JP2024073459A - ナノメディシンにおける受容体リガンド相互作用の効力を測定するためのアッセイ - Google Patents
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Abstract
【課題】ナノメディシンのアゴニスト活性をアッセイするためのインビトロの方法を提供する。【解決手段】ナノメディシンのアゴニスト活性をアッセイする方法であって、前記ナノメディシンは、MHC分子に結合される疾患関連抗原を含む構成物に結合されたナノ粒子を含み、前記方法は、a)組み換えTCRであって、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む、組み換えTCRと、T細胞受容体経路依存性レポーターであって、前記組み換えTCRは前記ナノ粒子に結合された前記MHC分子に結合された前記疾患関連抗原に特異的である、T細胞受容体経路依存性レポーターと、を含む細胞と、ナノメディシンを接触させる工程と、b)前記T細胞受容体経路依存性レポーターによって生成されたシグナルを検出する工程と、を含む、方法である。【選択図】図1H
Description
<関連出願の相互参照>
本出願は、2017年4月7日に出願された米国仮出願第62/483,298の優先権の利益を主張し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、2017年4月7日に出願された米国仮出願第62/483,298の優先権の利益を主張し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
1型糖尿病(T1D)、多発性硬化症および関節リウマチなどの自己免疫性疾患は、自己抗原の不完全に定義されたリスト上の多数の抗原エピトープを認識するT細胞およびB細胞に関与する慢性自己免疫反応に起因する(Santamaria, P. (2010) Immunity 32:437-445; Babbe, H. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:393-404; Firestein, G.S. (2003) Nature 423:356-361)。全身性免疫を損なわずに、個々の自己免疫疾患におけるポリクローナル自己反応性T細胞特異性(既知または未知)をすべて除去または抑制することは、現在可能ではない。
抗原主要組織適合性複合体(pMHC)分子と結合されたナノ粒子が、インビボでの1型制御性T(TR1)細胞の再プログラミングおよび増殖を引き起こし得ることが最近発見された。PCT出願PCT/IB2016/000691を参照。しかし、安定した抗原特異性T細胞クローンの必要性、初代細胞の使用に関連する非常に可変な実験間の変動性、および抗原受容体誘発事象の遠位の読み取りの不十分な定量的実験間の再現性を考慮すると、インビトロのpMHC結合ナノ粒子またはナノ粒子に結合しないpMHC複合体の生物学的効力ならびに拡大効力を測定するためのハイスループット方法は存在しない。さらに、当技術分野における方法(例えば、ウエスタンブロットによって測定されるような半量的近位のTCRシグナル伝達事象)は、ナノ粒子上のpMHC密度と濃度範囲にわたる生物活性との間の複雑な関係を厳密に模倣することができない。その結果、これらの方法は、特定の調製が最適な生体応答をもたらすのに十分な品質であるのか否かを正確に予測することができない。したがって、当技術分野において、pMHCのアゴニスト効力または拡大効力を測定するためのインビトロの方法を開発する必要がある。本開示は、この必要性を満たすとともに、関連する利点も提供する。
1型糖尿病(T1D)、多発性硬化症および関節リウマチなどの自己免疫性疾患は、自己抗原の不完全に定義されたリスト上の多数の抗原エピトープを認識するT細胞およびB細胞に関与する慢性自己免疫反応に起因する(Santamaria, P. (2010) Immunity 32:437-445; Babbe, H. et al. (2000) J. Exp. Med. 192:393-404; Firestein, G.S. (2003) Nature 423:356-361)。全身性免疫を損なわずに、個々の自己免疫疾患におけるポリクローナル自己反応性T細胞特異性(既知または未知)をすべて除去または抑制することは、現在可能ではない。
エクスビボで拡大されたポリクローナルFOXP3+CD4+CD25+制御性T(Treg)細胞の養子移植が、代替的治療手段として提案されている(Sakaguchi, S. et al. (2006) Immunol. Rev. 212:8-27)。バイスタンダー免疫抑制(bystander immunosuppression)の可能性、インビトロで抗原特異性Treg細胞を拡大するための有効な方策の欠如、およびFOXP3+Treg細胞の系列の不安定性は、この手段の臨床解釈を妨げている(Zhou, X. et al. (2009) Nature Immunol. 10:1000-1007; Komatsu, N. et al. (2014) Nature Med. 20:62-68; Bailey-Bucktrout, S.L. et al. (2013) Immunity 39:949-962)。サイトカインIL-10およびIL-21を産生し、および表面マーカーCD49bおよびLAG-3ならびに転写因子c-Maf 8を発現するTR1 FOXP3-CD4+CD25-T細胞は、ヒト炎症性疾患の処置のために最近開発された別の制御性T細胞のサブセットを構成する(McLarnon, A. (2012) Nature Rev. Gastroenterol. Hepatol. 9:559; Desreumaux, P. et al. (2012) Gastroenterology 143:1207-1217; Roncarolo, M.G. et al. (2011) Immunol. Rev. 241:145-163)。しかし、FOXP3+Treg細胞のように、インビボで自己抗原または疾患特異的TR1様の細胞を拡大することができる薬理学的手段はない。
出願人は、主要組織適合性複合体分子に結合する自己免疫疾患関連(米国特許第8,354,110号)、胃腸関連(国際公開第2013/144811号)、または癌あるいは腫瘍関連(米国特許第9,511,151号)のペプチドでコーティングされたナノ粒子の全身送達が、患者からのリンパ球でヒト化されたマウスを含む様々なマウスモデルにおける抗原特異的制御性細胞の生成および増殖を引き起こし、確立された自己免疫現象の解決に導くことを以前に示している。(さらに国際公開第2016/198932号およびClemente-Casares, X. et al. (2016) “Expanding antigen-specific regulatory networks to treat autoimmunity,” Nature 530:434-440)。しかし、安定した抗原特異的T細胞クローンの必要性、初代細胞の使用に関連する技術的困難および非常に可変な実験間の変動性、ならびに抗原受容体誘発事象の遠位の読み取りの不十分な定量的実験間の再現性を考慮すると、インビトロのpMHC結合ナノ粒子およびナノ粒子に結合しないpMHC複合体の生物学的効力ならびに拡大効力を測定するためのハイスループット方法は存在しない。
本明細書で提示されたデータは、その天然リガンド(ペプチドMHCクラスIIあるいはペプチドMHCクラスI分子)に反応する経路依存性レポーターおよび受容体複合体(TCRとCD4またはCD8共受容体)で形質導入された/トランスフェクトされた細胞株によって初代TCR-MHCペプチド相互作用が正確にインビトロでモデル化されるという予期しない結果をもたらす。図1のI対Jを参照する。この開示に記載される方法および組成物は、一般に、その同族の受容体あるいはリガンドを発現する細胞と相互作用するリガンドまたは受容体のいずれかを含む、ナノメディシンの効力の測定に適用可能である。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、本明細書に記載されるナノ粒子、ならびに細胞応答をインビボで変更および再プログラムするために展開できる受容体のリガンドを含むナノメディシンを設計するために使用することができる。例えば、β細胞機能は、E、P、およびN-カドヘリン(cadhereins)に結合することによって良い影響を受ける。本明細書に記載される方法および組成物は、ナノ粒子およびE、P、またはN-カドヘリンを含む、物質の組成物の開発および試験を可能にする。そのような組成物は、Min6細胞株(グルコース反応性β細胞株)などの適切な細胞株と、グルコースに対するその反応のために選択され得るβ細胞レポーターと合わせることができる。
特定の実施形態では、この開示は、ナノ粒子に随意に結合するpMHC複合体のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性あるいは「効力」を測定する組成物および方法を提供する。一態様では、以下をコードする1以上のポリヌクレオチドで形質導入された単離細胞がもたらされる:組み換えT細胞受容体(TCR);TCR経路依存性レポーター;および、クラスIあるいはクラスIIの主要組織適合性複合体(MHC)リガンドを結合する共受容体。さらなる態様では、細胞はTCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体を発現する。さらなる実施形態では、細胞は、共刺激分子および/またはサイトカインの1つ以上の受容体あるいはリガンドをコードする1つ以上のポリヌクレオチドで形質導入される。
MHCリガンドの非限定的な例は、以下を結合する受容体の群から選択される:古典的MHCクラスIタンパク質、非古典的MHCクラスIタンパク質、古典的MHCクラスIIタンパク質、非古典的MHCクラスIIタンパク質、MHC二量体(Fc融合)、MHC四量体、またはMHCタンパク質の多量体型。一態様では、ポリヌクレオチドはCD8などのMHCクラスI共受容体をコードする。他の態様では、ポリヌクレオチドはCD4などのMHCクラスII共受容体をコードする。ポリヌクレオチドは、随意にポリヌクレオチドの発現を駆り立てる調節エレメントに有効に結合され、さらに随意にエンハンサーエレメントに結合される。
一態様では、T細胞受容体をコードするポリヌクレオチドは、TCRαおよび/またはTCRβをコードするポリヌクレオチドに有効に結合される調節エレメントを随意に含有するTCRαおよび/またはTCRβをコードする。これらのポリヌクレオチドは、随意にリボソームスキッピング配列をさらに含むことができる。一態様では、リボソームスキッピング配列は、2Aリボソームスキッピング配列を含むか、またはさらに本質的にそれからなるか、あるいは代替的にそれからなる。2Aリボソームスキッピング配列の非限定的な例は、F2A、aT2A、またはP2Aリボソームスキッピング配列、あるいはその組み合わせを含むか、または代替的に本質的にそれからなるか、あるいはそれからさらになる。
さらなる態様では、TCR経路依存性レポーターは、遺伝子発現、活性、タンパク質局在化、タンパク質修飾、またはタンパク質間の相互作用の1つ以上の測定を随意に提供することができるTCR活性化またはTCR経路活性化のレポーターである。さらなる態様では、TCR経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、CAT、SEAP、あるいは蛍光タンパク質の群から選択されるタンパク質を含むか、または代替的に本質的にそれからなるか、あるいはそれからさらになる。さらなる態様では、TCR経路依存性レポーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーターを含む。
別の実施形態では、細胞は、随意に、細胞表面(例えば、プロモーターおよび/またはエンハンサー)上でのCD3シグナル複合体の発現のための制御配列に有効に結合される、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチドで形質導入された。一実施形態では、細胞はCD3シグナル複合体を内因的に発現しない。
細胞は任意の抗原の活性化能を判定するのに有用であり、そのような例としては、限定されないが、MHC(pMHC)に随意に結合される自己免疫性抗原または癌関連抗原が挙げられる。pMHCは、ナノ粒子コアあるいは他の担体に随意に結合される。一態様では、pMHCは、随意に、コアへのリンカーによって、またはコア上のコーティングによって、ナノ粒子コアに複合体化される。1ナノ粒子コア当たりのpMHCの数は、例えば、約10:1~約1000:1まで変動し、および10:1~約1000:1までの幅がある。ナノ粒子コアは、適宜、複数の共刺激分子および/またはサイトカインを随意にさらに含むことができる。
特定の態様では、pMHCは、サイトカインおよび/または共刺激分子は、コア上のコーティングによってナノ粒子コアに複合体化された。コーティングは、例えば、ポリマー、随意にポリエチレングリコール(PEG)コーティングであってもよく、1つのコア当たりのpMHC、サイトカイン、および/または共刺激分子の数は、「密度」あるいはポリマーでコーティングされたナノ粒子コアの1表面積当たりのpMHCの数によって測定することができる。任意の密度は、例えば、ナノ粒子コアの1表面積当たり約0.025のpMHC/100nm2~約100のpMHC/100nm2まで測定することができ、ナノ粒子コアの表面積当たり約0.025のpMHC/100nm2~100のpMHC/100nm2までの幅がある。
任意の適切な真核細胞は、必要な要素をコードするポリヌクレオチドで形質導入することができ;そのような非限定的な例としては、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、またはMolt-4が挙げられる。細胞は、任意の適切な種、動物、哺乳動物(例えば、ヒト)のものであり得る。さらなる態様では、細胞がCD3鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチドで形質導入される場合、細胞はCD3鎖シグナル複合体を内因的に発現しない。
本明細書で同定される細胞の集団がさらに提供され、一態様では、実質的に均質である。細胞および細胞の集団を培養する方法が本明細書でさらに提供される。
本開示は、本明細書に記載される単離細胞を調製する方法をさらに提供する。一態様では、該方法は、以下をコードする1つ以上のポリヌクレオチドで単離細胞を形質導入する工程を含むか、または代替的に該工程から本質的になるか、あるいは該工程からさらになる:組み換えT細胞受容体(TCR);およびTCR経路依存性レポーター;ならびにクラスIまたはクラスIIの主要組織適合性複合体(MHC)リガンドを結合する共受容体。一実施形態では、方法は、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチドで単離細胞を形質導入することを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。方法は、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、およびクラスIまたはクラスIIの主要組織適合性複合体(MHC)リガンドを結合する受容体をコードする1つ以上のポリヌクレオチドの発現に好都合である条件下で、細胞を培養することをさらに含む。別の実施形態では、方法は、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体の発現に好都合である条件下で、細胞を培養することをさらに含む。
さらなる実施形態では、方法は、以下の1つ以上の受容体またはリガンドを発現する1つ以上のポリヌクレオチドで細胞を形質導入することをさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる:複数の共刺激分子、複数の共同刺激抗体、複数の抑制受容体遮断抗体、および/または複数のサイトカイン。
受容体および形質導入されたポリヌクレオチドの発現産物を発現する細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの当技術分野において既知の方法によって、発現産物を結合する探知可能に標識されたリガンドおよび/または抗体を使用した、当技術分野において既知の任意の適切な方法によって同定することができる。
細胞の形質導入時に、細胞は、ポリヌクレオチドの発現に好都合な条件下で、および細胞の集団の産生のために成長する。
細胞および細胞集団は、組成物を、受容体をリガンドに結合するのに好都合である本明細書に記載される単離細胞と接触させ、その後、レポーターにより生成された任意のTCR経路依存性レポーターシグナルを検出することによって、抗原-MHC複合体(pMHC)(随意にナノ粒子コアに結合される)、ならびに随意に、共刺激分子および/またはサイトカインを含む組成物のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を測定するインビトロの方法に有用である。当業者にとって明白なように、組成物および細胞は可能性のある相互作用について選択され、例えば、組成物はpMHCクラスII特異的TCR分子を含有し、細胞はMHCクラスII共受容体(例えば、CD4)を発現する。
一態様では、細胞を組成物と接触させた後、細胞または集団によって生成された任意のレポーターシグナルを定量化する。測定された反応を分類化し、その後、アゴニスト活性あるいはアンタゴニスト活性の決定前測定値(pre-determined)および/または決定後測定値(post-determined measurement)を用いて定量化されたシグナルと比較して、他の治療または組成物に対する治療の有効性をモニターすることができる。組成物が共刺激分子および細胞を含み、かつ細胞集団が適切な受容体を発現する場合、測定された反応を分類化し、その後、拮抗する活性の決定前測定値および/または決定後測定値で数量化されたシグナルと比較して、他の治療または組成物に対する治療の有効性をモニターすることができる。
したがって、本開示の特定の態様は、本明細書に記載される単離された形質導入細胞または形質導入細胞集団、単離された複合体を少なくとも含み、ここで、該単離された複合体は、該複数のpMHC複合体に結合されるナノ粒子コアを含むか、または代替的にそれから実質的になるか、あるいはそれからさらになり、ここで、該ナノ粒子コアは随意に、ナノ粒子コアに結合される1以上の共刺激分子および/または1以上のサイトカインをさらに含むか、またはそれらからさらになるか、あるいは代替的にそれから実質的になる。
複数の複合体を含有するこのような組成物について、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体のMHCは、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のサイトカインは、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、ナノ粒子コアの直径は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体の結合価は互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体の密度は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子の結合価は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のサイトカインの結合価は、互いに同じまたは異なるものである。
一態様では、以下を含む組成物が本明細書記載され、該組成物は:(a)(i)TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む組み換えT細胞受容体(TCR);および(ii)T細胞受容体経路依存性レポーターを含む少なくとも1つの細胞であって、ここで、該組み換えTCRは主要組織適合性(MHC)分子に結合される疾患関連抗原に特異的である、少なくとも1つの細胞と;ならびに(b)ナノ粒子に結合されたMHC分子に結合される疾患関連抗原を含むナノメディシンと、を含む。ある実施形態では、T細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される。ある実施形態では、MHC分子に結合される疾患関連抗原は、10:1以上の比率でナノ粒子に結合される。ある実施形態では、ナノ粒子は、1ナノメートル~100ナノメートルの直径を有する。ある実施形態では、ナノ粒子は金属コアを含む。ある実施形態では、疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である。ある実施形態では、自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、喘息またはアレルギー喘息の抗原、I型糖尿病抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病/症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ANCAに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらのその組み合わせからなるリストから選択される。ある実施形態では、T細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する。ある実施形態では、T細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーター、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、IL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせを含むリストから選択されるポリヌクレオチド配列からなる。ある実施形態では、少なくとも1つの細胞は、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、またはMolt-4から選択される。ある実施形態では、疾患関連抗原は、SEQ ID No:1~352のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、疾患関連抗原は、SEQ ID NO:353~455のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、単一のポリペプチドのTCRα鎖およびTCRβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される。ある実施形態では、リボソームスキッピング配列は、SEQ ID NO:456~523のいずれか1つにおいて記載される。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:527、533、あるいは538のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は別個のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖であって、ここで、TCRα鎖は、SEQ ID NO:528、530、534、536 539、541のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、あるいは100%同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:529、531、535、537、540、または542のいずれか1つと、少なくとも80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は細胞の表面で発現される。ある実施形態では、細胞は、TCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、該少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドはIRES核酸配列を含む。ある実施形態では、該IRES核酸配列は、SEQ ID NO:524~526のいずれか1つにおいて記載される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:532あるいは557のいずれか1つに記載のものと少なくとも80% 90% 95%、100%相同する核酸配列を含む。ある実施形態では、組成物は、ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用するためのものである。ある実施形態では、ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである。
他の態様では、組み換えT細胞受容体(TCR)およびT細胞受容体経路依存性レポーターを含む細胞が本明細書に記載され、ここで、組み換えT細胞受容体は、主要組織適合性分子に結合される疾患関連抗原に特異的である。ある実施形態では、T細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される。ある実施形態では、疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である。ある実施形態では、自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、喘息またはアレルギー喘息の抗原、I型糖尿病抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病/症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ANCAに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらのその組み合わせからなるリストから選択される。ある実施形態では、T細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する。ある実施形態では、T細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーター、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、IL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせからなるリストから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、細胞は、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、またはMolt-4から選択される。ある実施形態では、疾患関連抗原は、SEQ ID NO:1~352のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、疾患関連抗原は、SEQ ID NO:353~455のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、単一のポリペプチドのTCRα鎖およびTCRβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される。ある実施形態では、リボソームスキッピング配列は、SEQ ID NO:456~523のいずれか1つにおいて記載される。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:527、533、あるいは538のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は別個のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖であって、ここで、TCRα鎖は、SEQ ID NO:528、530、534、536 539、541のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:529、531、535、537、540、あるいは542のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は細胞の表面で発現される。ある実施形態では、細胞は、TCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、該少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドはIRES核酸配列を含む。ある実施形態では、該IRES核酸配列は、SEQ ID NO:524~526のいずれか1つにおいて記載される。ある実施形態では、少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:532あるいは557のいずれか1つに記載のものと少なくとも80% 90% 95%、または100%相同する核酸配列を含む。ある実施形態では、細胞は細胞の集団である。ある実施形態では、細胞または細胞の集団は、ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用される。ある実施形態では、ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである。
他の態様では、ナノ粒子に結合されるMHC分子に結合する疾患関連抗原を含む、ナノメディシンのアゴニスト活性を測定するインビトロでの方法が本明細書に記載され、該方法は:(a)ナノメディシンを本明細書に記載される細胞または細胞の集団と接触させる工程と;(b)T細胞受容体経路依存性レポーターによって生成されたシグナルを検出する工程と、を含む。ある実施形態では、ナノメディシンは複数のナノ粒子を含む。ある実施形態では、該複数のナノ粒子は、ナノ粒子に結合されたMHC分子に結合される複数の疾患関連抗原を含む複数のナノ粒子を含む。ある実施形態では、疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である。ある実施形態では、自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、I型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病/症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ANCAに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される。ある実施形態では、複数のナノ粒子は、約1ナノメートル~約100ナノメートルの直径を有する複数のナノ粒子を含む。ある実施形態では、該方法は、T細胞受容体経路依存性レポーターのシグナルを定量化する工程をさらに含む。ある実施形態では、定量化は、最大応答の約50%である応答を開始するナノメディシンの濃度を判定する工程を含み、ここで、該最大応答とは、複数の濃度のナノメディシンが細胞または細胞の集団と接触する時に、細胞または細胞の集団と接触するナノメディシンの最高濃度で開始される応答である。ある実施形態では、ナノメディシンの複数の濃度は、同じアッセイ中の細胞または細胞の集団と接触する。ある実施形態では、定量化は、陰性対照の少なくとも約200%である応答を開始するナノメディシンの濃度を判定することを含み;ここで、該陰性対照は、細胞または細胞の集団の組み換えT細胞受容体(TCR)と特異的に相互作用しないナノメディシンを含む。ある実施形態では、シグナルは酵素によって生成される。ある実施形態では、酵素はルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼである。ある実施形態では、シグナルは蛍光シグナルである。ある実施形態では、該方法は、製造プロセスの品質管理工程として利用される。
以下の図面は、本明細書の部分を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書で提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれら図面の1つ以上を参照することによって、より良く理解され得る。
一態様では、組成物が本明細書に記載され、該組成物は:(a)(i)TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む組み換えT細胞受容体(TCR);および(ii)組み換えTCRは主要組織適合性(MHC)分子に結合される疾患関連抗原に特異的であるT細胞受容体経路依存性レポーターを含む少なくとも1つの細胞と;(b)ナノ粒子に結合されるMHC分子に結合された疾患関連抗原を含むナノメディシンと、を含む。
他の態様では、組み換えT細胞受容体(TCR)およびT細胞受容体経路依存性レポーターを含む、細胞が本明細書に記載され、ここで、組み換えT細胞受容体は、主要組織適合性分子に結合される疾患関連抗原に特異的である。
他の態様では、ナノ粒子に結合されるMHC分子に結合された疾患関連抗原を含むナノメディシンのアゴニスト活性を測定するインビトロの方法が本明細書に記載され、該方法は:(a)ナノメディシンを本明細書に記載される細胞または細胞の集団と接触させる工程と;(b)T細胞受容体経路依存性レポーターによって生成されたシグナルを検出する工程と、を含む。
この開示全体にわたって、およびこの開示内では、この開示が関連する最先端技術をより十分に説明するために技術文献および特許文献を参照する。一部の公報はアラビア数字によって識別され、公報の完全な書誌情報は請求項の直前の参照セクションで見られる。この開示が関係する最先端技術をより十分に説明するために、すべての公報は参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、記載される特定の実施形態に制限されず、当然ながら異なり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみについて説明するためのものであり、且つ、本開示の範囲が添付の請求項のみによって制限されないことから、制限を意図するものではないことも理解されたい。
本明細書や添付の請求項で使用されるように、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈で特段の定めのない限り、複数の指示物を含んでいる。故に、例えば「賦形剤(an excipient)」への言及は、複数の賦形剤を含む。用語「少なくとも1つ」は1以上を意図する。
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値を判定するために利用されている装置または方法に関する誤差の標準偏差を値が含むことを示すために使用される。用語「約」は、範囲を含む数の指定(例えば、温度、時間、量、および濃度)の前に使用される場合、最大10%(+)または(-)で異なり得る近似を示す。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用されるように、以下の用語は以下の意味を有している。
本明細書で使用されるように、用語「含むこと(comprising)」または「含む(comprises)」は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素は除外しないことを意味するように意図されている。「~から実質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、明示された目的のための組み合わせに不可欠な有意性の他の要素を除くことを意味する。故に、本明細書で定義されるような要素から実質的になる組成物は、多発性硬化症を処置または予防するための組成物などの、請求された開示の基本的かつ新しい特徴には実質的に影響しない他の材料または工程を除外するものではない。「~からなる」は、他の成分および実質的な方法の工程の微量元素より多くを除外することを意味する。このような移り変わる用語(transition term)の各々により定められる実施形態は、本開示の範囲内である。
「生体適合性」とは、送達システムの構成要素がヒト生体系に組織損傷または損傷を引き起こさないことを意味する。生体適合性を付与するために、ヒトにおける安全な使用の履歴を有しており、またはGRAS(Generally Accepted As Safe)の状態を伴うポリマーおよび賦形剤が優先的に使用される。「生体適合性」とは、組成物に使用される成分および賦形剤が最終的に「生体吸収」されるか、または身体への悪影響無しに身体により取り除かれることを意味する。組成物が生体適合性であり、かつ無毒であると見なされるためには、細胞に毒性を引き起こしてはならない。同様に、用語「生体吸収可能な」とは、患者における材料の長期間の蓄積が回避されるように、一定期間にわたりインビボで生体吸収を受ける材料から作られるナノ粒子を指す。ある実施形態において、生体適合性ナノ粒子は、2年未満の期間、好ましくは1年未満、更に好ましくは6か月未満にわたり生体吸収される。生体吸収の速度は、粒子の大きさ、使用される材料、および当業者に十分認識されている他の要素に関連する。生体吸収可能で生体適合性の材料の混合物が、本開示に使用されるナノ粒子コアを形成するために使用されてもよい。一実施形態において、酸化鉄と、生体適合性で生体吸収可能なポリマーとが組み合わされ得る。例えば、ナノ粒子を形成するために酸化鉄とPGLAとが組み合わされ得る。
用語「主要組織適合性複合体」または「MHC」は、抗原関連免疫細胞を形成する抗原と関連する能力を持っている免疫細胞上の抗原提示分子を指す。いくつかの実施形態では、MHCは、クラスIまたはIIの分子である。いくつかの実施形態では、MHCは、古典的MHCクラスIタンパク質、非古典的MHCクラスIタンパク質、古典的MHCクラスIIタンパク質、非古典的MHCクラスIIタンパク質、MHC二量体(Fc融合)、MHC四量体、またはMHCタンパク質のタンパク質の多量体型を含むか、それからなるか、あるいはそれから本質的になる。MHC結合細胞表面分子はCD4およびCD8から選択される。
ポリペプチド/抗原-MHC-ナノ粒子の複合体(「NP複合体」または「複合体」あるいは「pMHC-NP」または「ナノ粒子複合体」)は、ナノ粒子コアなどの表面上でMHC分子によって提示される、ペプチド、炭水化物、脂質、または他の抗原部分、フラグメント、あるいは抗原分子かタンパク質のエピトープ(すなわち、自己ペプチドまたは自己抗原)の提示を指す。
「ナノ粒子コア」は、層またはコーティングを含むか、または含まないナノ粒子基質である。ナノ粒子複合体は、少なくともpMHC複合体がコアに結合されているコアを含む。ナノ粒子コアは、様々な材料のいずれかから作ることができ、および生体適合性であり得る。
本明細書で使用されるように、用語「活性化T細胞核内因子」または「NFAT」は、免疫応答(例えば、T細胞調節免疫応答を活性化する)において重要であると示される転写因子のファミリーに適用される一般名である。免疫系は、限定されないが、NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、およびNFAT5を含む、NFATファミリーメンバーの1以上のメンバーを発現することができる。NFATc1~NFATc4は、カルシウムシグナル伝達によって調節される。カルモジュリン(CaM)(既知のカルシウムセンサータンパク質)がセリン/トレオニン ホスファターゼ カルシニューリン(CN)を活性化するので、カルシウムシグナル伝達はNFAT活性化に重要である。NFATタンパク質の核内移行は、核中の輸送キナーゼ(export kinases)および細胞質中の維持キナーゼによって対抗される。PKAおよびGSK-3βなどの輸送キナーゼは、NFAT核内繋留のために不活性化されなければならない。一実施形態では、NFAT転写因子は、ras-MAPKまたはPKCなどの他のシグナル伝達経路を用いたカルシウムシグナルの統合および一致検出を可能にする。
本明細書で使用されるように、用語「T細胞受容体」または「TCR」は、MHC分子によって提示された時、ペプチドを認識することができる分子を指す。いくつかの実施形態において、TCRは、T細胞受容体α-鎖(TCRα)およびT細胞受容体β-鎖(TCRβ)を含むヘテロ二量体であり、各鎖は、可変(V)領域および定常(C)領域、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質ドメインを含む。VおよびCの領域は、免疫グロブリンVおよびCの領域に通常相同であり、3つの相補性決定領域(CDR)を含む。両方のTCR鎖は、TCRを提示する細胞の細胞膜に固定される。いくつかの実施形態において、TCRは、TCRγ-鎖(TCRγ)およびTCRδ-鎖(TCRδ)を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、TCRは単鎖TCR構築物である。TCRαの非限定的な例は、GenBankで見つけることができる(例えば、GenBank受入番号:AAB31880.1、AAB28318.1、AAB24428.1、およびADW95878.1、ならびにその各々の等価物)。TCRβの非限定的な例もGenBankで見つけることができる(例えば、GenBank受入番号:AAB31887.1、AKG65861.1、ADW95908.1およびAAM53411.1、ならびにその各々の等価物)。一実施形態では、TCRγ-鎖は、GenBankで見られる1つ以上の配列を含む(例えば、GenBank受入番号:AAM21533.1、DAA30449.1およびABG91733.1、ならびにその各々の等価物)。一実施形態では、TCRδ-鎖は、GenBankで見られる1つ以上の配列を含む(例えば、GenBank受入番号:Q7YRN2.1、AAC48547.1、JC4663およびNP_001009418.1、ならびに各々の等価物)。単鎖TCRは当技術分野において既知である。単鎖TCRの非限定的な例は、WO1996018105およびUS20120252742に開示され、その各々は、参照によってその全体が組み込まれる。一実施形態では、ポリヌクレオチドおよびTCRβのポリペプチド配列は、下で提供される例示的な配列表で列挙され、TCRβのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドの等価物である。
いくつかの実施形態において、TCRはCD3と関連し、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体(またはTCR/CD3複合体)を形成する。これらの実施形態では、細胞は、αおよびβのTCR鎖、CD3γ、δ、およびεのポリペプチド、ならびにζ鎖を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになるポリペプチドによって形成される、TCR/CD3複合体をコードする1つ以上のポリヌクレオチドで形質導入される。様々なモジュールで形成され、TCR/CD3複合体は様々な役割を担うことができる。一実施形態では、複合体は抗原特異的認識に関与する。これらの実施形態では、複合体は、主に、CD3およびζの鎖の細胞質側末端におけるチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ(immunorecepter tyrosine-based activation motif)(「ITAM」)の存在を介したシグナル伝達に関与する。いくつかの実施形態において、TCR/CD3複合体は、抗原、超抗原、または抗体(例えば、抗受容体抗体)によって刺激されたTCRシグナル伝達経路に関与する。一実施形態では、TCR/CD3複合体の外因的発現は、CD3陰性細胞におけるTCRシグナル伝達経路を促進する。CD3陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、BW5147(ATCC No.TIB-472)、Nk-92(ATCC No.CRL-2407)、Mino(ATCC No.PTS-CRL-3000)、およびJeKo-1(ATCC No.CRL-3006)を含む。
本明細書で使用されるように、用語「単離細胞」は、pMHCに結合されるナノ粒子を含む検査剤の効力を評価するために提供される細胞を指す。一実施形態では、細胞は、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、またはMolt-4から選択されたT系列細胞である。それらは、任意の適切な種(例えば、動物、哺乳動物、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、またはヒツジ)であってもよい。別の実施形態では、単離細胞は、免疫細胞などのエフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、T細胞受容体(TCR)、TCR関連CD3マルチユニット鎖複合体、および/またはTCR経路依存性レポーター、およびCD4またはCD8の受容体を発現する。さらなる態様では、細胞は、さらに共刺激分子および/またはサイトカインに対する受容体も発現する。ある実施形態では、TCRはマウス化される(つまり、TCRはマウスCD4分子と相互作用するように最適化される)。
本明細書で使用されるように、用語「レポーター」は、特性(例えば、活性、発現、局在化、相互作用、修飾など)を有する単離細胞上の、または単離細胞内の要素を意味し、その要素は以下の1つ以上であり:細胞の生理学的変化または疾病に依存するか、相関するか、またはそれによって活性化される。例えば、「TCR経路依存性レポーター」は、細胞上の、または細胞内の要素を指し、その特性は活性化されるか、あるいはTCR経路の活性化または調節に依存する。いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターは、上流転写因子結合DNA配列またはプロモーター(例えば、NFAT転写因子結合DNA配列またはプロモーター、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、およびIL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーター)によって活性化される。一実施形態では、レポーター(例えば、TCR経路依存性レポーター)は、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、CAT、SEAP、蛍光タンパク質、数量化できる遺伝子産物、および/またはそれらの組み合わせからなる群から選択されたタンパク質をコードする遺伝子を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。
本明細書で使用されるように、用語「CD3」(分化のクラスタ3)は、T細胞受容体に関連するタンパク質複合体を指す。いくつかの実施形態において、CD3に対して作られる抗体は、Tリンパ球において活性化シグナルを生成することができる。限定されないが、CD28、CD134、CD137、およびCD27を含む他のT細胞活性化リガンドも使用することができる。いくつかの実施形態において、CD3は4つの別個の鎖を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる。哺乳動物について、4つの別個の鎖は以下のとおりである:CD3gamma、CD3delta、CD3epsilonとCD3zeta。CD3鎖の非限定的な例はGenBankで見つけることができる(例えば、GenBank受入番号:CAA72995.1、AAI45927.1、NP_998940.1、AAB24559.1、NP_000723.1、AEQ93556.1、およびEAW67366.1)。
本明細書で使用されるように、用語「CD4」(分化のクラスタ4)は、免疫細胞(例えば、ヘルパーT細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞)の表面で見られる糖タンパク質を指す。いくつかの実施形態において、CD4はTCRに対する共受容体として作用し、チロシンキナーゼ(例えば、Lck)を補充する。CD4の非限定的な例は、GenBankで見つけることができる(例えば、GenBank受入番号:AAC36010.1、CAA72740.1、AFK73394.1、CAA60883.1、およびAAH25782.1)。CD4の例示的なポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、以下で提供される例示的な配列表に列挙される。
用語「リボソームスキッピング配列」は、遺伝子配列が別々のポリペプチド(として翻訳される(つまり、ビシストロニック(biscistronic)または多シストロン性の配列として翻訳される)ように、同じプロモーターの管理下で2つ以上の遺伝子配列間に導入され得る任意の配列を指す。リボソームスキッピング配列の例は、限定されないが、2Aペプチド配列を含む。一実施形態では、1つのリボソームスキッピング配列は遺伝子配列間で導入される。別の実施形態では、2つ以上のリボソームスキッピング配列は遺伝子配列間で導入される。
用語「2Aリボソームスキッピング配列」はVal/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Proのコンセンサスモチーフを含むペプチド配列を指し、ここで、Xは任意のアミノ酸を表す。一実施形態では、2Aリボソームスキッピング配列は、ブタテッショウウイルス-1 2A(P2A);T2A、トセア・アシグナウイルス(Thosea asigna virus)2A(T2A));ウマ鼻炎Aウイルス(ERAV)2A(E2A);FMDV 2A(F2A)、またはその組み合わせを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。2Aペプチド配列の非限定的な例は、以下に提供される例示的な配列表中で提供される配列である。
2Aリボソームスキッピング配列は、1つの発現ベクター中の同義遺伝子の発現を可能にする。例えば、2Aリボソームスキッピング配列を有する発現ベクターは、CD3複合体を構成する4つのタンパク質すべてを発現することができる。一実施形態では、発現ベクターの非限定的な例示的コード領域配列は、以下に提供される例示的な配列表に列挙される:マウスCD3delta-F2Aγ-T2Aイプシロン-P2A-ゼータのポリヌクレオチド配列およびマウスCD3delta-F2Aγ-T2Aイプシロン-P2A-ゼータのポリペプチド配列、ならびにそれらの各々の等価物。
他の態様では、2Aリボソームスキッピング配列を有する発現ベクターは、TCRのマルチサブユニットを発現することができる。いくつかの実施形態において、発現ベクターの非限定的な例示的コード領域配列は、SEQ ID NO:527~531(IGRP13-25TCR)、533~537(マウス化されたIGRP13-25TCR)、538~542(PPI76-90TCR)、または543~547(BDC2.5TCR)において提供される。
用語「IRES配列」または「内部リボソーム侵入部位配列」は、RNA配列の途中で翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、2つの遺伝子配列(例えば、レポーター読み取り枠)間のIRES配列の挿入は、mRNA分子の5’末端に結合された5’-キャップ構造とは独立して、下流タンパク質コード領域の翻訳を誘導することができる。適切なIRES配列は当技術分野において既知である。いくつかの実施形態において、IRES配列は、ポリオウイルス、ライノウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、古典的ブタコレラウイルス、およびウシウイルス性下痢症ウイルスに由来する。IRES配列の非限定的な例は、www.iresite.orgで見つけることができ、それは、参照によってその全体が組み込まれる。IRES配列の非限定的な例は、SEQ ID NO:524~526において提供され、限定されないが、EMCV IRES配列、pBag1 IRES配列、および合成IRES配列、ならびにその各々の等価物を含む。
用語「ルシフェラーゼ」は、生物発光の反応を触媒することができるタンパク質を意味する。例えば、基質(例えば、ルシフェリン、長鎖アルデヒドまたはコレントラジン(colentrazine))、エネルギー源(例えば、ATP)、および、および酸素が提供される場合、酵素としてのルシフェラーゼはシグナルを生成することができる。この開示に適切なルシフェラーゼ配列は当技術分野において既知である。一実施形態では、ルシフェラーゼ遺伝子は、ホタル(例えば、フォティヌス・ピラリス(Photinus pyralis))からのものである。ルシフェラーゼ配列の非限定的な例は、GenBankにあり得る(例えば、GenBank受入番号:AAR20792.1、AAL40677.1、AAL40676.1、およびAAV35379.1、ならびにそれらの各々の等価物)。ルシフェラーゼレポーターシステムは市販されている(例えば、Promega Cat.# E1500またはE4550)。以下で提供されるように、ルシフェラーゼタンパク質およびポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:555および556において提供される。
用語「βラクタマーゼ」は、β‐ラクタム環を分解できる酵素またはタンパク質を指す。一実施形態では、βラクタマーゼは、細菌によって生成された、β-ラクタム系抗生物質中のβ-ラクタム環を部分的にまたは完全に加水分解することができる酵素である。βラクタマーゼ配列の非限定的な例は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBankにあり得る(例えば、GenBank受入番号:AMM70781.1、CAA54104.1、およびAAA23441.1、ならびにそれらの各々の等価物)。
用語「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」あるいは「CAT」は、アセチル化された補酵素Aからクロラムフェニコールあるいは関連する誘導体までアセチル基を移動させることができる酵素またはタンパク質を指す。「CAT」の非限定的な例は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBankにあり得る(例えば、受入番号:OCR39292.1、WP_072643749.1、CUB58229.1、およびKIX82948.1、ならびにそれらの各々の等価物)。CATアッセイは市販されている(例えば、Thermal Fisher社の FAST CAT(商標) Chloramphenicol Acetyltransferase Assay Kit(F-2900))。
用語「分泌型胚性アルカリホスファターゼ」または「SEAP」は、試験プロモーター活性あるいは遺伝子発現に対するレポーターとして使用される、SEAP遺伝子(例えば、GenBank受入番号:NP 001623およびその等価物、2017年1月12日に最終アクセスされた)によってコードされた酵素を指す。SEAP配列の非限定的な例は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:ADV10306.1、AAB64404.1、EEB84921.1、およびEFD70636.1、ならびにそれらの各々の等価物)にあり得る。SEAP活性は、ルミノメーター(例えば、Promega社のTurner BioSystems Veritas Microplate Luminometer)で測定することができる。
用語「蛍光タンパク質」は、適切な電磁放射線で励起させられる時に光を発することができる任意のタンパク質を指し、該タンパク質は、天然または設計されたアミノ酸配列を有し、ならびにオワンクラゲ関連蛍光タンパク質のアミノ酸配列に由来する。蛍光タンパク質から放射する光は、蛍光性リーダー(例えば、FL600蛍光マイクロプレートリーダ)により判定することができる。蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色タンパク質(GFP)、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、または他の適切な蛍光タンパク質、あるいはそれらの組み合わせ、またはそれらの蛍光性の部分または誘導体を含む。蛍光タンパク質の配列は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:AFA52654.1、ACS44348.1、およびAAQ96629.1、ならびに各々の等価物)にあり得る。蛍光タンパク質プロモーターレポーターは市販されている(例えば、TakaRa Cat.#631089)。
「転写調節下で」とは、当技術分野においてよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列(通常、DNA配列)の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進する要素に有効に結合されることに依拠することを示す。「有効に結合される」とは、ポリヌクレオチドが細胞中で機能することを可能にする様式でポリヌクレオチドが配置されることを示す。
ポリヌクレオチドに適用される際の用語「コードする」とは、ポリペプチドを「コードする」と言われているポリヌクレオチドが、天然の状態であるか、あるいは当業者に既知の方法によって操作される場合、ポリペプチドおよび/またはそのフラグメントについてのmRNAを生成するために転写および/または翻訳され得ることを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コードする配列はそこから推定することができる。
用語「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を始めるDNAの領域を指す。プロモーターは、適切に転写を始めるために必要なプロモーターの最小部分であるコアプロモーターを含み、転写因子結合部位などの調節エレメントも含むことができる。調節エレメントは転写を促進または阻害することができる。プロモーター中の調節エレメントは、転写活性化因子または転写抑制因子用の結合部位であり得る。プロモーターは構成的または誘導性であり得る。構成的プロモーターは常に活性であり、および/または転写の基礎レベルを超える遺伝子の転写を常に指示するものを指す。そのようなものの非限定的な例は、ホスホグリセレートキナーゼ1(PGK)プロモーター;SSFV、CMV、MNDU3、SV40、Ef1a、UBC、およびCAGGを含む。誘導性プロモーターは、細胞に添加されるか、または細胞中で発現される分子または因子によって誘発されることができるものである。誘導性プロモーターは、誘発の不在下で、依然として転写の基礎レベルを生成することがあるが、誘発は、典型的にはタンパク質の産生を大幅に増加する。
エンハンサーは標的配列の発現を増大させる調節エレメントである。「プロモーター/エンハンサー」はプロモーターおよびエンハンサーの機能の両方を提供することができる配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの末端反復配列は、プロモーターおよびエンハンサーの機能の両方を含む。エンハンサー/プロモーターは「内因性」または「外因性」あるいは「異種性」であってもよい。「内因性」のエンハンサー/プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子と自然に結合されるものである。「外因性」または「異種性」のエンハンサー/プロモーターは、その遺伝子の転写が結合されたエンハンサー/プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作(つまり、分子生物学的技術)による遺伝子に並置されるものである。この開示のポリヌクレオチドは随意にエンハンサー配列を含む。
本明細書で使用されるように、用語「NFATプロモーター」、「NFAT転写因子結合DNA配列」、または「活性化T細胞プロモーターの核因子」は、1つ以上のNFAT要素を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、NFAT転写因子(例えば、NFATc1、NFATc2、NFATc3、NFATc4、またはNFAT5)によるNFATプロモーターの結合は、下流配列(例えば、レポーター)の転写を増大させるか、あるいは促進する。NFATプロモーター配列は、通常GenBankの中にあり、それは、限定されないが、受入番号:DQ904462.1、KX591058.1、AF480838.1、およびそれらの各々の等価物のGenBankからの以下の配列、ならびにそれらの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、あるいは100%の同一性を有する配列を含む。
本明細書で使用されるように、用語「AP-1プロモーター」または「AP-1転写因子を結合DNA配列」は、1つ以上のAP-1転写活性化要素を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、AP-1転写因子によるAP-1プロモーターの結合は、下流配列(例えば、ルシフェラーゼまたはCATのようなレポーター)の転写を増大させるか、または促進する。AP-1プロモーターは、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ハエまたは他の種に由来してもよい。一実施形態では、AP-1プロモーターは、ATGAGTCATの配列、およびその等価物、またはATGAGTCATと等価で少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、あるいは100%の配列同一性を有する配列を有する。
本明細書で使用されるように、用語「NF-κBプロモーター」または「NF-κB転写因子結合DNA配列」は、1つ以上のNF-κB要素を含むか、または代替的にそれからからなるか、あるいはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとしてのRel/NF-κB転写因子のNF-κBプロモーターへの結合は、下流配列(例えば、ルシフェラーゼまたはCATのようなレポーター)の転写を増大させるか、あるいは開始する。NF-κBプロモーターまたは結合部位のいくつかの実施形態は、米国特許第8,299,237号に開示され、参照によってその全体中が組み込まれる。
本明細書で使用されるように、用語「IL-2プロモーター」または「IL-2転写因子結合DNA配列」は、T細胞シミュレーションに応答する1つ以上のIL-2転写活性化要素を含むか、または代替的にそれからなるか、あるいはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、転写因子のIL-2プロモーターへの結合は、下流配列(例えば、ルシフェラーゼまたはCATのようなレポーター)の転写を増大させるか、開始する。一実施形態では、IL-2プロモーターは、ヒト、マウス、ラット、またはゼブラフィッシュに由来する。いくつかの非限定的な例示的IL-2プロモーター配列は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBankから、受入番号:AJ006884.1、EF397241.1、AB041341.1、KU058846.1、EF457240.1、およびHM802330.1、ならびにそれらの各々の等価物で入手可能である。
本明細書で使用されるように、用語「ベクター」は、例えば、形質転換のプロセスにより細胞内に配置される時にベクターが複製され得るように、無傷のレプリコンを含む非染色体核酸を指す。ベクターはウイルスまたは非ウイルスであってもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウィルス、バキュロウイルス、修飾バキュロウイルス、パポウイルス(papovirus)または他の方法で修飾された自然発生のウイルスを含む。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターは、ネイキッドDNA;単独であるいはカチオン性ポリマーと組み合わせた、カチオン性脂質で複合体化されたDNA;アニオン性およびカチオン性リポソーム;場合によっては、リポソーム中に含まれる、異質性ポリリシン、定められた長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーと共に縮合されるDNAを含むDNAタンパク質複合体および粒子;ならびに、ウイルスおよびポリリシンDNAを含む三元複合体の使用を含む。
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボ、あるいはインビトロのいずれかで宿主細胞へと送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えで生成されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどを含む。セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターなどのアルファウイルスベクターも、遺伝子治療および免疫療法での使用のために開発されている。Schlesinger and Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439 and Ying, et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827参照。
遺伝子移入がレンチウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レンチウイルスゲノムまたはその一部、ならびに治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるように、「レンチウイルス媒介遺伝子導入」または「レンチウイルス形質導入」は同じ意味を持ち、および、細胞に入り、かつそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスにより、遺伝子または核酸配列が安定して宿主細胞へと転写されるプロセスを指す。ウイルスは、感染のその正常なメカニズムを介して宿主細胞を侵入することができるか、またはそれが異なる宿主細胞表面レセプタあるいはリガンドに結合して細胞に侵入するように修飾することができる。レトロウイルスは、RNAの形態でそれらの遺伝子情報を保有するが;一旦ウイルスが細胞を感染させると、該RNAは、感染細胞のゲノムDNAに組み込むDNAの形態へと逆転写される。組み込まれたDNA形態はプロウイルスと呼ばれる。本明細書で使用されるように、レンチウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス性侵入機構を介して細胞へと外因性核酸を導入することができるウイルス粒子を指す。「レンチウイルスベクター」は、他のレトロウイルスベクターと比較して、非分裂細胞を形質導入する際に特定の利点を有する当技術分野において既知のレトロウイルスベクターの一種である。Trono D. (2002) Lentiviral vectors, New York: Spring-Verlag Berlin Heidelbergを参照。
本発明のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス(MLVを含有するレトロウイルスのサブグループ)、およびレンチウイルス(HIVを含有するレトロウイルスのサブグループ)に基づくか、またはそれらに由来する。例としてはASLV、SNV、およびRSVが挙げられ、それらのすべてがレンチウイルスベクター粒子産生システムのためにパッケージングおよびベクター成分へと分割されている。本発明のレンチウイルスベクター粒子は、遺伝的または他の方法(例えば、細胞系をパッケージングする特定の選択)で変更されたバージョンの特定のレトロウイルスに基づいてもよい。
発明のベクター粒子は特定のレトロウイルスに「基づく」ことは、ベクターがその特定のレトロウイルスに由来することを意味する。ベクター粒子のゲノムは、そのレトロウイルスからの成分を骨格として含む。ベクター粒子は、逆転写および組み込みシステムを含むRNAゲノムと互換性のある必須のベクター成分を含有している。通常、これらは、特定のレトロウイルスに由来するgagタンパク質およびpolタンパク質を含む。したがって、ベクター粒子の構造成分の大半は、所望の有用な特性をもたらすために遺伝的にあるいは他の方法で変更されている可能性があるが、通常はそのレトロウイルスに由来する。しかし、特定の構造成分および特にenvタンパク質は、異なるウイルスに由来してもよい。感染または形質導入されたベクター宿主域および細胞型は、ベクター粒子産生システム内の異なるenv遺伝子を使用してベクター粒子に異なる特異性を与えることによって、変更することができる。
本明細書で使用されるように、用語「Jurkat」は、ヒトのリンパ球株を指す。様々な型のJurkat細胞が存在する。一実施形態では、Jurkat細胞はIL-2を生成することができる。Jurkat細胞は市販されているか、または細胞株リポジトリ(例えば、ATCC No.TIB-152)から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載される。
本明細書で使用されるように、用語「JurMa」または「Jurkat/MA」は、内因性TCR発現を欠くJurkat細胞株を指す。JurMa細胞の一実施形態は、Universiteit Medisch Centrum, AmsterdamのErik Hooijberg Vrije博士によって確立された(Asai et al., PLoS One. 8(2): e56820 (2013)(2017年1月12日に最終アクセスされた)を参照)。
本明細書で使用されるように、用語「BW5147」は、T細胞機能を試験するために使用することができるリンパ球株を指す。いくつかの実施形態において、BW5147細胞はリンパ腫に由来する。多くのタイプのBW5147細胞(市販されているか、または細胞株リポジトリ(例えば、ATCC No.TIB-472)から利用可能)、ならびに細胞を培養する方法および組成物が本明細書に記載されている。
本明細書で使用されるように、用語「HuT-78」はリンパ球株を指す。一実施形態では、HuT-78はT細胞性リンパ腫細胞株である。HuT-78細胞は、市販されているか(例えば、Sigma-Aldrich)、または細胞株リポジトリ(例えば、ATCC No.TIB-161)から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載されている。
本明細書で使用されるように、用語「CEM」はリンパ球株を指す。一実施形態において、CEM細胞は末梢血リンパ芽球細胞である。CEM細胞は、細胞株リポジトリ(例えば、ATCC No.CRL-2265またはCCL-119)から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載されている。
本明細書で使用されるように、用語「Molt-4」はリンパ球株を指す。一実施形態では、Molt-4細胞は急性リンパ芽球性白血病細胞である。Molt-4細胞は市販されているか(例えば、Sigma-Aldrich)、または細胞株リポジトリ(例えば、ATCC No.CRL-1582)から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載されている。
「結合価」は、1ナノ粒子コア当たりのpMHC、あるいは1ナノ粒子当たりの共同刺激、および/または1ナノ粒子コア当たりのサイトカインの数に関連する。
「密度」は、1ナノ粒子コア当たりのpMHC、または1ナノ粒子当たり共同刺激、および/または1ナノ粒子コア当たりのサイトカインを参照する場合、リンカーをさらに含むことができる外部層を有するナノ粒子コアの表面積として計算される。表面積は、使用される構成物の利用可能な表面積の合計である。
「抗原」は、本明細書で使用されるように、被験体の免疫応答、または免疫細胞、好ましくは、T細胞またはB細胞の増殖を引き起こし得る分子の、全て、一部、フラグメント、あるいはセグメントを指す。一態様では、抗原は癌関連抗原である。他の態様では、抗原は自己免疫疾患関連抗原である。さらなる態様では、抗原はアレルゲンである。
用語「アルキル」は、1~10の炭素原子(すなわち、C1-C10アルキル)、1~6の炭素原子(すなわち、C1-C6アルキル)、または1~4の炭素原子を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語は、一例として、メチル(CH3)、エチル(CH3CH2)、nプロピル(CH3CH2CH2-)、イソプロピル((CH3)2CH-)、n-ブチル(CH3CH2CH2CH2)、イソブチル((CH3)2CHCH2)、sec-ブチル((CH3)(CH3CH2)CH-)、t-ブチル((CH3)3C-)、n-ペンチル(CH3CH2CH2CH2CH2-)、およびネオペンチル((CH3)3CCH2-)などの直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基を含む。
用語「アルコキシ」は-O-アルキルを指す。
「模倣物」は、所与のリガンドまたはペプチドのアナログであり、該アナログはリガンドに実質的に類似する。「実質的に類似する」とは、模倣物が約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、約10%未満、または約5%未満の分子量のリガンドを総体的に占める1以上の官能基または修飾を有していることを除いて、アナログがリガンドと同様の結合プロファイルを有していることを意味する。
「免疫細胞」は、例えば、骨髄、リンパ球(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞)、および脊髄由来の細胞(好中球、好酸球、好塩基性細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞)において生成された造血幹細胞(HSC)に由来する白血球(白血球)を含む。本明細書で使用されるように、用語「B細胞」は、適応免疫系の液性免疫におけるリンパ球の一種を指す。B細胞は主に、抗体を作り、抗原提示細胞としての役割を果たし、サイトカインを放出し、および抗原相互作用による活性化の後に記憶B細胞を発達させるように機能する。B細胞は、細胞表面上のB細胞受容体の存在により、T細胞などの他のリンパ球と区別される。本明細書で使用されるように、用語「T細胞」は、胸腺において成熟するリンパ球の一種を指す。T細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上のT細胞受容体の存在によりB細胞などの他のリンパ球と区別される。T細胞は、市販で入手可能なソースから分離され、またはそこから獲得される場合もある。「T細胞」は、ヘルパーT細胞(CD4+細胞)、細胞障害性T細胞(CD8+細胞)、ナチュラルキラーT細胞、制御性T細胞(Treg)、およびガンマ-デルタT細胞を含む、CD3を発現させる免疫細胞の全ての種類を含む。「細胞傷害性細胞」は、CD8+T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、および好中球を含み、これら細胞は細胞毒性反応を媒介することができる。
用語「エフェクターT細胞」は、本明細書で使用されるように、さらなる分化を必要とすることなく、抗原を特異的に結合しかつ免疫応答(エフェクター機能)を媒介することができるT細胞を指す。エフェクターT細胞の例は、CTL、TH1細胞、TH2細胞、エフェクター記憶細胞、およびヘルパーT細胞を含む。エフェクターT細胞とは対照的に、ナイーブT細胞は、それらの特異性抗原、MHC複合体に遭遇せず、増殖およびエフェクターT細胞への分化によって該複合体に反応もしない。エフェクターT細胞は、(細胞周期のG0相において)静止するか、または活性化(増殖)され得る。
用語「抗病原性自己反応性T細胞」は、抗病原性特性を持つT細胞(すなわち、MS、MS関連性疾患または障害、あるいは糖尿病前症などの自己免疫疾患を相殺するT細胞)を指す。このようなT細胞は、抗炎症性T細胞、中央記憶T細胞、エフェクター記憶T細胞、記憶T細胞、低結合活性T細胞、ヘルパーT細胞、自己調節性T細胞、細胞障害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞、調節性T細胞、TR1細胞、サプレッサーT細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞などを含み得る。
用語「抗炎症性T細胞」は、抗炎症反応を促進するT細胞を指す。T細胞の抗炎症機能は、抗炎症性タンパク質、サイトカイン、ケモキネスなどの生成および/または分泌を通じて達成される場合がある。抗炎症性タンパク質は、免疫応答を抑える抗増殖シグナルを包含するようにも意図される。抗炎症性タンパク質は、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21、IL-23、IL-27、IFN-α、TGF-β、IL-1ra、G-CSF、および、TNFならびにIL-6の可溶性受容体を含む。
用語「分化された」とは、第1のタイプの細胞が第2のタイプの細胞へと発達するように誘発される時を指す。いくつかの実施形態において、同族T細胞は、調節性TR1細胞へと分化される。いくつかの実施形態において、活性化T細胞はTR1細胞へと分化される。いくつかの実施形態において、記憶T細胞はTR1細胞へと分化される。いくつかの実施形態において、B細胞は調節性B細胞へと分化される。
本明細書で使用されるように、「ノブ・イン・ホール」は、突起がヘテロ多量体の形成を促進するように腔の中に位置するこができるように、第1のポリペプチドの界面において突起(または「ノブ」)を必要とし、および第2のポリペプチドの界面において対応する腔(または「ホール」)を必要とするポリペプチジル構造を指す。隆起は、第1のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖(例えば、フェニルアラニンまたはチロシン)と交換することにより構築される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニンまたはトレオニン)と交換することによって、隆起と同一または同様のサイズの空洞が、第2のポリペプチドの界面に作られる。隆起および空洞は、当業者による慣例方法を使用して、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって、またはペプチド合成などによって合成手段により作られ得る。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドの界面は、第1のポリペプチドのFcドメイン上に位置し、第2のポリペプチドの界面は、第2のポリペプチドのFcドメイン上に位置する。ノブ・イン・ホールのヘテロ多量体、およびそれらの調製物ならびに使用の方法は、米国特許第5,731,168号;第5,807,706号;第5,821,333号;第7,642,228号;第7,695,936号;第8,216,805号;および、第8,679,785号に開示され、これらのすべては、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用されるように、「MHC-アルファ-Fc/MHC-ベータ-Fc」は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体を指し、ここで、該第1のポリペプチドはMHCクラスIIα-鎖および抗体Fcドメインを含み;該第2のポリペプチドは、MHCクラスIIβ-鎖および抗体Fcドメインを含む。ノブ・イン・ホールMHC-アルファ-Fc/MHC-ベータ-Fcは、各ポリペプチドのFcドメインが、他のFcドメイン上の対応する空洞内の1つのFcドメイン上の隆起の相補的位置決めによって互いに相互作用することをさらに必要とする。
用語「分離された」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントが通常自然において関連する、構成要素、細胞、またはその他のものから単離されることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドは、通常は染色体に関連する5’および3’の配列から単離されるものである。当業者にとって明白なように、自然には生じないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、これらを自然に発生する等価物と区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、体積当たりの分子の濃度または数が、その自然に発生する等価物のものよりも濃縮されており、またはその自然に発生する等価物のものよりも分離されていないという点で、その自然に発生する等価物と区別することができる。それらの一次配列、または例えば、それらの糖鎖付加パターンが自然に発生する点で等価物とは異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、それらの一次配列、または代替的にそれらの糖鎖付加パターンなどの別の特徴によって、自然に発生する等価物と区別可能であることから、単離された形態で存在する必要はない。T細胞などの哺乳動物細胞は、生体で見つけられる解剖学的部位から除去されると単離される。
「自己反応性T細胞」は、T細胞を含有する同じ個体により生成および含有される分子である「自己抗原」を認識するT細胞である。
「病原性T細胞」は、T細胞を含有する被験体に有害なT細胞であるが、非病原性T細胞は被験体には実質的に有害ではなく、抗病原性T細胞は、病原性T細胞の害を減少させるか、改善するか、阻害するか、または無効にする。
本明細書で使用されるように、調節性B細胞または制御性B細胞(「B-reg」)は、CD1dおよびCD5の発現、ならびにIL-10の分泌を特徴とする抗炎症作用の原因となる細胞を指す。B-regはまた、Tim-1の発現により同定され、Tim-1のライゲーションを介して誘発されることで耐性を促すことができる。B-regの能力は、トール様受容体、CD40リガンド、およびその他のものなどの多くの刺激因子により促進されることが示された。しかし、B-regの完全な特徴化は進行中である。B-regはまた、高レベルのCD25、CD86、およびTGF-βを発現させる。このB細胞のサブセットは、Th1増殖を抑え、従って自己寛容の維持に寄与し得る。B-regの機能の活性化は、多くの免疫調節薬物の目的となり、自己免疫疾患のより優れた制御に寄与しなければならない。例えば:2013年10月31日に最終アクセスされたncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23707422を参照。
1型調節性T(TR1)細胞は、調節特性を有し、かつインビトロおよびインビボで抗原特異的免疫応答を抑えることができるCD4+T細胞のサブセットである。このようなTR1細胞は、サイトカイン産生のそれらの特有のプロファイルによって定義され、高レベルのIL-10およびTGF-ベータを作るが、IL-4またはIL-2は作らない。このような細胞により生成されたIL-10およびTGF-ベータは、インビトロで原発性のナイーブT細胞の阻害を媒介する。さらに、TR細胞がインビボで存在するという証拠が存在しており、および、同種幹細胞移植を受けている重症複合免疫不全症の患者において高度なIL-10を生成するCD4(+)T細胞の存在が実証されている。TR1細胞は、末梢性寛容の調節に関係し、これらはインビボで免疫応答を調節するために細胞療法として潜在的に使用され得る。例えば:2013年10月31日に最終アクセスされたncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10887343を参照。
TR1細胞は、高レベルのIL-10およびTGF-ベータを生成する能力によって定義される。様々な抗原に特異的なTR1細胞はインビボで生じるが、インビトロでのIL-10の存在下ではナイーブCD4+T細胞から分化することもある。TR1細胞の増殖能は低く、これはIL-15により克服され得る。TR1細胞は、IL-10およびTGF-ベータの生成を介して、1型または2型のナイーブおよび記憶Tヘルパーの反応を抑える。分子レベルでのTR1細胞のさらなる特徴化は、それらの作用機構を定義し、かつTr細胞の他のサブセットとの関係を明確にする。新たな治療剤の開発のために新たな標的を同定するための、および末梢性寛容を調節するための細胞療法としてのTR1細胞の使用が予見され得る。例えば、2013年10月31日に最終アクセスされたncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11722624を参照。
「有効な量」は、意図した目的を達成するのに十分な量であり;そのような非限定的な例は、T細胞受容体の複合体化、免疫応答の開始、免疫応答の調節、炎症反応の抑制、およびT細胞活性またはT細胞集団の調節含む。一実施形態では、有効な量は標的細胞のTCR経路を刺激するのに十分な量である。一態様において、有効な量は、明示された治療目的を達成するか、測定可能な応答を提供するように機能する量(例えば、治療上有効な量)である。本明細書で詳細に記載されるように、有効な量または投与量は目的および組成物に依存し、本開示に従って決定され得る。
有効な量の治療用組成物は、意図した目的に基づいて決定される。用語「単位投与量」あるいは「投与量」は、被験体に使用するのに適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、投与に関連して、つまり、適切な経路およびレジメンに関連して、上で述べられた所望の反応を引き起こすために計算されたあらかじめ決められた量の組成物を含む。投与される量は、処置の数および単位投与量の両方に従って、望ましい結果および/または保護に依存する。組成物の正確な量はさらに医師の判断に委ねられ、各個体に特有である。投与量に影響する因子は、被験体の物理的および臨床的状態、投与経路、意図した治療目的(症状の緩和対治癒)および効力、安定性、および特定の組成物の毒性を含んでいる。製剤化に際して、溶液は、投与量製剤と適合する手法で、および治療上あるいは予防的に有効な量で投与される。製剤は上記の注入可能な溶液のタイプなど、様々な剤形で容易に投与される。
「MHC多量体」とは、この用語が本明細書で使用されるように、2以上、通常は4つ、または最大で50以上のMHCモノマーの複合体を意味する。
本明細書で使用されるように、「多量複合体(multimer complex)」は、標的細胞集団と1以上のpMHC複合体との間の複合体を指し、pMHC複合体のMHCタンパク質はMHCタンパク質の多量体形態を含む。いくつかの実施形態において、MHCタンパク質の多量体形態は、二量体、三量体、四量体、五量体、またはデキストラマーを含む。
本明細書で使用されるように、句「免疫応答」またはその同等物「免疫学的応答」は、(抗原特異性T細胞またはそれらの分泌物により媒介される)細胞媒介性反応の進行を指す。細胞性免疫応答は、ウイルス感染を処置または予防し、および/または抗原特異性Breg細胞、TC1、CD4+ヘルパーT細胞、および/またはCD8+細胞障害性T細胞、および/または疾患生成の自己調節性T細胞およびB細胞の「記憶」細胞を増殖するために、クラスIまたはクラスIIのMHC分子に関連したポリペプチドエピトープの提示により誘発される。該応答は、他の成分の活性化にも関係し得る。いくつかの態様において、用語「免疫応答」は、免疫細胞の調節ネットワークの形成を包含するように使用され得る。したがって、用語「調節ネットワーク形成」とは、免疫細胞、好ましくはT細胞、より好ましくは調節性T細胞が、限定されないが、B細胞または抗原提示細胞(非限定的例として、樹状細胞、単球、およびマクロファージを含む)などを含む他の免疫細胞のさらなる分化を引き起こすように誘発される、免疫応答を指す。ある実施形態において、調節ネットワーク形成は調節性B細胞へと分化されるB細胞に関係し、ある実施形態において、調節ネットワーク形成は寛容原性抗原提示細胞の形成に関係している。
本明細書に記載されるように、「ナノ球体」、「NP」、または「ナノ粒子」は、適宜、被験体、細胞標本、または組織標本に単独または複数で投与される、小さな別個の粒子を意味する。ある実施形態では、用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用されるように、ナノ粒子コアの周囲の任意の層も含み、したがって、リンカー層などの層を有する、または有しないコアを含む。ある実施形態において、ナノ粒子の形状は実質的に球状である。ある実施形態において、ナノ粒子はリポソームまたはウイルス粒子である。さらなる実施形態において、ナノ粒子は、任意の適切な物質、例えば、固体、固体コア、金属、デンドリマー、高分子ミセル、金属酸化物、またはタンパク質、あるいはそれらのフラグメントまたは組み合わせで構成される。用語「実質的に球状」とは、本明細書で使用されるように、粒子の形状が約10%を超えて球体から逸脱しないことを意味する。
用語「炎症反応」および「炎症」は、本明細書で使用されるように、病原体、損傷を受けた細胞、または刺激物などの有害な刺激に対する個体の血管組織の複雑な生体応答を示すものであり、サイトカイン、より好ましくは炎症促進性サイトカイン(即ち、活性化免疫細胞により優勢的に生成されかつ炎症反応の増幅に関与するサイトカイン)の分泌を含む。典型的な炎症促進性サイトカインは、限定されないが、IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α、IL-17、IL21、IL23、IL27、およびTGF-βを含む。典型的な炎症は急性炎症および慢性炎症を含む。急性炎症は、血漿および白血球による組織の浸潤を原因とする炎症(腫れ、発赤、疼痛、熱、および機能の損失)の典型的な兆候を特徴とする短期のプロセスを示す。急性炎性が典型的に、有害な刺激が存在する限り発生し、一旦刺激が取り除かれるか、弱まるか、または瘢痕(繊維症)により仕切られる(walled off)と刺激は止まる。慢性炎症は、同時発生の活性炎症、組織破壊、および修復の試みを特徴とする疾病を示す。慢性炎症は、上で列挙された急性炎性の典型的な兆候を特徴としない。代わりに、慢性的に炎症を起こした組織は、単核免疫細胞(単球、マクロファージ、リンパ球、および形質細胞)の浸潤、組織破壊、ならびに血管新生と繊維症を含む治癒の試みを特徴とする。炎症は、個体における炎症に関連した複雑な生体応答を形成する事象のいずれか1つに影響を及ぼし、具体的には、阻害することにより、本開示の意味において阻害することができる。
本明細書で使用されるように、用語「疾患関連」抗原は、選択された疾患を処置するために選択された抗原またはそのフラグメントを指し、および疾患プロセスに関与する。例えば、糖尿病関連抗原は、提示された時に糖尿病を処置する役目を果たす免疫応答を生成する抗原またはそのフラグメントであり、故に、そのような効果を生成する糖尿病関連抗原は、糖尿病を処置するために選択される。多発性硬化症(MS)関連抗原は、MSを処置するために選択される。糖尿病関連の抗原は、MSを処置するためには選択されない。同様に、自己免疫関連抗原は、自己免疫疾患に関連する抗原であり、自己免疫以外の障害または疾患(例えば、癌)の処置のためには選択されない。限定されない例示的な疾患関連抗原が本明細書に開示され、さらに、そのような抗原は、文献中で実証される技術、機構、および方法に基づいて特定の疾患について決定され得る。
「自己免疫疾患または障害」は、個体自身の組織または器官から生じ、かつそれらに向けられる疾患または障害、あるいはそれらの出現(manifestation)またはそれらの結果として生じる疾病を含む。一実施形態において、自己免疫疾患または障害は、正常な身体組織および抗原に反応性のT細胞による生成の結果として生じるか、またはその生成によって悪化する疾病を指す。自己免疫疾患または障害の例は、限定されないが、関節炎(などの関節リウマチ、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風、または痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性関節炎、II型コラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スチル病、脊椎関節炎、若年発症型関節リウマチ、変形性関節症、慢性進行性関節炎(arthritis chronica progrediente)、変形関節炎、原発性慢性多発関節炎(polyarthritis chronica primaria)、反応性関節炎、および強直性脊椎炎)、炎症性過剰増殖皮膚病(inflammatory hyperproliferative skin diseases)、尋常性乾癬 、滴状乾癬、膿胞性乾癬および爪の乾癬などの乾癬、枯草熱およびヨブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、x連鎖高IgM症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎/皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症(全身性強皮症を含む)、全身性硬化症、スピノ光学(spino-optical)MS、原発性進行性MS(PPMS)、および再発寛解型MS(RRMS)などの多発性硬化症(MS)、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、多発性硬化症(sclerosis disseminata)、失調性硬化症などの硬化症、視神経脊髄炎スペクトル障害(デビック病またはデビック症候群としても知られるNMO)、炎症性腸疾患(IBD)(例えば、クローン病、自己免疫性媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性結腸炎、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン大腸炎、ポリープ茸腫様大腸炎、壊死性小腸大腸炎、全層性大腸炎、および自己免疫性炎症性腸疾患、腸炎症、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人を含む呼吸窮迫症候群、または急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、脳膜炎、葡萄膜のすべてまたは一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎などにおける脳神経損傷、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒症(pruritis scroti)、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫性疾病による突発難聴、アナフィラキシー性およびアレルギー性およびアトピー性鼻炎などのIgE媒介性疾患、ラスムッセン脳炎および大脳辺縁系および/または脳幹脳炎などの脳幹脳炎、急性前部虹彩炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、晶状体抗原性(phacoantigenic)ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎などのブドウ膜炎、慢性または急性糸球体腎炎(例えば、原発性GN、免疫媒介性GN、膜性GN(膜性腎症)、特発性膜性GN、または特発性膜性腎症、I型およびII型を含む膜性(membrano)または膜質増殖性GN(MPGN)、急速進行性GN)などのネフローゼ症候群を伴う、または伴わない糸球体腎炎(GN)、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、亀頭炎、例えば形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、層状魚鱗癬、表皮溶解性角化症、前癌性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー性症状および応答、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹、および水疱性掌蹠湿疹(vesicular palmoplantar eczema)などの湿疹、気管支喘息、気管支喘息、および自己免疫喘息などの喘息、T細胞の浸潤および慢性炎症反応に関与する疾病、妊娠中の胎児のA-B-O血液型などの異種抗原に対する免疫反応、慢性炎症性肺疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、例えば狼瘡腎炎、狼瘡脳炎、小児狼瘡、非腎臓狼瘡、腎外狼瘡、円板状狼瘡、および円板状エリテマトーデス、脱毛狼瘡を含む狼瘡、皮膚SLEまたは亜急性皮膚SLE、新生児狼瘡症候群(NLE)、および播種性紅斑性狼瘡などの全身性エリトマトーデス(SLE)、I型糖尿病、II型糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病(または1.5型糖尿病)を含む。さらに熟考されるのは、以下と関連する免疫応答である:サイトカインおよびTリンパ球によって媒介した急性または遅延型過敏症、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、顆粒球減少症、脈管炎を含む脈管炎、大型血管炎(リウマチ性多発筋痛および巨大T細胞(Takayasu)動脈炎を含む)、中型血管炎(川崎病および結節性多発性動脈炎/結節性動脈周囲炎を含む)、顕微鏡的多発動脈炎、免疫脈管炎(immunovasculitis)、CNS脈管炎、皮膚血管炎、過敏症脈管炎、全身的壊死性脈管炎などの壊死性脈管炎、およびチャーグ・ストラウス症候群または症候群(CSS)ならびにANCA関連小型血管炎などのANCA関連脈管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス試験陽性の貧血(Coombs positive anemia)、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫溶血性貧血(AIHA)を含む溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、アジソン病、自己免液性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外漏出に関与する疾患、CNS炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷、または出血に続発するものなどの多臓器損傷症候群、免疫複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病/症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーヴェンズ-ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡(pemphigoid bullous )および皮膚類天疱瘡(skin pemphigoid)などの天疱瘡様、天疱瘡(尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘液膜類天疱瘡、ならびに紅斑性天疱瘡を含む)、自己免疫性の多腺性内分泌障害、ライター病または症候群、温熱性外傷、子癇前症、免疫複合体性腎炎などの免疫複合体障害、抗体腎炎、ポリニュートパシー、IgMポリニュートパシーあるいはIgM媒介神経障害などの慢性の神経障害、慢性または急性のITPを含む特発性血小板減少性紫斑病(ITP)などの自己免疫性または免疫性媒介血小板減少症、後天性血小板減少性紫斑病、特発性角膜強膜炎(cerato-scleritis)などの強膜炎、上強膜炎、自己免疫性精巣炎と卵巣炎を含む精巣と卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎などの甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)、または亜急性甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、自己免疫性甲状腺疾患、原発性甲状腺機能低下症、グレーヴス病、多腺性自己免疫症候群(または、多腺性内分泌病症候群)などの多腺性症候群、ランバート-イートン筋無力症候群またはイートン-ランバート症候群などの神経系腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、全身硬直症候群(stiff-man or stiff-person syndrome)、アレルギー性脳脊髄炎(allergic encephalomyelitis or encephalomyelitis allergica)および実験的アレルギー性脳脊髄炎(EAE)などの脳脊髄炎、胸腺腫関連性重症筋無力症などの重症筋無力症、小脳変性症、神経ミオトニー、 眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調(OMS)、および感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨大T細胞肝炎、活動性慢性肝炎または自己免疫性活動性慢性肝炎、リンパ性間質性肺炎(LIP)、閉塞性細気管支炎(非移植)対NSIP、ギラン・バレー症候群、ベルガー病(IgA腎症)、特発性IgA腎症、線状IgA皮膚病、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変および肺硬変症などの硬変症、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック病(Celiac or Coeliac disease)、セリアックスプルー(グルテン腸症)、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症(ALS;ルー・ゲーリッグ病)、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患(AIED)などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性難聴、難治性または回帰性あるいは再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群/非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病/症候群、自己免疫性酒さ、帯状疱疹関連性疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、モノクローナルB細胞リンパ球増加症(例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、MGUS)を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパシー、腫瘍随伴症候群、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、聴覚喪失、失明、周期性麻痺などのチャネル病およびCNSのチャネル病、自閉症、炎症性筋疾患、巣状または分節性あるいは巣状分節性糸球体硬化症(FSGS)、内分泌性眼障害、網膜ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病学的障害、線維筋痛、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老性痴呆、自己免疫性脱髄症および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーなどの脱髄性疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症(alopecia greata)、完全脱毛症、CREST症候群(石灰沈着症、レイノー現象、食道蠕動運動低下、強指症、および毛細血管拡張症)、例えば抗精子抗体による男性および女性の自己免疫性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球性脈管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア熱、リーシュマニア症などの寄生虫症、キパノシミアシス(kypanosomiasis)、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、膵嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎(eosinophilic faciitis)、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア(flariasis)、慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎(急性または慢性)またはフックス毛様体炎(Fuch’s cyclitis)などの毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症、SCID、後天性免疫不全症候群(AIDS)、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒血症、膵炎、甲状腺中毒症(thyroxicosis)、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン・バーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァン症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、レンサ球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis ubiterans)、甲状腺中毒、脊髄癆、脈絡膜炎、巨大T細胞多発性筋痛、慢性過敏性肺炎、乾
性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小病変症、良性家族性および虚血再潅流障害、移植臓器再灌流、網膜性自己免疫、ジョイント炎症、気管支炎、閉塞性気道疾患/肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化の障害、精子形成欠如(asperniogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)、腸炎アレルギー、癩性結節性紅斑、特発顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感音性(sensoneural)難聴、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域(ileitis regionalis)、白血球減少症、単核球症感染症、横断性脊髄炎(traverse myelitis)、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発神経根炎、壊疽性膿皮症、Quervain甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、毒素ショック症候群、食中毒、T細胞の浸潤に関与する疾病、白血球接着不全症、サイトカインおよびTリンパ球により媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、白血球漏出に関与する疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多内分泌症、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、I型自己免疫性多発内分泌腺症候群、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、心筋症、例えば拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(EBA)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、節骨、前頭、上顎骨、または蝶形骨の副鼻腔炎、好酸性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加筋痛症候群、レフレル症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性好酸球増多性肺疾患、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローマ、または好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多腺性自己免疫症候群、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細管拡張性失調症症候群、脈管拡張症、コラーゲン病に関連した自己免疫障害、リウマチ、神経系疾患、リンパ節炎、血圧応答の減少、血管機能不全、組織傷害、心血管虚血、痛覚過敏症、腎虚血、脳虚血、および血管新生、アレルギー性過敏症障害、糸球体腎炎、再潅流障害、虚血性再潅流障害、心筋または他の組織の再潅流障害を伴う疾患、リンパ腫の気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性要素を伴う皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連性症候群、サイトカインに誘導される毒性、ナルコレプシー、急性の重度の炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、気腫、円形脱毛症、脂肪組織炎症/II型糖尿病、肥満症関連性脂肪組織炎症/インスリン抵抗性、および子宮内膜症。
性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小病変症、良性家族性および虚血再潅流障害、移植臓器再灌流、網膜性自己免疫、ジョイント炎症、気管支炎、閉塞性気道疾患/肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化の障害、精子形成欠如(asperniogenese)、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎(endophthalmia phacoanaphylactica)、腸炎アレルギー、癩性結節性紅斑、特発顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感音性(sensoneural)難聴、血色素尿症発作(haemoglobinuria paroxysmatica)、性機能低下、回腸炎領域(ileitis regionalis)、白血球減少症、単核球症感染症、横断性脊髄炎(traverse myelitis)、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経眼炎(ophthalmia symphatica)、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発神経根炎、壊疽性膿皮症、Quervain甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、毒素ショック症候群、食中毒、T細胞の浸潤に関与する疾病、白血球接着不全症、サイトカインおよびTリンパ球により媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、白血球漏出に関与する疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多内分泌症、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、I型自己免疫性多発内分泌腺症候群、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、心筋症、例えば拡張型心筋症、後天性表皮水疱症(EBA)、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、節骨、前頭、上顎骨、または蝶形骨の副鼻腔炎、好酸性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加筋痛症候群、レフレル症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性好酸球増多性肺疾患、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローマ、または好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多腺性自己免疫症候群、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細管拡張性失調症症候群、脈管拡張症、コラーゲン病に関連した自己免疫障害、リウマチ、神経系疾患、リンパ節炎、血圧応答の減少、血管機能不全、組織傷害、心血管虚血、痛覚過敏症、腎虚血、脳虚血、および血管新生、アレルギー性過敏症障害、糸球体腎炎、再潅流障害、虚血性再潅流障害、心筋または他の組織の再潅流障害を伴う疾患、リンパ腫の気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性要素を伴う皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連性症候群、サイトカインに誘導される毒性、ナルコレプシー、急性の重度の炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、気腫、円形脱毛症、脂肪組織炎症/II型糖尿病、肥満症関連性脂肪組織炎症/インスリン抵抗性、および子宮内膜症。
いくつかの実施形態において、自己免疫障害または疾患は、限定されないが、I型およびII型の真性糖尿病、糖尿病前症、移植拒絶反応、多発性硬化症、多発性硬化症関連疾患、早期卵巣機能不全、強皮症、シェーグレン病/症候群、狼瘡、白斑、脱毛症(禿頭症)、多腺不全、グレーヴス病、甲状腺機能不全、多発性筋炎、天疱瘡、クローン病、大腸炎、自己免疫性肝炎、下垂体前葉機能低下症、心筋炎、アジソン病、自己免疫性皮膚病、ブドウ膜炎、悪性貧血、副甲状腺機能低下症、および/またはリウマチ性関節炎を含み得る。対象の他の指標は、限定されないが、喘息、アレルギー性喘息、原発性胆汁性肝硬変、硬変症、視神経脊髄炎スペクトル障害(デビック病、視神経脊髄型多発性硬化症(OSMS))、尋常性天疱瘡、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、リウマチ性関節炎、全身性エリトマトーデス(SLE)、セリアック病、乾癬、自己免疫性心筋症、特発性拡張型心筋症(IDCM)、重症筋無力症、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、免疫媒介性筋障害、前立腺癌、抗リン脂質抗体症候群(ANCA+)、アテローム性動脈硬化症、皮膚筋炎、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、気腫、脊髄損傷、外傷、たばこ誘発肺破壊、ANCA関連性脈管炎、乾癬、硬化性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、および中枢神経系と末梢神経系の疾患を含む。
いくつかの実施形態において、自己免疫障害または疾患は、限定されないが、糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、落葉状落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎スペクトル障害、関節炎(リウマチ性関節炎を含む)、アレルギー性喘息、炎症性腸疾患(クローン病と潰瘍性大腸炎を含む)、全身性エリトマトーデス、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患、気腫、乾癬、自己免疫性肝炎、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、強皮症、抗リン脂質抗体症候群、ANCA関連性脈管炎、およびスティフ・マン症候群を含み得る。
多発性硬化症(MS)は「多発硬化症(disseminated sclerosis)」、「散在性脳脊髄炎(encephalomyelitis disseminate)」または「アレルギー性脳脊髄炎」としても知られている。MSは、脳および脊髄の軸索まわりの脂肪ミエリン鞘が損傷し、脱髄および瘢痕化の他に、広範囲の徴候および症状につながる炎症性疾患である。多発性硬化症関連障害は、例えば、視神経脊髄炎スペクトル障害(NMO)、ブドウ膜炎、神経障害性疼痛などを含む。
「ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質」(MOG)は、中枢神経系(CNS)における神経の髄鞘化のプロセスにおいて重要であると考えられる糖タンパク質である。ヒトにおいて、このタンパク質は、MOG遺伝子によってコードされる。それは、ミエリン鞘に構造的完全性を提供する必要な「接着分子」として機能すると推測され、オリゴデンドロサイト上で遅れて進行すると知られている。GenBank受入番号:NM_001008228.2およびNP_001008229.1は、それぞれ、MOG遺伝子のmRNAおよびタンパク質配列を表す。これらのGenBank受入番号の各々に関連する配列は、すべての目的のために参照によって組み込まれる。
本明細書で使用されるように、「癌(cancer)」および「癌性の(cancerous)」という用語は、典型的に未制御の細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、またはそれについて記載している。癌の例は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、ならびにそれらの転移を含む。「転移」という用語は、血液またはリンパ管あるいは膜表面を介して、疾患を引き起こす有機体または悪性あるいは癌性の細胞を身体の他の部分への転移を指す。そのような癌の非限定的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、および様々なタイプの頭頸部癌を含む。表2は、この開示で使用される癌関連抗原の例示的で非限定的なリストである。
本明細書に記載されるように、「共刺激」という用語は、ナイーブT細胞を、上記の特定の抗原を有する細胞に対する免疫反応をもたらすことができる抗原特異的T細胞へと活性化する働きをする二次シグナルをインビボで生成する分子を指す。本開示は、特定の共刺激分子に限定されない。様々な共刺激分子が当該技術分野において周知である。共刺激分子のいくつかの限定しない例は、4-IBBL、OX40L、CD40、IL-15/IL-15Ra、CD28、CD80、CD86、CD30L、およびICOSLであり、それらをコードするそれぞれの受容体およびポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、本開示の共刺激分子は、以下のリガンドおよびそれらのそれぞれの受容体のいずれか1つ以上であってもよい:B7-1/CD80, BTLA, B7-2/CD86, CD28, B7-H1/PD-L1, CTLA-4, B7-H2, Gi24/VISTA/B7-H5, B7-H3, ICOS, B7-H4, PD-1, B7-H6, PD-L2/B7-DC, B7-H7, PDCD6, LILRA3/CD85e, LILRB2/CD85d/ILT4, LILRA4/CD85g/ILT7, LILRB3/CD85a/ILT5, LILRB1/CD85j/ILT2,LILRB4/CD85k/ILT3, 4-1BB/TNFRSF9/CD137, GITR リガンドTNFSF18, 4-1BB リガンド/TNFSF9, HVEM/TNFRSF14, BAFF/BLyS/TNFSF13B, LIGHT/TNFSF14, BAFF R/TNFRSF13C, リンホトキシン-α/TNF-β, CD27/TNFRSF7, OX40/TNFRSF4, CD27 リガンド/TNFSF7, OX40 リガンド/TNFSF4, CD30/TNFRSF8, RELT/TNFRSF19L, CD30 リガンド/TNFSF8, TACI/TNFRSF13B,CD40/TNFRSF5, TL1A/TNFSF15, CD40 リガンド/TNFSF5, TNF-α, DR3/TNFRSF25, TNF RII/TNFRSF1B, GITR/TNFRSF18, 2B4/CD244/SLAMF4, CD84/SLAMF5, BLAME/SLAMF8, CD229/SLAMF3, CD2, CRACC/SLAMF7,CD2F-10/SLAMF9, NTB-A/SLAMF6, CD48/SLAMF2, SLAM/CD150, CD58/LFA-3, CD7, DPPIV/CD26, CD96, EphB6, CD160, インテグリンα 4 β 1, CD200, インテグリンα 4 β 7/LPAM-1, CD300a/LMIR1, LAG-3, CRTAM, TIM-1/KIM-1/HAVCR, DAP12, TIM-4, Dectin-1/CLEC7A, TSLP R, ICOSL、および/またはその各々の生物学的同等物。
本明細書で使用されるように、用語「共同刺激的リガンド」は、共刺激分子と相互作用する細胞表面分子を意図している。
本明細書で使用されるように、用語「サイトカイン」は、分子および細胞のレベルで身体内の広範囲の生物学的過程を制御するためのシグナル伝達分子として作用する、免疫系において様々な細胞によって分泌された低分子量タンパク質を包含する。「サイトカイン」は、リンホカイン、インターロイキン、またはケモカインのクラス内にある個々の免疫調節タンパク質を含む。
本明細書で使用されるように、用語「糖尿病」は、遺伝的および環境的要因の組み合わせによって引き起こされた炭水化物代謝の可変的な障害を指し、通常、インスリンの不適切な分泌または利用、過度の尿産生、血液および尿における糖の過剰量、および渇き、空腹、および体重減少を特徴とする。糖尿病は、1型糖尿病および2型糖尿病を特徴とする。非肥満糖尿病(「NOD」)マウスは、糖尿病に関する試験および処置のための容認された動物モデルである。マウスにおける1型糖尿病(T1D)は、自己反応性CD8+T細胞と関連する。非肥満糖尿病(NOD)ハツカネズミは、自己抗原の増え続けるリストを認識するT細胞による膵臓のβ細胞の選択的な破壊に起因するヒトT1Dに非常によく似ているT1Dの形態を発展させる。T1Dの開始はCD4+細胞の寄与を明らかに必要とするが、T1DがCD8+T細胞依存性であるという有力な証拠がある。NODマウスにおける島関連CD8+細胞のかなりの割合が、「8.3-TCR様」と呼ばれるCDR3不変Vα17Jα42+TCRを使用することが発見されている。MHC分子Kdの文脈での(組み合わせのペプチドライブラリを使用して定義された)ミモトープNRP-A7を認識するこれらの細胞は、既に最も初期のNOD島CD8+浸潤物の重要な成分であり、糖尿病誘発性であり、および未知の機能を有するタンパク質である島特異的なグルコース-6-ホスファターゼ触媒サブユニット関連のタンパク質(IGRP)からペプチドを標的とする。このペプチド(NRP-A7に類似した、IGRP206-214)を認識するCD8+細胞は、循環が異常に頻繁である(>1/200のCD8+細胞)。顕著なことに、NODマウスにおける糖尿病への膵島炎の進行には、循環するIGRP206-214反応性CD8+プールの周期的な拡張(cyclic expansion)、およびその島関連対応物の貪欲な成熟が常に伴う。より最近では、NODマウスにおける島関連CD8+細胞が、複数のIGRPエピトープを認識することが示され、これは、IGRPが、少なくともマウスT1DにおいてCD8+細胞に対する優性の自己抗原であることを示唆している。NOD島関連CD8+細胞、特に疾患プロセスの早い時期に見られるものも、インスリンエピトープ(Ins B15-23)を認識する。
本明細書で使用されるように、用語「糖尿病前症」は、無症候性のβ細胞損傷を特徴とする糖尿病状態に先行する無症候性期を意図し、ここで患者は正常な血漿グルコースレベルを示す。それはまた、島細胞自己抗体(ICA)の存在を特徴とし、臨床症状の発症に近づくと、グルコースへの不耐性が伴う可能性がある。
本明細書で使用されるように、用語「多発性硬化症関連障害」は、MSに対する感受性またはMSと共存する障害を意図する。そのようなものの非限定的な例は、視神経脊髄炎スペクトル障害(NMO)、ブドウ膜炎、神経障害性疼痛硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、散在性硬化症、全身性硬化症、脊髄視神経MS、一次進行型MS(PPMS)、および再発寛解型MS(RRMS)、進行性全身性硬化症ならびに失調性硬化症を含む。
用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、B細胞および/またはT細胞が反応または認識する抗原上の部位を指すように交換可能に使用される。B細胞エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並置された非連続アミノ酸から形成することができる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に変性溶媒への曝露で保持され、一方で三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的に変性溶媒での処置によって失われる。エピトープは、典型的に、特有の空間構造に少なくとも3のアミノ酸、およびより一般的には、少なくとも5または8-20のアミノ酸を含む。エピトープの空間構造を判定する方法は、例えば、X線結晶解析および2次元の核磁気共鳴を含む。例えば、Glenn E. Morris, Epitope Mapping Protocols (1996)を参照。T細胞は、CD8細胞に対して約9のアミノ酸またはCD4細胞に対して約9-20のアミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープに応答するプライムされたT細胞により3H-チミジン取込みによって判定されるように、エピトープを認識するT細胞は、抗原依存性増殖を測定するインビトロのアッセイ(Burke et al., J. Inf. Dis. , 170:1110-1119, 1994), by (cytotoxic T lymphocyte assay, Tigges et al., J. Immunol. , 156(10):3901-3910, 1996)によって、抗原依存性死滅によって、またはサイトカイン分泌によって同定することができる。細胞媒介性免疫反応の存在は、増殖アッセイ(CD4+T細胞)またはCTL(細胞傷害性Tリンパ球)アッセイによって判定することができる。
随意に、抗原または好ましくは抗原のエピトープは、MHCおよびMHC関連タンパク質などの、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に結合されるか、または該融合タンパク質として発現され得る。
本明細書で使用されるように、「個体」、「患者」、および「被験体」という用語は、同義的に使用され、哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。他の実施形態では、個体は、獣医薬を必要とする哺乳動物、または研究室で一般に使用される哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、またはヒツジである。
本開示で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、組換え体であるか、または総ゲノム核酸のない状態で単離されている核酸分子を指す。用語「ポリヌクレオチド」には、オリゴヌクレオチド(核酸100残基以下の長さ)、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターが含まれる。ある態様において、ポリヌクレオチドは、それらの自然発生の遺伝子またはタンパク質コード化配列から実質的に単離された制御配列を含んでいる。ポリヌクレオチドは、RNA、DNA、そのアナログ、またはその組み合わせであってもよい。ポリペプチドのすべてまたは一部をコードする核酸は、以下の長さのこうしたポリペプチドのすべてまたは一部をコードする連続した核酸配列を含んでもよい:10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1010、1020、1030、1040、1050、1060、1070、1080、1090、1095、1100、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、9000、10000、またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、あるいは塩基対。所定の種からの特定のポリペプチドが、わずかに異なる核酸配列を有するにもかかわらず、同じまたは実質的に同様のタンパク質、ポリペプチド、あるいはペプチドをコードする、天然の変異を含有する核酸によってコードされ得ることも熟考される。
ポリヌクレオチドは、以下の5つのヌクレオチド塩基の特異的配列から構成される:アデニン(A);シトシン(C);グアニン(G);チミン(T);およびポリヌクレオチドがRNAでる場合のチミンに対するウラシル(U)。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピューターにおけるデータベースに入力され得、ゲノム機能解析およびホモロジー検索などのバイオインフォマティクス用途に使用され得る。
DNAまたはRNAなどの核酸に関して本明細書で使用されるように、用語「単離された」または「組み換えの」は、巨大分子およびポリペプチドの天然源に存在する、他のDNAまたはRNAから分離された分子をそれぞれ指す。用語「単離されたまたは組み換えの核酸」は、フラグメントとして自然発生しない、および自然状態で見られないであろう核酸フラグメントを含むことを意図する。用語「単離された」は、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指すために使用され、精製されたポリペプチドおよび組み換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。他の実施形態では、用語「単離されたまたは組み換えの」は、構成成分、細胞から分離されていること、そうでなければ、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントが、通常、自然に関連することを意味する。例えば、単離された細胞は、類似していない表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離される細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、通常、その天然または自然の環境において(例えば染色体上で)関連する、3’および5’の連続ヌクレオチドから分離される。当業者に明白なように、自然に発生しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、これらを自然に発生する等価物と区別するために「分離」を必要としない。
核酸またはポリヌクレオチドに関して「外因性」とは、核酸が組み換え核酸構築物の一部であることを示すか、またはその自然環境にないことを示す。例えば、外因性核酸は、別の種(つまり、異種核酸)へと導入された1つの種からの配列であり得る。典型的には、そのような外因性核酸は、組み換え核酸構築物によって他の種へと導入される。外因性核酸はさらに、生物に固有であり、その生物の細胞へと再導入される配列であってもよい。天然配列を含む外因性核酸は、外因性核酸(例えば、組み換え核酸構築物中の天然配列に隣接するか、あるいはイントロン配列を欠いている、非天然制御配列(プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、IRES、配列スキッピングリボソーム))に結合された非天然配列の存在によって自然発生の配列としばしば区別することができる。さらに、安定して形質転換された外因性核酸は、天然配列が自然に見られる位置以外の位置で典型的に組み込まれる。外因性要素は、例えば、遺伝的組換えを使用して構築物に加えられてもよい。
本明細書で使用されるように、「相同する」、「相同性」、または「パーセント相同性」の用語は、参照配列と比較して核酸配列を記載するために本明細書で使用される場合、Karlin and Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268, 1990, modified as in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって記載される式を用いて決定され得る。こうした式は、Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990)のbasic local alignment search tool(BLAST)プログラムに組み入れられる。配列のパーセント相同性は、この出願の出願日の時点での、BLASTの最新バージョンを使用して決定可能である。
参照ポリペプチド配列に対するパーセント(%)配列同一性は、最大パーセントの配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてガスを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指し、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、既知の様々な方法で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公開されている利用可能なコンピューター・ソフトウェアを用いて達成可能である。配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができ、それは、比較される配列の完全長にわたって最大の配列を達成するために必要とされるアルゴリズムを含む。しかし、本明細書における目的のために、%アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはGenentech社よって作成され、そのソースコードは米国著作権局(Washington D.C.20559)にユーザー文書と共に提出されており、米国著作権登録番号TXU510087で登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech社(South San Francisco, Calif.)から公に利用可能であるか、またはソースコードからコンパイルできる。ALIGN-2プログラムは、デジタルUNIX(登録商標) V4.0Dを含むUNIX(登録商標)オペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルされなければならない。配列比較パラメータのすべてが、ALIGN-2プログラムによって設定され、変化しない。
ALIGN-2がアミノ酸配列の比較のために使用される状況において、所与のアミノ酸配列Bへの、所与のアミノ酸配列Bとの、または所与のアミノ酸配列Bに対する所与のアミノ酸配列Aの%アミノ酸配列同一性(所与のアミノ酸配列Bへの、所与のアミノ酸配列との、または所与のアミノ酸配列Bに対して特定の%アミノ酸配列同一性を有するか、あるいはそれを含む所与のアミノ酸配列Aとして代替的に表現することができる)は、以下のように計算される:画分X/Yの100倍、ここで、XがそのプログラムのAとBのアライメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、およびここで、YがBにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、Bに対するAの%アミノ酸配列同一性は、Aに対するBの%アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されよう。特に別記しない限り、ALIGN-2コンピュータプログラムを使用して直前の段落で記載されるように、本明細書で使用されるすべての%アミノ酸配列同一性値が得られる。
「組成物」は、活性薬剤と、不活性(inert)(例えば、検出可能な薬剤またはラベル)またはアジュバントなどの活性(active)な別の化合物または組成物との組み合わせを意味するように意図される。ある実施形態では、組成物はアジュバントを含有していない。
「医薬組成物」は、医薬組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断または治療の用途に適したものにする、不活性または活性な担体との組み合わせを含むように意図される。
本明細書で使用されるように、「タンパク質」または「ポリペプチド」あるいは「ペプチド」は、少なくとも5つのアミノ酸残基を含む分子を指す。
本開示の他の目的、特徴、および利点は、後述する詳細な説明から明らかになるだろう。追加の定義もそこで提供される。しかし、本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正が、詳細な説明から当業者に明白になるため、この詳細な説明および具体的な例が、本開示の具体的な実施形態を示唆しながらも、例示目的のみで与えられることが理解されるべきである。
この開示はアッセイを実施するのに必要な新規なアッセイおよび組成物を提供する。1つのそのような組成物は、外因的に導入された組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、およびクラスIまたはクラスIIの主要組織適合性複合体(MHC)複合体を結合する共受容体を含む単離細胞である。さらなる態様では、単離細胞は、外因的に導入されたTCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体を含む。さらなる態様では、単離細胞は、共刺激分子および/またはサイトカイン受容体に対して外因的に導入された受容体を含む。
<細胞>
本明細書に記載される効力アッセイで利用される細胞は真核細胞である。細胞は最小限で発現する:1)分析するためにpMHC-NPに結合されるペプチド-MHCを特異的に結合する組み換えまたは天然のTCR;2)CD3シグナル複合体3)、TCR経路依存性レポーター;および、4)MHC共受容体。いくつかの細胞または細胞株は、本明細書に記載されるアッセイを実行するのに十分なレベルで、CD3シグナル複合体およびMHC共受容体(例えば、CD4またはCD8)を自然に発現することができる。しかし、特定の細胞または細胞株に基づいて、MHC共受容体、あるいはCD3シグナル複合体の1つ以上のポリペプチドは、外因性ポリヌクレオチドによって導入されて、均質様式でシグナルを増加させるか、またはシグナルを調節することができる。細胞は、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、MHC共受容体、またはCD3シグナル複合体の1つ以上のポリペプチドの1つ以上を発現するために設計された初代細胞あるいは細胞株であり得る。設計され得る適切な細胞株の非限定的な例は、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4、またはこの組み合わせを含む。細胞が、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、MHC共受容体、またはCD3シグナル複合体の1つ以上のポリペプチドのいずれも内因的に発現しない場合、その成分は細胞または細胞株に導入されたポリヌクレオチドから発現され得る。ある実施形態では、細胞はCD3シグナル複合体を内因的に発現しない。ある実施形態では、細胞はMHC共受容体を内因的に発現しない。一態様では、細胞は、内因的に共刺激分子および/またはサイトカインに対して受容体を発現する。ある実施形態では、細胞は低レベルで発現するか、または共刺激分子および/またはサイトカインに対する受容体を発現しないが、T細胞が活性化される場合、その発現がアップレギュレートされる。細胞は、MHC共受容体、CD3シグナル複合体の一部であるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの任意の1つ以上の追加を含むことができる。ある実施形態では、CD3シグナル複合体の一部であるポリペプチドは、SEQ ID NO:553と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、CD3シグナル複合体の一部であるポリペプチドは、SEQ ID NO:554と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%相同のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態では、MHC共受容体は、SEQ ID NO:549あるいは551と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%と同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、MHC共受容体は、SEQ ID NO:550あるいは552と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%相同のポリヌクレオチドによってコードされる。
本明細書に記載される効力アッセイで利用される細胞は真核細胞である。細胞は最小限で発現する:1)分析するためにpMHC-NPに結合されるペプチド-MHCを特異的に結合する組み換えまたは天然のTCR;2)CD3シグナル複合体3)、TCR経路依存性レポーター;および、4)MHC共受容体。いくつかの細胞または細胞株は、本明細書に記載されるアッセイを実行するのに十分なレベルで、CD3シグナル複合体およびMHC共受容体(例えば、CD4またはCD8)を自然に発現することができる。しかし、特定の細胞または細胞株に基づいて、MHC共受容体、あるいはCD3シグナル複合体の1つ以上のポリペプチドは、外因性ポリヌクレオチドによって導入されて、均質様式でシグナルを増加させるか、またはシグナルを調節することができる。細胞は、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、MHC共受容体、またはCD3シグナル複合体の1つ以上のポリペプチドの1つ以上を発現するために設計された初代細胞あるいは細胞株であり得る。設計され得る適切な細胞株の非限定的な例は、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4、またはこの組み合わせを含む。細胞が、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、MHC共受容体、またはCD3シグナル複合体の1つ以上のポリペプチドのいずれも内因的に発現しない場合、その成分は細胞または細胞株に導入されたポリヌクレオチドから発現され得る。ある実施形態では、細胞はCD3シグナル複合体を内因的に発現しない。ある実施形態では、細胞はMHC共受容体を内因的に発現しない。一態様では、細胞は、内因的に共刺激分子および/またはサイトカインに対して受容体を発現する。ある実施形態では、細胞は低レベルで発現するか、または共刺激分子および/またはサイトカインに対する受容体を発現しないが、T細胞が活性化される場合、その発現がアップレギュレートされる。細胞は、MHC共受容体、CD3シグナル複合体の一部であるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの任意の1つ以上の追加を含むことができる。ある実施形態では、CD3シグナル複合体の一部であるポリペプチドは、SEQ ID NO:553と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、CD3シグナル複合体の一部であるポリペプチドは、SEQ ID NO:554と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%相同のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態では、MHC共受容体は、SEQ ID NO:549あるいは551と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%と同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、MHC共受容体は、SEQ ID NO:550あるいは552と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%相同のポリヌクレオチドによってコードされる。
<T細胞受容体(TCR)>
本明細書に記載される効力アッセイに利用される細胞または細胞株は、組み換えT細胞受容体(TCR)を発現する。組み換えT細胞受容体は、3’UTR、5’UTR、イントロン配列、または天然のプロモーターあるいはエンハンサーエレメントの1つ以上を欠くポリヌクレオチドによってコードされるものである。この組み換えTCRは、形質導入、トランスフェクション、または感染により導入された外因性ポリヌクレオチドによってコードすることができる。ある実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは細胞または細胞株のゲノムへ組み込まれる。T細胞受容体の非限定的な例は、限定されないが、TCRαおよびTCRβを含むヘテロ二量体、TCRγおよびTCRδを含むヘテロ二量体、ならびに単鎖TCR構築物を含む。ある実施形態では、TCRはマウス化される(つまり、TCRはマウスCD4分子と相互作用するために最適化される)。TCRαの非限定的な例は、GenBankで見つけることができる(例えば、GenBank受入番号:AAB31880.1、AAB28318.1、AAB24428.1、およびADW95878.1、ならびにその各々の等価物)。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に導入され、細胞表面上の発現のための有効に結合された制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターをさらに含むことができる。
本明細書に記載される効力アッセイに利用される細胞または細胞株は、組み換えT細胞受容体(TCR)を発現する。組み換えT細胞受容体は、3’UTR、5’UTR、イントロン配列、または天然のプロモーターあるいはエンハンサーエレメントの1つ以上を欠くポリヌクレオチドによってコードされるものである。この組み換えTCRは、形質導入、トランスフェクション、または感染により導入された外因性ポリヌクレオチドによってコードすることができる。ある実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは細胞または細胞株のゲノムへ組み込まれる。T細胞受容体の非限定的な例は、限定されないが、TCRαおよびTCRβを含むヘテロ二量体、TCRγおよびTCRδを含むヘテロ二量体、ならびに単鎖TCR構築物を含む。ある実施形態では、TCRはマウス化される(つまり、TCRはマウスCD4分子と相互作用するために最適化される)。TCRαの非限定的な例は、GenBankで見つけることができる(例えば、GenBank受入番号:AAB31880.1、AAB28318.1、AAB24428.1、およびADW95878.1、ならびにその各々の等価物)。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に導入され、細胞表面上の発現のための有効に結合された制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターをさらに含むことができる。
TCRβの非限定的な例もまた、GenBankで見つけることができる(受入番号:AAB31887.1、AKG65861.1、ADW95908.1、およびAAM53411.1、ならびにその各々の等価物)。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。一実施形態では、TCRγ-鎖は、GenBank(例えば、GenBank受入番号:AAM21533.1、DAA30449.1、およびABG91733.1、ならびにその各々の等価物)で見つかった1つ以上の配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。一実施形態では、TCRδ-鎖は、GenBank(例えば、GenBank受入番号:Q7YRN2.1、AAC48547.1、JC4663、およびNP_001009418.1、ならびにその各々の等価物)で見つかった1つ以上の配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。単鎖TCRは当技術分野において既知である。単鎖TCRの非限定的な例は、それについてWO1996018105およびUS20120252742、およびその各々の等価物で開示され、その各々は参照によってその全体が取り込まれる。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入され、有効に結合された細胞表面上の発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターをさらに含む。
一態様では、TCRは、WO1996018105およびUS2012/02522742に開示されるような単鎖TCRである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。
ある実施形態では、本明細書に記載される方法および細胞株と共に使用される組み換えTCRは、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は別々に翻訳される。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は単鎖TCRとして単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は、TCRα鎖とTCRβ鎖の間の切断部位を含む単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、切断部位はリボソームスキッピング配列を含む。ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は、成熟した(切断された分泌リーダー配列)形態で細胞の表面上で発現される。
ある実施形態では、TCRα鎖は、SEQ ID NO:528、530、534、536 539、541、544、あるいは546のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であり、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:529、531、535、537、540、542、545、あるいは547のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。ある実施形態では、TCRα鎖は、SEQ ID NO:528、530、534、536、539あるいは541のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であり、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:529、531、535、537、540、あるいは542のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。
ある実施形態では、TCRは、DRB1*0301/DRA*0101に結合されるヒト島特異的グルコース-6-ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質(IGRP)アミノ酸13~25(QHLQKDYRAYYTF)に特異的である。ある実施形態では、TCRα鎖は、SEQ ID NO:528あるいは530のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であり、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:529あるいは531のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。ある実施形態では、TCRα鎖は、SEQ ID NO:534あるいは536のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であり、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:535あるいは537のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。
ある実施形態では、TCRは、DRB1*0401/DRA*0101に結合されたヒトプレプロインスリンアミノ酸76~90(SLQPLALEGSLQKRG)に特定である。ある実施形態では、TCRα鎖は、SEQ ID NO:539あるいは541のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一であり、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:540あるいは542のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一である。
さらなる態様では、TCRαおよびTCRβをコードするポリヌクレオチドは、リボソームスキッピング配列をさらにコードし、その非限定的な例は、限定されないが、2Aリボソームスキッピング配列(例えば、P2A、E2A、F2A、あるいはT2Aを含む)またはIRES配列を含む。したがって、一態様では、リボソームスキッピング配列は、P2A、E2A、F2A、またはT2Aのリボソームスキッピング配列を含む。いくつかの実施形態では、2Aリボソームスキッピング配列は、Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Proのコンセンサスモチーフを含み、ここで、Xは任意のアミノ酸を表す。2Aペプチド配列の非限定的な例は、例示的な配列表にて提供される。ポリヌクレオチドは、プロモーターおよび/またはエンハンサー配列をさらに含むことができる。リボソームスキッピング配列の例は、WO2013/057586で見つけることができ、それは参照によって組み込まれる。
IRES配列およびリボソームスキッピング配列の非限定的な例は、表3および4にて提供される。
ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は単一のポリペプチドとして産生され、およびTCRα鎖およびTCRβ鎖は、SEQ ID NO:456~523のいずれか1つに記載されるアミノ酸配列を有するリボソームスキッピング配列によって分離される。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:524、526、あるいは543のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:524、526のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:524のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:526のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。
ある実施形態では、TCRα鎖およびTCRβ鎖は単一のポリヌクレオチドによってコードされ、該ポリヌクレオチドはTCRα鎖とTCRβ鎖との間にIRES配列を含む。ある実施形態では、該IRES配列は、SEQ ID NO:524~526のいずれか1つに記載されるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、該TCRα鎖および/またはTCRβ鎖は、SEQ ID NO:532あるいは557に少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%相同のポリヌクレオチドによってコードされる。このポリヌクレオチドは、安定して細胞のゲノムに組み込まれ得る。
本明細書に記載の効力アッセイで利用される細胞によって発現されたTCRは、自己免疫性または炎症性疾患関連抗原に特異的である。ある実施形態では、自己免疫性または疾患関連抗原は、MHC分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、自己免疫性または疾患関連抗原は、MHCクラスI分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、自己免疫性または疾患関連抗原は、MHCクラスII分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、TCRは表1に記載される任意のポリペプチド抗原に結合する。
本明細書に記載の効力アッセイで利用される細胞によって発現されたTCRは、癌抗原に特異的である。ある実施形態では、癌抗原はMHC分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、癌抗原はMHCクラスI分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、癌抗原はMHCクラスII分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、癌抗原は表2に記載されるポリペプチドである。
<TCR依存性レポーター>
いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターはTCR活性化またはTCR経路活性化のレポーターである。一実施形態では、レポーターは、細胞の濃度、発現、活性、局在化、タンパク質修飾、またはタンパク質間の相互作用の1つ以上を提供する。いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(secreted embryonic alkaline phosphatase )(SEAP)、蛍光タンパク質、またその組み合わせを含むか、またはそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターは、活性化T細胞(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーターの核因子、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP--1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、あるいはIL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーターを含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。ある実施形態では、ルシフェラーゼは、SEQ ID NO:555と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ルシフェラーゼは、SEQ ID NO:556と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%相同のポリヌクレオチドによってコードされる。
いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターはTCR活性化またはTCR経路活性化のレポーターである。一実施形態では、レポーターは、細胞の濃度、発現、活性、局在化、タンパク質修飾、またはタンパク質間の相互作用の1つ以上を提供する。いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(secreted embryonic alkaline phosphatase )(SEAP)、蛍光タンパク質、またその組み合わせを含むか、またはそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターは、活性化T細胞(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーターの核因子、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP--1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、あるいはIL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーターを含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。ある実施形態では、ルシフェラーゼは、SEQ ID NO:555と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ルシフェラーゼは、SEQ ID NO:556と少なくとも80%、90%、95%、97%、98%、99%、または100%相同のポリヌクレオチドによってコードされる。
TCR依存性レポーターは上流のプロモーターによって活性化される。プロモーターの非限定的な例が本明細書に記載され、それは、限定されないが、NFAT転写因子結合DNA配列またはプロモーター、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、およびIL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーターを含む。さらなる例が例示的な配列表にて提供される。さらなる態様では、ポリヌクレオチドはエンハンサー配列をさらに含む。
他の態様では、TCR依存性レポーターは、数量化できる遺伝子産物レポーターを含むか、代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。該数量化できる遺伝子産物レポーターの非限定的な例は、限定されないが、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、CAT、SEAP、蛍光タンパク質、またはその組み合わせを含む。レポーターとしての取り込みのためのルシフェラーゼ配列の非限定的な例は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:AAR20792.1、AAL40677.1、AAL40676.1、およびAAV35379.1、ならびにその各々の等価物)にあり得る。ルシフェラーゼレポーターシステムは市販されている(例えば、Promega Cat.#E1500またはE4550)。さらなる例は、例示的な配列表にて提供される。βラクタマーゼ配列の非限定的な例は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:AMM70781.1、CAA54104.1、およびAAA23441.1、ならびにその各々の等価物)にあり得る。「CAT」の非限定的な例は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBank(例えば、受入番号:OCR39292.1、WP_072643749.1、CUB58229.1、およびKIX82948.1、ならびにその各々の等価物)にあり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。CATアッセイは市販されている(例えば、Thermal Fisher社のFAST CAT(商標) Chloramphenicol Acetyltransferase Assay Kit(F-2900))。SEAP配列の非限定的な例は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:ADV10306.1、AAB64404.1、EEB84921.1、およびEFD 70636.1、ならびにその各々の等価物)にあり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。SEAP活性は、ルミノメーター(例えば、Promega社のTurner BioSystems Veritas Microplate Luminometer)で測定することができる。蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、増強された緑色蛍光タンパク質(eGFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、または他の適切な蛍光タンパク質、あるいはそれらの組み合わせ、またはそれらの蛍光性の部分または誘導体を含む。蛍光タンパク質の配列は、2017年1月12日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:AFA52654.1、ACS44348.1、およびAAQ96629.1、ならびにその各々の等価物)にあり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。蛍光タンパク質プロモーターレポーターは市販されている(例えば、TakaRa Cat.#631089)。
<MHC共受容体>
形質転換細胞は、MHCリガンド(例えばクラスIおよびクラスIIのMHCリガンド)を結合するMHC共受容体も発現する。いくつかの実施形態において、該MHCリガンドは、古典的MHCクラスIタンパク質、非古典的MHCクラスIタンパク質、古典的MHCクラスIIタンパク質、非古典的MHCクラスIIタンパク質、MHC二量体(Fc融合)、MHC、MHC多量体、またはMHCタンパク質の多量体型を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。
形質転換細胞は、MHCリガンド(例えばクラスIおよびクラスIIのMHCリガンド)を結合するMHC共受容体も発現する。いくつかの実施形態において、該MHCリガンドは、古典的MHCクラスIタンパク質、非古典的MHCクラスIタンパク質、古典的MHCクラスIIタンパク質、非古典的MHCクラスIIタンパク質、MHC二量体(Fc融合)、MHC、MHC多量体、またはMHCタンパク質の多量体型を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。
一態様では、MHCクラスI共受容体はCD8複合体を含む。CD8の例示的な配列は、2017年1月19日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:AAA92533.1、AJP16706.1、AAA79217.1、および1203216A、ならびにその各々の等価物)にあり得る。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。
他の様相では、MHCクラスII共受容体はCD4分子を含む。例示的なCD4タンパク質配列は、2017年1月19日に最終アクセスされたGenBank(例えば、GenBank受入番号:CAA72740.1、AMR44293.1、ACG76115.1、AAC36010.1、およびAAB 51309.1、ならびにその各々の等価物)にあり得る。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。
<CD3>
さらなる態様では、「CD3」をコードするポリヌクレオチド(分化のクラスタ3)分子は、細胞に形質導入され、内因性CD3を欠く細胞はタンパク質を発現するようになる。いくつかの実施形態において、CD3は4つの別個の鎖を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる。CD3鎖の非限定的な例は、GenBank(例えば、GenBank受入番号:CAA72995.1、AAI45927.1、NP_998940.1、AAB24559.1、NP_000723.1、AEQ93556.1、およびEAW67366.1、ならびにその等価物)で見つけることができ、この開示に有用である。当業者には明白であるように、CD3をコードするポリヌクレオチドは、細胞表面上でのCD3の発現のための調節エレメント、随意に、エンハンサーに有効に結合され、ポリヌクレオチドの発現のためのベクター内に含まれてもよい。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。
さらなる態様では、「CD3」をコードするポリヌクレオチド(分化のクラスタ3)分子は、細胞に形質導入され、内因性CD3を欠く細胞はタンパク質を発現するようになる。いくつかの実施形態において、CD3は4つの別個の鎖を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる。CD3鎖の非限定的な例は、GenBank(例えば、GenBank受入番号:CAA72995.1、AAI45927.1、NP_998940.1、AAB24559.1、NP_000723.1、AEQ93556.1、およびEAW67366.1、ならびにその等価物)で見つけることができ、この開示に有用である。当業者には明白であるように、CD3をコードするポリヌクレオチドは、細胞表面上でのCD3の発現のための調節エレメント、随意に、エンハンサーに有効に結合され、ポリヌクレオチドの発現のためのベクター内に含まれてもよい。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。
一実施形態では、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体は、αとβのTCR鎖のポリペプチドまたはポリペプチド、CD3γ、δ、ならびにεのポリペプチド、およびζ鎖を含むか、代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。様々なモジュールで形成され、TCR/CD3複合体は様々な役割を担うことができる。一実施形態では、複合体は抗原特異的認識に関与する。いくつかの実施形態では、複合体は、主に、CD3鎖の細胞質側末端におけるチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ(「ITAM」)の存在を介したシグナル伝達に関与する。いくつかの実施形態において、TCR/CD3複合体は、抗原、超抗原、または抗体(例えば、受容体抗体)によって刺激されたTCRシグナル伝達経路に関与する。一実施形態では、TCR/CD3複合体の外因的発現は、CD3陰性細胞におけるTCRシグナル伝達経路を促進する。
<共刺激的受容体および/またはサイトカイン>
さらなる態様では、細胞は、選択された共刺激分子またはサイトカイン分子に対する受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて形質導入される。共刺激サイトカイン分子の非限定的な例は本明細書で提供される。
さらなる態様では、細胞は、選択された共刺激分子またはサイトカイン分子に対する受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて形質導入される。共刺激サイトカイン分子の非限定的な例は本明細書で提供される。
<ベクター>
ベクターまたは他の遺伝子送達システムは、上記のようなポリヌクレオチドで細胞を形質導入するために使用することができる。一態様では、用語「ベクター」は、非分裂細胞および/またはゆっくり分裂する細胞を感染させて形質導入し、かつ標的細胞のゲノムへ組み込む能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様では、ベクターは野生型のウイルスまたはプラスミド(例えば、プラスミド)に由来するか、またはにそれに基づく。さらなる態様では、ベクターは野生型のレンチウイルスに由来するか、またはそれに基づく。そのようなものの例としては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ウマ伝染性貧血(EIAV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、およびネコ免疫不全ウイルス(FIV)が挙げられる。あるいは、マウス白血病ウイルス(MLV)などのベクター骨格の基礎として他のレトロウイルスを使用することができると考えられる。本発明のウイルスベクターを特定のウイルスの成分に限定する必要がないことは明白である。ウイルスベクターは、2つ以上の異なるウイルスに由来した成分を含み、合成成分をさらに含むことがある。ベクター成分は、標的細胞特異性などの所望の特性を得るために操作することができる。
ベクターまたは他の遺伝子送達システムは、上記のようなポリヌクレオチドで細胞を形質導入するために使用することができる。一態様では、用語「ベクター」は、非分裂細胞および/またはゆっくり分裂する細胞を感染させて形質導入し、かつ標的細胞のゲノムへ組み込む能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様では、ベクターは野生型のウイルスまたはプラスミド(例えば、プラスミド)に由来するか、またはにそれに基づく。さらなる態様では、ベクターは野生型のレンチウイルスに由来するか、またはそれに基づく。そのようなものの例としては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ウマ伝染性貧血(EIAV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、およびネコ免疫不全ウイルス(FIV)が挙げられる。あるいは、マウス白血病ウイルス(MLV)などのベクター骨格の基礎として他のレトロウイルスを使用することができると考えられる。本発明のウイルスベクターを特定のウイルスの成分に限定する必要がないことは明白である。ウイルスベクターは、2つ以上の異なるウイルスに由来した成分を含み、合成成分をさらに含むことがある。ベクター成分は、標的細胞特異性などの所望の特性を得るために操作することができる。
この開示の組換えベクターは霊長類および非霊長類に由来する場合がある。霊長類レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の病原体、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)を含む。非霊長類レンチウイルス群は、原型「スローウイルス」ビスナ/マエディウイルス(VMV)、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血(EIAV)、およびより最近報告されたネコ免疫不全ウイルス(FIV)ならびにウシ免疫不全ウイルス(BIV)を含む。従来の組み換えレンチウイルスベクターは、当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第6,924,123号;第7,056,699号;第707,993号;第7,419,829号、および第7,442,551号を参照、参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許第6,924,123号は、特定のレトロウイルス配列が標的細胞ゲノムへの組み込みを促進することを開示する。この特許は、各レトロウイルスのゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするgag、pol、およびenvと呼ばれる遺伝子を含むことを教示する。これらの遺伝子は、末端反復配列(LTR)と呼ばれる領域によって両末端で隣接している。LTRはプロウイルスの組み込みおよび転写の原因となる。それらはエンハンサー-プロモーター配列としても機能する。言いかえれば、LTRは、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスRNAのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの5’末端にあるpsi配列によって生じる。LTRそれ自体が、U3、RおよびU5と呼ばれる3つの要素に分割することができる同一の配列である。U3は、RNAの3’末端に固有の配列に由来する。Rは、RNAの両末端で反復される配列に由来し、U5は、RNAの5’末端に固有の配列に由来する。3つの要素のサイズは、様々なレトロウイルス中でかなり変わることもある。ウイルスゲノムについて。およびポリ(A)の添加(終結)の部位は、右側LTRのRとU5との間の境界にある。U3は、プロウイルスの転写調節エレメントのほとんどを含有しており、それは、細胞、ならびに場合によっては、ウイルスの転写活性化因子タンパク質に反応するプロモーターおよび複数のエンハンサー配列を含む。
構造遺伝子gag、pol、およびenv自体に関して、gagはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。gagタンパク質は、成熟したタンパク質MA(マトリックス)、CA(キャプシド)およびNC(ヌクレオカプシド)へとタンパク分解性処理される。pol遺伝子は、ゲノムの複製を媒介するDNAポリメラーゼ、関連RNA分解酵素H、およびインテグラーゼ(IN)を含有する逆転写酵素(RT)をコードする。
ウイルスベクター粒子の産生については、ベクターRNAゲノムは、宿主細胞中でそれをコードするDNA構築物から発現される。ベクターゲノムによってコードされない粒子の成分は、宿主細胞中で発現される追加の核酸配列(gag/polおよびenvの遺伝子のいずれか、または両方を通常含む「パッケージングシステム」)によってトランスにおいて提供される。ウイルスベクター粒子の産生に必要な配列のセットは、一時的なトランスフェクションによって宿主細胞に導入され得るか、またはそれらは宿主細胞ゲノムへ組み込まれ得るか、あるいはそれらは混合した方法で提供され得る。関連する手法は当業者に知られている。
いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。関連する実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターからなる群から選択される。さらなる実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
非ウイルスベクターは、インビトロか、インビボか、またはエクスビボのいずれかで標的細胞に送達することができる異種性ポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む。異種性ポリヌクレオチドは対象の配列を含み、1つ以上の調節エレメントに有効に結合でき、かつ対象の核酸配列の転写を制御することができる。本明細書で使用されるように、ベクターは最終の標的細胞または被験体の複製可能である必要はない。
一実施形態では、さらなる調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、および/またはプロモーター/エンハンサーの組み合わせである。VEGFタンパク質をコードする核酸の発現を調節するプロモーターは、構成的のプロモーターになりえる。一態様では、自殺遺伝子の発現を調節するプロモーターは構成的プロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な例は、SFFV、CMV、PKG、MDNU3、SV40、Ef1a、UBC、およびCAGGを含む。一態様では、エンハンサーは、ウッドチャック調節後エレメント( Woodchuck post-regulatory element )(「WPRE」)(例えば、 Zufferey, R. et al. (1999) J. Virol. 73(4):2886-2992)を参照)。
この開示に有用なプロモーターは、構成的または誘導可能であり得る。プロモーターのいくつかの例は、SV40の初期のプロモーター、マウス乳癌ウイルスLTRプロモーター、アデノウイルスマヨール後期プロモーター、単純疱疹ウイルスプロモーター、およびCMVプロモーターを含む。一実施形態では、テトラサイクリン活性化タンパク質の発現を調節するプロモーターは構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、発現を一時的に調節する誘導可能なプロモーター、組織特異的プロモーターあるいはプロモーターである。一実施形態では、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼプロモーター(PGK)である。
さらなる態様では、ベクターは、増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、および黄色蛍光タンパク質(YFP)などをコードする遺伝子などのマーカーまたは検知できるラベルをさらに含む。これらは市販されており、技術分野で説明される。
本発明の遺伝子を送達する他の方法は、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、またはリポソーム媒介トランスフェクションを含む。この発明のベクターでトランスフェクトされる宿主細胞は、(限定されないが)大腸菌または他の細菌、酵母、菌類、昆虫細胞(例えば、SF9昆虫細胞の中の発現のためにバキュロウイルスのベクターを使用)、あるいはマウス、ヒト、または他の動物(例えば、哺乳動物)に由来する細胞を含む。タンパク質のインビトロの発現において、融合、ポリペプチドフラグメント、またはクローン化DNAによってコードされた突然変異体も使用され得る。分子生物学の当業者は、組み換えタンパク質およびその断片を産生するために、種々様々の発現系および浄化システムが使用されてもよいと理解する。
<細胞集団>
一態様では、本開示は単離細胞の集団に関連し、限定されないが、この開示の細胞(例えば、明細書に記載されるように修飾されるJurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4)を含む。他の態様では、細胞はCD3陰性細胞である。CD3陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、BW5147(ATCC No.TIB-472)、Nk-92(ATCC No.CRL-2407)、Mino(ATCC No.PTS-CRL-3000)、およびJeKo-1(ATCC No.CRL-3006)を含む。いくつかの実施形態では、集団は実質的に均質である。他の実施形態では、集団は実質的に不均質である。ある実施形態では、集団はこの開示の複数の細胞である。ある実施形態では、集団は、少なくとも50%、60%、70%、80%、95%、98%、または99%純粋である、少なくとも1x102~1x109の細胞を含む。
一態様では、本開示は単離細胞の集団に関連し、限定されないが、この開示の細胞(例えば、明細書に記載されるように修飾されるJurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4)を含む。他の態様では、細胞はCD3陰性細胞である。CD3陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、BW5147(ATCC No.TIB-472)、Nk-92(ATCC No.CRL-2407)、Mino(ATCC No.PTS-CRL-3000)、およびJeKo-1(ATCC No.CRL-3006)を含む。いくつかの実施形態では、集団は実質的に均質である。他の実施形態では、集団は実質的に不均質である。ある実施形態では、集団はこの開示の複数の細胞である。ある実施形態では、集団は、少なくとも50%、60%、70%、80%、95%、98%、または99%純粋である、少なくとも1x102~1x109の細胞を含む。
<モニタリング発現>
当業者には明白であるように、形質導入されたポリペプチドの有効な発現は当技術分野において既知の方法を使用して判定される(例えば、形質導入および細胞と細胞集団上での培養後に、量的にあるいは質的にモニタリングできる、検知できる標識抗体またはそのフラグメントの使用)。
当業者には明白であるように、形質導入されたポリペプチドの有効な発現は当技術分野において既知の方法を使用して判定される(例えば、形質導入および細胞と細胞集団上での培養後に、量的にあるいは質的にモニタリングできる、検知できる標識抗体またはそのフラグメントの使用)。
<細胞を調製するための方法>
他の態様では、本開示は、単離細胞を調製する方法にも関連し、以下をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを用いた単離細胞の形質導入を含むか、またはそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる:組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、およびMHC共受容体。さらなる態様では、該方法は、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチド、および/または共刺激分子、および/またはサイトカインで細胞を形質導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法は、形質導入されたポリヌクレオチド(例えば、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、クラスIまたはクラスIIの主要組織適合性複合体(MHC)リガンドを結合する共受容体、随意に、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体、共刺激分子および/またはサイトカインをコードするポリヌクレオチド)の1つ以上の発現に好都合な条件下で細胞を培養する工程を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、該方法は、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、クラスIまたはクラスII主要組織適合性複合体(MHC)リガンドを結合する共受容体、および/または、随意に、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体、および随意に、共刺激分子および/またはサイトカインを発現する細胞を単離させる工程を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、細胞はフローサイトメトリーを含む方法によって単離される。単離細胞は、形質導入されたポリヌクレオチドの拡大および継続的な発現のための条件下で培養され、それゆえ、細胞の集団が提供される。
他の態様では、本開示は、単離細胞を調製する方法にも関連し、以下をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを用いた単離細胞の形質導入を含むか、またはそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる:組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、およびMHC共受容体。さらなる態様では、該方法は、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチド、および/または共刺激分子、および/またはサイトカインで細胞を形質導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法は、形質導入されたポリヌクレオチド(例えば、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、クラスIまたはクラスIIの主要組織適合性複合体(MHC)リガンドを結合する共受容体、随意に、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体、共刺激分子および/またはサイトカインをコードするポリヌクレオチド)の1つ以上の発現に好都合な条件下で細胞を培養する工程を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、該方法は、組み換えT細胞受容体(TCR)、TCR経路依存性レポーター、クラスIまたはクラスII主要組織適合性複合体(MHC)リガンドを結合する共受容体、および/または、随意に、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体、および随意に、共刺激分子および/またはサイトカインを発現する細胞を単離させる工程を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、細胞はフローサイトメトリーを含む方法によって単離される。単離細胞は、形質導入されたポリヌクレオチドの拡大および継続的な発現のための条件下で培養され、それゆえ、細胞の集団が提供される。
ある態様では、本開示は、ナノ粒子コアに随意に結合されるpMHC分子の効力を測定するインビトロの方法に関する。該方法は:(a)T細胞受容体(TCR)およびTCR経路依存性レポーターならびにMHCリガンドを結合する共受容体を発現する形質導入された細胞を、pMHCを含む有効な量の組成物と接触させる工程と、(b)上記TCR経路依存性レポーターあるいは上記レポーターからのシグナルを検出する工程を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。さらなる態様では、細胞は、CD3複合体および/または共刺激受容体、および/またはサイトカイン受容体をさらに含む。
別の実施形態では、接触はインビトロである。
一実施形態では、複合体上の少なくとも1つのpMHCはTCRと相互作用し、ここで、相互作用はTCR依存性経路を活性化する。いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターは、TCR活性化またはTCR経路活性化のレポーターである。一実施形態では、レポーターの特性は、細胞の濃度、発現、活性、局在化、タンパク質修飾、またはタンパク質間の相互作用を含む。一実施形態では、レポーターは、エフェクター細胞型に対して内因性である天然のレポーターであり、検知可能で、かつTCR活性化あるいはTCR経路活性化と相関する特性を有する。いくつかの実施形態において、レポーターは、エフェクター細胞型に対して外因性である人工レポーターであり、検出可能で、かつTCR活性化あるいはTCR経路活性化と相関する特性を有する。
いくつかの実施形態において、単離細胞は上記の通りである(例えば、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、Molt-4、または初代T細胞の1つ以上を含むエフェクター細胞)。CD3陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、BW5147(ATCC No.TIB-472)、Nk-92(ATCC No.CRL-2407)、Mino(ATCC No.PTS-CRL-3000)、およびJeKo-1(ATCC No.CRL-3006)を含む。
一実施形態では、TCR経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ(ホタルまたはウミシイタケ)、βラクタマーゼ、CAT、SEAP、蛍光タンパク質、および数量化できる遺伝子産物からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、TCR経路依存性レポーターは、活性化T細胞(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーターの核因子、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP-1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、あるいはIL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーターを含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、レポーターは遺伝子からなり、その発現はTCR経路依存性経路に制御下にある。
一実施形態では、TCR関連マルチサブユニットCD3鎖シグナル複合体は、αおよびβのTCR鎖、CD3γ、δ、ならびにεのポリペプチド、およびζ鎖を含むか、代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。様々なモジュールで形成され、TCR/CD3複合体は様々な役割を担うことができる。一実施形態では、複合体は抗原特異的認識に関与する。いくつかの実施形態において、複合体は、主に、CD3鎖の細胞質側末端におけるチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ(「ITAM」)の存在を介するシグナル伝達に関与する。いくつかの実施形態において、TCR/CD3複合体は、抗原、超抗原、または抗体(例えば、抗受容体抗体)によって刺激されたTCRシグナル伝達経路に関与する。一実施形態では、TCR/CD3複合体の外因的発現は、CD3陰性細胞のTCRシグナル伝達経路を促進する。CD3陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、BW5147(ATCC No.TIB-472)、Nk-92(ATCC No.CRL-2407)、Mino(ATCC No.PTS-CRL-3000)、およびJeKo-1(ATCC No.CRL-3006)を含む。さらなる態様では、細胞は、サイトカインおよび/または個別に共刺激分子の受容体を内生的に発現する。
<効力アッセイの使用>
一態様では、効力アッセイは、pMHC-ナノ粒子の効力、純度、または活性を測定することができる。アッセイは、例えば、様々なバッチまたは多くのpMHC-NPをモニターする品質管理工程として使用して、ロットが、T細胞を結合し、および/または所望の免疫応答を誘導することが可能な機能するpMHCを含むことを確認することができる。一態様では、効力アッセイは、pMHC-ナノ粒子の活性を測定することができ、随意に、ナノ粒子コアに結合される共刺激分子および/または1つ以上のサイトカインの1つ以上を含むか、それからさらになるか、あるいは代替的にそれから本質的になる。
一態様では、効力アッセイは、pMHC-ナノ粒子の効力、純度、または活性を測定することができる。アッセイは、例えば、様々なバッチまたは多くのpMHC-NPをモニターする品質管理工程として使用して、ロットが、T細胞を結合し、および/または所望の免疫応答を誘導することが可能な機能するpMHCを含むことを確認することができる。一態様では、効力アッセイは、pMHC-ナノ粒子の活性を測定することができ、随意に、ナノ粒子コアに結合される共刺激分子および/または1つ以上のサイトカインの1つ以上を含むか、それからさらになるか、あるいは代替的にそれから本質的になる。
該アッセイにおいてテストすることができるナノ粒子について、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体は互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体のMHCは、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のサイトカインは、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、ナノ粒子コアの直径は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体の結合価は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体の密度は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子の結合価および/または密度は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のサイトカインの結合価および/または密度は、互いに同じまたは異なるものである。一態様では、組成物が分析され、ここで、組成物は、複数pMHC複合体を有するナノ粒子、次に、共同刺激および随意にサイトカインを有する別個の複数のナノ粒子を含む。上記のように、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体のMHCは、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のサイトカインは、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、ナノ粒子コアの直径は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体の結合価は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のpMHC複合体の密度は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子の結合価および/または密度は、互いに同じまたは異なるものであり;および/または、各ナノ粒子コア上のサイトカインの結合価および/または密度は、互いに同じまたは異なるものである。
ある態様では、該アッセイにおいてテストすることができるナノ粒子が、本明細書で提供される複数のナノ粒子複合体を含む組成物において提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、担体、随意に医薬担体をさらに含む。
該アッセイを使用して、ナノ粒子(例えば、pMHC-ナノ粒子)に随意に結合されるpMHCの効力を判定することができる。用語「粒子」、「ナノ粒子」、「微粒子」、「ビーズ」、「ミクロスフェア」、および本明細書において文法上の同等物は、被験体に投与可能である小さな離散粒子に適用される。ある実施形態では、粒子は実質的に球状である。用語「実質的に球状」は、本明細書で使用されるように、粒子の形状が約10%を超えて球体から逸脱しないことを意味する。本開示の様々な既知の抗原またはペプチドの複合体は、粒子に適用され得る。
互換性があり、本明細書に記載される効力アッセイを使用して分析可能なペプチドMHCナノ粒子は、少なくと、非限定的な例として、WO2008/109852、WO2012/041968、WO2012/062904、WO2013144811、WO2014/050286、WO2015/063616、WO2016/198932、またはPCT/IB2017/001508に記載されるものであり、それらのすべてが参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される効力アッセイは、組み換えTCRおよび経路依存性レポーターで少なくとも形質導入された細胞からのシグナルを定量化するために使用することができる。当業者によってシグナルの定量化が多くの方法で実施および利用することができる。ある実施形態では、シグナルは定量化され、プリセットされた閾値と比較され、ナノメディシンまたはナノ粒子の所与の調製物が品質管理工程を通過するか否かを判定することができる。閾値は、陰性対照から定量化されたシグナルの少なくとも約150%、200%、300%、400%、500%、600%、70%、800%、900%、または1,000%である。陰性対照は、例えば、組み換えTCRを有し、かつ定量化される種類のレポーターを欠いている細胞であってもよく;あるいは、無関係なペプチドMHC複合体を含むか、ペプチドMHC複合体を含まないナノメディシンまたはナノ粒子であってもよい。ある実施形態では、効力アッセイは、特定のナノ粒子調製物のIC50を定義するために使用することができる。
<ナノ粒子コアおよび層組成>
pMHC-NPのナノ粒子コアは、コア、例えば、ソリッドコア、金属コア、デンドリマーコア、高分子ミセルナノ粒子コア、ナノロッド、フラーレン、ナノシェル、コアシェル、タンパク質ベースのナノ構造体、または脂質ベースのナノ構造体を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからさらになる。いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、生体吸収性および/または生分解性である。いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、コアから成長する樹状構造を有する高度に分枝した巨大分子を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、デンドリマーナノ粒子コアである。さらなる態様では、デンドリマーナノ粒子コアは、ポリ(アミドアミン)-ベースのデンドリマーまたはポリ-L-リジンベースのデンドリマーを含み得るか、代替的にそれから本質的になり得るか、またはそれからさらになり得る。ある態様では、ナノ粒子コアは、ナノスケールのコアシェル構造へと構築された両親媒性ブロックコポリマーを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、高分子ミセルコアである。さらなる態様では、高分子ミセルコアは、ポリエチレングリコール-ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミンブロックコポリマーを使用して生成された高分子ミセルを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。さらなる態様では、ナノ粒子コアは、金属を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。別の態様では、ナノ粒子コアはリポソームではない。コア材の追加の例は、限定されないが、標準および専門のガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、アクリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、フッ素重合体、シリコン、セルロース、シリコン、金属(例えば、鉄、金、銀)、ミネラル(例えば、ルビー)、ナノ粒子(例えば、金ナノ粒子、コロイド粒子、金属酸化物、金属硫化物、金属セレニド、および酸化鉄などの磁性材料)、およびそれらの合成物を含む。いくつかの実施形態では、酸化鉄ナノ粒子コアは、酸化鉄(II、III)を含む。コアは、均質組成であり得るか、または望まれる特性に依存する2つ以上のクラスの材料の合成物であり得る。ある態様では、金属ナノ粒子が使用される。これらの金属の粒子またはナノ粒子は、Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si、およびIn、それらの前駆体、それらの二元合金、それらの三元合金kならびにそれらの金属間化合物から形成することができる。米国特許第6,712,997号を参照し、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ナノ粒子が生体適合性かつ生体吸収性であることを前提に、コアおよび層(以下に記載される)の組成物は変わり得る。コアは、均質組成であり得るか、または望まれる特性に依存する2つ以上のクラスの材料の合成物であり得る。ある態様では、金属ナノ球体が使用される。これらの金属ナノ粒子は、Fe、Ca、Gaなどから形成され得る。ある実施形態では、ナノ粒子は、金または酸化鉄などの金属あるいは金属酸化物を含むコアを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、複数の共刺激分子および/または複数のサイトカインは、ナノ粒子デンドリマーコアあるいは高分子ミセルコアに結合される。
pMHC-NPのナノ粒子コアは、コア、例えば、ソリッドコア、金属コア、デンドリマーコア、高分子ミセルナノ粒子コア、ナノロッド、フラーレン、ナノシェル、コアシェル、タンパク質ベースのナノ構造体、または脂質ベースのナノ構造体を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからさらになる。いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、生体吸収性および/または生分解性である。いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、コアから成長する樹状構造を有する高度に分枝した巨大分子を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、デンドリマーナノ粒子コアである。さらなる態様では、デンドリマーナノ粒子コアは、ポリ(アミドアミン)-ベースのデンドリマーまたはポリ-L-リジンベースのデンドリマーを含み得るか、代替的にそれから本質的になり得るか、またはそれからさらになり得る。ある態様では、ナノ粒子コアは、ナノスケールのコアシェル構造へと構築された両親媒性ブロックコポリマーを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、高分子ミセルコアである。さらなる態様では、高分子ミセルコアは、ポリエチレングリコール-ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミンブロックコポリマーを使用して生成された高分子ミセルを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。さらなる態様では、ナノ粒子コアは、金属を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。別の態様では、ナノ粒子コアはリポソームではない。コア材の追加の例は、限定されないが、標準および専門のガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、アクリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、フッ素重合体、シリコン、セルロース、シリコン、金属(例えば、鉄、金、銀)、ミネラル(例えば、ルビー)、ナノ粒子(例えば、金ナノ粒子、コロイド粒子、金属酸化物、金属硫化物、金属セレニド、および酸化鉄などの磁性材料)、およびそれらの合成物を含む。いくつかの実施形態では、酸化鉄ナノ粒子コアは、酸化鉄(II、III)を含む。コアは、均質組成であり得るか、または望まれる特性に依存する2つ以上のクラスの材料の合成物であり得る。ある態様では、金属ナノ粒子が使用される。これらの金属の粒子またはナノ粒子は、Au、Pt、Pd、Cu、Ag、Co、Fe、Ni、Mn、Sm、Nd、Pr、Gd、Ti、Zr、Si、およびIn、それらの前駆体、それらの二元合金、それらの三元合金kならびにそれらの金属間化合物から形成することができる。米国特許第6,712,997号を参照し、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ナノ粒子が生体適合性かつ生体吸収性であることを前提に、コアおよび層(以下に記載される)の組成物は変わり得る。コアは、均質組成であり得るか、または望まれる特性に依存する2つ以上のクラスの材料の合成物であり得る。ある態様では、金属ナノ球体が使用される。これらの金属ナノ粒子は、Fe、Ca、Gaなどから形成され得る。ある実施形態では、ナノ粒子は、金または酸化鉄などの金属あるいは金属酸化物を含むコアを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、複数の共刺激分子および/または複数のサイトカインは、ナノ粒子デンドリマーコアあるいは高分子ミセルコアに結合される。
粒子は、典型的に、実質的に球状のコアおよび随意に1つ以上の層またはコーティングからなる。コアは、本明細書に記載されるように、サイズおよび組成が異なり得る。コアに加えて、粒子は、対象の用途に適切な機能性を提供するために1つ以上の層を有してもよい。層の厚さは、存在する場合、具体的な用途の必要性によって様々であり得る。例えば、層は有用な光学的性質を与えることができる。
層はまた、化学的に活性なまたは生物学的に活性な層のとして本明細書で言及される、化学的または生物学的な機能性を与えることができる。これらの層は、典型的に、粒子の外部表面上に適用され、pMHC-NPに機能性を与えることができる。層は、(望ましい粒子直径に依存して)約0.001マイクロメートル(1ナノメートル)から約10マイクロメートルを超えて、または約1nmから5nmまで、または代替的に約1nmから約10nmまで、または代替的に約1nmから約40nmまで、または約15nmから約25nmまで、あるいは約15nmから約20nmの厚さにおよび、それらの間の範囲の厚さである。
層またはコーティングは、生分解性の糖または他のポリマーを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。生分解性の層の例は、限定されないが、デキストラン;ポリ(エチレングリコール);ポリ(酸化エチレン);マンニトール;ポリラクチド(PLA)、ポリグリコリド(PGA)、ポリカプロラクトン(PCL)に基づいたポリ(エステル);PHB-PHVクラスのポリ(ヒドロキシアルカノエート);およびデンプン、セルロース、およびキトサンなどの、他の修飾ポリ(サッカライド)を含む。さらに、ナノ粒子は、化学的な結合またはカップリングの部位に対して化学的な機能性を付与するための適切な表面を有する層を含んでもよい。
層は、当業者に既知の様々な方法でナノ粒子上で生成され得る。例は、Iler, Chemistry of Silica, John Wiley & Sons, 1979; Brinker and Scherer, Sol-gel Science, Academic Press, (1990)などに記載されるゾルーゲル化学技術を含む。ナノ粒子上の層の生産へのさらなるアプローチは、Partch and Brown, J. Adhesion, 67:259-276, 1998;Pekarek et al., Nature, 367:258, (1994);Hanprasopwattana, Langmuir, 12:3173-3179, (1996);Davies, Advanced Materials, 10:1264-1270, (1998);およびその中の参照などに記載される界面化学およびカプセル封入技術を含む。蒸着技術が使用されてもよく;例えば、Golman and Shinohara, Trends Chem. Engin., 6:1-6, (2000);および米国特許第6,387,498号を参照する。さらに他のアプローチは、Sukhorukov et al., Polymers Adv. Tech. , 9(10-11):759-767, (1998);Caruso et al., Macromolecules, 32(7):2317-2328, (1998);Caruso et al., J. Amer. Chem. Soc. , 121(25):6039-6046, (1999);米国特許6,103,379号およびその中で参照された文献などに記載されるような交互積層法(layer-by-layer self-assembly techniques)を含む。
ナノ粒子は、被験体に有効な量を投与した時、T細胞集団を拡大および分化させ、かつ疾患を処置するのに役立つ複数の疾患関連抗原-MHC複合体に結合されるナノ粒子コアを含み得るか、それから本質的になり得るか、あるいはそれからさらになり得る。いくつかの態様では、1ナノ粒子コア当たりのpMHCの数(ナノ粒子複合体の「結合価」と本明細書と呼ばれる)は、上記の、参照によって本明細書に組み込まれる様々な範囲を有する。
いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、コアから成長する樹状構造を有する高度に分枝した巨大分子を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる、デンドリマーナノ粒子コアである。さらなる態様では、デンドリマーナノ粒子は、ポリ(アミドアミン)ベースのデンドリマーまたはポリ-L-リジンベースのデンドリマーを含み得るか、または代替的にそれから本質的になり得るか、あるいはそれからさらになり得る。ある態様では、ナノ粒子コアは、ナノスケールのコアシェル構造へと構築された両親媒性ブロックコポリマーを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、高分子ミセルコアである。さらなる態様では、高分子ミセルコアは、ポリエチレングリコール-ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミンブロックコポリマーを使用して生成された高分子ミセルを含み得るか、代替的にそれから本質的になり得るか、またはそれからさらになり得る。デンドリマーコアまたは高分子ミセルコアは、本明細書に記載される外側の被膜または層をさらに含み得る。
ある実施形態では、デンドリマーナノ粒子またはナノ粒子のデンドリマーナノ粒子コアとの合成の具体的な手段には、“Synthesis, Characterization, and Applications of Dendrimer-Encapsulated Nanoparticles.” The Journal of Physical Chemistry B (109):692-704 (2005)に開示される方法など、金属イオンが、デンドリマーの内部へと抽出され、その後、化学的に還元されて、3nm未満の寸法を有するほぼ径単分散された(nearly size-monodispersed)粒子がもたらされる必要があり得、ここで、結果として生じるデンドリマーコア成分は、ナノ粒子を調製するための鋳型として機能するだけでなく、ナノ粒子を安定させるために機能することによって、溶解度を調整することを可能にし、固体担体上のナノ粒子の固定化のための手段を提供する。いくつかの実施形態において、複数の共刺激分子および/または複数のサイトカインは、ナノ粒子デンドリマーコアあるいは高分子ミセルコアに結合される。
ナノ粒子コアのサイズは、約1nmから約1μmまでの範囲であり得る。ある実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約1未満μmである。他の実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約500nm未満、約400nm未満、約300nm未満、約200nm未満、約100nm未満、または約50nm未満である。さらなる実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約1nmから約10nmまで、15nm、20nm、25nm、30nm、40nm、50nm、75nm、または100nmである。特異的な実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約1nmから約100nm;約1nmから約75nm;約1nmから約50nm;約1nmから約25nm;約1nmから約25nm;約5nmから約100nm;約5nmから約50nm;約5nmから約25nm;約15nmから約25nm;または、約20nmである。いくつかの実施形態において、ナノ粒子コアは、約25nm~約60nm、約25nm~約50nm、約20nm~約40nm、約15nm~約50nm、約15nm~約40nm、約15nm~約35nm、約15nm~約30nm、約15nm~約25nm、あるいは代替的に、約15nm、約20nm、約25nm、約30nm、約35nm、または約40nmの直径を持つ。
pMHC-NPのサイズは、層の有無にかかわらず、直径が約5nmから約1μmまでの範囲であり得る。ある実施形態では、pMHC-NP複合体は、直径が約1μm未満または代替的に100nm未満である。他の実施形態では、pMHC-NP複合体は、直径が約500nm未満、約400nm未満、約300nm未満、約200nm未満、約100nm未満、または約50nm未満である。さらなる実施形態では、複合体は、直径が約5nm、または10nmから約50nm、または約5nmから約75nm、または約5nmから約50nm、または約5nmから約60nm、または約10nmから約50nm、または約10nmから約60nm、または約10nmから約70nm、または約10nmから約75nm、または約20nmから約50nm、または約20nmから約60nm、または約20nmから約70nm、または約20nmから約75nm、または約30nmから約50nm、または約30nmから約60nm、または約30nmから約70nm、または約30nmから約75nmまでであるか、あるいは一態様では、約55nmである。具体的な実施形態では、pMHC-NP複合体は、直径が約35nmから約60nm、約35nmから約70nm、または約35nmから約75nmまでである。一態様では、pMHC-NP複合体は、直径002Eが約30nmから約50nmまでである。
<抗原-MHC複合体>
ナノ粒子は、層の有無にかかわらず、抗原-MHC(pMHC)複合体に結合された、ナノ粒子コアを含む。抗原は、特定の自己免疫疾患、アレルゲン、感染症、または癌の処置のために選択される。
ナノ粒子は、層の有無にかかわらず、抗原-MHC(pMHC)複合体に結合された、ナノ粒子コアを含む。抗原は、特定の自己免疫疾患、アレルゲン、感染症、または癌の処置のために選択される。
個々のポリペプチド(例えば、MHC)および抗原(例えば、ペプチド)成分は、共有結合または非共有結合(例えば、水素結合、イオン結合、または疎水結合)によって複合体を形成する。そのような複合体の調製には、様々な程度の操作が必要とされ得、そのような方法は文献において既知である。いくつかの態様では、抗原成分は、例えば、MHCと抗原成分を混合することによってMHC成分のポケット部分と非共有結合的に関連付けられ得;これは、MHCと抗原との間の天然の結合親和性に依存する。代替的に、いくつかの態様では、MHC成分は、限定されないが、既知のカップリング剤または光親和性標識の導入などの標準手順を使用して、抗原成分に共有結合され得る(例えば、 Hall et al., Biochemistry 24:5702-5711 (1985)を参照)。ある態様では、抗原成分は、ペプチド結合、または、限定されないが、例えば、アルファまたはベータ鎖の炭水化物部分を含む、糖タンパク質上の炭水化物群による結合を含む、文献中で論じられる他の方法によって、MHC成分に有効に結合され得る。特定の実施形態では、抗原成分は、適切なMHC分子のN末端またはC末端に結合され得る。代替的に、ある実施形態では、MHC複合体は、MHCをコードする配列に抗原成分の配列を組み込むことによって組み換えで形成されることができ、その結果、その両方はそれらの機能特性を保持する。
複数の抗原-MHC複合体は、同じナノ粒子コアに結合することができ;これらの複合体、MHC、および/または抗原は互いに同じであるか、または異なってもよく、ならびに、ナノ粒子コア当たりのpMHCの数(ナノ粒子複合体の「結合価」と本明細書で呼ばれる)は本明細書に記載される様々な範囲を有する。結合価は、約1pMHC複合体に対してナノ粒子コア(1:1)~約6000pMHC複合体に対して1つのナノ粒子コア(6000:1)、または代替的に、約8:1~約6000:1、あるいは代替的に約10:1~6000:1;または代替的に約11:1~約6000:1、または代替的に約12:1~約6000:1、または代替的に少なくとも2:1、または代替的に少なくとも8:1、または代替的に少なくとも9:1、または代替的に少なくとも10:1、または代替的に少なくとも11:1、または代替的に少なくとも12:1の間の範囲であり得る。いくつかの態様では、結合価は、約10:1から約6000:1、または約20:1から約5500:1、または代替的に約10:1から約5000:1、または代替的に約10:1から約4000:1、または代替的に約10:1から約3500:1、または代替的に約10:1から約3000:1、または代替的に約10:1から約2500:1、または代替的に約10:1から約2000:1、または代替的に約10:1から約1500:1、または代替的に約10:1から1000:1、または代替的に約10:1から約500:1、または代替的に約10:1から約100:1、または代替的に約20:1から約50:1、または代替的に約25:1から約60:1、または代替的に約30:1から約50:1、または代替的に約35:1から約45:1、または代替的に40:1である。他の態様では、1ナノ粒子コア当たりのpMHC複合体の結合価は、約10:1から約100:1、または代替的に約10:1から約1000:1、または代替的に8:1から10:1、または代替的に13:1から50:1である。
出願人は、ナノ粒子上のpMHC密度が、用量非依存的な方法でTR1細胞の形成を引き起こすかまたは分化するpMHC-NPの能力を調節することも発見した。密度は、ナノ粒子の単位面積当たりの複合体の数として計算される。ナノ粒子の表面積は、限定されないが、pMHC複合体をナノ粒子に結合させるリンカーを含む層を用いてまたは層を用いずに判定され得る。密度を計算する目的で、関連する表面積値は、ナノ粒子コア上の外側層を用いてまたは層を用いずに、pMHC複合体を有しない粒子構成物の最終的な直径に基づく。
このような態様において、1ナノ粒子当たりのpMHC密度は、ナノ粒子コアの表面積の約0.025pMHC/100nm2~約100pMHC/100nm2、または代替的に約0.406pMHC/100nm2~約50pMHC/100nm2、あるいは代替的に約0.05pMHC/100nm2~約25pMHC/100nm2である。ある態様では、1ナノ粒子当たりのpMHC密度は、約0.2pMHC/100nm2~約25pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約20のpMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約15pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約14pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約13pMHC/100nm2、または、約0.4pMHC/100nm2~約12pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約11.6pMHC/100nm2、約0.4pMHC/100nm2~約11.5pMHC/100nm2、約0.4pMHC/100nm2~約11pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約10pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約9pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約8pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約2pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約6pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約5pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約4pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約3pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約2.5pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約2pMHC/100nm2、または約0.4pMHC/100nm2~約1.5pMHC/100nm2である。
さらに別の態様では、ナノ粒子は、約0.4pMHC/100nm2~約1.3pMHC/100nm2、または代替的に約0.5pMHC/100nm2から約0.9pMHC/100nm2、または代替的に約0.6pMHC/100nm2~約0.8pMHC/100nm2の本明細書に定義されるpMHC密度を有し、さらにここで、ナノ粒子コアは約25nm~約60nm、または約25nm~約50nm、または約20nm~約40nm、または約15nm~約50nm、または約15nm~約40nm、または約15nm~約35nm、または約15nm~約30nm、または約15nm~約25nm、または代替的に約15nm、または約20nm、または約25nm、または約30nm、または約35nm、あるいは約40nmの直径を有する。一実施形態では、1ナノ粒子当たりのpMHC複合体の密度は、ナノ粒子の表面積の約0.2pMHC/100nm2~ナノ粒子の表面積の約0.8または10pMHC/100nm2を含む。他の態様では、1ナノ粒子当たりのpMHC複合体の密度は、ナノ粒子の表面積の約0.65pMHC/100nm2~ナノ粒子の表面積の約12pMHC/100nm2、ならびに本明細書に開示され、参照によって本明細書に組み込まれるさらなる濃度範囲である。
いくつかの態様では、pMHC複合体の分子間の距離は、約4nm~約300nm、または代替的に約10nm~約250nm、または代替的に約10nm~約200nm、または代替的に約10~約150nm、または代替的に約10nm~約100nm、または代替的に約10nm~約50nm、または代替的に約12nm~約30nm、または代替的に約12nm~約20nmである。いくつかの実施形態において、pMHC複合体の分子間の距離は約15nm~約20nmである。
いくつかの態様では、ナノ粒子コアを含む複合体が本明細書で提供され、ここで、複数の疾患関連抗原-MHC(pMHC)複合体がコアに結合され;コアの直径は約15nm~約25nmであり;およびここで、ナノ粒子上のpMHC密度は、ナノ粒子の表面積の約0.4pMHC/100nm2~約6pMHC/100nm2である。いくつかの実施形態において、複合体はナノ粒子コア上の外側層をさらに含み、ここで、pMHC複合体はナノ粒子コアおよび/または外側層に結合され、およびここで、ナノ粒子コアおよび外側層の直径は約35nm~約75nm、または代替的に約35nm~約70nm、あるいは約35nm~約65nmである。
本明細書で使用されるように、用語「有効に結合された」または「コーティングされた」とは、個々のポリペプチド(例えば、MHC)および抗原(例えば、ペプチド)成分が組み合わせられて、標的部位(例えば、免疫細胞)で結合する前に活性な複合体を形成する状況を指す。これは、被験体への投与前に、個々のポリペプチド複合体成分が、合成されるかまたは組み換えで発現され、続いて、単離され、組み合わせられて、インビトロで複合体を形成する状況;キメラまたは融合ポリペプチド(すなわち、複合体の各々の離散したタンパク質成分が、単一のポリペプチド鎖に含有されている)が、合成されるかまたは無傷の複合体として組み換えで発現される状況を含む。典型的に、ポリペプチド複合体がナノ粒子に加えられて、以下の分子数の比率を有する吸着されたまたは結合されたポリペプチド複合体を有するナノ粒子が産出される:約少なくとも、または多くても約0.1、0.5、1、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、50、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、またはそれ以上:1、より典型的には、0.1:1、1:1~50:1、または300:1、ならびに比率が各範囲の選択されたエンドポイントを提供する場合のそれらの間の範囲のナノ粒子の数。ナノ粒子のポリペプチド含有量は、標準技術を使用して判定され得る。
<抗原/MHCのMHC>
本明細書で使用されるように、および他に具体的に留意されない限り、pMHC複合体に関連する用語MHCは、古典的あるいは非古典的なMHCクラスIタンパク質および/または古典的あるいは非古典的なMHCクラスIIタンパク質、HLA DR、HLA DQ、HLA DP、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、CD1dの任意の遺伝子座、またはそれらのフラグメントか生物学的同等物、二本鎖または一本鎖構築物、二量体(Fc融合)、四量体、多量体形態、ならびにMHCIまたはMHCIIの多量体型を意図する。いくつかの実施形態では、pMHCは一本鎖構築物であり得る。いくつかの実施形態では、pMHCは二本鎖構築物であり得る。
本明細書で使用されるように、および他に具体的に留意されない限り、pMHC複合体に関連する用語MHCは、古典的あるいは非古典的なMHCクラスIタンパク質および/または古典的あるいは非古典的なMHCクラスIIタンパク質、HLA DR、HLA DQ、HLA DP、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、CD1dの任意の遺伝子座、またはそれらのフラグメントか生物学的同等物、二本鎖または一本鎖構築物、二量体(Fc融合)、四量体、多量体形態、ならびにMHCIまたはMHCIIの多量体型を意図する。いくつかの実施形態では、pMHCは一本鎖構築物であり得る。いくつかの実施形態では、pMHCは二本鎖構築物であり得る。
いくつかの実施形態では、MHCタンパク質は二量体または多量体であってもよい。
いくつかの実施形態では、MHCタンパク質は、ノブ・イン・ホール-ベースのMHC-アルファ-Fc/MHC-ベータ-Fcヘテロ二量体または多量体を含み得る。
上で留意されるように、隆起がヘテロ多量体の形成を促進するように空洞内に位置付けられ得るように、「ノブ・イン・ホール」は、第1のポリペプチドの界面で隆起(または「ノブ」)および第2のポリペプチドの界面で対応する空洞(または「ホール」)を必要とするポリペプチジル構造である。隆起は、第1のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖(例えばフェニルアラニンまたはチロシン)と交換することにより構築される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖(例えば、アラニンまたはトレオニン)と交換することによって、隆起と同一のまたは同様サイズの空洞が、第2のポリペプチドの界面に作られる。隆起および空洞は、当業者にとっての慣例方法を使用して、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって、またはペプチド合成などによって、合成手段により作られ得る。いくつかの実施形態では、第1のポリペプチドの界面は、第1のポリペプチドのFcドメイン上に位置し、第2のポリペプチドの界面は、第2のポリペプチド上のFcドメイン上に位置する。
上で留意されるように、「MHC-アルファ-Fc/MHC-ベータ-Fc」は、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含むヘテロ二量体であり、ここで、第1のポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖および抗体Fcドメインを含み、第2のポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖および抗体Fcドメインを含む。ノブ・イン・ホールMHC-アルファ-Fc/MHC-ベータ-Fcはさらに、各ポリペプチドのFcドメインが、他のFcドメイン上の対応する空洞内の1つのFcドメイン上の隆起の相補的位置決めによって、互いに相互作用することを必要とする。
本開示の特定の実施形態では、特定の抗原が同定され、適切なMHCクラスIまたはIIポリペプチドの文脈において抗原-MHCナノ粒子複合体中で提示される。T細胞への抗原の提示は、2つの別個のクラスの分子、すなわちMHCクラスI(MHC-I)およびMHCクラスII(MHC-II)によって媒介され、これらは別々の抗原プロセシング経路を利用する。細胞内抗原に由来するペプチドは、MHCクラスI分子によってCD8+T細胞に提示され、これは事実上すべての細胞上で発現され、一方で細胞外抗原に由来するペプチドは、MHC-II分子によってCD4+T細胞に提示される。しかし、この二分に対する特定の例外がある。いくつかの試験は、細胞内に取り込まれた微粒子または可溶性タンパク質から生成されたペプチドが、マクロファージの他に樹状細胞においてMHC-I分子上に提示されることを示した。ある態様では、被験体の遺伝的構造は、特定の患者およびペプチドの特定のセットに対してどのMHCポリペプチドが使用されるかを判定するために評価され得る。ある実施形態では、MHCクラスI成分は、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、またはCD-1分子のすべてまたは一部を含み得るか、またはそれらから本質的になり得るか、あるいは代替的にそれらからさらになり得る。MHC成分がMHCクラスII成分である実施形態では、MHCクラスII成分は、HLA-DR、HLA-DQ、またはHLA-DPのすべてまたは一部を含み得るか、またはそれらから本質的になり得るか、あるいは代替的にそれらからさらになり得る。ある実施形態では、MHCは、HLA DRB1、HLA DRB3、HLA DRB4、HLA DRB5、HLA DQB1、HLA DQA1、IAg7、I-Ab、I-Ad、HLA-DQ、HLA-DP、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-EまたはCD1dを含み得る。
非古典的なMHC分子はまた、本開示のMHC複合体での使用のために熟考される。いくつかの実施形態では、非古典的なMHC分子は非多形的であり、種間で保護され、および、狭く、深い、疎水性リガンド結合ポケットを有する。これらの結合ポケットは、ナチュラルキラーT(NKT)細胞に糖脂質およびリン脂質を提示することができる。NKT細胞は、NK細胞マーカーおよび半不変T細胞受容体(TCR)を同時発現する特有のリンパ球集団を表す。それらは、広範囲の疾患に関連する免疫反応の調節に関係している。
上で留意されるように、用語「MHC」とは、ヒトMHCに関して使用されるときに、用語「ヒト白血球抗原」(HLA)と交換可能に使用されることができ、それ故、MHCは、限定されないが、上に開示された古典的なMHC遺伝子を含む、以下のすべてのHLAサブタイプを指す:HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DP、HLA-DQ、およびHLA-DR、すべての変異体に加えて、アイソフォーム、アイソタイプ、および他の生物学的同等物。
本開示に従った使用のためのMHCは、当該技術分野で既知の技術によって、生成、単離、または精製されてもよい。MHCを得るための共通プロトコルは、限定されないが、電気泳動または電荷あるいはサイズベースの分離(size based separation)の他の技術、ビオチン化または他のタギング法および精製、またはMHCタンパク質を発現するベクター構築物のトランスフェクションおよび誘導を含むステップを含む。精製された動物抗体も、eBioscience、Biolegend、およびTonbo Biosciencesなどの小売り業者を含む、市販のソースを介して入手可能である。
ある実施形態では、抗原-MHC複合体のMHCは、古典的MHCI、非古典的MHCI、典型的MHCII、非古典的MHCII、二量体(Fc融合)、MHC四量体、多量体、またはMHCの多量体型であってもよい。いくつかの実施形態において、MHC多量体は当技術分野において十分に立証された方法に従って生成され、例えば、Bakker et al. “MHC Multimer Technology: Current Status and Future Prospects,” Current Opinion in Immunology 17(4):428-433 (2005)およびその中の参照文献を参照する。非限定的な典型的な方法は、MHC単量体と結合するストレプトアビジンまたはアビジンなどのビオチン化剤の使用を含み、骨格(backbone)としての薬剤を用いて多重体構造を作り上げる。MHC二量体は、具体的には、抗体定常領域またはFc領域を用いて融合によって代替的に生成することができ、これには、直接的に、またはリンカー(例えば、システインリンカー)を介した有効なカップリング(operative coupling)が伴い得る。
<pMHCの抗原>
抗原および抗原成分の具体的な例が本明細書に開示されるが、本開示はそれらに限定されない。具体的に他に明記されない限り、本明細書には、単離または精製されたポリペプチド抗原の同等物が含まれ、これらは、本明細書に記載されるようなアミノ酸配列、または抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列同一性、または代替的に少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的に少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチド、または抗原のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して約80%の配列同一性、あるいは代替的に少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的に少なくとも98%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、またはその補体、あるいは中程度から高度のストリンジェンシー条件下で抗原のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドへとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、またはその補体を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからさらになる。さらに、本明細書に開示された抗原ポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレオチド、またはそれに対して少なくとも約80%の配列同一性、あるいは代替的に開示された配列に対して少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的に少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸、または同等物、あるいはストリンジェントな条件下でポリヌクレオチド、その同等物またはその補体へとハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドによってコードされた単離または精製されたポリペプチドが提供される。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それらが自然に関連付けられていない非自然発生物質、例えば、担体、薬学的に許容可能な担体、ベクター、およびMHC分子と組み合わせられてもよい。本明細書に開示される抗原に加えて、出願人のWO2016/198932に開示される抗原(参照によって本明細書に組み込まれる)。
抗原および抗原成分の具体的な例が本明細書に開示されるが、本開示はそれらに限定されない。具体的に他に明記されない限り、本明細書には、単離または精製されたポリペプチド抗原の同等物が含まれ、これらは、本明細書に記載されるようなアミノ酸配列、または抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも約80%の配列同一性、または代替的に少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的に少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチド、または抗原のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して約80%の配列同一性、あるいは代替的に少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的に少なくとも98%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、またはその補体、あるいは中程度から高度のストリンジェンシー条件下で抗原のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドへとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、またはその補体を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからさらになる。さらに、本明細書に開示された抗原ポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレオチド、またはそれに対して少なくとも約80%の配列同一性、あるいは代替的に開示された配列に対して少なくとも85%、または代替的に少なくとも90%、または代替的に少なくとも95%、または代替的に少なくとも98%の配列同一性を有するアミノ酸、または同等物、あるいはストリンジェントな条件下でポリヌクレオチド、その同等物またはその補体へとハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドによってコードされた単離または精製されたポリペプチドが提供される。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それらが自然に関連付けられていない非自然発生物質、例えば、担体、薬学的に許容可能な担体、ベクター、およびMHC分子と組み合わせられてもよい。本明細書に開示される抗原に加えて、出願人のWO2016/198932に開示される抗原(参照によって本明細書に組み込まれる)。
<修飾ペプチドおよびその同等物>
抗原のポリペプチド、タンパク質、ならびにそれらのフラグメントは、様々なアミノ酸の欠失、挿入、および/または置換によって修飾され得る。特定の実施形態では、修飾されたポリペプチドおよび/またはペプチドは、被験体における免疫反応を調節することができる。本明細書で使用されるように、「タンパク質」または「ポリペプチド」あるいは「ペプチド」は、少なくとも5つのアミノ酸残基を含む分子を指す。いくつかの実施形態において、タンパク質またはペプチドの野生型のバージョンが使用されるが;開示の多くの実施形態では、修飾されたタンパク質またはポリペプチドはペプチド/MHC/ナノ粒子複合体を生成するために使用される。ペプチド/MHC/ナノ粒子複合体は、免疫反応を発生させるため、および/または免疫系のT細胞集団を修飾する(すなわち、免疫系を再教育する(re-educate))ために使用され得る。上記の用語は、本明細書で交換可能に使用されてもよい。「修飾タンパク質」または「修飾ポリペプチド」あるいは「修飾ペプチド」は、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が野生型のタンパク質またはポリペプチドに関して変更される、タンパク質またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾されたタンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドは、少なくとも1つの修飾された活性または機能を有する(タンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドが、複数の活性または機能を有し得ることを認識)。修飾されたタンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドが、1つの活性または機能に関してさらに変更されても、MHC/ナノ粒子複合体の文脈において免疫原性または免疫系の他の細胞と相互作用する能力などの、他の関連での野生型の活性または機能を保持し得ることが具体的には熟考される。
抗原のポリペプチド、タンパク質、ならびにそれらのフラグメントは、様々なアミノ酸の欠失、挿入、および/または置換によって修飾され得る。特定の実施形態では、修飾されたポリペプチドおよび/またはペプチドは、被験体における免疫反応を調節することができる。本明細書で使用されるように、「タンパク質」または「ポリペプチド」あるいは「ペプチド」は、少なくとも5つのアミノ酸残基を含む分子を指す。いくつかの実施形態において、タンパク質またはペプチドの野生型のバージョンが使用されるが;開示の多くの実施形態では、修飾されたタンパク質またはポリペプチドはペプチド/MHC/ナノ粒子複合体を生成するために使用される。ペプチド/MHC/ナノ粒子複合体は、免疫反応を発生させるため、および/または免疫系のT細胞集団を修飾する(すなわち、免疫系を再教育する(re-educate))ために使用され得る。上記の用語は、本明細書で交換可能に使用されてもよい。「修飾タンパク質」または「修飾ポリペプチド」あるいは「修飾ペプチド」は、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が野生型のタンパク質またはポリペプチドに関して変更される、タンパク質またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾されたタンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドは、少なくとも1つの修飾された活性または機能を有する(タンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドが、複数の活性または機能を有し得ることを認識)。修飾されたタンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドが、1つの活性または機能に関してさらに変更されても、MHC/ナノ粒子複合体の文脈において免疫原性または免疫系の他の細胞と相互作用する能力などの、他の関連での野生型の活性または機能を保持し得ることが具体的には熟考される。
本開示のタンパク質は、組み換え型であり得るか、インビトロで合成され得る。代替的に、組み換えタンパク質は、細菌または他の宿主細胞から単離され得る。
配列が生物学的タンパク質活性(例えば、免疫原性)の維持を含む上述の基準を満たす限り、アミノ酸および核酸の配列が、それぞれ、追加のN末端またはC末端のアミノ酸などの追加の残基、あるいは5’または3’の核酸配列を含むことができ、さらに、本質的に本明細書に開示される配列の1つに記載される通りのものであることも理解される。末端配列の追加は、特に、例えば、コード領域の5’または3’部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る核酸配列に適用される。
<疾患関連抗原>
ナノ粒子は、本明細書に記載されるような治療方法に有用である。pMHC-NPのpMHC複合体は、処置される疾患に基づいて使用のために選択される。例えば、糖尿病関連抗原は、抗原が疾患プロセスの誘因またはその病態形成における中心的存在ではなく、提示されたときに糖尿病を処置する働きをする免疫反応を生成する場合であっても、その自己免疫性疾患において標的とされた細胞、組織、または臓器において発現される、および自己免疫反応によって引き起こされた細胞、組織、または臓器の損傷で免疫系に曝露される抗原またはそのフラグメントであり;したがって、この定義を満たす糖尿病関連抗原は、糖尿病を処置するために選択される。MS関連抗原は、MSを処置するために選択される。糖尿病関連抗原は、MSを処置するためには選択されないだろう。非限定的な典型的な疾患関連抗原が本明細書に開示され、さらに、そのような抗原は、文献において十分に立証された技術、機構、および方法に基づいて、特定の疾患のために判定され得る。
ナノ粒子は、本明細書に記載されるような治療方法に有用である。pMHC-NPのpMHC複合体は、処置される疾患に基づいて使用のために選択される。例えば、糖尿病関連抗原は、抗原が疾患プロセスの誘因またはその病態形成における中心的存在ではなく、提示されたときに糖尿病を処置する働きをする免疫反応を生成する場合であっても、その自己免疫性疾患において標的とされた細胞、組織、または臓器において発現される、および自己免疫反応によって引き起こされた細胞、組織、または臓器の損傷で免疫系に曝露される抗原またはそのフラグメントであり;したがって、この定義を満たす糖尿病関連抗原は、糖尿病を処置するために選択される。MS関連抗原は、MSを処置するために選択される。糖尿病関連抗原は、MSを処置するためには選択されないだろう。非限定的な典型的な疾患関連抗原が本明細書に開示され、さらに、そのような抗原は、文献において十分に立証された技術、機構、および方法に基づいて、特定の疾患のために判定され得る。
対象の疾患の非限定的な例としては、限定されないが、喘息、真性糖尿病I型およびII型、糖尿病前症、多発性硬化症、末梢神経障害、アレルギー喘息、原発性胆汁性肝硬変、肝硬変、視神経脊髄炎スペクトル障害、全身硬直症候群などの自己抗体関連神経症候群、自己免疫性脳炎、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、天疱瘡、葉状、乾癬、シェーグレン病/症候群、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡(SLE)、強皮症、ANCA関連の脈管炎、グッドパスチャー症候群、川崎病、セリアック病、自己免疫性心筋症、特発性拡張型心筋症(IDCM)、重症筋無力症、自己免疫性ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、グレーヴス病、免疫介在性ミオパチー、抗リン脂質抗体症候群(ANCA+)、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性肝炎、硬化性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、皮膚筋炎、慢性閉塞性肺疾患、脊髄損傷、外傷、タバコ誘発性肺破壊、気腫、天疱瘡、ブドウ膜炎、中枢および末梢の神経系の他の関連する癌および/または疾患が挙げられる。
例示的な抗原または抗原成分は、限定されないが、米国特許出願第15/348、959号に開示されるものを含み、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
<糖尿病関連の抗原>
糖尿病関連抗原は、限定されないが、PPI、IGRP、GAD、島細胞自己抗原-2(ICA2)、および/またはインスリンに由来する抗原を含む。自己反応性の糖尿病関連抗原ペプチドは、限定されないが、hInsB10-18(HLVEALYLV)、hIGRP228-236(LNIDLLWSV)、hIGRP265-273(VLFGLGFAI)、IGRP206-214(VYLKTNVFL)、hIGRP206-214(VYLKTNLFL)、NRP-A7 (KYNKANAFL)、NRP-I4(KYNIANVFL)、NRP-V7(KYNKANVFL)、YAI/Db(FQDENYLYL)INS B15-23(LYLVCGERG)、PPI76-90(K88S)(SLQPLALEGSLQSRG)、IGRP13-25(QHLQKDYRAYYTF)、GAD555-567(NFFRMVISNPAAT)、GAD555-567(557I):(NFIRMVISNPAAT)、IGRP23-35(YTFLNFMSNVGDP)、B24-C36(FFYTPKTRREAED)、PPI76-90(SLQPLALEGSLQKRG)、ならびに、米国特許公報第2005/0202032号に開示されるペプチドおよびタンパク質を含み、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。自己反応性ペプチドまたは対照ペプチドとして、この開示とともに使用することができる他のペプチドは、限定されないが、INS-I9(LYLVCGERI)、TUM(KYQAVTTTL)、およびG6Pase(KYCLITIFL)、ならびにその各々の等価物を含む。さらなる例は、Pro-insulinL2-10、ALWMRLLPL;Pro-insulinL3-11、LWMRLLPLL;Pro-insulinL6-14、RLLPLLALL;Pro-insulinB5-14、HLCGSHLVEA;Pro-insulinB10-18、HLVEALYLV;Pro-insulinB14-22、ALYLVCGER;Pro-insulinB15-24、LYLVCGERGF;Pro-insulinB17-25、LVCGERGFF;Pro-insulinB18-27、VCGERGFFYT;Pro-insulinB20-27、GERGFFYT;Pro-insulinB21-29、ERGFFYTPK;Pro-insulinB25-C1、FYTPKTRRE;Pro-insulinB27-C5、TPKTRREAEDL;Pro-insulinC20-28、SLQPLALEG;Pro-insulinC25-33、ALEGSLQKR;Pro-insulinC29-A5、SLQKRGIVEQ;Pro-insulinA1-10、GIVEQCCTSI;Pro-insulinA2-10、IVEQCCTSI;Pro-insulinA12-20、SLYQLENYCまたはその等価物および/またはそれらの組み合わせを含む。糖尿病関連抗原としては、限定されないが、表1に列挙されるものおよびその等価物ならびに組み合わせが挙げられる。
糖尿病関連抗原は、限定されないが、PPI、IGRP、GAD、島細胞自己抗原-2(ICA2)、および/またはインスリンに由来する抗原を含む。自己反応性の糖尿病関連抗原ペプチドは、限定されないが、hInsB10-18(HLVEALYLV)、hIGRP228-236(LNIDLLWSV)、hIGRP265-273(VLFGLGFAI)、IGRP206-214(VYLKTNVFL)、hIGRP206-214(VYLKTNLFL)、NRP-A7 (KYNKANAFL)、NRP-I4(KYNIANVFL)、NRP-V7(KYNKANVFL)、YAI/Db(FQDENYLYL)INS B15-23(LYLVCGERG)、PPI76-90(K88S)(SLQPLALEGSLQSRG)、IGRP13-25(QHLQKDYRAYYTF)、GAD555-567(NFFRMVISNPAAT)、GAD555-567(557I):(NFIRMVISNPAAT)、IGRP23-35(YTFLNFMSNVGDP)、B24-C36(FFYTPKTRREAED)、PPI76-90(SLQPLALEGSLQKRG)、ならびに、米国特許公報第2005/0202032号に開示されるペプチドおよびタンパク質を含み、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。自己反応性ペプチドまたは対照ペプチドとして、この開示とともに使用することができる他のペプチドは、限定されないが、INS-I9(LYLVCGERI)、TUM(KYQAVTTTL)、およびG6Pase(KYCLITIFL)、ならびにその各々の等価物を含む。さらなる例は、Pro-insulinL2-10、ALWMRLLPL;Pro-insulinL3-11、LWMRLLPLL;Pro-insulinL6-14、RLLPLLALL;Pro-insulinB5-14、HLCGSHLVEA;Pro-insulinB10-18、HLVEALYLV;Pro-insulinB14-22、ALYLVCGER;Pro-insulinB15-24、LYLVCGERGF;Pro-insulinB17-25、LVCGERGFF;Pro-insulinB18-27、VCGERGFFYT;Pro-insulinB20-27、GERGFFYT;Pro-insulinB21-29、ERGFFYTPK;Pro-insulinB25-C1、FYTPKTRRE;Pro-insulinB27-C5、TPKTRREAEDL;Pro-insulinC20-28、SLQPLALEG;Pro-insulinC25-33、ALEGSLQKR;Pro-insulinC29-A5、SLQKRGIVEQ;Pro-insulinA1-10、GIVEQCCTSI;Pro-insulinA2-10、IVEQCCTSI;Pro-insulinA12-20、SLYQLENYCまたはその等価物および/またはそれらの組み合わせを含む。糖尿病関連抗原としては、限定されないが、表1に列挙されるものおよびその等価物ならびに組み合わせが挙げられる。
<MS関連抗原>
本開示の抗原は、多発性硬化症に関連する抗原を含む。そのような抗原は、例えば、米国特許出願公開番号2012/0077686に開示される抗原、およびミエリン塩基性タンパク質に由来する抗原、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質NOGO A、糖タンパク質Po、末梢ミエリンタンパク質22、ならびに2’3’-環状ヌクレオチド3’-ホスホジエステラーゼを含む。ある実施形態では、抗原は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)に由来する。
本開示の抗原は、多発性硬化症に関連する抗原を含む。そのような抗原は、例えば、米国特許出願公開番号2012/0077686に開示される抗原、およびミエリン塩基性タンパク質に由来する抗原、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質NOGO A、糖タンパク質Po、末梢ミエリンタンパク質22、ならびに2’3’-環状ヌクレオチド3’-ホスホジエステラーゼを含む。ある実施形態では、抗原は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)に由来する。
さらなる態様では、MSおよびMS関連障害の処置のためのペプチド抗原は、限定されることなく:MOG35-55、MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK;MOG36-55、EVGWYRSPFSRVVHLYRNGK;MAG287-295、SLLLELEEV;MAG509-517、LMWAKIGPV;MAG556-564、VLFSSDFRI;MBP110-118、SLSRFSWGA;MOG114-122、KVEDPFYWV;MOG166-175、RTFDPHFLRV;MOG172-180、FLRVPCWKI;MOG179-188、KITLFVIVPV;MOG188-196、VLGPLVALI;MOG181-189、TLFVIVPVL;MOG205-214、RLAGQFLEEL;PLP80-88、FLYGALLLA MAG287-295、SLLLELEEV;MAG509-517、LMWAKIGPV;MAG556-564、VLFSSDFRI、MOG97-109(TCFFRDHSYQEEA)、MOG97-109(E107S)(TCFFRDHSYQSEA)、MBP89-101(VHFFKNIVTPRTP), PLP175-192 (YIYFNTWTTCQSIAFPSK), PLP94-108(GAVRQIFGDYKTTIC、MBP86-98(PVVHFFKNIVTPR-HLA-DRB1*1501(13量体のペプチド)、PLP54-68(NYQDYEYLINVIHAF)、PLP249-263(ATLVSLLTFMIAATY)、MOG156-170(LVLLAVLPVLLLQIT)、MOG201-215(FLRVPCWKITLFVIV)、ならびにその等価物および/または組み合わせを含む。多発性硬化症関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<セリアック病(CD)関連抗原>
セリアック病関連抗原は、限定されないが、aGliaに由来する抗原を含む。非限定的なセリアック病関連抗原はグリアジンを含む。他の非限定的な例示的なセリアック病関連抗原は以下mpものを含む:aGlia57-68:QLQPFPQPELPY(12量体のペプチド);aGlia62-72:PQPELPYPQPE(11量体のペプチド);aGlia217-219;およびSGEGSFQPSQQNP(13量体のペプチド)、その等価物ならびに組み合わせ。セリアック病関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
セリアック病関連抗原は、限定されないが、aGliaに由来する抗原を含む。非限定的なセリアック病関連抗原はグリアジンを含む。他の非限定的な例示的なセリアック病関連抗原は以下mpものを含む:aGlia57-68:QLQPFPQPELPY(12量体のペプチド);aGlia62-72:PQPELPYPQPE(11量体のペプチド);aGlia217-219;およびSGEGSFQPSQQNP(13量体のペプチド)、その等価物ならびに組み合わせ。セリアック病関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<原発性胆汁性肝硬変症(PBC)関連抗原>
原発性胆汁性肝硬変症関連抗原は、限定されないが、PDC-E2に由来する抗原を含む。代表的な抗原の非限定的な例は以下を含む:PDC-E2122-135:GDLIAEVETDKATV(14量体のペプチド);PDC-E2249-262:GDLLAEIETDKATI(14量体のペプチド);PDC-E2249-263:GDLLAEIETDKATIG(15量体のペプチド);およびPDC-E2629-643:AQWLAEFRKYLEKPI(15量体のペプチド)、その等価物および組み合わせ。原発性胆汁性肝硬変関連抗原は、表1に列挙されるもの、ならびにその等価物および組み合わせを含む。
原発性胆汁性肝硬変症関連抗原は、限定されないが、PDC-E2に由来する抗原を含む。代表的な抗原の非限定的な例は以下を含む:PDC-E2122-135:GDLIAEVETDKATV(14量体のペプチド);PDC-E2249-262:GDLLAEIETDKATI(14量体のペプチド);PDC-E2249-263:GDLLAEIETDKATIG(15量体のペプチド);およびPDC-E2629-643:AQWLAEFRKYLEKPI(15量体のペプチド)、その等価物および組み合わせ。原発性胆汁性肝硬変関連抗原は、表1に列挙されるもの、ならびにその等価物および組み合わせを含む。
<落葉状天疱瘡(PF)および尋常性天疱瘡(PV)関連抗原>
PFおよびPV関連抗原は、限定されないが、DG1EC2、デスモグレイン3(DG3またはDSG3)、および/またはデスモグレイン1(DG1またはDSG1)に由来する抗原を含む。非限定的な例は以下を含む:DG1EC2216-235:GEIRTMNNFLDREI(14量体のペプチド);DG397-111:FGIFVVDKNTGDINI(15量体のペプチド);およびDG3251-265:CECNIKVKDVNDNFP(15量体のペプチド)、その等価物ならびに組み合わせ。落葉状天疱瘡および尋常性天疱瘡関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
PFおよびPV関連抗原は、限定されないが、DG1EC2、デスモグレイン3(DG3またはDSG3)、および/またはデスモグレイン1(DG1またはDSG1)に由来する抗原を含む。非限定的な例は以下を含む:DG1EC2216-235:GEIRTMNNFLDREI(14量体のペプチド);DG397-111:FGIFVVDKNTGDINI(15量体のペプチド);およびDG3251-265:CECNIKVKDVNDNFP(15量体のペプチド)、その等価物ならびに組み合わせ。落葉状天疱瘡および尋常性天疱瘡関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<視神経脊髄炎(NMO)関連抗原>
NMO関連抗原は、限定されないが、AQP4またはaquaporina 4に由来するものを含む。非限定的な例は以下を含む:AQP4129-143:GAGILYLVTPPSVVG(15量体のペプチド);AQP4284-298:RSQVETDDLILKPGV(15量体のペプチド);AQP463-76:EKPLPVDMVLISLC(14量体のペプチド);AQP4129-143:GAGILYLVTPPSVVG(15量体のペプチド);およびAQP439-53:TAEFLAMLIFVLLSL(15量体のペプチド)、その等価物および組み合わせ。NMO関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
NMO関連抗原は、限定されないが、AQP4またはaquaporina 4に由来するものを含む。非限定的な例は以下を含む:AQP4129-143:GAGILYLVTPPSVVG(15量体のペプチド);AQP4284-298:RSQVETDDLILKPGV(15量体のペプチド);AQP463-76:EKPLPVDMVLISLC(14量体のペプチド);AQP4129-143:GAGILYLVTPPSVVG(15量体のペプチド);およびAQP439-53:TAEFLAMLIFVLLSL(15量体のペプチド)、その等価物および組み合わせ。NMO関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<コラーゲン誘発性関節炎関連抗原>
コラーゲン誘発性関節関連抗原は、限定されないが、CIIに由来するものを含む。非限定的な例は以下を含む:cCII230-244:APGFPGPRGPPGPQG(15量体のペプチド);cCII632-646:PAGFAGPPGADGQPG(15量体のペプチド);およびCII259-273:GIAGFKGDQGPKGET(15量体のペプチド)、またはその等価物および組み合わせ。関節炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
コラーゲン誘発性関節関連抗原は、限定されないが、CIIに由来するものを含む。非限定的な例は以下を含む:cCII230-244:APGFPGPRGPPGPQG(15量体のペプチド);cCII632-646:PAGFAGPPGADGQPG(15量体のペプチド);およびCII259-273:GIAGFKGDQGPKGET(15量体のペプチド)、またはその等価物および組み合わせ。関節炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<アレルギー喘息関連抗原>
アレルギー喘息関連抗原は、限定されないが、DERP1およびDERP2に由来するものを含む。アレルギー喘息関連抗原は、限定されないが、表1に表記されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
アレルギー喘息関連抗原は、限定されないが、DERP1およびDERP2に由来するものを含む。アレルギー喘息関連抗原は、限定されないが、表1に表記されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<大腸炎関連抗原>
実験的大腸炎関連抗原は、限定されないが、バクテロイデスインテグラーゼ、Fla-2/Fla-X、およびYIDXに由来したものを含む。大腸炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
実験的大腸炎関連抗原は、限定されないが、バクテロイデスインテグラーゼ、Fla-2/Fla-X、およびYIDXに由来したものを含む。大腸炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<全身性エリテマトーデス(SLE)関連抗原>
SLE関連抗原は、限定されないが、H4、H2B、H1’dsDNA、RNP、Smith(Sm)、SSA/Ro、SSB/La(SS-B)、および/またはヒストンに由来するものを含む。非限定的な例は、各タンパク質の以下のセグメントを含む:H471-94:TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG、H474-88:EHAKRKTVTAMDVVY(15量体のペプチド);H476-90:AKRKTVTAMDVVYAL(15量体のペプチド);H475-89:HAKRKTVTAMDVVYA(15量体のペプチド);H478-92:RKTVTAMDVVYALKR(15量体のペプチド);H480-94:TVTAMDVVYALKRQ(15量体のペプチド);H2B10-24:PKKGSKKAVTKAQKK(15量体のペプチド);およびH2B16-30:KAVTKAQKKDGKKRK(15量体のペプチド)、H1’22-42:STDHPKYSDMIVAAIQAEKNR;ならびにH1’27-41:KYSDMIVAAIQAEKN、ならびにその等価物および組み合わせ。SLE関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
SLE関連抗原は、限定されないが、H4、H2B、H1’dsDNA、RNP、Smith(Sm)、SSA/Ro、SSB/La(SS-B)、および/またはヒストンに由来するものを含む。非限定的な例は、各タンパク質の以下のセグメントを含む:H471-94:TYTEHAKRKTVTAMDVVYALKRQG、H474-88:EHAKRKTVTAMDVVY(15量体のペプチド);H476-90:AKRKTVTAMDVVYAL(15量体のペプチド);H475-89:HAKRKTVTAMDVVYA(15量体のペプチド);H478-92:RKTVTAMDVVYALKR(15量体のペプチド);H480-94:TVTAMDVVYALKRQ(15量体のペプチド);H2B10-24:PKKGSKKAVTKAQKK(15量体のペプチド);およびH2B16-30:KAVTKAQKKDGKKRK(15量体のペプチド)、H1’22-42:STDHPKYSDMIVAAIQAEKNR;ならびにH1’27-41:KYSDMIVAAIQAEKN、ならびにその等価物および組み合わせ。SLE関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<高脂肪食誘発性アテローム動脈硬化症関連抗原>
高脂肪食誘発性アテローム動脈硬化症関連抗原は、限定されないが、ApoBに由来するものを含む。非限定的な例は、各タンパク質の以下のセグメントを含む:ApoB3501-3516:SQEYSGSVANEANVY(15量体のペプチド);ApoB1952-1966:SHSLPYESSISTALE(15量体のペプチド);ApoB978-993:TGAYSNASSTESASY(15量体のペプチド);ApoB3498-3513:SFLSQEYSGSVANEA(15量体のペプチド);ApoB210A:KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH(20量体のペプチド);ApoB210B:KTTKQSFDLSVKAQY(15量体のペプチド);およびApoB210C:TTKQSFDLSVKAQYK(15量体のペプチド)ならびにその等価物および組み合わせ。アテローム動脈硬化症関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
高脂肪食誘発性アテローム動脈硬化症関連抗原は、限定されないが、ApoBに由来するものを含む。非限定的な例は、各タンパク質の以下のセグメントを含む:ApoB3501-3516:SQEYSGSVANEANVY(15量体のペプチド);ApoB1952-1966:SHSLPYESSISTALE(15量体のペプチド);ApoB978-993:TGAYSNASSTESASY(15量体のペプチド);ApoB3498-3513:SFLSQEYSGSVANEA(15量体のペプチド);ApoB210A:KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH(20量体のペプチド);ApoB210B:KTTKQSFDLSVKAQY(15量体のペプチド);およびApoB210C:TTKQSFDLSVKAQYK(15量体のペプチド)ならびにその等価物および組み合わせ。アテローム動脈硬化症関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<COPDおよび気腫関連抗原>
COPDおよび/または気腫関連抗原は、限定されないが、エラスチンに由来するものを含む。非限定的な例は、エラスチンの以下のセグメントを含む。COPDおよび/または気腫関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
COPDおよび/または気腫関連抗原は、限定されないが、エラスチンに由来するものを含む。非限定的な例は、エラスチンの以下のセグメントを含む。COPDおよび/または気腫関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
<乾癬関連抗原>
乾癬関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的な乾癬関連抗原は、ヒトadamis様タンパク質5(ATL5)、カテリシジン抗菌性ペプチド(CAP18)、および/またはADAMTS様タンパク質5(ADMTSL5)を含む。
乾癬関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的な乾癬関連抗原は、ヒトadamis様タンパク質5(ATL5)、カテリシジン抗菌性ペプチド(CAP18)、および/またはADAMTS様タンパク質5(ADMTSL5)を含む。
<自己免疫性肝炎関連抗原>
自己免疫性肝炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的な自己免疫性肝炎関連抗原は、シトクロムP450 2D6(CYP2D6)および/または可溶性肝臓抗原(SLA)を含む。
自己免疫性肝炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的な自己免疫性肝炎関連抗原は、シトクロムP450 2D6(CYP2D6)および/または可溶性肝臓抗原(SLA)を含む。
<ブドウ膜炎関連抗原>
ブドウ膜炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的なブドウ膜炎関連抗原は、アレスチン、S-アレスチン、ヒト網膜のS抗原、および/または光受容体レチノイド結合タンパク質(IRBP)を含む。
ブドウ膜炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的なブドウ膜炎関連抗原は、アレスチン、S-アレスチン、ヒト網膜のS抗原、および/または光受容体レチノイド結合タンパク質(IRBP)を含む。
<シェーグレン症候群関連抗原>
シェーグレン症候群関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的なシェーグレン症候群関連抗原は、SSA/Ro(TROVE)、SSB/La、および/またはムスカリン受容体3(MR3)を含む。
シェーグレン症候群関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的なシェーグレン症候群関連抗原は、SSA/Ro(TROVE)、SSB/La、および/またはムスカリン受容体3(MR3)を含む。
<強皮症関連抗原>
強皮症関連抗原は、限定されないが、セントロメア自己抗原セントロメアタンパク質C(CENP-C)、DNAトポイソメラーゼI(TOP1)、および/またはRNAポリメラーゼIIIを含む。
強皮症関連抗原は、限定されないが、セントロメア自己抗原セントロメアタンパク質C(CENP-C)、DNAトポイソメラーゼI(TOP1)、および/またはRNAポリメラーゼIIIを含む。
<抗リン脂質抗体症候群関連抗原>
抗リン脂質抗体症候群関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。非限定的な典型的な抗リン脂質抗体症候群関連抗原は、β-2-糖タンパク質1(BG2P1またはAPOH)を含む。
抗リン脂質抗体症候群関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。非限定的な典型的な抗リン脂質抗体症候群関連抗原は、β-2-糖タンパク質1(BG2P1またはAPOH)を含む。
<ANCA関連血管炎関連抗原>
ANCA関連血管炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。非限定的な典型的なANCA関連血管炎関連抗原は、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、プロテイナーゼ(PR3)、あるいは細菌の透過性増加因子(BPI)を含む。
ANCA関連血管炎関連抗原は、限定されないが、表1に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。非限定的な典型的なANCA関連血管炎関連抗原は、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)、プロテイナーゼ(PR3)、あるいは細菌の透過性増加因子(BPI)を含む。
<癌関連抗原>
ある態様では、疾患関連抗原は癌関連の抗原である。さらなる態様では、癌は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および/またはこれらからまたは他の癌からの転移の混合型である。典型的な癌または腫瘍関連の抗原は、限定されないが、表2に開示されるものを含む。
ある態様では、疾患関連抗原は癌関連の抗原である。さらなる態様では、癌は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および/またはこれらからまたは他の癌からの転移の混合型である。典型的な癌または腫瘍関連の抗原は、限定されないが、表2に開示されるものを含む。
他の癌関連抗原は、2015年5月6日を最後に参照された、このオンラインデータベースhttp://cancerimmunity.org/peptide/における表中に要約されるものおよび参照によって本明細書に組み込まれるものを含む。
本開示の組成物では、組成物中に1ml当たり約0.001mg~約10mgの総タンパク質量があると考えられる。pMHCによって測定されるように、有効量は約0.0004mg/kg~約2.027mg/kgであり、および0.0004mg/kg~約2.027mg/kgの間の範囲であるとさらに考えられる。したがって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、50、100μg/mlあるいはmg/ml以上(あるいはそこから推論可能な任意の範囲)であり得る。このうち、約、少なくとも約、または多くても約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%は、ペプチド/MHC/ナノ粒子複合体であることがある。
加えて、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,554,101号(Hopp)は、親水性に基づいて原発性のアミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示する。Hoppで開示された方法により、当業者は、アミノ酸配列内からの潜在的なエピトープを同定し、それらの免疫原性を確認することができる。多くの科学的な出版物が、アミノ酸配列の分析による二次構造の予測およびエピトープの同定を扱っている(Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979)。米国特許第4,554,101号におけるHoppの教示を補足するために、必要に応じてこれらのいずれかを使用してもよい。
<サイトカイン>
ある態様では、NPは、少なくとも1つのサイトカイン分子をさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。本明細書で使用されるように、用語「サイトカイン」は、分子および細胞のレベルで身体内の広範囲の生物学的過程を制御するためのシグナル伝達分子として作用する、免疫系において様々な細胞によって分泌された低分子量タンパク質を包含する。「サイトカイン」は、リンホカイン、インターロイキン、またはケモカインのクラス内にある個々の免疫調節タンパク質を含む。
ある態様では、NPは、少なくとも1つのサイトカイン分子をさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。本明細書で使用されるように、用語「サイトカイン」は、分子および細胞のレベルで身体内の広範囲の生物学的過程を制御するためのシグナル伝達分子として作用する、免疫系において様々な細胞によって分泌された低分子量タンパク質を包含する。「サイトカイン」は、リンホカイン、インターロイキン、またはケモカインのクラス内にある個々の免疫調節タンパク質を含む。
非限定的な典型的な例が本明細書に開示される。例えば、IL-1AおよびIL-1Bは、ヒトインターロイキン-1(IL-1)ファミリーの2つの別個のメンバーである。成熟したIL-1Aは18kDaタンパク質であり、線維芽細胞活性化因子(FAF)、リンパ球活性化因子(LAF)、B細胞活性化因子(BAF)、白血球内因性メディエーター(LEM)などとしても知られている。IL-4は、Tヘルパー-2(Th2)細胞分化を誘発するサイトカインであり、IL-13と同様の機能を有する。IL-5は、Th2細胞およびマスト細胞によって生成される。それは、B細胞成長を刺激し、免疫グロブリン分泌を増加させるように作用する。それは好酸球活性化にも関係している。IL-6は、炎症促進性または抗炎症性のサイトカインのいずれかとして作用することができるインターロイキンである。それはT細胞およびマクロファージによって分泌されて、外傷または炎症につながる他の組織損傷に対する免疫反応を刺激する。IL-6はまた、筋収縮に応じて筋肉から生成される。IL-8は、マクロファージ、および上皮細胞ならびに内皮細胞などの他の細胞タイプによって生成されるケモカインであり、先天性免疫系反応において免疫反応の重要なメディエーターとして作用する。IL-12は、Tヘルパー(Th1またはTh2)細胞へのナイーブT細胞の分化に関与する。ヘテロ二量体サイトカインとして、IL-12は、2つの別々の遺伝子、すなわちIL-12A(p35)およびIL-12B(p40)によってコードされる2つのサブユニットが、タンパク質合成後に二量化した後に形成される。IL-12p70は、このヘテロ二量体組成物を示唆している。多くの細胞型、特に、Th2細胞によって分泌されたサイトカインであるIL-13は、アレルギー性の炎症および疾患の重要なメディエーターである。IL-17は、Tヘルパー細胞によって生成されるサイトカインであり、IL-23によって誘発され、遅延型反応における破壊的な組織損傷が結果として生じる。IL-17は、細胞外病原体による免疫系の侵入に反応し、病原体の細胞マトリックスの破壊を誘発する炎症促進性サイトカインとして機能する。IP-10、すなわちインターフェロンガンマ誘発性タンパク質10は、C-X-Cモチーフケモカイン10(CXCL10)または小誘導性サイトカイン(small-inducible cytokine)B10としても知られている。CXCケモカインファミリーに属する小さなサイトカインとして、IP-10は、IFN-γに応じていくつかの細胞型(単球、内皮細胞、および線維芽細胞を含む)によって分泌される。マクロファージ炎症タンパク(MIP)は、ケモカインのファミリーに属している。ヒトのMIP、MIP-1α、およびMIP-1βの2つの主要な形態が存在し、これらは、それぞれ、ケモカイン(C-Cモチーフ)リガンド3(CCL3)ならびにCCL4としても知られている。それらの両方は、菌体内毒素による刺激後にマクロファージによって生成される。コロニー刺激因子3(CSF3)としても知られている果粒球コロニー刺激因子(G-CSFまたはGCSF)は、コロニー刺激因子ホルモンである。G-CSFは、糖タンパク質、増殖因子、および骨髄を刺激して顆粒球および幹細胞を生成するために、多くの異なる組織によって生成されたサイトカインである。G-CSFはまた、好中球前駆体および成熟した好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する。上皮増殖因子またはEGFは、高親和性でその受容体EGFRに結合することによって、細胞の成長、増殖、および分化の調節に重要な役割を果たす増殖因子である。血管内皮細胞増殖因子(VEGF)は、脈管形成(胚循環系のデノボ形成)および血管新生(先在する脈管構造からの血管の成長)の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である増殖因子のファミリーである。
サイトカインは、pMHC複合体と同じ方法でナノ粒子に結合され得る。本開示の一実施形態では、サイトカインおよびpMHC複合体は、ナノ粒子に別々に結合される。本開示の別の実施形態では、サイトカインまたはサイトカイン分子およびpMHC複合体は、最初に一緒に複合体化され、その後、ナノ粒子に複合体化される。複数のサイトカインがナノ粒子に結合されてもよく;これらは、同じサイトカインまたは異なるサイトカインの複数のサイトカインであってもよい。
<共刺激分子成分>
ある態様では、NPは、少なくとも1つの共刺激分子をさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。共刺激分子は、上記特異的抗原を有する細胞に対する免疫反応を生成することができる抗原特異的T細胞へと、ナイーブT細胞を活性化する働きをする二次シグナルをインビボで生成する分子である。本開示は、いかなる特異的共刺激分子にも限定されない。様々な共刺激分子が当該技術分野で周知である。共刺激分子のいくつかの限定しない例は、4-IBBL、OX40L、CD40、IL-15/IL-15Ra、CD28、CD80、CD86、CD30L、およびICOSLである。1つの特異的共刺激分子のみが1つのナノ粒子に結合することができ、または様々な共刺激分子が同じナノ粒子に結合することができる。特定の実施形態では、共刺激分子は、T細胞上の共刺激受容体を刺激することができる抗体などのタンパク質である。この場合、抗体は、抗原特異的な方法でナイーブT細胞を活性化し、および免疫反応を誘発するのに必要とされる共刺激シグナルを誘発することができる。さらにまたは代替的に、本明細書で使用されるように、用語「共刺激分子」はまた、天然の共刺激シグナル伝達分子、例えば、CD28の共刺激反応を生成する抗CD28またはCD28リガンドに対するアゴニスト作用を有することによって共刺激シグナルを生成することができる薬剤を指し得る。いくつかの態様では、共刺激分子の結合価は約1~約6000であり、および/または共刺激分子の結合価はそれぞれナノ粒子コア当たり約1~約6000である。
ある態様では、NPは、少なくとも1つの共刺激分子をさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。共刺激分子は、上記特異的抗原を有する細胞に対する免疫反応を生成することができる抗原特異的T細胞へと、ナイーブT細胞を活性化する働きをする二次シグナルをインビボで生成する分子である。本開示は、いかなる特異的共刺激分子にも限定されない。様々な共刺激分子が当該技術分野で周知である。共刺激分子のいくつかの限定しない例は、4-IBBL、OX40L、CD40、IL-15/IL-15Ra、CD28、CD80、CD86、CD30L、およびICOSLである。1つの特異的共刺激分子のみが1つのナノ粒子に結合することができ、または様々な共刺激分子が同じナノ粒子に結合することができる。特定の実施形態では、共刺激分子は、T細胞上の共刺激受容体を刺激することができる抗体などのタンパク質である。この場合、抗体は、抗原特異的な方法でナイーブT細胞を活性化し、および免疫反応を誘発するのに必要とされる共刺激シグナルを誘発することができる。さらにまたは代替的に、本明細書で使用されるように、用語「共刺激分子」はまた、天然の共刺激シグナル伝達分子、例えば、CD28の共刺激反応を生成する抗CD28またはCD28リガンドに対するアゴニスト作用を有することによって共刺激シグナルを生成することができる薬剤を指し得る。いくつかの態様では、共刺激分子の結合価は約1~約6000であり、および/または共刺激分子の結合価はそれぞれナノ粒子コア当たり約1~約6000である。
<組成物>
ある態様において、本明細書で提供される複数の複合体を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、担体、随意に医薬担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物は、1以上の共刺激分子および/またはサイトカインに結合される1以上のナノ粒子コアを随意に含み得る。従って、いくつかの実施形態において、組成物は、以下のものを含むか、または代替的にそれらから実質的になるか、あるいはさらにそれらからなる:1)複数の抗原-MHC複合体に結合される複数のナノ粒子コアであって、ナノ粒子コアの少なくとも一部が、1以上の共刺激分子および/または1以上のサイトカインをさらに含み、ならびにナノ粒子コアの別の部分は、共刺激分子および/またはサイトカインをさらに含まない、複数のナノ粒子コアと、2)1以上の共刺激分子および/またはサイトカインに結合される複数のナノ粒子コア。
ある態様において、本明細書で提供される複数の複合体を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、担体、随意に医薬担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物は、1以上の共刺激分子および/またはサイトカインに結合される1以上のナノ粒子コアを随意に含み得る。従って、いくつかの実施形態において、組成物は、以下のものを含むか、または代替的にそれらから実質的になるか、あるいはさらにそれらからなる:1)複数の抗原-MHC複合体に結合される複数のナノ粒子コアであって、ナノ粒子コアの少なくとも一部が、1以上の共刺激分子および/または1以上のサイトカインをさらに含み、ならびにナノ粒子コアの別の部分は、共刺激分子および/またはサイトカインをさらに含まない、複数のナノ粒子コアと、2)1以上の共刺激分子および/またはサイトカインに結合される複数のナノ粒子コア。
<ナノ粒子およびpMHC複合体を作る方法>
pMHC-NPおよびナノ粒子は、例えば、WO2008/109852、WO2012/041968、WO2012/062904、WO2013144811、WO2014/050286、WO2015/063616、WO2016/198932、またはPCT/IB2017/001508に記載される様々な方法によって作ることができる。
pMHC-NPおよびナノ粒子は、例えば、WO2008/109852、WO2012/041968、WO2012/062904、WO2013144811、WO2014/050286、WO2015/063616、WO2016/198932、またはPCT/IB2017/001508に記載される様々な方法によって作ることができる。
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例示するために与えられるものであり、本開示をいかなる様式でも限定することを目的としていない。当業者は、目的を実行し、言及された目標と利点と同様に、本明細書に固有の目標および利点本開示を得るために、本開示がよく適応していることを容易に認識するだろう。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、現在、実施形態の代表であり、例示的なものであり、本開示の範囲を制限するものとしては意図されない。請求項の範囲によって定義される本開示の精神内に包含される変化および他の使用が当業者に想到される。
<方法>
マウス
NOD/LtマウスはJackson Lab (Bar Harbor, ME)のものであった。17.4α/8.3β(8.3-NOD)およびBDC2.5NODマウス(IGRP206-214またはNRP-V7/Kdおよび2.5mi/IAg7の遺伝子導入T細胞受容体をそれぞれ表現する)に記載されている(19、20、21)。
マウス
NOD/LtマウスはJackson Lab (Bar Harbor, ME)のものであった。17.4α/8.3β(8.3-NOD)およびBDC2.5NODマウス(IGRP206-214またはNRP-V7/Kdおよび2.5mi/IAg7の遺伝子導入T細胞受容体をそれぞれ表現する)に記載されている(19、20、21)。
pMHC生成
2つの異なる方法を使用して、組み換えpMHCクラスI複合体を発現した。1つ目の方法は、ペプチドの存在下において細菌中で発現されるMHCクラスI重鎖および軽鎖をリフォールディングし、続いて、ゲルろ過および陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製することを含む(22、23)。2つ目の方法は、単鎖構築物として、ミコプラズマを含まないレンチウイルスに形質導入された自由型チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において、MHCクラスI複合体を高収率で発現させる工程を含み、ここで、ペプチドコード化配列、MHCクラスI軽鎖および重鎖が軟性グリシン-セリン(GS)リンカー24で順次に繋留され、続いて、BirA部位をコードするC末端のリンカー、遊離システインで終わる6xHisおよびstrep tagで繋留される。分泌されたタンパク質は、strep tagおよび/またはニッケルカラムを使用して培養液上清から精製し、NPコーティングに直接使用するか、あるいは蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用してpMHC四量体を生成するためにビオチン化した。
2つの異なる方法を使用して、組み換えpMHCクラスI複合体を発現した。1つ目の方法は、ペプチドの存在下において細菌中で発現されるMHCクラスI重鎖および軽鎖をリフォールディングし、続いて、ゲルろ過および陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製することを含む(22、23)。2つ目の方法は、単鎖構築物として、ミコプラズマを含まないレンチウイルスに形質導入された自由型チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において、MHCクラスI複合体を高収率で発現させる工程を含み、ここで、ペプチドコード化配列、MHCクラスI軽鎖および重鎖が軟性グリシン-セリン(GS)リンカー24で順次に繋留され、続いて、BirA部位をコードするC末端のリンカー、遊離システインで終わる6xHisおよびstrep tagで繋留される。分泌されたタンパク質は、strep tagおよび/またはニッケルカラムを使用して培養液上清から精製し、NPコーティングに直接使用するか、あるいは蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用してpMHC四量体を生成するためにビオチン化した。
組み換えpMHCクラスII単量体は、複合体のペプチドMHCα鎖およびMHCβ鎖がリボソームスキッピングP2A配列によって分離されるモノシストロニックメッセージをコードする、レンチウイルスで形質導入されたフリースタイルCHO細胞中で生成された。Bir部位をコードするリンカー、strepおよび/または6xHisのタグ、ならびに遊離システインを構築物のC末端に加えた。自己組織化されたpMHCクラスII複合体を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製し、NP上をコーティングするために使用するか、あるいは上記のようなビオチン化ならびに四量体形成のために処理する。
NP合成
金ナノ粒子(GNP)を、(Perrault, S.D. et al. (2009) Nano Lett. 9(5):1909-1915)に記載されるクエン酸ナトリウムで塩化金酸(HAuCl4)の化学的環元によって合成した。簡潔に言えば、2mLの1%のHAuCl4(Sigma Aldrich, Oakville, ON)を、勢いよく撹拌しながら100mLのH2Oに加え、溶液を油浴において加熱した。6mL(14nmのGNPの場合)または2mL(40nmのGNPの場合)の1%のクエン酸ナトリウムを沸騰しているHAuCl4溶液に加え、これをさらに10分間撹拌して、その後、室温に冷ました。GNPを、pMHCの受容体としてカルボキシル(-COOH)または一級アミン(-NH2)の基を用いて官能化された1uMのチオール-ポリエチレングリコール(チオール-PEG)リンカー(Nanocs, MA)を加えることによって安定化した。ペグ化されたGNPを水で洗浄して遊離チオール-PEGを取り除き、濃縮して、さらなる分析のために水中で保存した。NP密度はベールの法則に従って吸光度測定法測定から計算された。
金ナノ粒子(GNP)を、(Perrault, S.D. et al. (2009) Nano Lett. 9(5):1909-1915)に記載されるクエン酸ナトリウムで塩化金酸(HAuCl4)の化学的環元によって合成した。簡潔に言えば、2mLの1%のHAuCl4(Sigma Aldrich, Oakville, ON)を、勢いよく撹拌しながら100mLのH2Oに加え、溶液を油浴において加熱した。6mL(14nmのGNPの場合)または2mL(40nmのGNPの場合)の1%のクエン酸ナトリウムを沸騰しているHAuCl4溶液に加え、これをさらに10分間撹拌して、その後、室温に冷ました。GNPを、pMHCの受容体としてカルボキシル(-COOH)または一級アミン(-NH2)の基を用いて官能化された1uMのチオール-ポリエチレングリコール(チオール-PEG)リンカー(Nanocs, MA)を加えることによって安定化した。ペグ化されたGNPを水で洗浄して遊離チオール-PEGを取り除き、濃縮して、さらなる分析のために水中で保存した。NP密度はベールの法則に従って吸光度測定法測定から計算された。
SFPシリーズ酸化鉄(Fe3O4)NPを、界面活性剤の存在下において、有機溶媒中で鉄アセチルアセトネートの熱分解によって生成し、その後、ペグ化によって水性緩衝液中で溶媒にした (Xie, J. et al. (2007) Adv Materials 19(20):3163-3166; Xie, J.P.S. et al. (2006) Pure Appl Chem 78(5):1003-1014; Xu, C. et al. (2007) Polymer International 56(7):821-82)。簡潔に言えば、2mmolのFe(acac)3(Sigma Aldrich)を、10mLのベンジルエーテルおよびオレイルアミンの混合物中に溶解し、100°Cに1時間加熱し、その後、窒素ブランケットの保護下で還流で300°Cに2時間加熱した。合成されたNPをエタノールの添加によって沈殿させて、ヘキサン中で再懸濁した。酸化鉄NPのペグ化のために、100mgの異なるドーパミン結合PEG(DPA-PEG、3.5kDa)リンカー(Jenkem Tech USA)を、クロロホルムおよびジメチルホルムアミド(DMF)の混合物中に溶解した。その後、NP溶液(20mgのFe)をDPA-PEG溶液に加え、室温で4時間撹拌した。ペグ化したSFP NPをヘキサンの添加によって夜通し沈殿させ、水中で再懸濁した。微量の凝集体を、高速遠心分離(20,000xg、30分)によって取り除いた。単分散のSFP NPを、pMHC結合のために水中で保存した。鉄の濃度を、2N塩酸(HCl)中で、410nmで、分光測光で判定した。SFP NPの分子構造および直径に基づいた(Fe3O4;8+1nmの直径)(Xie, J. et al. (2007) Adv Materials 19(20):3163-3166; Xie, J.P.S. et al. (2006) Pure Appl Chem 78(5):1003-1014)、出願人は、1mgの鉄を含有するSFP溶液が5x1014のNPを含有すると推測した。
出願人は、その後、界面活性剤(PFシリーズ酸化鉄NP)の完全な非存在下でのペグ化酸化鉄NPの形成を、1工程で、さらに熱分解によって可能にした新しい酸化鉄NP設計を開発した。この設計では、PEG分子をインサイチュの表面コーティング剤として使用した。典型的な反応では、3gのPEG(2kDa MW)を100°Cで50mLの丸底沸騰フラスコ中でゆっくり溶かし、その後、7mLのベンジルエーテルおよび2mmolのFe(acac)3と混合した。その反応物を1時間勢いよく撹拌し、還流で260°Cにさらに2時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、遠心分離管に移し、30mLの水と混合した。不溶性物質を遠心分離によって2,000xgで30分間取り除いた。遊離PEG分子を、Amicon-15フィルター (MWCO 100 kDa, Millipore, Billerica, MA)を介した限外ろ過によって取り除いた。酸化鉄NPは、テストされたPEG分子のすべてではないが、その大部分で生成された。酸化鉄NPのサイズは、熱分解反応で使用されるPEGリンカーの官能基によって異なる。磁気(MACS)カラム (Miltenyi Biotec, Auburn, CA)またはIMag細胞分離システム(BD BioSciences, Mississauga, ON)を使用して、NPを容易に精製することができる。精製した酸化鉄NPを、室温または4°Cで、水中で、検出可能な凝集なしで保存した。上記のようにSFP NPにいてNP密度を計算した。
NPへのpMHC結合遠位の一級アミン(-NH2)あるいはカルボキシル(-COOH)群を運ぶPEGリンカーを用いて生成されたNPへのpMHC結合は、1-エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド塩酸塩(EDC)の存在下でのアミド結合の形成によって達成された。-COOH基を有するNP(GNP-C、SFP-C、およびPF-C)は、20mMの2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液、pH 5.5中に最初に溶解された。その後、N-ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩(sulpho-NHS;10mM)およびEDC(1mM)(Thermo scientific, Waltham, MA)を、NP溶液に加えた。20分間室温で撹拌した後に、該NP溶液を、pMHCモノマー溶液(20mMのホウ酸塩緩衝液中、pH8.2)に液滴で加えた。混合物を4時間撹拌した。NH2官能化NP(GNP-N、SFPN、およびPF-N)にpMHCを結合するために、pMHC複合体を、100mMの塩化ナトリウム(NaCl)を含有する20mMのMES緩衝液、pH 5.5に最初に溶解した。その後、Sulpho-NHS(10mM)およびEDC(5mM)をpMHC溶液に加えた。活性化したMHC分子を、20mMのホウ酸塩緩衝液(pH8.2)中のNP溶液に加え、室温で4時間撹拌した。
マレイミド官能化NP(SFP-MおよびPF-M)にpMHCを結合するために、遊離C末端システインをコードするように設計されたpMHC分子を、2mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、150mMのNaClを含有する40mMのリン酸塩緩衝液(pH 6.0)中のNPと混合し、室温で夜通しインキュベートした。pMHCは、マレイミド基とシステイン残基との間の炭素-硫黄結合の形成によってNPと共有結合する。
クリックケミストリーを使用して、アジド基(SFP-Z)で官能化されたNPにpMHCを結合した。この反応について、pMHC分子を、室温で、2時間、ジベンゾシクロオクチン-N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(DBCO-NHS, Click Chemistry Tools, Scottdale, AZ)で最初にインキュベートした。透析によって遊離DBCO分子を夜通し取り除いた。その後、pMHC-DBCOは結合体をSFP-Zで2時間インキュベートし、pMHC分子とNPとの間のトリアゾール結合の形成が結果として生じる。
異なるpMHC-NP結合反応における非結合pMHC複合体を、300kDa分子量の分離膜(cut off membranes)(Spectrum labs)を用いて、4°Cで、PBSに対する広範な透析、pH 7.4によって取り除いた。あるいは、pMHC結合酸化鉄NPを磁気分離によって精製した。非結合NPは、AmiconのUltra-15ユニット(100kDaのMWCO)を介した限外ろ過によって濃縮し、PBSに保存した。
NP特徴づけ
非結合NPおよびpMHC結合NPのコアのサイズおよび分散度を、透過型電子顕微鏡(TEM, Hitachi H7650)によって最初に評価した。動的光散乱(DLS, Zetasizer, Malvern, UK) を使用して、NPおよびpMHC-NPの水力学的サイズを判定した。小角電子線回折(SEBD)を使用して、NPのPFシリーズの酸化鉄コアの化学的性質を評価した。フーリエ変換赤外分光法(FTIR)を使用して表面の化学的性質を評価した。pMHC結合NPを、天然PAGEおよび変性PAGE、Bradfordアッセイ、アミノ酸分析、ならびにドット酵素結合免疫吸着アッセイ(dot-enzyme-linked immunosorbent assay)(dot-ELISA)によって分析した。
非結合NPおよびpMHC結合NPのコアのサイズおよび分散度を、透過型電子顕微鏡(TEM, Hitachi H7650)によって最初に評価した。動的光散乱(DLS, Zetasizer, Malvern, UK) を使用して、NPおよびpMHC-NPの水力学的サイズを判定した。小角電子線回折(SEBD)を使用して、NPのPFシリーズの酸化鉄コアの化学的性質を評価した。フーリエ変換赤外分光法(FTIR)を使用して表面の化学的性質を評価した。pMHC結合NPを、天然PAGEおよび変性PAGE、Bradfordアッセイ、アミノ酸分析、ならびにドット酵素結合免疫吸着アッセイ(dot-enzyme-linked immunosorbent assay)(dot-ELISA)によって分析した。
フーリエ変換赤外分光法(FTIR)
PFシリーズ酸化鉄NP設計の表面の化学的性質を、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)を使用して評価した。PF-NP表面上で固定された対照PEGおよびPEGのFTIRスペクトルは、ATR(減衰全反射法)モード上でNicolet FTIR分光光度計を使用して得た。スペクトルの各々を、4cm-1のスペクトル分解での256回の走査の平均として記録した。PEG骨格の分子振動特性(C-H非対称伸縮振動 、C-O-C振動、およびCH2横ゆれ振動によって表わされる)、ならびにそれらの遠位のpMHC-受容体官能基を同定した。
PFシリーズ酸化鉄NP設計の表面の化学的性質を、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)を使用して評価した。PF-NP表面上で固定された対照PEGおよびPEGのFTIRスペクトルは、ATR(減衰全反射法)モード上でNicolet FTIR分光光度計を使用して得た。スペクトルの各々を、4cm-1のスペクトル分解での256回の走査の平均として記録した。PEG骨格の分子振動特性(C-H非対称伸縮振動 、C-O-C振動、およびCH2横ゆれ振動によって表わされる)、ならびにそれらの遠位のpMHC-受容体官能基を同定した。
アガロースゲル電気泳動
ペグ化またはpMHCコーティングに応じてNP電荷上の変化を早く評価するために、NPを0.8%のアガロースゲル上で電気泳動にさらした。ペグ化したNPは、全体的な表面電荷に応じて陰性または陽極に移動した。
ペグ化またはpMHCコーティングに応じてNP電荷上の変化を早く評価するために、NPを0.8%のアガロースゲル上で電気泳動にさらした。ペグ化したNPは、全体的な表面電荷に応じて陰性または陽極に移動した。
天然および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
pMHC結合NPを天然PAGEおよびSDS-PAGE(10%)分析にさらしてpMHC-NP調製物中の遊離(非結合pMHC)の不在を確認し、NPの表面上に無傷の三分子pMHC複合体の存在を確認した。
pMHC結合NPを天然PAGEおよびSDS-PAGE(10%)分析にさらしてpMHC-NP調製物中の遊離(非結合pMHC)の不在を確認し、NPの表面上に無傷の三分子pMHC複合体の存在を確認した。
pMHC結合価の測定
個々のNP(pMHC結合価)上に結合したpMHC単量体の数を評価するために、出願人は、Bradfordアッセイ(Thermo Scientific)、アミノ酸分析(加水分解されたpMHC-NP調製物中の17の異なるアミノ酸のHPLCベースの定量化)(University of Toronto)、およびドット酵素結合免疫吸着定アッセイ(dot-ELISA)を含む様々なアプローチを使用して、pMHC-NP調製物のpMHC濃度、ならびにpMHC分子数対NP数の比率に変換された値を測定した。簡潔に言えば、「dot-ELISA」アプローチでは、pMHC結合および非結合NPおよびpMHCモノマー溶液(基準としての)を、PBSにおいて連続的に希釈し、マルチウェルフィルタプレート(PALL株式会社)においてポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に吸収された。プレートを室温で半乾燥させ、その後、pMHC特異的一次抗体(つまり、pMHCクラスIコーティングNPの抗-β2Mおよび抗Kd抗体、クローン2M2およびSF1-1.1のそれぞれ;BioLegend, San Diego, CA)でインキュベートし、続いて、HRP結合二次抗体またはAP結合二次抗体でインキュベートした。酵素発色反応の発生に際して、ウェルの内容物を従来のELISAプレートのウェルに移し、プレートリーダーを使用してそれらの吸光度を450nmで測定した。これらの様々な方法によって生成された値が類似したので、Bradfordアッセイ(ブランクとして非結合NPを使用)は容易かつ簡単な選択の方法になった。
個々のNP(pMHC結合価)上に結合したpMHC単量体の数を評価するために、出願人は、Bradfordアッセイ(Thermo Scientific)、アミノ酸分析(加水分解されたpMHC-NP調製物中の17の異なるアミノ酸のHPLCベースの定量化)(University of Toronto)、およびドット酵素結合免疫吸着定アッセイ(dot-ELISA)を含む様々なアプローチを使用して、pMHC-NP調製物のpMHC濃度、ならびにpMHC分子数対NP数の比率に変換された値を測定した。簡潔に言えば、「dot-ELISA」アプローチでは、pMHC結合および非結合NPおよびpMHCモノマー溶液(基準としての)を、PBSにおいて連続的に希釈し、マルチウェルフィルタプレート(PALL株式会社)においてポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に吸収された。プレートを室温で半乾燥させ、その後、pMHC特異的一次抗体(つまり、pMHCクラスIコーティングNPの抗-β2Mおよび抗Kd抗体、クローン2M2およびSF1-1.1のそれぞれ;BioLegend, San Diego, CA)でインキュベートし、続いて、HRP結合二次抗体またはAP結合二次抗体でインキュベートした。酵素発色反応の発生に際して、ウェルの内容物を従来のELISAプレートのウェルに移し、プレートリーダーを使用してそれらの吸光度を450nmで測定した。これらの様々な方法によって生成された値が類似したので、Bradfordアッセイ(ブランクとして非結合NPを使用)は容易かつ簡単な選択の方法になった。
TCR/mCDAトランスフェクトされたJurMA細胞におけるTCRシグナル伝達
BDC2.5-TCRをコードするTCRαおよびTCRβのcDNAを、5’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, version 2.0 kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)ならびにTCRαまたはTCRβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、BDC2.5-CD4+T細胞由来のmRNAから生成した。結果として生じるPCR産物をpCR8プラスミドにクローン化し、配列決定した。その後、TCRαおよびTCRβのcDNAがP2Aリボソームスキッピング配列によって分離される単一の読み取り枠として、完全長のcDNAをIRES-eGFPカセットの上流のレトロウイルスベクターにサブクローン化した。
BDC2.5-TCRをコードするTCRαおよびTCRβのcDNAを、5’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends, version 2.0 kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)ならびにTCRαまたはTCRβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、BDC2.5-CD4+T細胞由来のmRNAから生成した。結果として生じるPCR産物をpCR8プラスミドにクローン化し、配列決定した。その後、TCRαおよびTCRβのcDNAがP2Aリボソームスキッピング配列によって分離される単一の読み取り枠として、完全長のcDNAをIRES-eGFPカセットの上流のレトロウイルスベクターにサブクローン化した。
TCRα-P2A-TCRβ融合タンパク質のポリペプチド配列は、以下の例示的な配列表において提供される。
TCRα-P2A-TCRβ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列が、以下の例示的な配列表において提供される。
レトロウイルスを産生するGP+envAm12細胞株との共培養によってマウスCD4をコードするレトロウイルスで、ヒトCD3+/TCRβ-JurMAレポーター細胞株(NFAT駆動ルシフェラーゼを発現するように設計された)を形質導入した。形質導入された細胞を拡大し、Pacific Blue-conjugated anti-mCD4(GK1.5)(BioLegend, San Diego, CA)で染色し、BD FACSAria II(BD Biosciences, NJ)で選別した。その後、BDC2.5TCRαβおよびIRES-eGFPをコードするレトロウイルスでCD4+Jurkat/MA細胞を形質導入した。eGFPおよびmCD4の二重の陽性細胞をフローサイトメトリーによって選別し、PE標識BDC2.5/IAg7 pMHC四量体で染色してそれらの特異性を確認した。
ルシフェラーゼのNFAT駆動発現を測定するために、野生型およびBDC2.5/mCD4+JurMA細胞を、20ng/mlのPMA(Sigma-Aldrich)と0.5μMのイオノマイシン(Sigma-Aldrich)、10μg/mLの抗hCD3εmAb(OKT3, BD Biosciences)または12.5μg/mLのBDC2.5/IAg7コーティングされたPF-Mの存在下または不在下において、10%のFBS(Sigma-Aldrich)、20mMのL-グルタミン(SigmaAldrich)、10mMのピルビン酸ナトリウム(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)、ならびに抗生物質で補充された200μlのDMEM(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)において500,000細胞/ウェルで48ウェルプレートに蒔いた。刺激後の様々な時間で細胞をウェルから収集し、96ウェルプレートに移し、PBSで3回洗浄した。105の細胞を新しい96ウェルプレートに移し、20μlの細胞培養溶解試薬(Promega、Madison、WI)中で溶解し、注射器を伴うVeritas(商標)マイクロプレート照度計(Promega)を使用して、乳白色プレート (Greiner Bio One International GmbH, Kremsmunster, Austria)中の100μlのルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、非刺激細胞のルシフェラーゼ活性に対して正規化された相対的な発光単位(RLU)として表した。
インビトロのpMHC-NPのアゴニスト活性
TCRトランスジェニックマウスからのFACSで選別された脾臓のCD8+またはCD4+細胞(2.5x105細胞/mL)を、37°Cで24-48時間pMHC結合NPの濃度または対照NPの濃度の範囲でインキュベートした。上清をELISAによってIFNγについて分析した。
TCRトランスジェニックマウスからのFACSで選別された脾臓のCD8+またはCD4+細胞(2.5x105細胞/mL)を、37°Cで24-48時間pMHC結合NPの濃度または対照NPの濃度の範囲でインキュベートした。上清をELISAによってIFNγについて分析した。
アゴニストmAbおよびpMHCコーティングされたNPへのヒトT細胞クローンの応答性を、抗CD3/抗CD28mAbコーティングされたビーズ(Life Technologies;1:1のビーズ対細胞の比率で)、PPI76-90(88S)/DRB1*0401コーティングされたPF-M(50μgのペプチド/MHC/ml)、または同一数の対照のシステインコーティングされたPF-Mを含有する500μlの完全なRPMI-1640培地の48ウェルプレート中で、5x105のクローンT細胞を培養することによって評価した。2日目に、ルミネックスによるサイトカイン内容分析のために上清を収集し、RNA抽出のために細胞ペレットを収集した。他の実験では、T細胞クローンを、PPI76-90(88S)/DRB1*0401コーティングされたPF-MまたはシステインコーティングされたPF-Mで最大5日間インキュベートした。0、2、3、4、および5日目に細胞を収集して、RNA抽出に使用した。
pMHC-NP/細胞抱合体の透過型電子顕微鏡観察(TEM)
ビオチン-ストレプトアビジンCD4+あるいはCD8+Tリンパ球濃縮キット(BDC ImagTM, BD Biosciences)を使用してTCRトランスジェニック動物から単離されたBDC2.5-CD4+および8.3CD8+T細胞(5x106/mL)を、2.5mi/IAg7コーティングされたPF-M NPおよびNRP-V7/KdコーティングされたPF-M NPで、4°Cで、30分間インキュベートした(15-20μg/mLのpMHC)。培養物を示された時間にわたって37°Cでさらにインキュベートし、冷たいPBSで洗浄して非結合PF-M NPを取り除き、固定して、Hitachi H7650を用いたTEM画像化のために切断した(70nm)。
ビオチン-ストレプトアビジンCD4+あるいはCD8+Tリンパ球濃縮キット(BDC ImagTM, BD Biosciences)を使用してTCRトランスジェニック動物から単離されたBDC2.5-CD4+および8.3CD8+T細胞(5x106/mL)を、2.5mi/IAg7コーティングされたPF-M NPおよびNRP-V7/KdコーティングされたPF-M NPで、4°Cで、30分間インキュベートした(15-20μg/mLのpMHC)。培養物を示された時間にわたって37°Cでさらにインキュベートし、冷たいPBSで洗浄して非結合PF-M NPを取り除き、固定して、Hitachi H7650を用いたTEM画像化のために切断した(70nm)。
超解像顕微鏡
精製した8.3-CD8+T細胞を、NRP-V7/Kd-PF-M-Alexa-647 NPで、4°Cで30分間または37°Cでさらに1時間インキュベートした。細胞を冷たいPBS pH 7.4で3回洗浄し、その後、氷上で2%のPFAにおいて15分間固定した。洗浄後、細胞をRTの1μg/mLのDAPIによって5分間染色し、超解像顕微鏡(ELYRA 131、Zeiss)下で観察した。クラスタ直径の画像処理および定量分析を、ZEN 2012ソフトウェアを用いて行った(n=100)。
精製した8.3-CD8+T細胞を、NRP-V7/Kd-PF-M-Alexa-647 NPで、4°Cで30分間または37°Cでさらに1時間インキュベートした。細胞を冷たいPBS pH 7.4で3回洗浄し、その後、氷上で2%のPFAにおいて15分間固定した。洗浄後、細胞をRTの1μg/mLのDAPIによって5分間染色し、超解像顕微鏡(ELYRA 131、Zeiss)下で観察した。クラスタ直径の画像処理および定量分析を、ZEN 2012ソフトウェアを用いて行った(n=100)。
pMHC-NP/細胞の結合体の走査型電子顕微鏡(SEM)およびX線分光測定
上記のように、チオグリコール酸塩誘発腹腔マクロファージおよび骨髄由来のDCを調製した。BDC2.5-CD4+および8.3-CD8+T細胞を、ビオチン-ストレプトアビジンCD4+あるいはCD8+Tリンパ球濃縮キット((BD ImagTM, BD Biosciences)を使用して、BDC2.5-NODまたは8.3-NODマウス脾臓から陰性選択した。細胞をカバーガラス上で蒔き、37°Cでのさらに60分間のまたは180分間のインキュベーションを伴って/伴わずに、非結合またはシステイン結合PF-M、BDC2.5mi/IAg7-PF-MあるいはNRP-V7/Kd-PF-Mで4°Cで30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を0.05Mのカコジル酸塩緩衝液(CB)pH 7.4で洗浄し、その後、2.5%のグルタルアルデヒドを用いて4°Cで夜通し固定した。検体を段階的エタノール中で連続的な脱水にさらし、乾燥のためにヘキサメチルジシラザンに3分間浸した。サンプルを金メッキによってXL30 SEM(Philips、Netherlands)下で観察した。エネルギー分散型X線分析(EDS)を使用して要素分析を行った。
上記のように、チオグリコール酸塩誘発腹腔マクロファージおよび骨髄由来のDCを調製した。BDC2.5-CD4+および8.3-CD8+T細胞を、ビオチン-ストレプトアビジンCD4+あるいはCD8+Tリンパ球濃縮キット((BD ImagTM, BD Biosciences)を使用して、BDC2.5-NODまたは8.3-NODマウス脾臓から陰性選択した。細胞をカバーガラス上で蒔き、37°Cでのさらに60分間のまたは180分間のインキュベーションを伴って/伴わずに、非結合またはシステイン結合PF-M、BDC2.5mi/IAg7-PF-MあるいはNRP-V7/Kd-PF-Mで4°Cで30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を0.05Mのカコジル酸塩緩衝液(CB)pH 7.4で洗浄し、その後、2.5%のグルタルアルデヒドを用いて4°Cで夜通し固定した。検体を段階的エタノール中で連続的な脱水にさらし、乾燥のためにヘキサメチルジシラザンに3分間浸した。サンプルを金メッキによってXL30 SEM(Philips、Netherlands)下で観察した。エネルギー分散型X線分析(EDS)を使用して要素分析を行った。
実施例1-ナノ粒子(NP)表面対pMHCベースのナノメディシンの生物学的活性上の分子のpMHC密度
ペプチド主要組織適合性複合体(pMHC)およびpMHC-ナノ粒子(NP)濃度の結合価がこれらの化合物の生物学的活性にどのように寄与するか理解するために、出願人は、様々なNRP-V7/Kd-NP調製物の、T細胞受容体(TCR)-トランスジェニック8.3-NODマウスからの同族の(NRP-V7/Kd/IGRP206-214-特異的)CD8+T細胞を一時的に活性化する能力を比較した。図1Aで示されるように、SFP-NPの存在下で培養された時、8pMHC/NPでコーディングされた8.3-CD8+T細胞は少量のインターフェロンγ(IFNγ)を産生したが、広範囲のpMHC-NP濃度あるいはpMHC濃度にわたって、11pMHC/NPという低さでさえ、より高いpMHC結合価でコーディングされたNPに応答して実質的により多くの量のIFNγを産出した。この観察は、SFP-NPのアゴニスト活性のためのpMHC結合価の閾値が、9~11pMHC/NP(図1Aおよび1B)の間に位置することを示唆した。理論によって制限されずに、pMHC-NP濃度の増加は、「閾値の」または「閾値を超える」pMHC結合価を保持するpMHC-NPのアゴニスト特性を増強することができる。
ペプチド主要組織適合性複合体(pMHC)およびpMHC-ナノ粒子(NP)濃度の結合価がこれらの化合物の生物学的活性にどのように寄与するか理解するために、出願人は、様々なNRP-V7/Kd-NP調製物の、T細胞受容体(TCR)-トランスジェニック8.3-NODマウスからの同族の(NRP-V7/Kd/IGRP206-214-特異的)CD8+T細胞を一時的に活性化する能力を比較した。図1Aで示されるように、SFP-NPの存在下で培養された時、8pMHC/NPでコーディングされた8.3-CD8+T細胞は少量のインターフェロンγ(IFNγ)を産生したが、広範囲のpMHC-NP濃度あるいはpMHC濃度にわたって、11pMHC/NPという低さでさえ、より高いpMHC結合価でコーディングされたNPに応答して実質的により多くの量のIFNγを産出した。この観察は、SFP-NPのアゴニスト活性のためのpMHC結合価の閾値が、9~11pMHC/NP(図1Aおよび1B)の間に位置することを示唆した。理論によって制限されずに、pMHC-NP濃度の増加は、「閾値の」または「閾値を超える」pMHC結合価を保持するpMHC-NPのアゴニスト特性を増強することができる。
この観察を確認するために、出願人は、次に、SFP-NPより大きく、したがって、より大きなpMHC-コーティング能力を有するPF-NPを使用した。はるかに高いpMHC結合価(61pMHC/NP、図1Cおよび1D、ならびにデータは図示せず)を表示するPF-NPと比較して、13あるいはそれより少数のpMHC/NPを保持するpMHC-PF NPは非常に弱く、~8x1012NP/mLまでの生物学的活性がない。これは、アゴニスト活性に必要なpMHCの閾値がNPサイズによって増加するという考えを裏付けた(つまり、~8nmのSFP-NPの場合>8pMHC~20nmのPF-NPの場合>13pMHC)。アゴニスト活性に対するNPサイズおよびpMHC結合価の逆効果は、pMHC密度(NPのpMHC/表面積)への役割を示唆した。これは、図1Eおよび1Fでさらに例示され、そこでは、出願人は、NPまたはpMHCの濃度の範囲にわたって、同様の数のpMHCでコーティングされたSFP-NPおよびPF-NPの生物学的活性を比較した(異なるサイズのNPの同一濃度を使用する場合に総pMHC「ロード」の絶対差を補うため)。
実施例2-閾値pMHC密度を超える生物学的活性の急速な増加
これらのデータは、NP上の個々のpMHC単量体を分離する距離に対応する定数によって生物学的活性閾値が定義されることを示唆した。出願人は、異なるサイズの最大閾値結合能力と予測された閾値結合能力とを比較し、pMHC-密度閾値を特定した。理論的なpMHC密度閾値は0.004468pMHC/nm2にあり、これは、8nmのNPの場合11pMHCあるいは20nmのNPの場合22pMHCに相当する。これらの値は~16.88nmの計算された分子間距離に相当する。T細胞抗原レセプタ(TCR)複合体は、CD3γ-CD3ε-TCRαβ-CD3ζ-CD3ζ-TCRαβ-CD3δ-CD3ε複合体内に最大2TCRαβヘテロ二量体を含有すると思われる(Rojo, J.M. ET AL. (1991) Immunol Today 12(10):377-378; Fernandez-Miguel, G. et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4):1547-1552)。この構造は、3D再構成(12nm) (Arechaga, I. et al. (2010) Int Immunol 22(11):897-903)に基づいたTCR複合体の予測された幅と一致し、アゴニスト閾値に達するための16.88nmの計算されたpMHC間の距離と一致している。出願人は~3.62nmで可能性のある最小の分子間の距離を計算し、それは、TCRαβナノクラスタ内の個々のTCRに及ぶ、予測された3-6nmの距離に都合良く合う);この距離は、T細胞(図2A)上のNPの上のpMHCおよび同族TCRのほぼ完全なアライメントを可能にする。これらのクラスタ中の隣接するTCRヘテロ二量体を結合することができるpMHC-NPは、TCRシグナル伝達を誘発するのに効率的である。これらのモデルは、緊密に並置されたpMHCでコーティングされた小さなNPが最適な免疫学的特性を有する理由を説明する。pMHC密度はTreg細胞転換を制御する。なぜなら、それが大きなTCRマイクロクラスタの持続的な集合体を促進することができ、迅速で、ロバストで、長期のTCRシグナル伝達をもたらすからである(図2B)。
これらのデータは、NP上の個々のpMHC単量体を分離する距離に対応する定数によって生物学的活性閾値が定義されることを示唆した。出願人は、異なるサイズの最大閾値結合能力と予測された閾値結合能力とを比較し、pMHC-密度閾値を特定した。理論的なpMHC密度閾値は0.004468pMHC/nm2にあり、これは、8nmのNPの場合11pMHCあるいは20nmのNPの場合22pMHCに相当する。これらの値は~16.88nmの計算された分子間距離に相当する。T細胞抗原レセプタ(TCR)複合体は、CD3γ-CD3ε-TCRαβ-CD3ζ-CD3ζ-TCRαβ-CD3δ-CD3ε複合体内に最大2TCRαβヘテロ二量体を含有すると思われる(Rojo, J.M. ET AL. (1991) Immunol Today 12(10):377-378; Fernandez-Miguel, G. et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96(4):1547-1552)。この構造は、3D再構成(12nm) (Arechaga, I. et al. (2010) Int Immunol 22(11):897-903)に基づいたTCR複合体の予測された幅と一致し、アゴニスト閾値に達するための16.88nmの計算されたpMHC間の距離と一致している。出願人は~3.62nmで可能性のある最小の分子間の距離を計算し、それは、TCRαβナノクラスタ内の個々のTCRに及ぶ、予測された3-6nmの距離に都合良く合う);この距離は、T細胞(図2A)上のNPの上のpMHCおよび同族TCRのほぼ完全なアライメントを可能にする。これらのクラスタ中の隣接するTCRヘテロ二量体を結合することができるpMHC-NPは、TCRシグナル伝達を誘発するのに効率的である。これらのモデルは、緊密に並置されたpMHCでコーティングされた小さなNPが最適な免疫学的特性を有する理由を説明する。pMHC密度はTreg細胞転換を制御する。なぜなら、それが大きなTCRマイクロクラスタの持続的な集合体を促進することができ、迅速で、ロバストで、長期のTCRシグナル伝達をもたらすからである(図2B)。
pMHCクラスIコーティングされたNPを使用して生成されたデータに基づいた仮説は、広範囲の結合価上にわたってpMHCクラスII単量体でコーティングされたPF-NPの効力を誘発するTCRの比較によりテストされた。BDC2.5-TCR-トランスジェニックNODマウスから単離されたCD4+T細胞は、最大22の同族(BDC2.5mi/IAg7)pMHC複合体でコーディングされたPF-M NPに応答して、少量のIFNγを産生した(0.0045pMHC/nm2、図1G)。著しく、10および5μgのpMHC/mL(用量反応効果がプラトーに達する濃度)で得られたIFNγ分泌データをプロットすることにより、IFNγ分泌の規模は、pMHC結合価の比較的小さな増加に応答して指数関数的に増大し、それは、~22pMHC(予測された閾値結合価)から開始して~32pMHC/NP(0.0065pMHC/nm2、本明細書で「最小最適な結合価」と呼ばれる)(図1H)で終了する。この最小最適な結合価上のpMHC結合価/密度の実質的な増加は、有効により高い効力を結果としてもたらさない(図1H)。
実施例3-pMHC密度は、pMHC-NP-誘発TCRシグナル伝達の規模を制御する。
TCRシグナル伝達の効率におけるpMHC密度依存性差によってこれらの生物学的効果を説明することができるか否かを確認するために、出願人は、BDC2.5 TCRαβヘテロ二量体およびマウスCD4共受容体をコードするレンチウイルスでJurkat/MA(JurMA)ヒトT細胞株を形質導入した(内因性TCRβ鎖発現を欠き、活性化T細胞(NFAT)転写因子結合DNA配列の核因子によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを保持する)(Scholten, K.B. et al. (2005) Clin Immunol 114(2):119-129)。図1Iに示されるように、アゴニスト抗ヒトCD3εmAbまたはPMA/イオノマイシンの最適な濃度と比較されるように、BDC2.5-TCR/mCD4-JurMA細胞はBDC2.5mi/IAg7コーティングされたPF-Mに対して迅速(2時間以内)に、活発に、長期間(>24時間)応答し、それは、14時間でピークに達し、その後徐々に減少する非常に低速の応答を引き起こした。顕著に、広範囲のBDC2.5mi/IAg7結合価でコーティングされたPF-M NPを使用した実験は、ルシフェラーゼ発現(TCRシグナル伝達の直接読み出し)の規模が、初代BDC2.5-CD4+T細胞で見られるものに著しく似ている速度論に従っていたことを示し、これは、閾値および閾値を超えるpMHC密度が何らかの形で協同TCRシグナル伝達を促進することを示した(図1J)。
TCRシグナル伝達の効率におけるpMHC密度依存性差によってこれらの生物学的効果を説明することができるか否かを確認するために、出願人は、BDC2.5 TCRαβヘテロ二量体およびマウスCD4共受容体をコードするレンチウイルスでJurkat/MA(JurMA)ヒトT細胞株を形質導入した(内因性TCRβ鎖発現を欠き、活性化T細胞(NFAT)転写因子結合DNA配列の核因子によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを保持する)(Scholten, K.B. et al. (2005) Clin Immunol 114(2):119-129)。図1Iに示されるように、アゴニスト抗ヒトCD3εmAbまたはPMA/イオノマイシンの最適な濃度と比較されるように、BDC2.5-TCR/mCD4-JurMA細胞はBDC2.5mi/IAg7コーティングされたPF-Mに対して迅速(2時間以内)に、活発に、長期間(>24時間)応答し、それは、14時間でピークに達し、その後徐々に減少する非常に低速の応答を引き起こした。顕著に、広範囲のBDC2.5mi/IAg7結合価でコーティングされたPF-M NPを使用した実験は、ルシフェラーゼ発現(TCRシグナル伝達の直接読み出し)の規模が、初代BDC2.5-CD4+T細胞で見られるものに著しく似ている速度論に従っていたことを示し、これは、閾値および閾値を超えるpMHC密度が何らかの形で協同TCRシグナル伝達を促進することを示した(図1J)。
さらに、(a)協同シグナル伝達と一致する形状、および(b)閾値および最小最適な密度を定義する特定のpMHC結合価/密度の両方の点から、ナイーブ初代TCRトランスジェニックT細胞を使用する場合、pMHC-密度応答曲線を非常によく模倣するS字状曲線(図1J)を提示するこの開示のアッセイを観察することは予想外である。外因性TCR/共受容体の対を過剰発現するトランスフェクトされた細胞株にとって、これは完全に驚くべきことである。トランスフェクトされたマウスTCRおよびCD4分子の分子数と正確な化学量論を一致させることが困難であること、ならびに宿主細胞株はヒト起源(そのCD3鎖成分を含む)のものであるが、テストされたpMHCおよびTCR/CD4分子がマウスであったことを考慮すると、当業者は、トランスフェクトされた細胞からの線形(S字形状曲線の形と対照的に)反応を予想しただろう。
実施例4-pMHC-NPは、マウス同族T細胞での抗原受容体クラスタ化を誘発する。
出願人は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)を介してこれらのT細胞にpMHCを送達するのではなく、同族T細胞上のTCRを直接結合することにより、pMHC-NPがTreg細胞転換を促進することを示している(Clemente-Casares, X. et al. (2016) Nature 530(7591):434-440)。上記実験によって明らかにされたpMHC密度効果は、他の刺激(図1J)と比較して、pMHC-NP-曝露TCR/mCD4トランスフェクトJurMA細胞におけるNFAT駆動ルシフェラーゼの迅速で持続的な産生とあいまって、長期のTCRライゲーションを誘導することによって、pMHC-NPが作動するかもしれないことを示唆した(低い親和性の単量体のpMHC/TCR相互作用の一時的な性質に対立するものとして)。
出願人は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)を介してこれらのT細胞にpMHCを送達するのではなく、同族T細胞上のTCRを直接結合することにより、pMHC-NPがTreg細胞転換を促進することを示している(Clemente-Casares, X. et al. (2016) Nature 530(7591):434-440)。上記実験によって明らかにされたpMHC密度効果は、他の刺激(図1J)と比較して、pMHC-NP-曝露TCR/mCD4トランスフェクトJurMA細胞におけるNFAT駆動ルシフェラーゼの迅速で持続的な産生とあいまって、長期のTCRライゲーションを誘導することによって、pMHC-NPが作動するかもしれないことを示唆した(低い親和性の単量体のpMHC/TCR相互作用の一時的な性質に対立するものとして)。
TCRは、最大~200nmの直径/長さの線形クラスタ (Schamel, W.W. et al. (2013) Immunol Rev 251(1):13-20)または非線形の集合体 (Lillemeier, B.F. et al. (2010) Nat Immunol 11(1):90-96)として、ナイーブT細胞の表面上で組織化され、最大30の緊密に関連するTCRで構成される(ナノクラスタ)(Zhong, L. et al. (2009) PLoS One 4(6):e5945)。これらのTCR集合体のナノクラスタ構造は、プロフェショナルAPC上の同族pMHCのT細胞の物理的活性(従って、官能性の感度)を増加させ、緊密に並置されたTCRユニット中の協同細胞内シグナル伝達を促進すると思われる。TCRナノクラスタ形成が構成的で、pMHCライゲーション(通常、300-800nmのサイズの範囲で、最大70のTCRを含有する)に起因するTCRマイクロクラスタ形成(長期のTCRシグナル伝達をもたらす)に先行するという証拠がある (Lillemeier, B.F. et al. (2010) Nat Immunol 11(1):90-96; Yokosuka, T. et al. (2005) Nat Immunol 6(12):1253-1262; Choudhuri, K. et al. (2010) FEBS Lett 584(24):4823-4831; Sherman, E. et al. (2011) Immunity 35(5):705-720)。
上記のpMHC密度効果に対する洞察力を得るために、出願人は、同族T細胞に対するpMHCコーティングされたNP(閾値を超えるpMHC密度)の結合の幾何学的形状および速度論(kinetics)を調査した。TEM試験は、~100-150nmに及ぶいくつかのNPのクラスタ(島)として、pMHC-NPが同族CD8+またはCD4+T細胞を結合することを明らかにした(図3Aおよび3B)。この結合の幾可学的形状は、4°Cで30分以内に既に見られており、その後、37°Cでのインキュベーション時にクラスタ成長(~400nmの直径/長さへの)が続き(図3A、3BおよびG)、結合後~3時間から開始する細胞内小胞中のNPのインターナリゼーションに結果的になった(図3Aおよび3B)。pMHC-NPを非同族T細胞でインキュベートした時、NPの結合もインターナリゼーションも見られなかったので、このクラスタ化された結合は抗原特異性であった(図3C)。これらの結果は、超解像顕微鏡(図3D)および走査型電子顕微鏡(SEM)(図4Aおよび4B)によって実証され、同族T細胞の表面上でのクラスタ化されたpMHC-NPの存在を確認した。
まとめると、これらのデータは、pMHC-NPがTCRナノクラスタ結合およびマイクロクラスタ誘発デバイスとして機能し、このプロセスがTreg細胞転換の原因となるか、あるいは、少なくともTreg細胞転換に寄与する可能性を高めることを示唆した。Treg転換がpMHC密度の直接的な機能であるので、出願人はpMHC密度における変動がTCRマイクロクラスタ形成に何らかの効果を有するかどうか調査した。出願人は、閾値より下の、閾値の、および閾値を超える密度で、pMHCを保持するBDC2.5mi-IAg7-NP調製物を比較した。注目すべきことに、閾値より下の密度でコーティングされたNPは、同族CD4+T細胞に結合し、および同族CD4+T細胞によって、クラスタを形成することなく最終的にはインターナライズされた(図3Eおよび3G)。これに対して、閾値の密度でコーティングされたNPはクラスタの形成を容易に誘発し、これらのクラスタのサイズは、閾値を超える密度でコーティングされたNPを使用して増加した(図3A、3Fおよび3G)。
上記のデータは、同族T細胞へのpMHCベースのナノメディシンの結合幾可学的形状が、観察されたpMHC-密度効果の主な原因になることを示す。NP表面上の緊密に並置されたpMHC単量体は、個々のNP上の一時的に分離されたpMHC単量体の反復される再結合を促進し、したがって、TCRインターナリゼーションを遅らせ、個々のTCR-pMHC相互作用のt1/2を延長する(Zhong, L. et al. (2009) PLoS One 4(6): e5945; Huppa, J.B. et al. (2010) Nature 463(7283):963-967)。その後、結果として生じるシグナル伝達事象によって誘発された細胞骨格再構成は、大きなTCRマイクロクラスタへの近位のpMHC-NP-TCRユニットの持続的な集合体を促進し(Bunnell, S.C. et al. (2002) J Cell Biol 158(7):1263-1275)、TCRシグナル伝達の持続時間および規模をさらに増幅する(Yokosuka, T. et al. (2005) Nat Immunol 6(12):1253-1262)。高いpMHC密度は、細胞膜クラスタ上のNP内およびその間の両方で、構造変化の協同増殖ならびにpMHC結合TCRからそれらの非結合ネイバー(unbound neighbours)(Gil, D. et al. (2002) Cell 109(7):901-912; Minguet, S. et al.(2007) Immunity 26(1):43-54)までの関連する下流シグナル伝達事象も促進する(Martinez-Martin, N. et al. (2009) Science Signaling 2(83):ra43)。この解釈は、T細胞活性化の動的校正(McKeithan, T.W. (1995) Proc Natl Acad Sci USA 92(11):5042-5046)および連続的TCR結合モデル (Valitutti, S. et al. (1995) Nature 375(6527):148-151)の両方に適合する。
これらの化合物の予期しないpMHC密度および抗原受容体をクラスタ化する依存性シグナル伝達特性は、本明細書に記載されるもの、または効力とバッチ放出アッセイで類似するものなどの抗原受容体を表現するレポーター細胞株の使用を可能にする。
実施例5-ルシフェラーゼベースの効力アッセイのための例示的プロトコル
pMHC-ナノ粒子の所定の調製物の効力の判定に使用される例示的な効力アッセイを、この例にて詳述する。この場合の細胞は、NFATプロモーターの管理下でルシフェラーゼ遺伝子を含む。JurMA細胞がヒト細胞株であるため、マウスCD4が発現され、この例で分析されたpMHCのMHC成分はマウスI-Ag7である。JurMA細胞株がヒトMHCならびにマウスで機能することが考えられ、続く例において示される(JurMA細胞は、ヒトCD4の内因性発現を表示するので)。
1.96ウェルプレート(三通りの)において、200のμLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に500,000のBDC2.5/mCD4+JurMA細胞を加え (Sigma-Aldrich, catalog #D6429-500ML)、以下のいずれかの存在下で10%のウシ胎仔血清(FBS)(Sigma-Aldrich, Catalog # F6178)で補充した:1)20ng/mLのPMA(Sigma-Aldrich, catalog #P8139)と0.5μMのイオノマイシン(Sigma-Aldrich, Catalog#I3909-1ML)、10μg/mLの抗hCD3εmAb(OKT3, BD Biosciences)(陽性対照として);2)10-48pMHC/NPに及ぶ様々な結合価の12.5または5.0μg/mLのpMHCコーティングされたNPあるいはPF-M NP;または、3)システインコーティングされたNP(pMHC-NPに対して同等の鉄濃度を有する陰性対照として)。9%のCO2を供給しながら、37°CでCO2インキュベーターで夜通しインキュベートする。対照として、野生型JurMA細胞を用いてこのセットアップを複製する。
2.翌日、細胞を1200rpmで5分間遠心分離機にかけて、培地を取り除く。この後、200μLのPBSを加えて、細胞を3回洗浄する。
3.100μLの溶解緩衝液1x(Cell Culture Lysis Reagent, Promega, Cat. #E1531)中で細胞ペレットを再撹拌し、軽く振盪させながら30分間インキュベートする。
4.20μLの可溶化液を取り出し、それを乳白色96ウェルプレート(Greiner Bio-one Ref. #655075)に移す。
5.ウェル毎に100μLのルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega, Cat. # E1500)を加え、その後、Veritas(商標)マイクロプレート照度計を使用してすぐに読み取る(この機器の注射器は自動的にウェル毎に100μLのルシフェラーゼアッセイ試薬を加える。プレートは、注入後の読み取りプロセスを繰り返すために次のウェルに前進する)。生成された光を10秒間(積分時間)測定した。遅延時間は2秒である。
pMHC-ナノ粒子の所定の調製物の効力の判定に使用される例示的な効力アッセイを、この例にて詳述する。この場合の細胞は、NFATプロモーターの管理下でルシフェラーゼ遺伝子を含む。JurMA細胞がヒト細胞株であるため、マウスCD4が発現され、この例で分析されたpMHCのMHC成分はマウスI-Ag7である。JurMA細胞株がヒトMHCならびにマウスで機能することが考えられ、続く例において示される(JurMA細胞は、ヒトCD4の内因性発現を表示するので)。
1.96ウェルプレート(三通りの)において、200のμLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中に500,000のBDC2.5/mCD4+JurMA細胞を加え (Sigma-Aldrich, catalog #D6429-500ML)、以下のいずれかの存在下で10%のウシ胎仔血清(FBS)(Sigma-Aldrich, Catalog # F6178)で補充した:1)20ng/mLのPMA(Sigma-Aldrich, catalog #P8139)と0.5μMのイオノマイシン(Sigma-Aldrich, Catalog#I3909-1ML)、10μg/mLの抗hCD3εmAb(OKT3, BD Biosciences)(陽性対照として);2)10-48pMHC/NPに及ぶ様々な結合価の12.5または5.0μg/mLのpMHCコーティングされたNPあるいはPF-M NP;または、3)システインコーティングされたNP(pMHC-NPに対して同等の鉄濃度を有する陰性対照として)。9%のCO2を供給しながら、37°CでCO2インキュベーターで夜通しインキュベートする。対照として、野生型JurMA細胞を用いてこのセットアップを複製する。
2.翌日、細胞を1200rpmで5分間遠心分離機にかけて、培地を取り除く。この後、200μLのPBSを加えて、細胞を3回洗浄する。
3.100μLの溶解緩衝液1x(Cell Culture Lysis Reagent, Promega, Cat. #E1531)中で細胞ペレットを再撹拌し、軽く振盪させながら30分間インキュベートする。
4.20μLの可溶化液を取り出し、それを乳白色96ウェルプレート(Greiner Bio-one Ref. #655075)に移す。
5.ウェル毎に100μLのルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega, Cat. # E1500)を加え、その後、Veritas(商標)マイクロプレート照度計を使用してすぐに読み取る(この機器の注射器は自動的にウェル毎に100μLのルシフェラーゼアッセイ試薬を加える。プレートは、注入後の読み取りプロセスを繰り返すために次のウェルに前進する)。生成された光を10秒間(積分時間)測定した。遅延時間は2秒である。
以下の例において示されるように、この方法は、様々な型のナノ粒子組成物の効力および活性のためのアッセイに通常適用可能である。
実施例6-アッセイ間の変動性の測定
アッセイ間の変動性を測定するために、出願人は、同じ特異性を有するpMHC-NP(つまり、コアに結合された同じpMHC複合体)を調製し、SD50(片対数のプロット中で測定されるように、最大活性の半分をもたらす濃度)について分析した。これらの実験には、I-Ag7(BDC 2.5mi)に結合されたGAD524-543に特異的な組み換えTCRおよび組み替えマウスCD4でトランスフェクトされたJurMA細胞を利用した。結果が図5に要約され、7回の実験を用いた現在のデータが8.91プラス/マイナス1のマイクログラム/mL(平均プラス/マイナスの平均値の標準偏差)であることを示す。レポーターが実際にはTCR近位のシグナル伝達事象ではないので、出願人のアッセイを用いてテストされかつ観察された再現性は予期しないものであり、当業者は示されたよりも大きいアッセイ間の変動性を予測する。しかし、このデータ計算は厳格な応答(tight responses)を示し、そのような定量アッセイは従来のそれほど定量的ではないアッセイあるいは半定量アッセイ(例えば、TCRシグナル伝達レポーターの上流のシグナル伝達中間体のリン酸化の強度の測定)よりずっと好ましいことを証明する。生物学的活性の原因となるpMHC密度の閾値の低い実験間の変動性および忠実な再現と関連する定量化の利点は、この開示の組成物および品質の優れた高い感受性のあるバッチ間の比較を提供することができる。
アッセイ間の変動性を測定するために、出願人は、同じ特異性を有するpMHC-NP(つまり、コアに結合された同じpMHC複合体)を調製し、SD50(片対数のプロット中で測定されるように、最大活性の半分をもたらす濃度)について分析した。これらの実験には、I-Ag7(BDC 2.5mi)に結合されたGAD524-543に特異的な組み換えTCRおよび組み替えマウスCD4でトランスフェクトされたJurMA細胞を利用した。結果が図5に要約され、7回の実験を用いた現在のデータが8.91プラス/マイナス1のマイクログラム/mL(平均プラス/マイナスの平均値の標準偏差)であることを示す。レポーターが実際にはTCR近位のシグナル伝達事象ではないので、出願人のアッセイを用いてテストされかつ観察された再現性は予期しないものであり、当業者は示されたよりも大きいアッセイ間の変動性を予測する。しかし、このデータ計算は厳格な応答(tight responses)を示し、そのような定量アッセイは従来のそれほど定量的ではないアッセイあるいは半定量アッセイ(例えば、TCRシグナル伝達レポーターの上流のシグナル伝達中間体のリン酸化の強度の測定)よりずっと好ましいことを証明する。生物学的活性の原因となるpMHC密度の閾値の低い実験間の変動性および忠実な再現と関連する定量化の利点は、この開示の組成物および品質の優れた高い感受性のあるバッチ間の比較を提供することができる。
実施例7-インビトロのT細胞の刺激機能におけるNavacimに対する抗Navacim抗体の可能性のある効果を評価する細胞ベースの効力アッセイ
インビボでの送達後、免疫応答性の宿主がpMHC-NPの様々な成分に対する体液性応答を生成する可能性が存在する。これらは、pMHC-NPの構造成分であるPEGと同様に、表面にコーティングされたpMHC単量体内に存在する6xHisタグなどのタンパク質の精製タグを含む。この例では、pMHC-NP(pMHC、PEG、Hisタグ)の様々な成分に対して向けられた抗体が、T細胞中のTCRシグナル伝達に関与して誘発するpMHC-NPの能力に対してかなりの効果があるか否かを評価する。前の結果は、抗PEG(AGP4)の結合を阻むpMHC-NPおよび粒子への抗His(6G2A9)抗体へのヒト血清の曝露の能力およびを実証した。したがって、このアッセイは、抗His、抗PEG、あるいは抗MHCモノクローナル抗体、またはウサギ高度免疫血清への曝露後の同族JurMA T細胞を刺激するそれらの能力について、ヒト血清のあらかじめ曝露された粒子および曝露されていない粒子の両方をテストするだろう。
<試薬および実験レイアウト>
抗pMHC mAb
●精製された抗マウス/ラットMHCクラスII RT1B mAb(クローンOX-6)(1 mg/mL in PBS, Bio-Rad Catalog # MCA46R)
●精製された抗PEG mAb(クローンAGP4)(PBS中の1.4mg/mL、抗PEG、 Catalog # AGP4-PABM-A)
●精製された抗HisタグmAb(クローン6G2A9)(PBS中の0.5mg/mL、Genscript, Catalog # A00186)
●精製されたマウスIgG(クローンMOPC21)(PBS中の0.5mg/mL、BD Biosciences Catalog #554121)
血清
●抗PEG過免疫ウサギ血清
●抗BDC2.5miのpMHC過免疫ウサギ血清
●免疫前のウサギ血清
●ヒト血清(Sigma, Cat #H4522)
pMHC-NP
●BDC2.5miPFM-112017(Fe:2.15mg/mL、pMHC:0.97mg/mL、結合価42pMHC/NP)
●システインPFM-111417(Fe:1.52mg/mL)
ルシフェラーゼ検出方法:
●細胞培養溶解緩衝液(Promega Catalog #E1500)を用いたPromegaホタルルシフェラーゼ・アッセイ・キット
●試薬注射器を有するSpectramaxi3xプレート読み取り照度計効力アッセイを、実施例5-ルシフェラーゼベースの効力アッセイのための例示的プロトコルに従って実施した。
インビボでの送達後、免疫応答性の宿主がpMHC-NPの様々な成分に対する体液性応答を生成する可能性が存在する。これらは、pMHC-NPの構造成分であるPEGと同様に、表面にコーティングされたpMHC単量体内に存在する6xHisタグなどのタンパク質の精製タグを含む。この例では、pMHC-NP(pMHC、PEG、Hisタグ)の様々な成分に対して向けられた抗体が、T細胞中のTCRシグナル伝達に関与して誘発するpMHC-NPの能力に対してかなりの効果があるか否かを評価する。前の結果は、抗PEG(AGP4)の結合を阻むpMHC-NPおよび粒子への抗His(6G2A9)抗体へのヒト血清の曝露の能力およびを実証した。したがって、このアッセイは、抗His、抗PEG、あるいは抗MHCモノクローナル抗体、またはウサギ高度免疫血清への曝露後の同族JurMA T細胞を刺激するそれらの能力について、ヒト血清のあらかじめ曝露された粒子および曝露されていない粒子の両方をテストするだろう。
<試薬および実験レイアウト>
抗pMHC mAb
●精製された抗マウス/ラットMHCクラスII RT1B mAb(クローンOX-6)(1 mg/mL in PBS, Bio-Rad Catalog # MCA46R)
●精製された抗PEG mAb(クローンAGP4)(PBS中の1.4mg/mL、抗PEG、 Catalog # AGP4-PABM-A)
●精製された抗HisタグmAb(クローン6G2A9)(PBS中の0.5mg/mL、Genscript, Catalog # A00186)
●精製されたマウスIgG(クローンMOPC21)(PBS中の0.5mg/mL、BD Biosciences Catalog #554121)
血清
●抗PEG過免疫ウサギ血清
●抗BDC2.5miのpMHC過免疫ウサギ血清
●免疫前のウサギ血清
●ヒト血清(Sigma, Cat #H4522)
pMHC-NP
●BDC2.5miPFM-112017(Fe:2.15mg/mL、pMHC:0.97mg/mL、結合価42pMHC/NP)
●システインPFM-111417(Fe:1.52mg/mL)
ルシフェラーゼ検出方法:
●細胞培養溶解緩衝液(Promega Catalog #E1500)を用いたPromegaホタルルシフェラーゼ・アッセイ・キット
●試薬注射器を有するSpectramaxi3xプレート読み取り照度計効力アッセイを、実施例5-ルシフェラーゼベースの効力アッセイのための例示的プロトコルに従って実施した。
<結果>
ヒト血清の前曝露の有無に関わらず、予想通りに、抗-MHC-II(抗BDC2.5mi/IAg7)対象mAbあるいは抗血清は、力価依存性方法でインビトロの効力アッセイでのNavacim活性を著しく阻害することができた。これらの処置は、アッセイの検証を支援するために陽性阻害対照として含まれていた。図6A-6Dを示されるように、陰性対照(マウスIgGあるいはウサギ前免疫血清)と比較して、pMHC-NP活性の阻害は、ヒト血清前曝露の有無に関わらず、抗Hisタグ、抗PEG mAb、またはウサギ抗PEG過免疫血清で見られなかった。ヒト血清前露光も不在下で、抗PEG mAbは、pMHC-NP Tリンパ球刺激に対する強力な増強効果を実際に示した(これは抗PEG過免疫血清では見られないので、おそらくpMHC-NP複合体の五量体構造によって架橋することによる)。この効果は、ヒト血清へのNavacimsの前曝露によって妨げられ、血清曝露が抗PEG抗体結合を妨げたという我々の以前の発見と一致している。したがって、ヒト血清へのNavacims曝露は、JurMAアッセイにおけるそれらの効力を減少しない。
ヒト血清の前曝露の有無に関わらず、予想通りに、抗-MHC-II(抗BDC2.5mi/IAg7)対象mAbあるいは抗血清は、力価依存性方法でインビトロの効力アッセイでのNavacim活性を著しく阻害することができた。これらの処置は、アッセイの検証を支援するために陽性阻害対照として含まれていた。図6A-6Dを示されるように、陰性対照(マウスIgGあるいはウサギ前免疫血清)と比較して、pMHC-NP活性の阻害は、ヒト血清前曝露の有無に関わらず、抗Hisタグ、抗PEG mAb、またはウサギ抗PEG過免疫血清で見られなかった。ヒト血清前露光も不在下で、抗PEG mAbは、pMHC-NP Tリンパ球刺激に対する強力な増強効果を実際に示した(これは抗PEG過免疫血清では見られないので、おそらくpMHC-NP複合体の五量体構造によって架橋することによる)。この効果は、ヒト血清へのNavacimsの前曝露によって妨げられ、血清曝露が抗PEG抗体結合を妨げたという我々の以前の発見と一致している。したがって、ヒト血清へのNavacims曝露は、JurMAアッセイにおけるそれらの効力を減少しない。
実施例8-IGRP13-25/DR3 pMHCヘテロ二量体結合中の、同族TCRを発現する設計された細胞株に結合する。
システイン補足、ジッパーレス(zipperless)、ノブ・イン・ホールIGRP13-25 pMHC-DR3ヘテロ二量体のT細胞受容体を結合する能力をテストした。これについては、IGRP13-25 pMHC-DR3に特異的なヒトT細胞受容体からのα鎖およびβ鎖を発現するレポーター細胞株を使用した。
システイン補足、ジッパーレス(zipperless)、ノブ・イン・ホールIGRP13-25 pMHC-DR3ヘテロ二量体のT細胞受容体を結合する能力をテストした。これについては、IGRP13-25 pMHC-DR3に特異的なヒトT細胞受容体からのα鎖およびβ鎖を発現するレポーター細胞株を使用した。
<IGRP-TCRをコードするレトロウイルスを用いたJURMA-hCD4細胞株の形質導入プロトコル>
GP+EnvAM12パッケージング細胞株の生成我々は、gag/polおよびVSVパッケージング構築物と共に、IGRP-TCRおよびGFPレポーターを発現するレトロウイルスで293T細胞をトランスフェクトした。VSVシュードタイプ化された3日後に、濃縮した上清を収集し、等分し、冷凍した。これらのアリコートを使用して、スピン感染法(spin infection)(2700rpm 1時間)によって、アンホトロピックパッケージング細胞株GP+envAm12(ATCC CRL-9641)を形質導入した。5回のスピン感染の後、形質導入したGP+envAm12を、必要に応じて、GFPの発現のために選別した。
GP+EnvAM12パッケージング細胞株の生成我々は、gag/polおよびVSVパッケージング構築物と共に、IGRP-TCRおよびGFPレポーターを発現するレトロウイルスで293T細胞をトランスフェクトした。VSVシュードタイプ化された3日後に、濃縮した上清を収集し、等分し、冷凍した。これらのアリコートを使用して、スピン感染法(spin infection)(2700rpm 1時間)によって、アンホトロピックパッケージング細胞株GP+envAm12(ATCC CRL-9641)を形質導入した。5回のスピン感染の後、形質導入したGP+envAm12を、必要に応じて、GFPの発現のために選別した。
<IGRP-TCRをコードするレトロウイルスでのJURMA-hCD4細胞株の形質導入>
300万の形質導入および選別されたGP+envAm12を、6ウェルプレートのウェル毎に3mlの最終体積で蒔いた。次の日、8ug/mlのポリブレンで補充された3mlの最終体積で、100,000のJURMA-hCD4をあらかじめ蒔かれた、形質導入されたGP+envAm12で共培養した。2または3日毎に培地を変更して、この共培養を2週間間維持した。共培養の後、JURMA-hCD4細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析し、高い導入遺伝子発現のために選別した。その後、細胞をPE標識ヘテロ二量体で染色した。図7Aは陰性対照としての非染色細胞を示し、図7Dは無関係の四量体で染色された細胞を示し、図7Bはシステイン補足およびロイシンジッパー技術を使用して発現されたヘテロ二量体から作られた四量体で染色することを示し、図7Cは、ロイシンジッパーなしで、システイン補足およびノブ・イン・ホール技術を使用して発現されたヘテロ二量体から作られた四量体を示す。いずれかの技術を使用して作られたヘテロ二量体間の着色は頑強であった。これらのデータは、ジッパーレス、システイン補足ノブ・イン・ホール技術を使用して作られたヘテロ二量体がT細胞受容体を結合することができることを実証する。
300万の形質導入および選別されたGP+envAm12を、6ウェルプレートのウェル毎に3mlの最終体積で蒔いた。次の日、8ug/mlのポリブレンで補充された3mlの最終体積で、100,000のJURMA-hCD4をあらかじめ蒔かれた、形質導入されたGP+envAm12で共培養した。2または3日毎に培地を変更して、この共培養を2週間間維持した。共培養の後、JURMA-hCD4細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析し、高い導入遺伝子発現のために選別した。その後、細胞をPE標識ヘテロ二量体で染色した。図7Aは陰性対照としての非染色細胞を示し、図7Dは無関係の四量体で染色された細胞を示し、図7Bはシステイン補足およびロイシンジッパー技術を使用して発現されたヘテロ二量体から作られた四量体で染色することを示し、図7Cは、ロイシンジッパーなしで、システイン補足およびノブ・イン・ホール技術を使用して発現されたヘテロ二量体から作られた四量体を示す。いずれかの技術を使用して作られたヘテロ二量体間の着色は頑強であった。これらのデータは、ジッパーレス、システイン補足ノブ・イン・ホール技術を使用して作られたヘテロ二量体がT細胞受容体を結合することができることを実証する。
実施例9-IGRP13-25/DR3ノブ・イン・ホールpMHCヘテロ二量体は、インビトロのレポーター細胞株を刺激する。
酸化鉄ナノ粒子に結合された時、システイン捕捉、ノブ・イン・ホール安定化ヘテロ二量体のT細胞シグナル伝達を刺激する能力の能力を、NFATプロモーターの管理下で、ヒトIGRP13-25TCRおよびルシフェラーゼを発現するJurMA細胞を使用してテストした。図8Aおよび図8Bで示されるこれらの結果は、システイン捕捉ノブ・イン・ホール安定化ヘテロ二量体が、酸化鉄ナノ粒子に結合された時、誘導するT細胞シグナル伝達を誘発することができることを示す。
酸化鉄ナノ粒子に結合された時、システイン捕捉、ノブ・イン・ホール安定化ヘテロ二量体のT細胞シグナル伝達を刺激する能力の能力を、NFATプロモーターの管理下で、ヒトIGRP13-25TCRおよびルシフェラーゼを発現するJurMA細胞を使用してテストした。図8Aおよび図8Bで示されるこれらの結果は、システイン捕捉ノブ・イン・ホール安定化ヘテロ二量体が、酸化鉄ナノ粒子に結合された時、誘導するT細胞シグナル伝達を誘発することができることを示す。
本開示は特定の実施形態およびオプション機能によって具体的に開示されたが、本明細書に開示される例示された本開示の修正、改良、および変形は、当業者に頼ることができ、ならびに、そのような修正、改良、および変形はこの開示の範囲内であると考えられると理解されなければならない。材料、方法、および本明細書で提供される例は、特定の実施形態の代表であり、例示であり、ならびに本開示の範囲に対する限定として意図されない。
本開示は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示内にあるより狭い種および亜属のグルーピングの各々は、本開示の一部も形成する。これは、切り取られた材料が具体的に本明細書に詳述されるかどうかにかかわらず、属から任意の主題を取り除く条件付きまたは否定的な限定を用いる本開示の一般的な記載を含む。
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から記載されている場合、当業者は本開示がマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識するだろう。
請求項中の用語「または(or)」の使用は、代替物のみを指すように明確に意図されない限り、あるいは、その代替物が相互に排他的でない限り、「および/または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみあるいは「および/または」を指す定義を支持する。
この明細書および請求書で使用されるように、用語「含む(comprising)」(「含む(comprise)」および「含む(comorises)」などの含む(comprising)の任意の形態)、「有する(having)」(「有する(have)」および「有する(has)」などの有する(having)の任意の形態)、「含む(including)」(「含む(includes)」および「含む(include)」などの含む(including)の任意の形態)、あるいは「含有する(containing)」(「含有する(contains)」および「含有する(contain)」などの含有する(containing)の任意の形態)は、包括的であるか、または変更可能であり、ならびに追加の記載されていない要素あるいは方法の工程を除外しない。
この開示、様々な公報、特許および公開された特許明細書全体にわたって、引用を識別することによって参照される。あたかも各々が参考文献によって個々に組み込まれるのと同じ程度に、公報、特許出願、特許、および本明細書で言及された他の参考文献はすべて、参照によってその全体が明確に組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が統制することになる。
<例示的な配列表>
Claims (62)
- 組成物であって、該組成物は:
a)少なくとも1つの細胞であって:
i.組み換えT細胞受容体(TCR)であって、TCRα鎖およびTCRβ鎖を含む、組み換えTCRと;
ii.T細胞受容体経路依存性レポーターであって、前記組み換えTCRは主要組織適合性(MHC)分子に結合された疾患関連抗原に特異的である、T細胞受容体経路依存性レポーターと、を含む少なくとも1つの細胞;および、
b)ナノ粒子に結合されたMHC分子に結合される疾患関連抗原を含むナノメディシンを含む、組成物。 - 前記T細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される、請求項1に記載の組成物。
- 前記MHC分子に結合される疾患関連抗原は、10:1以上の比率で前記ナノ粒子に結合される、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記ナノ粒子は約1ナノメートル~約100ナノメートルの直径を有する、請求項1または3のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記ナノ粒子は金属コアを含む、請求項1または4のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である、請求項1~5のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記自己免疫性疾患関連抗原原または炎症性疾患関連抗原は、I型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病/症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ANCA関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項6に記載の組成物。
- 前記T細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する、請求項1~7のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記T細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーター、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、IL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせからなるリストから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項1~8のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの細胞は、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、またはMolt-4から選択される、請求項1~9のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記疾患関連抗原は、SEQ ID NO:1~352のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項1~10のうちのいずれか1つの組成物。
- 前記疾患関連抗原は、SEQ ID NO:353~455のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項1~10のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記TCRα鎖およびTCRβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される、請求項1~12のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記単一のポリペプチドのTCRα鎖およびTCRβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される、請求項13に記載の組成物。
- 前記リボソームスキッピング配列は、SEQ ID NO:456~523のいずれか1つにおいて記載される、請求項14に記載の組成物。
- 前記単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:527、533、あるいは538のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の組成物。
- 前記TCRα鎖およびTCRβ鎖は別個のポリペプチドとして翻訳される、請求項1~12のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記TCRα鎖は、SEQ ID NO:528、530、534、536 539、541のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:529、531、535、537、540、あるいは542のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、請求項1~17のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記TCRα鎖およびTCRβ鎖は細胞の表面で発現される、請求項1~18のうちのいずれか1つに記載の組成物。
- 前記細胞はTCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項1~19のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドはIRES核酸配列を含む、請求項20に記載の組成物。
- 前記IRES核酸配列はSEQ ID NO:524~526のいずれか1つにおいて記載される、請求項21に記載の組成物。
- 前記少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:532あるいは557のいずれか1つに記載のものと少なくとも80%、90%、95%、または100%相同する核酸配列を含む、請求項20~22のいずれか1つに記載の組成物。
- ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用される、請求項1~23のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである、請求項24に記載の使用。
- 組み換えT細胞受容体(TCR)およびT細胞受容体経路依存性レポーターを含む細胞であって、ここで、前記組み換えT細胞受容体は、主要組織適合性分子に結合される疾患関連抗原に特異的である、細胞。
- 前記T細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される、請求項26に記載の細胞。
- 前記疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である、請求項26または27に記載の細胞。
- 前記自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、I型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病/症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ANCAに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項28に記載の細胞。
- 前記T細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する、請求項26~29のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記T細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化T細胞核内因子(NFAT)転写因子結合DNA配列またはプロモーター、NF-κB転写因子結合DNA配列またはプロモーター、AP1転写因子結合DNA配列またはプロモーター、IL-2転写因子結合DNA配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせからなるリストから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項26~30のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記細胞は、JurMA、Jurkat、BW5147、HuT-78、CEM、またはMolt-4から選択される、請求項26~31のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記疾患関連抗原は、SEQ ID NO:1~352のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項26~32のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記疾患関連抗原は、SEQ ID NO:353~455のいずれか1つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項26~33のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記TCRα鎖およびTCRβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される、請求項26~34のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記単一のポリペプチドのTCRα鎖およびTCRβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される、請求項35に記載の細胞。
- 前記リボソームスキッピング配列は、SEQ ID NO:456~523のいずれか1つにおいて記載される、請求項36に記載の細胞。
- 前記単一のポリペプチドは、SEQ ID NO:527、533、あるいは538のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項35に記載の細胞。
- 前記TCRα鎖およびTCRβ鎖は別個のポリペプチドとして翻訳される、請求項26~34のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記TCRα鎖は、SEQ ID NO:528、530、534、536 539、541のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、TCRβ鎖は、SEQ ID NO:529、531、535、537、540、あるいは542のいずれか1つと少なくとも80%、90%、95%、または100%同一のアミノ酸配列を含む、請求項26~39のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記TCRα鎖およびTCRβ鎖は細胞の表面で発現される、請求項26~40のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記細胞はTCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項26~41のいずれか1つに記載の細胞。
- 前記少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドはIRES核酸配列を含む、請求項42に記載の細胞。
- 前記IRES核酸配列はSEQ ID NO:524~526のいずれか1つにおいて記載される、請求項43に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つの外因性ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:532あるいは557のいずれか1つに記載のものと少なくとも80%、90%、95%、または100%相同する核酸配列を含む、請求項42~44のいずれか1つに記載の細胞。
- 請求項26~45のいずれか1つに記載の細胞の集団。
- ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用される、請求項26~45のいずれか1つに記載の細胞あるいは請求項46に記載の細胞の集団。
- 前記ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである、請求項47に記載の使用。
- ナノ粒子に結合されたMHC分子に結合される疾患関連抗原を含むナノメディシンのアゴニスト活性を測定するインビトロの方法であって、該方法は:
a)ナノメディシンを、請求項26~45のいずれかに記載の細胞または請求項46に記載の細胞の集団と接触させる工程と;
b)T細胞受容体経路依存性レポーターによって生成されたシグナルを検出する工程と、
を含む、方法。 - ナノメディシンは複数のナノ粒子を含む、請求項49に記載の方法。
- 前記複数のナノ粒子は、前記ナノ粒子に結合されたMHC分子に結合される複数の疾患関連抗原を含む複数のナノ粒子を含む、請求項50に記載の方法。
- 前記疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である、請求項51に記載の方法。
- 前記自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、I型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病/症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ANCAに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項52に記載の方法。
- 前記複数のナノ粒子は、約1ナノメートル~約100ナノメートルの直径を有する複数のナノ粒子を含む、請求項49~53のいずれか1つに記載の方法。
- 前記T細胞受容体経路依存性レポーターのシグナルを定量化する工程をさらに含む、請求項49~54のいずれか1つに記載の方法。
- 定量化は、最大応答の約50%である応答を開始するナノメディシンの濃度を判定することを含み、ここで、前記最大応答とは、複数の濃度のナノメディシンが前記細胞または細胞の集団と接触する時に、前記細胞または細胞の集団と接触するナノメディシンの最高濃度で開始される応答である、請求項55に記載の方法。
- 前記複数の濃度のナノメディシンは、同じアッセイ中の前記細胞または細胞の集団と接触する、請求項56に記載の方法。
- 前記定量化は、陰性対照の少なくとも約200%である応答を始める前記ナノメディシンの濃度を決定し、ここで、前記陰性対照は、前記細胞または細胞の集団の組み換えT細胞受容体(TCR)と特異的に相互作用しないナノメディシンを含む、請求項55に記載の方法。
- シグナルは酵素によって生成される、請求項49~58のいずれか1つに記載の方法。
- 前記酵素はルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼである、請求項59に記載の方法。
- 前記シグナルは蛍光シグナルである、請求項49~58のいずれか1つに記載の方法。
- 前記方法は、製造プロセスの品質管理工程として利用される、請求項49~61のいずれか1つに記載の方法。
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