕透翅毒蛾小RNA样病毒
<400> 502
Ile Gly Gly Gly Gln Lys Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 503
<211> 20
<212> PRT
<213> 茶尺蠖小核糖核酸样病毒
<400> 503
Ala Gln Gly Trp Ala Pro Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 504
<211> 20
<212> PRT
<213> 茶尺蠖小核糖核酸样病毒
<400> 504
Ile Gly Gly Gly Gln Arg Asp Leu Thr Gln Asp Gly Asp Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 505
<211> 19
<212> PRT
<213> Providence病毒
<400> 505
Val Gly Asp Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Ser Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 506
<211> 19
<212> PRT
<213> Providence病毒
<400> 506
Ser Gly Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Ala Gly Asp Val Glu Lys Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 507
<211> 19
<212> PRT
<213> Providence病毒
<400> 507
Gly Asp Pro Ile Glu Asp Leu Thr Asp Asp Gly Asp Ile Glu Lys Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 508
<211> 20
<212> PRT
<213> 牛轮状病毒
<400> 508
Ser Lys Phe Gln Ile Asp Arg Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 509
<211> 20
<212> PRT
<213> 猪轮状病毒
<400> 509
Ala Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Val Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 510
<211> 20
<212> PRT
<213> 人轮状病毒
<400> 510
Ser Lys Phe Gln Ile Asp Lys Ile Leu Ile Ser Gly Asp Ile Glu Leu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 511
<211> 20
<212> PRT
<213> 家蚕
<400> 511
Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Ile Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 512
<211> 20
<212> PRT
<213> 舞毒蛾
<400> 512
Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 513
<211> 20
<212> PRT
<213> 马尾松毛虫
<400> 513
Phe Arg Ser Asn Tyr Asp Leu Leu Lys Leu Cys Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 514
<211> 20
<212> PRT
<213> 布氏锥虫
<400> 514
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Val Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 515
<211> 20
<212> PRT
<213> 布氏锥虫
<400> 515
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 516
<211> 20
<212> PRT
<213> 布氏锥虫
<400> 516
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Met Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 517
<211> 20
<212> PRT
<213> 布氏锥虫
<400> 517
Ser Ser Ile Ile Arg Thr Lys Ile Leu Leu Ser Gly Asp Val Glu Glu
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 518
<211> 20
<212> PRT
<213> 克氏锥虫
<400> 518
Cys Asp Ala Gln Arg Gln Lys Leu Leu Leu Ser Gly Asp Ile Glu Gln
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 519
<211> 21
<212> PRT
<213> 海栖热袍菌
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 任意氨基酸
<400> 519
Tyr Ile Pro Asp Phe Gly Gly Phe Leu Val Lys Ala Asp Ser Glu Phe
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro Xaa
20
<210> 520
<211> 21
<212> PRT
<213> 支气管炎博德特菌
<400> 520
Val His Cys Ala Gly Arg Gly Gly Pro Val Arg Leu Leu Asp Lys Glu
1 5 10 15
Gly Asn Pro Gly Pro
20
<210> 521
<211> 21
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 任意氨基酸
<400> 521
Asp Leu Glu Leu Glu Thr Val Gly Ser His Gln Ala Asp Ala Glu Thr
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro Xaa
20
<210> 522
<211> 21
<212> PRT
<213> 黑腹果蝇
<220>
<221> MOD_RES
<222> (21)..(21)
<223> 任意氨基酸
<400> 522
Thr Ala Ala Asp Lys Ile Gln Gly Ser Trp Lys Met Asp Thr Glu Gly
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro Xaa
20
<210> 523
<211> 20
<212> PRT
<213> 构巢曲霉
<400> 523
Pro Ile Thr Asn Arg Pro Arg Asn Ser Gly Leu Ile Asp Thr Glu Ile
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 524
<211> 583
<212> DNA
<213> 脑心肌炎病毒
<400> 524
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggta 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataatatggc cac 583
<210> 525
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 525
ctgggcggtc aacaagtgcg ggcctggctc agcgcggggg ggcgcggaga ccgcgaggcg 60
accgggagcg gctgggttcc cggctgcgcg cccttcggcc aggccgggag ccgcgccagt 120
cggagccccc ggcccagcgt ggtccgcctc cctctgggcg tccacctgcc cggagtactg 180
ccagcgggca tgaccgaccc accaggggcg ccgccgccgg cgctcgcagg ccgcggatga 240
agaagaaaac ccggcgccgc tcgacccgga gcgaggagtt gacccggagc gaggagttga 300
ccctgagtga ggaagcgacc tggagtgaag aggcgaccca gagtgaggag gcgacccagg 360
gcgaag 366
<210> 526
<211> 92
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
寡核苷酸
<400> 526
aaaagaagga aaaagaagga aaagaaggaa aaagaaggct gcaggcggct gcagaaaaga 60
aggaaaaaga aggaaaagaa ggaaaaagaa gg 92
<210> 527
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 527
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
85 90 95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn
130 135 140
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
145 150 155 160
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met
180 185 190
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys
195 200 205
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu
210 215 220
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val
225 230 235 240
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
245 250 255
Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
260 265 270
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe
275 280 285
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
290 295 300
Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala Asn
305 310 315 320
Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys
325 330 335
Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp
340 345 350
Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile
355 360 365
Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu
370 375 380
Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val
385 390 395 400
Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Gly
405 410 415
Gly Arg Val Tyr Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser
420 425 430
Ile Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
435 440 445
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
450 455 460
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
465 470 475 480
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro
485 490 495
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
500 505 510
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
515 520 525
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
530 535 540
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
545 550 555 560
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val
565 570 575
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
580 585 590
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
595 600 605
Lys Asp Phe
610
<210> 528
<211> 281
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 528
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
85 90 95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn
130 135 140
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
145 150 155 160
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln
165 170 175
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met
180 185 190
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys
195 200 205
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu
210 215 220
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val
225 230 235 240
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
245 250 255
Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
260 265 270
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
275 280
<210> 529
<211> 308
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 529
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Gly Gly Arg Val Tyr Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Ser Ile Leu Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Phe
305
<210> 530
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 530
Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly
1 5 10 15
Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val
50 55 60
Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser
65 70 75 80
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Asn Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val
100 105 110
Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
115 120 125
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
130 135 140
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
145 150 155 160
Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
165 170 175
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
180 185 190
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
195 200 205
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
210 215 220
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
225 230 235 240
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250 255
<210> 531
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 531
Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly
1 5 10 15
Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
35 40 45
Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr
50 55 60
Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser
65 70 75 80
Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Gly Gly Arg
85 90 95
Val Tyr Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu
100 105 110
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
180 185 190
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
195 200 205
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
210 215 220
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
245 250 255
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
260 265 270
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
275 280 285
Phe
<210> 532
<211> 1622
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 532
atggccatgc tcctgggggc atcagtgctg attctgtggc ttcagccaga ctgggtaaac 60
agtcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 120
gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 180
tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 240
gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 300
ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaacaaat 360
agtggaggta gcaactataa actgacattt ggaaaaggaa ctctcttaac cgtgaatcca 420
aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 480
tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 540
gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 600
agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc 660
attattccag aagacacctt cttccccagc ccagaaagtt cctgtgatgt caagctggtc 720
gagaaaagct ttgaaacaga tacgaaccta aactttcaaa acctgtcagt gattgggttc 780
cgaatcctcc tcctgaaagt ggccgggttt aatctgctca tgacgctgcg gctgtggtcc 840
agcggctccg gagccacgaa cttctctctg ttaaagcaag caggagacgt ggaagaaaac 900
cccggtccca tgagcaacca ggtgctctgc tgtgtggtcc tttgtttcct gggagcaaac 960
accgtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 1020
gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 1080
ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 1140
gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 1200
acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtggggg acgggtctat 1260
cagccccagc attttggtga tgggactcga ctctccatcc标签aggacct gaacaaggtg 1320
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 1380
gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 1440
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacggacc cgcagcccct caaggagcag 1500
cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 1560
tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 1620
ga 1622
<210> 533
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 533
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
85 90 95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn
130 135 140
Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser
145 150 155 160
Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys
165 170 175
Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met
180 185 190
Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln
195 200 205
Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys
275 280 285
Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ser Asn Gln Val
290 295 300
Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala Asn Thr Val Asp Gly
305 310 315 320
Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly Gln Asn
325 330 335
Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met Tyr Trp
340 345 350
Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr Ser Gln
355 360 365
Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr Ser Val
370 375 380
Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser Ala Gln
385 390 395 400
Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Gly Gly Arg Val Tyr
405 410 415
Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu Glu Asp
420 425 430
Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys
435 440 445
Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg
450 455 460
Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys
465 470 475 480
Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser
485 490 495
Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe
500 505 510
Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe His Gly
515 520 525
Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr
530 535 540
Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr
545 550 555 560
Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu
565 570 575
Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Thr Leu
580 585 590
Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
595 600
<210> 534
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 534
Met Ala Met Leu Leu Gly Ala Ser Val Leu Ile Leu Trp Leu Gln Pro
1 5 10 15
Asp Trp Val Asn Ser Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln
20 25 30
Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn
35 40 45
Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys
50 55 60
Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys
65 70 75 80
Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala
85 90 95
Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala
100 105 110
Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Asn Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Lys Leu
115 120 125
Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val Asn Pro Asn Ile Gln Asn
130 135 140
Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser
145 150 155 160
Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys
165 170 175
Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met
180 185 190
Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln
195 200 205
Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr
210 215 220
Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 535
<211> 304
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 535
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Gly Gly Arg Val Tyr Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Ser Ile Leu Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
195 200 205
Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
210 215 220
Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
245 250 255
Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
260 265 270
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
275 280 285
Leu Val Ser Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
290 295 300
<210> 536
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 536
Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser Leu Ser Val Gln Glu Gly
1 5 10 15
Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr Asn Ser Met Phe Asp Tyr
20 25 30
Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu Gly Pro Thr Phe Leu Ile
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu Asp Gly Arg Phe Thr Val
50 55 60
Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser Leu His Ile Val Pro Ser
65 70 75 80
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Asn Ser Gly
85 90 95
Gly Ser Asn Tyr Lys Leu Thr Phe Gly Lys Gly Thr Leu Leu Thr Val
100 105 110
Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp
115 120 125
Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
130 135 140
Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp
145 150 155 160
Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala
165 170 175
Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys
180 185 190
Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr
195 200 205
Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn
210 215 220
Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe
225 230 235 240
Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 537
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 537
Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys Glu Gly
1 5 10 15
Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp Ala Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile Tyr Tyr
35 40 45
Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu Gly Tyr
50 55 60
Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val Thr Ser
65 70 75 80
Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Gly Gly Arg
85 90 95
Val Tyr Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg Leu Ser Ile Leu
100 105 110
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
165 170 175
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
180 185 190
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
195 200 205
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
210 215 220
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
225 230 235 240
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
245 250 255
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
260 265 270
Thr Leu Val Val Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
275 280 285
<210> 538
<211> 605
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 538
Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser
20 25 30
Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser
35 40 45
Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val
50 55 60
His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile
85 90 95
Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Gly
100 105 110
Arg Met Asp Ser Ser Tyr Lys Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Val Arg Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
210 215 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp
275 280 285
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Asp Ser Trp Thr Phe Cys Cys Val
290 295 300
Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln
305 310 315 320
Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg
325 330 335
Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asn Ser Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr
340 345 350
Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro
355 360 365
Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro
370 375 380
Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp
385 390 395 400
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Glu Gln Leu Ser Gly Asn Thr
405 410 415
Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn
420 425 430
Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu
435 440 445
Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe
450 455 460
Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val
465 470 475 480
His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala
485 490 495
Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
500 505 510
Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
515 520 525
Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro
530 535 540
Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
545 550 555 560
Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
565 570 575
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
580 585 590
Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
595 600 605
<210> 539
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 539
Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser
20 25 30
Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser
35 40 45
Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val
50 55 60
His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile
85 90 95
Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Gly
100 105 110
Arg Met Asp Ser Ser Tyr Lys Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Leu Val Arg Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu
130 135 140
Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe
145 150 155 160
Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile
165 170 175
Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn
180 185 190
Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala
195 200 205
Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu
210 215 220
Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr
225 230 235 240
Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu
245 250 255
Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser
260 265 270
Ser
<210> 540
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 540
Met Asp Ser Trp Thr Phe Cys Cys Val Ser Leu Cys Ile Leu Val Ala
1 5 10 15
Lys His Thr Asp Ala Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr
20 25 30
Glu Met Gly Gln Glu Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His
35 40 45
Asn Ser Leu Phe Trp Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu
50 55 60
Leu Ile Tyr Phe Asn Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro
65 70 75 80
Glu Asp Arg Phe Ser Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Gln Pro Ser Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Glu Gln Leu Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser
115 120 125
Trp Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val
130 135 140
Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys
195 200 205
Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg
210 215 220
Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp
225 230 235 240
Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala
245 250 255
Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln
260 265 270
Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys
275 280 285
Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met
290 295 300
Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 541
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 541
Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser Ile Gln Glu Gly Glu
1 5 10 15
Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser Ile Asn Asn Leu Gln
20 25 30
Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val His Leu Ile Leu Ile
35 40 45
Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg Leu Arg Val Thr Leu
50 55 60
Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile Thr Ala Ser Arg Ala
65 70 75 80
Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Gly Arg Met Asp Ser Ser
85 90 95
Tyr Lys Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Arg Pro Asp
100 105 110
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
115 120 125
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
130 135 140
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val
145 150 155 160
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
165 170 175
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
180 185 190
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
195 200 205
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
210 215 220
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
225 230 235 240
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
245 250
<210> 542
<211> 289
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 542
Gly Val Ile Gln Ser Pro Arg His Glu Val Thr Glu Met Gly Gln Glu
1 5 10 15
Val Thr Leu Arg Cys Lys Pro Ile Ser Gly His Asn Ser Leu Phe Trp
20 25 30
Tyr Arg Gln Thr Met Met Arg Gly Leu Glu Leu Leu Ile Tyr Phe Asn
35 40 45
Asn Asn Val Pro Ile Asp Asp Ser Gly Met Pro Glu Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Ala Lys Met Pro Asn Ala Ser Phe Ser Thr Leu Lys Ile Gln Pro Ser
65 70 75 80
Glu Pro Arg Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Glu Gln Leu
85 90 95
Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Phe Gly Glu Gly Ser Trp Leu Thr Val Val
100 105 110
Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys
165 170 175
Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
180 185 190
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
195 200 205
Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp
210 215 220
Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
225 230 235 240
Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser
245 250 255
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
260 265 270
Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp
275 280 285
Phe
<210> 543
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 543
Met His Ser Leu His Val Ser Leu Val Phe Leu Trp Leu Gln Leu Gly
1 5 10 15
Gly Val Ser Ser Gln Glu Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Thr
20 25 30
Val Pro Glu Gly Ala Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ile Ser Asp Ser
35 40 45
Ala Ser Gln Ser Ile Trp Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Lys Ala Leu Ile Ser Ile Phe Ser Asn Gly Asn Lys Lys Glu Gly Arg
65 70 75 80
Leu Thr Val Tyr Leu Asn Arg Ala Ser Leu His Val Ser Leu His Ile
85 90 95
Arg Asp Ser His Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Leu Ala Gly Ser Trp Gln Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr
115 120 125
Val Met Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys
130 135 140
Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly
180 185 190
Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe
195 200 205
Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala
210 215 220
Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser Ala Thr Asn Phe
260 265 270
Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
275 280 285
Gly Ser Ile Phe Leu Ser Cys Leu Ala Val Cys Leu Leu Val Ala Gly
290 295 300
Pro Val Asp Pro Lys Ile Ile Gln Lys Pro Lys Tyr Leu Val Ala Val
305 310 315 320
Thr Gly Ser Glu Lys Ile Leu Ile Cys Glu Gln Tyr Leu Gly His Asn
325 330 335
Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Phe Met
340 345 350
Phe Ser Tyr Ser Tyr Gln Lys Leu Met Asp Asn Gln Thr Ala Ser Ser
355 360 365
Arg Phe Gln Pro Gln Ser Ser Lys Lys Asn His Leu Asp Leu Gln Ile
370 375 380
Thr Ala Leu Lys Pro Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser Ser
385 390 395 400
Gln Gly Gly Thr Thr Asn Ser Asp Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg
405 410 415
Leu Leu Val Ile Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser
420 425 430
Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr
435 440 445
Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser
450 455 460
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro
465 470 475 480
Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu
485 490 495
Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys
500 505 510
Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly
515 520 525
Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg
530 535 540
Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser
545 550 555 560
Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala
565 570 575
Val Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn
580 585 590
Ser
<210> 544
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 544
Met His Ser Leu His Val Ser Leu Val Phe Leu Trp Leu Gln Leu Gly
1 5 10 15
Gly Val Ser Ser Gln Glu Lys Val Gln Gln Ser Pro Glu Ser Leu Thr
20 25 30
Val Pro Glu Gly Ala Met Ala Ser Leu Asn Cys Thr Ile Ser Asp Ser
35 40 45
Ala Ser Gln Ser Ile Trp Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Lys Gly Pro
50 55 60
Lys Ala Leu Ile Ser Ile Phe Ser Asn Gly Asn Lys Lys Glu Gly Arg
65 70 75 80
Leu Thr Val Tyr Leu Asn Arg Ala Ser Leu His Val Ser Leu His Ile
85 90 95
Arg Asp Ser His Pro Ser Asp Ser Ala Val Tyr Leu Cys Ala Ala Ser
100 105 110
Leu Ala Gly Ser Trp Gln Leu Ile Phe Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr
115 120 125
Val Met Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys
130 135 140
Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly
180 185 190
Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe
195 200 205
Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala
210 215 220
Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 545
<211> 306
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 545
Met Gly Ser Ile Phe Leu Ser Cys Leu Ala Val Cys Leu Leu Val Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asp Pro Lys Ile Ile Gln Lys Pro Lys Tyr Leu Val Ala
20 25 30
Val Thr Gly Ser Glu Lys Ile Leu Ile Cys Glu Gln Tyr Leu Gly His
35 40 45
Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Phe
50 55 60
Met Phe Ser Tyr Ser Tyr Gln Lys Leu Met Asp Asn Gln Thr Ala Ser
65 70 75 80
Ser Arg Phe Gln Pro Gln Ser Ser Lys Lys Asn His Leu Asp Leu Gln
85 90 95
Ile Thr Ala Leu Lys Pro Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Gln Gly Gly Thr Thr Asn Ser Asp Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr
115 120 125
Arg Leu Leu Val Ile Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val
130 135 140
Ser Leu Phe Glu Pro Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala
145 150 155 160
Thr Leu Val Cys Leu Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu
165 170 175
Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp
180 185 190
Pro Gln Ala Tyr Lys Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg
195 200 205
Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg
210 215 220
Cys Gln Val Gln Phe His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu
225 230 235 240
Gly Ser Pro Lys Pro Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly
245 250 255
Arg Ala Asp Cys Gly Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu
260 265 270
Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr
275 280 285
Ala Val Leu Val Ser Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys
290 295 300
Asn Ser
305
<210> 546
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 546
Gln Ser Pro Glu Ser Leu Thr Val Pro Glu Gly Ala Met Ala Ser Leu
1 5 10 15
Asn Cys Thr Ile Ser Asp Ser Ala Ser Gln Ser Ile Trp Trp Tyr Gln
20 25 30
Gln Asn Pro Gly Lys Gly Pro Lys Ala Leu Ile Ser Ile Phe Ser Asn
35 40 45
Gly Asn Lys Lys Glu Gly Arg Leu Thr Val Tyr Leu Asn Arg Ala Ser
50 55 60
Leu His Val Ser Leu His Ile Arg Asp Ser His Pro Ser Asp Ser Ala
65 70 75 80
Val Tyr Leu Cys Ala Ala Ser Leu Ala Gly Ser Trp Gln Leu Ile Phe
85 90 95
Gly Ser Gly Thr Gln Leu Thr Val Met Pro Asp Ile Gln Asn Pro Glu
100 105 110
Pro Ala Val Tyr Gln Leu Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu
115 120 125
Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met
130 135 140
Glu Ser Gly Thr Phe Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala
145 150 155 160
Met Asp Ser Lys Ser Asn Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser
165 170 175
Phe Thr Cys Gln Asp Ile Phe Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser
180 185 190
Ser Asp Val Pro Cys Asp Ala Thr Leu Thr Glu Lys Ser Phe Glu Thr
195 200 205
Asp Met Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Met Gly Leu Arg Ile
210 215 220
Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu
225 230 235 240
Trp Ser Ser
<210> 547
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 547
Lys Ile Ile Gln Lys Pro Lys Tyr Leu Val Ala Val Thr Gly Ser Glu
1 5 10 15
Lys Ile Leu Ile Cys Glu Gln Tyr Leu Gly His Asn Ala Met Tyr Trp
20 25 30
Tyr Arg Gln Ser Ala Lys Lys Pro Leu Glu Phe Met Phe Ser Tyr Ser
35 40 45
Tyr Gln Lys Leu Met Asp Asn Gln Thr Ala Ser Ser Arg Phe Gln Pro
50 55 60
Gln Ser Ser Lys Lys Asn His Leu Asp Leu Gln Ile Thr Ala Leu Lys
65 70 75 80
Pro Asp Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Gln Gly Gly Thr
85 90 95
Thr Asn Ser Asp Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Leu Val Ile
100 105 110
Glu Asp Leu Arg Asn Val Thr Pro Pro Lys Val Ser Leu Phe Glu Pro
115 120 125
Ser Lys Ala Glu Ile Ala Asn Lys Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu
130 135 140
Ala Arg Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn
145 150 155 160
Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Ala Tyr Lys
165 170 175
Glu Ser Asn Tyr Ser Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala
180 185 190
Thr Phe Trp His Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe
195 200 205
His Gly Leu Ser Glu Glu Asp Lys Trp Pro Glu Gly Ser Pro Lys Pro
210 215 220
Val Thr Gln Asn Ile Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly
225 230 235 240
Ile Thr Ser Ala Ser Tyr His Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu
245 250 255
Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser
260 265 270
Gly Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asn Ser
275 280 285
<210> 548
<211> 1782
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 548
atgcattcct tacatgtttc actagtgttc ctctggcttc aactaggtgg ggtgagcagc 60
caggagaagg tacagcagag cccagaatct ctcacagtcc cagagggagc catggcctcc 120
ctcaactgca ctatcagcga cagtgcttct cagtccatct ggtggtacca acagaatcct 180
gggaaaggcc ccaaagcact aatatccata ttctctaatg gcaacaagaa agaaggcaga 240
ttgacagttt acctcaatag agccagcctg catgtttccc tgcacatcag agactcccat 300
cccagtgact ccgccgtcta cctctgtgca gcgagccttg cgggcagctg gcaactcatc 360
tttggatctg gaacccaact gacagttatg cctgacatcc agaacccaga acctgctgtg 420
taccagttaa aagatcctcg gtctcaggac agcaccctct gcctgttcac cgactttgac 480
tcccaaatca atgtgccgaa aaccatggaa tctggaacgt tcatcactga caaaactgtg 540
ctggacatga aagctatgga ttccaagagc aatggggcca ttgcctggag caaccagaca 600
agcttcacct gccaagatat cttcaaagag accaacgcca cctaccccag ttcagacgtt 660
ccctgtgatg ccacgttgac cgagaaaagc tttgaaacag atatgaacct aaactttcaa 720
aacctgtcag ttatgggact ccgaatcctc ctgctgaaag标签ccggatt taacctgctc 780
atgacgctga ggctgtggtc cagtgccacg aacttctctc tgttaaagca agcaggagac 840
gtggaagaaa accccggtcc catgggctcc attttcctca gttgcctggc cgtttgtctc 900
ctggtggcag gtccagtcga cccgaaaatt atccagaaac caaaatatct ggtggcagtc 960
acagggagcg aaaaaatcct gatatgcgaa cagtatctag gccacaatgc tatgtattgg 1020
tatagacaaa gtgctaagaa gcctctagag ttcatgtttt cctacagcta tcaaaaactt 1080
atggacaatc agactgcctc aagtcgcttc caacctcaaa gttcaaagaa aaaccattta 1140
gaccttcaga tcacagctct aaagcctgat gactcggcca catacttctg tgccagcagc 1200
caagggggga caacaaactc cgactacacc ttcggctcag ggaccaggct tttggtaata 1260
gaggatctga gaaatgtgac tccacccaag gtctccttgt ttgagccatc aaaagcagag 1320
attgcaaaca aacaaaaggc taccctcgtg tgcttggcca ggggcttctt ccctgaccac 1380
gtggagctga gctggtgggt gaatggcaag gaggtccaca gtggggtcag cacggaccct 1440
caggcctaca aggagagcaa ttatagctac tgcctgagca gccgcctgag ggtctctgct 1500
accttctggc acaatcctcg caaccacttc cgctgccaag tgcagttcca tgggctttca 1560
gaggaggaca agtggccaga gggctcaccc aaacctgtca cacagaacat cagtgcagag 1620
gcctggggcc gagcagactg tggaatcact tcagcatcct atcatcaggg ggttctgtct 1680
gcaaccatcc tctatgagat cctactgggg aaggccaccc tatatgctgt gctggtcagt 1740
ggcctggtgc tgatggccat ggtcaagaga aaaaattcct ga 1782
<210> 549
<211> 458
<212> PRT
<213> 智人
<400> 549
Met Asn Arg Gly Val Pro Phe Arg His Leu Leu Leu Val Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Leu Leu Pro Ala Ala Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly Lys
20 25 30
Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser
35 40 45
Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn
50 55 60
Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala
65 70 75 80
Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile
85 90 95
Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu
100 105 110
Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn
115 120 125
Ser Gly Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu
130 135 140
Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly
145 150 155 160
Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu
165 170 175
Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys
180 185 190
Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser
195 200 205
Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro
210 215 220
Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp
225 230 235 240
Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu
245 250 255
Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu
260 265 270
Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu
275 280 285
Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys
290 295 300
Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Ala Thr
305 310 315 320
Gln Leu Gln Lys Asn Leu Thr Cys Glu Val Trp Gly Pro Thr Ser Pro
325 330 335
Lys Leu Met Leu Ser Leu Lys Leu Glu Asn Lys Glu Ala Lys Val Ser
340 345 350
Lys Arg Glu Lys Ala Val Trp Val Leu Asn Pro Glu Ala Gly Met Trp
355 360 365
Gln Cys Leu Leu Ser Asp Ser Gly Gln Val Leu Leu Glu Ser Asn Ile
370 375 380
Lys Val Leu Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val Gln Pro Met Ala Leu Ile
385 390 395 400
Val Leu Gly Gly Val Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ile Gly Leu Gly Ile
405 410 415
Phe Phe Cys Val Arg Cys Arg His Arg Arg Arg Gln Ala Glu Arg Met
420 425 430
Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro
435 440 445
His Arg Phe Gln Lys Thr Cys Ser Pro Ile
450 455
<210> 550
<211> 1661
<212> DNA
<213> 智人
<400> 550
atgaaccggg gagtcccttt标签gcacttg cttctggtgc tgcaactggc gctcctccca 60
gcagccactc agggaaagaa agtggtgctg ggcaaaaaag gggatacagt ggaactgacc 120
tgtacagctt cccagaagaa gagcatacaa ttccactgga aaaactccaa ccagataaag 180
attctgggaa atcagggctc cttcttaact aaaggtccat ccaagctgaa tgatcgcgct 240
gactcaagaa gaagcctttg ggaccaagga aactttcccc tgatcatcaa gaatcttaag 300
atagaagact cagatactta catctgtgaa gtggaggacc agaaggagga ggtgcaattg 360
ctagtgttcg gattgactgc caactctggt acccacctgc ttcaggggca gagcctgacc 420
ctgaccttgg agagcccccc tggtagtagc ccctcagtgc aatgtaggag tccaaggggt 480
aaaaacatac agggggggaa gaccctctcc gtgtctcagc tggagctcca ggatagtggc 540
acctggacgt gcactgtctt gcagaaccag aagaaggtgg agttcaaaat agacatcgtg 600
gtgctagctt tccagaaggc ctccagcata gtctataaga aagaggggga acaggtggag 660
ttctccttcc cactcgcctt tacagttgaa aagctgacgg gcagtggcga gctgtggtgg 720
caggcggaga gggcttcctc ctccaagtct tggatcacct ttgacctgaa gaacaaggaa 780
gtgtctgtaa aacgggttac ccaggaccct aagctccaga tgggcaagaa gctcccgctc 840
cacctcaccc tgccccaggc cttgcctcag tatgctggct ctggaaacct caccctggcc 900
cttgaagcga aaacaggaaa gttgcatcag gaagtgaacc tggtggtgat gagagccact 960
cagctccaga aaaatttgac ctgtgaggtg tggggaccca cctcccctaa gctgatgctg 1020
agcttgaaac tggagaacaa ggaggcaaag gtctcgaagc gggagaaggc ggtgtgggtg 1080
ctgaaccctg aggcggggat gtggcagtgt ctgctgagtg actcgggaca ggtcctgctg 1140
gaatccaaca tcaaggttct gcccacatgg tccaccccgg tgcagccaat ggccctgatt 1200
gtgctggggg gcgtcgccgg cctcctgctt ttcattgggc标签gcatctt cttctgtgtc 1260
aggtgccggc accgaaggcg ccaagcagag cggatgtctc agatcaagag actcctcagt 1320
gagaagaaga cctgccagtg ccctcaccgg tttcagaaga catgtagccc catttgagtc 1380
gacaagggcg aattaattca gatcttacgt agctagcgga tcccaattgc tcgagcggga 1440
tcaattccgc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc 1500
gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa 1560
acctggccct gtcttcttga cgagcattcc标签gggtctt tcccctctcg ccaaaggaat 1620
gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg g 1661
<210> 551
<211> 457
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 551
Met Cys Arg Ala Ile Ser Leu Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Gln Leu Leu Ala Val Thr Gln Gly Lys Thr Leu Val Leu Gly
20 25 30
Lys Glu Gly Glu Ser Ala Glu Leu Pro Cys Glu Ser Ser Gln Lys Lys
35 40 45
Ile Thr Val Phe Thr Trp Lys Phe Ser Asp Gln Arg Lys Ile Leu Gly
50 55 60
Gln His Gly Lys Gly Val Leu Ile Arg Gly Gly Ser Pro Ser Gln Phe
65 70 75 80
Asp Arg Phe Asp Ser Lys Lys Gly Ala Trp Glu Lys Gly Ser Phe Pro
85 90 95
Leu Ile Ile Asn Lys Leu Lys Met Glu Asp Ser Gln Thr Tyr Ile Cys
100 105 110
Glu Leu Glu Asn Arg Lys Glu Glu Val Glu Leu Trp Val Phe Lys Val
115 120 125
Thr Phe Ser Pro Gly Thr Ser Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu
130 135 140
Thr Leu Asp Ser Asn Ser Lys Val Ser Asn Pro Leu Thr Glu Cys Lys
145 150 155 160
His Lys Lys Gly Lys Val Val Ser Gly Ser Lys Val Leu Ser Met Ser
165 170 175
Asn Leu Arg Val Gln Asp Ser Asp Phe Trp Asn Cys Thr Val Thr Leu
180 185 190
Asp Gln Lys Lys Asn Trp Phe Gly Met Thr Leu Ser Val Leu Gly Phe
195 200 205
Gln Ser Thr Ala Ile Thr Ala Tyr Lys Ser Glu Gly Glu Ser Ala Glu
210 215 220
Phe Ser Phe Pro Leu Asn Phe Ala Glu Glu Asn Gly Trp Gly Glu Leu
225 230 235 240
Met Trp Lys Ala Glu Lys Asp Ser Phe Phe Gln Pro Trp Ile Ser Phe
245 250 255
Ser Ile Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Gln Lys Ser Thr Lys Asp Leu
260 265 270
Lys Leu Gln Leu Lys Glu Thr Leu Pro Leu Thr Leu Lys Ile Pro Gln
275 280 285
Val Ser Leu Gln Phe Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Thr Leu Asp
290 295 300
Lys Gly Thr Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Lys Val Ala
305 310 315 320
Gln Leu Asn Asn Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Gly Pro Thr Ser Pro
325 330 335
Lys Met Arg Leu Thr Leu Lys Gln Glu Asn Gln Glu Ala Arg Val Ser
340 345 350
Glu Glu Gln Lys Val Val Gln Val Val Ala Pro Glu Thr Gly Leu Trp
355 360 365
Gln Cys Leu Leu Ser Glu Gly Asp Lys Val Lys Met Asp Ser Arg Ile
370 375 380
Gln Val Leu Ser Arg Gly Val Asn Gln Thr Val Phe Leu Ala Cys Val
385 390 395 400
Leu Gly Gly Ser Phe Gly Phe Leu Gly Phe Leu Gly Leu Cys Ile Leu
405 410 415
Cys Cys Val Arg Cys Arg His Gln Gln Arg Gln Ala Ala Arg Met Ser
420 425 430
Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro His
435 440 445
Arg Met Gln Lys Ser His Asn Leu Ile
450 455
<210> 552
<211> 1620
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 552
atgtgccgag ccatctctct标签gcgcttg ctgctgctgc tgctgcagct gtcacaactc 60
ctagctgtca ctcaagggaa gacgctggtg ctggggaagg aaggggaatc agcagaactg 120
ccctgcgaga gttcccagaa gaagatcaca gtcttcacct ggaagttctc tgaccagagg 180
aagattctgg ggcagcatgg caaaggtgta ttaattagag gaggttcgcc ttcgcagttt 240
gatcgttttg attccaaaaa aggggcatgg gagaaaggat cgtttcctct catcatcaat 300
aaacttaaga tggaagactc tcagacttat atctgtgagc tggagaacag gaaagaggag 360
gtggagttgt gggtgttcaa agtgaccttc agtccgggta ccagcctgtt gcaagggcag 420
agcctgaccc tgaccttgga标签caactct aaggtctcta accccttgac agagtgcaaa 480
cacaaaaagg gtaaagttgt cagtggttcc aaagttctct ccatgtccaa cctaagggtt 540
caggacagcg acttctggaa ctgcaccgtg accctggacc agaaaaagaa ctggttcggc 600
atgacactct cagtgctggg ttttcagagc acagctatca cggcctataa gagtgaggga 660
gagtcagcgg agttctcctt cccactcaac tttgcagagg aaaacgggtg gggagagctg 720
atgtggaagg cagagaagga ttctttcttc cagccctgga tctccttctc cataaagaac 780
aaagaggtgt ccgtacaaaa gtccaccaaa gacctcaagc tccagctgaa ggaaacgctc 840
ccactcaccc tcaagatacc ccaggtctcg cttcagtttg ctggttctgg caacctgact 900
ctgactctgg acaaagggac actgcatcag gaagtgaacc tggtggtgat gaaagtggct 960
cagctcaaca atactttgac ctgtgaggtg atgggaccta cctctcccaa gatgagactg 1020
accctgaagc aggagaacca ggaggccagg gtctctgagg agcagaaagt agttcaagtg 1080
gtggcccctg agacagggct gtggcagtgt ctactgagtg aaggtgataa ggtcaagatg 1140
gactccagga tccaggtttt atccagaggg gtgaaccaga cagtgttcct ggcttgcgtg 1200
ctgggtggct ccttcggctt tctgggtttc cttgggctct gcatcctctg ctgtgtcagg 1260
tgccggcacc aacagcgcca ggcagcacga atgtctcaga tcaagaggct cctcagtgag 1320
aagaagacct gccagtgccc ccaccggatg cagaagagcc ataatctcat ctgaagcggc 1380
cgcgtcgact cgagcgggat caattccgcc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct 1440
tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg 1500
gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt 1560
cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg 1620
<210> 553
<211> 773
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多肽
<400> 553
Met Glu His Ser Gly Ile Leu Ala Ser Leu Ile Leu Ile Ala Val Leu
1 5 10 15
Pro Gln Gly Ser Pro Phe Lys Ile Gln Val Thr Glu Tyr Glu Asp Lys
20 25 30
Val Phe Val Thr Cys Asn Thr Ser Val Met His Leu Asp Gly Thr Val
35 40 45
Glu Gly Trp Phe Ala Lys Asn Lys Thr Leu Asn Leu Gly Lys Gly Val
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Leu Cys Asn Gly Thr Glu Gln Leu Ala
65 70 75 80
Lys Val Val Ser Ser Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Ser Gly Thr Met Ala Gly Val Ile Phe Ile Asp Leu
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ile Tyr Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Pro Ser Gly Ala Ala Glu Val Gln Ala Leu Leu Lys
130 135 140
Asn Glu Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Glu Asp Thr Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Arg Leu Gly Gly Asn Trp Pro Arg Asn Lys Lys Ser Gly Pro Val
165 170 175
Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu
180 185 190
Ser Asn Pro Gly Pro Met Glu Gln Arg Lys Gly Leu Ala Gly Leu Phe
195 200 205
Leu Val Ile Ser Leu Leu Gln Gly Thr Val Ala Gln Thr Asn Lys Ala
210 215 220
Lys Asn Leu Val Gln Val Asp Gly Ser Arg Gly Asp Gly Ser Val Leu
225 230 235 240
Leu Thr Cys Gly Leu Thr Asp Lys Thr Ile Lys Trp Leu Lys Asp Gly
245 250 255
Ser Ile Ile Ser Pro Leu Asn Ala Thr Lys Asn Thr Trp Asn Leu Gly
260 265 270
Asn Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Thr Tyr Gln Cys Gln Gly Ala Lys
275 280 285
Glu Thr Ser Asn Pro Leu Gln Val Tyr Tyr Arg Met Cys Glu Asn Cys
290 295 300
Ile Glu Leu Asn Ile Gly Thr Ile Ser Gly Phe Ile Phe Ala Glu Val
305 310 315 320
Ile Ser Ile Phe Phe Leu Ala Leu Gly Val Tyr Leu Ile Ala Gly Gln
325 330 335
Asp Gly Val Arg Gln Ser Arg Ala Ser Asp Lys Gln Thr Leu Leu Gln
340 345 350
Asn Glu Gln Leu Tyr Gln Pro Leu Lys Asp Arg Glu Tyr Asp Gln Tyr
355 360 365
Ser His Leu Gln Gly Asn Gln Leu Arg Lys Lys Arg Ser Glu Gly Arg
370 375 380
Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met
385 390 395 400
Arg Trp Asn Thr Phe Trp Gly Ile Leu Cys Leu Ser Leu Leu Ala Val
405 410 415
Gly Thr Cys Gln Asp Asp Ala Glu Asn Ile Glu Tyr Lys Val Ser Ile
420 425 430
Ser Gly Thr Ser Val Glu Leu Thr Cys Pro Leu Asp Ser Asp Glu Asn
435 440 445
Leu Lys Trp Glu Lys Asn Gly Gln Glu Leu Pro Gln Lys His Asp Lys
450 455 460
His Leu Val Leu Gln Asp Phe Ser Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr Tyr
465 470 475 480
Val Cys Tyr Thr Pro Ala Ser Asn Lys Asn Thr Tyr Leu Tyr Leu Lys
485 490 495
Ala Arg Val Cys Glu Tyr Cys Val Glu Val Asp Leu Thr Ala Val Ala
500 505 510
Ile Ile Ile Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Met Val
515 520 525
Ile Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr
530 535 540
Arg Gly Thr Gly Ala Gly Ser Arg Pro Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg
545 550 555 560
Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln
565 570 575
Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Ala Val Gly Ser Ala Thr
580 585 590
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
595 600 605
Pro Met Lys Trp Lys Val Ser Val Leu Ala Cys Ile Leu His Val Arg
610 615 620
Phe Pro Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu
625 630 635 640
Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Ile Thr
645 650 655
Ala Leu Tyr Leu Arg Ala Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Thr Ala Ala
660 665 670
Asn Leu Gln Asp Pro Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
675 680 685
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Lys Arg Ala Arg Asp Pro Glu
690 695 700
Met Gly Gly Lys Gln Gln Arg Arg Arg Asn Pro Gln Glu Gly Val Tyr
705 710 715 720
Asn Ala Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
725 730 735
Thr Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
740 745 750
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
755 760 765
Thr Leu Ala Pro Arg
770
<210> 554
<211> 2322
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 554
atggaacaca gcgggattct ggctagtctg atactgattg ctgttctccc ccaagggagc 60
cccttcaaga tacaagtgac cgaatatgag gacaaagtat ttgtgacctg caataccagc 120
gtcatgcatc标签atggaac ggtggaagga tggtttgcaa agaataaaac actcaacttg 180
ggcaaaggcg ttctggaccc acgagggata tatctgtgta atgggacaga gcagctggca 240
aaggtggtgt cttctgtgca agtccattac cgaatgtgcc agaactgtgt ggagctagac 300
tcgggcacca tggctggtgt catcttcatt gacctcatcg caactctgct cctggctttg 360
ggcatctact gctttgcagg acatgagacc ggaaggcctt ctggggctgc tgaggttcaa 420
gcactgctga agaatgagca gctgtatcag cctcttcgag atcgtgaaga tacccagtac 480
agccgtcttg gagggaactg gccccggaac aagaaatccg gaccggtgaa acagactttg 540
aattttgacc ttctcaagtt ggcgggagac gtggagtcca acccagggcc catggagcag 600
aggaagggtc tggctggcct cttcctggtg atctctcttc ttcaaggcac tgtagcccag 660
acaaataaag caaagaattt ggtacaagtg gatggcagcc gaggagacgg ttctgtactt 720
ctgacttgtg gcttgactga caagactatc aagtggctta aagacgggag cataataagt 780
cctctaaatg caactaaaaa cacatggaat ctgggcaaca atgccaaaga ccctcgaggc 840
acgtatcagt gtcaaggagc aaaggagacg tcaaaccccc tgcaagtgta ttacagaatg 900
tgtgaaaact gcattgagct aaacataggc accatatccg gctttatctt cgctgaggtc 960
atcagcatct tcttccttgc tcttggtgta tatctcattg cgggacagga tggagttcgc 1020
cagtcaagag cttcagacaa gcagactctg ttgcaaaatg aacagctgta ccagcccctc 1080
aaggaccggg aatatgacca gtacagccat ctccaaggaa accaactgag gaagaagaga 1140
tctgagggca gaggaagtct gctaacatgc ggtgacgtcg aggagaatcc tggcccaatg 1200
cggtggaaca ctttctgggg catcctgtgc ctcagcctcc标签ctgttgg cacttgccag 1260
gacgatgccg agaacattga atacaaagtc tccatctcag gaaccagtgt agagttgacg 1320
tgccctctag acagtgacga gaacttaaaa tgggaaaaaa atggccaaga gctgcctcag 1380
aagcatgata agcacctggt gctccaggat ttctcggaag tcgaggacag tggctactac 1440
gtctgctaca caccagcctc aaataaaaac acgtacttgt acctgaaagc tcgagtgtgt 1500
gagtactgtg tggaggtgga cctgacagca gtagccataa tcatcattgt tgacatctgt 1560
atcactctgg gcttgctgat ggtcatttat tactggagca agaataggaa ggccaaggcc 1620
aagcctgtga cccgaggaac cggtgctggt agcaggccca gagggcaaaa caaggagcgg 1680
ccaccacctg ttcccaaccc agactatgag cccatccgca aaggccagcg ggacctgtat 1740
tctggcctga atcagagagc agtcggatcc gccacgaact tctctctgtt aaagcaagca 1800
ggagacgtgg aagaaaaccc cggtcccatg aagtggaaag tgtctgttct cgcctgcatc 1860
ctccacgtgc ggttcccagg agcagaggca cagagctttg gtctgctgga ccccaaactc 1920
tgctacttgc标签atggaat cctcttcatc tacggagtca tcatcacagc cctgtacctg 1980
agagcaaaat tcagcaggag tgcagagact gctgccaacc tgcaggaccc caaccagctc 2040
tacaatgagc tcaatctagg gcgaagagag gaatatgacg tcttggagaa gaagcgggct 2100
cgggacccag agatgggagg caaacagcag aggaggagga acccccagga aggcgtatac 2160
aatgcactgc agaaagacaa gatggcagaa gcctacagtg agatcggcac aaaaggcgag 2220
aggcggagag gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagcactgc caccaaggac 2280
acctatgatg ccctgcatat gcagaccctg gcccctcgct aa 2322
<210> 555
<211> 550
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：萤光素酶蛋白质序列
<400> 555
Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro
1 5 10 15
Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg
20 25 30
Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu
35 40 45
Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala
50 55 60
Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val
65 70 75 80
Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu
85 90 95
Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg
100 105 110
Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val
115 120 125
Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro
130 135 140
Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly
145 150 155 160
Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe
165 170 175
Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile
180 185 190
Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val
195 200 205
Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp
210 215 220
Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val
225 230 235 240
Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu
245 250 255
Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu
260 265 270
Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val
275 280 285
Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr
290 295 300
Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser
305 310 315 320
Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile
325 330 335
Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr
340 345 350
Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe
355 360 365
Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val
370 375 380
Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly
385 390 395 400
Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly
405 410 415
Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe
420 425 430
Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln
435 440 445
Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile
450 455 460
Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu
465 470 475 480
Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys
485 490 495
Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu
500 505 510
Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly
515 520 525
Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys
530 535 540
Gly Gly Lys Ser Lys Leu
545 550
<210> 556
<211> 1904
<212> DNA
<213> 未知
<220>
<223> “未知”的描述：萤光素酶序列
<400> 556
aaaggaggaa aaactgtttc atacagaagg cgtggaggaa aaactgtttc atacagaagg 60
cgtggaggaa aaactgtttc atacagaagg cgtattttga cacccccata atatttttcc 120
agaattaaca gtataaattg catctcttgt tcaagagttc cctatcactc tctttaatca 180
ctactcacag taacctcaac tcctgccaca ggtaccgagc tcaagtttgt acaaaaaagc 240
aggctgccac catggaagac gccaaaaaca taaagaaagg cccggcgcca ttctatccgc 300
tagaggatgg aaccgctgga gagcaactgc ataaggctat gaagagatac gccctggttc 360
ctggaacaat tgcttttaca gatgcacata tcgaggtgaa catcacgtac gcggaatact 420
tcgaaatgtc cgttcggttg gcagaagcta tgaaacgata tgggctgaat acaaatcaca 480
gaatcgtcgt atgcagtgaa aactctcttc aattctttat gccggtgttg ggcgcgttat 540
ttatcggagt tgcagttgcg cccgcgaacg acatttataa tgaacgtgaa ttgctcaaca 600
gtatgaacat ttcgcagcct accgtagtgt ttgtttccaa aaaggggttg caaaaaattt 660
tgaacgtgca aaaaaaatta ccaataatcc agaaaattat tatcatggat tctaaaacgg 720
attaccaggg atttcagtcg atgtacacgt tcgtcacatc tcatctacct cccggtttta 780
atgaatacga ttttgtacca gagtcctttg atcgtgacaa aacaattgca ctgataatga 840
actcctctgg atctactggg ttacctaagg gtgtggccct tccgcataga actgcctgcg 900
tcagattctc gcatgccaga gatcctattt ttggcaatca aatcattccg gatactgcga 960
ttttaagtgt tgttccattc catcacggtt ttggaatgtt tactacactc ggatatttga 1020
tatgtggatt tcgagtcgtc ttaatgtata gatttgaaga agagctgttt ttacgatccc 1080
ttcaggatta caaaattcaa agtgcgttgc标签taccaac cctattttca ttcttcgcca 1140
aaagcactct gattgacaaa tacgatttat ctaatttaca cgaaattgct tctgggggcg 1200
cacctctttc gaaagaagtc ggggaagcgg ttgcaaaacg cttccatctt ccagggatac 1260
gacaaggata tgggctcact gagactacat cagctattct gattacaccc gagggggatg 1320
ataaaccggg cgcggtcggt aaagttgttc cattttttga agcgaaggtt gtggatctgg 1380
ataccgggaa aacgctgggc gttaatcaga gaggcgaatt atgtgtcaga ggacctatga 1440
ttatgtccgg ttatgtaaac aatccggaag cgaccaacgc cttgattgac aaggatggat 1500
ggctacattc tggagacata gcttactggg acgaagacga acacttcttc atagttgacc 1560
gcttgaagtc tttaattaaa tacaaaggat accaggtggc ccccgctgaa ttggagtcga 1620
tattgttaca acaccccaac atcttcgacg cgggcgtggc aggtcttccc gacgatgacg 1680
ccggtgaact tcccgccgcc gttgttgttt tggagcacgg aaagacgatg acggaaaaag 1740
agatcgtgga ttacgtcgcc agtcaagtaa caaccgcgaa aaagttgcgc ggaggagttg 1800
tgtttgtgga cgaagtaccg aaaggtctta ccggaaaact cgacgcaaga aaaatcagag 1860
agatcctcat aaaggccaag aagggcggaa agtccaaatt gtaa 1904
<210> 557
<211> 876
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
多核苷酸
<400> 557
ctgggagcaa acaccgtgga tggtggaatc actcagtccc caaagtacct gttcagaaag 60
gaaggacaga atgtgaccct gagttgtgaa cagaatttga accacgatgc catgtactgg 120
taccgacagg acccagggca agggctgaga ttgatctact actcacagat agtaaatgac 180
tttcagaaag gagatatagc tgaagggtac agcgtctctc gggagaagaa ggaatccttt 240
cctctcactg tgacatcggc ccaaaagaac ccgacagctt tctatctctg tgccagtggg 300
ggacgggtct atcagcccca gcattttggt gatgggactc gactctccat cctagaggat 360
ctgagaaatg tgactccacc caaggtctcc ttgtttgagc catcaaaagc agagattgca 420
aacaaacaaa aggctaccct cgtgtgcttg gccaggggct tcttccctga ccacgtggag 480
ctgagctggt gggtgaatgg caaggaggtc cacagtgggg tcagcacgga ccctcaggcc 540
tacaaggaga gcaattatag ctactgcctg agcagccgcc tgagggtctc tgctaccttc 600
tggcacaatc ctcgcaacca cttccgctgc caagtgcagt tccatgggct ttcagaggag 660
gacaagtggc cagagggctc acccaaacct gtcacacaga acatcagtgc agaggcctgg 720
ggccgagcag actgtgggat tacctcagca tcctatcaac aaggggtctt gtctgccacc 780
atcctctatg agatcctgct agggaaagcc accctgtatg ctgtgcttgt cagtacactg 840
gtggtgatgg ctatggtcaa aagaaagaat tcatga 876
<210> 558
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> Val或Ile
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> 任意氨基酸
<400> 558
Xaa Glu Xaa Asn Pro Gly Pro
1 5
<210> 559
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成
6xHis标签
<400> 559
His His His His His His
1 5

Claims (62)

1.一种组合物，其包含：
a)至少一种细胞，其包含：
i.包含TCRα链和TCRβ链的重组T细胞受体(TCR)；和
ii.T细胞受体途径依赖性报道分子，其中所述重组TCR对与主要组织相容性(MHC)分子结合的疾病相关抗原具有特异性；以及
b)纳米药物，其包含偶联至纳米颗粒的与MHC分子结合的疾病相关抗原。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述T细胞受体途径依赖性报道分子被活跃地转录。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述与MHC分子结合的疾病相关抗原以10:1或更高的比例偶联至所述纳米颗粒。
4.根据权利要求1或3中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒的直径为约1纳米至约100纳米。
5.根据权利要求1或4中任一项所述的组合物，其中所述纳米颗粒包含金属核心。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述疾病相关抗原是自身免疫或炎性疾病相关抗原。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述自身免疫或炎性疾病相关抗原选自I型糖尿病抗原、哮喘或变应性哮喘抗原、多发性硬化抗原、周围神经病抗原、原发性胆汁性肝硬化抗原、视神经脊髓炎谱系障碍抗原、僵人综合征抗原、自身免疫性脑炎抗原、寻常型天疱疮抗原、落叶型天疱疮抗原、银屑病抗原、舍格伦病/综合征抗原、炎性肠病抗原、关节炎或类风湿性关节炎抗原、系统性红斑狼疮抗原、硬皮病抗原、ANCA相关性血管炎抗原、古德帕斯丘综合征抗原、川崎病抗原、乳糜泻、自身免疫性心肌病抗原、重症肌无力抗原、自身免疫性葡萄膜炎抗原、格雷夫斯病抗原、抗磷脂综合征抗原、自身免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原发性硬化性胆管炎抗原、慢性阻塞性肺疾病抗原或葡萄膜炎相关抗原及其组合。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述T细胞受体途径依赖性报道分子激活选自萤光素酶基因、β内酰胺酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、分泌型胚性碱性磷酸酶(SEAP)基因、荧光蛋白基因及其组合的基因的转录。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述T细胞受体途径依赖性报道分子包含选自活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP1转录因子结合DNA序列或启动子、IL-2转录因子结合DNA序列或启动子及其组合的多核苷酸序列。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述至少一种细胞选自JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM或Molt-4。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述疾病相关抗原是由SEQ IDNO:1至352中的任一个及其组合组成的多肽。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述疾病相关抗原是由SEQ IDNO:353至455中的任一个及其组合组成的多肽。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单个多肽。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述单个多肽的TCRα链和TCRβ链被核糖体跳跃序列隔开。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述核糖体跳跃序列在SEQ ID NO:456至523中的任一个中示出。
16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述单个多肽包含与SEQ ID NO:527、533或538中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
17.根据权利要求1至12中任一项所述的组合物，其中所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单独的多肽。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述TCRα链包含与SEQ ID NO:528、530、534、536、539、541中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，并且所述TCRβ链包含与SEQ ID NO:529、531、535、537、540或542中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述TCRα链和TCRβ链在所述细胞的表面表达。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述细胞包含至少一种编码所述TCRα链和所述TCRβ链的外源多核苷酸。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述至少一种外源多核苷酸包含IRES核酸序列。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述IRES核酸序列在SEQ ID NO:524至526中的任一个中示出。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的组合物，其中所述至少一种外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:532或557中的任一个所示的核酸序列至少80％、90％、95％或100％同源的核酸序列。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的组合物，其在体外用于确定纳米药物的效力或活性。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述纳米药物用于人类个体。
26.一种包含重组T细胞受体(TCR)和T细胞受体途径依赖性报道分子的细胞，其中所述重组T细胞受体对与主要组织相容性分子结合的疾病相关抗原具有特异性。
27.根据权利要求26所述的细胞，其中所述T细胞受体途径依赖性报道分子被活跃地转录。
28.根据权利要求26或27所述的细胞，其中所述疾病相关抗原是自身免疫或炎性疾病相关抗原。
29.根据权利要求28所述的细胞，其中所述自身免疫或炎性疾病相关抗原选自I型糖尿病抗原、哮喘或变应性哮喘抗原、多发性硬化抗原、周围神经病抗原、原发性胆汁性肝硬化抗原、视神经脊髓炎谱系障碍抗原、僵人综合征抗原、自身免疫性脑炎抗原、寻常型天疱疮抗原、落叶型天疱疮抗原、银屑病抗原、舍格伦病/综合征抗原、炎性肠病抗原、关节炎或类风湿性关节炎抗原、系统性红斑狼疮抗原、硬皮病抗原、ANCA相关性血管炎抗原、古德帕斯丘综合征抗原、川崎病抗原、乳糜泻、自身免疫性心肌病抗原、重症肌无力抗原、自身免疫性葡萄膜炎抗原、格雷夫斯病抗原、抗磷脂综合征抗原、自身免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原发性硬化性胆管炎抗原、慢性阻塞性肺疾病抗原或葡萄膜炎相关抗原及其组合。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的细胞，其中所述T细胞受体途径依赖性报道分子激活选自萤光素酶基因、β内酰胺酶基因、氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因、分泌型胚性碱性磷酸酶(SEAP)基因、荧光蛋白基因及其组合的基因的转录。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的细胞，其中所述T细胞受体途径依赖性报道分子包含选自活化T细胞核因子(NFAT)转录因子结合DNA序列或启动子、NF-κB转录因子结合DNA序列或启动子、AP1转录因子结合DNA序列或启动子、IL-2转录因子结合DNA序列或启动子及其组合的多核苷酸序列。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM或Molt-4。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的细胞，其中所述疾病相关抗原是由SEQ IDNO:1至352中的任一个及其组合组成的多肽。
34.根据权利要求26至33中任一项所述的细胞，其中所述疾病相关抗原是由SEQ IDNO:353至455中的任一个及其组合组成的多肽。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的细胞，其中所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单个多肽。
36.根据权利要求35所述的细胞，其中所述单个多肽的TCRα链和TCRβ链被核糖体跳跃序列隔开。
37.根据权利要求36所述的细胞，其中所述核糖体跳跃序列在SEQ ID NO:456至523中的任一个中示出。
38.根据权利要求35所述的细胞，其中所述单个多肽包含与SEQ ID NO:527、533或538中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
39.根据权利要求26至34中任一项所述的细胞，其中所述TCRα链和TCRβ链被翻译为单独的多肽。
40.根据权利要求26至39中任一项所述的细胞，其中所述TCRα链包含与SEQ ID NO:528、530、534、536、539、541中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列，并且所述TCRβ链包含与SEQ ID NO:529、531、535、537、540或542中的任一个至少80％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。
41.根据权利要求26至40中任一项所述的细胞，其中所述TCRα链和TCRβ链在所述细胞的表面表达。
42.根据权利要求26至41中任一项所述的细胞，其中所述细胞包含至少一种编码所述TCRα链和所述TCRβ链的外源多核苷酸。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中所述至少一种外源多核苷酸包含IRES核酸序列。
44.根据权利要求43所述的细胞，其中所述IRES核酸序列在SEQ ID NO:524至526中的任一个中示出。
45.根据权利要求42至44中任一项所述的细胞，其中所述至少一种外源多核苷酸包含与SEQ ID NO:532或557中的任一个所示的核酸序列至少80％、90％、95％或100％同源的核酸序列。
46.根据权利要求26至45中任一项所述的细胞的群体。
47.根据权利要求26至45中任一项所述的细胞或根据权利要求46所述的细胞群体，其在体外用于确定纳米药物的效力或活性。
48.根据权利要求47所述的用途，其中所述纳米药物用于人类个体。
49.一种测定纳米药物的激动活性的体外方法，该纳米药物包含偶联至纳米颗粒的与MHC分子结合的疾病相关抗原，该方法包括：
a)使所述纳米药物与根据权利要求26至45中任一项所述的细胞或根据权利要求46所述的细胞群体接触；以及
b)检测由所述T细胞受体途径依赖性报道分子产生的信号。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述纳米药物包含多个纳米颗粒。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述多个纳米颗粒包括包含偶联至所述纳米颗粒的与MHC分子结合的多个疾病相关抗原的多个纳米颗粒。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述疾病相关抗原是自身免疫或炎性疾病相关抗原。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述自身免疫或炎性疾病相关抗原选自I型糖尿病抗原、哮喘或变应性哮喘抗原、多发性硬化抗原、周围神经病抗原、原发性胆汁性肝硬化抗原、视神经脊髓炎谱系障碍抗原、僵人综合征抗原、自身免疫性脑炎抗原、寻常型天疱疮抗原、落叶型天疱疮抗原、银屑病抗原、舍格伦病/综合征抗原、炎性肠病抗原、关节炎或类风湿性关节炎抗原、系统性红斑狼疮抗原、硬皮病抗原、ANCA相关性血管炎抗原、古德帕斯丘综合征抗原、川崎病抗原、乳糜泻、自身免疫性心肌病抗原、重症肌无力抗原、自身免疫性葡萄膜炎抗原、格雷夫斯病抗原、抗磷脂综合征抗原、自身免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原发性硬化性胆管炎抗原、慢性阻塞性肺疾病抗原或葡萄膜炎相关抗原及其组合。
54.根据权利要求49至53中任一项所述的方法，其中所述多个纳米颗粒包括直径为1纳米至约100纳米的多个纳米颗粒。
55.根据权利要求49至54中任一项所述的方法，其进一步包括对所述T细胞受体途径依赖性报道分子信号进行定量。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述定量包括确定引发最大反应的约50％的反应时所述纳米药物的浓度，其中所述最大反应是当多种浓度的纳米药物与细胞或细胞群体接触时，与所述细胞或细胞群体接触的所述纳米药物在最高浓度下引发的反应。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述多种浓度的所述纳米药物与所述细胞或细胞群体在同一测定中进行接触。
58.根据权利要求55所述的方法，其中所述定量包括确定引发阴性对照的至少约200％的反应的所述纳米药物的浓度，其中所述阴性对照包含不与所述细胞或细胞群体的所述重组T细胞受体(TCR)特异性相互作用的纳米药物。
59.根据权利要求49至58中任一项所述的方法，其中所述信号由酶产生。
60.根据权利要求59所述的方法，其中所述酶是萤光素酶或过氧化物酶。
61.根据权利要求49至58中任一项所述的方法，其中所述信号是荧光信号。
62.根据权利要求49至61中任一项所述的方法，其中所述方法被用作制备过程中的质量控制步骤。
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