TW201842335A - 寡聚粒子試劑及其使用方法 - Google Patents

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湯瑪仕 史庫米特
克里斯蒂安 史坦伯格
湯姆 柯斯奇
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Abstract

本文提供寡聚試劑，包括抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之寡聚試劑、及其組合物、及製造寡聚試劑之方法，包括可靠地製造具有所需尺寸之寡聚粒子試劑之方法。在一些情況下，該等試劑為含有複數個針對試劑之結合位點的寡聚粒子試劑，且因此一或多種試劑係藉由可逆地結合至該寡聚粒子試劑而多聚化，例如藉此產生多聚化寡聚粒子試劑，讓刺激劑在其上面多聚化。亦提供使用該等寡聚試劑進行培育或培養之方法，以誘導刺激細胞，諸如淋巴細胞群體之組合物擴增(增殖)、活化、共刺激及/或存活。在一些態樣中，本發明提供刺激例如細胞群體之擴增(增殖)、存活或續存、活化、共刺激或其他效應的方法及試劑，其包含將試劑結合至細胞表面上之分子，藉此向該等細胞提供一或多個信號。

Description

寡聚粒子試劑及其使用方法
本發明提供寡聚試劑，包括抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之寡聚試劑，及其組合物以及用於製造寡聚試劑之方法，包括用於可靠地製造具有所需尺寸之寡聚粒子試劑之方法。在一些情況下，試劑為含有複數個用於試劑之結合位點的寡聚粒子試劑，且因此一或多種試劑，例如一或多種選擇試劑或刺激試劑係藉由可逆地結合至寡聚粒子試劑而多聚化，例如藉此產生刺激試劑或選擇試劑在其上多聚化的多聚化寡聚粒子試劑。本發明亦提供使用寡聚試劑進行培育或培養，以誘導細胞，諸如淋巴細胞群體之組合物的擴增(增殖)、活化、共刺激及/或存活刺激之方法。在一些態樣中，本發明提供用於刺激例如細胞群體之擴增(增殖)、存活或續存、活化、共刺激或其他效應(例如親和性選擇)之方法及試劑，其包含將試劑結合至細胞表面上之分子，藉此向細胞提供一或多個信號。
各種策略可用於活體外刺激T細胞群體，包括活體外擴增抗原特異性T細胞以用於授受細胞免疫療法或癌症療法，其中已顯示此類T細胞之輸注在攜有腫瘤之宿主中具有抗腫瘤反應性或用於治療病毒感染。需要用於活體外擴增細胞群體之改進的策略，包括用於研究、診斷及治療目的。
本文提供包含複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑之尺寸包含i)大於25 nm之半徑，例如流體動力半徑，ii)至少5×106 g/mol之分子量；及/或(iii)每一寡聚粒子試劑至少100個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子結合至或能夠結合至生物素、生物素類似物(例如去硫生物素、亞胺基生物素)或(融合)肽(例如Strep-tagII (WSHPQFEK))。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子可逆地結合至或能夠可逆地結合至生物素、生物素類似物或(融合)肽(例如Strep-tagII (WSHPQFEK))。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，其中抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在參看SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列中之抗生蛋白鏈菌素之位置，對應於位置44至47之序列位置處包含胺基酸序列Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子結合至或能夠結合至生物素、抗生物素蛋白、生物素類似物或突變蛋白、抗生物素蛋白類似物或突變蛋白及/或其生物學活性片段。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子可逆地結合至或能夠可逆地結合至生物素、抗生物素蛋白、生物素類似物或突變蛋白、抗生物素蛋白類似物或突變蛋白及/或其生物學活性片段。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，其中抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在參看SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列中之抗生蛋白鏈菌素之位置，對應於位置44至47之序列位置處包含胺基酸序列Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，該等分子包含：a)SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者中所闡述之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性且含有對應於Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 之胺基酸序列及/或可逆地結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽之胺基酸序列；或與SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性且含有對應於Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 之胺基酸序列及/或結合至生物素或其生物學活性形式、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽之胺基酸序列a)或b)之功能片段，該功能片段結合至生物素或其生物學活性形式、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽及/或可逆地結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽；或c)a)或b)之功能片段，該功能片段結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，其中寡聚粒子試劑包含複數個包含SEQ ID NO: 6或61中所闡述之胺基酸序列之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在參看SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列中之抗生蛋白鏈菌素之位置，對應於117、120及/或121之位置處進一步包含一或多個胺基酸置換。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中：一或多個胺基酸置換係選自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或一或多個胺基酸置換係選自Glu117、Gly120或Tyr121中之一或多者；或胺基酸置換係選自Glu117、Gly120或Tyr121。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，該等分子包含：a)SEQ ID NO: 27或28中所闡述之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO: 28展現至少85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性且含有對應於Va144 、Thr45 、Ala46 、Arg47 、Glu117 、Gly120 及Tyr121 之胺基酸序列及/或結合至生物素或生物學活性片段、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽；或c) a)或b)之功能片段，該功能片段結合至生物素或生物學活性片段、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中：一或多個胺基酸置換係選自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或一或多個胺基酸置換係選自Glu117、Gly120或Tyr121中之一或多者；或胺基酸置換係選自Glu117、Gly120或Tyr121。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，該等分子包含：a)SEQ ID NO: 27或28中所闡述之胺基酸序列；b)與SEQ ID NO: 28展現至少85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性且含有對應於Va144 、Thr45 、Ala46 、Arg47 、Glu117 、Gly120 及Tyr121 之胺基酸序列及/或可逆地結合至生物素、生物素類似物抗生蛋白鏈菌素結合肽；或c) a)或b)之功能片段，該功能片段可逆地結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，寡聚粒子試劑結合至或能夠結合至一或多種試劑(包含生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽)。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑包含結合搭配物，其中結合搭配物能夠結合至寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽或生物素或生物素類似物。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑結合或另外能夠結合至表現於靶細胞表面上之分子。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，一或多種試劑包含抗體，視情況為Fab或nanobody®，例如單域抗體(sdAb)。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞之表面上之受體的受體結合劑。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子，藉此誘導或調節靶細胞中之信號的刺激劑。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，刺激劑為第一受體結合劑且寡聚粒子試劑包含第二受體結合劑，其中第二受體結合劑能夠特異性結合至靶細胞表面上之第二分子，該結合至第二分子視情況能夠誘導或調節靶細胞中之信號。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)結合至共刺激或輔助分子且共刺激或輔助分子係選自CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至細胞介素受體且細胞介素受體係選自IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至趨化因子受體且趨化因子受體係選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為誘導細胞介素或趨化因子產生之因子且該因子為特異性結合至細胞介素或趨化因子受體之配位體。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至細胞介素受體之配位體，其中配位體特異性結合IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2；及/或配位體係選自IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17及TNF，或為其生物學活性片段。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至趨化因子受體之配位體，其中配位體特異性結合至選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1 CXCR3及CXCR4之趨化因子受體；或配位體係選自CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21及CCL25或為其生物學活性片段。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為黏附分子且黏附分子係選自CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)及CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)或為其生物學活性片段。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑包含選擇試劑，其中選擇試劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，靶細胞為免疫細胞。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，靶細胞為淋巴細胞或抗原呈遞細胞。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，靶細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，靶細胞為T細胞。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，選擇標記物為CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，寡聚粒子試劑包含大於25 nm、大於50 nm、大於60 nm、大於70 nm、大於80 nm或大於90 nm之半徑。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，寡聚粒子試劑包含25 nm與150 nm之間、50 nm與150 nm之間、75 nm與125 nm之間、80 nm與115 nm之間或90 nm與110 nm之間(含上下限值)或90 nm ±15 nm或95 nm±20-25 nm之半徑。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，寡聚粒子試劑具有小於150 nm之半徑。在特定實施例中，半徑為流體動力半徑。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，寡聚粒子試劑包含至少1×107 g/mol、至少5×107 g/mol或至少1×108 g/mol之分子量。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，寡聚粒子試劑包含1×106 g/mol與1×1010 g/mol之間、1×107 g/mol與1×109 g/mol之間、5×107 g/mol與5×108 g/mol之間、1×108 g/mol與5×108 g/mol之間或1×108 g/mol與2×108 g/mol之間的分子量。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之一些實施例中，寡聚粒子試劑包含至少100個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少500個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少1,000個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少1,500個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體或至少2,000個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之特定實施例中，寡聚粒子試劑包含100與50,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、1,000與20,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、1,000與10,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體或2,000與5,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在本文提供之寡聚粒子試劑中之任一者之某些實施例中，複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白包含離胺酸殘基，其中小於20%、10%、5%、1%之離胺酸殘基包含N經取代之亞胺基硫雜環戊烷。 本文提供包含一或多種寡聚粒子試劑之組合物。在本文提供之組合物中之任一者之一些實施例中，一或多種寡聚粒子試劑為複數種寡聚粒子試劑。在本文提供之組合物中之任一者之特定實施例中，複數種寡聚粒子試劑包含i)大於70 nm之平均半徑；ii)至少1×108 g/mol之平均分子量；及/或iii)每一寡聚粒子試劑至少2,000之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚體之平均數量；及/或iv)其中至少95%之複數種寡聚粒子試劑包含10 nm至150 nm之間的半徑之半徑尺寸分佈。在某些實施例中，半徑尺寸分佈為流體動力半徑尺寸分佈。 在本文提供之組合物中之任一者之某些實施例中，複數種寡聚粒子試劑包含大於25 nm、大於50 nm、大於60 nm、大於70 nm、大於80 nm、大於90 nm或大於100 nm之平均半徑。在本文提供之組合物中之任一者之一些實施例中，複數種寡聚粒子試劑包含25 nm與150 nm之間、50 nm與150 nm之間、75 nm與125 nm之間、80 nm與110 nm之間或90 nm與110 nm之間(含上下限值)或90 nm ±15 nm或95 nm±20-25 nm之平均半徑。在本文提供之組合物中之任一者之特定實施例中，至少95%之複數種寡聚粒子試劑包含50 nm與150 nm之間、70 nm與140 nm之間、80 nm與120 nm之間、80 nm與115 nm之間、80 nm與100 nm之間、90 nm與110 nm之間及/或100 nm與120 nm之間的半徑。 在本文提供之組合物中之任一者之某些實施例中，至少95%之寡聚粒子試劑包含複數種寡聚粒子試劑之平均及/或中值半徑之±50%、±25%、±20%、±15%、±10%及/或±5%之間的半徑。在本文提供之組合物中之任一者之一些實施例中，複數種寡聚粒子試劑包含80 nm與115 nm之間的平均半徑且其中至少95%之寡聚粒子試劑包含平均半徑之±25%之間的半徑。在本文提供之組合物中之任一者之特定實施例中，複數個粒子包含1×108 g/mol與5×108 g/mol之間或1×108 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)的平均分子量。 在本文提供之組合物中之任一者之某些實施例中，複數種寡聚粒子試劑包含每一寡聚粒子試劑至少100、至少500、至少1,000、至少1,500或至少2,000之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚體之平均數量。在本文提供之組合物中之任一者之一些實施例中，複數種寡聚粒子試劑包含每一寡聚粒子試劑在100與50,000之間、1,000與20,000之間、1,000與10,000之間或2,000與5,000之間(各含上下限值)的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚體之平均數量。 在本文提供之組合物中之任一者之特定實施例中，當在大約或低於 -80℃、大約或低於-20℃及/或大約或低於4℃下儲存至少1週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過25%。在本文提供之組合物中之任一者之某些實施例中，當儲存於大約或低於4℃下至少1週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過10%。在本文提供之組合物中之任一者之一些實施例中，當儲存於大約或低於4℃下至少3週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過10%。在本文提供之組合物中之任一者之特定實施例中，當儲存於大約或低於4℃下至少9週、至少27週或至少46週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過10%。在特定實施例中，當儲存於大約或低於-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下至少1週、3週、9週、27週或46週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過10%。 本文提供產生包含抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之寡聚粒子試劑的方法，該方法包含：培育複數個包含能夠與硫醇官能基反應之硫醇反應性官能基的活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個包含一或多個硫醇官能基之硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，藉此產生寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白粒子；從單體及/或較小寡聚分子中分離寡聚粒子；及使寡聚粒子與穩定劑接觸，藉此產生寡聚粒子試劑。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與能夠將一或多個胺轉化為硫醇反應性官能基之活化試劑一起培育而產生。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與添加或能夠添加硫醇官能基至一或多個離胺酸殘基之硫醇化試劑一起培育而產生。 本文亦提供一種產生寡聚粒子試劑之方法，該方法包含：(a)在將一或多個胺轉化為能夠與硫醇官能基反應之硫醇反應性基團之條件下將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育，藉此產生複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子；(b)將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與添加或能夠添加硫醇官能基至一或多個離胺酸殘基之硫醇化試劑一起培育，藉此產生複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子；及(c)將複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子一起培育，藉此產生包含寡聚粒子試劑之粒子組合物；其中該方法係在如下條件下進行：其中在起始(c)中之培育時，複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子使得至少60%之離胺酸平均包含一個硫醇官能基，及/或每一硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體平均至少10個離胺酸包含一個硫醇官能基。 某些實施例進一步包含分離寡聚粒子試劑與單體及/或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，在1:1與1:10之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與活化試劑之莫耳比下進行將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，在1:2±2%之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與活化試劑之莫耳比下進行將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，活化試劑包含雜雙官能基交聯劑。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，活化試劑包含4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基SMCC)及/或6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，硫醇反應性官能基為鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基、氮丙啶基、丙烯醯基、芳化劑、乙烯基碸基、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇或二硫化物還原劑。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，硫醇反應性官能基為順丁烯二醯亞胺基。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，在中性pH下培育第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在6.8與7.5之間的pH下培育。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在7.0與7.4之間，視情況為或大約7.2的pH下培育。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在4℃與39℃之間的溫度下培育。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間，視情況在約23℃或約24℃下培育。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係培育15分鐘至6小時或30分鐘至2小時之間(各含上下限值)。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係培育45分鐘至1.5小時之間(含上下限值)，視情況培育1小時或約1小時。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，在硫醇化試劑與每一抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之各一級胺為10:1與1:1之間(含上下限值)之莫耳比下進行，將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑一起培育。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，在1:50與1:500之間(含上下限值)的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與硫醇化試劑之莫耳比下進行將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑一起培育。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，在1:100或大約1:100的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與活化試劑之莫耳比下進行將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑一起培育。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，硫醇化試劑為或包含2-亞胺基硫雜環戊烷。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在7.0或大於7.0，視情況7.0與8.0之間(含上下限值)的pH下培育。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在約7.7之pH下培育。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，培育第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在pH為8.0或大於8.0，視情況在8.0與9.0之間(含上下限值)的緩衝液存在下起始。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，培育第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在pH為8.5或約8.5之緩衝液存在下起始。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，緩衝液包含硼酸鹽。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，緩衝液包含10 mM至200 mM硼酸鹽或50 mM至100 mM硼酸鹽(各含上下限值)，視情況約100 mM硼酸鹽。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在4℃與39℃之間的溫度下培育。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間，視情況在23℃或約23℃下或在24℃或約24℃下培育。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係培育15分鐘至2小時或15分鐘至1.5小時之間。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係培育15分鐘至2小時或25分鐘至1小時之間(各含上下限值)。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子及硫醇化試劑係培育1小時或約1小時。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係培育25分鐘或約25分鐘。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，培育期間的複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在X:1之莫耳比下，其中X為每一抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子可用於硫醇化之離胺酸殘基的數目。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，莫耳比為1:1至8:1或2:1至6:1，視情況為4:1或約4:1。在某些實施例中，莫耳比為1:1至1:8或1:2至1:6，視情況為1:4或約1:4。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在6.8與7.5之間(含上下限值)的pH下培育。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在7.0與7.4之間(含上下限值)的pH下培育。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在7.2或約7.2之pH下培育。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在4℃與39℃之間(含上下限值)的溫度下培育。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間(含上下限值)，視情況在23℃或約23℃或在24℃或約24℃下培育。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子係培育15分鐘至6小時或30分鐘至2小時之間(各含上下限值)。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子係培育45分鐘至1.5小時之間(含上下限值)，視情況培育1小時或約1小時。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，培育活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由使分子與N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)接觸而結束。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，同時分開地進行將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育的至少一部分及將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑一起培育的至少一部分。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育及將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑一起培育係持續基本上相同的時間量進行及/或在基本上相同的時間完成。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，其中在培育硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之前，該方法包含(i)自包含活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除活化試劑；及/或(ii)自包含硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除硫醇化試劑。. 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，其中培育複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在將第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子與硫醇化試劑一起培育結束之後及/或在自包含硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除硫醇化試劑之後15分鐘內起始。 本文提供產生寡聚粒子試劑之方法，其包含：將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)在7.2或約7.2之pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生複數個包含順丁烯二醯亞胺硫醇反應性官能基之活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子；將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與2-亞胺基硫雜環戊烷在7.5與8.5之間(含上下限值)的pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生複數個包含一或多個硫醇官能基之硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子；及將複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子在7.2或約7.2之pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生包含寡聚粒子試劑之組合物；其中將複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子一起培育係在將第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子與2-亞胺基硫雜環戊烷一起培育結束之後10分鐘內起始。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，該方法進一步包含使寡聚粒子試劑與穩定劑接觸。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，穩定劑降低存在於寡聚粒子試劑之離胺酸殘基上之N經取代之亞胺基硫雜環戊烷的量。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，穩定劑降低存在於寡聚粒子試劑之離胺酸殘基上之N經取代之亞胺基硫雜環戊烷的量至少25%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，穩定劑包含羥胺。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，寡聚粒子試劑具有小於150 nm之半徑。本文所提供之方法中之任一者之某些實施例進一步包含對寡聚粒子試劑進行過濾滅菌。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，寡聚粒子試劑係藉由尺寸排阻層析法與單體或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子分離。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，尺寸排阻極限大於或超過約100 kDa、500 kDa、750 kDa、1000 kDa或2000 kDa。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，尺寸排阻極限為500 kDa至1000 kDa或約500 kDa至1000 kDa。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，尺寸排阻極限為750 kDa或約750 kDa。 本文所提供之方法中之任一者之特定實施例包含收集一或多個包含空隙體積之部分，藉此將寡聚粒子試劑與單體或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子分離。在某些實施例中，方法進一步包含將寡聚粒子試劑儲存於大約或低於4℃、大約或低於-20℃或大約或低於 -80℃之溫度下。在一些實施例中，方法進一步包含在將一或多種試劑可逆地結合至寡聚粒子試劑之條件下混合寡聚粒子試劑與一或多種試劑。 本文亦提供將一或多種試劑多聚化為寡聚粒子試劑之方法，該方法包含將藉由本文所提供之方法產生之寡聚粒子試劑與一或多種試劑在將一或多種試劑可逆地結合至寡聚粒子試劑之條件下混合。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑包含結合搭配物，其中結合搭配物能夠結合至寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之分子。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，一或多種試劑包含抗體，視情況為Fab。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體的受體結合劑。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子，藉此誘導或調節靶細胞中之信號的刺激劑。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，刺激劑為第一受體結合劑且該方法進一步包含將第二受體結合劑可逆地結合至寡聚粒子試劑，其中第二受體結合劑能夠特異性結合至靶細胞表面上之第二分子，該結合至第二分子視情況能夠誘導或調節靶細胞中之信號。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)結合至共刺激或輔助分子且共刺激或輔助分子係選自CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至細胞介素受體且細胞介素受體係選自IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至趨化因子受體且趨化因子受體係選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為誘導細胞介素或趨化因子產生之因子且該因子為特異性結合至細胞介素或趨化因子受體之配位體。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至細胞介素受體之配位體，其中配位體特異性結合IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2；及/或配位體係選自IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17及TNF，或為其生物學活性片段。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至趨化因子受體之配位體，其中配位體特異性結合至選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1 CXCR3及CXCR4之趨化因子受體；或配位體係選自CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21及CCL25或為其生物學活性片段。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為黏附分子且黏附分子係選自CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)及CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)或為其生物學活性片段。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑包含選擇劑，其中選擇劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，靶細胞為免疫細胞。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，靶細胞為淋巴細胞或抗原呈遞細胞。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，靶細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，靶細胞為T細胞。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，選擇標記物為CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。 特定實施例涉及包含藉由本文提供之實施例中之任一者之方法產生之寡聚粒子試劑的組合物。特定實施例涉及包含複數種藉由本文提供之實施例中之任一者之方法產生之寡聚粒子試劑的組合物。某些實施例涉及一種製品，其包含本文提供之實施例中任一項之寡聚粒子試劑或本文提供之實施例中任一項之組合物。 本文提供調節細胞之方法，該方法包含在本文提供之實施例中任一項之寡聚粒子試劑存在下或在本文提供之實施例中任一項之組合物存在下培育包含靶細胞之細胞組合物，藉此調節靶細胞。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，調節靶細胞包含活化、富集及/或擴增靶細胞。 本文提供培養細胞之方法，該方法包含在本文提供之實施例中任一項之寡聚粒子試劑存在下或在本文提供之實施例中任一項之組合物存在下培育包含靶細胞之細胞組合物。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，寡聚粒子試劑可逆地結合至一或多種試劑。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之分子。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，一或多種試劑包含抗體，視情況為Fab。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體的受體結合劑。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子，藉此誘導或調節靶細胞中之信號的刺激劑。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，刺激劑為第一受體結合劑且該方法進一步包含將第二受體結合劑可逆地結合至寡聚粒子試劑，其中第二受體結合劑能夠特異性結合至靶細胞表面上之第二分子，該結合至第二分子視情況能夠誘導或調節靶細胞中之信號。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)結合至共刺激或輔助分子且共刺激或輔助分子係選自CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至細胞介素受體且細胞介素受體係選自IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至趨化因子受體且趨化因子受體係選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為誘導細胞介素或趨化因子產生之因子且該因子為特異性結合至細胞介素或趨化因子受體之配位體。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至細胞介素受體之配位體，其中配位體特異性結合IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2；及/或配位體係選自IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17及TNF，或為其生物學活性片段。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至趨化因子受體之配位體，其中配位體特異性結合至選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1 CXCR3及CXCR4之趨化因子受體；或配位體係選自CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21及CCL25或為其生物學活性片段。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，受體結合劑(第二受體結合劑)為黏附分子且黏附分子係選自CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)及CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)或為其生物學活性片段。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，一或多種試劑包含選擇劑，其中選擇劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，靶細胞為免疫細胞。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，靶細胞為淋巴細胞或抗原呈遞細胞。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，靶細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，靶細胞為T細胞。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，選擇標記物為CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。在某些實施例中，靶細胞包含血細胞、白血球、淋巴細胞、B細胞、B細胞群體、T細胞、T細胞群體、NK細胞、樹突狀細胞及/或巨噬細胞。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，靶細胞表現重組受體。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，靶細胞表現重組T細胞受體及/或嵌合抗原受體(CAR)。 在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，靶細胞表現結合至與疾病及/或癌症相關之抗原的CAR。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，抗原為αvβ6整合素(avb6整合素)、B細胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9 (CA9，亦稱為CAIX或G250)、一種癌症-睾丸抗原-癌症/睾丸抗原1B (CTAG，亦稱為NY-ESO-1及LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、一種細胞週期蛋白-細胞週期蛋白A2、C-C基序趨化因子配位體1 (CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、硫酸軟骨素蛋白聚醣4 (CSPG4)、表皮生長因子蛋白(EGFR)、截短表皮生長因子蛋白(tEGFR)、III型表皮成長因子受體突變體(EGFR vIII)、上皮醣蛋白2 (EPG-2)、上皮醣蛋白40 (EPG-40)、ephrinB2、腎上腺素受體A2(EPHa2)、雌激素受體、Fc受體樣5 (FCRL5；亦稱為Fc受體同系物5或FCRH5)、胎兒乙醯膽鹼受體(胎兒AchR)、葉酸結合蛋白(FBP)、葉酸受體α、胎兒乙醯膽鹼受體、神經節苷脂GD2、O-乙醯化GD2 (OGD2)、神經節苷脂GD3、醣蛋白100 (gp100)、G蛋白偶合受體5D (GPCR5D)、Her2/neu (受體酪胺酸激酶erbB2)、Her3 (erb-B3)、Her4 (erb-B4)、erbB二聚體、人類高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、B型肝炎表面抗原、人類白血球抗原A1 (HLA-AI)、人類白血球抗原A2 (HLA-A2)、IL-22受體α (IL-22Ra)、IL-13受體α2 (IL-13Ra2)、激酶插入域受體(kdr)、κ輕鏈、L1細胞黏附分子(L1CAM)、L1-CAM之CE7抗原決定基、含有8個家族成員A之富含白胺酸之重複序列(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、間皮素、c-Met、鼠類巨細胞病毒(CMV)、黏蛋白1 (MUC1)、MUC16、自然殺手第2組成員D (NKG2D)配位體、melan A (MART-1)、神經細胞黏附分子(NCAM)、癌胚抗原、黑色素瘤之優先表現抗原(PRAME)、孕酮受體、前列腺特異性抗原-前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、存活素、滋胚層醣蛋白(TPBG，亦稱為5T4)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、威爾姆氏腫瘤1 (WT-1)、病原體特異性抗原或與通用標籤相關之抗原，及/或生物素標記分子，及/或經HIV、HCV、HBV或其他病原體表現之分子。 本文所提供之方法中之任一者之一些實施例進一步包含破壞一或多種試劑與寡聚粒子試劑之間的可逆結合。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，該破壞包含向靶細胞中引入包含能夠逆轉一或多種試劑與寡聚粒子試劑之間的結合之物質之組合物。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，該物質為自由結合搭配物及/或為競爭試劑。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，該破壞終止或減少藉由一或多種試劑於靶細胞，視情況T細胞中誘導或調節之信號。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，該物質包含抗生蛋白鏈菌素結合肽、生物素或生物學活性片段，視情況為D-生物素或生物素類似物(或生物學活性片段)。 在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，物質為選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，該破壞係在起始該培育之後5天內進行。
相關申請案之交叉引用 本申請案主張2017年4月27日申請的名稱為「OLIGOMERIC PARTICLE REAGENTS AND METHODS OF USE THEREOF」之美國臨時專利申請案62/491,245之優先權，其內容以全文引用的方式併入本文中。序列表以引用之方式併入 本申請案與電子格式之序列表一起提交。序列表提供為2018年4月25日創建的名稱為735042008542SeqList.TXT之檔案，其大小為110,426位元組。電子格式之序列表中的資訊以全文引用之方式併入。 除非另有定義，否則本文所用之所有技術術語、標記法及其他技術及科學術語意欲具有與一般熟習所主張標的物所屬技術者通常所理解相同的含義。在一些情況下，出於清楚起見及/或方便參考，在本文中定義具有通常所理解含義之術語，且本文中包括此類定義不應必然解釋為表示與此項技術中通常所理解存在實質性差異。 本申請案中所提及的所有公開案，包括專利文件、科學論文及資料庫，出於所有目的均以全文引用之方式併入本文中，其引用之程度如同各個別公開案以引用之方式個別地併入一般。若本文所闡述之定義與以引用方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他公開案中所述之定義相反或另外不一致，則以本文所闡述之定義為準，而非以以引用方式併入本文中的定義為準。 本文中所用之部分標題僅出於組織目的而不應理解為限制所述標的物。 I. 概述 本文提供用於製造、生產及/或產生寡聚粒子試劑之方法。在一些實施例中，本文所提供之方法適用於將分子寡聚為介於1百萬Da至1億Da、1百萬Da至10億Da、1百萬Da至100億Da及/或1百萬Da至1000億Da範圍內的寡聚物粒子試劑。特定實施例涵蓋藉由所提供方法生產之寡聚粒子試劑之尺寸分佈受改變各個步驟中之一或多者之相異反應條件影響。因此，在一些實施例中，諸如時序、試劑之濃度及莫耳比以及溶液pH之條件經精確控制且保持恆定。在一些實施例中，本文所提供之方法適用於得到在批次或批料之間具有一致尺寸的寡聚粒子試劑。在一些實施例中，可調節本文所提供之方法之一或多個步驟或階段之條件以製造、生產或產生一或多個不同所需尺寸之寡聚粒子試劑。 在一些實施例中，用於製造、生產及/或產生寡聚粒子試劑之本文所提供之方法藉由使複數個具有附接硫醇官能基之分子(亦稱為硫醇化分子，例如硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子)與複數個具有附接硫醇反應性官能基，諸如順丁烯二醯亞胺官能基之分子(例如活化分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子)反應而交聯分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 特定實施例涵蓋一或多個特定尺寸之多聚化試劑可尤其有效地用於調節細胞。舉例而言，在一些實施例中，某一尺寸之寡聚粒子試劑當可逆地結合至一或多種刺激劑時，對擴增、活化及/或富集細胞群體尤其有效。如本文中所發現，可逆地結合至刺激劑之特定較大尺寸，例如具有大於32 nm之平均半徑(例如流體動力半徑)，且一般而言大於60 nm之平均半徑，諸如大於或大於大約90 nm、95 nm或100 nm之平均半徑之寡聚粒子試劑在相較於較小尺寸之寡聚粒子(例如圖6)之較大程度上活化細胞。因此，在一些實施例中，本文提供具有界定尺寸及尺寸分佈之寡聚粒子試劑，及用於一致地製造具有所需尺寸及尺寸分佈之寡聚粒子試劑之方法。 在一些實施例中，所提供方法導致變化性減小且一般一致地產生較大尺寸之寡聚試劑，同時使組合物中之寡聚物之尺寸分佈最小化。在一些實施例中，藉由存在於離胺酸殘基上及分子N端處之胺之亞胺基硫雜環戊烷活化將用於寡聚反應之反應性硫醇基添加至分子。在一些實施例中，硫醇化反應之時序，及硫醇化反應結束與寡聚反應起始之間的時間在反應與反應間保持恆定，在一些情況下，因為游離硫醇可由於異構化，亦即形成N經取代之亞胺基硫雜環戊烷而損失。在一些態樣中，時序應使硫醇損失及N經取代之亞胺基硫雜環戊烷形式之產生最小化，該N經取代之亞胺基硫雜環戊烷形式在一些情況下為可導致寡聚物之合成後生長之再異構化之後的SH官能基之隱藏來源。在一些實施例中，控制硫醇基與含順丁烯二醯亞胺之分子之反應的可供使用性，及使N經取代之亞胺基硫雜環戊烷之積聚最小化為可影響寡聚物尺寸之一致性的參數。 此外，在一些實施例中，硫醇活化以及其他化學反應之動力學可在一些情況下為pH依賴性的。在一些實施例中，用於化學反應之一或多種緩衝液(活化及偶合緩衝液)之pH，且特定言之用於硫醇化試劑之緩衝液之pH係在預定範圍或水準內且一般精密地量測及調節。此外，在一些實施例中，硫醇化及活化試劑與分子之間的化學計量係藉由在小公差(±2%)內調節濃度而高精度地調節以獲得多聚物之可再現平均尺寸。 本文亦提供如本文所述之此類寡聚試劑。在一些實施例中，一或多種試劑能夠可逆或不可逆地結合至寡聚試劑，其在一些情況下為多聚化試劑，其中一或多種試劑在寡聚粒子試劑上多聚化。諸如多聚化試劑之一或多種試劑結合至之寡聚試劑可用於涉及與靶細胞，包括原代細胞，諸如T細胞一起培養或培育之方法中。 本文提供一種使用提供之寡聚試劑擴增靶細胞，諸如T細胞組合物之方法。在一些實施例中，方法係關於能夠結合至靶細胞表面上之分子，諸如受體結合分子，藉此向細胞提供信號之可逆試劑系統，該信號在一些情況下可為原始活化信號。在一些實施例中，方法中採用之寡聚粒子試劑為在其上結合有一或多種試劑，例如第一試劑、第二試劑等的多聚化試劑，該一或多種試劑向細胞提供信號，諸如原始活化信號及/或輔助或共刺激信號。在一些實施例中，原始活化信號可因此足以活化細胞以進行擴增/增殖。此第一試劑能夠可逆或不可逆地結合至多聚化試劑。第二試劑亦可結合至多聚化試劑，該第二試劑刺激細胞表面上之輔助分子。第二試劑當結合至細胞表面上之輔助分子時可藉此刺激活化細胞進行擴增。另外，此第二試劑能夠可逆或不可逆地結合至多聚化試劑。多聚化試劑可固定於固體擔體上或可溶。在一個態樣中，本文所揭示之方法為細胞群體之連續擴增，其中完整淋巴細胞群體經刺激/擴增，接著藉由適合之固定相上之層析移除擴增所需之試劑。在一些實施例中，擴增/刺激之細胞(其為經培養細胞)視情況經例如T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)轉染，且在一些態樣中可經受藉由結合至引入之T細胞受體或嵌合抗原受體之不同刺激分子的第二刺激擴增。 本文提供一種擴增靶細胞，諸如T細胞組合物之方法。在一些實施例中，方法係關於能夠結合至靶細胞表面上之分子，諸如受體結合分子，藉此向細胞提供信號之可逆試劑系統，該信號在一些情況下可為原始活化信號。在一些實施例中，方法採用試劑，諸如寡聚粒子試劑，其可為在其上結合有一或多種試劑，例如第一試劑、第二試劑等的多聚化試劑，該一或多種試劑向細胞提供信號，諸如原始活化信號及/或輔助或共刺激信號。在一些實施例中，原始活化信號可因此足以活化細胞以進行擴增/增殖。此第一試劑能夠可逆或不可逆地結合至多聚化試劑。第二試劑亦可結合至多聚化試劑，該第二試劑刺激細胞表面上之輔助分子。第二試劑當結合至細胞表面上之輔助分子時可藉此刺激活化細胞進行擴增。另外，此第二試劑能夠可逆或不可逆地結合至多聚化試劑。多聚化試劑可固定於固體擔體上或可溶。在一個態樣中，本文所揭示之方法為細胞群體之連續擴增，其中完整淋巴細胞群體經刺激/擴增，接著藉由適合之固定相上之層析移除擴增所需之試劑。在一些實施例中，擴增/刺激之細胞(其為經培養細胞)視情況經例如T細胞受體或嵌合抗原受體(CAR)轉染，且在一些態樣中可經受藉由結合至引入之T細胞受體或嵌合抗原受體之不同刺激分子的第二刺激擴增。 在不存在外源生長因子或較低量之外源生長因子之情況下活體外擴增T細胞群體之方法為此項技術中已知的(參見例如美國專利6,352,694 B1及歐洲專利EP 0 700 430 B1)。一般而言，此類方法採用直徑大於1 µm之固相表面，各種結合劑(例如抗CD3抗體及/或抗CD28抗體)固定至該固相表面。舉例而言，Dynabeads® CD3/CD28 (Invitrogen)為用於T細胞擴增之市售試劑，其為均一、4.5 µm超順磁、無菌、非致熱聚苯乙烯珠粒，塗佈有針對人類T細胞上之CD3及CD28細胞表面分子之親和性純化單株抗體之混合物。然而，在一些情況下，此類磁性珠粒(例如)難以整合至在臨床試驗或治療目的所需的條件下擴增細胞之方法中，因為必須確保在向患者投與擴增之T細胞之前完全移除此等磁性珠粒。 在一些實施例中，本文所提供之方法解決此等問題。在一些態樣中，提供之試劑為可逆的，使得刺激劑可自細胞組合物移除。另外，在一些態樣中，刺激劑結合之試劑，例如多聚化試劑不固定於擔體上，諸如不固定於固體擔體或表面上。因此，在一些態樣中，試劑，例如多聚化試劑為可撓性且非硬性的。在一些實施例中，試劑可適應或符合細胞表面。在一些實施例中，有可能將試劑固定於擔體，諸如固體擔體，包括固定相上。在一些實施例中，此類方法可與使用類似選擇劑之選擇方法配合使用，在選擇方法中可選擇一或多個靶細胞且同時或依序暴露於刺激劑。因此，在一些態樣中，刺激特定細胞或細胞亞群可由於連同刺激之選擇及分離而有偏差。 在一些實施例中，提供之方法涉及培養，例如接觸細胞之組合物與試劑，例如一或多種受體結合劑(例如刺激劑)結合至之多聚化試劑(參見例如圖10A及10B)。在一些實施例中，在接觸細胞組合物與多聚化試劑且通常培育細胞群體與多聚化試劑之後，細胞群體經由第一試劑與多聚化試劑形成複合物/結合至多聚化試劑。其他細胞群體包含於不具有不結合至多聚化試劑之特定細胞表面分子的初始樣品中。就此而言，應注意，細胞群體通常在其表面上具有細胞表面分子之多個複本且此等多個複本之結合通常為刺激或活化所必需。 因此，多聚化試劑通常提供多於一個結合位點，例如Z1，其中在一些情況下，複數種試劑能夠可逆地結合(諸如經由一或多種試劑之結合搭配物，例如C1之結合)至一或多個結合位點，例如Z1。在一些此類態樣中，此呈現足夠密度之第一試劑、第二試劑及/或其他試劑至細胞群體。就此而言，應注意，多聚化試劑可因此具有多個結合位點(例如Z1)，例如天然狀態之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白(為均四聚體)具有四個此類結合位點(例如Z1)，且可另外經寡聚。在一些情況下，試劑可僅具有一個用於可逆地結合結合搭配物(例如C1)之結合位點(例如Z1)。此類實例為多聚調鈣蛋白。調鈣蛋白因此僅具有一個用於調鈣蛋白結合肽之結合位點。然而，調鈣蛋白可經生物素標記且接著與抗生蛋白鏈菌素寡聚物反應(亦參見下文)，藉此提供多個調鈣蛋白分子以高密度呈現於「支架」上之多聚化試劑，藉此提供多聚調鈣蛋白。 在一些實施例中，在培育之後或期望破壞刺激之其他適合之時間，可逆結合劑之結合搭配物(在本文中亦稱為結合搭配物C，例如C1)與多聚化試劑之結合位點Z，例如Z1之間的結合藉由破壞各別可逆結合而破壞。在一些情況下，破壞可藉由添加競爭者至含有結合至多聚化試劑至細胞群體的培育/反應混合物來達成。為了競爭性破壞(其可理解為競爭性溶離)可逆結合劑之結合搭配物C (例如C1)與多聚化試劑之結合位點Z (例如Z1)之間的可逆黏合，培育混合物/細胞群體可與自由第一結合搭配物C (例如C1)，或能夠破壞第一結合搭配物與結合位點Z (例如Z1)之間的結合之該第一結合搭配物C之類似物接觸。在結合搭配物C (例如C1)為結合至抗生蛋白鏈菌素之生物素結合位點之抗生蛋白鏈菌素結合肽之實例中，第一自由搭配物可為競爭性地結合之對應自由抗生蛋白鏈菌素結合肽或類似物。此類類似物可例如為生物素或生物素衍生物或類似物，諸如去硫生物素。 在一些實施例中，添加自由搭配物或其類似物導致結合搭配物C (例如C1)自多聚化試劑置換，且因此，由於結合搭配物包含於可逆結合劑中，達成自多聚化試劑置換此類試劑。試劑之此置換轉而導致第一試劑自細胞表面分子解離，尤其在第一試劑與細胞表面受體之間的結合之結合親和力具有10- 2 M至10- 13 M範圍內之解離常數(Kd )的情況下，且因此亦為可逆的。由於此解離，在一些態樣中，細胞群體之刺激亦終止。 在一些實施例中，抗體分子針對其抗原(包括例如細胞表面受體分子)之結合親和力通常在10- 7 M至10- 13 M之Kd 的親和力範圍內。因此，習知單株抗體可用作試劑(第一或第二受體結合劑，例如刺激劑或選擇劑)。在一些實施例中，為了避免導致較強結合之任何非所需親合力效應，單株抗體亦可以其單價抗體片段，諸如Fab片段或單鏈Fv片段之形式使用。 在一些實施例中，由於一或多種可逆結合劑自細胞表面分子解離，提供之方法具有刺激之細胞群體在刺激時段結束時不含刺激劑之附加優勢。另外，在一些實施例中，用於該方法中之所有其他試劑，即試劑(例如第一或第二受體結合劑，例如刺激劑，或選擇劑)以及結合搭配物C (例如C1)或其類似物之競爭試劑可經由「移除濾筒」自刺激之細胞群體容易地移除(參見例如國際專利申請案WO 2013/124474中所述)。在一些情況下，例如其中多聚化試劑固定於固體擔體，諸如生物反應器表面或磁珠上，其經抑制。因此，使用移除濾筒來移除自由試劑及競爭試劑可包括將溶離樣品(例如在破壞可逆結合之後獲得之樣品)負載至第二層析管柱上。 在一些實施例中，此層析管柱具有適合之固定相，其為親和性層析基質且同時可充當凝膠滲透基質。在一些態樣中，此親和性層析基質在其上固定有親和性試劑。在一些實施例中，親和性試劑可例如為抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或其混合物。在一些實施例中，試劑(例如第一或第二受體結合劑，例如刺激劑，或選擇劑)，結合搭配物C、C1之競爭試劑結合至親和性試劑，藉此固定於層析基質上。因此，含有經分離及擴增之細胞群體的溶離樣品耗盡試劑(例如第一或第二受體結合劑，例如刺激劑，或選擇劑)及競爭試劑。在一些實施例中，培養組合物不含任何反應物，其在一些態樣中有利於與診斷應用(例如另外的FACSTM 分選)結合使用或用於任何基於細胞之治療應用。 在一些實施例中，自組合物移除試劑及其他組分之能力具有能夠避免任何固體擔體，諸如磁性珠粒之另外優勢。在一些實施例中，此意謂不存在藉由此類磁性珠粒污染活化T細胞之風險或風險極小。在一些實施例中，此亦意謂符合GMP標準之方法可相較於其他方法更易於建立，其他方法為諸如使用Dynabeads®，其中必須採取額外措施以確保最終擴增之T細胞群體不含磁性珠粒。此外，在一些實施例中，使用可溶多聚化試劑使得自活化細胞群體(T細胞、B細胞或連同自然殺手細胞)移除磁性珠粒容易得多，因為細胞可藉由離心簡單地沈澱，且可丟棄包括可溶多聚化試劑之上清液。或者，可溶多聚化試劑可在諸如上文(例如國際專利申請案WO 2013/124474)所述之移除濾筒之凝膠滲透基質中自擴增之細胞群體移除。在一些實施例中，由於不存在固相(例如磁性珠粒)，本發明亦提供用於擴增細胞之自動化封閉系統，其可整合至已知細胞擴增系統中，已知細胞擴增系統為諸如購自GE Healthcare (Little Chalfont, Buckinghamshire, United Kingdom)之Xuri細胞擴增系統W25及WAVE Bioreactor 2/10系統或購自TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA)之QUANTUM®細胞擴增系統。 在一些態樣中，本文所提供之方法可包括攜有至少兩個特定細胞表面分子之細胞群體。在一些實施例中，第一細胞表面分子涉及向細胞群體之原始活化信號，而第二細胞表面分子為涉及向細胞提供刺激之細胞表面上之輔助分子。在特定實施例中，細胞群體與多聚化試劑接觸，其中可逆或非可逆地結合向細胞提供原始活化信號之第一試劑及誘導或調節額外信號，諸如刺激細胞表面上之輔助分子之第二試劑。在一些實施例中，細胞群體與多聚化試劑接觸，其中可逆地結合向細胞提供原始活化信號之第一試劑及誘導或調節額外信號，諸如刺激細胞表面上之輔助分子之第二試劑。細胞群體可例如為T細胞群體，其中細胞表面分子為TCR/CD3複合物且細胞表面分子為輔助分子CD28。在一些態樣中，相較於經由CD28之習知刺激，經由此類其他輔助分子之刺激可導致分化較少且在一些情況下長壽之群體T細胞，諸如長壽記憶T細胞之增加。在一些實施例中，結合作為原始活化信號之TCR/CD3複合物及結合輔助分子(例如CD28或其他輔助分子)可為T細胞擴增/增殖所需。 在一些實施例中，本文所提供之方法亦可進一步組合以包括至少一種可逆地結合至相同試劑，例如相同多聚化試劑之選擇劑作為第一或第二受體結合劑(例如刺激劑)中之任一者或兩者。在一些情況下，有可能增強或增加產生於培育或培養之一或多個特徵，諸如T細胞亞群中之擴增(增殖)、活化、共刺激及/或存活刺激，該一或多個特徵可在至少一或多種選擇劑存在下於培育或培養中可逆地選擇，該培育或培養亦在一或多種刺激劑存在下發生。舉例而言，如本文之實例中所示，當此類細胞與多聚化試劑一起培育時，T細胞組合物中之擴增程度在CD8+細胞中選擇性地增加，除抗CD3抗體及抗CD28抗體刺激劑以外，抗CD8抗體亦可逆地結合至多聚化試劑。在一些實施例中，相較於僅在一或多種刺激劑但不在選擇劑存在下之培育，當在特異性結合至選擇標記物之一或多種刺激劑及選擇劑存在下培育時，產生於培育或培養之一或多個特徵，諸如擴增(增殖)、活化、共刺激及/或存活刺激可在對於選擇標記物呈陽性之培養組合物中之T細胞亞群中增加至少1.5倍、至少2.0倍、至少3.0倍、至少4.0倍、至少5.0倍、至少6.0倍、至少7.0倍、至少8.0倍、至少9.0倍、至少10倍或大於10倍。細胞(諸如T細胞)特徵之此偏差或選擇性准許控制特定T細胞亞群或群體之端點特徵。在一些實施例中，選擇標記物可為如本文所述之任何選擇標記物。在一些實施例中，選擇標記物係選自：CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。 在一些實施例中，多聚化試劑包含至少一個用於可逆地結合第一試劑之結合位點Z，例如Z1，且第一試劑亦包含至少一種結合搭配物C，例如C1，其中結合搭配物C，例如C1能夠可逆或非可逆地結合至多聚化試劑之結合位點Z，例如Z1。因此，第一試劑當與多聚化試劑接觸或培育時能夠經由形成於結合搭配物C，例如C1與結合位點Z，例如Z1之間的可逆結合而可逆地結合至多聚化試劑。另外，第二試劑可包含結合搭配物C，例如C2，其中結合搭配物C2能夠可逆地結合至多聚化試劑之各別結合位點Z，例如Z2。在一些實施例中，第二試劑當與多聚化試劑接觸或培育時經由形成於結合搭配物C，例如C1與結合位點Z，例如Z2之間的可逆結合而可逆地結合至多聚化試劑。在一些情況下，C1及C2可相同或基本上相同及/或包含相同基本上相同之部分。在一些情況下，Z1及Z2可相同或基本上相同及/或包含相同或基本上相同之部分。 在一些實施例中，使用結合至多聚化試劑之相同結合位點的部分作為結合搭配物C1及C2具有如下優勢：(第一結合搭配物C1以及第二結合搭配物C2之)相同競爭試劑或其類似物可用於破壞，且在一些情況下終止靶細胞(例如T細胞)群體之擴增且將此靶細胞(例如T細胞)群體自多聚化試劑釋放。 在一些情況下，為了產生包含結合搭配物C之結合劑(例如第一或第二受體結合劑，例如刺激劑，或選擇劑)，結合搭配物C(例如C1或C2)可藉由用於重組產生試劑(例如抗體片段)之各別表現載體提供，以使得結合搭配物C(例如C1或C2)為融合肽之一部分，其中試劑在N端或C端處。在一些實施例中，在試劑為抗體或抗原結合片段的情況下，結合搭配物C (例如C1或C2)可存在於輕鏈或重鏈之C端處。另外，選殖重組蛋白，諸如抗體分子之可變域，及以重組方式產生各別蛋白質，例如抗體片段之此方法為熟習此項技術者熟知，參見例如Skerra, A. (1994)。在一些實施例中，抗體分子可針對給定標靶，諸如CD3或CD28或如所描述之其他輔助劑或刺激劑分子由具有抗體樣特性之人工結合分子產生，諸如藉由熟知演化方法，諸如噬菌體呈現(綜述於例如Kay, B.K等人 (1996)Phage Display of Peptides and Proteins - A Laboratory Manual , 第1版, Academic Press, New York NY；Lowman, H.B. (1997)Annu . Rev . Biophys . Biomol . Struct . 26 , 401-424，或Rodi, D.J.及Makowski, L. (1999)Curr . Opin . Biotechnol . 10 , 87-93中)、核糖體呈現(綜述於Amstutz, P.等人 (2001)Curr . Opin . Biotechnol . 12 , 400-405)或報導於Wilson, D.S.等人 (2001)Proc . Natl . Acad . Sci . USA 98 , 3750-3755中之mRNA呈現。 II. 可逆試劑系統及相關用途 在一些實施例中，方法採用可逆系統，其中至少一種試劑(例如受體結合劑或選擇劑)能夠結合至細胞表面上之分子(細胞表面分子)，與試劑締合，例如可逆地締合。在一些情況下，試劑含有複數個能夠結合，例如可逆地結合至試劑(例如受體結合劑或選擇劑)之結合位點。在一些情況下，試劑為多聚化試劑。在一些實施例中，至少一種試劑(例如受體結合劑或選擇劑)含有至少一個可特異性結合分子之抗原決定基或區域之結合位點B，且亦含有特異性結合至試劑之至少一個結合位點Z之結合搭配物，在本文中亦稱為結合搭配物C。在一些情況下，結合搭配物C與至少一個結合位點Z之間的結合相互作用為非共價相互作用。在一些情況下，結合搭配物C與至少一個結合位點Z之間的結合相互作用為共價相互作用。在一些實施例中，結合搭配物C與至少一個結合位點Z之間的結合相互作用，諸如非共價相互作用為可逆的。 在一些實施例中，可逆締合可在作為或含有結合位點之物質，諸如競爭試劑(亦稱作溶離試劑)存在下介導，該結合位點亦能夠結合至至少一個結合位點Z。一般而言，物質(例如競爭試劑)可充當競爭者。舉例而言，在一些實施例中，結合搭配物C由於其解離速率而自至少一個結合位點Z解離。在某些態樣中，在解離之後，結合搭配物C可(i)再次結合至至少一個結合位點Z，或在一些態樣中，(ii)若物質，例如競爭試劑首先結合至一或多個結合位點Z，則將阻止再次結合至至少一個結合位點Z。在一些態樣中，物質可具有較高結合親和力及/或以較高及/或足夠濃度存在，或針對存在於試劑中之結合位點Z及/或由於以相較於結合搭配物C較高之濃度存在，藉此減少來自一或多種結合搭配物C之連接及/或締合結合搭配物C的量。在一些實施例中，物質(例如競爭試劑)對於至少一個結合位點Z之親和性大於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)之結合搭配物C對於至少一個結合位點Z之親和性。在某些實施例中，試劑之結合位點Z與試劑(例如受體結合劑或選擇劑)之結合搭配物C之間的結合可藉由添加物質(例如競爭試劑)而減小或降低，藉此在一些態樣中使得試劑(例如受體結合劑或選擇劑)及試劑之締合有效地可逆。 可用於此類可逆系統中之試劑描述於此項技術中已知且在此項技術中已知，參見例如美國專利第5,168,049號；第5,506,121號；第6,103,493號；第7,776,562號；第7,981,632號；第8,298,782號；第8,735,540號；第9,023,604號；及國際公佈PCT申請案第WO2013/124474號及第WO2014/076277號。能夠形成可逆相互作用之試劑及結合搭配物，以及能夠逆轉此類結合之物質(例如競爭試劑)之非限制性實例描述於下文。 A. 試劑在一些實施例中，試劑含有一或多個能夠可逆地結合至試劑(例如受體結合劑或選擇劑)包含之結合搭配物C的結合位點Z。在一些實施例中，試劑含有複數個結合位點Z，其各自能夠特異性結合至結合搭配物C，亦即包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中，使得試劑能夠可逆地結合至複數種試劑(例如受體結合劑或選擇劑)，例如為多聚化試劑。在一些實施例中，試劑為個別分子(例如單體)之寡聚物或聚合物或構成個別分子(例如四聚體)之複合物，其各自含有至少一個結合位點Z。在一些實施例中，試劑含有至少兩個結合位點Z、至少三個結合位點Z、至少四個結合位點Z，諸如至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72或更多個結合位點Z。結合位點可全部相同或複數個結合位點可含有一或多個不同結合位點(例如Z1、Z2、Z3等)。在一些實施例中，試劑為寡聚粒子試劑，且含有至少72、120、140、200、240、280、320、360、400、440、480、520、560、600、640、680、720、760、800、900、1,000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000或至少100,000個結合位點Z。在一些實施例中，一或多種試劑(例如受體結合劑或選擇劑)與試劑締合，諸如可逆地結合至試劑，諸如經由存在於試劑上之一個或複數個結合位點Z。在一些情況下，此導致試劑(例如受體結合劑或選擇劑)彼此緊密地配置，使得若具有細胞表面分子(至少兩個複本)之靶細胞與具有一或多個能夠結合特定分子之結合位點B的試劑(例如受體結合劑或選擇劑)接觸，則可發生親合力效應。在一些實施例中，相同，亦即含有相同結合位點B之兩種或大於兩種不同試劑(例如受體結合劑或選擇劑)能夠可逆地結合至試劑。在一些實施例中，含有相同結合位點B之兩種或大於兩種不同試劑可逆地結合至寡聚粒子試劑。在一些實施例中，有可能使用至少兩種不同(類型之)試劑(例如受體結合劑或選擇劑)，且在一些情況下，三種或四種不同(類型之)試劑，例如兩種或大於兩種不同受體結合劑及/或選擇劑。舉例而言，在一些實施例中，試劑能夠可逆地結合至含有結合位點B1、B2、B3或B4等的第一試劑(例如受體結合劑或選擇劑)及含有另一結合位點，例如結合位點B1、B2、B3或B4中之另一者之第二試劑(例如受體結合劑或選擇劑)。在一些情況下，第一試劑及第二試劑之結合位點可相同。舉例而言，在一些態樣中，至少兩種試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之每一者可結合至相同分子。在一些情況下，第一試劑及第二試劑之結合位點可不同。在一些態樣中，至少兩種試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之每一者可結合至不同分子，諸如第一分子、第二分子等。在一些情況下，不同分子，諸如細胞表面分子可存在於相同靶細胞上。在其他情況下，不同分子，諸如細胞表面分子可存在於不同靶細胞上，該等不同靶細胞存在於相同細胞群體中。在一些情況下，第三、第四等試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可與各自含有另一不同結合位點之相同試劑締合。 在一些實施例中，兩種或大於兩種不同試劑(例如受體結合劑或選擇劑)含有相同結合搭配物C。在一些實施例中，兩種或大於兩種不同試劑(例如受體結合劑或選擇劑)含有不同結合搭配物。在一些態樣中，第一試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可具有結合搭配物C1，該結合搭配物可特異性結合至存在於試劑上之結合位點Z1，且第二試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可具有結合搭配物C2，該結合搭配物可特異性結合至存在於試劑上之結合位點Z1或結合位點Z2。因此，在一些情況下，試劑包含之複數個結合位點Z包括結合位點Z1及Z2，其能夠分別可逆地結合至試劑(例如受體結合劑或選擇劑)包含之結合搭配物C1及C2。在一些實施例中，C1及C2相同，及/或Z1及Z2相同。在其他態樣中，複數個結合位點Z中之一或多者可不同。在其他情況下，複數個結合搭配物C中之一或多者可不同。選擇與含有結合位點Z之試劑相容之不同結合搭配物C之任何組合在熟習此項技術者之能力內，只要結合搭配物C中之每一者能夠與結合位點Z中之一者相互作用，諸如特異性結合。在一些實施例中，試劑為抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或類似物(諸如中性抗生物素蛋白)或其混合物，其中此類試劑含有一或多個用於與結合搭配物C可逆締合之結合位點Z。在一些實施例中，結合搭配物C可為生物素、生物素衍生物或類似物、或抗生蛋白鏈菌素結合肽或其他能夠特異性結合至抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突變蛋白或類似物之分子。在一些實施例中，試劑為或含有抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素之類似物或突變蛋白，或類似物或突變蛋白或抗生物素蛋白，其可逆地結合生物素、生物素類似物或其生物學活性片段。在一些實施例中，試劑為或含有抗生蛋白鏈菌素之類似物或突變蛋白或抗生物素蛋白之類似物或突變蛋白，其可逆地結合抗生蛋白鏈菌素結合肽。在一些實施例中，物質(例如競爭性試劑)可為能夠與結合搭配物C競爭結合一或多個結合位點Z之生物素、生物素衍生物或類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽。在一些實施例中，結合搭配物C及物質(例如競爭性試劑)不同，且相較於結合搭配物之親和力，物質(例如競爭性試劑)針對一或多個結合位點Z展現較高結合親和力。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素可為野生型抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物，諸如抗生蛋白鏈菌素樣多肽。同樣，在一些態樣中，抗生物素蛋白包括野生型抗生物素蛋白或抗生物素蛋白之突變蛋白或類似物，諸如中性抗生物素蛋白，一種通常展現更中性pi且可用作天然抗生物素蛋白之替代方案的具有經修飾精胺酸之去糖基化抗生物素蛋白。一般而言，去糖基化、中性形式之抗生物素蛋白包括市售形式之彼等，諸如可購自Sigma Aldrich之「Extravidin」，或例如購自Thermo Scientific或Invitrogen之「NeutrAvidin」。 在一些實施例中，試劑為抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物。在一些實施例中，野生型抗生蛋白鏈菌素(wt-抗生蛋白鏈菌素)具有由Argarana等人, Nucleic Acids Res. 14 (1986) 1871-1882 (SEQ ID NO: 1)所揭示之胺基酸序列。一般而言，抗生蛋白鏈菌素以四個相同亞單位之四聚體形式天然地存在，亦即其為均四聚體，其中各亞單位含有用於生物素、生物素衍生物或類似物或生物素模擬物之單一結合位點。抗生蛋白鏈菌素亞單位之例示性序列為SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列，但此類序列亦可包括存在於來自其他鏈黴菌物種之其同系物中之序列。特定言之，抗生蛋白鏈菌素之各亞單位可展現針對生物素之強結合親和力，其中解離常數(Kd )為近似10- 14 M。在一些情況下，抗生蛋白鏈菌素可以如下形式存在：其中四個結合位點中之僅一者具功能性之單價四聚體(Howarth等人 (2006)Nat . Methods , 3:267-73；Zhang等人 (2015)Biochem . Biophys . Res . Commun ., 463:1059-63))、其中四個結合位點中之兩者具功能性之二價四聚體(Fairhead等人 (2013)J . Mol . Biol ., 426:199-214)，或可以單體或二聚體形式存在(Wu等人 (2005)J . Biol . Chem ., 280:23225-31；Lim等人 (2010)Biochemistry , 50:8682-91)。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素可呈任何形式，諸如野生型或未經修飾之抗生蛋白鏈菌素，諸如來自鏈黴菌物種之抗生蛋白鏈菌素或其功能活性片段，其包括至少一個含有用於生物素、生物素衍生物或類似物或生物素模擬物之結合位點的功能亞單位，諸如一般含有至少一個來自SEQ ID NO: 1中所闡述之親和鏈黴菌之野生型抗生蛋白鏈菌素或其功能活性片段之功能亞單位。舉例而言，在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素可包括野生型抗生蛋白鏈菌素之片段，其在N端及/或C端處縮短。此類最小抗生蛋白鏈菌素包括在N端開始於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置10至16之區域中且在C端終止於SEQ ID NO: 1之胺基酸位置133至142之區域中之任何抗生蛋白鏈菌素。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素之功能活性片段含有SEQ ID NO: 2中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，諸如SEQ ID NO: 2中所闡述之抗生蛋白鏈菌素可在對應於Ala13 (根據SEQ ID NO: 1中所闡述之編號)之位置處另外含有N端甲硫胺酸。抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白中之殘基位置的參考為參考SEQ ID NO: 1中之殘基的編號。 在一些態樣中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白包括多肽，其藉由一或多個胺基酸取代、缺失或添加區別於未經修飾或野生型抗生蛋白鏈菌素之序列，但包括至少一個含有用於生物素、生物素衍生物或類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽之結合位點之功能亞單位。在一些態樣中，抗生蛋白鏈菌素樣多肽及抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可為基本在免疫學上等效於野生型抗生蛋白鏈菌素且尤其能夠以與wt-抗生蛋白鏈菌素相同或不同之親和性結合生物素、生物素衍生物或生物素類似物之多肽。在一些情況下，抗生蛋白鏈菌素樣多肽或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可含有並非野生型抗生蛋白鏈菌素之一部分的胺基酸或其可包括野生型抗生蛋白鏈菌素之僅一部分。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素樣多肽為與野生型抗生蛋白鏈菌素不相同之多肽，因為宿主不具有將宿主產生之多肽轉化為野生型抗生蛋白鏈菌素之結構所需的酶。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素亦可以抗生蛋白鏈菌素四聚體及抗生蛋白鏈菌素二聚體，特定言之抗生蛋白鏈菌素均四聚體、抗生蛋白鏈菌素均二聚體、抗生蛋白鏈菌素雜四聚體及抗生蛋白鏈菌素雜二聚體之形式存在。一般而言，各亞單位通常具有用於生物素或生物素類似物或用於抗生蛋白鏈菌素結合肽之結合位點。抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之實例提及於例如WO 86/02077、DE 19641876 Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606中。 在一些實施例中，生物素一般以其天然d-立體異構形式，亦即D-生物素採用。在一些實施例中，生物素為D-生物素。在特定實施例中，生物素類似物及/或衍生物之實例包括(但不限於)D-生物素、N-酮生物素類似物、酮生物素類似物、N-疊氮化物生物素類似物、疊氮化物生物素類似物、N-醯基疊氮化物生物素類似物、NBD-GABA生物素類似物、1,2-二胺生物素類似物、N-炔烴生物素類似物、四硫醇生物素類似物、N-羥基丁二醯亞胺-亞胺基生物素、亞胺基生物素、醯胺基生物素N-羥基丁二醯亞胺-亞胺基生物素、醯胺基生物素、去硫生物素、生物素碸、己醯基醯胺基生物素及生胞素。在一些態樣中，生物素類似物為或包括生物素碸、2'-硫基生物素、2'-亞胺基生物素、d-去硫生物素、dl-去硫生物素、dl-去硫生物素甲酯及其他咪唑啉酮衍生物及Green, N.M., (1975)於Advances in Protein Chemistry (Anson, M.L.及Edsell, J.T.編), 第29卷, 第85-133頁, Academic Press, New York中所述之彼等。在某些實施例中，生物素類似物或衍生物為D-生物素、去硫生物素及/或亞胺基生物素。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可含有並非未經修飾或野生型抗生蛋白鏈菌素之一部分的胺基酸或可包括野生型或未經修飾之抗生蛋白鏈菌素之僅一部分。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白含有至少一個亞單位，其相較於未經修飾或野生型抗生蛋白鏈菌素之亞單位，諸如相較於SEQ ID NO: 1中所闡述之野生型抗生蛋白鏈菌素亞單位或其功能活性片段(例如SEQ ID NO: 2中所闡述)可具有一或多個胺基酸取代(置換)。在一些實施例中，相較於野生型或未經修飾之抗生蛋白鏈菌素，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之至少一個亞單位可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸差異及/或含有至少一個包含與SEQ ID NO: 1、2或59中所闡述之胺基酸序列展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列的亞單位，其中此類抗生蛋白鏈菌素突變蛋白展現結合生物素、生物素衍生物或類似物或生物素模擬物之功能活性。在一些實施例中，胺基酸置換(取代)為保守或非保守突變。抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之實例為此項技術中已知的，參見例如美國專利第5,168,049號；第5,506,121號；第6,022,951號；第6,156,493號；第6,165,750號；第6,103,493號；或第6,368,813號；或國際公佈PCT申請案第WO2014/076277號。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白包括含有一個或大於一個功能亞單位，諸如兩個或大於兩個、三個或大於三個、四個或大於四個，且在一些情況下，5、6、7、8、9、10、11、12個或更多個功能亞單位之蛋白質，該一或多個功能亞單位含有一或多個用於生物素、生物素衍生物或類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽之結合位點。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可包括單體；二聚體，包括雜二聚體或均二聚體；四聚體，包括均四聚體、雜四聚體、單價四聚體或二價四聚體；或可包括其高階多聚物或寡聚物。 在一些實施例中，用於肽配位體結合搭配物之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之解離常數(Kd )為小於1×10- 4 M、5×10- 4 M、1×10- 5 M、5×10- 5 M、1×10- 6 M、5×10- 6 M或1×10- 7 M，但一般大於1×10- 13 M、1×10- 12 M或1×10- 11 M。舉例而言，諸如美國專利第5,506,121號中所揭示之肽序列(Strep-tag)可充當生物素模擬物且展示針對抗生蛋白鏈菌素之結合親和力，例如以大致10- 4 與10- 5 M之間的Kd 。在一些情況下，可藉由在抗生蛋白鏈菌素分子內製造突變而進一步提高結合親和力，參見例如美國專利第6,103,493號或國際公佈PCT申請案第WO2014/076277號。在一些實施例中，結合親和力可藉由此項技術中已知之方法，諸如本文所述之任何方法測定。 在一些實施例中，用於肽配位體結合搭配物之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之結合親和力為小於1×10- 4 M、5×10- 4 M、1×10- 5 M、5×10- 5 M、1×10- 6 M、5×10- 6 M或1×10- 7 M，但一般大於1×10- 13 M、1×10- 12 M或1×10- 11 M。舉例而言，諸如美國專利第5,506,121號中所揭示之肽序列(Strep-tag)可充當生物素模擬物且展示針對抗生蛋白鏈菌素之結合親和力，例如以大致10- 4 與10- 5 M之間的Kd 。在一些情況下，可藉由在抗生蛋白鏈菌素分子內製造突變而進一步提高結合親和力，參見例如美國專利第6,103,493號或國際公佈PCT申請案第WO2014/076277號。在一些實施例中，結合親和力可藉由此項技術中已知之方法，諸如本文所述之任何方法測定。 在一些實施例中，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之試劑展現針對肽配位體結合搭配物之結合親和力，該肽配位體結合搭配物可為存在於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C。在一些實施例中，肽序列含有具有SEQ ID NO: 9中所闡述之通式之序列，諸如含有SEQ ID NO: 10中所闡述之序列。在一些實施例中，肽序列具有SEQ ID NO: 11中所闡述，諸如SEQ ID NO: 12中所闡述之通式。在一個實例中，肽序列為Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (亦稱為Strep-tag®，闡述於SEQ ID NO: 7中)。在一個實例中，肽序列為Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (亦稱為Strep-tag® II，闡述於SEQ ID NO: 8中)。在一些實施例中，肽配位體含有至少兩個抗生蛋白鏈菌素結合模組之連續配置，其中兩個模組之間的距離為至少0個且不超過50個胺基酸，其中一個結合模組具有3至8個胺基酸且含有至少序列His-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 9)，其中Xaa為麩醯胺酸、天冬醯胺或甲硫胺酸，且其中另一結合模組具有相同或不同抗生蛋白鏈菌素肽配位體，諸如SEQ ID NO: 11中所闡述(參見例如國際公佈PCT申請案第WO02/077018號；美國專利第7,981,632號)。在一些實施例中，肽配位體含有具有SEQ ID NO: 13或14中之任一者中所闡述之式之序列。在一些實施例中，肽配位體具有SEQ ID NO: 15-19中之任一者中所闡述之胺基酸之序列。在大多數情況下，所有此等抗生蛋白鏈菌素結合肽結合至相同結合位點，即抗生蛋白鏈菌素之生物素結合位點。若此類抗生蛋白鏈菌素結合肽中之一或多者用作結合搭配物C，例如C1及C2，則多聚化試劑通常為抗生蛋白鏈菌素突變蛋白。 在一些實施例中，試劑為或含有抗生蛋白鏈菌素突變蛋白。在一些實施例中，相較於SEQ ID NO: 1中所闡述之野生型抗生蛋白鏈菌素或其生物學有效部分，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白含有一或多個突變(例如胺基酸置換)。舉例而言，抗生蛋白鏈菌素之生物學活性部分可包括在N端及/或C端處縮短之抗生蛋白鏈菌素變異體，其在一些情況下稱為最小抗生蛋白鏈菌素。在一些實施例中，可進行突變中之任一者之N端縮短之最小抗生蛋白鏈菌素在N端開始於相較於SEQ ID NO: 1中所闡述之序列的胺基酸位置10至16之區域中且在C端終止於胺基酸位置133至142之區域中。在一些實施例中，可進行突變中之任一者之N端縮短之抗生蛋白鏈菌素含有SEQ ID NO: 2或59中所闡述之胺基酸序列。在一些實施例中，最小抗生蛋白鏈菌素含有位置Ala13至Ser139之胺基酸序列且視情況具有N端甲硫胺酸殘基而非Ala13。出於本文之目的，胺基酸位置之編號通篇係指SEQ ID NO: 1中所闡述之wt-抗生蛋白鏈菌素之編號(例如Argarana等人, Nucleic Acids Res. 14 (1986), 1871 -1882，亦參見圖9)。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白為如美國專利第6,103,493號中所述之突變體。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白在基於諸如SEQ ID NO: 1中所闡述之野生型抗生蛋白鏈菌素之胺基酸序列之胺基酸位置44至53之區域內含有至少一個突變。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白在一或多個殘基44、45、46及/或47處含有一個突變。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白經疏水性脂族胺基酸(例如Val、Ala、Ile或Leu)、位置45處之任何胺基酸、脂族胺基酸(諸如位置46處之疏水性脂族胺基酸)置換野生型抗生蛋白鏈菌素之Glu位置44，及/或經鹼性胺基酸，例如Arg或Lys，諸如一般而言Arg置換位置47處之Val。在一些實施例中，Ala為位置46及/或Arg為位置47及/或Val或Ile為位置44。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變體含有殘基Val44 -Thr45 -Ala46 -Arg47 ，諸如含有SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4或60中所闡述之胺基酸序列之例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白中所闡述(亦稱為抗生蛋白鏈菌素突變體1，SAM1)。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白含有殘基Ile44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 ，諸如含有SEQ ID NO: 5、6或61中所闡述之胺基酸序列之例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白中所闡述(亦稱為SAM2)。在一些情況下，此類抗生蛋白鏈菌素突變蛋白描述於例如美國專利6,103,493中，且以商標Strep-Tactin®市售。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白為如國際公佈PCT申請案第WO 2014/076277號中所述之突變體。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白在參考SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸位置之胺基酸位置44至53之區域中含有至少兩個半胱胺酸殘基。在一些實施例中，半胱胺酸殘基存在於位置45及52處以產生連接此等胺基酸之二硫橋鍵。在此實施例中，胺基酸44通常為甘胺酸或丙胺酸且胺基酸46通常為丙胺酸或甘胺酸且胺基酸47通常為精胺酸。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白在參考SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸位置之胺基酸殘基115至121之區域中含有至少一個突變或胺基酸差異。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白含有胺基酸位置117、120及121處之至少一個突變及/或胺基酸118及119之缺失及至少胺基酸位置121之取代。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白在對應於位置117之位置處含有突變，該突變可針對大型疏水性殘基，如Trp、Tyr或Phe，或帶電殘基，如Glu、Asp或Arg，或親水性殘基，如Asn或Gln，或在一些情況下，疏水性殘基Leu、Met或Ala，或極性殘基Thr、Ser或His。在一些實施例中，位置117處之突變與對應於位置120之位置處之突變組合，該突變可針對小型殘基，如Ser或Ala或Gly，及對應於位置121之位置處之突變，該突變可針對疏水性殘基，諸如大型疏水性殘基，如Trp、Tyr或Phe。在一些實施例中，突變位置117與以下各者組合：對應於SEQ ID NO: 1中所闡述之野生型抗生蛋白鏈菌素或其生物學活性片段之位置120之位置處之突變，該突變可為疏水性殘基，諸如Leu、Ile、Met或Val，或一般而言，Tyr或Phe，及對應於相較於SEQ ID NO: 1中所闡述之野生型抗生蛋白鏈菌素或其生物學活性片段之位置之位置121的位置處之突變，該突變可針對小型殘基，如Gly、Ala或Ser，或與Gln，或與疏水性殘基，如Leu、Val、Ile、Trp、Tyr、Phe或Met。在一些實施例中，此類突變蛋白亦可含有殘基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或殘基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白含有殘基Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120及Tyr121。在一些實施例中，突變蛋白抗生蛋白鏈菌素含有SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 28中所闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 27或SEQ ID NO: 28中所闡述之胺基酸序列展現至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列，含有殘基Val44、Thr45、Ala46、Arg47、Glu117、Gly120及Tyr121且展現結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽之功能性、活性。 在一些實施例中，分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白具有約5至30個一級胺，其在一些情況下可包括N端胺及/或一或多個離胺酸殘基。在特定實施例中，分子為抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白，包括所述抗生蛋白鏈菌素突變蛋白中之任一者之四聚體，其作為四聚體，含有大於5個一級胺，諸如一般而言5至40或15至35個，諸如一般而言約15、16、17、18、19、20、21、22、23、14、25、26、27、28、29、30、31、32或大於32個一級胺。在一些實施例中，分子為抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或其截短片段，諸如此類所述分子中之任一者。在特定實施例中，分子為包含SEQ ID NO: 2、4、6、27、59、60或61中之任一者中所闡述之序列之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之四聚體，其作為四聚體，為每一單體含有20個一級胺，包括1個N端胺及4個離胺酸之分子。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可含有呈任何組合之以上突變中之任一者，且所得抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可展現藉由解離常數(Kd )表徵之結合親和力，該解離常數針對肽配位體(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；亦稱為Strep-tag®，闡述於SEQ ID NO: 7中)為或小於3.7×10- 5 M，及/或針對肽配位體(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；亦稱為Strep-tag® II，闡述於SEQ ID NO: 8中)為小於7.1×10- 5 M，及/或針對SEQ ID NO: 7-19中之任一者中所闡述之肽配位體中之任一者為小於1×10- 4 M、5×10- 4 M、1×10- 5 M、5×10- 5 M、1×10- 6 M、5×10- 6 M或1×10- 7 M，但一般大於1×10- 13 M、1×10- 12 M或1×10- 11 M。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可含有呈任何組合之以上突變中之任一者，且所得抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可展現藉由締合常數表徵之結合親和力，該締合常數針對肽配位體(Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly；亦稱為Strep-tag®，闡述於SEQ ID NO: 7中)為或小於2.7×10- 4 M，及/或針對肽配位體(Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys；亦稱為Strep-tag® II，闡述於SEQ ID NO: 8中)為小於1.4×10- 4 M，及/或針對SEQ ID NO: 7-19中之任一者中所闡述之肽配位體中之任一者為小於1×10- 4 M、5×10- 4 M、1×10- 5 M、5×10- 5 M、1×10- 6 M、5×10- 6 M或1×10- 7 M，但一般大於1×10- 13 M、1×10- 12 M或1×10- 11 M。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可含有呈任何組合之以上突變中之任一者，且所得抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可展現針對肽配位體(Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly；亦稱為Strep-tag®，闡述於SEQ ID NO: 7中)為小於2.7×10- 4 M，及/或針對肽配位體(Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys；亦稱為Strep-tag® II，闡述於SEQ ID NO: 8中)為小於1.4×10- 4 M，及/或針對SEQ ID NO: 7-19中之任一者中所闡述之肽配位體中之任一者為小於1×10- 4 M、5×10- 4 M、1×10- 5 M、5×10- 5 M、1×10- 6 M、5×10- 6 M或1×10- 7 M，但一般大於1×10- 13 M、1×10- 12 M或1×10- 11 M之結合親和力。 在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白展現SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者中所闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者中所闡述之胺基酸序列展現至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性之胺基酸序列且展現針對肽配位體(Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly；亦稱為STREP-TAG®，闡述於SEQ ID NO: 7中)為小於2.7×10- 4 M，及/或針對肽配位體(Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys；亦稱為STREP-TAG® II，闡述於SEQ ID NO: 8中)為小於1.4×10- 4 M，及/或針對SEQ ID NO: 7-19中之任一者中所闡述之肽配位體中之任一者為小於1×10- 4 M、5×10- 4 M、1×10- 5 M、5×10- 5 M、1×10- 6 M、5×10- 6 M或1×10- 7 M，但一般大於1×10- 13 M、1×10- 12 M或1×10- 11 M之結合親和力。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白亦展現與其他抗生蛋白鏈菌素配位體，諸如(但不限於)生物素、亞胺基生物素、類脂酸、去硫生物素、二胺基生物素、HABA (羥基偶氮苯-苯甲酸)及/或二甲基-HABA之結合。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白展現針對另一抗生蛋白鏈菌素配位體，諸如生物素或去硫生物素之結合親和力，該結合親和力大於抗生蛋白鏈菌素突變蛋白針對諸如SEQ ID NO: 7-19中之任一者中所闡述之生物素模擬肽配位體之結合親和力。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白展現針對另一抗生蛋白鏈菌素配位體，諸如生物素或去硫生物素之結合親和力，該結合親和力與抗生蛋白鏈菌素突變蛋白針對諸如SEQ ID NO: 7-19中之任一者中所闡述之生物素模擬肽配位體之結合親和力相同、大約相同或更低。在一些實施例中，生物素或生物素類似物或衍生物(例如去硫生物素)可用作所提供方法中之競爭試劑。舉例而言，作為實例，稱為Strep-tactin® 之突變蛋白抗生蛋白鏈菌素(例如含有SEQ ID NO: 4或60中所闡述之數列)與稱為STREP-TAG® II之肽配位體(例如闡述於SEQ ID NO: 8中)之相互作用之特徵在於相較於針對生物素-抗生蛋白鏈菌素相互作用之大致10- 13 M，Kd 為大致10- 6 M之結合親和力。在一些情況下，可以高親和力，以10- 10 與10- 13 M之間或約10- 10 與10- 13 M之間的Kd 與Strep-Tactin® 結合之生物素可與STREP-TAG® II競爭結合位點。 在一些情況下，試劑含有至少兩個可能能夠結合至過渡金屬離子之螯合基團K。在一些實施例中，試劑可能能夠結合至寡組胺酸親和標籤、麩胱甘肽-S-轉移酶、調鈣蛋白或其類似物、調鈣蛋白結合肽(CBP)、FLAG-肽、HA-標籤、麥芽糖結合蛋白(MBP)、HSV抗原決定基、myc抗原決定基及/或生物素標記之載劑蛋白。 在一些實施例中，試劑為寡聚物或聚合物。在一些實施例中，寡聚物或聚合物可藉由直接地或間接地鍵聯天然存在形式之蛋白質之個別分子，藉由直接地或間接地鍵聯構成個別分子之亞單位之單體或複合物之個別分子(例如直接地或間接地鍵聯天然存在形式之蛋白質之二聚體、三聚體四聚體等)而產生。舉例而言，在一些實施例中，四聚抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白可稱為各別寡聚物或聚合物之個別分子或最小建構嵌段。在特定實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白之四聚均二聚體或雜二聚體可稱為各別寡聚物或聚合物之個別分子或最小建構嵌段。在一些實施例中，寡聚物或聚合物可含有蛋白質之至少2個個別分子之鍵(例如為2-單體單元)，或可為蛋白質之個別分子(例如單體、四聚體)之至少3-單體單元、4-單體單元、5-單體單元、6-單體單元、7-單體單元、8-單體單元、9-單體單元、10-單體單元、11-單體單元、12-單體單元、13-單體單元、14-單體單元、15-單體單元、16-單體單元、17-單體單元、18-單體單元、19-單體單元、20-單體單元、25-單體單元、30-單體單元、35-單體單元、40-單體單元、45-單體單元或50-單體單元。在某些實施例中，寡聚物可為蛋白質之個別分子之至少100-單體單元、200-單體單元、300-單體單元、400-單體單元、500-單體單元、1,000-單體單元、1,500-單體單元、2,000-單體單元、2,500-單體單元、3,000-單體單元或至少3,500-單體單元。在一些實施例中，試劑為第II(A)(1)或(2)部分中所述之寡聚粒子試劑，或為藉由第II(B)(3)部分中所述之方法製造之寡聚粒子試劑。 寡聚物可使用此項技術中已知之任何方法產生，諸如公佈之美國專利申請案第US2004/0082012號中所述之任何方法。在一些實施例中，寡聚物或聚合物含有兩個或大於兩個可藉由諸如多醣或雙官能連接子交聯之個別分子。在一些實施例中，寡聚物或聚合物係藉由在多醣存在下交聯個別分子或構成個別分子之亞單位之複合物獲得。在一些實施例中，寡聚物或聚合物可藉由將羧基殘基引入至多醣，例如聚葡萄糖中而製備。在一些態樣中，試劑之個別分子(例如單體、四聚體)可使用習知碳化二亞胺化學經由內部離胺酸殘基之第一胺基及/或自由N端偶合至聚葡萄糖主鏈中之羧基。在一些實施例中，以每莫耳聚葡萄糖約60莫耳試劑之個別分子(例如單體、四聚體)之莫耳比進行偶合反應。在一些實施例中，試劑為一或多種抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素之任何類似物或突變蛋白或抗生物素蛋白之類似物(例如中性抗生物素蛋白)或突變蛋白之寡聚物或聚合物。在一些實施例中，結合位點Z為可在個別分子中存在至多四個結合位點之抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素之天然生物素結合位點，藉此均四聚體可含有至多4個相同的結合位點，亦即Z1，而雜四聚體可含有至多4個可不同之結合位點，例如含有Z1和Z2。在一些實施例中，寡聚物產生或生產自相同抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突變蛋白之複數個個別分子(例如複數個均四聚體)，在此情況下寡聚物之各結合位點Z，例如Z1相同。舉例而言，在一些情況下，寡聚物可含有複數個結合位點Z1，諸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50或大於50個結合位點Z1。在一些實施例中，寡聚物產生或生產自複數個可為抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突變蛋白之雜四聚體之個別分子及/或複數個在結合位點Z，例如Z1及Z2不同之抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突變蛋白之兩個或大於兩個不同個別分子(例如不同均四聚體)，在此情況下，複數個不同結合位點Z，例如Z1和Z2可存在於寡聚物中。舉例而言，在一些情況下，寡聚物可含有複數個結合位點Z1及複數個結合位點Z，其組合地可包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50或大於50個組合的結合位點Z1及Z2。 在一些情況下，各別寡聚物或聚合物可藉由多醣交聯。在一個實施例中，抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白之類似物(例如中性抗生物素蛋白)之寡聚物或聚合物可藉由將羧基殘基引入至多醣，例如聚葡萄糖中而製備，基本上如Noguchi, A等人, Bioconjugate Chemistry (1992) 3,132-137在第一步驟中所述。在一些此類態樣中，抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白或其類似物可接著在第二步驟中使用習知碳化二亞胺化學經由內部離胺酸殘基之第一胺基及/或自由N端連接至聚葡萄糖主鏈中之羧基。在一些情況下，抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白之任何類似物之交聯寡聚物或聚合物亦可藉由經由雙官能分子交聯、充當諸如戊二醛之連接子或藉由此項技術中描述之其他方法獲得。 在一些實施例中，寡聚物或聚合物係藉由使用雙官能連接子或其他化學連接子，諸如戊二醛交聯個別分子或構成個別分子之亞單位之複合物或藉由此項技術中已知之其他方法獲得。在一些態樣中，抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白之任何突變蛋白或類似物之交聯寡聚物或聚合物可藉由經由雙官能分子交聯個別抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白分子、充當諸如戊二醛之連接子或藉由此項技術中描述之其他方法獲得。舉例而言，有可能藉由將硫醇基引入至抗生蛋白鏈菌素突變蛋白中(此可例如藉由使抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑(Trauts reagent))反應而進行)及藉由例如在獨立反應中活化抗生蛋白鏈菌素突變蛋白中可用之胺基而產生抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之寡聚物。在一些實施例中，胺基之此活化可藉由使抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與市售雜雙官能基交聯劑，諸如4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基SMCC)或6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)反應來達成。在一些此類實施例中，將由此獲得之兩種反應產物混合在一起，通常導致包含於一批改性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白中之硫醇基與另一批改性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之活化(諸如藉由順丁烯二醯亞胺官能基)胺基酸反應。在一些情況下，藉由此反應，形成抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之多聚物/寡聚物。此等寡聚物可具有任何適合數目的個別分子，諸如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、45、50、100、200、300、400、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000或更大，且寡聚程度可根據反應條件而變化。在一些實施例中，寡聚或聚合試劑可經由尺寸排阻層析法分離且任何所需部分可用作試劑。舉例而言，在一些實施例中，在2-亞胺基硫雜環戊烷及諸如磺基SMCC之雜雙官能基交聯劑存在下使改性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白反應之後，寡聚或聚合試劑可經由尺寸排阻層析法分離且任何所需部分可用作試劑。在一些實施例中，寡聚物不具有(且不需要具有)單一分子量，但其可觀測到統計重量分佈，諸如高斯分佈。在一些情況下，任何具有超過三個抗生蛋白鏈菌素或突變蛋白四聚體，例如均四聚體或雜四聚體可用作試劑，諸如一般3至50個四聚體，例如均四聚體或雜四聚體，10至40個四聚體，例如均四聚體或雜四聚體，或25至35個四聚體，例如均四聚體或雜四聚體。寡聚物可具有例如3至25個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體，例如均四聚體或雜四聚體。在一些態樣中，在抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之分子量為約50 kDa之情況下，寡聚物之分子量可為約150 kDa至約2000 kDa、約150 kDa至約1500 kDa、約150 kDa至約1250 kDa、約150 kDa至1000 kDa、約150 kDa至約500 kDa或約150 kDa至約300 kDa、約300 kDa至約2000 kDa、約300 kDa至約1500 kDa、約300 kDa至約1250 kDa、約300 kDa至1000 kDa、約300 kDa至約500 kDa、約500 kDa至約2000 kDa、約500 kDa至約1500 kDa、約500 kDa至約1250 kDa、約500 kDa至1000 kDa、約1000 kDa至約2000 kDa、約1000 kDa至約1500 kDa、約1000 kDa至約1250 kDa、約1250 kDa至約2000 kDa或約1500 kDa至約2000 kDa。在一些實施例中，寡聚物之分子量大於2,000 kDa。一般而言，由於各抗生蛋白鏈菌素分子/突變蛋白具有四個生物素結合位點，此類試劑可提供12至160個結合位點Z，諸如12至160個或更多個結合位點Z。在一些實施例中，寡聚物為可溶試劑。 1. 寡聚物粒子試劑 本文提供由複數個分子組成及/或含有複數個分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，寡聚粒子試劑為可溶試劑。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有至少一個可逆地結合至或能夠可逆地結合至一或多種試劑，例如刺激劑及/或選擇劑之結合位點。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有複數個能夠可逆地結合至一或多種試劑之結合位點，例如在連接至一或多種試劑之結合搭配物，例如結合搭配物C上之位點處。在一些實施例中，寡聚粒子試劑可逆地結合至一或多種試劑。在特定實施例中，寡聚物粒子試劑為藉由第II(B)部分中所述之方法中之任一者製造、生產或產生之寡聚粒子。 在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑由作為蛋白質、多肽、肽之寡聚分子及/或含有或包括一或多種胺基酸之分子組成及/或含有該等分子。在一些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有寡聚分子及/或由寡聚分子組成，該等寡聚分子含有複數個能夠結合至一或多種試劑，例如受體結合劑之結合位點。在一些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有複數個能夠結合至第 II(B)(4)部分及/或第II(B)(5)部分中所述之試劑的結合位點。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有複數個在連接至一或多種試劑之結合搭配物，例如結合搭配物C內之一個位點處結合至或能夠結合至一或多種試劑之結合位點。在特定實施例中，經寡聚之分子含有複數個能夠結合至第II(A)部分中所述之結合搭配物C之結合位點。在一些實施例中，經寡聚之分子為或包括抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或類似物(諸如中性抗生物素蛋白)。在某些實施例中，抗生蛋白鏈菌素為呈天然狀態之四聚體。因此在某些實施例中，分子為抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或類似物(諸如中性抗生物素蛋白)之四聚體。在特定實施例中，寡聚粒子試劑含有複數種第II(A)部分中所述之試劑中之任一者或多者。 在特定實施例中，寡聚粒子試劑之尺寸係藉由此項技術中已知之任何適合之方法測定。在一些實施例中，寡聚粒子試劑之質量及/或分子量係藉由此項技術中之任何適合之方法測定，包括(但不限於)電泳(例如SDS-PAGE)、層析(例如凝膠過濾層析或SEC)或質譜。在一些實施例中，寡聚粒子試劑之尺寸，例如半徑係藉由動態光散射技術(DLS)測定。在一些實施例中，尺寸，例如半徑係藉由流場流分離(F4)技術測定。在某些實施例中，F4可用於基於獨立於粒子密度之尺寸來分離及量測粒子。在某些實施例中，粒度係藉由不對稱流場流分離(AF4)來量測。在一些實施例中，粒子之尺寸可藉由量測粒子之直徑或半徑測定。在某些實施例中，粒子之尺寸可藉由量測粒子之流體動力學半徑或回轉半徑測定。在某些實施例中，半徑係由動態光散射技術測定。在某些實施例中，半徑，例如流體動力學半徑及/或斯托克斯半徑(Stokes radius)可由層析技術，例如尺寸排阻層析法SEC)測定。 在特定實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑之半徑，例如平均半徑為至少5 nm、至少10 nm、至少15 nm、至少20 nm、至少25 nm、至少30 nm、至少35 nm、至少40 nm、至少45 nm、至少50 nm、至少55 nm、至少60 nm、至少65 nm、至少70 nm、至少75 nm、至少80 nm、至少85 nm、至少90 nm、至少95 nm、至少100 nm、至少105 nm、至少110 nm、至少115 nm、至少120 nm、至少125 nm、至少130 nm、至少135 nm、或至少140 nm。在某些實施例中，寡聚粒子試劑之半徑在5 nm與150 nm之間、在25 nm與150 nm之間、在50 nm與150 nm之間、在75 nm與125 nm之間、在80 nm與140 nm之間、在85 nm與135 nm之間、在80 nm與120 nm之間、在80 nm與115 nm之間或在90 nm與110 nm之間(含上下限值)。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑之半徑為約85 nm、約86 nm、約87 nm、約88 nm、約89 nm、約90 nm、約91 nm、約92 nm、約93 nm、約94 nm、約95 nm、約96 nm、約97 nm、約98 nm、約99 nm、約100 nm、約101 nm、約102 nm、約103 nm、約104 nm、約105 nm、約106 nm、約107 nm、約108 nm、約109 nm、約110 nm、約111 nm、約112 nm、約113 nm、約114 nm或約115 nm。在某些實施例中，粒子之半徑在80 nm與115 nm之間(含上下限值)。 在一些實施例中，半徑為流體動力學半徑、回轉半徑、斯托克斯半徑、斯托克斯-愛因斯坦半徑(Stokes-Einstein radius)及/或溶液中之有效水合半徑。在某些實施例中，半徑為流體動力學半徑。在一些實施例中，半徑為斯托克斯半徑。在特定實施例中，流體動力學半徑為斯托克斯半徑。在一些實施例中，半徑為複數個粒子之平均值、中值及/或平均半徑。 在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑之分子量為至少2×106 g/mol、×106 g/mol、5×106 g/mol、1×107 g/mol、至少5×107 g/mol、至少1×108 g/mol、至少1.25×108 g/mol、至少1.5×108 g/mol、至少2×108 g/mol或至少5×108 g/mol。在一些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑之分子量在1×106 g/mol與1×1010 g/mol之間、在2×106 g/mol與1×1010 g/mol之間、在1×107 g/mol與1×109 g/mol之間、在5×107 g/mol與5×108 g/mol之間、在7.5×107 g/mol與2.5×108 g/mol之間、在2.5×107 g/mol與2.75×108 g/mol之間、在1×108 g/mol與5×108 g/mol之間、在7.5×107 g/mol與5×108 g/mol之間或在1×108 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)。在特定實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑之分子量為約7.5×107 g/mol、約8.0×107 g/mol、約9.0×107 g/mol、約1.0×108 g/mol、約1.1×108 g/mol、約1.2×108 g/mol、約1.3×108 g/mol、約1.4×108 g/mol、約1.5×108 g/mol、約1.6×108 g/mol、約1.7×108 g/mol、約1.8×108 g/mol、約1.9×108 g/mol、約2.0×108 g/mol、約2.1×108 g/mol、約2.2×108 g/mol、約2.3×108 g/mol、約2.4×108 g/mol或約2.5×108 g/mol。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑之分子量在5×107 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)。 在一些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑由至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,100、至少1,200、至少1,300、至少1,400、至少1,500、至少1,600、至少1,700、至少1,800、至少1,900、至少2,200、至少2,300、至少2,400、至少2,500、至少2,600、至少2,700、至少2,800、至少2,900、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少10,000、或至少20,000個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有該等抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在特定實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有及/或由100與50,000之間、500與10,000之間、1,000與20,000之間、500與5,000之間、300與7,500之間、1,500與7,500之間、500與3,500之間、1,000與5,000之間、1,500與2,500之間、1,500與2,500之間、2,000與3,000之間、2,500與3,500之間、2,000與4,000之間或2,000與5,000之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成。在一些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑由約2,000與3,500個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有該等抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在一些實施例中，本文提供由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有複數個可逆地結合至或能夠可逆地結合至一或多種試劑，例如刺激劑及/或選擇劑之結合位點。在一些實施例中，寡聚粒子具有25 nm與150 nm之間(含上下限值)的半徑；2×106 g/mol與1×1010 g/mol之間的分子量；及/或500 與10,000之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在特定實施例中，本文提供由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有複數個可逆地結合至或能夠可逆地結合至一或多種試劑，例如刺激劑及/或選擇劑之結合位點。在一些實施例中，寡聚粒子具有70 nm與125 nm之間(含上下限值)的半徑，例如平均半徑；1×107 g/mol與1×109 g/mol之間(含上下限值)的分子量；及/或1,000與5,000個之間(含上下限值)的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在一些實施例中，本文提供由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，本文提供之寡聚粒子試劑含有複數個可逆地結合至或能夠可逆地結合至一或多種試劑，例如刺激劑及/或選擇劑之結合位點。在一些實施例中，寡聚粒子具有80 nm與120 nm之間(含上下限值)的半徑，例如平均半徑；7.5×106 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)的分子量，例如平均分子量；及/或500與10,000個之間(含上下限值)的量，例如平均量之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 2. 寡聚粒子試劑之組合物 本文提供含有寡聚粒子試劑，例如複數種寡聚粒子試劑之組合物，該等寡聚粒子試劑由複數個分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有該等分子。在一些實施例中，本文提供之組合物含有複數種本文所述之寡聚粒子試劑中之任一者。在特定實施例中，組合物含有複數種第II(A)(1)部分中所述之寡聚粒子試劑中之任一者。在一些實施例中，組合物含有複數種藉由第II(B)部分中所述之方法中之任一者製造、生產及/或產生之寡聚粒子試劑。 在特定實施例中，組合物含有具有平均、平均值及/或中值尺寸之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，組合物含有平均、平均值或中值半徑為至少25 nm、至少30 nm、至少35 nm、至少40 nm、至少45 nm、至少50 nm、至少55 nm、至少60 nm、至少65 nm、至少70 nm、至少75 nm、至少80 nm、至少85 nm、至少90 nm、至少95 nm、至少100 nm、至少105 nm、至少110 nm、至少115 nm、至少120 nm、至少125 nm、至少130 nm、至少135 nm、或至少140 nm之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，組合物含有平均、平均值或中值半徑在5 nm與150 nm之間、在25 nm與150 nm之間、在50 nm與150 nm之間、在75 nm與125 nm之間、在80 nm與140 nm之間、在85 nm與135 nm之間、在80 nm與120 nm之間、在80 nm與115 nm之間或在90 nm與110 nm之間(含上下限值)的寡聚粒子試劑。 在一些實施例中，組合物含有平均、平均值或中值半徑為90 nm±25 nm、90 nm±20 nm、90 nm±15 nm、90 nm±10 nm、90 nm±5 nm、95 nm±25 nm、95 nm±20 nm、95 nm±15 nm、95 nm±10 nm、95 nm±5 nm、97 nm±20 nm、97 nm±15 nm、97 nm±10 nm、97 nm±5 nm之寡聚粒子試劑。 在某些實施例中，組合物含有平均、平均值或中值半徑為約85 nm、約86 nm、約87 nm、約88 nm、約89 nm、約90 nm、約91 nm、約92 nm、約93 nm、約94 nm、約95 nm、約96 nm、約97 nm、約98 nm、約99 nm、約100 nm、約101 nm、約102 nm、約103 nm、約104 nm、約105 nm、約106 nm、約107 nm、約108 nm、約109 nm、約110 nm、約111 nm、約112 nm、約113 nm、約114 nm或約115 nm之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，組合物含有平均、平均值或中值半徑在80 nm與115 nm之間(含上下限值)的寡聚粒子試劑。 在某些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑之平均、平均值或中值分子量為至少2×106 g/mol、3×106 g/mol、5×106 g/mol、1×107 g/mol、至少5×107 g/mol、至少1×108 g/mol、至少1.25×108 g/mol、至少1.5×108 g/mol、至少2×108 g/mol或至少5×108 g/mol。在一些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑之平均、平均值或中值分子量在1×106 g/mol與1×1010 g/mol之間、在2×106 g/mol與1×1010 g/mol之間、在1×107 g/mol與1×109 g/mol之間、在5×107 g/mol與5×108 g/mol之間、在7.5×107 g/mol與2.5×108 g/mol之間、在2.5×107 g/mol與2.75×108 g/mol之間、在1×108 g/mol與5×108 g/mol之間、在7.5×107 g/mol與5×108 g/mol之間或在1×108 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)。在特定實施例中，組合物之寡聚粒子試劑之平均、平均值或中值分子量為約7.5×107 g/mol、約8.0×107 g/mol、約9.0×107 g/mol、約1.0×108 g/mol、約1.1×108 g/mol、約1.2×108 g/mol、約1.3×108 g/mol、約1.4×108 g/mol、約1.5×108 g/mol、約1.6×108 g/mol、約1.7×108 g/mol、約1.8×108 g/mol、約1.9×108 g/mol、約2.0×108 g/mol、約2.1×108 g/mol、約2.2×108 g/mol、約2.3×108 g/mol、約2.4×108 g/mol或約2.5×108 g/mol。在某些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑之平均、平均值或中值分子量在5×107 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)。 在一些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑各自由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在某些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑由平均、平均值或中值量為至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1,000、至少1,100、至少1,200、至少1,300、至少1,400、至少1,500、至少1,600、至少1,700、至少1,800、至少1,900、至少2,200、至少2,300、至少2,400、至少2,500、至少2,600、至少2,700、至少2,800、至少2,900、至少3,000、至少4,000、至少5,000、至少10,000、或至少20,000之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有該等抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在特定實施例中，組合物之寡聚粒子試劑含有及/或由平均、平均值或中值量在100與50,000之間、500與10,000之間、1,000與20,000之間、500與5,000之間、300與7,500之間、1,500與7,500之間、500與3,500之間、1,000與5,000之間、1,500與2,500之間、1,500與2,500之間、2,000與3,000之間、2,500與3,500之間、2,000與4,000之間或2,000與5,000之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成。在一些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑由平均、平均值或中值量在約2,000與3,500之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有該等抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在一些實施例中，組合物含有具有一定尺寸分佈之寡聚粒子試劑。在一些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑具有尺寸分佈，其中至少70%、80%、90%、或95%的組合物之寡聚粒子試劑之尺寸在組合物之寡聚粒子試劑之中值或平均值尺寸之±100%、±90%、±80%、±70%、±60%、±50%、±40%、±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.01%、或±0.001%內。在某些實施例中，尺寸係藉由寡聚粒子試劑之分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之半徑、分子量或數目來量測。 在一些實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之半徑在組合物之寡聚粒子試劑之中值或平均值半徑之±100%、±90%、±80%、±70%、±60%、±50%、±40%、±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.01%、或±0.001%內。在特定實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之半徑在10 nm與250 nm之間、在25 nm與200 nm之間、在50與150 nm之間、在70 nm與140 nm之間、在70與130 nm之間、在70與100 nm之間、在80 nm與110 nm之間、在80 nm與120 nm之間、在80 nm與115 nm之間、在80 nm與100 nm之間、在90與120 nm之間、在90 nm與110 nm之間、在100 nm與120 nm之間或在85及/或115 nm之間(含上下限值)。在特定實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之半徑在組合物之寡聚粒子試劑之平均值半徑之±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±1%內。 在特定實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之分子量在組合物之寡聚粒子試劑之中值或平均值分子量之±100%、±90%、±80%、±70%、±60%、±50%、±40%、±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.01%、或±0.001%內。在一些實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之分子量在2×106 g/mol與1×1010 g/mol之間、在1×106 g/mol與1×108 g/mol之間、在1×107 g/mol與1×109 g/mol之間、在1×108 g/mol與1×1010 g/mol之間、在1×108 g/mol與1×109 g/mol之間、在5×107 g/mol與5×108 g/mol之間、在1×109 g/mol與1×1010 g/mol之間、在1×107 g/mol與×108 g/mol之間、在7.5×107 g/mol與2.5×108 g/mol之間、在5×107 g/mol與2.5×108 g/mol之間、在1×108 g/mol與3×108 g/mol之間、在7.0×107 g/mol與3.0×108 g/mol之間或在1×108 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)。在一些實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之分子量在組合物之寡聚粒子試劑之平均值分子量之±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±1%內。 在某些實施例中，組合物之寡聚粒子由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成且至少95%的寡聚粒子試劑由每一寡聚粒子試劑之四聚體之中值或平均值量之±100%、±90%、±80%、±70%、±60%、±50%、±40%、±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.01%或±0.001%之內量的四聚體組成。在一些實施例中，組合物之寡聚粒子，至少95%的寡聚粒子試劑由100與50,000之間、500與10,000之間、1,000與20,000之間、1,000與5,000之間、5,000與10,000之間、10,000與15,000之間、1,500與4,000之間、2,000與4,500之間、2,500與5,000之間、3,000與5,000之間、3,500與5,500之間、4,000與6,000之間或1,500與3,500之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成。在一些實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑由組合物之寡聚粒子試劑之平均值分子量之±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±1%內之量的四聚體組成。 在一些實施例中，將寡聚粒子試劑之組合物儲存一段時間，例如在已製造、生產及/或產生寡聚粒子試劑之後及在添加試劑，例如受體結合劑之前。在某些實施例中，寡聚粒子試劑之組合物儲存於具有中性pH之緩衝液中。在一些實施例中，組合物儲存於獨立等分試樣中。在一些實施例中，寡聚粒子試劑之組合物儲存於處於或低於室溫、處於或低於4℃、處於或低於-20℃或處於或低於-80℃。在某些實施例中，將組合物儲存恰好、大約或至少12小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、18週、20週、22週、24週、26週、27週、28週、30週、32週、34週、36週、38週、40週、42週、44週、46週、48週、50週、52週、60週、70週、80週、90週、12個月、16個月、18個月、24個月、30個月、36個月或超過36個月之時段。在特定實施例中，寡聚粒子試劑之組合物持續、持續大約或持續至少1週、9週、27週或46週儲存於處於或低於4℃。在某些實施例中，寡聚粒子試劑之組合物持續、持續大約或持續至少1週、9週、27週或46週儲存於處於或低於-80℃。在特定實施例中，寡聚粒子之尺寸在儲存期間穩定，例如尺寸不改變或增加超過25%、20%、15%、10%或5%。 在特定實施例中，組合物之寡聚粒子試劑在儲存期間不經歷平均粒度，例如平均值或中值粒度之增加。在某些實施例中，將組合物儲存一段時間且寡聚粒子試劑不經歷超過1%、超過5%、超過10%、超過20%、超過25%、超過30%、超過40%或超過50%之平均尺寸增加。在特定實施例中，組合物持續至少9週、27週或46週儲存於大約或低於4℃、大約或低於-20℃或大約或低於-80℃且不經歷大於1%、5%或10%之平均尺寸增加。在某些實施例中，組合物儲存於大約-80℃下。 在一些實施例中，本文提供由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚粒子試劑之組合物。在某些實施例中，組合物之寡聚粒子試劑各自含有複數個可逆地結合至或能夠可逆地結合至一或多種試劑，例如刺激劑及/或選擇劑之結合位點。在一些實施例中，寡聚粒子試劑具有25 nm與150 nm之間的平均、平均值或中值半徑；2×106 g/mol與1×1010 g/mol之間的平均、平均值或中值分子量；及/或500與10,000之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之平均、平均值或中值量。在某些實施例中，至少70%、80%、90%、或95%的組合物之寡聚粒子試劑之半徑、分子量或四聚體量在組合物之寡聚粒子試劑之平均、平均值或中值半徑、分子量或四聚體量之±100%、±90%、±80%、±70%、±60%、±50%、±40%、±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%內。 在特定實施例中，本文提供寡聚粒子試劑之組合物，該等寡聚粒子試劑由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體且含有複數個可逆地結合至一或多種試劑，例如受體結合劑之結合位點。在一些實施例中，寡聚粒子試劑具有50 nm與150 nm之間的平均、平均值或中值半徑；1×107 g/mol與1×109 g/mol之間的平均、平均值或中值分子量；及/或1,000與5,000之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之平均、平均值或中值量。在某些實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之半徑、分子量或四聚體量在組合物之寡聚粒子試劑之平均、平均值或中值半徑、分子量或四聚體量之±50%、±40%、±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%內。 在一些實施例中，本文提供寡聚粒子試劑之組合物，該等寡聚粒子試劑由複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成及/或含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體且含有複數個可逆地結合至一或多種試劑之結合位點。在一些實施例中，寡聚粒子試劑具有50 nm與150 nm之間的平均、平均值或中值半徑；5×107 g/mol與5×108 g/mol之間的平均、平均值或中值分子量；及/或2,000與4,000之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之平均、平均值或中值量。在某些實施例中，至少95%的組合物之寡聚粒子試劑之半徑、分子量或四聚體量在組合物之寡聚粒子試劑之平均、平均值或中值半徑、分子量或四聚體量之±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%內。在特定實施例中，當儲存於-80℃下至少9週、27週或46週時，寡聚粒子試劑不經歷大於10%之尺寸增加。 在一些實施例中，提供之寡聚試劑中之任一者係藉由下文第II.B部分中所述之用於製造或產生寡聚試劑之方法產生。 B. 製造寡聚粒子試劑本文提供用於產生、生產及/或製造由寡聚試劑，亦即寡聚粒子試劑組成之試劑的方法。在特定實施例中，寡聚粒子試劑含有多個能夠可逆地結合至試劑，例如刺激劑之結合位點。在一些實施例中，寡聚粒子試劑含有多個能夠可逆地結合至試劑，例如刺激劑及/或選擇劑之結合位點，該等試劑識別及/或結合至表現於細胞上之一或多個分子。在某些實施例中，本文所提供之方法適用於產生、生產及/或製造所需或目標尺寸之寡聚粒子試劑。 本文提供用於製造、產生及/或生產為寡聚粒子試劑之試劑的方法。在一些實施例中，本文所提供之方法適用於製造、產生及/或生產含有及/或由複數個分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體組成之寡聚粒子試劑。在一些實施例中，本文所提供之方法係用於製造、產生及/或生產為可溶試劑之寡聚粒子試劑。在一些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括或含有在適合於寡聚分子之條件下培育、處理及/或接觸分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之步驟。在某些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法含有將寡聚粒子試劑與非寡聚分子分離之步驟。在某些實施例中，本文所提供之方法含有使寡聚粒子試劑之一或多種特性，例如粒度穩定化之步驟。 在特定實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法含有寡聚分子之步驟、將寡聚分子自非寡聚分子移除之步驟及/或使寡聚粒子試劑之特性穩定化之步驟。在一些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法含有及/或包括一或多個向分子添加官能基，例如適合於交聯或寡聚反應之官能基之步驟。在某些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法含有及/或包括一或多個向分子添加官能基之步驟及一或多個寡聚分子之步驟。在特定實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法含有及/或包括向分子添加一或多個官能基之步驟、寡聚分子之步驟及將例如寡聚粒子之寡聚分子與非寡聚分子分離之步驟。 在某些實施例中，經寡聚之分子為含有或包括一或多個胺基酸之蛋白質、多肽、肽及/或分子。在一些實施例中，經寡聚之分子含有複數個能夠結合至試劑，例如受體結合劑之結合位點。在一些實施例中，經寡聚之分子含有複數個能夠結合至第II(C)(3)部分中所述之試劑之結合位點。在某些實施例中，經寡聚之分子含有複數個能夠結合至結合搭配物，例如結合搭配物C之結合位點。在特定實施例中，經寡聚之分子含有複數個能夠結合至第II(A)部分中所述之結合搭配物C之結合位點。在一些實施例中，經寡聚之分子為或包括抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或類似物(諸如中性抗生物素蛋白)。在某些實施例中，抗生蛋白鏈菌素為呈天然狀態之四聚體。因此在某些實施例中，分子為抗生蛋白鏈菌素、抗生蛋白鏈菌素突變蛋白或類似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突變蛋白或類似物(諸如中性抗生物素蛋白)之四聚體。在特定實施例中，分子為第II(A)部分中所述之試劑中之任一者。在某些實施例中，分子為第II(A)部分中所述之試劑之四聚體。 特定實施例涵蓋藉由本文所提供之方法製造、生產及/或產生之寡聚粒子試劑之特徵，例如尺寸取決於各種步驟、程序及培育之時序，以及諸如程序之不同步驟或階段處之試劑之pH及溫度及濃度之條件。因此，在特定實施例中，以精確時序及量度進行及/或記錄本文所提供之方法之一或多個步驟或階段，例如以保證當重複本文所提供之方法時，所得經製造之寡聚粒子試劑將於藉由本文所提供之方法生產之其他批次或批料具有相同或類似尺寸及特徵。舉例而言，在一些實施例中，緩衝液及試劑量測為在目標或所需量或濃度之±10%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.1%、±0.01%或±0.001%內。在某些實施例中，在±1、±0.5、±0.1、±0.05、±0.04、±0.03、±0.02、±0.01、±0.001或±0.0001之pH內之所需或目標pH處進行反應，例如培育、處理或接觸。在特定實施例中，在目標或所需時間量之30分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、90秒、60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒或1秒內進行培育、處理或接觸。在特定實施例中，步驟、階段及/或反應，例如培育或處理之間的時間在設定之目標或所需時間之30分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘、4分鐘、3分鐘、2分鐘、90秒、60秒、45秒、30秒、15秒、10秒、5秒或1秒內。 在一些實施例中，用於製造、生產或產生寡聚粒子試劑之本文所提供之方法之特定特徵對於一致地生產寡聚粒子試劑而言重要。舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之方法包括使分子硫醇化之步驟，例如藉由用硫醇化試劑培育分子，且培育之時序、pH及/或試劑濃度及量全部落入目標或所需值之±5%、±2%、±1%、±0.1%、±0.01%或±0.001%內以實現寡聚粒子試劑之一致生產。在某些實施例中，使分子硫醇化之步驟之結束點與寡聚分子(例如藉由培育活化及硫醇化分子)之步驟之間的時間量落入所需或目標時間量之±5%、±2%、±1%、±0.1%、±0.01%或±0.001%內。在一些實施例中，本文所提供之方法包括活化分子之步驟，例如藉由用向分子添加官能基之活化試劑培育分子，且培育之時序、pH及/或試劑濃度及量全部落入目標或所需值之±5%、±2%、±1%、±0.1%、±0.01%或±0.001%內以實現寡聚粒子試劑之一致生產。在特定實施例中，寡聚分子之步驟之時序、pH及/或試劑濃度及量全部落入目標或所需值之±5%、±2%、±1%、±0.1%、±0.01%或±0.001%內以實現寡聚粒子試劑之一致生產。在特定實施例中，寡聚粒子試劑之一致生產導致或包括生產一致批次或批料。因此，在一些實施例中，本文所提供之方法產生寡聚粒子試劑之一致批次或批料。舉例而言，在一些實施例中，本文所提供之方法產生寡聚粒子試劑之批次或批料，其平均粒度，例如平均值或中值粒度落入藉由本文中之方法製造、生產或產生之批料或批次之平均粒度，例如平均值或中值粒度之±50%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±4%、±3%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.01%或±0.001%內。 在某些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括藉由培育、處理及/或接觸分子與活化試劑而活化分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之步驟。在某些實施例中，活化試劑添加或能夠添加在交聯反應中反應或能夠在交聯反應中反應之官能基至分子。在一些實施例中，活化試劑添加或能夠添加官能基至分子之一或多個胺。在一些實施例中，活化試劑添加或能夠添加胺反應性基團、巰基反應性或硫醇反應性基團、醛反應性基團、光反應性基團及/或羥基反應性基團至分子。在一些實施例中，活化試劑添加或能夠添加巰基反應性或硫醇反應性基團至分子。在某些實施例中，活化試劑添加或能夠添加鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基、氮丙啶基、丙烯醯基、芳化劑、乙烯基碸基、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇或二硫化物還原劑至分子。在某些實施例中，活化試劑添加或能夠添加順丁烯二醯亞胺基至分子。在某些實施例中，活化試劑為或含有4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基SMCC)及/或6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)。 在特定實施例中，在適合於活化分子，亦即添加一或多個官能基至分子之條件下培育、處理及/或接觸分子與活化試劑，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在特定實施例中，在中性pH下進行培育、處理或接觸活化試劑與分子。在一些實施例中，在5.0與9.0之間、6.0與8.0之間、6.5與7.5之間或7.0與7.5之間的pH下進行培育、處理或接觸活化試劑與分子。在某些實施例中，在約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4或約7.5之pH下進行培育、處理或接觸活化試劑與分子。在一些實施例中，pH為約7.2。在特定實施例中，pH為7.2±0.1、±0.05、±0.02、±0.01、±0.005或±0.0001。 在一些實施例中，在恆定溫度下進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在一些實施例中，在至少4℃、至少8℃、至少12℃、至少16℃、至少20℃、至少24℃、至少28℃、至少32℃、至少37℃、至少39℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、或至少100℃之溫度下進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在特定實施例中，在4℃與39℃之間、10℃與37℃之間、10℃與25℃之間、20℃與30℃之間、24℃與39℃之間、或40℃與100℃之間的溫度下進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在特定實施例中，在室溫下進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在一些實施例中，在24℃或約24℃下進行培育及/或處理以寡聚分子。在某些實施例中，在24℃±2℃、±1℃、±0.5℃、±0.2℃、±0.1℃、±0.05℃或±0.01℃下進行培育及/或處理以活化分子。 在某些實施例中，持續一定時間進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在一些實施例中，持續5分鐘至1小時之間、15分鐘至2小時之間、30分鐘至90分鐘之間、1小時至6小時之間、6小時至24小時之間或超過24小時進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在一些實施例中，持續約5分鐘、15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約1.5小時、約2小時、約3小時、約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約18小時、約20小時、或約24小時進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在某些實施例中，持續1小時或約1小時進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在特定實施例中，持續1小時±5分鐘、±2分鐘、±1分鐘、±30秒、±15秒、±10秒、±5秒、或±1秒進行培育、處理或接觸活化試劑與分子。 在特定實施例中，活化試劑在活化試劑與分子之一定莫耳比下培育、處理及/或接觸分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在某些實施例中，分子與活化試劑之莫耳比為或為約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在特定實施例中，分子與活化試劑之莫耳比為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%或±0.001%。在某些實施例中，莫耳比為1:2±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%或±0.001%。在一些實施例中，莫耳比為1:2±5%。在特定實施例中，莫耳比為1:2±2%。 在某些實施例中，藉由自分子移除活化試劑而結束活化試劑及分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，藉由層析自分子移除活化試劑。在某些實施例中，藉由凝膠過濾層析，例如藉由去鹽管柱自分子移除活化試劑。 在特定實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括藉由培育、處理及/或接觸分子與硫醇化試劑而使分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體硫醇化之步驟。在某些實施例中，硫醇化試劑為添加或能夠添加硫醇官能基至分子之試劑。在一些實施例中，硫醇化試劑為添加或能夠添加硫醇官能基至一或多個游離胺之試劑。在一些實施例中，硫醇官能基添加至N端胺基及/或存在於分子之離胺酸殘基處之游離胺。在某些實施例中，硫醇化試劑為或含有環狀硫醯亞胺化合物。在特定實施例中，硫醇化試劑為或含有2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑)。在一些實施例中，硫醇化試劑為或含有2-亞胺基硫雜環戊烷且在如下所說明之反應中添加硫醇官能基至游離胺：在特定實施例中，以鹽酸鹽，例如2-亞胺基硫硫環戊烷-HCl鹽形式購買、儲存及/或獲得硫醇化試劑，例如2-亞胺基硫雜環戊烷。因此，在一些實施例中，添加2-亞胺基硫雜環戊烷至溶液誘發溶液pH之顯著降低。在某些實施例中，溶液可經緩衝以阻止或減少pH降低。特定實施例涵蓋在酸性pH及/或低於7.0之pH下進行之硫醇化反應限制離胺酸殘基可供使用性，例如限制離胺酸殘基上之游離胺之可供使用性，且因此限制藉由硫醇化試劑添加至分子之硫醇官能基的量。在某些實施例中，離胺酸殘基上之胺基可在減弱或阻止在酸性pH值及/或低於7.0之pH值下硫醇化及/或添加硫醇官能基至胺基之能力的程度上變得質子化。因此，在某些實施例中，含有硫醇化試劑之溶液之酸度經調節及/或中和以提高硫醇化反應之效率。 在一些實施例中，培育、處理及/或接觸硫醇化試劑與分子包括在用分子培育、處理、接觸硫醇化試劑之前或開始時添加硫醇化試劑至具有鹼性pH或高於7.0之pH的緩衝液。在特定實施例中，在用分子培育、處理、接觸硫醇化試劑之前或開始時將硫醇化試劑添加至pH為至少7.0、至少7.2、至少7.4、至少7.6、至少7.8、至少8.0、至少8.1、至少8.2、至少8.3、至少8.4、至少8.5、至少8.6、至少8.7、至少8.8、至少8.9、至少9.0、至少9.5、或至少10.0之緩衝液。在某些實施例中，在用分子培育、處理、接觸硫醇化試劑之前或開始時將硫醇化試劑添加至pH為約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、約8.0、約8.1、約8.2、約8.3、約8.4、約8.5、約8.6、約8.7、約8.8、約8.9、約9.0、約9.1、約9.2、約9.3、約9.4、或約9.5之緩衝液。在一些實施例中，緩衝液之pH為約8.5。在特定實施例中，緩衝液之pH為8.5±0.1、±0.05、±0.02、±0.01、±0.005或±0.0001。在一些實施例中，緩衝液含有緩衝劑，該緩衝劑在室溫下之pKa 大於7.0、大於7.5、大於8.0、大於8.5或大於9.0。在特定實施例中，緩衝劑為或包括TES、HEPES、DIPSO、MOBS、TAPSO、Trizma、HEPPSO、POPSO、TEA、EPPS、麥黃酮、Gly-gly、二甘胺酸、HEPBS、TAPS、AMPD、TABS、AMPSO、CHES、CAPSO、AMP、CAPS、CABS及/或硼酸鹽。在某些實施例中，緩衝液為或含有硼酸鹽緩衝液。在特定實施例中，硼酸鹽緩衝液含有至少25 mM硼酸鹽、至少50 mM硼酸鹽、至少75 mM硼酸鹽或約或至少100 mM硼酸鹽。在特定實施例中，緩衝液為或包括100 mM±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%、或±0.001%硼酸鹽。 在某些實施例中，在鹼性pH或高於7.0之pH下進行培育、處理及/或接觸硫醇化試劑與分子。舉例而言，在一些實施例中，當添加硫醇化試劑及分子時，溶液之pH為鹼性pH或高於7.0之pH。在一些實施例中，在培育、處理或接觸硫醇化試劑與分子期間之pH在7.0與11.0之間、在7.0與9.0之間、在7.5與8.5之間或在7.5與8.0之間。在某些實施例中，在約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、約7.5、約7.6、約7.7、約7.8、約7.9、或約8.0之pH下進行培育、處理或接觸硫醇化試劑與分子。在一些實施例中，在培育、處理或接觸硫醇化試劑與分子期間之pH為或為約7.7。在特定實施例中，在培育、處理或接觸硫醇化試劑與分子期間之pH為7.7±0.1、±0.05、±0.02、±0.01、±0.005、或±0.0001。 在某些實施例中，持續一定時間進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。在一些實施例中，持續5分鐘至1小時之間、15分鐘至2小時之間、30分鐘至90分鐘之間、1小時至6小時之間、6小時至24小時之間或超過24小時進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在一些實施例中，持續約5分鐘、15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約1.5小時、約2小時、約3小時、約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約18小時、約20小時、或約24小時進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在某些實施例中，持續1小時或約1小時進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在特定實施例中，持續1小時±5分鐘、±2分鐘、±1分鐘、±30秒、±15秒、±10秒、±5秒、或±1秒進行培育、處理或接觸活化試劑與分子。在一些實施例中，持續25分鐘或約25分鐘進行培育、處理及/或接觸活化試劑與分子。在特定實施例中，持續25分鐘±5分鐘、±2分鐘、±1分鐘、±30秒、±15秒、±10秒、±5秒、或±1秒進行培育、處理或接觸活化試劑與分子。 特定實施例涵蓋培育、處理及/或接觸分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，導致添加所需硫醇官能基之第一反應。然而，在一些實施例中，所需硫醇官能基可再異構化為更穩定但無活性之N取代形式。因此，在一些實施例中，分子藉由2-亞胺基硫雜環戊烷之硫醇化添加硫醇官能基至分子，該硫醇官能基可再異構化為與硫醇官能基不具有相同反應性之更穩定N取代形式(Singh等人 Anal Biochem 236(1): 114-1125(1996))。此反應之描繪顯示如下：因此，在一些實施例中，分子藉由2-亞胺基硫雜環戊烷之硫醇化不應產生標準飽和曲線且將替代地產生其中存在於分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體上之硫醇官能基之含量或量將達到峰值或最大含量且接著應在達到最大值之後再次降低之曲線。在某些實施例中，硫醇官能基之半衰期為139分鐘。 在一些實施例中，在硫醇化反應期間達成的連接至分子之硫醇官能基之最大或峰值含量受發生反應之溶液之pH影響。在某些實施例中，相較於硫醇化試劑添加至鹼性較小之緩衝液時，硫醇官能基之最大或峰值含量在硫醇化試劑添加至具有更鹼性pH之緩衝液時更大。在一些實施例中，相較於硫醇化試劑添加至鹼性較小之緩衝液時，硫醇官能基之最大或峰值含量在硫醇化試劑添加至具有更鹼性pH之緩衝液時在較短時間量內達成。在某些實施例中，相較於硫醇化試劑添加至鹼性較小之緩衝液，例如pH為8.3之緩衝液時，硫醇官能基之最大或峰值含量在硫醇化試劑添加至pH為或為大約8.5之緩衝液時更大。在某些實施例中，相較於硫醇化試劑添加至鹼性較小之緩衝液，例如pH為8.3之緩衝液時，硫醇官能基之最大或峰值含量在硫醇化試劑添加至pH為或為大約8.5之緩衝液時在較短時間量內達成。在一些實施例中，相較於培育、處理及/或接觸發生於在反應期間pH小於7.7，例如pH為約6.9之溶液中時，硫醇官能基之最大或峰值含量在培育、處理及/或接觸硫醇化試劑和分子的溶液的pH在反應期間在在約pH 7.7處時更大。在一些實施例中，相較於培育、處理及/或接觸發生於在反應期間pH小於7.7，例如pH為約6.9之溶液中時，硫醇官能基之最大或峰值含量在培育、處理及/或接觸硫醇化試劑和分子的溶液的pH在反應期間在在約pH 7.7處時在較短時間量內達成。 在一些實施例中，添加至分子之硫醇官能基之最大或峰值含量為表示為添加至分子之硫醇官能基之量的平均數(例如平均值或中值)。在一些實施例中，硫醇官能基之最大或峰值含量為至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個或至少50個硫醇官能基。在一些實施例中，添加至各分子之硫醇官能基之最大或峰值含量為具有連接或添加之硫醇官能基的每分子之離胺酸殘基之平均(例如平均值或中值)百分比。在某些實施例中，最大或峰值含量為具有連接或添加之硫醇官能基之離胺酸殘基之至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%。在特定實施例中，分子為抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體，且硫醇官能基之最大或峰值含量為每個四聚體至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個或至少16個硫醇官能基。 在一些實施例中，持續足以達成添加至分子之硫醇官能基之最大或峰值含量之時間量培育、處理及/或接觸分子與硫醇化試劑。在特定實施例中，最大或峰值含量係在培育、處理或接觸硫醇化試劑與分子之1分鐘內、2分鐘內、5分鐘內、10分鐘內、15分鐘內、20分鐘內、25分鐘內、30分鐘內、45分鐘內、60分鐘內、90分鐘內或120分鐘內達成。 在特定實施例中，硫醇化試劑與分子培育、處理和/或接觸，且添加或連接至分子之硫醇官能基的量達到峰值或最大含量且接著在已達到最大值或峰值後開始下降。在一些實施例中，培育、接觸及/或處理在已達成峰值或最大含量之後結束。在一些實施例中，培育、處理或接觸在連接至分子之硫醇官能基的量相較於最大或峰值含量小50%、小40%、小30%、小25%、小20%、小15%、小10%、小5%、或小1%之前結束。在某些實施例中，培育、處理及/或接觸在硫醇官能基之平均(例如平均值或中值)量為至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個或至少50個硫醇官能基之時間點結束。在一些實施例中，培育、接觸及/或處理在至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%之離胺酸殘基具有連接或添加之硫醇官能基之時間點結束。在特定實施例中，分子為抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體，且培育、接觸及/或處理在硫醇官能基的量為每一四聚體至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個或至少16個硫醇官能基之時間點結束。在特定實施例中，硫醇化試劑及分子之培育、處理及/或接觸在1小時之後結束。在一些實施例中，硫醇化試劑及分子之培育、處理及/或接觸在25分鐘之後結束。 在一些實施例中，在恆定溫度下進行硫醇化試劑與分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，硫醇化試劑與分子之培育、處理及/或接觸係在至少4℃、至少8℃、至少12℃、至少16℃、至少20℃、至少24℃、至少28℃、至少32℃、至少37℃、至少39℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、或至少100℃之溫度下進行。在特定實施例中，在4℃與39℃之間、10℃與37℃之間、10℃與25℃之間、20℃與30℃之間、24℃與39℃之間、或40℃與100℃之間的溫度下進行硫醇化試劑之培育、處理及/或與分子接觸。在特定實施例中，在室溫下進行硫醇化試劑與分子之培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，在24℃或約24℃下進行培育及/或處理以寡聚分子。在某些實施例中，在24℃±2℃、±1℃、±0.5℃、±0.2℃、±0.1℃、±0.05℃或±0.01℃下進行培育及/或處理以進行分子硫醇化。 在特定實施例中，硫醇化試劑在硫醇化試劑與分子之一定莫耳比下與分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，硫醇化試劑及分子之培育處理及/或接觸係在每分子之硫醇化試劑與各一級胺之1:1至10:1之間的莫耳比下進行。在特定實施例中，硫醇化試劑及分子之培育、處理及/或接觸係在每分子之硫醇化試劑與各一級胺之5:1之莫耳比下進行。在某些實施例中，每分子之硫醇化試劑與各一級胺之莫耳比為或為約10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1。在特定實施例中，每分子之硫醇化試劑與各一級胺之莫耳比為10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、2:1或1:1±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%或±0.001%。在某些實施例中，莫耳比為1:5±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%或±0.001%。在某些實施例中，硫醇化試劑與分子之莫耳比為1:1及1,000:1、在1:1與500:1之間、在10:1與200:1之間、或在100:1與1,000:1之間。在特定實施例中，活化試劑與分子之莫耳比為約100:1。在某些實施例中，莫耳比為100:1±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%或±0.001%。 在某些實施例中，藉由自分子移除或分離硫醇化試劑而結束硫醇化試劑與分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之培育、處理及/或接觸。用於移除或分離分子，例如蛋白質或多肽分子，諸如抗生蛋白鏈菌素之方法此項技術中為慣常的，且包括諸如層析及/或凝膠過濾之方法。在一些實施例中，藉由層析自分子移除硫醇化試劑。在某些實施例中，藉由凝膠過濾層析，例如藉由去鹽管柱自分子移除活化試劑。 在某些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法含有及/或包括寡聚分子之步驟。在某些實施例中，分子藉由交聯個別分子或構成個別分子之亞單位之複合物而寡聚。在一些實施例中，本文所提供之方法包括一或多個處理、培育及/或接觸分子與促進寡聚之試劑之步驟。舉例而言，在一些實施例中，分子係藉由培育、處理及/或接觸分子與試劑，例如活化試劑而寡聚，該試劑為連接劑或交聯劑，例如雙官能連接劑或交聯劑或其他化學連接劑。在一些實施例中，連接劑或交聯劑為或包括雙官能連接劑。在一些實施例中，連接劑為同型雙官能連接劑，例如具有至少兩個相同的官能性及/或反應性基團之連接劑。在特定實施例中，連接劑為雜雙官能基連接劑，例如具有至少兩個不同的官能性及/或反應性基團之連接劑。在某些實施例中，分子與連接劑一起培育以寡聚或變得能夠寡聚。寡聚分子之適合之連接劑為此項技術中已知的，且包括(但不限於)戊二醛、二亞胺代己二酸二甲酯(DMA)、辛二亞胺酸二甲酯(DMS)、庚二亞胺酸二甲酯(DMP)、N-羥基丁二醯亞胺(NHS)、二硫基雙(丁二醯亞胺基丙酸酯(DSP)、二硫基雙(磺酸基丁二醯亞胺基丙酸酯)(DTSSP)、乙二醇雙[丁二醯亞胺基丁二酸酯]、NHS酯、N-ε-順丁烯二醯亞胺基己酸、N-[ε-順丁烯二醯亞胺基己酸]醯肼、N-丁二醯亞胺基S-乙醯基硫基乙酸酯、N-丁二醯亞胺基S-乙醯基硫基丙酸酯、2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑)、4-丁二醯亞胺基氧基羰基-甲基-(2-吡啶基二硫基)-甲苯磺基丁二醯亞胺基、4-[N-順丁烯二醯亞胺基甲基]-環己烷-1-甲酸酯、N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯氧基]磺酸基-丁二醯亞胺酯、N-(K-順丁烯二醯亞胺基十一醯氧基)磺基丁二醯亞胺酯、順丁烯二醯亞胺基乙酸N-羥基丁二醯亞胺酯、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己酸)醯肼、N-(K-順丁烯二醯亞胺基十一酸)醯肼、N-(β-順丁烯二醯亞胺基丙酸)醯肼及3-(2-吡啶基二硫基)丙醯基醯肼。 在一些實施例中，本文所提供之方法含有及/或包括已經修飾，例如化學修飾之寡聚分子。在特定實施例中，一或多個經修飾分子已寡聚化。在特定實施例中，一或多個分子已活化。在某些實施例中，經修飾分子為已藉由添加及/或連接官能基而在或可在交聯及/或寡聚反應中反應之活化分子。在一些實施例中，官能基係添加或連接至分子之胺，例如一級胺，例如可利用的胺及/或游離胺。在一些實施例中，該胺，例如一級胺為N端胺。在特定實施例中，該胺，例如一級胺在離胺酸殘基上。在一些實施例中，活化分子已藉由添加及/或連接官能基而經修飾，該官能基為或包括胺反應性基團(例如N-羥基丁二醯亞胺酯、亞胺酯、五氟苯酯、或羥甲基膦)、巰基反應性或硫醇反應性基團(例如順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯基、吡啶基二硫化物、硫代磺酸根或乙烯基碸)、醛反應性基團(例如醯肼或烷氧基胺)、光反應性基團(例如二氮雜環丙烯或芳基疊氮化物)及/或羥基反應性基團(例如異氰酸根)。在一些實施例中，活化分子已藉由添加及/或連接巰基反應性或硫醇反應性基團而活化。在某些實施例中，活化分子已藉由添加及/或連接鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基、氮丙啶基、丙烯醯基、芳化劑、乙烯基碸基、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇或二硫化物還原劑而活化。在某些實施例中，活化分子已藉由添加及/或連接順丁烯二醯亞胺基而活化。 在某些實施例中，已經修飾之分子為硫醇化分子。在特定實施例中，經修飾分子已藉由硫醇化，例如添加硫醇(亦即硫醇基、硫醇官能基或硫醇官能基團)而經修飾。在特定實施例中，硫醇化分子已藉由連接及/或添加硫醇官能基至一或多個離胺酸殘基而硫醇化。 在某些實施例中，本文所提供製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之方法含有及/或包括由活化分子使用硫醇化分子進行培育、處理或接觸之步驟。在一些實施例中，該培育、處理及/或接觸係寡聚化及/或導致硫醇化分子與活化分子之間的寡聚反應。在特定實施例中，分子之寡聚物係藉由培育、處理及/或接觸硫醇化分子與活化分子而形成。在某些實施例中，活化分子具有一或多個連接之順丁烯二醯亞胺基團。在特定實施例中，活化分子為或包括活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子。在某些實施例中，活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子為或包括具有一或多個連接之順丁烯二醯亞胺基團之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子。在特定實施例中，硫醇化分子為硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子。在一些實施例中，硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子為具有一或多個硫醇官能基之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子。在特定實施例中，本文所提供之方法包括培育、接觸及/或處理硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與活化之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之步驟，例如用以寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在特定實施例中，分子係藉由交聯反應寡聚。在一些實施例中，一部分分子已藉由添加一或多個硫醇官能基至分子而硫醇化。在某些實施例中，硫醇基係添加至分子之游離胺基，例如在離胺酸殘基之胺基，例如一級胺基上及/或N端胺，例如N端一級胺。在一些實施例中，與硫醇化分子分離之一部分分子係藉由添加或連接順丁烯二醯亞胺基團而活化。在一些實施例中，活化分子不含半胱胺酸殘基及/或硫醇官能基。因此，在一些實施例中，活化分子不與其他活化分子反應。在一些實施例中，活化和硫醇化分子經培育，且出現活化分子之順丁烯二醯亞胺官能基與硫醇化分子之硫醇官能基之間的交聯反應。舉例而言，分子R上之順丁烯二醯亞胺官能基與分子P上之硫醇(SH)官能基之間的交聯反應說明於下：在一些實施例中，硫醇官能基與順丁烯二醯亞胺官能基之間的反應適合於交聯分子以形成寡聚物。在某些實施例中，分子為抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 在特定實施例中，分子，例如活化及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體係在適合於寡聚分子之條件下培育及/或處理。在特定實施例中，在中性pH下進行培育及/或處理以寡聚分子。在一些實施例中，在5.0與9.0之間、6.0與8.0之間、6.5與7.5之間或7.0與7.5之間的pH下進行培育及/或處理以寡聚分子。在某些實施例中，在約6.5、約6.6、約6.7、約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、約7.3、約7.4、或約7.5之pH下進行培育及/或處理以寡聚分子。在一些實施例中，pH為約7.2。在特定實施例中，pH為7.2±0.1、±0.05、±0.02、±0.01、±0.005或±0.0001。 在一些實施例中，分子，例如活化及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在適合於寡聚分子之條件下培育及/或處理，且適合之條件包括溫度。在一些實施例中，在至少4℃、至少8℃、至少12℃、至少16℃、至少20℃、至少24℃、至少28℃、至少32℃、至少37℃、至少39℃、至少50℃、至少60℃、至少70℃、至少80℃、至少90℃、或至少100℃之溫度下進行培育及/或處理以寡聚分子。在特定實施例中，在4℃與39℃之間、10℃與37℃之間、10℃與25℃之間、20℃與30℃之間、24℃與39℃之間、或40℃與100℃之間的溫度下進行培育及/或處理以寡聚分子。在特定實施例中，在室溫下進行培育及/或處理以寡聚分子。在一些實施例中，在24℃或約24℃下進行培育及/或處理以寡聚分子。在某些實施例中，在24℃±2℃、±1℃、±0.5℃、±0.2℃、±0.1℃、±0.05℃或±0.01℃下進行培育及/或處理以寡聚分子。 在某些實施例中，分子，例如活化及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體在適合於寡聚分子之條件下培育及/或處理一定時間量。在一些實施例中，分子在適合於寡聚分子之條件下培育及/或處理5分鐘至1小時之間、15分鐘至2小時之間、30分鐘至90分鐘之間、1小時至6小時之間、6小時至24小時之間或超過24小時。在一些實施例中，持續約5分鐘、15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約1小時、約1.5小時、約2小時、約3小時、約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約18小時、約20小時、或約24小時進行培育及/或處理以寡聚分子。在某些實施例中，持續1小時或約1小時進行培育及/或處理以寡聚分子。在特定實施例中，持續1小時±5分鐘、±2分鐘、±1分鐘、±30秒、±15秒、±10秒、±5秒、或±1秒進行培育及/或處理以寡聚分子。 在特定實施例中，活化及硫醇化分子，例如活化及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體以活化分子與硫醇化分子之一定莫耳比培育及/或處理以寡聚分子。在特定實施例中，活化分子與硫醇化分子之莫耳比為1:X。在一些實施例中，X為硫醇化分子上之離胺酸及N端胺之數目，亦即總和。在一些實施例中，X為分子上之游離或可用胺基之數目。在一些實施例中，X為在添加硫醇官能基之前的硫醇化分子上之離胺酸之數目。在特定實施例中，活化分子與硫醇化分子之莫耳比為或為約1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10。在特定實施例中，活化分子與硫醇化分子之莫耳比為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、或1:10±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%、或±0.001%。在某些實施例中，莫耳比為1:4±10%、±5%、±2%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.05%、或±0.001%。 在某些實施例中，在寡聚分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之條件下之培育、處理及/或接觸係藉由添加一或多種結束及/或能夠結束寡聚反應之試劑，例如化學劑而結束。在一些實施例中，試劑為修飾或以其他方式阻止一或多個官能基，例如順丁烯二醯亞胺或硫醇官能基在交聯或寡聚反應中反應之試劑。在一些實施例中，分子為活化及硫醇化分子且一或多種試劑為或包括諸如藉由添加及/或附接硫醇基而使可用順丁烯二醯亞胺基團飽和，或將順丁烯二醯亞胺基團與分子裂解及/或分離之試劑。在一些實施例中，可藉由提昇pH之試劑移除未反應之順丁烯二醯亞胺基團。在某些實施例中，較高pH將導致移除及/或分離未反應之順丁烯二醯亞胺基團，而交聯之順丁烯二醯亞胺基團將保持穩定。在某些實施例中，一或多種試劑包括例如藉由開環反應催化順丁烯二醯亞胺環系統之水解的試劑。在一些實施例中，分子為活化及硫醇化分子且一或多種試劑為或包括修飾及/或飽和硫醇官能基之試劑。在一些實施例中，硫醇官能基之飽和及/或修飾阻止與順丁烯二醯亞胺基團之寡聚及/或交聯反應。在一些實施例中，活化及硫醇化分子，例如活化及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)培育、處理及/或接觸以結束寡聚及/或交聯反應。 在一些實施例中，分子，例如活化及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與結束及/或能夠結束寡聚及/或交聯反應之試劑培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，結束及/或能夠結束寡聚及/或交聯反應之試劑在在4℃與39℃之間、4℃與25℃之間、4℃與10℃之間、或20℃與30℃之間的溫度下與分子培育、處理及/或接觸。在特定實施例中，培育、處理及/或接觸起初在室溫下進行，且接著在約4℃下進行。在一些實施例中，培育、處理及/或接觸起初在24℃或約24℃下進行，且接著在約4℃下進行。在某些實施例中，培育、處理或接觸起初在室溫下及/或在約24℃下進行約5分鐘、約10分鐘、約15分鐘、約30分鐘、約60分鐘、約90分鐘、或約120分鐘，且接著培育、接觸及/或處理在約4℃下進行約1小時、約2小時、約4小時、約6小時、約8小時、約12小時、約16小時、約24小時、或超過24小時。在一些實施例中，培育、處理或接觸起初在室溫下及/或在約24℃下進行約15分鐘，且接著在約4℃下進行約16小時。在某些實施例中，與NEM培育、處理或接觸起初在室溫下及/或在約24℃下進行約15分鐘，且接著在約4℃下培育、接觸及/或處理約16小時。 在特定實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括用於使分子硫醇化及使分子活化之步驟。在某些實施例中，不同分子群體或多個分子自經活化之分子群體或多個分子硫醇化。在一些實施例中，活化及硫醇化步驟以大約相同時間進行，例如以使得硫醇化及活化分子均可用於培育反應而不需要在注意另一過程時儲存硫醇化或活化分子。在一些實施例中，至少一部分的培育、處理及或接觸硫醇化試劑與分子及培育、處理及或接觸活化試劑與分子係同時進行。 在某些實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%之培育、處理及或接觸硫醇化試劑與分子係在進行培育、處理及或接觸活化試劑與分子時進行。在某些實施例中，至少1%、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少95%之培育、處理及或接觸活化試劑與分子係在進行培育、處理及或接觸硫醇化試劑與分子時進行。 在一些實施例中，至少1分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘、至少60分鐘、至少90分鐘、至少120分鐘、至少4小時、至少6小時、至少8小時、至少12小時、至少16小時、或至少24小時之培育、處理及或接觸活化試劑與分子係在進行培育、處理及或接觸硫醇化試劑與分子時進行。在特定實施例中，至少1分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少15分鐘、至少30分鐘、至少45分鐘、至少60分鐘、至少90分鐘、至少120分鐘、至少4小時、至少6小時、至少8小時、至少12小時、至少16小時、或至少24小時之培育、處理及或接觸硫醇化試劑與分子係在進行培育、處理及或接觸活化試劑與分子時進行。 在一些實施例中，培育、處理及/或接觸硫醇化試劑以及培育、處理及/或接觸活化試劑與分子係在大約相同時間開始。在某些實施例中，培育、處理及/或接觸硫醇化試劑以及培育、處理及/或接觸活化試劑與分子係在彼此之30分鐘內、15分鐘內、10分鐘內、5分鐘內、1分鐘內、30秒內、15秒內、10秒內、5秒內、1秒內開始。在一些實施例中，培育、處理及/或接觸硫醇化試劑以及培育、處理及/或接觸活化試劑與分子係在大約相同時間結束。在特定實施例中，培育、處理及/或接觸硫醇化試劑以及培育、處理及/或接觸活化試劑與分子係在彼此之30分鐘內、15分鐘內、10分鐘內、5分鐘內、1分鐘內、30秒內、15秒內、10秒內、5秒內、1秒內結束。 特定實施例涵蓋當硫醇官能基連接或添加至分子時，硫醇官能基可異構化為更穩定但非活性之N取代形式。在一些態樣中，硫醇官能基係在2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑)存在下添加或連接。某些實施例涵蓋當硫醇官能基在2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑)存在下連接或添加至分子時，硫醇官能基可異構化為更穩定但非活性之N取代形式。在某些實施例中，硫醇官能基在移除硫醇化試劑之後以139分鐘之半衰期異構化。因此，在一些實施例中，在與硫醇化試劑培育、處理及/或接觸後，分子上之硫醇官能基的量隨時間推移減少。 在特定實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括使分子硫醇化、使分子活化及使分子寡聚之步驟，例如在適合於寡聚之條件下培育活化及硫醇化分子。在特定實施例中，寡聚分子之步驟定時為在硫醇化步驟已結束或完成之後的精確時間量內或精確時間量處開始。在一些實施例中，寡聚分子之步驟定時為在硫醇化步驟及活化步驟已結束或完成之後的精確時間量內或精確時間量處開始。 在特定實施例中，寡聚分子，例如在適合於寡聚之條件下培育活化及硫醇化分子之步驟係在硫醇化步驟結束，例如培育分子與硫醇化試劑已結束之後的一定時間內開始。在某些實施例中，寡聚分子之步驟在損失、減少或衰減50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.01%、0.001%、或0.0001%在硫醇化步驟結束時連接至分子之硫醇官能基之前開始或起始。在特定實施例中，寡聚分子之步驟在損失、減少或衰減10%在硫醇化步驟結束時連接至分子之硫醇官能基之前開始或起始。在一些實施例中，寡聚分子之步驟在硫醇化步驟結束之後的24小時內、16小時內、12小時內、8小時內、6小時內、4小時內、2小時內、90分鐘內、60分鐘內、45分鐘內、30分鐘內、15分鐘內、10分鐘內、5分鐘內、或1分鐘內開始或起始。在某些實施例中，寡聚分子之步驟開始或起始6小時、5小時、4小時、3小時、2小時、90分鐘、60分鐘、45分鐘、30分鐘、15分鐘、10分鐘、5分鐘、或1分鐘±5分鐘、±2分鐘、±1分鐘、±30秒、±15秒、±10秒、±5秒、或±1秒。在某些實施例中，寡聚分子之步驟在硫醇化步驟結束之後的15分鐘內開始或起始。在特定實施例中，寡聚分子之步驟在硫醇化步驟結束之後的10分鐘±1分鐘、±30秒、±15秒、±10秒、±5秒、或±1秒開始或起始。 在特定實施例中，硫醇化步驟，例如培育分子與硫醇化試劑之終點為或出現於硫醇化試劑自分子移除時或移除硫醇化試劑之過程開始或起始時。在一些實施例中，硫醇化步驟之終點為或出現於移除硫醇化試劑之過程開始或起始時。在特定實施例中，移除硫醇化試劑之方法為或包括層析，例如凝膠過濾層析。在一些實施例中，硫醇化步驟之終點為或出現於含有硫醇化試劑及分子之樣品或溶液倒入至層析管柱，例如凝膠過濾層析管柱中以將硫醇化試劑自分子移除或分離時或即刻。在特定實施例中，寡聚分子之步驟之起點開始及/或起始於活化分子與硫醇化分子接觸、添加及/或混合時。 在特定實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括將寡聚物粒子試劑及/或寡聚分子自未經寡聚之分子移除及/或分離之步驟。在某些實施例中，將寡聚物粒子試劑及/或寡聚分子自未經寡聚之分子移除及/或分離之步驟出現於寡聚分子之步驟已完成或結束之後。 在一些實施例中，寡聚粒子試劑及/或分子之寡聚物自未經寡聚之分子及小於或低於臨限值尺寸之寡聚物粒子移除及/或分離。在一些實施例中，尺寸之臨限值為或包括至少5 nm、至少10 nm、至少15 nm、至少20 nm、至少25 nm、至少30 nm、至少40 nm、至少50 nm、至少60 nm、至少70 nm、至少75 nm、至少80 nm、至少85 nm、或至少90 nm之半徑。在某些實施例中，尺寸之臨限值為或包括至少100 kDa、至少500 kDa、至少1,000 kDa、至少2,000 kDa、至少5,000 kDa、至少10,000 kDa、至少50,000 kDa、或至少100,000 kDa之分子量。在某些實施例中，臨限值尺寸不影響藉由本文所提供之方法生產之寡聚物粒子試劑之平均(例如平均值或中值)尺寸及/或尺寸分佈。 在一些實施例中，寡聚物粒子試劑，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚物係藉由尺寸排阻層析(SEC)自未經寡聚之粒子移除及/或分離。在一些實施例中，SEC為准許在不損壞或破壞分子之情況下藉由尺寸分離分子之技術，藉此小於排阻極限之分子截留於管柱中，且大於排阻極限之分子穿過管柱，例如在無延遲之情況下。在某些實施例中，排阻極限為落入1 kDa與100,000 kDa之間、100 kDa與10,000 kDa之間、500 kDa與1,000 kDa之間、500 kDa與5,000 kDa之間、5,000 kDa與20,000 kDa之間、10,000 kDa與50,000 kDa之間、或50,000與100,000 kDa之間的尺寸。在某些實施例中，排阻極限大於分子之單體及/或四聚體之分子量。在一些實施例中，排阻極限大於抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之分子量。在特定實施例中，收集所有粒子，例如穿過SEC管柱，諸如在空隙體積中之寡聚粒子，例如在無延遲之情況下。 在特定實施例中，當進行SEC時，分子離開管柱之次序與分子之尺寸有關，因此，在一些實施例中，可在不同溶離份中收集管柱之溶離液。在一些實施例中，可組合或丟棄溶離份以移除某些尺寸之粒子。舉例而言，在一些實施例中，可丟棄溶離份以移除尺寸為小於100 kDa、小於500 kDa、小於1,000 kDa、小於2,000 kDa、小於5,000 kDa、小於10,000 kDa、小於50,000 kDa、或小於100,000 kDa之粒子，例如寡聚粒子試劑。在某些實施例中，SEC自未經寡聚之分子移除寡聚粒子試劑，但不影響藉由本文所提供之方法生產之寡聚物粒子試劑之平均(例如平均值或中值)尺寸及/或尺寸分佈。 在某些實施例中，寡聚粒子試劑，例如寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體可在培育、處理及/或接觸分子以進行寡聚已完成或結束之後繼續交聯及/或寡聚。因此，在一些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括使寡聚物穩定化，例如使其尺寸穩定化之步驟。在一些實施例中，用於穩定化寡聚物之步驟為或包括培育、接觸及/或處理寡聚分子，例如寡聚粒子試劑與穩定劑。 在一些實施例中，穩定劑為防止或能夠防止粒子，例如寡聚粒子試劑尺寸變化之任何試劑。在一些實施例中，穩定劑為修飾分子或寡聚粒子上之官能基之任何試劑，該官能基在寡聚及/或交聯反應中反應或能夠在寡聚及/或交聯反應中反應。在某些實施例中，穩定劑為防止形成、異構化及/或轉化在分子或寡聚粒子上產生官能基之任何試劑，該分子或寡聚粒子在寡聚及/或交聯反應中反應或能夠在寡聚及/或交聯反應中反應。在一些實施例中，穩定試劑為修飾或能夠修飾連接至分子或寡聚粒子之鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基、氮丙啶基、丙烯醯基、芳化劑、乙烯基碸基、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇或二硫化物還原劑之任何試劑。在特定實施例中，穩定試劑為防止形成、異構化及/或轉化產生連接至分子或寡聚粒子之鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基、氮丙啶基、丙烯醯基、芳化劑、乙烯基碸基、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇或二硫化物還原劑之任何試劑。 在一些實施例中，穩定劑與寡聚粒子培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，寡聚粒子為含有多個硫醇化分子及活化分子，例如活化及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚粒子試劑。在某些實施例中，寡聚粒子含有更多含有連接之N取代亞胺基硫雜環戊烷之硫醇化分子。在一些實施例中，與NEM培育及/或處理使所有可用硫醇官能基飽和及/或經修飾，藉此停止交聯及/或寡聚反應。然而，在一些實施例中，N取代亞胺基硫雜環戊烷不與NEM反應且此等異構體在與NEM培育之後保留於分子及寡聚粒子上。在一些實施例中，N取代亞胺基硫雜環戊烷再異構化為硫醇異構體可因此導致寡聚粒子試劑之合成後生長，例如藉由額外交聯及/或寡聚反應，諸如與其他寡聚粒子上之其餘的可用順丁烯二醯亞胺基團。 在一些實施例中，穩定劑為修飾、移除及/或防止N取代亞胺基硫雜環戊烷再異構化為硫醇官能基或能夠如此之試劑。在一些實施例中，穩定劑為或包括羥胺。在某些實施例中，含有連接之N取代亞胺基硫雜環戊烷之寡聚粒子及/或分子與穩定劑培育、處理及/或接觸，該穩定劑修飾、移除及/或防止N取代亞胺基硫雜環戊烷再異構化為硫醇官能基或能夠如此。在特定實施例中，含有連接之N取代亞胺基硫雜環戊烷之寡聚粒子及/或分子與羥胺培育、處理及/或接觸。 在一些實施例中，穩定試劑，例如羥胺與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育，以便進行穩定化反應。在一些實施例中，穩定試劑，例如羥胺係在進行及/或完成硫醇官能基與順丁烯二醯亞胺官能基之間的交聯反應之後添加至寡聚分子。在特定實施例中，穩定試劑，例如羥胺係在藉由添加NEM至寡聚分子而結束、完成及/或終止交聯反應之後與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育。在某些實施例中，穩定試劑，例如羥胺係在藉由添加NEM至寡聚分子結束、完成及/或終止交聯反應之後與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育。在某些實施例中，穩定試劑與寡聚分子接觸、處理及/或培育，隨後長期儲存，例如在、在大約或低於室溫、4℃、-20℃、或-80℃下儲存至少1天、1週、3週、9週、27週、46週或1或超過1年。在一些實施例中，穩定試劑，例如羥胺在寡聚分子負載至諸如層析管柱及/或SEC管柱之管柱上、穿過該管柱及/或自該管柱溶離之後與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育。在特定實施例中，穩定試劑在寡聚分子負載至SEC管柱上、穿過SEC管柱及/或自SEC管柱溶離之後與寡聚分子接觸、處理及/或培育。在某些實施例中，穩定試劑在寡聚分子負載至SEC管柱上、穿過SEC管柱及/或自SEC管柱溶離之任何步驟之前與寡聚分子接觸、處理及/或培育。 在一些實施例中，穩定試劑，例如羥胺持續、持續大約或持續至少1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時或24小時與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育。在某些實施例中，穩定試劑持續1分鐘至12小時之間、1分鐘至1小時之間、1分鐘至30分鐘之間、5分鐘至30分鐘之間、10分鐘至60分鐘之間、10分鐘至20分鐘之間、1小時至3小時之間、1小時至2小時之間、或6小時至12小時之間與寡聚分子接觸、處理及/或培育。在特定實施例中，穩定試劑持續5分鐘至30分鐘之間，或持續15分鐘或大約15分鐘與寡聚分子接觸、處理及/或培育。在某些實施例中，藉由混合及/或搖動，例如溫和搖動及/或混合進行處理、接觸及/或培育。 在一些實施例中，穩定試劑，例如羥胺在、在大約或4℃、8℃、12℃、16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、37℃、39℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃之溫度下與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育。在一些實施例中，穩定試劑在4℃與39℃之間、10℃與37℃之間、10℃與25℃之間、20℃與30℃之間、24℃與39℃之間、或40℃與100℃之間的溫度下與寡聚分子接觸、處理及/或培育。在特定實施例中，穩定試劑在室溫下與寡聚分子接觸、處理及/或培育。在某些實施例中，穩定試劑在或在大約23℃、24℃、25℃、或26℃±2℃、±1℃、±0.5℃、±0.2℃、±0.1℃、±0.05℃、或±0.01℃下與寡聚分子接觸、處理及/或培育。 在一些實施例中，穩定試劑，例如羥胺係自寡聚分子，例如寡聚粒子試劑移除及/或分離。在特定實施例中，穩定化反應係藉由自寡聚粒子分離及/或移除穩定試劑而結束及/或終止。在一些實施例中，穩定試劑係藉由層析步驟自寡聚粒子移除及/或分離。在特定實施例中，層析步驟為或包括SEC。在一些實施例中，穩定試劑係藉由管柱及/或過濾器自寡聚分子移除及/或分離。在一些實施例中，管柱或過濾器為去鹽管柱。在某些實施例中，去鹽管柱含有樹脂，例如為或含有葡聚糖凝膠、聚葡萄糖及/或表氯醇之樹脂。 在特定實施例中，穩定試劑，例如羥胺持續1分鐘至1小時之間在4℃與39℃之間、10℃與25℃之間或20℃與30℃之間的溫度下與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育。在一些實施例中，穩定試劑，例如羥胺持續5分鐘至30分鐘之間在10℃與25℃之間的溫度下與寡聚分子，例如寡聚粒子試劑接觸、處理及/或培育。 在特定實施例中，與穩定劑培育、處理或接觸之寡聚粒子試劑，例如含有複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之寡聚粒子試劑就尺寸而言穩定。在一些實施例中，當粒子儲存於室溫下、儲存於或儲存於大約4℃或低於4℃下、儲存於或儲存於大約-20℃或低於-20℃下、或儲存於或儲存於大約-80℃下時，與穩定劑培育、處理或接觸之寡聚粒子試劑經一定時間量，例如12小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、或超過16週不經歷大於1%、大於5%、大於10%、大於20%、大於25%、大於30%、大於40%、或大於50%尺寸變化，例如半徑或分子量變化的隨時間推移之尺寸變化。在一些實施例中，與穩定劑寡聚粒子試劑(其與穩定劑培育、處理或接觸)培育、處理或接觸之寡聚粒子試劑經12小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、或超過16週不經歷大於1%、大於5%、大於10%、大於20%、大於25%、大於30%、大於40%、或大於50%尺寸增加的隨時間推移之尺寸增加。 在一些實施例中，本文所提供之方法包括一或多個對分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體，及/或寡聚粒子試劑進行過濾滅菌之步驟。在一些實施例中，寡聚粒子試劑經過濾滅菌。在一些實施例中，分子或寡聚粒子試劑在與活化試劑或硫醇化試劑培育之前或之後、在活化及硫醇化分子經交聯及/或寡聚之前或之後、在進行SEC以自例如四聚體之非寡聚分子移除寡聚粒子試劑之前或之後、及/或在寡聚粒子試劑與穩定劑培育之前或之後進行過濾滅菌。在一些實施例中，寡聚粒子試劑經過濾滅菌或能夠經過濾滅菌。在某些實施例中，寡聚粒子試劑不、阻塞或以其他方式阻礙或阻止過濾滅菌過程。在一些實施例中，過濾滅菌包括使含有分子或寡聚粒子試劑之溶液穿過多孔過濾器或膜。在一些實施例中，多孔過濾器或膜含有孔隙，該等孔隙之直徑為或為至少約0.02 µm、約0.05 µm、約0.1 µm、約0.15 µm、約0.2 µm、約0.22 µm、約0.3 µm、約0.4 µm、約0.45 µm、或約0.5 µm。在一些實施例中，孔隙之尺寸在0.01 µm與1.0 µm之間、在0.1 µm與.05 µm之間、在0.2 µm與0.25 µm之間、在0.4與0.45 µm之間或在0.2 µm與0.45 µm之間。在一些實施例中，寡聚粒子之半徑及/或平均半徑處於或低於150 nm。在特定實施例中，寡聚粒子之半徑及/或平均半徑為大約、恰好或低於125 nm、110 nm、或100 nm。 在一些實施例中，寡聚粒子試劑係藉由本文所提供之方法製造、產生及/或生產且接著儲存。在一些實施例中，寡聚粒子試劑在任何處理或培育之前儲存一定時間量，以將例如受體結合劑之試劑結合至寡聚粒子試劑。在特定實施例中，寡聚粒子試劑在一或多個處理或培育之後儲存一定時間量，以將例如受體結合劑之試劑可逆地結合至寡聚粒子試劑。在一些實施例中，寡聚粒子試劑儲存於兩個或大於兩個等分試樣中。在某些實施例中，寡聚粒子試劑儲存於緩衝液中。在一些實施例中，緩衝液具有中性pH及/或6.5與7.5之間、6.8與7.4之間或約6.8、約6.9、約7.0、約7.1、約7.2、或約7.3之pH。在某些實施例中，寡聚粒子試劑儲存於pH為約7.2之緩衝液中。在某些實施例中，緩衝液為磷酸鹽緩衝液，例如磷酸鈉緩衝液。在某些實施例中，寡聚粒子試劑儲存於室溫下、儲存於或儲存於大約4℃或低於4℃下、儲存於或儲存於大約-20℃或低於-20℃下、或儲存於或儲存於大約-80℃下。在特定實施例中，寡聚粒子試劑經儲存12小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、或超過16週。在一些實施例中，寡聚粒子試劑置於具有中性pH之緩衝液中且儲存於-80℃或約-80℃之溫度下。 在一些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括或含有在適合於寡聚分子之條件下培育、處理及/或接觸分子，例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之步驟；自未藉由SEC寡聚之分子分離寡聚粒子試劑之步驟；及培育粒子與穩定劑之步驟。在一些實施例中，在適合於寡聚分子之條件下培育、處理及/或接觸分子之步驟為或包括培育具有一或多個連接之硫醇官能基之硫醇化分子與具有一或多個連接之順丁烯二醯亞胺官能基之活化分子。 在一些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括：持續15至90分鐘之間的時間量在具有鹼性pH的緩衝液中培育複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與硫醇化試劑以使四聚體硫醇化之步驟、持續30分鐘至90分鐘之間的時間量培育獨立的複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與活化試劑以將一或多個順丁烯二醯亞胺官能基添加至四聚體之步驟、在相同時間或大約相同時間結束2-亞胺基硫雜環戊烷及SMPH培育、在活化及硫醇化培育結束之後的五分鐘至十五分鐘之間的時間量內培育硫醇化及活化四聚體之步驟、自未藉由SEC寡聚之分子分離寡聚粒子試劑之步驟及培育粒子與穩定劑以使寡聚物粒子試劑之尺寸穩定之步驟。在一些實施例中，方法包括將寡聚粒子試劑在大約或低於-80℃、-20℃或4℃下儲存於具有中性pH之緩衝溶液中之步驟。 在一些實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括：持續60分鐘在約24℃之溫度下在具有7.7與8.5之間的鹼性pH之緩衝液中培育複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與2-亞胺基硫雜環戊烷以使四聚體硫醇化之步驟、持續1小時在約24℃之溫度下在7.2之中性pH下培育獨立的複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與SMPH以將一或多個順丁烯二醯亞胺官能基添加至四聚體之步驟、藉由用例如SEC之層析自四聚體分離2-亞胺基硫雜環戊烷及SMPH培育物而同時結束2-亞胺基硫雜環戊烷及SMPH培育之步驟、在結束2-亞胺基硫雜環戊烷及SMPH培育之後培育硫醇化及活化四聚體十分鐘之步驟、藉由培育四聚體與NEM而在60分鐘之後結束硫醇化與活化四聚體之間的寡聚反應之步驟、自未藉由SEC寡聚之分子分離寡聚粒子試劑之步驟及培育粒子與羥胺以使寡聚物粒子試劑之尺寸穩定之步驟。在一些實施例中，方法包括將寡聚粒子試劑在-80℃下儲存於具有中性pH之緩衝溶液中之步驟。在一些實施例中，將2-亞胺基硫雜環戊烷添加至具有8.5之鹼性pH之緩衝液。在某些實施例中，緩衝液為或含有100 mM硼酸鹽緩衝液。在一些實施例中，粒子為穩定的，例如持續至少46週經歷大於10%之尺寸變化。 在特定實施例中，用於製造、產生及/或生產寡聚粒子試劑之本文所提供之方法包括：持續60分鐘在約24℃之溫度下在具有7.7與8.5之間的鹼性pH之緩衝液中培育複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與2-亞胺基硫雜環戊烷以使四聚體硫醇化之步驟；持續1小時在約24℃之溫度下在7.2之中性pH下培育獨立的複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與SMPH以將一或多個順丁烯二醯亞胺官能基添加至四聚體之步驟；藉由用例如SEC之層析自四聚體分離2-亞胺基硫雜環戊烷及SMPH培育物而同時結束2-亞胺基硫雜環戊烷及SMPH培育之步驟；視需要在結束2-亞胺基硫雜環戊烷及SMPH培育之後的10分鐘內培育硫醇化及活化四聚體之步驟；藉由培育四聚體與NEM而在或在大約60分鐘之後結束硫醇化與活化四聚體之間的寡聚反應之步驟；培育粒子與羥胺之步驟；SEC步驟；及視情況存在之過濾粒子步驟，例如經由具有或具有約0.45 μm及/或0.2 µm直徑孔徑之膜及/或過濾器。在一些實施例中，方法包括將寡聚粒子試劑在-80℃下儲存於具有中性pH之緩衝溶液中之步驟。在一些實施例中，粒子為穩定的，例如持續至少46週經歷大於10%之尺寸變化。 C. 試劑型式 1. 擔體在一些實施例中，試劑包含於擔體，諸如固體支撐物或表面，例如珠粒，或固相或固定相(層析基質)上。在一些此類實施例中，試劑在擔體上可逆地固定。在一些情況下，試劑經由共價鍵固定至擔體。在一些態樣中，試劑以非共價方式可逆地固定至擔體。在一些實施例中，擔體為固體擔體。任何固體擔體(表面)可用於試劑之可逆固定。試劑可在上面固定之固體擔體之說明性實例包括磁珠、聚合珠粒、細胞培養盤、微量滴定盤、膜、瓊脂糖珠粒、聚苯乙烯珠粒或中空纖維。在一些態樣中，中空纖維可用作購自TerumoBCT Inc. (Lakewood, CO, USA)之Quantum®細胞擴增系統(Cell Expansion System)中之生物反應器。在一些實施例中，試劑共價連接至固體擔體。在其他實施例中，非共價相互作用亦可用於固定，例如在塑膠基板上。在一些實施例中，試劑可例如為可逆地結合抗生蛋白鏈菌素結合肽之抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白突變蛋白。此類抗生蛋白鏈菌素突變蛋白可共價連接至任何表面，例如用於層析純化之樹脂(珠粒)且可以此類形式商購自IBA GmbH, Göttingen，例如作為Strep-Tactin®瓊脂糖、Strep-Tactin® Superflow®、Strep-Tactin® Superflow®高容量或Strep-Tactin® MacroPrep®。可易於商購之其他說明性實例為固定化金屬親和性層析(IMAC)樹脂，諸如TALON®樹脂(Westburg, Leusden, The Netherlands)，其可用於可逆地固定寡聚組胺酸標記之(his-標記之)蛋白質，諸如用於可逆地結合含有諸如五-或六-組胺酸標籤之寡組胺酸標籤作為結合搭配物C之試劑(例如受體結合劑或選擇劑)。其他實例包括購自GE Life Sciences之調鈣蛋白瓊脂糖，其可與含有調鈣蛋白結合肽作為結合搭配物C或偶合有麩胱甘肽之瓊脂糖之試劑(例如受體結合劑或選擇劑)一起使用。在一些此類情況下，結合搭配物C為麩胱甘肽-S-轉移酶。 在一些實施例中，擔體含有固相或固定相。因此，在一些實施例中，試劑包含於固相或固定相(亦稱作層析基質)上。在一些此類實施例中，試劑可逆地固定於固相或固定相上。在一些情況下，試劑經由共價鍵可逆地固定至固定相。在一些態樣中，試劑以非共價方式可逆地固定至固定相。任何材料可用作層析基質。一般而言，適合之層析材料基本上無害，亦即不會對細胞活力不利，諸如當在所需條件下用於填充層析管柱中時。在一些實施例中，固定相保持於預定位置，諸如預定位置，而樣品之位置改變。因此，在一些實施例中，固定相為移動相流動經(藉由流經或以批量模式)之層析系統的一部分且其中出現包含於液相中之組分(溶解或分散)在各相之間的分佈。 在一些實施例中，層析基質具有固相或半固相形式，而含有待隔離/分離之靶細胞的樣品為流體相。層析基質可為微粒材料(具有任何適合之尺寸及形狀)或單片層析材料，包括紙基板或膜。因此，在一些態樣中，層析可為管柱層析以及平面層析。在一些實施例中，除標準層析管柱以外，允許雙向流動之管柱，諸如購自PhyNexus, Inc. San Jose, CA, U.S.A.之PhyTip® 管柱或吸管端可用於基於管柱/基於流經模式之方法。因此，在一些情況下，適用於本發明方法之層析管柱亦包含允許雙向流動之吸管端或管柱。在一些情況下，諸如使用微粒基質材料之情況下，微粒基質材料之平均粒度可例如為約5 μm至約200 μm、或約5 μm至約400 μm、或約5 μm至約600 μm。在一些態樣中，層析基質可例如為或包括聚合樹脂或金屬氧化物或類金屬氧化物。在一些態樣中，諸如使用平面層析之情況下，基質材料可為任何適合於平面層析之材料，諸如習知基於纖維素或基於有機聚合物之膜(例如紙膜、硝化纖維素膜或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜)或二氧化矽塗佈之玻璃板。在一個實施例中，層析基質/固定相為非磁性材料或非可磁化材料。 在一些實施例中，適合於本發明方法之非磁性或非可磁化層析固定相或固相包括衍生二氧化矽或交聯凝膠。在一些態樣中，交聯凝膠可基於天然聚合物，諸如基於在自然界中存在之聚合物類別。舉例而言，層析固定相可基於之天然聚合物為多醣。在一些實施例中，固相或固定相為聚苯乙烯珠粒。在一些情況下，各別多醣總體上交聯。多醣基質之實例包括(但不限於)瓊脂糖凝膠(例如Superflow™瓊脂糖或Sepharose®材料，諸如以不同珠粒及孔徑市售之Superflow™ Sepharose®)或交聯聚葡萄糖之凝膠。另一說明性實例為聚葡萄糖共價鍵結至之微粒交聯瓊脂糖基質，該基質以均購自GE Healthcare之Sephadex®或Superdex®形式市售(以各種珠粒尺寸及各種孔徑)。此類層析材料之另一說明性實例為Sephacryl®，其亦可以不同珠粒及孔徑商購自GE Healthcare。此類層析材料之另一說明性實例為CytoSorb聚苯乙烯珠粒。 在一些實施例中，交聯凝膠亦可基於合成聚合物，諸如基於不在自然界中存在之聚合物類別。在一些態樣中，層析固定相或固相基於之此類合成聚合物為具有極性單體單元，且因此本身具極性之聚合物。因此，在一些情況下，此類極性聚合物為親水性的。在一些態樣中，親水性分子(亦稱為疏油性)含有可與水分子形成偶極子-偶極子相互作用之部分。一般而言，疏水性分子(亦稱為親脂性)具有與水分離之傾向。 適合之合成聚合物之說明性實例為聚丙烯醯胺、苯乙烯-二乙烯基苯凝膠以及丙烯酸酯與二醇或丙烯醯胺與二醇之共聚物。說明性實例為以Fractogel®形式市售之聚甲基丙烯酸酯凝膠。另一實例為以Toyopearl®形式市售之乙二醇與甲基丙烯酸酯之共聚物。在一些實施例中，層析固定相亦可包括天然及合成聚合物組分，諸如複合基質或多醣及瓊脂糖之複合物或共聚物，例如聚丙烯醯胺/瓊脂糖複合物，或多醣及N, N'-亞甲基雙丙烯醯胺之複合物。聚葡萄糖及N, N'-亞甲基雙丙烯醯胺之共聚物之說明性實例為上文所提及之Sephacryl®系列材料。在一些實施例中，衍生二氧化矽可包括偶合至合成或天然聚合物之二氧化矽粒子。此類實施例之實例包括(但不限於)多醣接枝二氧化矽、聚乙烯吡咯啶酮接枝二氧化矽、聚氧化乙烯接枝二氧化矽、聚(2-羥乙基天冬醯胺)二氧化矽及聚(N-異丙基丙烯醯胺)接枝二氧化矽。 在一些實施例中，層析基質為凝膠過濾基質，例如當用於如本文所述之移除濾筒中時。一般而言，凝膠過濾可藉由其經設計以經歷之特性表徵。因此，凝膠過濾基質在一些態樣中允許在很大程度上基於尺寸分離細胞或其他生物實體。在一些此類態樣中，各別層析基質通常為如上所述之微粒多孔材料。層析基質可具有某一排阻極限，其通常關於分子量界定，高於該分子量，完全排阻分子進入孔隙。在一些實施例中，界定尺寸排阻極限之各別分子量可經選擇以低於對應於靶細胞重量之重量。在此實施例中，阻止靶細胞進入尺寸排阻層析基質之孔隙。同樣，固定相可具有尺寸小於所選靶細胞之尺寸的孔隙。在說明性實施例中，層析基質之平均孔徑為0至約500 nm。 在一些實施例中，存在於諸如試劑(例如受體結合劑或選擇劑)或競爭試劑之樣品中之組分可具有低於孔隙之排阻極限的尺寸且因此可進入層析基質之孔隙。在一些態樣中，在能夠部分或完全進入孔隙體積之此類組分中，可首先溶離較不接近孔隙體積之較大分子，而最小分子通常最後溶離。在一些實施例中，層析基質之排阻極限選擇為低於靶細胞之最大寬度。因此，在一些態樣中，相較於靶細胞，可接近孔隙體積之組分可保持於層析基質中/上更久。因此，在一些情況下，靶細胞可與樣品之其他物質/組分分開在層析管柱之溶離液中收集。因此，在一些態樣中，諸如試劑(例如受體結合劑或選擇劑)，或適用時競爭試劑之組分可在相較於靶細胞更晚之時間點自凝膠過濾基質溶離。在一些實施例中，此效應可進一步增加，諸如在凝膠滲透基質含有試劑(諸如共價鍵結於其上)，該試劑含有能夠結合存在於樣品中之試劑(例如受體結合劑或選擇劑)及/或競爭試劑之結合位點Z之情況下。在一些情況下，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)及/或競爭試劑可由試劑之結合位點Z結合且藉此固定於基質上。在一些態樣中，此方法在移除濾筒中進行。 在一些實施例中，本發明方法中採用之層析基質亦可包括磁性吸引物質，諸如一或多個磁性吸引粒子或鐵磁流體。各別磁性吸引粒子可包含具有能夠結合靶細胞之結合位點的試劑。在一些情況下，磁性吸引粒子可含有反磁、鐵磁、順磁或超順磁材料。一般而言，超順磁材料響應於具有感應磁場之磁場而無所得永久磁化。基於氧化鐵之磁性粒子例如可以Dynabeads®形式商購自Dynal Biotech，以磁性微珠形式商購自Miltenyi Biotec，以磁性多孔玻璃珠形式商購自CPG Inc.，以及各種其他來源，諸如Roche Applied Science、BIOCLON、BioSource International Inc.、micromod、AMBION、Merck、Bangs Laboratories、Polysciences或Novagen Inc.(僅列舉幾例)。已例如由Hutten, A.等人 (J. Biotech. (2004), 112, 47-63)描述基於超順磁Co及FeCo以及鐵磁性Co奈米結晶之磁性奈米粒子。在其他實施例中，本發明方法中採用之層析基質為任何磁性吸引物質之空隙。 在一些實施例中，提供含有第一及第二固定相之至少一種配置，諸如用於細胞選擇之層析管柱(選擇濾筒)及用於試劑移除之第二層析管柱(移除濾筒)之裝置。裝置可包含串聯流體連接之第一及第二固定相(層析管柱)之複數個配置。裝置可包含流體連接至第一及第二固定相之第一配置之第一固定相之樣品入口。在一些實施例中，裝置亦可包含用於細胞之樣品出口，該樣品出口流體連接至用於層析之第一及第二固定相之至少一種配置之最後一者之第二固定相。在一些態樣中，裝置亦可包含流體連接第一及第二固定相之配置之第一固定相中之至少一者之競爭試劑容器。 2. 可溶試劑在一些實施例中，試劑不結合至固體擔體，亦即其以可溶形式存在或為可溶的。原則上，可使用相同試劑，如在固定於擔體，諸如固體擔體或固定相上之試劑。舉例而言，可在不將此類試劑固定或連接至擔體，例如不連接固體擔體或固定相之情況下使用上文所述之例示性試劑中之任一者。在一些實施例中，試劑含有複數個用於經由與結合搭配物C之相互作用而可逆結合至結合劑之結合位點Z。在一些情況下，試劑為個別分子之寡聚物或聚合物或構成個別分子之亞單位之複合物之寡聚物或聚合物(例如二聚、三聚或四聚蛋白質之寡聚物或聚合物)。在一些實施例中，試劑可例如為提供抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚物、調鈣蛋白寡聚物、至少兩個螯合基團K之化合物(寡聚物)，其中至少兩個螯合基團能夠結合至過渡金屬離子，藉此使得試劑能夠結合至寡組胺酸親和標籤、多聚麩胱甘肽-S-轉移酶或生物素標記之載劑蛋白。 在一些實施例中，試劑係藉由不存在連接至試劑之固體擔體(表面)表徵。舉例而言，在一些實施例中，試劑不包括或並連接(直接地或間接地)至粒子、珠粒、奈米粒子、微球或其他固體擔體。在一些實施例中，試劑並非剛性、非可撓或硬性的或不包括或不連接至剛性、非可撓或硬性表面。在一些實施例中，試劑為可撓性或基本上可撓性的。在一些情況下，試劑能夠調節或適應於細胞表面之形式。在一些實施例中，試劑並非或不包含球形或大體上球體之形狀。 在一些實施例中，基本上所有，亦即大於80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%之試劑為有機材料、由有機材料組成或含有有機材料。舉例而言，在一些實施例中，大於80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或大於99%之試劑為脂質、碳水化合物、蛋白質、肽或其混合物，由該等物質組成或含有該等物質。在一些實施例中，試劑為基本不存在之無機材料、無機核心(例如金屬，例如鐵)、合成或無機聚合物(諸如苯乙烯聚合物、例如聚苯乙烯)、乳膠、二氧化矽或磁心，由該等物質組成或含有該等物質。舉例而言，在一些實施例中，試劑或包含作為試劑之一部分的無機材料之相對百分比為小於20%、15%、10%、5%或小於5%。 在一些實施例中，水溶液中之試劑之總體積之大多數(亦即大於50%)，諸如大於60%、70%、80%、90%、95%、99%或大於99%由包含試劑之個別蛋白分子，諸如個別分子之寡聚物或聚合物或構成個別分子(例如四聚分子)之亞單位之複合物組成。在一些實施例中，可溶試劑之總密度為小於1.2 g/cm3 、1.1 g/cm3 、1.0 g/cm3 或更小。 在一些實施例中，例如不連接至擔體或固體擔體(例如不連接至珠粒)之可溶試劑具有相對較小尺寸，諸如尺寸一般小於或大約小於20 nM，諸如小於或大約小於15 nM、小於或大約小於10 nM、小於或大約小於5 nM或更小。 在一些實施例中，例如不連接至擔體或固體擔體(例如不連接至珠粒)之可溶試劑為生物惰性的，亦即其對活細胞無毒。在一些實施例中，試劑可為可生物降解的，例如其可藉由酶活性降解或藉由吞噬細胞清除。 在一些實施例中，有可能使試劑(例如抗生蛋白鏈菌素或突變蛋白，諸如四聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)與載劑，諸如有機載劑反應。在一些態樣中，除與多醣反應以外，亦有可能使用生理學上或醫藥學上可接受之蛋白質，諸如血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA))作為載劑蛋白。在此情況下，試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白(以個別四聚體形式或亦呈寡聚物形式)可經由非共價相互作用偶合至載劑蛋白。在一些此類實施例中，生物素標記之BSA (其可商購自各種供應商，諸如ThermoFisher Scientific、Sigma Aldrich或Vectorlabs，僅列舉幾例)可與試劑(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)反應。在一些態樣中，試劑寡聚物(例如抗生蛋白鏈菌素寡聚物)中之一些可經由一或多個結合位點Z非共價結合至生物素標記之載劑蛋白，留下可用於結合試劑(例如受體結合劑或選擇劑)及如本文所述之任何其他試劑之寡聚物之大多數結合位點Z。因此，藉由此類方法，可製備具有多個結合位點Z之可溶試劑。 在一些實施例中，試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白(以個別四聚體形式或亦呈寡聚物形式)可共價偶合至合成載劑，諸如聚乙二醇(PEG)分子。舉例而言，任何適合之PEG分子可用於此目的，且PEG分子及各別試劑可為可溶的。通常，至多1000 Da分子量之PEG分子可溶於可用於本發明方法之水或培養基中。在一些情況下，此類基於PEG之試劑可使用市售活化PEG分子(例如購自NOF North America Corporation, Irvine, California, USA之PEG-NHS衍生物，或購自Creative PEGWorks, Chapel Hills, North Carolina, USA之活化PEG衍生物)與抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之胺基製備。 3. 試劑在一些實施例中，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)具有一或個用於結合至細胞表面上之分子，例如細胞表面分子之結合位點B。因此，在一些情況下，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)含有一個結合位點B或複數個結合位點B，其中試劑(受體結合劑或選擇劑)與靶細胞表面上之分子之間的特異性結合含有B與分子之間的相互作用。在一些實施例中，試劑僅含有單一結合位點，亦即為單價。在一些實施例中，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)具有至少兩個，諸如複數個結合位點B，包括三個、四個或五個能夠結合至細胞表面分子之結合位點B。在一些此類態樣中，至少兩個或複數個結合位點B可相同。在一些實施例中，至少兩個或複數個結合位點B中之一或多者可不同(例如B1及B2)。 在一些實施例中，一或多種不同試劑(例如一或多種不同受體結合劑、選擇劑或其他結合至細胞上之分子的試劑)可逆地結合至試劑。在一些實施例中，試劑為寡聚粒子試劑。在一些實施例中，至少2、3、4或更多種不同試劑可逆地結合至相同試劑。在一些實施例中，至少兩種不同試劑可逆地結合至相同試劑，藉此各試劑包含一個結合位點B或複數個結合位點B用於試劑與分子之間的特異性結合。在一些實施例中，至少兩種或大於兩種試劑含有相同結合位點B，例如用以結合相同或基本上相同之分子。在一些實施例中，至少兩種或大於兩種試劑含有不同結合位點B，例如用以結合至不同分子。在一些實施例中，第一試劑(例如第一受體結合劑或第一選擇劑)含有結合位點B1、B2、B3、B4等且第二試劑(例如第二受體結合劑或第二選擇劑)含有另外的結合位點B1、B2、B3、B4等。在一些實施例中，第一試劑(例如第一選擇劑)含有結合位點B1且第二試劑(例如第二選擇劑)含有結合位點B3。在一些實施例中，第一試劑(例如第一受體結合劑)含有結合位點B2且第二試劑(例如第二受體結合劑)含有結合位點B4。在此類實施例中之任一者中，第一試劑及第二試劑可含有結合搭配物C1或C2。在一些實施例中，C1及C2可相同。在一些實施例中，C1及C2不同。在一些實施例中，第一試劑及第二試劑含有相同結合搭配物C1。 在一些情況下，試劑與試劑之結合位點Z之間的結合(例如經由結合位點B)之解離常數(Kd )可具有介於約10- 2 M至約10- 13 M，或約10- 3 M至約10- 12 M或約10- 4 M至約10- 11 M，或約10- 5 M至約10- 10 M範圍內之值。在一些實施例中，結合劑與分子之間的結合之解離常數(Kd )具有低親和力，例如在約10− 3 至約10− 7 M之Kd 範圍內。在一些實施例中，結合劑與分子之間的結合之解離常數(Kd )具有高親和力，例如在約10− 7 至約1×10− 10 M之Kd 範圍內。 在一些實施例中，試劑經由結合位點B與分子之結合的解離充分快速地出現，例如以允許靶細胞僅短暫染色或在破壞試劑與試劑之間的可逆結合之後與試劑締合。在一些情況下，當關於k離 速率(亦稱作試劑與分子之間的結合(經由結合位點B)之解離速率常數)表示時，k離 速率為約0.5×10− 4 sec− 1 或更大、約1×10− 4 sec− 1 或更大、約2×10− 4 sec− 1 或更大、約3×10− 4 sec− 1 或更大、約4×10− 4 sec− 1 或更大、約5×10− 4 sec− 1 或更大、約1×10− 3 sec− 1 或更大、約1.5×10− 3 sec− 1 或更大、約2×10− 3 sec− 1 或更大、約3×10− 3 sec− 1 或更大、約4×10− 3 sec− 1 、約5×10− 3 sec− 1 或更大、約1×10− 2 sec或更大、或約5×10− 1 sec− 1 或更大。憑經驗確定適合於特定試劑及細胞分子相互作用之k離 速率範圍在熟習此項技術者之能力內(參見例如美國公佈申請案第US2014/0295458號)。舉例而言，可使用具有例如大於4.0×10− 4 sec− 1 之相當高k離 速率之試劑以使得在破壞結合複合物之後，可在一小時內移除或解離大部分試劑。在其他情況下，可使用具有例如1.0×10− 4 sec− 1 之較低k離 速率之試劑，以使得在破壞結合複合物之後，可在約3個半小時內自細胞移除或解離大部分試劑。 在一些實施例中，此結合之Kd 以及形成於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)之結合位點B與細胞表面分子之間的結合之k離 及k合 速率可藉由任何適合之方法測定，例如藉由螢光滴定、平衡滲析或表面電漿子共振。 在一些態樣中，細胞表面分子為試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可針對之分子。在一些實施例中，細胞表面分子為肽或蛋白質，諸如受體，例如膜受體蛋白。在一些實施例中，受體為脂質、多醣或核酸。在一些實施例中，為蛋白質之細胞表面分子可為外周膜蛋白質或膜本體蛋白質。細胞表面分子可在一些實施例中具有一或多個跨膜域。作為一些說明性實例，具有跨膜域之膜蛋白質可為G蛋白偶合受體，諸如氣味劑受體、視紫質受體、視紫質費洛蒙受體、肽激素受體、味覺受體、GABA受體、鴉片受體、血清素受體、Ca2+受體、黑視素、神經傳遞質受體(諸如配位體門控、電壓門控或機械門控受體，包括乙醯膽鹼、菸鹼、腎上腺素、去甲腎上腺素、兒茶酚胺、L-DOPA-、多巴胺及血清素(生物胺、內啡肽/腦啡肽)神經肽受體)、受體激酶(諸如絲胺酸/蘇胺酸激酶、酪胺酸激酶)、孔蛋白/通道(諸如氯通道、鉀通道、鈉通道)、OMP蛋白質、ABC轉運體(ATP結合卡匣轉運體，諸如胺基酸轉運體、Na-葡萄糖轉運體、Na/碘化物轉運體)、離子轉運體(諸如集光複合體)、細胞色素c氧化酶、ATP酶Na/K、H/K、Ca、細胞黏附受體(諸如金屬蛋白酶、整合素或鈣黏素)。 在一些實施例中，細胞表面分子可為界定所需細胞群體或亞群，例如血細胞群體或亞群，例如淋巴細胞(例如T細胞、T輔助細胞(例如CD4+ T輔助細胞)、B細胞或自然殺手細胞)、單核細胞或幹細胞，例如CD34陽性周圍幹細胞或Nanog或Oct-4表現幹細胞之抗原。T細胞之實例包括諸如CMV特異性CD8+ T-淋巴細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞及調節T細胞(Treg)之細胞。Treg之說明性實例為CD4 CD25 CD45RA Treg細胞且記憶T細胞之說明性實例為CD62L CD8+特異性中樞記憶T細胞。細胞表面分子亦可為腫瘤細胞之標記物。 如上文所述，在一些實施例中，除能夠結合細胞表面分子之結合位點B以外，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)具有結合搭配物C。在一些態樣中，此結合搭配物C能夠結合至試劑之結合位點Z，其中試劑具有一或多個用於結合搭配物C之結合位點。在一些實施例中，可在包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C與試劑之結合位點Z之間形成之非共價鍵可具有任何所需強度及親和力，且可在進行該方法之條件下可破壞或可逆。試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可包括至少一種，包括兩種、三種或更多種額外結合搭配物C且試劑可包括至少兩個，諸如三個、四個、五個、六個、七個、八個或更多個用於包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C之結合位點Z。如美國專利7,776,562、美國專利8,298,782或國際專利申請案WO 2002/054065中所述，可選擇結合搭配物C與具有一或多個對應結合位點Z之試劑之任何組合，例如以使得結合搭配物C及結合位點Z能夠在複合物中可逆地結合，以便引起親合力效應。 包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C可例如為烴基的(包括聚合的)且包括氮、磷、硫、碳、鹵素或假鹵素基團。在一些態樣中，其可為醇、有機酸、無機酸、胺、膦、硫醇、二硫化物、烷烴、胺基酸、肽、寡肽、多肽、蛋白質、核酸、脂質、醣、寡醣、或多醣。作為其他實例，其亦可為陽離子、陰離子、聚陽離子、聚陰離子、聚陽離子、電解質、聚電解質、碳奈米管或碳奈米發泡體。一般而言，此類結合搭配物C針對試劑之結合位點之親和力高於針對其他物質之親和力。各別結合搭配物C之實例包括(但不限於)冠醚、免疫球蛋白、其片段及具有抗體樣功能之蛋白質結合分子。 在一些實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C包括生物素且試劑包括可逆地結合至生物素之抗生蛋白鏈菌素類似物或抗生物素蛋白類似物。在一些實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C包括可逆地結合至抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白之生物素類似物，且試劑包括可逆地結合至各別生物素類似物之抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素類似物或抗生物素蛋白類似物。在一些實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C包括抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白結合肽且試劑包括可逆地結合至各別抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白結合肽之抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素類似物或抗生物素蛋白類似物。 在一些實施例中，試劑為抗生蛋白鏈菌素，諸如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白，包括上文所述之任何突變蛋白(例如SEQ ID NO: 3-6或60-61中所闡述)，且包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C可包括抗生蛋白鏈菌素結合肽。在一些實施例中，抗生蛋白鏈菌素結合肽可包括具有SEQ ID NO: 9中所闡述之通式之序列，諸如含有SEQ ID NO: 10中所闡述之序列。在一些實施例中，肽序列具有SEQ ID NO: 11中所闡述，諸如SEQ ID NO: 12中所闡述之通式。在一個實例中，肽序列為Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly (亦稱作Strep-tag®，闡述於SEQ ID NO: 7中)。在一個實例中，肽序列為Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (亦稱作Strep-tag® II，闡述於SEQ ID NO: 8中)。在一些實施例中，肽配位體含有至少兩個抗生蛋白鏈菌素結合模組之連續配置，其中兩個模組之間的距離為至少0個且不超過50個胺基酸，其中一個結合模組具有3至8個胺基酸且含有至少序列His-Pro-Xaa (SEQ ID NO: 9)，其中Xaa為麩醯胺酸、天冬醯胺或甲硫胺酸，且其中另一結合模組具有相同或不同抗生蛋白鏈菌素肽配位體，諸如SEQ ID NO: 11中所闡述(參見例如國際公佈PCT申請案第WO02/077018號；美國專利第7,981,632號)。在一些實施例中，肽配位體含有具有SEQ ID NO: 13或14中之任一者中所闡述之式之序列。在一些實施例中，肽配位體具有SEQ ID NO: 15-19中之任一者中所闡述之胺基酸之序列。 在一些實施例中，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)之結合搭配物C包括熟習此項技術者稱為親和標籤之部分。在此類實施例中，試劑可包括已知結合至親和標籤之對應結合搭配物，例如抗體或抗體片段。作為已知親和標籤之一些說明性實例，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C可包括二硝基苯酚或地高辛、寡組胺酸、聚組胺酸、免疫球蛋白域、麥芽糖結合蛋白、麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)或硫氧還原蛋白、調鈣蛋白結合肽(CBP)、FLAG'-肽、HA-標籤(序列：Tyr-Pro-Tyr-Asp-Val-Pro-Asp-Tyr-Ala)(SEQ ID NO: 20)、VSV-G-標籤(序列：Tyr-Thr-Asp-Ile-Glu-Met-Asn-Arg-Leu-Gly-Lys)(SEQ ID NO: 21)、HSV-標籤(序列：Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp)(SEQ ID NO: 22)、T7抗原決定基(Ala-Ser-Met-Thr-Gly-Gly-Gln-Gln-Met-Gly)(SEQ ID NO: 22)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、單純疱疹病毒醣蛋白D之序列Gln-Pro-Glu-Leu-Ala-Pro-Glu-Asp-Pro-Glu-Asp (SEQ ID NO: 24)之HSV抗原決定基、序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu (SEQ ID NO: 25)之轉錄因子c-myc之「myc」抗原決定基、V5-標籤(序列：Gly-Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu-Gly-Leu-Asp-Ser-Thr)(SEQ ID NO: 26)或麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)。在此類實施例中，複合物形成於可為抗體或抗體片段之試劑之一或多個結合位點Z之間，且抗原可藉由添加游離抗原，亦即游離肽(抗原決定基標籤)或游離蛋白質(諸如MBP或CBP)而競爭性地破壞。在一些實施例中，親和標籤亦可為寡核苷酸標籤。在一些情況下，此類寡核苷酸標籤可例如用於雜交至具有互補序列之寡核苷酸、連接至試劑或包含於試劑中。 適合之結合搭配物C之其他實例包括(但不限於)凝集素、蛋白A、蛋白G、金屬、金屬離子、氮基三乙酸衍生物(NTA)、RGD-基元、聚葡萄糖、聚乙二亞胺(PEI)、氧化還原聚合物、醣蛋白、適體、染料、直鏈澱粉、麥芽糖、纖維素、幾丁質、麩胱甘肽、調鈣蛋白、明膠、多黏菌素、肝素、NAD、NADP、離胺酸、精胺酸、苯甲脒、poly U、或寡聚脫氧胸苷酸(oligo-dT)。已知諸如伴刀豆球蛋白A之凝血素結合至多醣及糖基化蛋白質。染料之說明性實例為三嗪染料，諸如Cibacron blue F3G-A (CB)或Red HE-3B，其特異性結合NADH依賴性酶。通常，Green A結合至Co A蛋白質、人血清白蛋白及去氫酶。在一些情況下，染料7-胺基放線菌素D及4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚結合至DNA。一般而言，諸如Ni、Cd、Zn、Co、或Cu之金屬之陽離子通常用於結合親和標籤，諸如含有寡組胺酸之序列，包括六組胺酸或His-Asn-His-Arg-His-Lys-His-Gly-Gly-Gly-Cys標籤(MAT標籤)(SEQ ID NO: 35)，及N-甲基丙烯醯基-(L)-半胱胺酸甲酯。 在一些實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C於試劑之一或多個結合位點Z之間的結合在二價、三價或四價陽離子存在下出現。就此而言，在一些實施例中，試劑包括二價、三價或四價陽離子，通常藉助於適合之螯合劑保持，例如複合。在一些實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C可包括一個部分，該部分包括，例如複合二價、三價或四價陽離子。各別金屬螯合劑之實例包括(但不限於)乙二胺、乙烯-二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、N,N-雙(羧甲基)甘胺酸(亦稱作氮基三乙酸，NTA)、1,2-雙(鄰胺基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、2,3-二巰基-l-丙醇(二巰基丙醇)、卟吩及血紅素。舉例而言，EDTA與大部分單價、二價、三價及四價金屬離子，諸如銀(Ag+ )、鈣(Ca2 + )、錳(Mn2 + )、銅(Cu2 + )、鐵(Fe2 + )、鈷(Co+ )及鋯(Zr4 + )形成複合物，而BAPTA對Ca2 + 具有特異性。作為說明性實例，用於此項技術中之標準方法為在寡組胺酸標籤與銅(Cu2 + )、鎳(Ni2 + )、鈷(Co2 + )或鋅(Zn2 + )離子之間形成複合物，該等離子係藉助於螯合劑氮基三乙酸(NTA)呈現。 在一些實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C包括調鈣蛋白結合肽且試劑包括如例如美國專利5,985,658中所述之多聚調鈣蛋白。在一些實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C包括FLAG肽且試劑包括結合至FLAG肽之抗體，例如旗標肽，其結合至單株抗體4E11，如美國專利4,851,341中所述。在一個實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C包括寡組胺酸標籤且試劑包括結合寡組胺酸標籤之抗體或過渡金屬離子。在一些情況下，可藉由金屬離子螯合，例如鈣螯合，例如藉由添加EDTA或EGTA而實現所有此等結合複合物之破壞。在一些實施例中，調鈣蛋白、諸如4E11之抗體或螯合金屬離子或游離螯合劑可藉由習知方法多聚化，例如藉由生物素化及與抗生蛋白鏈菌素或抗生物素蛋白或其寡聚物複合，或藉由在第一步驟中將羧基殘基引入至多醣，例如聚葡萄糖中，基本上如Noguchi, A等人 Bioconjugate Chemistry (1992) 3, 132-137中所述，且在第二步驟中使用習知碳化二亞胺化學方法，經由第一胺基將調鈣蛋白或抗體或螯合金屬離子或游離螯合劑連接至多醣，例如聚葡萄糖主鏈中之羧基。在一些此類實施例中，包含於試劑(例如受體結合劑或選擇劑)中之結合搭配物C於試劑之一或多個結合位點Z之間的結合可藉由金屬離子螯合破壞。金屬螯合可例如藉由添加EGTA或EDTA實現。 在一些實施例中，特異性結合至細胞表面分子之試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可例如為抗體、其片段或具有抗體樣功能之蛋白質結合分子所包含。在一些實施例中，試劑之結合位點B為抗體組合位點，諸如為或含有抗體之一或多個互補決定區(CDR)。(重組)抗體片段之實例包括(但不限於)Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(scFv)、諸如(Fab)2'片段之二價抗體片段、雙功能抗體、三功能抗體(Iliades, P.等人, FEB S Lett (1997) 409, 437-441)、十功能抗體(Stone, E.等人, Journal of Immunological Methods (2007) 318, 88-94)及其他域抗體(Holt, L.J.等人, Trends Biotechnol. (2003), 21, 11, 484-490)、單域抗體(nanobodies®)。在一些實施例中，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可包含二價蛋白質人工結合分子，諸如亦稱為「duocalin」之二聚脂質運載蛋白突變蛋白。 在一些實施例中，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可具有單一結合位點B，亦即其可為單價的。單價試劑(例如受體結合劑或選擇劑)之實例包括(但不限於)單價抗體片段、具有抗體樣結合特性之蛋白質結合分子或MHC分子。單價抗體片段之實例包括(但不限於)Fab片段、Fv片段、單域抗體(例如駱駝源性nanobodies®)及單鏈Fv片段(scFv)，包括二價單鏈Fv片段。 在一些實施例中，試劑為抗體或其抗原結合片段，諸如Fab片段、Fv片段、單鏈Fv片段(scFv)、例如駱駝源性nanobodies®之單域抗體、諸如(Fab)2'片段之二價抗體片段。在一些實施例中，試劑為或衍生自已知結合至所關注之細胞分子之親本抗體。針對細胞表面分子之各種抗體分子或其片段為此項技術中熟知的且多種此類者中之任一者可用作本文方法中之試劑。在一些實施例中，試劑為在親本或參考抗體之可變重鏈中含有一或多個胺基酸置換之抗體或其片段，例如以產生具有改變之親和力或展現如上文所述之充分快速解離速率之抗體。舉例而言，在抗CD4抗體13B8.2之突變體之背景下已知例示性此類突變(參見例如美國專利第7,482,000號、美國專利申請案第US2014/0295458號或國際專利申請案第WO2013/124474號)，且此類突變中之任一者可在另一親本或參考抗體中產生。 在一些態樣中，試劑(例如受體結合劑或選擇劑)可為單價的，例如包含單價抗體片段或單價人工結合分子(蛋白質或其他)，諸如基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白(亦稱為「Anticalin®」)，或二價分子，諸如保留兩個結合位點之抗體或片段，諸如F(ab')2片段。 具有抗體樣功能之蛋白質結合分子之實例包括基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白(參見例如WO 03/029462，Beste等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1999) 96, 1898-1903)。一般而言，脂質運載蛋白，諸如後膽色素結合蛋白、人類嗜中性白血球明膠酶相關脂質運載蛋白、人類阿撲脂蛋白D或人淚液脂質運載蛋白具有可經修飾以使其結合給定標靶之天然配位體結合位點。具有可用作特異性結合至細胞表面分子之試劑(例如受體結合劑或選擇劑)之抗體樣結合特性之蛋白質結合分子的其他實例包括(但不限於)所謂的黏抗體(glubodies)(參見例如國際專利申請案WO 96/23879)、基於錨蛋白支架之蛋白質(Mosavi, L.K.等人, Protein Science (2004) 13, 6, 1435-1448)或結晶支架(例如國際專利申請案WO 01/04144)、Skerra, J. Mol. Recognit. (2000) 13, 167-187中所述之蛋白質、阿德奈汀(AdNectin)、四連接素(tetranectin)及高親合性多聚體。一般而言，高親合性多聚體，包括藉由人類受體域家族之外顯子改組進化之多價高親和性多聚體蛋白質含有所謂的A-域，其以若干細胞表面受體中之多個域之串形式出現(Silverman, J.等人, Nature Biotechnology (2005) 23, 1556-1561)。一般衍生自人類纖維結合蛋白域之阿德奈汀通常含有三個可經工程改造以用於免疫球蛋白樣結合至標靶之環(Gill, D.S.及Damle, N.K., Current Opinion in Biotechnology (2006) 17, 653-658)。一般衍生自各別人類同源三聚蛋白質之四連接素 同樣通常含有可經工程改造以用於所需結合之C型凝集素域中之環區。可在一些情況下充當蛋白質配位體之類肽通常為寡聚(N-烷基)甘胺酸，其與肽之不同之處在於側鏈連接至醯胺氮而非碳原子。類肽通常對蛋白酶及其他修飾酶具抗性且可具有相較於肽高得多的細胞滲透性(參見例如Kwon, Y.-U.及Kodadek, T., J. Am. Chem. Soc. (2007) 129, 1508-1509)。 適合之蛋白質結合分子之其他實例包括(但不限於)EGF樣域、三環域、I型纖維結合蛋白域、II型纖維結合蛋白域、III型纖維結合蛋白域、PAN域、Gla域、SRCR域、Kunitz/牛胰臟胰蛋白酶抑制劑域、澱粉酶抑肽、Kazal型絲胺酸蛋白酶抑制劑域、車軸草(P型)域、C型血管性血友病因子域、過敏毒素樣域、CUB域、I型甲狀球蛋白重複、A類LDL受體域、壽司域(Sushi domain)、連接域、I型凝血栓蛋白域、免疫球蛋白域或免疫球蛋白樣域(例如域抗體或駱駝重鏈抗體)、C型凝集素域、MAM域、A型血管性血友病因子域、促生長因子B域、WAP型四二硫化物核心域、F5/8 C型域、凝血酵素域、SH2域、SH3域、層黏連蛋白型EGF樣域、C2域、「κ抗體(Kappabodies)」(Ill等人 Protein Eng (1997) 10, 949-57、所謂的「微型抗體」(Martin等人, EMBO J (1994) 13, 5303-5309)、雙功能抗體(Holliger等人, PNAS USA (1993)90, 6444-6448)、所謂的「Janusis」(Traunecker等人, EMBO J (1991) 10, 3655-3659，或Traunecker等人, Int J Cancer (1992) 增刊7, 51-52)、奈米抗體、微體、阿菲林(affilin)、親和抗體、打結素、泛素、鋅指蛋白、自發螢光蛋白、達爾潘蛋白(DARPins)或富白胺酸重複蛋白。在一些實施例中，具有抗體樣功能之核酸分子可為適體。一般而言，適體摺疊為界定三維基元且顯示針對給定目標結構之高親和力。 在某些實施例中，一或多種試劑，例如含有諸如結合搭配物C之結合搭配物之試劑附接、連接及/或結合至寡聚粒子試劑。在特定實施例中，一或多種試劑可逆地附接、連接及/或結合至寡聚粒子試劑。在一些實施例中，一或多種試劑藉由接觸、處理及/或培育一或多種試劑與寡聚粒子試劑而附接、連接及/或結合，例如可逆地結合至寡聚粒子試劑。在某些實施例中，藉由混合及/或搖動，例如溫和搖動及/或混合進行處理、接觸及/或培育。 在某些實施例中，一或多種試劑持續、持續大約或持續至少1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、90分鐘、120分鐘、4小時、6小時、8小時、12小時、16小時或24小時與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，一或多種試劑持續1分鐘至12小時之間、1分鐘至1小時之間、1分鐘至30分鐘之間、10分鐘至60分鐘之間、10分鐘至20分鐘之間、1小時至3小時之間、1小時至2小時之間、或6小時至12小時之間與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。在某些實施例中，一或多種試劑持續5分鐘至30分鐘之間，或持續15分鐘或約15分鐘與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。 在特定實施例中，一或多種試劑在、在大約或在至少4℃、8℃、12℃、16℃、20℃、24℃、28℃、32℃、37℃、39℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃或100℃之溫度下與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。在一些實施例中，一或多種試劑在4℃與39℃之間、10℃與37℃之間、10℃與25℃之間、20℃與30℃之間、24℃與39℃之間、或40℃與100℃之間的溫度下與寡聚分子培育、處理及/或接觸。在特定實施例中，一或多種試劑在室溫下與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。在某些實施例中，一或多種試劑在或在大約23℃、24℃、25℃、或26℃±2℃、±1℃、±0.5℃、±0.2℃、±0.1℃、±0.05℃、或±0.01℃下與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。 在某些實施例中，一或多種試劑以每0.5 µg、1.0 µg、1.5 µg、2.0 µg、2.5 µg、3.0 µg、4.0 µg、5.0 µg、6 µg、7 µg、8 µg、9 µg或10 µg寡聚粒子試劑恰好、大約或至少0.1 µg、0.2 µg、0.3 µg、0.4 µg、0.5 µg、0.6 µg、0.7 µg、0.8 µg、0.9 µg、1.0 µg、1.2 µg、1.4 µg、1.6 µg、1.8 µg、2.0 µg、2.2 µg、2.4 µg、2.6 µg、2.8 µg或3.0 µg試劑之量與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。在特定實施例中，一或多種試劑以每2 µg、3 µg、4 µg、或5 µg寡聚粒子試劑約1.0 µg試劑之量與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。 在一些實施例中，一或多種試劑，例如含有諸如結合搭配物C之結合搭配物之試劑藉由培育、處理及或接觸寡聚粒子試劑與一或多種試劑而附接、連接及/或結合至寡聚粒子試劑。在一些實施例中，一或多種試劑在4℃與39℃之間、10℃與25℃之間、或20℃與30℃之間的溫度下持續1分鐘至1小時之間以每2 µg、3 µg、4 µg、或5 µg寡聚粒子試劑恰好或大約1.0 µg試劑之量與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。在特定實施例中，一或多種試劑在10℃與25℃之間的溫度下持續5分鐘至30分鐘之間以每3 µg寡聚粒子試劑約1.0 µg試劑之量與寡聚粒子試劑培育、處理及/或接觸。 a. 受體結合劑在一些實施例中，試劑為受體結合劑。在一些實施例中，受體結合劑結合至細胞表面上之分子(例如受體)，試劑與分子之間的該結合能夠誘導或調節細胞中之信號。在一些情況下，細胞表面分子(例如受體)為信號傳導分子。在一些此類情況下，受體結合劑能夠特異性結合至藉由細胞中之一或多者表現之信號傳導分子。在一些情況下，受體結合劑為刺激劑，其可為能夠在結合至諸如受體之細胞表面分子後在細胞(例如T細胞)中誘導信號之任何試劑。在一些實施例中，信號可為免疫刺激性的，在此情況下，受體結合劑或刺激劑能夠誘導或調節參與免疫反應或藉由細胞(例如T細胞)刺激免疫反應之信號，例如增加免疫細胞增殖或擴增、免疫細胞活化、免疫細胞分化、細胞介素分泌、細胞毒性活性或免疫細胞之一或多種其他功能活性。在一些實施例中，信號可為抑制性的，在此情況下，受體結合劑或刺激劑能夠在細胞(例如T細胞)中誘導或調節參與或抑制免疫反應之信號，例如抑制或減少免疫細胞增殖或擴增、免疫細胞活化、免疫細胞分化、細胞介素分泌、細胞毒性活性或免疫細胞之一或多種其他功能活性。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑為第一受體結合劑，例如第一刺激劑。在一些態樣中，第一受體結合劑，例如第一刺激劑結合至細胞表面上之受體分子。因此，在一些情況下，第一受體結合劑，例如第一刺激劑誘導或調節信號。在一些態樣中，藉由第一受體結合劑，例如第一刺激劑誘導或調節信號實現細胞之活化、刺激及/或擴增(增殖)。因此，在一些情況下，第一受體結合劑，例如第一刺激劑向細胞提供原始活化信號，藉此活化細胞。 在一些實施例中，細胞群體可為淋巴細胞群體，包括(但不限於)B細胞群體、T細胞群體或自然殺手細胞群體。細胞群體之說明性實例為攜有CD40或CD137之B細胞(兩種細胞群體均可在僅結合第一試劑後增殖，該第一試劑提供活化信號，例如4-1BB配位體；或αCD40抗體分子或αCD137抗體分子(參見例如Zhang等人, 2010, J Immunol, 184:787-795))。可用於擴增B細胞之試劑(第一或第二試劑)之其他說明性實例為結合至IgG、CD19、CD28或CD14，例如αCD19、αIgG、αCD28、或αCD14抗體分子之試劑。亦預想用於擴增B細胞之第一或第二試劑可包含用於鐸樣受體或介白素之配位體，諸如IL-21 (參見例如Dienz O等人 2009. J. Exp. Med. 206:69)。應注意，B細胞之脂多醣依賴性活化亦包涵於本發明中，因為脂多醣亦可用作第一試劑且可裝備有如本文所用之結合搭配物C1。 適合之細胞群體之其他說明性實例包括在藉由將第一試劑結合至TCR/CD3及將第二試劑結合至T細胞上之輔助分子，諸如CD28而活化之後擴增之T細胞群體。在此狀況下，第一試劑刺激T細胞中之TCR/CD3複合物相關信號且第二試劑藉由結合作為輔助分子之CD28而提供二次刺激。可用於擴增T細胞之試劑亦可包括介白素，諸如IL-2、IL-7、IL-15或IL-21 (參見例如Cornish等人 2006, Blood. 108(2):600-8，Bazdar及Sieg, 2007, Journal of Virology, 2007, 81(22):12670-12674，Battalia等人, 2013, Immunology, 139(1):109-120)。可用於擴增T細胞之試劑之其他說明性實例為結合至CD8、CD45或CD90之試劑，諸如αCD8、αCD45或αCD90抗體。T細胞群體之說明性實例包括抗原特異性T細胞、T輔助細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞(記憶T細胞之說明性實例為CD62L+ CD8+ 特異性中樞記憶T細胞)或調節T細胞(Treg之說明性實例為CD4+ CD25+ CD45RA+ Treg細胞)。 適合之細胞群體之另一說明性實例包括自然殺手細胞(NK細胞)，其可例如藉由結合至CD16或CD56之試劑，諸如αCD16或αCD56抗體擴增。在說明性實例中，此類αCD16抗體為具有SEQ ID NO: 52中所示之VH序列及SEQ ID NO: 53中所示之VL序列之抗體3G8 (參見例如Hoshino等人, Blood. 1991年12月15日;78(12):3232-40)。可用於擴增NK細胞之另一試劑可為IL-15 (參見例如Vitale等人 2002. The Anatomical Record. 266:87-92)。適合之細胞群體之另一說明性實例包括單核細胞，其可例如使用結合至CD14之試劑，諸如αCD14抗體分子擴增。 在一些態樣中，受體結合劑，例如刺激劑特異性靶向表現於靶細胞表面上之分子，其中分子為TCR或嵌合抗原受體。舉例而言，表現於靶細胞表面上之分子選自T細胞或B細胞抗原受體複合物、CD3鏈、CD3 ξ、T細胞受體或B細胞受體之抗原結合部分或嵌合抗原受體。在一些情況下，受體結合劑靶向肽:MHC I類複合物。在一些態樣中，受體結合劑，例如刺激劑特異性結合至重組受體之抗體部分，例如CAR。在一些情況下，重組受體之抗體部分包括免疫球蛋白恆定區之至少一部分，諸如鉸鏈區，例如IgG4鉸鏈區，及/或CH1/CL及/或Fc區。在一些實施例中，恆定區或部分屬於人類IgG，諸如IgG4或IgG1。在一些情況下，試劑負載有識別IgG4間隔子之αIgG。 在一些實施例中，第一受體結合劑，例如第一刺激劑可刺激細胞，例如T細胞中之TCR/CD3複合物相關信號。在一些態樣中，第一受體結合劑，例如第一刺激劑可為特異性結合CD3之結合劑。在一些情況下，特異性結合CD3之第一受體結合劑，例如第一刺激劑可選自由以下各者組成之群：抗CD3抗體、抗CD3抗體之二價抗體片段、抗CD3抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD3結合分子。二價抗體片段可為(Fab)2 '片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由以下各者組成之群：Fab片段、Fv片段、奈米抗體(sdAntibody)及單鏈Fv片段(scFv)。在一些情況下，具有抗體樣結合特性之蛋白質CD3結合分子可為適體、基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白、黏抗體、基於錨蛋白支架之蛋白質、基於結晶支架之蛋白質、阿德奈汀、DARPin或高親和性多聚體。 在一些實施例中，抗CD3 Fab片段可衍生自藉由融合瘤細胞株OKT3 (ATCC® CRL-8001™；亦參見美國專利第4,361,549號)產生之CD3結合單株抗體。抗CD3抗體OKT3之重鏈之可變域及輕鏈之可變域描述於Arakawa等人 J. Biochem. 120, 657-662 (1996)中且分別包含SEQ ID NO: 31及32中所闡述之胺基酸序列。 在一些態樣中，受體結合劑，例如刺激劑為第二受體結合劑，例如第二刺激劑。在一些情況下，第二受體結合劑，例如第二刺激劑結合至細胞表面上之分子，諸如細胞表面分子，例如受體分子。在一些實施例中，第二受體結合劑，例如第二刺激劑能夠增強、抑制或修改遞送通過第一分子之信號。在一些實施例中，第二受體結合劑，例如第二刺激劑誘導或調節信號，例如第二或額外信號。在一些態樣中，第二受體結合劑，例如第二刺激劑可增強或強化藉由第一受體結合劑，例如第一刺激劑誘導之信號。在一些實施例中，第二受體結合劑，例如第二刺激劑結合至輔助分子及/或可刺激或誘導細胞中之輔助或二次信號。在一些態樣中，第二受體結合劑，例如第二刺激劑結合至共刺激分子及/或提供共刺激信號。 在一些實施例中，可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑之受體結合劑，例如刺激劑結合，例如特異性結合至第二分子，該第二分子可為共刺激分子、輔助分子、細胞介素受體、趨化因子受體、免疫檢查點分子、或TNF家族或TNF受體家族之成員。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CD28且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD28。在一些態樣中，特異性結合CD28之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗CD28抗體、抗CD28抗體之二價抗體片段、抗CD28抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD28結合分子。二價抗體片段可為(Fab)2'片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由以下各者組成之群：Fab片段、Fv片段、及單鏈Fv片段(scFv)。具有抗體樣結合特性之蛋白質CD28結合分子可為適體、基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白、黏抗體、基於錨蛋白支架之蛋白質、基於結晶支架之蛋白質、阿德奈汀及高親和性多聚體。在一些情況下，特異性結合受體之受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑，例如刺激劑為抗體或其抗原結合片段，例如Fab片段。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為結合，例如特異性結合至受體之配位體，例如在結合試劑後刺激或活化T細胞活化信號2，例如共刺激信號之細胞表面分子。在一些實施例中，受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑為內源性配位體、同源配位體、合成配位體及/或其部分、變異體或修改形式。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為內源性配位體及/或同源配位體之細胞外域或其部分。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑能夠結合至以下中之任何一或多者：CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BBL、CD30L及LIGHT。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為抗體、二價抗體(例如F(ab')2 片段或二價單鏈Fv片段)、單價抗體(例如Fab片段、Fv片段、或單鏈Fv片段(scFv))或CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BBL、CD30L及LIGHT中之任何一或多者之配位體，其中此類試劑能夠在將受體結合劑，例如刺激劑結合至分子後誘導或建模細胞中之信號。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BBL、CD30L及LIGHT中之任何一或多者之配位體，其中此類試劑能夠在將受體結合劑，例如刺激劑結合至分子後誘導或建模細胞中之信號。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為內源性配位體及/或同源配位體之細胞外域或其部分。舉例而言，在一些實施例中，受體結合劑為或含有B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、ICOS-L、PD-L1、OX40L、CD27、4-1BB (CD137)及/或CD30之細胞外域或其部分。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑能夠特異性結合至除CD28、CD3、CD137或CD40以外的靶細胞表面上之分子。在一些情況下，受體結合劑，例如刺激劑結合至除CD28、CD3、CD137或CD40以外的靶細胞表面上之分子誘導或調節靶細胞中之信號及/或改變靶細胞之功能，藉此產生經培養靶細胞。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑能夠結合至TNF家族或TNF受體家族之任何一或多個成員，例如TNF受體超家族之成員，及/或Wnt受體或輔受體，例如受體之捲曲蛋白(Frizzled；Fz)家族。 在一些實施例中，細胞上之分子為TNF受體超家族之成員，諸如腫瘤壞死因子受體1 (CD120a)、腫瘤壞死因子受體2 (CD120b)、淋巴毒素β受體(CD18)、OX40 (CD134)、CD40 (Bp50)、Fas受體(Apo-1，CD95)、誘餌受體3 (TR6，M68)、CD27 (S152，Tp55)、CD30 (Ki-1)、4-1BB (CD137)、死亡受體4 (TRAILR1，Apo-2，CD261)、死亡受體5 (TRAILR2，CD262)、誘餌受體1 (TRAILR3，LIT，TRID，CD263)、誘餌受體2 (TRAILR4，TRUNDD，CD264)、RANK (CD265)、骨保護素(OCIF，TR1)、TWEAK受體(Fn14，CD266)、TACI (IGAD2，CD267)、BAFF受體(CD268)、疱疹病毒進入介體(ATAR，TR2，CD270)、神經生長因子受體(p75NTR，CD271)、B細胞成熟抗原(TNFRSF13A，CD269)、糖皮質激素誘導之TNFR相關(AITR，CD357)、TROY (TAJ，TRADE)、死亡受體6 (CD358)、死亡受體3 (Apo-3，TRAMP，LARD，WS-1)或外異蛋白A2受體(XEDAR)。 在一些情況下，特異性結合TNF受體超家族蛋白質之受體結合劑為抗體或其抗原結合片段，例如Fab片段。在一些實施例中，特異性結合TNF受體超家族蛋白質之受體結合劑可為結合，例如特異性結合至受體之配位體，及/或細胞外域或其部分。在一些實施例中，配位體為或包括TNFα、淋巴毒素β (TNF-C)、OX40L、CD154、FasL、FasL、LIGHT、TL1A、CD70、Siva、CD153、4-1BB配位體、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、CAMLG、BAFF、LIGHT、NGF、BDNF、NT-3、NT-4、BAFF、GITR配位體、TL1A或EDA-A2，或跨膜蛋白中之任一者之細胞外域或其部分。 在一些實施例中，細胞上之分子為Wnt受體或輔受體、受體(諸如捲曲蛋白(Fz)家族受體)、脂蛋白受體相關蛋白(LRP)-5/6受體酪胺酸激酶(RTK)及受體相關孤兒受體2 (ROR2)。在一些實施例中，細胞上之分子為例如捲曲蛋白-1 (FZD1)、捲曲蛋白-2 (FZD2)、捲曲蛋白-3 (FZD3)、捲曲蛋白-4 (FZD4)、捲曲蛋白-5 (FZD5)、捲曲蛋白-6 (FZD6)、捲曲蛋白-7 (FZD7)、捲曲蛋白-8 (FZD8)、捲曲蛋白-9 (FZD9)或捲曲蛋白-10 (FZD10)。 在一些情況下，特異性結合Wnt受體或共受體之受體結合劑為抗體或其抗原結合片段，例如Fab片段。在一些實施例中，特異性結合Wnt受體或共受體之受體結合劑可為結合，例如特異性結合至受體之配位體。在一些實施例中，配位體為或包括例如WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、或WNT16。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑能夠結合至以下中之任何一或多者：CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40及HVEM。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為抗體、二價抗體(例如F(ab')2 片段或二價單鏈Fv片段)、單價抗體(例如Fab片段、Fv片段、或單鏈Fv片段(scFv))或CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40及HVEM中之任何一或多者之配位體，其中此類試劑能夠在將受體結合劑，例如刺激劑結合至分子後誘導或建模細胞中之信號。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為CD28、4-1BB (CD137)、CD40、CD40L、T細胞活化連接子(LAT)、CD27、OX40 (CD134)及疱疹病毒進入介體(HVEM)中之任何一或多者之配位體，其中此類試劑能夠在將受體結合劑，例如刺激劑結合至分子後誘導或建模細胞中之信號。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為內源性配位體及/或同源配位體之細胞外域或其部分。舉例而言，在一些實施例中，受體結合劑為或含有B7-1 (CD80)、B7-2 (CD86)、4-1BBL、CD40、CD40L、CD27L (CD70)及/或OX40L之細胞外域或其部分。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CD28且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD28。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CD28且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD28。在一些態樣中，特異性結合CD28之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗CD28抗體、抗CD28抗體之二價抗體片段、抗CD28抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD28結合分子。二價抗體片段可為F(ab')2 片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由以下各者組成之群：Fab片段、Fv片段、奈米抗體及單鏈Fv片段(scFv)。 在一些實施例中，抗CD28 Fab片段可衍生自抗體CD28.3 (以GenBank寄存編號AF451974.1寄存為合成單鏈Fv構築體；亦參見Vanhove等人, BLOOD, 2003年7月15日, 第102卷, 第2期, 第564-570頁)，其重鏈及輕鏈分別包含SEQ ID NO: 33及34。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CD90且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD90。在一些態樣中，特異性結合CD90之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗CD90抗體、抗CD90抗體之二價抗體片段、抗CD90抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD90結合分子。抗體或抗原結合片段可衍生自此項技術中已知之任何者。參見例如抗CD90抗體G7 (Biolegend，目錄號105201)。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CD95且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD95。在一些態樣中，特異性結合CD95之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗CD95抗體、抗CD95抗體之二價抗體片段、抗CD95抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD95結合分子。抗體或抗原結合片段可衍生自此項技術中已知之任何者。舉例而言，在一些態樣中，抗CD90抗體可為單株小鼠抗人類CD95 CH11 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY)或可為抗CD95 mAb 7C11或抗APO-1，諸如Paulsen等人Cell Death & Differentiation 18.4 (2011): 619-631中所述。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞或B細胞上之分子可為CD137且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD137。在一些態樣中，特異性結合CD137之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗CD137抗體、抗CD137抗體之二價抗體片段、抗CD137抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD137結合分子。抗體或抗原結合片段可衍生自此項技術中已知之任何者。舉例而言，抗CD137抗體可為如Taraban等人 Eur J Immunol. 2002年12月;32(12):3617-27中所述之LOB12、IgG2a或LOB12.3、IgG1。亦參見例如US6569997、US6303121、Mittler等人 Immunol Res. 2004;29(1-3):197-208。 在一些實施例中，細胞，例如B細胞上之分子可為CD40且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD40。在一些態樣中，特異性結合CD40之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗CD40抗體、抗CD40抗體之二價抗體片段、抗CD40抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD40結合分子。抗體或抗原結合片段可衍生自此項技術中已知之任何者。舉例而言，抗CD40抗體可為嵌合單株抗人類CD40抗體替奈昔單抗(Teneliximab)及抗人類CD40 (Affymetrix目錄號14-0409-80)，或例如US 2002/0142358、US 2007/0077242、WO 2001/083755、Zhang等人, 2010, J Immunol, 184:787-795中所述之任何者。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CD40L (CD154)且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)特異性結合CD40L。在一些態樣中，特異性結合CD40L之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗CD40L抗體、抗CD40L抗體之二價抗體片段、抗CD40L抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD40L結合分子。抗體或抗原結合片段可衍生自此項技術中已知之任何者。舉例而言，抗CD40L抗體可在一些態樣中為Hu5C8，如Blair et al. JEM 第191卷 第4期 651-660中所述。亦參見例如WO1999061065、US20010026932、US7547438、WO2001056603。在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為誘導性T細胞協同刺激因子(ICOS)、T細胞活化連接子(LAT)、CD27、OX40 (CD134)、疱疹病毒進入介體(HVEM)、CD90及/或CD95，且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)分別特異性結合ICOS、LAT、CD27、CD134、HVEM、CD90及/或CD95。在一些態樣中，特異性結合ICOS、LAT、CD27、CD134、HVEM、CD90及/或CD95之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為第二受體結合劑，例如第二刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗體、其二價抗體片段、其單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質結合分子。抗體或抗原結合片段可衍生自此項技術中已知之任何者。 在一些實施例中，可為第二或額外受體結合劑之受體結合劑結合至之細胞，例如T細胞上之分子細胞表面分子，該細胞表面分子在試劑結合後刺激或活化細胞介素信號、趨化因子信號、細胞黏附信號、T細胞活化信號或額外信號，例如環境信號。在一些實施例中，可為第二或額外受體結合劑之受體結合劑特異性結合至之細胞，例如T細胞上之分子為細胞介素受體或趨化因子受體。在一些情況下，受體結合劑，例如額外受體結合劑為或含有黏附分子，為誘導細胞介素產生、趨化因子產生、黏附分子表現之因子，及/或參與刺激及/或調節輔助信號及/或額外信號，例如環境信號。 在本文提供之實施例中之任一者中，受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑，例如刺激劑可為特異性結合受體，例如表現於細胞表面上之受體的結合劑。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑為抗體或其抗原結合片段，例如結合至細胞表面分子之抗體或其抗原結合片段，該細胞表面分子在試劑結合後刺激或活化細胞介素信號、趨化因子信號、細胞黏附信號、T細胞活化信號或額外信號，例如環境信號。在一些情況下，特異性結合受體之受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑，例如刺激劑可選自由以下各者組成之群：抗受體抗體、抗受體抗體之二價抗體片段、抗受體抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質受體結合分子。二價抗體片段可為F(ab')2 片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由以下各者組成之群：Fab片段、Fv片段、及單鏈Fv片段(scFv)。在一些情況下，具有抗體樣結合特性之蛋白質受體結合分子可為適體、基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白、黏抗體、基於錨蛋白支架之蛋白質、基於結晶支架之蛋白質、阿德奈汀、DARPin或高親和性多聚體。在一些情況下，特異性結合受體之受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑，例如刺激劑為抗體或其抗原結合片段，例如Fab片段。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為結合，例如特異性結合受體，例如細胞表面分子之配位體，該細胞表面分子在試劑結合後刺激或活化細胞介素信號、趨化因子信號、細胞黏附信號、T細胞活化信號或額外信號，例如環境信號。在一些實施例中，受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑為內源性配位體、同源配位體、合成配位體及/或其部分、變異體或修改形式。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為內源性配位體及/或同源配位體之細胞外域或其部分。 在一些實施例中，受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑為或含有特異性結合至細胞介素受體之配位體。在一些實施例中，受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑為或包含細胞介素受體之配位體，例如細胞介素或其部分。例示性細胞介素受體包括(但不限於)IL-2R、IL-7R、IL-21R、CD132 (IL受體共用γ鏈)、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-17R、TNFR1及TNFR2。例示性配位體，例如細胞介素包括(但不限於)IL-2、IL-7、IL-21、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、I型干擾素(例如IFNα及/或IFNβ)、IL-12、IL-17、IL-9及TNF，及其生物學活性片段。 在一些實施例中，受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑為特異性結合至細胞介素受體之抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，特異性結合細胞介素受體之受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑可選自由以下各者組成之群：抗(細胞介素受體)抗體、抗(細胞介素受體抗體之二價抗體片段、抗(細胞介素受體)抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質細胞介素受體結合分子。二價抗體片段可為F(ab')2 片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由以下各者組成之群：Fab片段、Fv片段、奈米抗體及單鏈Fv片段(scFv)。 在一些實施例中，受體結合劑，例如額外受體結合劑為或含有特異性結合至趨化因子受體之配位體。在一些實施例中，受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑為或包含趨化因子受體之配位體，例如趨化因子或其部分。例示性趨化因子受體包括(但不限於)CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4。例示性配位體，例如趨化因子包括(但不限於)CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21、及CCL25或其生物學活性片段。 在一些實施例中，受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑為特異性結合至趨化因子受體之抗體或其抗原結合片段。在一些情況下，特異性結合趨化因子受體之受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑可選自由以下各者組成之群：抗(趨化因子受體)抗體、抗(趨化因子受體)抗體之二價抗體片段、抗(趨化因子受體)抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質趨化因子受體結合分子。二價抗體片段可為F(ab')2 片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由以下各者組成之群：Fab片段、Fv片段、奈米抗體及單鏈Fv片段(scFv)。 在一些情況下，特異性結合誘導細胞介素之黏附分子或因子之受體結合劑為抗體或其抗原結合片段，例如Fab片段。在一些實施例中，特異性結合誘導細胞介素之黏附分子或因子之受體結合劑可為結合，例如特異性結合至受體之配位體。在一些實施例中，受體結合劑為黏附分子及/或受體之內源性配位體、同源配位體、合成配位體及/或其部分、變異體或修改形式。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑可為自身為細胞表面或跨膜蛋白之內源性配位體及/或同源配位體之細胞外域或其部分。 在一些情況下，細胞上之分子，例如黏附分子為CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1；分別示於SEQ ID NO: 36及37中之全長α及β鏈序列)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素；示於SEQ ID NO: 38中之全長序列)、CD29/CD49d (VLA-4；示於SEQ ID NO: 40中之全長序列)、CD106 (VCAM-1；示於SEQ ID NO: 39中之全長序列)或為其生物學活性片段。在一些實施例中，受體結合劑為結合，例如特異性結合至黏附分子之抗體或其抗原結合片段，該黏附分子為例如CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)、CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)或為其生物學活性片段。在一些實施例中，受體結合劑為結合，例如特異性結合至黏附分子之配位體或其部分，該黏附分子為例如CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)、CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)。此類受體結合劑包括一種試劑，其為或包含黏附分子之內源性配位體及/或同源配位體之細胞外域(ECD)或其部分。在一些實施例中，受體結合劑為黏附分子之細胞外域或其部分，且可結合細胞表面上之一或多個黏附分子。此類受體結合劑之實例包括LFA-1α (示於SEQ ID NO: 54中之ECD)；LFA-1β (示於SEQ ID NO: 55中之ECD)；L-選擇素(示於SEQ ID NO: 57中之ECD)；VCAM-1 (示於SEQ ID NO: 56中之ECD)；及VLA-4 (示於SEQ ID NO: 58中之ECD)之細胞外域，或其任何部分。 在一些實施例中，誘導細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子為或含有核因子，諸如視黃酸受體相關孤兒受體γ(RORγ)或RORα。在一些實施例中，受體結合劑，例如第二或額外受體結合劑為或含有特異性結合至細胞介素受體之配位體。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為IL-2R、IL-7R (CD127)、IL-21R (CD360)、IL受體共用γ鏈(γc；或CD132)、IL-1R (CD121)(諸如IL-1R1或IL-1R2)、IL-15R (CD215)、干擾素γ受體(IFNγR；CD119)、包括TNFR1 (CD120a)及TNFR2 (CD120b)之腫瘤壞死因子α受體(TNFαR)、IL-4R、IL-10R、干擾素I型受體(例如IFNα受體(IFNAR)，包括IFNAR1及IFNAR2)、IL-17R (CD217)及/或IL-12R，及受體結合劑，例如特異性結合至分子之刺激劑。在一些態樣中，特異性結合細胞上之分子之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗體、二價抗體片段、單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質結合分子。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)可包括刺激受體或能夠在細胞中誘導信號之其他受體之配位體，諸如IL-2配位體、IL-7配位體、IL-21配位體、IL-1配位體、IL-15配位體、IL-9配位體、IFNγ配位體、TNFα配位體、IL-4配位體、IL-10配位體、IL-12配位體、IL-17配位體，或其生物學有效部分或變異體。在一些實施例中，生物學有效部分或變異體保留結合至受體之活性及/或調節一或多個受體信號之功能活性。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)可包括刺激受體或能夠在細胞中誘導信號之其他受體之配位體，諸如I型干擾素，例如IFNα、IFNβ、IFNκ、IFNδ、IFNε、IFNτ、IFNω及IFNζ (亦稱為限制素)或其生物學有效部分。 在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CXCR3、CCR7、CXCR1或CXCR4，且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)特異性結合CXCR3、CCR7、CXCR1或CXCR4。在一些態樣中，特異性結合CXCR3、CCR7、CXCR1或CXCR4之受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)可選自由以下各者組成之群：抗體、二價抗體片段、單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質結合分子。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)可包括刺激受體或能夠在細胞中誘導信號之其他受體之配位體，諸如CXCL9配位體、CXCL10配位體、CCL19配位體、CCL21配位體、CCL25配位體或保留結合至受體之活性及/或調節一或多個受體信號之功能活性之其生物學有效部分。 在一些情況下，受體結合劑，例如額外受體結合劑為或含有黏附分子，或為誘導細胞介素產生、趨化因子產生、黏附分子表現之因子，及/或參與刺激及/或調節輔助信號及/或額外信號。在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為CD62L且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)特異性結合CD62L。在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為RORγt且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)特異性結合RORγt。在一些實施例中，細胞，例如T細胞上之分子可為RORα且受體結合劑，例如刺激劑(例如其可為額外受體結合劑，例如額外刺激劑)特異性結合RORα。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑能夠結合至CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BBL、CD30L及LIGHT中之任何一或多者，且受體結合劑，例如刺激劑可為抗體、二價抗體(例如(Fab)2'片段或二價單鏈Fv片段)、單價抗體(例如Fab片段、Fv片段、或單鏈Fv片段(scFv))或CD28、CD5、CD4、CD8、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BBL、CD30L及LIGHT中之任何一或多者之配位體，其中此類試劑能夠在將受體結合劑，例如刺激劑結合至分子後誘導或建模細胞中之信號。 在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑能夠特異性結合至除CD28、CD3、CD137或CD40以外的靶細胞表面上之分子。在一些情況下，受體結合劑，例如刺激劑結合至除CD28、CD3、CD137或CD40以外的靶細胞表面上之分子誘導或調節靶細胞中之信號及/或改變靶細胞之功能，藉此產生經培養靶細胞。 在以上實例中之任一者中，二價抗體片段可為(Fab)2 '片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由Fab片段、Fv片段及單鏈Fv片段(scFv)組成之群。在以上實例中之任一者中，具有抗體樣結合特性之蛋白質結合分子可為適體、基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白、黏抗體、基於錨蛋白支架之蛋白質、基於結晶支架之蛋白質、阿德奈汀、奈米抗體、DARPin及高親和性多聚體。 b. 選擇劑 在一些實施例中，試劑為選擇劑。在一些實施例中，選擇劑結合至細胞表面上之分子，諸如細胞表面分子。在一些情況下，細胞表面分子為選擇標記物。在一些此類情況下，選擇劑能夠特異性結合至藉由細胞中之一或多者表現之選擇標記物。在一些實施例中，可逆地結合至試劑之選擇劑或試劑可用於促進細胞之選擇或分離。 在本文提供之實施例中之任一者中，受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑，例如刺激劑可為特異性結合受體，例如表現於細胞表面上之受體的結合劑。在一些情況下，特異性結合受體之受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑，例如刺激劑可選自由以下各者組成之群：抗受體抗體、抗受體抗體之二價抗體片段、抗受體抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質受體結合分子。二價抗體片段可為F(ab')2 片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由以下各者組成之群：Fab片段、Fv片段、及單鏈Fv片段(scFv)。在一些情況下，具有抗體樣結合特性之蛋白質受體結合分子可為適體、基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白、黏抗體、基於錨蛋白支架之蛋白質、基於結晶支架之蛋白質、阿德奈汀、奈米抗體、DARPin或高親和性多聚體。在一些情況下，特異性結合受體之受體結合劑，例如第一、第二及/或額外受體結合劑，例如刺激劑為抗體或其抗原結合片段，例如Fab片段。 在一些態樣中，細胞表面分子，例如選擇標記物可為界定所需細胞群體或亞群，例如血細胞群體或亞群，例如淋巴細胞(例如T細胞、T輔助細胞(例如CD4+ T輔助細胞)、B細胞或自然殺手細胞)、單核細胞或幹細胞，例如CD34陽性周圍幹細胞或Nanog或Oct-4表現幹細胞之抗原。在一些實施例中，選擇標記物可為表現於T細胞或T細胞亞群之表面上之標記物，諸如CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。T細胞之實例包括諸如CMV特異性CD8+ T淋巴細胞、細胞毒性T細胞、記憶T細胞及調節T細胞(Treg)之細胞。Treg之說明性實例包括CD4 CD25 CD45RA Treg細胞且記憶T細胞之說明性實例包括CD62L CD8+特異性中樞記憶T細胞。細胞表面分子，例如選擇標記物亦可為腫瘤細胞標記物。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD4且選擇劑特異性結合CD4。在一些態樣中，特異性結合CD4之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD4抗體、抗CD4抗體之二價抗體片段、抗CD4抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD4結合分子(例如抗運載蛋白或奈米抗體)。在一些實施例中，抗CD4抗體，諸如二價抗體片段或單價抗體片段(例如CD4 Fab片段)可衍生自抗體13B8.2或功能活性突變體13B8.2，其保持針對CD4之特異性結合。舉例而言，抗體13B8.2或m13B8.2之例示性突變體描述於美國專利第7,482,000號、美國專利申請案第US2014/0295458號或國際專利申請案第WO2013/124474號；以及Bes, C等人 J Biol Chem 278, 14265-14273 (2003)中。稱為「ml3B8.2」之突變體Fab片段攜有CD4結合鼠類抗體13B8.2之可變域及含有γ型恆定人類CH1域(就重鏈而言)及κ型恆定人類輕鏈域之恆定域，如美國專利7,482,000中所述。在一些實施例中，抗CD4抗體，例如抗體13B8.2之突變體含有可變輕鏈中之胺基酸置換H91A、可變輕鏈中之胺基酸置換Y92A、可變重鏈中之胺基酸置換H35A及/或可變重鏈中之胺基酸置換R53A，其各自藉由Kabat編號。在一些態樣中，相較於ml3B8.2中之13B8.2 Fab片段之可變域，輕鏈之位置91 (SEQ ID NO: 30中之位置93)處之His殘基突變為Ala且重鏈之Arg殘基位置53 (SEQ ID NO: 29中之位置55)突變為Ala。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD4或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8000-206或6-8000-205或6-8002-100；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD8且選擇劑特異性結合CD8。在一些態樣中，特異性結合CD8之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD8抗體、抗CD8抗體之二價抗體片段、抗CD8抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD8結合分子。在一些實施例中，抗CD8抗體，諸如二價抗體片段或單價抗體片段(例如CD8 Fab片段)可衍生自抗體OKT8(例如ATCC CRL-8014)或保留針對CD8之特異性結合之其功能活性突變體。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD8或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8003或6-8000-201；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD3且選擇劑特異性結合CD3。在一些態樣中，特異性結合CD3之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD3抗體、抗CD3抗體之二價抗體片段、抗CD3抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD3結合分子。在一些實施例中，抗CD3抗體，諸如二價抗體片段或單價抗體片段(例如CD3 Fab片段)可衍生自抗體OKT3 (例如ATCC CRL-8001；參見例如Stemberger等人 PLoS One. 2012; 7(4): e35798)或保留針對CD3之特異性結合之其功能活性突變體。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD3或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8000-201、6-8001-100；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD25且選擇劑特異性結合CD25。在一些態樣中，特異性結合CD25之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD25抗體、抗CD25抗體之二價抗體片段、抗CD25抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD25結合分子。在一些實施例中，抗CD25抗體，諸如二價抗體片段或單價抗體片段(例如CD25 Fab片段)可衍生自抗體FRT5(參見例如Stemberger等人 2012)或保留針對CD25之特異性結合之其功能活性突變體。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD4或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8000-205或6-8000-207或6-8004-050；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD62L且選擇劑特異性結合CD62L。在一些態樣中，特異性結合CD62L之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD62L抗體、抗CD62L抗體之二價抗體片段、抗CD62L抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD62L結合分子。在一些實施例中，抗CD62L抗體，諸如二價抗體片段或單價抗體片段(例如CD62L Fab片段)可衍生自抗體DREG56 (例如ATCC HB300；參見例如Stemberger等人 2012)或保留針對CD62L之特異性結合之其功能活性突變體。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD62L或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8000-204或6-8005-050；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD45RA且選擇劑特異性結合CD45RA。在一些態樣中，特異性結合CD45RA之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD45RA抗體、抗CD45RA抗體之二價抗體片段、抗CD45RA抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD45RA結合分子。在一些實施例中，抗CD45RA抗體，諸如二價抗體片段或單價抗體片段(例如CD45RA Fab片段)可衍生自抗體MEM56 (例如Millipore 05-1413；參見例如Stemberger等人 2012)或保留針對CD45RA之特異性結合之其功能活性突變體。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD45RA或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8000-208或6-8007-050；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD45RO且選擇劑特異性結合CD45RO。在一些態樣中，特異性結合CD45RO之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD45RO抗體、抗CD45RO抗體之二價抗體片段、抗CD45RO抗體之單價抗體片段及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD45RO結合分子。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD45RO或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8000-209或6-8012-020；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD154且選擇劑特異性結合CD154。在一些態樣中，特異性結合CD154之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD154抗體、抗CD154抗體之二價抗體片段、抗CD154抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD154結合分子。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD154或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑(例如目錄號6-8000-202或6-5510-050；IBA GmbH, Gottingen, Germany)。 在一些實施例中，選擇標記物可為CD16且選擇劑特異性結合CD16。在一些態樣中，特異性結合CD16之選擇劑可選自由以下各者組成之群：抗CD16抗體、抗CD16抗體之二價抗體片段、抗CD16抗體之單價抗體片段、及具有抗體樣結合特性之蛋白質CD16結合分子。在一些實施例中，可逆地結合至抗CD16或其片段之試劑為市售的或衍生自市售試劑。在一些態樣中，CD16結合分子包含分別在SEQ ID NO: 52及53中所示之重鏈及/或輕鏈序列。 在以上實例中之任一者中，二價抗體片段可為(Fab)2 '片段或二價單鏈Fv片段，而單價抗體片段可選自由Fab片段、Fv片段及單鏈Fv片段(scFv)組成之群。在以上實例中之任一者中，具有抗體樣結合特性之蛋白質結合分子可為適體、基於脂質運載蛋白家族之多肽之突變蛋白、黏抗體、基於錨蛋白支架之蛋白質、基於結晶支架之蛋白質、阿德奈汀、奈米抗體、DARPin及高親和性多聚體。 III. 培養細胞之方法 本文提供培養細胞之方法，其包括在試劑(例如第一或第二受體結合劑，例如刺激劑，或選擇劑)存在下培育含有靶細胞(例如T細胞)之組合物，該試劑能夠結合至組合物中之靶細胞(例如T細胞)表面上之分子且可逆地結合至含有複數個能夠可逆地結合至試劑之結合位點的試劑。在某些實施例中，試劑為寡聚粒子試劑，諸如如所描述之任何試劑。在一些實施例中，培育係在試劑結合，諸如特異性結合至細胞上之分子的條件下進行。在一些情況下，對於某些受體結合劑(例如刺激劑)，此類結合可在組合物之靶細胞(例如T細胞)中誘導或調節信號，諸如如所描述之原始信號或輔助信號。在一些實施例中，試劑結合至分子導致組合物中之靶細胞之刺激、活化、擴增(增殖)及/或分化中之一或多者。 在一些實施例中，提供之方法可用於選擇性地誘導細胞群體，諸如B細胞、T細胞或自然殺手細胞之離體擴增。在一些情況下，刺激可在不存在外源生長因子，諸如淋巴介質及輔助細胞之情況下。在一些實施例中，諸如B細胞或T細胞之此等細胞之增殖可在不需要抗原的情況下誘導，因此提供諸如T細胞群體之擴增細胞群體，其就抗原反應性而言為多株的。本文所揭示之方法可提供諸如CD4+或CD8+ T細胞之所選T細胞群體經延長時段之持續增殖，以產生此等細胞之數目相對於原始T細胞群體之多倍增加。一般而言，在如本文所述之淋巴細胞群體之(純系)擴增之情況下，所有後代可與選擇用於擴增之細胞群體共用相同抗原特異性。 在一些實施例中，方法涉及擴增抗原特異性T細胞群體。在一些實施例中，為了產生抗原特異性T細胞群體，使T細胞與呈適合於在T細胞中觸發原始活化信號之形式的抗原接觸，亦即向抗原呈遞T細胞以經由TCR/CD3複合物在T細胞中觸發信號。舉例而言，可藉由與MHC分子結合之抗原呈遞細胞向T細胞呈遞抗原。抗原呈遞細胞，諸如B細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞蘭格漢氏細胞或其他可向T細胞呈遞抗原之細胞可在抗原(例如可溶抗原)存在下與T細胞一起培育，以使得抗原呈遞細胞向T細胞呈遞抗原。或者，表現所關注之抗原之細胞可與T細胞一起培育。舉例而言，表現腫瘤相關抗原之腫瘤細胞可與T細胞一起培育以誘發腫瘤特異性反應。類似地，經病原體，例如病毒感染之細胞(其呈遞病原體之抗原)可與T細胞一起培育。在T細胞群體之抗原特異性活化之後，細胞可根據所提供方法擴增。舉例而言，在已建立抗原特異性之後，T細胞可藉由根據本文所描述之方法與抗CD3抗體(用作第一試劑)及抗CD28抗體(用作第二試劑)培養而擴增。在另一實施例中，第一試劑可為MHC I:肽複合物，其結合至抗原特異性T細胞群體。在此類實施例中，可使用任何已知且可與各別MHC I分子複合之抗原特異性肽。或者，亦有可能將觸發細胞擴增之受體之天然配位體用作第一試劑。舉例而言，CD19之細胞外域可用於引起經轉導以表現嵌合CD19結合抗原受體(CAR)之細胞之細胞內信號傳導級聯的激活。以上之例示性態樣顯示於實例中。 在一些實施例中，提供培養細胞群體之活體外方法，其包含使樣品與多聚化試劑接觸，該樣品包含有包含複數個細胞之組合物。在一些實施例中，多聚化試劑為寡聚粒子試劑。多聚化試劑在其上可逆地固定有(結合於其中)試劑(第一或第二受體結合劑，例如刺激劑，或選擇劑)，該試劑可用於細胞之選擇、刺激、擴增及/或分化。在一些實施例中，第一試劑向細胞提供原始活化信號，其中多聚化試劑包含至少一個用於第一試劑之可逆結合的結合位點Z1。第一試劑包含至少一種結合搭配物C1，其中結合搭配物C1能夠可逆地結合至多聚化試劑之結合位點Z1，其中第一試劑經由形成於結合搭配物C1與結合位點Z1之間的可逆鍵結合至多聚化試劑。第一試劑結合至細胞表面上之受體分子，藉此向細胞提供原始活化信號且藉此活化細胞。 在一些實施例中，多聚化試劑固定於擔體，諸如固體表面上。在一些實施例中，多聚化試劑不結合至擔體，諸如不結合至固體表面或固定相。 舉例而言，在一些實施例中，提供擴增細胞群體之活體外方法，其包含實包含細胞群體之樣品與多聚化試劑接觸，其中多聚化試劑不固定於固體擔體上，亦即呈可溶形式，且一種試劑(第一或第二受體結合劑，例如刺激劑，或選擇劑)結合至該多聚化試劑，該試劑可用於細胞之選擇、刺激、擴增及/或分化。在一些實施例中，向細胞提供原始活化信號之第一試劑可逆地結合至多聚化試劑。多聚化試劑包含至少一個結合位點，例如用於結合第一試劑之Z1，其中第一試劑包含至少一種結合搭配物，例如C1，其中結合搭配物C1能夠結合至多聚化試劑之結合位點Z1。在一些實施例中，第一試劑經由形成於結合搭配物C1與結合位點Z1之間的結合而結合至多聚化試劑，且第一試劑結合至細胞表面上之受體分子，藉此向細胞提供原始活化信號且藉此活化細胞。在一些實施例中，當使用可溶多聚化試劑時，結合部分C，例如C1與結合位點Z，例如Z1之間的結合不需要可逆。 舉例而言，在一些實施例中，提供之方法亦包括使用多聚化試劑，第二試劑，諸如細胞表面上之輔助分子或刺激輔助分子之共刺激分子結合至該多聚化試劑。在一些情況下，多聚化試劑固定於擔體，例如固體擔體、固相或固定相上。在一些實施例中，多聚化試劑不固定於擔體上，亦即呈可溶形式。在一些實施例中，第二試劑包含結合搭配物，例如C2，其中結合搭配物，例如C2能夠可逆地結合至結合位點，例如多聚化試劑之Z2，其中第二試劑經由形成於結合搭配物C2與結合位點Z2之間的可逆結合而結合至多聚化試劑。在一些實施例中，形成於結合搭配物C1與結合位點Z1之間的結合可為可逆的且形成於結合搭配物C2與結合位點Z2之間的結合可為可逆的。在此狀況下，結合位點Z1與該結合搭配物C1之間的可逆結合及/或結合位點Z2與該結合搭配物C2之間的可逆結合之解離常數(Kd )可在10- 2 M至10- 13 M的範圍內。在一些態樣中，諸如當多聚化試劑不結合至擔體(例如不結合至固體擔體或固定相)時，形成於結合搭配物C1與結合位點Z1之間的結合可為不可逆的及/或形成於結合搭配物C2與結合位點Z2之間的結合亦可為不可逆的。 在一些情況下，第二試劑結合至細胞表面上之輔助分子，藉此刺激活化細胞。在此實施例中，第一試劑可刺激T細胞中之TCR/CD3複合物相關信號且可為特異性結合CD3之結合劑。在此實施例中，T細胞上之輔助分子可為CD28且結合輔助分子之第二試劑為特異性結合CD28之結合試劑。或者，在一些實施例中，發現亦可採用靶向其他輔助分子，其可在一些情況下改變，諸如改良經培養細胞之一或多個特點、特性或特徵。在一些實施例中，輔助分子可為以下中之一或多者：IL-12R、IFNγR、IL-4R、IL-17R、RORγt、RORα、CXCR3、CCR7、CD62L、CXCR1或CXCR4 (例如分別為抗IL-12R抗體、抗IFNγR抗體、抗IL-4R抗體、及抗IL-17R抗體、抗RORγt抗體、抗RORα抗體、抗CXCR3抗體、抗CCR7抗體、抗CD62L抗體、抗CXCR1抗體或抗CXCR4抗體)。例示性試劑，諸如受體結合劑(例如刺激劑)描述於下文。 在一些實施例中，提供之方法可在細胞群體之活力至少基本上不受損之任何溫度下進行。在一些實施例中，進行培育或培養之條件包括至少基本上不會有害、不會不利或至少基本上不損害活力之任何條件，例如在該等條件下，以完整活力擴增之細胞群體之百分比為至少70%，包括至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%。在一些實施例中，提供之方法係在約20℃或更高溫度下進行。取決於待擴增之細胞群體，適合之溫度範圍可例如為約20℃至約45℃，包括約25℃至約40℃，或約32℃至37℃。在一些實施例中，根據本發明之方法係在恆定溫度值下，或在所選溫度值±約5℃、±約4℃、±約3℃、±約2℃、±約1℃或±約0.5℃下進行。熟習此項技術者能夠考慮細胞性質及擴增條件而憑經驗確定適合之溫度。通常，人類細胞係在諸如37℃之溫度下擴增。 根據本文中之本發明，亦提供多聚化試劑，或包含能夠擴增細胞群體之多聚化試劑的組合物。能夠擴增細胞群體之此類多聚化試劑為多聚化試劑，其不結合至擔體(例如呈可溶形式)且包含至少一個用於可逆地結合向細胞提供原始活化信號之第一試劑的結合位點Z，例如Z1，其中向細胞提供原始活化信號之第一試劑可逆地結合至多聚化試劑；其中第一試劑包含至少一種結合搭配物C，例如C1，其中結合搭配物C1能夠可逆地結合至多聚化試劑之至少一個結合位點Z1，其中第一試劑經由形成於結合搭配物C1與結合位點Z1之間的可逆結合而結合至多聚化試劑。在此處應注意，此類多聚化試劑可在其上固定有本文所述之第一試劑中之任一者。 在一些實施例中，本文提供之多聚化試劑可進一步包含至少一個用於可逆地結合刺激細胞表面上之輔助分子之第二試劑的結合位點，例如Z2，其中刺激細胞表面上之輔助分子之第二試劑可逆地結合至多聚化試劑，其中第二試劑包含結合搭配物，例如C2，其中結合搭配物C2能夠結合至多聚化試劑之至少一個結合位點Z2。在此實施例中，第二試劑經由形成結合搭配物C2於與結合位點Z2之間的結合而結合至多聚化試劑。在一些實施例中，第二試劑為可結合至以下各者之任何試劑：IL-12R、IFNγR、IL-4R、IL-17R、RORγt、RORα、CXCR3、CCR7、CD62L、CXCR1或CXCR4 (例如分別為抗IL-12R抗體、抗IFNγR抗體、抗IL-4R抗體、及抗IL-17R抗體、抗RORγt抗體、抗RORα抗體、抗CXCR3抗體、抗CCR7抗體、抗CD62L抗體、抗CXCR1抗體或抗CXCR4抗體)。 在一些實施例中，藉由多聚化試劑(例如抗CD3/抗CD28突變蛋白抗生蛋白鏈菌素或其寡聚物)培養含有靶細胞(例如T細胞)之組合物可在生物反應器，諸如中空纖維生物反應器(例如Quantum®細胞擴增系統之中空纖維生物反應器)或塑膠袋生物反應器(例如用於獲自GE Healthcare之Xuri細胞擴增系統W25之Cellbag®)中進行。 在一些實施例中，方法進一步包括使反應混合物(例如)中的培養靶細胞(例如T細胞)與以下各者接觸：(i)競爭試劑(例如自由第一結合搭配物C，例如C1)或其類似物，能夠破壞第一結合搭配物，例如C1與結合位點，例如Z1之間的結合，及/或(諸如必要時)(ii)第二競爭試劑，例如自由第二結合搭配物，例如C2，或其類似物，能夠破壞第二結合搭配物C2與結合位點Z2之間的結合。藉此，破壞第一試劑之該結合搭配物C1與該結合位點Z1之間的可逆結合以及第二試劑之該結合搭配物C2與該多聚化試劑之該結合位點Z2之間的可逆結合，藉此在溶離液中釋放經由第一試劑及第二試劑結合至多聚化試劑之T細胞及破壞T細胞之刺激及/或擴增。 在一些實施例中，競爭試劑(例如第一及/或第二競爭試劑)在培育起始之後14天、10天、7天或5天內，諸如在培育起始之後10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天或1天內添加。在特定實施例中，競爭試劑在培育起始之後5天內，諸如在培育起始之後4天、3天、2天或1天內添加。在某些實施例中，競爭試劑在培育起始之後1天內，諸如在培育起始之後18小時、16小時、12小時、8小時、6小時、4小時、3小時、2小時、90分鐘、60分鐘或30分鐘內添加。因此，藉由控制刺激經破壞之時間，自多聚化試劑溶離之培養之T細胞之一或多個特定特徵可如本文所述地改變。舉例而言，在一些實施例中，在培育起始之後5天、4天、3天、2天或1天內添加競爭試劑將增加一或多個經培養細胞之刺激、活化、富集、擴增、選擇及/或增殖。 在一些實施例中，方法進一步包括分離或移除在組分之可逆解離之後殘餘的組分中之一或多者。在一些實施例中，可分離或移除經培養靶細胞(例如T細胞)中之任何非結合或殘餘生物素。在一些實施例中，多聚化試劑自經培養靶細胞組合物中之細胞移除或分離。舉例而言，在一些實施例中，分離/移除可使用第二固定相進行。出於此目的，包含靶細胞(例如T細胞)及可溶多聚化試劑之混合物在塗覆至上文所述之第一固定相上之前或之後暴露於適合之第二固定相上之層析。此第二固定相可為凝膠過濾基質及/或親和性層析基質，其中凝膠過濾及/或親和性層析基質包含親和性試劑。層析樹脂上包含之親和性試劑包括(特異性)結合至多聚化試劑之結合位點Z1及/或結合位點Z2 (若存在)，藉此將多聚化試劑固定於固定相上之結合搭配物D。若使用基於多聚化試劑之抗生蛋白鏈菌素且第一及第二試劑均具有抗生蛋白鏈菌素結合肽作為結合搭配物C1或C2，則包括於此第二固定相之親和性試劑中之結合搭配物D可為生物素。用作多聚化試劑之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之可溶寡聚物接著結合至生物素，該生物素通常共價偶合至層析基質，諸如市售之生物素-sepharoseTM 。在一些此類實施例中，經培養細胞(例如培養之T細胞)可遠離多聚化試劑回收。 A. 細胞 包含於含有靶細胞之組合物中之細胞一般為真核細胞，諸如哺乳動物細胞，且通常為人類細胞。在一些實施例中，細胞來源於血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，或為免疫系統細胞，諸如先天性或後天性免疫細胞，例如骨髓或淋巴細胞，包括淋巴細胞，通常為T細胞及/或NK細胞。其他例示性細胞包括幹細胞，諸如多潛能(multipotent)及多能(pluripotent)幹細胞，包括經誘導之多能幹細胞(iPSC)。細胞通常為初代細胞，諸如直接自個體分離及/或自個體分離且冷凍之細胞。在一些實施例中，本文提供之可逆結合試劑，諸如多聚化試劑能夠擴增包含於淋巴細胞群體中之淋巴細胞群體或亞群。待擴增之淋巴細胞群體可為任何適合之群體，例如B細胞群體、T細胞群體或自然殺手細胞群體。T細胞群體可為抗原特異性T細胞群體、T輔助細胞群體、細胞毒性T細胞、記憶T細胞、調節T細胞、或自然殺手T細胞群體。因此，在多聚化試劑之此類實施例中，第一試劑能夠刺激T細胞中之TCR/CD3複合物相關信號。存在於多聚化試劑中之第一試劑可因此為特異性結合CD3之結合試劑，而結合輔助分子之第二試劑例如可為特異性結合CD28、CD137、IL-12R、IFNγR、IL-4R、IL-17R、RORγt、RORα、CXCR3、CCR7、CD62L、CXCR1或CXCR4之結合劑。在一些實施例中，細胞包括T細胞或其他細胞類型之一或多種亞群，諸如完整T細胞群體、CD4+細胞、CD8+細胞及其亞群，諸如根據以下定義之彼等：功能、活化狀態、成熟度、分化潛能、擴增、再循環、位置及/或持久能力、抗原專一性、抗原受體類型、特定器官或區室中之存在、標記物或細胞激素分泌概況及/或分化程度。提及所治療之個體時，細胞可為同種異體細胞及/或自體細胞。在該等方法當中包括現成方法。在一些態樣中，諸如在現成技術中，細胞為多能及/或多潛能細胞，諸如幹細胞，諸如經誘導之多能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，方法包括如本文所述自個體分離出細胞、對其進行製備、處理、培養及/或工程改造，及低溫保存之前或之後將其再引入同一患者中。T細胞及/或CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞的亞型及亞群為未處理T (TN )細胞、效應子T細胞(TEFF )、記憶T細胞及其亞型，諸如幹細胞記憶T (TSCM )、中樞記憶T (TCM )、效應子記憶T (TEM )或末期分化效應子記憶T細胞；腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、不成熟T細胞、成熟T細胞、輔助T細胞、細胞毒性T細胞、黏膜相關不變T (MAIT)細胞、天然存在及適應性調節T (Treg)細胞、輔助T細胞，諸如TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾泡性輔助T細胞；α/β T細胞及δ/γ T細胞。在一些實施例中，細胞為自然殺手(NK)細胞。在一些實施例中，細胞為單核球或粒細胞，例如骨髓細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突狀細胞、肥大細胞、嗜伊紅血球及/或嗜鹼性球。 1. 製備細胞在一些實施例中，細胞製備包括一或多個培養及/或製備步驟。細胞可自樣品，諸如生物樣品，例如獲自或衍生自個體之樣品分離。在一些實施例中，分離細胞之個體為患有疾病或病況或需要細胞療法或將投與細胞療法之個體。在一些實施例中，個體為需要特定治療性干預(諸如對細胞進行分離、處理及/或工程改造的授受細胞療法)的人類。因此，在一些實施例中，細胞為初級細胞，例如初級人類細胞。樣品包括直接獲自個體之組織、流體及其他樣品，以及產生於一或多個處理步驟，諸如分離、離心、基因工程改造(例如藉由病毒載體轉導)、洗滌及/或培育之樣品。生物樣品可為直接獲自生物學來源的樣品或經處理之樣品。生物樣品包括(但不限於)體液，諸如血液、血漿、血清、腦脊髓液、滑液、尿液及汗液、組織及器官樣品，包括來源於其的經處理樣品。在一些態樣中，所得或經分離之細胞所來自的樣品為血液或血液源性樣品，或為或來源於清除術或白血球清除術產物。例示性樣品包括全血、周邊血液單核細胞(PBMC)、白血球、骨髓、胸腺、組織生物檢體、腫瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴結、腸道相關淋巴組織、黏膜相關淋巴組織、脾臟、其他淋巴組織、肝臟、肺、胃、腸、結腸、腎臟、胰臟、乳房、骨骼、前列腺、子宮頸、睪丸、卵巢、扁桃體或其他器官，及/或來源於其的細胞。在細胞療法(例如授受細胞療法)之情形中，樣品包括自體及同種異體來源的樣品。在一些實施例中，細胞來源於細胞株，例如T細胞株。在一些實施例中，細胞自異種來源獲得，例如自小鼠、大鼠、非人類靈長類動物及豬獲得。在一些實施例中，細胞之分離包括一或多個製備步驟及/或基於非親和力之細胞分離步驟。在一些實例中，對細胞進行洗滌、離心且/或在一或多種試劑存在下培育，以例如移除不合需要之組分、富集所需組分、溶解或移除對特定試劑敏感之細胞。在一些實例中，基於一或多種特性(諸如密度、黏附特性、大小、敏感性及/或對特定組分之耐受性)分離細胞。在一些實例中，自個體之循環血液中獲得細胞，例如藉由清除術或白血球清除術獲得。在一些態樣中，樣品含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他成核白血球、紅血球及/或血小板，且在一些態樣中含有除紅血球及血小板之外的細胞。在一些實施例中，自個體收集之血細胞經洗滌，例如以移除血漿部分及將細胞置於適當緩衝液或培養基中用於後續處理步驟。在一些實施例中，細胞用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)洗滌。在一些實施例中，洗滌溶液缺乏鈣及/或鎂及/或多種或全部二價陽離子。在一些態樣中，利用半自動化「流過」式離心機(例如Cobe 2991細胞處理器，Baxter)，根據製造商說明書完成洗滌步驟。在一些態樣中，根據製造商說明書，藉由切向流過濾(TFF)完成洗滌步驟。在一些實施例中，將細胞在洗滌之後再懸浮於多種生物相容性緩衝液(諸如無Ca++ /Mg++ 之PBS)中。在某些實施例中，移除血細胞樣品中的組分且將細胞直接再懸浮於培養基中。在一些實施例中，方法包括基於密度之細胞分離方法，諸如藉由溶解紅血球而自周邊血液製備白血球及經由Percoll或Ficoll梯度離心。在一些實施例中，分離方法包括基於一或多種特定分子，諸如表面標記物，例如表面蛋白質、細胞內標記物或核酸於細胞中之表現或存在而分離不同細胞類型。在一些實施例中，可使用用於基於此類標記物分離之任何已知方法。分離方法可包括本文公開之彼等方法中之任一者，包括使用可逆試劑系統，例如如本文所述之製劑(諸如受體結合劑或選擇劑)及試劑之方法。在一些實施例中，分離為基於親和力或免疫親和力之分離。舉例而言，在一些態樣中，分離包括根據一或多種標記物(典型地為細胞表面標記物)之細胞表現或表現量分離細胞及細胞群體，例如藉由與專一性結合至此類標記物的抗體或結合搭配物一起培育，隨後通常進行洗滌步驟且將已結合抗體或結合搭配物的細胞與尚未結合至抗體或結合搭配物的彼等細胞分離。此類分離步驟可基於陽性選擇，其中保留已結合試劑之細胞供進一步使用；及/或陰性選擇，其中保留尚未結合於抗體或結合搭配物上之細胞。在一些實例中，兩個部分皆保留以供進一步使用。在一些態樣中，負向選擇可為特別適用的，其中專一性鑑別非均質群體中之細胞類型的抗體無法獲得，因此基於除所要群體之外之細胞所表現的標記物進行分離最佳。分離無需對特定細胞群體或表現特定標記物之細胞進行100%富集或移除。舉例而言，特定類型之細胞(諸如表現標記物之彼等細胞)的陽性選擇或富集係指增加此類細胞之數目或百分比，但無需使得不表現該標記物之細胞完全不存在。同樣，特定類型之細胞(諸如表現標記物的細胞)的負向選擇、移除或耗乏係指此類細胞之數目或百分比的降低，但無需使得所有此類細胞完全移除。在一些實例中，進行多輪分離步驟，其中對來自一個步驟的經陽性或陰性選擇之部分進行另一個分離步驟，諸如後續陽性或陰性選擇。在一些實例中，單一分離步驟能耗乏同時表現多種標記物的細胞，諸如藉由將細胞與各自對負向選擇所靶向之標記物具專一性之多種抗體或結合搭配物一起培育。同樣，多種細胞類型可藉由使細胞與各種細胞類型上所表現之複數種抗體或結合搭配物一起培育而同時進行陽性選擇。舉例而言，在一些態樣中，T細胞之特定亞群，諸如陽性或表現高含量之一或多種表面標記物，例如CD28+ 、CD62L+ 、CCR7+ 、CD27+ 、CD127+ 、CD4+ 、CD8+ 、CD45RA+ 及/或CD45RO+ T細胞之細胞係藉由陽性或陰性選擇技術分離。舉例而言，CD3+ 、CD28+ T細胞可使用CD3/CD28結合之磁性珠粒(例如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T細胞擴增器)進行陽性選擇。在一些實施例中，分離如下進行：藉由陽性選擇富集特定細胞群體，或藉由陰性選擇耗乏特定細胞群體。在一些實施例中，正向或負向選擇如下完成：將細胞與一或多種專一性結合至一或多種表面標記物的抗體或其他結合劑一起培育來完成選擇，該等表面標記物以相對較高的量(標記物高)分別表現(標記物+ )於正向或負向選擇的細胞上。在一些實施例中，T細胞藉由陰性選擇非T細胞(諸如B細胞、單核球或其他白血球)上所表現之標記物(諸如CD14)而與PBMC樣品分離。在一些態樣中，使用CD4+ 或CD8+ 選擇步驟分離CD4+ 輔助細胞與CD8+ 細胞毒性T細胞。此類CD4+ 及CD8+ 群體可藉由對在一或多種初始、記憶及/或效應T細胞亞群上表現或表現至相對較高程度之標記的陽性或陰性選擇而進一步分選成亞群。在一些實施例中，CD8+ 細胞諸如藉由基於與各別亞群相關聯之表面抗原的陽性或陰性選擇而相對於未處理、中樞記憶、效應子記憶及/或中樞記憶幹細胞進一步富集或耗盡。在一些實施例中，針對中樞記憶T (TCM )細胞進行富集以提高功效，諸如在投藥之後改良長期存活率、擴增及/或移植，在一些態樣中，功效在此類亞群中特別穩定。參見Terakura等人 (2012) Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother. 35 (9):689-701。在一些實施例中，將TCM 富集CD8+ T細胞與CD4+ T細胞組合進一步增強功效。 在實施例中，記憶T細胞存在於CD8+ 周邊血液淋巴細胞之CD62L+ 與CD62L- 亞群兩者中。可諸如使用抗CD8及抗CD62L抗體富集或耗盡CD62L- CD8+ 及/或CD62L+ CD8+ 部分之PBMC。在一些實施例中，中樞記憶T (TCM )細胞的富集係基於CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3及/或CD 127之陽性或高表面表現；在一些態樣中，其係基於對表現或高度表現CD45RA及/或顆粒酶B之細胞進行的陰性選擇。在一些態樣中，藉由耗盡表現CD4、CD14、CD45RA之細胞及對表現CD62L之細胞進行陽性選擇或富集來分離TCM 細胞富集之CD8+ 群體。在一個態樣中，如下在中樞記憶T (TCM )細胞中進行富集：以基於CD4表現所選擇之陰性細胞部分為起始物，基於CD14及CD45RA之表現進行陰性選擇，且基於CD62L進行陽性選擇。此類選擇在一些態樣中同時進行且在其他態樣中以任一順序依次進行。在一些態樣中，製備CD8+ 細胞群體或亞群所用的基於CD4表現之相同選擇步驟亦用於產生CD4+ 細胞群體或亞群，從而保留基於CD4之分離所得的陽性與陰性溶離份且用於方法之後續步驟，視情況在一或多個其他正向或負向選擇步驟之後。藉由鑑別具有細胞表面抗原的細胞群體將CD4+ T輔助細胞分選為未處理、中樞記憶及效應細胞。CD4+ 淋巴細胞可藉由標準方法獲得。在一些實施例中，原初CD4+ T淋巴細胞為CD45RO- 、CD45RA+ 、CD62L+ 、CD4+ T細胞。在一些實施例中，中樞記憶CD4+ 細胞為CD62L+ 及CD45RO+ 。在一些實施例中，效應子CD4+ 細胞為CD62L- 及CD45RO- 。在一個實例中，為了藉由負向選擇來富集CD4+ 細胞，單株抗體混合物典型地包括針對CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在一些實施例中，抗體或結合搭配物結合至固體擔體或基質，諸如磁性珠粒或順磁珠粒，以便根據正向及/或負向選擇來分離細胞。舉例而言，在一些實施例中，細胞及細胞群係使用免疫磁性(或親和磁性)分離技術分離(separate)或分離(isolate)(回顧於Methods in Molecular Medicine, 第58卷: Metastasis Research Protocols, 第2卷: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, 第17-25頁, 編輯為S.A.Brooks及U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ)。在一些態樣中，所分離之細胞之樣品或組合物係與可磁化或磁性反應的小物質(諸如磁性反應粒子或微粒，諸如順磁珠粒(例如Dynalbeads或MACS珠粒))一起培育。磁性反應物質，例如粒子一般直接或間接地連接至特異性結合至分子，例如表面標記物之結合搭配物，例如抗體，該分子存在於需要分離，例如需要陰性或陽性選擇之一或多個細胞或細胞群體上。在一些實施例中，磁性粒子或珠粒含有結合至專一性結合成員(諸如抗體或其他結合搭配物)的磁性反應物質。存在多種磁性分離方法中所用之熟知磁性反應材料。適合的磁性粒子包括Molday之美國專利第4,452,773號及歐洲專利說明書EP 452342 B中所述之彼等，該等專利以引用的方式併入本文中。膠態尺寸化粒子(諸如Owen之美國專利第4,795,698號及Liberti等人之美國專利第5,200,084號中所述之彼等)為其他實例。培育一般在一定條件下進行，藉此附接至磁性粒子或珠粒之抗體或結合搭配物或特異性結合至此類抗體或結合搭配物之分子(諸如二級抗體或其他試劑)特異性結合至樣品內之細胞的細胞表面分子(若存在)。在一些態樣中，將樣品置放於磁場中，且連接至磁性反應或可磁化粒子的彼等細胞將吸引至磁體且與未標記之細胞分離。正向選擇時，吸引至磁體的細胞得以保留；負向選擇時，未吸引的細胞(未標記之細胞)得以保留。在一些態樣中，在相同選擇步驟期間進行正向選擇與負向選擇之組合，其中保留陽性及陰性溶離份且進一步處理或進行進一步分離步驟。在某些實施例中，磁性反應粒子經初級抗體或其他結合搭配物、二級抗體、凝集素、酶或抗生蛋白鏈菌素塗佈。在某些實施例中，磁性粒子經由對一或多種標記物具有特異性之一級抗體的塗佈而連接至細胞。在某些實施例中，細胞(而非珠粒)經初級抗體或結合搭配物標記，且接著添加經細胞類型特異性二級抗體或其他結合搭配物(例如抗生蛋白鏈菌素)塗佈之磁性粒子。在某些實施例中，經抗生蛋白鏈菌素塗佈之磁性粒子與經生物素標記之初級或二級抗體結合使用。 在一些實施例中，磁性反應粒子保持附接至待隨後培育、培養及/或工程改造之細胞；在一些態樣中，該等粒子保持附接至向患者投與之細胞。在一些實施例中，自細胞移除可磁化或磁性反應粒子。自細胞移除可磁化粒子的方法已知且包括例如使用未經標記之競爭性抗體、可磁化粒子或抗體與可裂解連接子之結合物等。在一些實施例中，可磁化粒子可生物降解。在一些實施例中，基於親和力之選擇係經由磁性活化細胞分選術(MACS)(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)。磁性活化細胞分選術(MACS)系統能夠高純度選擇連接至磁化粒子的細胞。在某些實施例中，MACS係以其中施加外部磁場之後依序溶離非目標及目標物質的模式操作。亦即，附接至磁化粒子之細胞保持在適當位置，而溶離未附接之物質。接著，在此第一溶離步驟完成之後，在磁場中捕獲且防止溶離之物質以某一方式釋放，使其可溶離及回收。在某些實施例中，非目標細胞經標記且自非均質細胞群體耗盡。在某些實施例中，使用進行該等方法之分離(isolation)、細胞製備、分離(separation)、處理、培育、培養且/或調配步驟中之一或多者的系統、裝置或設備來進行分離(isolation)或分離(separation)。在一些態樣中，系統用於在封閉或無菌環境中進行此等步驟中之每一者，以例如使誤差、使用者操作及/或污染最小化。在一個實例中，系統為如國際專利申請公開案第WO2009/072003號或US 20110003380 A1中所述之系統。在一些實施例中，系統或設備在整合式或整裝式系統中及/或以自動化或可程式化方式進行分離、處理、工程改造及調配步驟中之一或多者(例如全部)。在一些態樣中，系統或設備包括與系統或設備通信之電腦及/或電腦程式，其允許使用者對處理、分離、工程改造及調配步驟進行程式化、控制、評估其結果及/或調整其各個態樣。在一些態樣中，分離及/或其他步驟係使用例如在封閉的無菌系統中、在臨床規模水準自動化分離細胞的CliniMACS系統(Miltenyi Biotic)進行。組件可包括整合式微電腦、磁性分離單元、蠕動泵及各種夾閥。在一些態樣中，整合式電腦控制儀器之所有組件且導引系統以標準化順序執行重複程序。在一些態樣中，磁性分離單元包括可移動永久磁體及用於選擇管柱之固持器。蠕動泵控制通過整個管組的流速且連同夾閥一起確保控制緩衝液通過系統之流動及細胞之持續懸浮。 在一些態樣中，CliniMACS系統使用以無菌非熱解溶液供應之抗體偶聯可磁化粒子。在一些實施例中，在細胞經磁性粒子標記之後，洗滌細胞以移除過量粒子。接著使細胞製劑袋連接至管組，管組又連接至含有緩衝液之袋及細胞收集袋。管組由預組裝之無菌管組成，包括前管柱及分離管柱，且僅用於單次使用。起始分離程式之後，系統自動地將細胞樣品施加至分離管柱上。經標記之細胞保留於管柱內，而未標記之細胞藉由一系列洗滌步驟移除。在一些實施例中，適用於本文所述方法的細胞群體未標記且未保留於管柱中。在一些實施例中，適用於本文所述方法的細胞群體經標記且保留於管柱中。在一些實施例中，移除磁場之後，自管柱溶離適用於本文所述方法的細胞群體，且收集於細胞收集袋內。在某些實施例中，使用CliniMACS Prodigy系統(Miltenyi Biotec)執行分離及/或其他步驟。在一些態樣中，CliniMACS Prodigy系統裝備有允許自動化洗滌及藉由離心對細胞進行分級分離的細胞處理單元。CliniMACS Prodigy系統亦可包括機載照相機及影像識別軟體，該軟體藉由辨別源細胞產物之宏觀層來確定最佳的細胞分級分離終點。舉例而言，周邊血液可自動分離成紅血球、白血球及血漿層。CliniMACS Prodigy系統亦可包括整合式細胞培養室，從而完成細胞培養方案，諸如細胞分化及擴增、抗原負載及長期細胞培養。輸入埠能允許對培養基進行無菌移除及補充且可使用整合式顯微鏡監測細胞。參見例如Klebanoff等人 (2012)J Immunother . 35(9): 651-660，Terakura等人 (2012) Blood.1:72-82，及Wang等人 (2012)J Immunother . 35(9):689-701。在一些實施例中，本文所描述之細胞群體經由流動式細胞量測術收集及富集(或耗乏)，其中經多種細胞表面標記物染色之細胞運載於流體流中。在一些實施例中，本文所描述之細胞群體經由製備級(FACS)分選術收集及富集(或耗乏)。在某些實施例中，本文所描述之細胞群體藉由使用微機電系統(MEMS)晶片與基於FACS之偵測系統的組合來收集及富集(或耗乏) (參見例如WO 2010/033140；Cho等人(2010) Lab Chip 10, 1567-1573；及Godin等人(2008) J Biophoton. 1(5):355-376。在兩種情況下，細胞均可經多種標記物標記，從而允許以高純度對界限分明之T細胞亞群進行分離。在一些實施例中，抗體或結合搭配物經一或多種可偵測標記物標記，以促進根據正向及/或負向選擇進行的分離。舉例而言，分離可基於與經螢光標記之抗體的結合。在一些實例中，基於抗體或其他對一或多種細胞表面標記物具有特異性之結合搭配物之細胞分離係在射流物料流中進行，諸如藉由螢光激活細胞分選(FACS)，包括製備規模(FACS)及/或微機電系統(MEMS)晶片，例如與流式細胞偵測系統組合。此類方法允許基於多種標記物同時進行陽性及陰性選擇。在一些實施例中，製備方法包括在分離、培育及/或工程改造之前或之後，冷凍(例如低溫保藏)細胞的步驟。在一些實施例中，冷凍及後續解凍步驟移除細胞群體中之粒細胞及在一定程度上移除單核球。在一些實施例中，將細胞懸浮於冷凍溶液中，例如在洗滌步驟之後將細胞懸浮於冷凍溶液中，以移除血漿及血小板。在一些態樣中，可使用多種已知冷凍溶液及參數中之任一者。一個實例涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白(HSA)之PBS，或其他適合之細胞冷凍培養基。接著用培養基1:1稀釋，使得DMSO及HSA的最終濃度分別為10%及4%。細胞隨後以每分鐘1°之速率冷凍至-80℃且儲存於液氮儲槽之氣相中。在一些實施例中，細胞在基因工程改造之前或與基因工程改造結合進行培育及/或培養。培育(incubation)步驟可包括培養、培育(cultivation)、刺激、活化及/或繁殖。在一些實施例中，組合物或細胞在刺激條件或刺激劑存在下培育。此類條件包括經設計以誘導群體中之細胞增殖、擴增、活化及/或存活、模擬抗原暴露及/或使用於基因工程改造(諸如用於引入重組抗原受體)之細胞預致敏的彼等條件。該等條件可包括以下中之一或多者：特定培養基、溫度、氧含量、二氧化碳含量、時間、試劑，例如養分、胺基酸、抗生素、離子及/或刺激因子，諸如細胞介素、趨化因子、抗原、結合搭配物、融合蛋白、重組可溶受體及任何其他經設計以活化細胞之試劑。在一些實施例中，刺激條件或試劑包括一或多種試劑，例如配位體，其能夠活化TCR複合物之細胞內信號傳導域。在一些態樣中，試劑開啟或起始T細胞中之TCR/CD3細胞內信號傳導級聯。此類試劑可包括抗體，諸如對TCR組分及/或共刺激受體具有特異性之彼等，例如抗CD3、抗CD28，例如結合至諸如珠粒之固體擔體，及/或一或多種細胞介素。視情況，擴增方法可進一步包含將抗CD3及/或抗CD28抗體添加至培養基(例如以至少約0.5 ng/ml之濃度)之步驟。在一些實施例中，刺激劑包括IL-2及/或IL-15，例如至少約10個單位/毫升濃度的IL-2。在一些態樣中，根據以下技術進行培育，諸如Riddell等人之美國專利第6,040,177號、Klebanoff等人 (2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura等人 (2012) Blood.1:72-82及/或Wang等人 (2012) J Immunother. 35(9):689-701中所描述之彼等技術。在一些實施例中，T細胞係藉由向組合物添加飼養細胞，諸如非分裂外周血液單核細胞(PBMC)(例如使得所得細胞群體就待擴增之初始群體中之各T淋巴細胞而言含有至少約5、10、20、或40個或更多個PBMC飼養細胞)；及培育培養物(例如持續足以擴大T細胞數目之時間)而擴增。在一些態樣中，非分裂飼養細胞可包含γ輻射PBMC飼養細胞。在一些實施例中，PBMC經約3000 rads至3600 rads範圍內之γ射線輻射以防止細胞分裂。在一些態樣中，添加T細胞群體之前，向培養基中添加飼養細胞。 在一些實施例中，刺激條件包括適用於人類T淋巴細胞生長的溫度，例如至少約25℃，通常至少約30℃，且通常為37℃或約37℃。視情況，培育可進一步包含添加非分裂EBV轉型類淋巴母細胞(LCL)作為飼養細胞。LCL可經約6000至10,000拉德範圍內之γ射線輻射。在一些態樣中，LCL飼養細胞以任何適合量提供，諸如LCL飼養細胞與初始T淋巴細胞之比率至少約10:1。在實施例中，抗原特異性T細胞(諸如抗原特異性CD4+及/或CD8+ T細胞)藉由用抗原刺激原初或抗原特異性T淋巴細胞來獲得。舉例而言，針對細胞巨大病毒抗原之抗原特異性T細胞株或純系可藉由自經感染之個體分離T細胞且用相同抗原活體外刺激該等細胞來產生。 B. 裝置及製品 在一些實施例中，亦提供裝置或製品。在一些實施例中，提供用於層析之生物反應器及第一固定相之配置。生物反應器適合於擴增細胞，且固定相適合於細胞分離及試劑移除。第一固定相為凝膠過濾基質及/或親和性層析基質，其中凝膠過濾及/或親和性層析基質包含親和性試劑，其中親和性試劑包含特異性結合至第一試劑中包含之結合搭配物C1之結合位點Z1及/或親和性試劑包含特異性結合至第二試劑中包含之結合搭配物C2之結合位點Z2。第一固定相藉此適合於在其上固定第一試劑及/或第二試劑，第一結合搭配物C1及/或自由第二結合搭配物C2。另外，生物反應器及固定相經流體地連接。此配置可用於如上所解釋之連續擴增且可整合於已知細胞擴增系統，諸如Quantum®細胞擴增系統)或Xuri細胞擴增系統W25中。 在此配置中，第一固定相包含於層析管柱中或為平面固定相。該配置可進一步包含第二固定相，其流體地連接至第一固定相。第二固定相可為凝膠過濾基質及/或親和性層析基質，其中凝膠過濾及/或親和性層析基質包含親和性試劑。此親和性試劑可包含結合搭配物D，其(特異性)結合至多聚化試劑之結合位點Z1，藉此適合於將多聚化試劑固定於固定相上。 本發明另外涉及用於純化(例如選擇)及培養，諸如刺激或擴增細胞組合物之裝置，該裝置包含至少一種用於層析之生物反應器及第一固定相及/或第二固定相之配置，如上文所定義。 裝置可進一步包含串聯流體連接之生物反應器及固定相之複數個配置。 裝置可包含流體連接至用於層析之生物反應器及固定相之配置之生物反應器的樣品入口。裝置亦可包含用於純化及擴增靶細胞之樣品出口，該樣品出口流體連接至至少一種用於層析之生物反應器及固定相之配置中之最後一者之固定相。 在某些實施例中，裝置可設計為功能封閉系統。 C. 經培養細胞之例示性特徵 在一些實施例中，經培養靶細胞(例如培養之T細胞)可包括根據本文所提供之方法產生或生產之經培養細胞，其基於或相關於其增殖能力、表面標記物表現、分化狀態、活化狀態及/或代謝型態而展現一或多種指定表型及/或功能特徵。在一些實施例中，根據所提供方法中之任一者培養靶細胞(例如培養T細胞)導致相較於根據本文提供之方法進行培育之前的組合物中之細胞之對應或各別功能或表型，與細胞之功能(例如功能活性之增加或減少)或表型(例如一或多種標記物之更高或更低表現)相關之參數的變化。在一些實施例中，培養之T細胞展現就選自擴增及/或增殖能力、CD4+/CD8+ T細胞分佈或比率、表面標記物表現、功能活性或代謝型態之參數而言的變化。 在一些實施例中，將如在培養之T細胞中量測之參數的變化與參考T細胞組合物或製備物中量測之相同或類似參數進行比較或參照。通常，參考T細胞組合物或製備物中之T細胞在與可逆結合試劑(例如多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)一起培育之前包括或衍生自相同或基本上相同之T細胞組合物，除了此類細胞不經受培育或經受不同培育。在一些實施例中，參考T細胞製備物使用基本上相同之方案或條件(例如一或多種刺激劑之類型、一或多種刺激劑之型式、基本上相同之起始細胞數目、洗滌、存在或不存在額外試劑、培育時序、培育溫度)經受培育，除了參考T細胞製備物之此類培育之至少一個態樣，且在一些情況下僅一個態樣不同於產生培養之T細胞之培育。 在一些實施例中，在與可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之前，參考T細胞組合物或製備物為含有T細胞之組合物。 在一些實施例中，藉由與可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)小於28天、21天、14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天產生培養之T細胞及/或其中此類試劑與細胞上之一或多個分子之締合經破壞(例如在競爭試劑，例如生物素或生物素類似物存在下)，諸如在起始與此類試劑一起培育之28天、21天、14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、或1天內破壞。舉例而言，在一些態樣中，培養之T細胞係在與如本文所述之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，其中培育在起始此類培育之後28天、21天、14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天內(諸如小於或大約4、3、2或1天，或更小)終止及/或破壞，及/或其中將可逆結合劑自細胞解離之競爭劑(例如生物素)係在起始此類培育之後28天、21天、14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天內(諸如小於或大約4、3、2或1天，或更小)添加至培育細胞。在一些實施例中，參考T細胞製備物係在與相同或基本上相同之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，但其中進行培育超過5天，不終止及/或破壞以減少或終止細胞中誘導或調節之信號，及/或其中T細胞製備物係在不添加將試劑自細胞解離之競爭劑(例如生物素或生物素類似物)的情況下生產。 在一些實施例中，培養之T細胞係藉由與可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)而產生，其中受體結合劑(例如刺激劑)為不結合至CD28及/或誘導信號傳導之試劑，亦即不為抗CD28抗體或其片段。舉例而言，在一些實施例中，培養之T細胞係在與可逆結合試劑一起培育之後產生或生產，其中一或多種刺激劑可逆地結合至突變蛋白抗生蛋白鏈菌素，其中至少一種刺激劑對CD3 (例如抗CD3抗體或其片段)具有特異性，且第二刺激劑可對以下中之一或多者具有特異性：CD90、CD95、CD137、CD154、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM (例如分別為抗CD90抗體、抗CD95抗體、抗CD137抗體、及抗CD154抗體、抗ICOS抗體、抗LAT抗體、抗CD27抗體、抗OX40抗體、或抗HVEM抗體，或其抗原結合片段)。在一些實施例中，參考T細胞製備物為在與可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產的T細胞培養物，但其中試劑包含特異性結合CD28及/或誘導或調節CD28信號傳導之試劑。舉例而言，在一些實施例中，參考T細胞製備物係在T細胞組合物與抗CD3/抗CD28 Dynabeads®、抗CD3/抗CD28 ExPact®珠粒或其他抗CD3/抗CD28刺激劑培育之後產生或生產。在一些實施例中，此類其他抗CD3/抗CD28刺激劑為其中抗體試劑結合至擔體(例如固體擔體)，例如珠粒、粒子、磁性粒子或珠粒、奈米粒子或微球之試劑。在一些實施例中，培養之T細胞製法係藉由與可溶，亦即不結合至擔體(例如固體擔體)之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)。 舉例而言，在一些實施例中，提供培養之T細胞，諸如根據本文所提供之方法中之任一者製備，其中培養之T細胞係在與如本文所述之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，其中培養之T細胞之特徵在於相較於參考T細胞組合物或製備物增強之擴增及/或增殖能力。在一些實施例中，增強之擴增及/或增殖能力包含分別相較於參考T細胞組合物或製備物中之CD3+ T細胞、CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞之數目或百分比，培養之T細胞中之CD3+ T細胞、CD4+ T細胞及/或CD8+ T細胞之數目或百分比之至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)增加。 在一些實施例中，提供培養之T細胞，諸如根據本文所提供之方法中之任一者製備，其中培養之T細胞係在與如本文所述之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，其中培養之T細胞之特徵在於CD3+ T細胞相較於參考T細胞培養物增強之擴增及/或增殖能力。在一些實施例中，增強之擴增及/或增殖能力包含相較於參考T細胞組合物或製備物中之CD3+ T細胞之數目或百分比，培養之T細胞中之CD3+ T細胞之數目或百分比之至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)增加。 在一些實施例中，提供培養之T細胞，諸如根據本文所提供之方法中之任一者製備，其中培養之T細胞係在與如本文所述之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，其中培養之T細胞之特徵在於CD4+ T細胞相較於參考T細胞組合物或製備物增強之擴增及/或增殖能力。在一些實施例中，增強之擴增及/或增殖能力包含相較於參考T細胞組合物或製備物中之CD4+ T細胞之數目或百分比，培養之T細胞中之CD4+ T細胞之數目或百分比之至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)增加。 在一些實施例中，提供培養之T細胞，諸如根據本文所提供之方法中之任一者製備，其中培養之T細胞係在與如本文所述之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，其中培養之T細胞之特徵在於CD8+ T細胞相較於參考T細胞組合物或製備物增強之擴增及/或增殖能力。在一些實施例中，增強之擴增及/或增殖能力包含相較於參考T細胞組合物或製備物中之CD8+ T細胞之數目或百分比，培養之T細胞中之CD8+ T細胞之數目或百分比之至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)增加。 在一些實施例中，提供培養之T細胞，諸如根據本文所提供之方法中之任一者製備，其中培養之T細胞係在與如本文所述之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，其中培養之T細胞之特徵在於相較於參考T細胞組合物或製備物改變之CD8+/CD4+ T細胞分佈或標準化T細胞分佈，諸如改變之CD8+/CD4+比率或標準化CD8+/CD4+ T細胞比率。CD8+/CD4+比率或標準化比率可增加或減少。在一些實施例中，改變之CD8+/CD4+ T細胞比率由相對於或相較於參考組合物或製備物中之數目或百分比或標準化數目或百分比，培養之T細胞中之CD8+ T細胞之數目或百分比或標準化數目或百分比之增加產生。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或製備物中之CD8+ T細胞之數目或百分比或CD8+ T細胞之標準化數目或百分比，培養之T細胞中之CD8+ T細胞之數目增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或製備物中之CD8+/CD4+ T細胞之比率或CD8+/CD4+之標準化比率，CD8+/CD4+ T細胞之比率或CD8+/CD4+之標準化比率增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。在一些實施例中，培養之T細胞或組合物或製備物中之數目、百分比或比率標準化為培育之前的含有T細胞之起始組合物中之數目、百分比或比率。 在一些實施例中，提供根據本文所提供之方法中之任一者製備之培養之T細胞，其中培養之T細胞係在與如本文所述之可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之後產生或生產，且其中培養之T細胞之特徵在於相較於參考T細胞組合物或製備物改變之表面標記物表現圖譜。在一些實施例中，改變之表面標記物表現圖譜係歸因於T細胞之一或多個亞群之數目或百分比之變化，該變化對於選自以下之一或多個表面標記物而言為正性、負性或較低：CD45RA、CD45RO、CD62L、CD69、CCR7、CD27、CD28、CD122、t-bet、IL-7Rα、CD95、IL-2Rβ、CXCR3、LFA-1、KLRG1。在一些實施例中，相較於參考組合物或製備物中之T細胞亞群之數目或百分比，培養之T細胞中之T細胞亞群之數目或百分比增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。 在一些實施例中，培養之T細胞中之T細胞亞群(例如相較於參考組合物或製備物，在培養之T細胞中增加之T細胞亞群)展現相較於參考T細胞組合物或製備物降低或減少之分化或活化狀態。在一些實施例中，T細胞亞群不為或不包括效應T細胞(TE )或效應記憶T細胞(TEM )表型。在一些實施例中，T細胞亞群含有為CD62L+ 、CCR7+ 、CD27+ 、CD28+ 或KLRG1低 /- 中之一或多者之表面表型。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或培養物中之T細胞亞群之數目或百分比，培養之T細胞中之此類T細胞亞群增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。 在一些實施例中，培養之T細胞中之T細胞亞群(例如相較於參考組合物或製備物，在培養之T細胞中增加之T細胞亞群)針對CD62L及/或IL-7Rα (CD127)為陽性及/或針對t-bet為陰性或較低。在一些實施例中，T細胞亞群針對CD45RA為陽性及/或針對CD45RO為陰性或較低。在一些實施例中，T細胞亞群針對CCR7、CD45RA、CD62L、CD27、CD28、IL-7Rα (CD127)、CD95、IL-2Rβ、CXCR3及LFA-1中之一或多者為陽性，及/或針對CD45RO為陰性。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或培養物中之T細胞亞群之數目或百分比，培養之T細胞中之此類T細胞亞群增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。 在一些實施例中，培養之T細胞中之T細胞亞群(例如相較於參考組合物或製備物，在培養之T細胞中增加之T細胞亞群)為或包括針對CD62L為陽性之細胞(CD62L+)。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或培養物中之T細胞亞群之數目或百分比，培養之T細胞中之此類T細胞亞群增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。 在一些實施例中，培養之T細胞中之T細胞亞群(例如相較於參考組合物或製備物，在培養之T細胞中增加之T細胞亞群)為或包括為CD62L+及a) CD45RA低 /+ 、CD45RO低 /+ 、CCR7+及CD27+中之任何一或多者，及b) t-bet低 、IL-7Rα+ (CD127+)、CD95+、IL-2Rβ+、CXCR3+及LFA-1+中之任何一或多者之細胞。在一些實施例中，T細胞亞群亦可為CD3+、CD4+或CD8+。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或培養物中之T細胞亞群之數目或百分比，培養之T細胞中之此類T細胞亞群增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。 在一些實施例中，培養之T細胞中之T細胞亞群，諸如CD62L+ T細胞亞群為或包括記憶T細胞或其特定亞群，諸如長期記憶T細胞或與其共用表型特徵。在一些實施例中，此類記憶T細胞為中樞記憶T細胞(Tcm)或T記憶幹細胞(Tscm)細胞。在一些實施例中，記憶T細胞為Tscm細胞。Tscm細胞可描述為相較於其他記憶T細胞亞群或相較於未處理T細胞具有一或多個表型差異或功能特徵，諸如分化較少或更未處理(參見例如Ahlers及Belyakov (2010) Blood, 115:1678)；Cieri等人 (2015) Blood, 125:2865；Flynn等人 (2014) Clinical & Translational Immunology, 3, e20；Gattinoni等人 (2012) Nat. Med., 17:1290-1297；Gattinoni等人 (2012) Nat. Reviews, 12:671；Li等人 (2013) PLOS ONE, 8:e67401；及公佈之PCT申請案第WO2014/039044號)。在一些情況下，認為Tscm細胞為能夠產生效應T細胞及記憶T細胞之全部三個亞群(Tscm、Tcm及Tem)之唯一記憶T細胞。在一些態樣中，Tscm細胞具有所有記憶T細胞亞群之最高存活率及針對抗原或恆穩刺激之增殖反應，及不存在同源抗原之最小消耗。在一些實施例中，分化較少之Tscm細胞可在授受性轉移之後展現相較於其他記憶T細胞之較大擴增、長期活力及靶細胞破壞，且因此可能能夠以相較於Tcm或Tem細胞將可能之情況較少的轉移細胞介導更有效治療。 在一些態樣中，已關於Tscm細胞報導或已知之表型或功能特徵之實例包括例如此類細胞a)為CD45RO- 、CCR7+ 、CD45RA+ 、CD62L+ 、CD27+ 、CD28+ 、IL-7Rα+ 、CD95+ 、IL-2Rβ+ 、CXCR3+ 及LFA-1+ ；b)為CD45RA+ 、CCR7+ 、CD62L+ 及CD95+ ；c)為CD45RA+ 、CD45RO+ 、CCR7+ 、CD62L+ 、CD27+ 、CD28+ 、CD95+ 及IL-2Rβ+ ；d)為CD45RO- 、CD45RA+ 、CCR7+ 、CD62L+ 、CD27+ 、CD28+ 、CD127+ 及CD95+ ；e)為CD45RA+ 、CD44+/- 、CD62L+ 、CD127+ 、IL-2Rβ+ 、CD28+ 、CD43- 、KLRG1- 、Peforin- 及GranzymeB- ；f)表現高含量之CCR7、CD62L、CD27及CD28，中等含量之CD95及IL-2Rβ，低含量之CD45RA，且不表現CD45RO或KLRG-1；或g)表現高含量之CD62L，低含量之CD44及t-bet，及為Sca-1+ ；及/或具有中等IL-2生產能力、低IFNγ生產能力、低細胞毒性及高自我更新能力。 在一些實施例中，培養之T細胞中之T細胞亞群(例如相較於參考組合物或製備物，在培養之T細胞中增加之T細胞亞群)為或包括記憶T細胞，諸如長期記憶T細胞。在一些實施例中，記憶T細胞為中樞記憶(Tcm)T細胞。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RA-、CD45RO低 /+ 、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+ CD122+及/或KLGR1低 。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或培養物中之T細胞亞群之數目或百分比，培養之T細胞中之此類T細胞亞群增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。 在一些實施例中，記憶T細胞為主幹中樞記憶(Tscm)T細胞。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RA低 /+ 、CD45RO低 /+ 、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+、CD122+及/或KLGR1-。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RA低 /+ 、CD45RO- 、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD28+、CD95+、CD122+及/或KLGR1-。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RO- 、CCR7+ 、CD45RA+ 、CD62L+ 、CD27+ 、CD28+ 、IL-7Rα+ 、CD95+ 、IL-2Rβ+ 、CXCR3+ 及/或LFA-1+ 。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RA+ 、CCR7+ 、CD62L+ 及/或CD95+ 。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RA+ 、CD45RO+ 、CCR7+ 、CD62L+ 、CD27+ 、CD28+ 、CD95+ 及/或IL-2Rβ+ 。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RO- 、CD45RA+ 、CCR7+ 、CD62L+ 、CD27+ 、CD28+ 、CD127+ 及/或CD95+ 。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵CD45RA+ 、CD44+/- 、CD62L+ 、CD127+ 、IL-2Rβ+ 、CD28+ 、CD43- 、KLRG1- 、Peforin- 及/或GranzymeB- 。在一些實施例中，T細胞亞群表現高含量之CCR7、CD62L、CD27及/或CD28，中等含量之CD95及/或IL-2Rβ，低含量之CD45RA，及/或不表現CD45RO及/或KLRG-1。在一些實施例中，T細胞亞群表現高含量之CD62L，低含量之CD44及t-bet，及/或為Sca-1+ 。在一些實施例中，T細胞亞群具有表型特徵中等IL-2生產能力、低IFNγ生產能力、低細胞毒性及/或高自我更新能力。在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或培養物中之T細胞亞群之數目或百分比，培養之T細胞中之此類T細胞亞群增加至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍中之任一者)。 在一些實施例中，相較於參考T細胞組合物或製備物，T細胞亞群，諸如上文所述之任何T細胞亞群以培養之T細胞中之總T細胞之較大百分比或培養之T細胞中之總T細胞之較大數目存在。在一些實施例中，呈培養物中之總T細胞或總細胞之百分比形式之培養之T細胞中之T細胞亞群之百分比為至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大。在一些實施例中，相較於基於包含表型，但未經培育或培養之一或多種標記物之表面表現直接自人類個體分離或富集之T細胞組合物中之T細胞之細胞亞群之對應百分比，經培養細胞中之T細胞亞群，諸如上文所述之任何T細胞亞群之百分比更大，例如大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或超過5倍。在一些實施例中，相較於根據本文所提供之方法中之任一者與可逆結合劑一起培育(例如與多聚化試劑，諸如與可逆地結合至寡聚突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之刺激劑一起培育)之前的參考T細胞組合物或製備物，諸如上文所述之任何參考T細胞組合物或製備物，例如T細胞組合物中之T細胞亞群之數目、相對數目或標準化數目，經培養細胞中之T細胞亞群，諸如上文所述之任何T細胞亞群之總數、相對數目或標準化數目更大，例如大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或超過5倍。在一些實施例中，對應於存在於T細胞培養物中之T細胞亞群之T細胞的數目為至少或至少約1×106 個細胞、2×106 個細胞、3×106 個細胞、4×106 個細胞、5×106 個細胞或更大。 在一些實施例中，T細胞亞群為CD62L+及/或IL-7Rα+ (CD127+)且呈培養物中之總T細胞或總細胞之百分比形式之培養之T細胞中之CD62L+及/或IL-7Rα+ (CD127+)亞群之百分比為至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大。在一些實施例中，T細胞亞群為CD45RA-、CD45RO低 /+ 及/或KLRG1低 且呈培養物中之總T細胞或總細胞之百分比形式之培養之T細胞中之CD45RA-、CD45RO低 /+ 及/或KLRG1低 亞群之百分比為至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大。在一些實施例中，T細胞亞群為CD45RA低/+ 、CD45RO低 /+ 及/或KLRG1- 且呈培養物中之總T細胞或總細胞之百分比形式之培養之T細胞中之CD45RA低 /+ 、CD45RO低 /+ 及/或KLRG1- 亞群之百分比為至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大。 在一些實施例中，T細胞亞群為或包括Tcm細胞。在一些實施例中，呈培養物中之總T細胞或總細胞之百分比形式之培養之T細胞中之Tcm亞群之百分比為至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大。 在一些實施例中，T細胞亞群為或包括Tscm細胞。在一些實施例中，呈培養物中之總T細胞或總細胞之百分比形式之培養之T細胞中之Tscm亞群之百分比為至少35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更大。 在一些實施例中，T細胞亞群，諸如CD62L+ T細胞亞群具有或展現a)低水準之TCR重排切除環(TREC)；及/或b)表現增殖標記物(例如Ki-67)；及/或c)展現在刺激劑存在下增殖之能力；及/或d)展現在刺激劑存在下產生選自IFN-γ、TNF及IL-2之細胞介素之能力；及/或e)在不存在刺激劑的情況下難以消耗；及/或f)能夠產生Tscm、Tcm、Tem及Teff細胞；及/或g)具有低細胞毒性；及/或h)相較於Tcm或Tem細胞，可在較少細胞之授受性轉移之後產生相同或更大反應。在一些實施例中，刺激劑為抗原、恆穩細胞介素(例如IL-15或IL-17)，或為能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號之試劑。在一些實施例中，產生細胞介素之能力包含產生IFNγ之較低能力及/或產生IL-2之中等能力。 在一些實施例中，提供培養之T細胞，諸如根據本文所提供之方法中之任一者製備，其中培養之T細胞係在如本文所述之培育之後產生或生產，且其中培養之T細胞之特徵在於相較於參考T細胞組合物或製備物改良之功能活性概況。在一些實施例中，存在於培養物中之培養之T細胞或特定T細胞亞群展現相較於參考組合物或製備物或相較於參考組合物或製備物中之T細胞亞群改變之功能活性概況，諸如改變(例如增加或減少)至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍之功能活性。在一些實施例中，功能活性選自以下中之一或多者：a)低水準之TCR重排切除環(TREC)；及/或b)表現增殖標記物(例如Ki-67)；及/或c)展現在刺激劑存在下增殖之能力；及/或d)展現在刺激劑存在下產生選自IFN-γ、TNF及IL-2之細胞介素之能力；及/或e)在不存在刺激劑的情況下難以消耗；及/或f)能夠產生Tscm、Tcm、Tem及Teff細胞；及/或g)具有低細胞毒性。在一些實施例中，刺激劑為抗原、恆穩細胞介素(例如IL-15或IL-17)，或為能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號之試劑。在一些實施例中，產生細胞介素之能力包含產生IFNγ之較低能力及/或產生IL-2之中等能力。在一些實施例中，T細胞亞群包含培養之T細胞中之記憶T細胞，諸如長期記憶T細胞。在一些實施例中，記憶T細胞為Tscm細胞。 在一些實施例中，相較於可藉由參考組合物或製備物或藉由參考組合物或製備物中之T細胞亞群實現之反應，存在於培養物中之培養之T細胞或特定T細胞亞群可在較少細胞之授受性轉移之後產生相同或更大反應。在一些實施例中，藉由至少少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超過10倍中之任一者)之細胞實現此類反應。在一些實施例中，反應增加或大至少約2倍(諸如至少約3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或超過10倍中之任一者)。 在一些實施例中，相較於在GSK-P抑制劑存在下培育之T細胞製備物中之對應細胞亞群，經培養細胞中之T細胞亞群，諸如上文所述之任何T細胞亞群之百分比更大，例如大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或超過5倍。在一些實施例中，培養之T細胞之組合物不含GSK-P抑制劑。 在一些實施例中，相較於在重組恆穩細胞介素，視需要IL-7或IL-15存在下培育之對應細胞亞群，經培養細胞中之T細胞亞群，諸如上文所述之任何T細胞亞群之百分比更大，例如大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或超過5倍。在一些實施例中，培養之T細胞之組合物不含重組(例如外源)IL-7細胞介素或重組(例如外源)IL-15細胞介素。 在一些實施例中，培養之T細胞之組合物係根據本文所提供之方法中之任一者生產或產生，其中諸如競爭試劑之物質係添加至T細胞以破壞，以便減少及/或終止一或多種刺激劑之信號傳導。在一些實施例中，培養之T細胞之組合物含有物質，諸如競爭試劑，例如生物素或生物素類似物，例如D-生物素。在一些實施例中，相較於物質並非在培育期間外源地添加之培養之T細胞之參考組合物或製備物中之物質的量，物質，諸如競爭試劑，例如生物素或生物素類似物，例如D-生物素以大至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或超過1000倍之量存在。在一些實施例中，培養之T細胞之組合物中之物質，諸如競爭試劑，例如生物素或生物素類似物，例如D-生物素的量為或為約10 µM至100 µM、100 µM至1 mM、100 µM至500 µM、或10 µM至100 µM。 IV. 對經培養細胞、抗原受體及基因工程改造細胞進行基因工程改造之方法 在一些實施例中，經培養細胞含有或經工程改造以含有工程改造受體，例如工程改造抗原受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)，或T細胞受體(TCR)。亦提供此類細胞之群體、含有此類細胞及/或富集此類細胞之組合物，諸如在其中富集或選擇某一類型之細胞，諸如T細胞或CD8+或CD4+細胞。在組合物當中為用於投藥(諸如用於授受細胞療法)之醫藥組合物及調配物。亦提供向個體(例如患者)投與細胞及組合物的治療方法。因此，在一些實施例中，經培養細胞包括經由基因工程改造所引入的一或多種核酸且藉此表現此類核酸之重組或基因工程改造產物。在一些實施例中，如下實現基因轉移：首先刺激經培養細胞，諸如藉由將其與誘導諸如增殖、存活及/或活化之反應的刺激物組合，例如如藉由細胞介素或活化標記物之表現所量測，接著轉導活化細胞，且在培養物中擴增至對於臨床應用而言足夠之數目。在一些情形中，刺激因子(例如淋巴激素或細胞激素)之過度表現可對個體具有毒性。因此，在一些情形中，經工程改造之細胞包括使得細胞容易接受活體內負選擇(諸如以授受性免疫療法投藥時)的基因區段。舉例而言，在一些態樣中，經培養細胞經工程改造以使其可由於其所投與之患者之活體內條件的變化而排除。陰性可選表型可由賦予對所投與試劑(例如化合物)之敏感性之基因的插入產生。陰性可選基因包括賦予更昔洛韋(ganciclovir)敏感性的單純性疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人, Cell II: 223, I977)；細胞次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)基因、細胞腺嘌呤磷酸核糖基轉移酶(APRT)基因、細菌胞嘧啶脫胺酶(Mullen等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992))。在一些態樣中，經培養細胞進一步經工程改造以促進細胞激素或其他因子表現。A. 編碼抗原受體，例如嵌合抗原受體之核酸 提供用於生產基因工程改造細胞之方法、核酸、組合物及套組。基因工程改造一般涉及將編碼重組或工程改造組分之核酸引入至含有經培養細胞之組合物中，諸如藉由反轉錄病毒轉導、轉染或轉化。在一些實施例中，核酸為異源核酸，亦即通常不存在於細胞或自該細胞獲得之樣品中的核酸，諸如自另一生物體或細胞獲得之核酸，此類核酸例如在經工程改造之細胞及/或此類細胞所來源之生物體中通常未發現。在一些實施例中，核酸為非天然存在之核酸，諸如自然界中未發現之核酸，包括包含編碼來自多種不同細胞類型之不同域之核酸之嵌合組合的核酸。1. 嵌合抗原受體(CAR)細胞一般表現重組受體，諸如包括功能性非TCR抗原受體之抗原受體，例如嵌合抗原受體(CAR)，及其他抗原結合受體，諸如轉殖基因T細胞受體(TCR)。其他嵌合受體亦屬於重組受體。例示性抗原受體(包括CAR)及對此類受體進行工程改造且將其引入至細胞中之方法包括例如國際專利申請公開案第WO200014257號、第WO2013126726號、第WO2012/129514號、第WO2014031687號、第WO2013/166321號、第WO2013/071154號、第WO2013/123061號、美國專利申請公開案第US2002131960號、第US2013287748號、第US20130149337號、美國專利第6,451,995號、第7,446,190號、第8,252,592號、第8,339,645號、第8,398,282號、第7,446,179號、第6,410,319號、第7,070,995號、第7,265,209號、第7,354,762號、第7,446,191號、第8,324,353號及第8,479,118號以及歐洲專利申請案第EP2537416號中所描述之彼等內容及/或由Sadelain等人, Cancer Discov. 2013年4月; 3(4): 388-398；Davila等人 (2013)PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle等人,Curr . Opin . Immunol . , 2012年10月; 24(5): 633-39；Wu等人,Cancer , 2012年3月 18(2): 160-75所描述之彼等內容。在一些態樣中，抗原受體包括如美國專利第7,446,190號中所述之CAR，及國際專利申請公開案第WO/2014055668 A1號中所述之彼等。CAR之實例包括如上述公開案中之任一者，諸如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美國專利第7,446,190號、美國專利第8,389,282號；Kochenderfer等人, 2013,Nature Reviews Clinical Oncology , 10, 267-276 (2013)；Wang等人 (2012)J . Immunother . 35(9): 689-701；及Brentjens等人,Sci Transl Med . 2013 5(177)中所揭示之CAR。亦參見WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美國專利第7,446,190號及美國專利第8,389,282號。嵌合受體，諸如CAR一般包括胞外抗原結合域，諸如抗體分子之一部分，一般為抗體之可變重鏈(VH )區及/或可變輕鏈(VL )區，例如scFv抗體片段。在一些實施例中，藉由受體靶向之抗原為多肽。在一些實施例中，其為碳水化合物或其他分子。在一些實施例中，相較於正常或非靶向細胞或組織，抗原選擇性地表現或過度表現於疾病或病況細胞，例如腫瘤或病原細胞上。在其他實施例中，抗原表現於正常細胞上及/或表現於工程改造細胞上。在一些實施例中，藉由受體靶向之抗原包括孤兒酪胺酸激酶受體RORl、tEGFR、Her2、Ll-CAM、CD19、CD20、CD22、間皮素、CEA及B型肝炎表面抗原、抗葉酸受體、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGP-2、EGP-4、0EPHa2、ErbB2、3或4、FBP、胎兒乙醯膽鹼e受體、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ輕鏈、路易斯Y、L1-細胞黏附分子、MAGE-A1、間皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配位體、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性抗原、PSMA、Her2/neu、雌激素受體、孕酮受體、ephrinB2、CD123、c-Met、GD-2、及MAGE A3、CE7、威爾姆斯腫瘤1 (WT-1)、諸如細胞週期蛋白A1 (CCNA1)之細胞週期蛋白及/或生物素標記分子，及/或藉由HIV、HCV、HBV或其他病原體表現之分子。在本文所提供之方法中之任一者之某些實施例中，靶細胞表現結合至與疾病及/或癌症相關之抗原的CAR。在本文所提供之方法中之任一者之特定實施例中，抗原為αvβ6整合素(avb6整合素)、B細胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9 (CA9，亦稱為CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B (CTAG，亦稱為NY-ESO-1及LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、細胞週期蛋白、細胞週期蛋白A2、C-C基序趨化因子配位體1 (CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、硫酸軟骨素蛋白聚醣4 (CSPG4)、表皮生長因子蛋白質(EGFR)、截短表皮生長因子蛋白質(tEGFR)、III型表皮成長因子受體突變體(EGFR vIII)、上皮醣蛋白2 (EPG-2)、上皮醣蛋白40 (EPG-40)、ephrinB2、腎上腺素受體A2 (EPHa2)、雌激素受體、Fc受體樣5 (FCRL5；亦稱為Fc受體同系物5或FCRH5)、胎兒乙醯膽鹼受體(胎兒AchR)、葉酸結合蛋白(FBP)、葉酸受體α、胎兒乙醯膽鹼受體、神經節苷脂GD2、O-乙醯化GD2 (OGD2)、神經節苷脂GD3、醣蛋白100 (gp100)、G蛋白偶合受體5D (GPCR5D)、Her2/neu (受體酪胺酸激酶erbB2)、Her3 (erb-B3)、Her4 (erb-B4)、erbB二聚體、人類高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、B型肝炎表面抗原、人類白血球抗原A1 (HLA-AI)、人類白血球抗原A2 (HLA-A2)、IL-22受體α (伊利諾伊州-22Ra)、IL-13受體α2 (IL-13Ra2)、激酶插入域受體(kdr)、κ輕鏈、L1細胞黏附分子(L1CAM)、L1-CAM之CE7抗原決定基、含有8個家族成員A之富含白胺酸之重複序列(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、間皮素、c-Met、鼠類巨細胞病毒(CMV)、黏蛋白1 (MUC1)、MUC16、自然殺手第2組成員D (NKG2D)配位體、melan A (MART-1)、神經細胞黏附分子(NCAM)、癌胚抗原、黑色素瘤之優先表現抗原(PRAME)、孕酮受體、前列腺特異性抗原、前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、存活素、滋胚層醣蛋白(TPBG，亦稱為5T4)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、威爾姆斯腫瘤1 (WT-1)、病原體特異性抗原或與通用標籤相關之抗原，及/或生物素標記分子，及/或經HIV、HCV、HBV或其他病原體表現之分子。 在一些實施例中，CAR結合病原體特異性抗原。在一些實施例中，CAR對病毒抗原(諸如HIV、HCV、HBV等)、細菌抗原及/或寄生蟲抗原具有特異性。在一些實施例中，重組受體，例如CAR之抗體部分進一步包括免疫球蛋白恆定區之至少一部分，諸如鉸鏈區，例如IgG4鉸鏈區，及/或CH1/CL及/或Fc區。在一些實施例中，恆定區或部分屬於人類IgG，諸如IgG4或IgG1。在一些態樣中，恆定區部分充當抗原識別組分，例如scFv與跨膜域之間的間隔子區。間隔子之長度可使得細胞在抗原結合後之反應性與間隔子不存在之情況相比增加。例示性間隔子(例如鉸鏈區)包括國際專利申請公開案第WO2014031687號中所述之間隔子。在一些實例中，間隔子之長度為或為約為12個胺基酸或長度不超過12個胺基酸。例示性間隔子包括具有至少約10至229個胺基酸、約10至200個胺基酸、約10至175個胺基酸、約10至150個胺基酸、約10至125個胺基酸、約10至100個胺基酸、約10至75個胺基酸、約10至50個胺基酸、約10至40個胺基酸、約10至30個胺基酸、約10至20個胺基酸或約10至15個胺基酸(且包括任一所列範圍之端點之間的任何整數)之彼等間隔子。在一些實施例中，間隔區具有約12或少於12個胺基酸、約119個或少於119個胺基酸、或約229個或少於229個胺基酸。例示性間隔子包括單獨IgG4鉸鏈、連接至CH2及CH3域的IgG4鉸鏈，或連接至CH3域的IgG4鉸鏈。此抗原識別域一般連接至一或多種細胞內信號傳導組分，諸如在CAR之情況下經由抗原受體複合物(諸如TCR複合物)模擬活化及/或經由另一細胞表面受體傳導信號的信號傳導組分。因此，在一些實施例中，抗原結合組分(例如抗體)連接至一或多個跨膜及細胞內信號傳導域。在一些實施例中，跨膜域與細胞外域融合。在一個實施例中，使用與受體(例如CAR)中之一個域天然關聯的跨膜域。在一些情況下，跨膜域可經選擇或藉由胺基酸取代修飾以避免此類域結合至相同或不同表面膜蛋白質之跨膜域，以使與受體複合物之其他成員的相互作用降至最低。在一些實施例中，跨膜域來源於天然或合成來源。在天然來源的情況下，在一些態樣中，域來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。跨膜區包括來源於以下各者之跨膜區(亦即包含至少以下各者之跨膜區)：T細胞受體之α、β或ξ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD 154。或者，在一些實施例中，跨膜域為合成的。在一些態樣中，合成性跨膜域主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些態樣中，將在合成性跨膜域之各端處發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。在一些實施例中，藉由連接子、間隔子及/或跨膜域連接。細胞內信號傳導域為經由天然抗原受體模擬或接近信號、經由此受體與協同刺激受體之組合模擬或接近信號及/或經由單獨協同刺激受體模擬或接近信號之彼等域。在一些實施例中，存在短寡肽或多肽連接子(例如長度在2個與10個胺基酸之間的連接子，諸如含有甘胺酸及絲胺酸的連接子，例如甘胺酸-絲胺酸二聯體)且形成CAR之跨膜域與細胞質信號傳導域之間的連接。受體(例如CAR)一般包括至少一種細胞內信號傳導組分。在一些實施例中，受體包括TCR複合物之細胞內組分，諸如介導T細胞活化及細胞毒性的TCR CD3鏈，例如CD3 ξ鏈。因此，在一些態樣中，抗原結合部分連接至一或多個細胞信號傳導模組。在一些實施例中，細胞信號傳導模組包括CD3跨膜域、CD3細胞內信號傳導域及/或其他CD跨膜域。在一些實施例中，受體(例如CAR)進一步包括一或多個額外分子之一部分，諸如Fc受體γ、CD8、CD4、CD25或CD16。舉例而言，在一些態樣中，CAR或其他嵌合受體包括CD3-ζ或Fc受體γ與CD8、CD4、CD25或CD16之間的嵌合分子。在一些實施例中，在接合CAR或其他嵌合受體後，受體之細胞質域或細胞內信號傳導域活化免疫細胞(例如經工程改造以表現CAR之T細胞)的正常效應功能或反應中之至少一者。舉例而言，在一些情形下，CAR誘導T細胞功能，諸如細胞溶解活性；或T輔助細胞活性，諸如細胞激素或其他因子之分泌。在一些實施例中，使用抗原受體組分或共刺激分子之細胞內信號傳導域的截短部分置換完整免疫刺激鏈，例如在該部分轉導效應功能信號之情況下使用。在一些實施例中，細胞內信號傳導域包括T細胞受體(TCR)之細胞質序列，且在一些態樣中，亦包括在天然情形中與此類受體協同作用以在抗原受體參與後引發信號轉導之共受體的細胞質序列。在天然TCR之情形下，完全活化一般不僅需要經由TCR傳導信號，而且需要共刺激信號。因此，在一些實施例中，為了促進完全活化，CAR中亦包括用於產生二級或共刺激信號的組分。在其他實施例中，CAR不包括產生共刺激信號之組分。在一些態樣中，另一種CAR表現於相同細胞中且提供產生二級或共刺激信號之組分。T細胞活化在一些態樣中描述為由兩類細胞質信號傳導序列介導：經由TCR起始抗原依賴性初級活化的細胞質信號傳導序列(初級細胞質信號傳導序列)，及以抗原非依賴性方式起作用以提供二級或協同刺激信號的細胞質信號傳導序列(二級細胞質信號傳導序列)。在一些態樣中，CAR包括此類信號傳導組分中的一者或兩者。在一些態樣中，CAR包括調節TCR複合物初始活化的初始細胞質信號傳導序列。以刺激方式起作用之一級細胞質信號傳導序列可含有信號傳導基元，其稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM。含有ITAM之初級細胞質信號傳導序列之實例包括來源於TCRξ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b及CD66d之初級細胞質信號傳導序列。在一些實施例中，CAR中之細胞質信號傳導分子含有細胞質信號傳導域、其部分或來源於CD3ξ之序列。在一些實施例中，CAR包括共刺激受體(諸如CD28、4-1BB、OX40、DAP10及ICOS)之信號傳導域及/或跨膜部分。在一些態樣中，同一CAR包括活化組分及共刺激組分。在一些實施例中，活化域包括在一個CAR內，而協同刺激組分由識別另一抗原之另一CAR提供。在一些實施例中，CAR包括活化或刺激CAR、協同刺激CAR，其均表現於同一細胞上(參見WO2014/055668)。在一些態樣中，細胞包括一或多個刺激或活化CAR及/或協同刺激CAR。在一些實施例中，細胞另外包括抑制CAR (iCAR，參見Fedorov等人,Sci . Transl . Medicine , 5(215) (2013年12月)，諸如識別除與疾病或病況相關聯及/或對疾病或病況具有特異性之抗原以外之抗原的CAR，由此經由靶向疾病之CAR傳遞的活化信號藉由抑制CAR結合至其配位體而減弱或抑制，例如以減小脫靶效應。在某些實施例中，細胞內信號傳導域包含連接至CD3 (例如CD3-ξ)細胞內域之CD28跨膜及信號傳導域。在一些實施例中，細胞內信號傳導域包含連接至CD3ξ細胞內域之嵌合CD28及CD137 (4-1BB、TNFRSF9)共刺激域。在一些實施例中，CAR在細胞質部分中涵蓋一或多個，例如兩個或大於兩個共刺激域及活化域，例如主要活化域。例示性CAR包括CD3-ζ、CD28及4-1BB之細胞內組分。在一些實施例中，CAR或其他抗原受體進一步包括標記物，諸如細胞表面標記物，其可用於確認表現受體(諸如細胞表面受體之截短形式，諸如截短之EGFR (tEGFR))之細胞得到轉導或工程改造。在一些態樣中，標記包括CD34、NGFR或表皮生長因子受體(例如tEGFR)之全部或一部分(例如截短形式)。在一些實施例中，編碼標記物之核酸可操作地連接於編碼連接子序列，諸如可裂解連接子序列，例如T2A之聚核苷酸。參見WO2014031687。在一些實施例中，標記物為非天然地發現於T細胞上或非天然地發現於T細胞表面上之分子，例如細胞表面蛋白，或其部分。在一些實施例中，分子為非自身分子，例如非自身蛋白質，亦即不能被細胞所接受性轉移之宿主之免疫系統識別為「自身」的分子。在一些實施例中，標記物不具有治療功能且/或不產生除用作基因工程改造之標記物(例如用於選擇成功地經工程改造之細胞)之外的作用。在其他實施例中，標記物可為以其他方式發揮一些所要作用的治療分子，諸如細胞在活體內所遇到的配位體，諸如共刺激或免疫檢查點分子，以在授受性轉移時增強且/或減弱細胞反應且與配位體相遇。在一些情況下，CAR稱為第一、第二及/或第三代CAR。在一些態樣中，第一代CAR為僅在一些態樣中，第一代CAR為僅在抗原結合時提供CD3鏈誘導信號之CAR；在一些態樣中，第二代CAR為提供此信號及協同刺激信號之CAR，諸如包括來自協同刺激受體(諸如CD28或CD137)之細胞內信號傳導結構域的CAR；在一些態樣中，第三代CAR為包括不同協同刺激受體之多個協同刺激結構域的CAR。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括含有抗體或抗體片段之細胞外部分。在一些態樣中，嵌合抗原受體包括含有抗體或片段之細胞外部分及細胞內信號傳導域。在一些實施例中，抗體或片段包括scFv且細胞內域含有ITAM。在一些態樣中，細胞內信號傳導域包括CD3-ξ (CD3ζ)鏈之ξ鏈的信號傳導域。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括連接胞外域及細胞內信號傳導域的跨膜域。在一些態樣中，跨膜域含有CD28之跨膜部分。在一些實施例中，嵌合抗原受體含有T細胞共刺激分子之細胞內域。在一些態樣中，T細胞共刺激分子為CD28或41BB。術語「多肽」及「蛋白質」可互換使用且係指胺基酸殘基之聚合物，且不限於最小長度。多肽(包括所提供之受體及其他多肽，例如連接子或肽)可包括具有天然及/或非天然胺基酸殘基之胺基酸殘基。術語亦包括多肽之表現後修飾，例如糖基化、唾液酸化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。在一些態樣中，多肽可含有相對於原生或天然序列的修飾，只要蛋白質維持所要活性。此等修飾可為有意的，如經由定點突變誘發；或可為偶然的，諸如經由產生蛋白質之宿主的突變或因PCR擴增所致的錯誤。在一些實施例中，藉由呈連續劑量之細胞表現之受體，例如CAR含有至少一種免疫反應性抗原決定基作為藉由第一劑量之細胞表現之受體，例如CAR。在一些態樣中，藉由以連續劑量投與之細胞表現之受體，例如CAR與藉由第一劑量表現之受體，例如CAR相同，或與藉由以第一劑量投與之細胞表現之受體，例如CAR大體上相同。藉由以各種劑量向個體投與之細胞表現之重組受體，諸如CAR一般識別或特異性結合至表現於其治療之疾病或病況或細胞中，與其相關，及/或對其具有特異性。在特異性結合至分子，例如抗原後，受體一般將免疫刺激信號，諸如ITAM轉導之信號傳遞至細胞中，藉此促進靶向疾病或病況之免疫反應。舉例而言，在一些實施例中，第一劑量之細胞表現特異性結合至藉由疾病或病況之細胞或組織表現或與疾病或病況相關之抗原之CAR。2. TCR在一些實施例中，基因工程改造抗原受體包括重組T細胞受體(TCR)及/或自天然存在之T細胞選殖之TCR。在一些實施例中，靶抗原(例如癌症抗原)之高親和力T細胞純系經識別，自患者分離，且引入至細胞中。在一些實施例中，已在經人類免疫系統基因(例如人類白血球抗原系統，或HLA)工程改造之轉殖基因小鼠中產生靶抗原之TCR純系。參見例如腫瘤抗原(參見例如Parkhurst等人 (2009)Clin Cancer Res . 15:169-180及Cohen等人 (2005)J Immunol . 175:5799-5808。在一些實施例中，噬菌體呈現用於相對於靶抗原分離TCR (參見例如Varela-Rohena等人 (2008)Nat Med . 14:1390-1395及Li (2005)Nat Biotechnol . 23:349-354。在一些實施例中，在獲得T細胞純系之後，TCR α及β鏈經分離且選殖至基因表現載體中。在一些實施例中，TCR α及β基因係經由小RNA病毒(picornavirus)2A核糖體跳躍肽連接以使得兩條鏈均為共表現。在一些實施例中，TCR之基因轉移係經由反轉錄病毒或慢病毒載體，或經由轉座子實現(參見例如Baum等人 (2006) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13:1050-1063；Frecha等人 (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:1748-1757；Hackett等人 (2010) Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 18:674-683。3. 多靶向在一些實施例中，細胞及方法包括多靶向策略，諸如表現細胞上之兩個或大於兩個基因工程改造受體，其各自識別不同抗原之相同組分且通常各自包括不同細胞內信號傳導組分。此類多靶向策略描述於例如國際專利申請公開案第WO 2014055668 A1號(描述活化及共刺激CAR之組合，例如靶向個別地存在於脫靶，例如正常細胞上，但僅共同存在於待治療之疾病或病況之細胞上之兩種不同抗原)及Fedorov等人, Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013年12月)(描述表現活化及抑制CAR之細胞，諸如其中活化CAR結合至表現於正常或非病變細胞及待治療之疾病或病況之細胞兩者之一種抗原上，且抑制CAR結合至僅表現於正常細胞或不需要治療之細胞上之另一抗原)中。舉例而言，在一些實施例中，細胞包括表現第一基因工程改造抗原受體(例如CAR或TCR)之受體，該第一基因工程改造抗原受體能夠將活化信號誘導至細胞，一般在特異性結合藉由第一受體識別之抗原，例如第一抗原之後。在一些實施例中，細胞進一步包括第二基因工程改造抗原受體(例如CAR或TCR)，例如嵌合共刺激受體，其能夠將共刺激信號誘導至免疫細胞，一般在特異性結合至藉由第二受體識別之第二抗原之後。在一些實施例中，第一抗原及第二抗原相同。在一些實施例中，第一抗原及第二抗原不同。在一些實施例中，第一及/或第二基因工程改造抗原受體(例如CAR或TCR)能夠將活化信號誘導至細胞。在一些實施例中，受體包括含有ITAM或ITAM樣基元之細胞內信號傳導組分。在一些實施例中，藉由第一受體誘導之活化涉及細胞中之信號轉導或蛋白質表現之變化，其導致引發免疫反應，諸如ITAM磷酸化及/或引發ITAM介導之信號轉導級聯、形成免疫突觸及/或在結合受體(例如CD4或CD8等)附近聚集分子、活化諸如NF-κB及/或AP-1之一或多種轉錄因子及/或誘導諸如細胞介素之因子之基因表現、增殖及/或存活。在一些實施例中，第一及/或第二受體包括諸如CD28、CD137 (4-1 BB)、OX40及/或ICOS之共刺激受體之細胞內信號傳導域。在一些實施例中，第一及第二受體包括不同共刺激受體之細胞內信號傳導域。在一個實施例中，第一受體含有CD28共刺激信號傳導區且第二受體含有4-1BB共刺激信號傳導區，或反之亦然。在一些實施例中，第一及/或第二受體包括含有ITAM或ITAM樣基元之細胞內信號傳導域以及共刺激受體之細胞內信號傳導域。在一些實施例中，第一受體含有含有ITAM或ITAM樣基元之細胞內信號傳導域且第二受體含有共刺激受體之細胞內信號傳導域。與在相同細胞中誘導之活化信號組合之共刺激信號為導致免疫反應，諸如穩定且持續之免疫反應，諸如增加之基因表現、分泌細胞介素及其他因子及T細胞介導之效應功能(諸如細胞殺滅)之信號。在一些實施例中，單獨接合第一受體或單獨接合第二受體均不誘導穩定免疫反應。在一些態樣中，若僅接合一種受體，則細胞變得對抗原耐受或無反應，或經抑制，及/或不經誘導以增殖或分泌因子或執行效應功能。然而，在一些此類實施例中，當接合複數個受體時，諸如在遇到表現第一及第二抗原之細胞時，實現所需反應，諸如完全免疫活化或刺激，例如如由分泌一或多種細胞介素、增殖、持久性及/或執行免疫效應功能(諸如靶細胞之細胞毒性殺滅)指示。在一些實施例中，兩個受體分別將活化及抑制信號誘導至細胞，使得藉由受體中之一者結合至其抗原活化細胞或誘導反應，但藉由第二抑制受體結合至其抗原誘導抑制或減弱該反應之信號。實例為活化CAR及抑制CAR或iCAR之組合。此類策略可用於例如活化CAR結合表現於疾病或病況中，但亦表現於正常細胞上之抗原，且抑制受體結合至表現於正常細胞上但不表現於疾病或病況細胞上之獨立抗原之情況下。在一些實施例中，多靶向策略用於與特定疾病或病況相關之抗原表現於非病變，細胞上及/或表現於工程改造細胞自身上(短暫地(例如與基因工程改造結合進行刺激後)或永久地)之情況下。在此類情況下，藉由要求兩個獨立且個別地具特異性抗原受體之接合，可改良特異性、選擇性及/或功效。在一些實施例中，複數個抗原，例如第一及第二抗原表現於靶向之細胞、組織或疾病或病況上，諸如癌細胞上。在一些態樣中，細胞、組織、疾病或病況為多發性骨髓瘤或多發性骨髓瘤細胞。在一些實施例中，複數個抗原中之一或多者一般亦表現於不需要藉由細胞療法靶向之細胞，諸如正常或非病變細胞或組織，及/或工程改造細胞本身上。在此類實施例中，藉由要求多個受體之接合達成細胞反應而達成特異性及/或功效。B. 用於基因工程改造之載體及方法 用於引入基因工程改造組分，例如抗原受體，例如CAR或TCR之各種方法已為所熟知且可與提供之方法及組合物一起使用。例示性方法包括轉移編碼受體之核酸的方法，包括經由病毒，例如逆轉錄病毒或慢病毒；轉導、轉座子及電穿孔。在一些實施例中，使用重組感染性病毒粒子(諸如來源於猴病毒40 (SV40)、腺病毒、腺相關病毒(AAV)的載體)將重組核酸轉移至經培養細胞中。在一些實施例中，使用重組慢病毒載體或反轉錄病毒載體(諸如γ-反轉錄病毒載體)將重組核酸轉移至T細胞中(參見例如Koste等人 (2014) Gene Therapy 2014年4月3日. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens等人 (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino等人 (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park等人, Trends Biotechnol. 2011年11月 29(11): 550-557。在一些實施例中，反轉錄病毒載體具有長末端重複序列(LTR)，例如來源於莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠類胚幹細胞病毒(MESV)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)，或腺相關病毒(AAV)。大部分反轉錄病毒載體來源於鼠類反轉錄病毒。在一些實施例中，逆轉錄病毒包括來源於任何禽鳥或哺乳動物細胞來源的彼等物。反轉錄病毒通常為雙嗜性，意味著其能夠感染數個物種(包括人類)之宿主細胞。在一個實施例中，所表現的基因置換逆轉錄病毒gag、pol及/或env序列。已描述多種說明性反轉錄病毒系統(例如美國專利第5,219,740號；第6,207,453號；第5,219,740號；Miller及Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990；Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa等人 (1991) Virology 180:849-852；Burns等人 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；及Boris-Lawrie及Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109。慢病毒轉導方法為已知的。例示性方法描述於例如Wang等人 (2012)J . Immunother . 35(9): 689-701；Cooper等人 (2003)Blood . 101:1637-1644；Verhoeyen等人 (2009)Methods Mol Biol . 506: 97-114；及Cavalieri等人 (2003) Blood. 102(2): 497-505中。在一些實施例中，重組核酸經由電穿孔轉移至T細胞中(參見例如Chicaybam等人, (2013)PLoS ONE 8(3): e60298及Van Tedeloo等人, (2000)Gene Therapy 7(16): 1431-1437)。在一些實施例中，重組核酸經由轉位轉移至T細胞中(參見例如Manuri等人 (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437；Sharma等人 (2013)Molec Ther Nucl Acids 2, e74；及Huang等人 (2009)Methods Mol Biol 506: 115-126)。將遺傳物質引入且表現於免疫細胞中之其他方法包括磷酸鈣轉染(例如如Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.中所述)、原生質體融合、陽離子脂質體介導轉染；鎢顆粒促進微粒轟擊(Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990))；及磷酸鍶DNA共沈澱(Brash等人, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987))。用於轉移編碼重組產物之核酸的其他方法及載體為例如國際專利申請公開案第WO2014055668號及美國專利第7,446,190號中所述之彼等。在一些實施例中，細胞，例如T細胞可在例如藉由T細胞受體(TCR)或嵌合抗原受體(CAR)擴增期間或之後經轉染。用於引入所需受體之基因之此轉染可例如藉由任何適合之反轉錄病毒載體進行。遺傳修飾細胞群體可隨後自初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)釋放且隨後藉由第二類型之刺激物刺激，例如經由重新引入之受體)。此第二類型之刺激物可包括呈肽/MHC分子形式之抗原刺激物、以遺傳方式引入之受體之同源(交聯)配位體(例如CAR之天然配位體)或在新受體之框架內直接結合(例如藉由識別受體內之恆定區)之任何配位體(諸如抗體)。參見例如Cheadle等人, 「Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy」 Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66或Barrett等人, Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine 第65卷: 333-347 (2014)。用於引入的其他核酸(例如基因)包括改良治療功效(諸如促進所轉移細胞之存活力及/或功能)的核酸；為選擇及/或評價細胞(諸如評估活體內存活或定位)提供遺傳標記物的基因；改善安全的基因，例如藉由使得細胞容易接受活體內負向選擇，如Lupton S. D.等人,Mol . and Cell Biol ., 11:6 (1991)；及Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)所述；亦參見Lupton等人之公開案PCT/US91/08442及PCT/US94/05601，其描述經由顯性正向選擇性標記物與負向選擇性標記物融合所得之雙功能選擇性融合基因的用途。參見例如Riddell等人之美國專利第6,040,177號的第14-17欄。在一些情況下，可使用不需要細胞，例如T細胞經活化之載體。在一些此類情況下，細胞可在活化之前經選擇及/或經轉導。因此，細胞可在如本文所述地培養細胞之前或之後，且在一些情況下與培養的至少一部分同時或在其期間經工程改造。在一些實施例中，待工程改造之細胞為經培養細胞，或在一些情況下，細胞可在進行如本文所述之培養之前經轉導。 C. 轉導細胞之方法 在一些實施例中，將病毒載體轉移至細胞中之方法係使用所提供之寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)試劑中之任一者進行。在一些實施例中，根據所提供之轉導方法使用之寡聚蛋白質試劑為多聚化試劑。在一些實施例中，細胞用於細胞療法，諸如製備用於自體或同種異體移植，例如用於授受細胞療法之原代細胞。在一些實施例中，試劑亦可用於方法中以促進與製備工程改造細胞組合物相關之一或多個其他處理步驟，諸如選擇或調節、活化及/或刺激細胞中之一或多者。方法可包括額外細胞處理步驟，諸如細胞洗滌、分離(isolation)、分離(separation)、調配或與生產細胞組合物相關之其他步驟。在一些實施例中，提供之方法用於將病毒載體粒子，諸如反轉錄病毒載體粒子引入至細胞，諸如免疫細胞，包括T細胞中。在一些實施例中，病毒載體粒子具有基因組，該基因組含有編碼抗原受體，諸如嵌合抗原受體(CAR)或轉殖基因T細胞受體(TCR)之核酸。因此，在一些實施例中，提供之方法可用於在諸如T細胞之免疫細胞中表現基因工程改造抗原受體，諸如轉殖基因TCR或CAR。亦提供藉由此類粒子及方法轉導之細胞及含有此類細胞之組合物，及其使用方法。在一些實施例中，反轉錄病毒載體粒子及方法包括導致合意地用於授受免疫療法的增加之免疫細胞及/或某些群體及/或其亞群之轉導之特徵。在提供之轉導方法及病毒載體粒子之一些實施例中，經轉導之群體中之細胞，例如T細胞在接觸或培育細胞與提供之反轉錄病毒載體粒子之前不或不必進行刺激及/或活化及/或不或不必與其結合進行刺激及/或活化。a. 培育細胞與病毒載體粒子 在一些實施例中，提供之方法涉及藉由接觸，例如培育包含複數個細胞之細胞組合物(在下文中亦稱作「輸入組合物」)與(1)寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)試劑，諸如多聚化試劑及(2)病毒粒子而轉導細胞之方法。在一些實施例中，該方法涉及同時或依序摻合細胞與試劑及病毒粒子。在一些實施例中，該方法涉及將病毒粒子與試劑預混合在一起且接著使細胞組合物與病毒粒子與試劑締合之混合物接觸。在一些實施例中，接觸持續30分鐘至72小時，諸如30分鐘至48小時、30分鐘至24小時或1小時至24小時，諸如至少或大約至少30分鐘、1小時、2小時、6小時、12小時、24小時、36小時或超過36小時。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，(i)培育包括以任一順序依序摻合靶細胞與試劑，及/或摻合靶細胞與病毒粒子，視需要其中(a)中之摻合及(b)中之摻合在不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、48小時、或72小時之時段內進行及/或(a)中之摻合與(b)中之摻合間隔不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、或48小時進行；(ii)培育包括摻合靶細胞、試劑及病毒粒子，該摻合同時或基本上同時進行；(iii)培育包括摻合含有靶細胞及病毒粒子且不包括試劑之組合物，視需要其中：包括靶細胞及試劑之組合物中不超過5%、10%、20%、30%、或40%之靶細胞為活化細胞，表現選自由HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L及4-1BB組成之群的表面標記物；包括選自由IL-2、IFNγ、TNF-α組成之群的細胞介素之細胞內表現，及/或能夠增殖；及/或該摻合係在於組合物中摻合靶細胞及病毒粒子之後不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、或48小時進行；(iv)培育包括摻合含有靶細胞及試劑且不包括病毒粒子之組合物與病毒粒子，視需要其中：包括靶細胞及試劑之組合物中不超過5%、10%、20%、30%、或40%之靶細胞為活化細胞，表現選自由HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L及4-1BB組成之群的表面標記物；包括選自由IL-2、IFNγ、TNF-α組成之群的細胞介素之細胞內表現，及/或能夠增殖；及/或該摻合係在於組合物中摻合靶細胞及病毒粒子之後不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、或48小時進行；及/或(v)培育包括摻合包括病毒粒子及試劑之組合物與含有靶細胞且不含病毒粒子及/或不含試劑之組合物，視需要其中：包括靶細胞及試劑之組合物中不超過5%、10%、20%、30%、或40%之靶細胞為活化細胞，表現選自由HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L及4-1BB組成之群的表面標記物；包括選自由IL-2、IFNγ、TNF-α組成之群的細胞介素之細胞內表現，及/或能夠增殖。 在一些實施例中，培育包括同時或以任一順序依序摻合細胞與試劑及病毒粒子。在一些實施例中，在培育之至少一部分期間，試劑及病毒粒子係在細胞存在下或同時與細胞接觸。 在一些實施例中，提供之方法涉及(a)使病毒粒子與寡聚蛋白質試劑接觸，藉此產生包括病毒粒子及試劑之組合物，其中病毒粒子視需要與試劑締合；及(b)培育(a)中之組合物與包括靶細胞之複數個細胞，其中該方法產生包括一或多個經病毒粒子轉導之細胞的輸出組合物。 在一些實施例中，提供之方法涉及摻合含有病毒粒子及寡聚蛋白質試劑之組合物與包括靶細胞之複數個細胞，其中該方法產生包括一或多個經病毒粒子轉導之細胞的輸出組合物。 在一些實施例中，提供之方法涉及(a)使病毒粒子與包括抗生蛋白鏈菌素或突變蛋白或前述任一者之生物學活性片段，及/或前述任一者之多個亞單位之寡聚蛋白質試劑接觸，藉此產生包括病毒粒子及試劑之組合物，其中病毒粒子視需要與試劑締合；及(b)培育(a)中之組合物與複數個細胞，其中該方法產生包括一或多個經病毒粒子轉導之細胞的輸出組合物。 在一些實施例中，提供之方法涉及摻合含有病毒粒子及蛋白質試劑之組合物與包括靶細胞之複數個細胞，其中：蛋白質試劑包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、抗生蛋白鏈菌素類似物或突變蛋白、抗生物素蛋白類似物、突變蛋白或前述任一者之生物學活性片段及/或前述任一者之多個亞單位；且該方法產生包括一或多個經病毒粒子轉導之細胞的輸出組合物。在一些實施例中，試劑及/或單體單元中之每一者及/或多聚單元中之每一者具有淨正電荷或總正電荷。 在一些實施例中，提供之方法涉及培育包括靶細胞之複數個細胞與：1)包括複數個能夠可逆地結合至結合劑之結合位點的寡聚蛋白質試劑，其中一或多個結合位點可逆地結合至結合劑；及2)病毒粒子，其中(1)中之培育的至少一部分與(2)同時進行，且其中該方法產生包括一或多個經病毒粒子轉導之細胞的輸出組合物。 在一些實施例中，提供之方法涉及(1)使(a)包括一或多個病毒粒子之組合物與(b)為病毒結合劑之結合劑接觸，該病毒結合劑(i)能夠特異性結合至病毒粒子表面上之分子，及ii)可逆地結合至包括複數個能夠可逆地結合至病毒結合劑之結合位點的試劑；及(2)在一或多個病毒粒子存在下培育至少複數個包括靶細胞之細胞，其中(1)中之接觸及(2)中之培育係同時或以任一順序依序進行，其中該方法產生包括複數個經病毒粒子轉導之細胞的輸出組合物。 在本文所提供之方法中之任一者之一些實施例中，(1)中之接觸及(2)中之培育係在不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、48小時、或72小時之時段內進行及/或(a)中之摻合係在與(b)中之培育間隔不超過1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時、12小時、18小時、24小時、36小時、或48小時進行。在一些實施例中，病毒載體粒子包含編碼重組抗原受體，視需要嵌合抗原受體之基因組。 在轉導步驟期間含有病毒載體粒子及細胞之組合物可另外包括一或多種額外試劑，諸如提高轉導效率之試劑，諸如聚陽離子，包括魚精蛋白(例如硫酸魚精蛋白)、海地美溴銨(hexadimethrine bromide) (POLYBRENE®，Abbott Laboratories Corp)及CH-296 (RETRONECTIN®，Clontech)。在一些實施例中，聚陽離子可以1 μg/mL至100 μg/mL，諸如5 μg/mL至50 μg/mL之最終濃度存在於輸入組合物中。該組合物亦可包括培養基，包括細胞培養基，包括經設計用於培養待處理細胞類型之培養基，諸如造血幹細胞培養基，例如無血清培養基。 在一些實施例中，輸入組合物之細胞濃度為或為約1.0×105 個細胞/毫升至1.0×108 個細胞/毫升，諸如至少或大約至少或大約1.0×105 個細胞/毫升、5×105 個細胞/毫升、1×106 個細胞/毫升、5×106 個細胞/毫升、1×107 個細胞/毫升、5×107 個細胞/毫升或1×108 個細胞/毫升。 在一些實施例中，病毒粒子係以一定比率之病毒載體粒子或其感染單位(IU)之複本/輸入組合物中之細胞總數或待轉導細胞之總數(IU/個細胞)提供。舉例而言，在一些實施例中，病毒粒子在接觸期間以在或約或至少在或約0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、或60 IU之病毒載體粒子/細胞中之一者存在。 在一些實施例中，病毒載體粒子之效價為或約為1×106 IU/mL至1×108 IU/mL，諸如為或約為5×106 IU/mL至5×107 IU/mL，諸如至少6×106 IU/mL、7×106 IU/mL、8×106 IU/mL、9×106 IU/mL、1×107 IU/mL、2×107 IU/mL、3×107 IU/mL、4×107 IU/mL或5×107 IU/mL。 在一些實施例中，轉導可以小於100，諸如一般小於60、50、40、30、20、10、5或更小之感染倍率(MOI)達成。 在一些實施例中，接觸係在溶液中進行，諸如使用可溶寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)試劑或多聚化試劑。在一些實施例中，細胞、寡聚試劑及病毒粒子以或以大約0.5 mL至500mL，諸如以或以大約0.5 mL至200 mL、0.5 mL至100 mL、0.5 mL至50 mL、0.5 mL至10 mL、0.5 mL至5 mL、5 mL至500 mL、5 mL至200 mL、5 mL至100 mL、5 mL至50 mL、5 mL至10 mL、10 mL至500 mL、10 mL至200 mL、10 mL至100 mL、10 mL至50 mL、50 mL至500 mL、50 mL至200 mL、50 mL至100 mL、100 mL至500 mL、100 mL至200 mL或200 mL至500 mL之體積接觸。 在一些實施例中，當在溶液中，例如使用可溶寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)試劑進行接觸時，接觸可在接觸之至少一部分係藉由離心，諸如旋轉接種(spinoculation)(例如離心接種)之情況下進行。在一些實施例中，含有細胞、病毒粒子及試劑之組合物可經旋轉，一般在相對較低力或速度，諸如低於用於將細胞製成丸粒之速度，諸如自或自大約600 rpm至1700 rpm下(例如在或在大約或至少600 rpm、1000 rpm、或1500 rpm或1700 rpm下)。在一些實施例中，旋轉係在自或自大約100 g至3200 g之力，例如相對離心力下(例如在或在大約或至少在或在大約100 g、200 g、300 g、400 g、500 g、1000 g、1500 g、2000 g、2500 g、3000 g或3200 g下)進行，如例如在腔室或空腔之內壁或外壁處所量測。術語「相對離心力」或RCF一般理解為在空間中相較於旋轉軸之具體點，相對於地球重力賦予物體或物質(諸如細胞、樣品或集結粒及/或旋轉之腔室或其他容器中之點)的有效力。該值可使用熟知公式，考慮重力、旋轉速度及旋轉半徑(旋轉軸與量測RCF之物體、物質或粒子的距離)來確定。 在一些實施例中，寡聚試劑，諸如多聚化試劑不結合至擔體，諸如不結合至固體表面或固定相。 在一些實施例中，寡聚試劑，諸如多聚化試劑固定於擔體，諸如固體表面或固定相上。在一些實施例中，接觸係在固定相中進行，諸如使用層析基質，在其上固定有蛋白質(抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)，諸如寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)試劑。與提供之方法結合使用之例示性此類型式描述於本文中。因此，在一些實施例中，可根據提供之方法進行管柱上轉導。 在一些實施例中，與細胞接觸之輸入組合物包含活化細胞。在一些實施例中，輸入組合物中之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%之細胞，例如T細胞經活化，諸如在一些情況下針對HLA-DR、CD25、CD69、CD71、CD40L及/或4-1BB中之一或多者為表面陽性的。在一些實施例中，細胞藉由活化試劑活化，諸如在抗CD3/抗CD28存在下，在接觸起始之前，例如在轉導起始之前。在不存在外源生長因子或較低量之外源生長因子之情況下活體外擴增T細胞群體之方法為此項技術中已知的(參見例如美國專利6,352,694 B1及歐洲專利EP 0 700 430 B1)。一般而言，此類方法採用大於1 µM之固相表面，各種結合劑(例如抗CD3抗體及/或抗CD28抗體)固定至該固相表面。舉例而言，Dynabeads® CD3/CD28 (Invitrogen)為用於T細胞擴增之市售試劑，其為均一、4.5 µm超順磁、無菌、非致熱聚苯乙烯珠粒，塗佈有針對人類T細胞上之CD3及CD28細胞表面分子之親和性純化單株抗體之混合物。在一些實施例中，活化試劑，例如抗CD3及/或抗CD28可固定於珠粒，諸如磁性珠粒上。 在一些實施例中，細胞活化亦在IL-2(例如自或自大約50 IU/mL至200 IU/mL，諸如或大約100 IU/mL)存在下進行。在一些實施例中，持續或持續大約1小時至96小時、1小時至72小時、1小時至48小時、4小時至36小時、8小時至30小時或12小時至24小時之間，諸如至少或大約至少6小時、12小時、18小時、24小時、36小時或72小時進行活化。在一些實施例中，在大於或大於約25℃，諸如一般大於或大於約32℃、35℃或37℃，例如在或在約37℃±2℃之溫度下，諸如在或在約37℃之溫度下進行活化。 在一些實施例中，細胞不藉由活化試劑活化，諸如在抗CD3/抗CD28存在下，在接觸起始之前，例如在轉導起始之前。在一些實施例中，與細胞接觸之輸入組合物包含複數個靜息細胞。在一些實施例中，群體中至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、或超過90%之T細胞為靜息T細胞，諸如不具有T細胞活化標記物，諸如表面標記物或細胞內細胞介素或其他標記物之T細胞，及/或處於細胞週期之G0 或G0 G1a 階段之T細胞。 在特定態樣中，提供之方法允許在不需要在與寡聚蛋白質試劑，諸如多聚化試劑接觸及/或培育之前進行活化的情況下在T細胞中發生轉導。在一些實施例中，方法包括在不首先，亦即在轉導之前活化及/或刺激T細胞的情況下，根據提供之方法在寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素)試劑存在下藉由病毒載體轉導含有靜息或未處理T細胞之T細胞群體。在一些此類實施例中，提供之方法可用於製備免疫細胞，諸如T細胞用於授受療法，該等方法不包括活化及/或刺激T細胞之步驟。 在一些實施例中，寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)為裸蛋白。 在一些實施例中，寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)為一或多種結合劑結合至其之多聚化試劑，該一或多種結合劑能夠結合至靶細胞(例如T細胞)之表面上，或在一些情況下，組合物中之病毒粒子之表面上的分子。在一些實施例中，結合劑可逆地結合至含有複數個能夠可逆地結合至試劑之結合位點的試劑。在一些實施例中，培育係在試劑結合，諸如特異性結合至細胞或病毒粒子上之分子的條件下進行。在如所描述之一些實施例中，一或多種試劑(例如第一或第二或第三等)可逆地固定於寡聚試劑上(結合至寡聚試劑)，該一或多種試劑可包括受體結合劑(例如刺激劑或輔助劑)、選擇劑或病毒結合劑，其可用於細胞之選擇、刺激、擴增及/或分化或細胞之轉導調節。 在一些情況下，對於某些受體結合劑(例如刺激劑或輔助劑)，此類結合可誘導或調節組合物中之靶細胞(例如T細胞)中之信號，諸如如所描述之原始信號或輔助信號。在一些實施例中，試劑結合至分子導致組合物中之靶細胞之刺激、活化、擴增(增殖)及/或分化中之一或多者。在一些實施例中，試劑包含向細胞提供原始活化信號之刺激劑，其中刺激劑包含至少一種結合搭配物C (例如C1、C2或C3等)，其中結合搭配物C能夠可逆地結合至寡聚試劑之結合位點Z1以可逆地結合試劑。在一些實施例中，試劑包含向細胞提供輔助信號之輔助劑，其中輔助劑包含至少一種結合搭配物C (例如C1、C2或C3等)，其中結合搭配物C能夠可逆地結合至寡聚試劑之結合位點Z1以可逆地結合試劑。在一些實施例中，試劑包含特異性靶向結合至特定細胞表面分子或標記物之選擇劑，其中選擇劑包含至少一種結合搭配物C (例如C1、C2或C3等)，其中結合搭配物C能夠可逆地結合至寡聚試劑之結合位點Z1以可逆地結合試劑。 在一些實施例中，輸入組合物中之細胞的活化係在輸入組合物之細胞與寡聚蛋白質試劑及/或病毒粒子接觸期間引發。在此類情況下，寡聚蛋白質試劑可在其上固定有能夠誘導或調節細胞，諸如T細胞中之信號的受體結合劑，例如刺激劑及/或輔助劑。在一些實施例中，刺激劑包含MHCI：肽複合物或其功能部分、MHCII：肽複合物或其功能部分，及/或能夠經由T細胞中之TCR/CD3複合物、T細胞中之含CD3之複合物及/或T細胞中之含ITAM之分子遞送刺激信號。在一些實施例中，寡聚試劑可在其上固定有能夠向細胞，諸如T細胞提供輔助信號之輔助劑。在一些實施例中，受體結合劑，例如刺激劑及/或輔助劑為如本文所述之任何試劑，諸如抗CD3及/或抗CD28抗體(例如Fab)。或者，亦有可能將觸發細胞擴增之受體之配位體，諸如天然配位體用作刺激劑。舉例而言，CD19之細胞外域可用於引起經轉導以表現嵌合CD19結合抗原受體(CAR)之細胞之細胞內信號傳導級聯的激活。在一些實施例中，寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素)試劑能夠在接觸及視情況存在之另外的培育期間調節細胞轉導以及活化，諸如刺激細胞。在一些實施例中，包含刺激劑之寡聚試劑之結合為可逆的，諸如在例如生物素之競爭劑存在下。 在一些實施例中，提供之方法可用於選擇性地誘導特定細胞群體(諸如B細胞、T細胞或自然殺手細胞)之轉導及/或離體擴增。在一些實施例中，寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)試劑為可包括至少一種選擇劑之多聚化試劑，該至少一種選擇劑可逆地結合至用於調節轉導之相同試劑。在一些實施例中，寡聚(例如抗生蛋白鏈菌素突變蛋白)試劑為可在相同試劑上含有選擇劑及第一或第二受體結合劑(例如刺激劑或輔助劑)中之一者或兩者的多聚化試劑。在一些實施例中，寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素)試劑，諸如多聚化試劑能夠調節細胞轉導且將轉導優先靶向至所選或靶向細胞之特定亞群。在一些實施例中，寡聚蛋白質(例如抗生蛋白鏈菌素)試劑，諸如多聚化試劑能夠在接觸及視情況存在之另外的培育期間調節細胞轉導，諸如將轉導優先靶向至所選或靶向細胞之特定亞群，及活化，諸如刺激細胞。 在一些實施例中，包含結合劑，例如選擇劑及/或刺激劑之寡聚試劑之結合為可逆的，諸如在競爭劑(例如生物素)存在下。如下所述，在一些態樣中，方法包括添加或培育含有細胞、病毒粒子及寡聚試劑(例如結合至一或多種結合劑之多聚化試劑)之組合物與競爭物質以逆轉、解離或破壞一或多種結合劑與細胞或病毒粒子之結合。在一些實施例中，在逆轉、解離或破壞之後，可移除組合物之一或多種組分，諸如解離之寡聚試劑、一或多種結合劑及/或競爭物質。 在一些實施例中，產生自所提供方法之細胞(在下文中亦稱作「輸出組合物」或「培育組合物」)包括經病毒載體，諸如含有編碼異源蛋白質之核苷酸的病毒載體，諸如重組受體，例如CAR轉導之彼等。在此背景下，異源係指通常不表現自病毒及/或不由病毒基因組編碼之蛋白質。在一些實施例中，病毒載體整合至宿主基因組中可藉由量測在培育後由病毒載體粒子之基因組中所含之核酸編碼之重組蛋白質(諸如異源蛋白質)的表現量來評定。可使用用於評估重組分子之表現量的多種熟知方法，諸如藉由基於親和性之方法，例如基於免疫親和性之方法，例如在細胞表面蛋白質的情況下，諸如藉由流動式細胞測量術進行偵測。在一些實例中，表現藉由偵測轉導標記物及/或報導子構築體來量測。在一些實施例中，編碼截短表面蛋白質之核酸包括在載體內且用作其表現及/或增強之標記。 V. 組合物、調配物及投與方法 亦提供含有工程改造受體(例如工程改造抗原受體)，諸如CAR或TCR之組合物，及含有工程改造細胞之組合物，包括醫藥組合物及調配物。亦提供使用方法及組合物之用途，諸如用於治療抗原經表現之疾病、病況及病症，或用於偵測、診斷及預後方法。 A. 組合物/調配物 術語「醫藥調配物」係指呈准許其中所含活性成分之生物活性有效之形式的製劑，且其不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分。「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分之外對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。在一些態樣中，載劑之選擇在某種程度上由具體細胞及/或投與方法決定。因此，存在多種適合調配物。舉例而言，醫藥組合物可含有防腐劑。適合之防腐劑可包括例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及苯紮氯銨(benzalkonium chloride)。在一些態樣中，使用兩種或兩種以上防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物通常以總組合物之約0.0001重量%至約2重量%的量存在。載劑例如由Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編 (1980)描述。醫藥學上可接受之載劑一般在採用之劑量及濃度下對受體無毒，且包括(但不限於)：緩衝液，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；包括抗壞血酸及甲硫胺酸之抗氧化劑；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六羥季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；酚醇、丁醇或苯甲醇；對羥苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。在一些態樣中，組合物中包括緩衝劑。適合的緩衝劑包括例如檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、磷酸鉀以及各種其他酸及鹽。在一些態樣中，使用兩種或兩種以上緩衝劑之混合物。緩衝劑或其混合物典型地以總組合物重量之約0.001%至約4%的量存在。製備可投與之醫藥組合物的方法為已知的。例示性方法更詳細地描述於例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 第21版 (2005年5月1日)中。調配物或組合物亦可含有超過一種適用於用細胞治療之具體適應症、疾病或病況之活性成分，較佳為具有與細胞互補之活性的活性成分，其中各自活性並未彼此不利地影響。此類活性成分宜以有效達成預期目的之量的組合存在。因此，在一些實施例中，醫藥組合物進一步包括其他醫藥活性劑或藥物，諸如化學治療劑，例如天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、道諾黴素、小紅莓、氟尿嘧啶、吉西他濱(gemcitabine)、羥基脲、甲胺喋呤、太平洋紫杉醇、利妥昔單抗(rituximab)、長春鹼、長春新鹼等。在一些實施例中，細胞或抗體係以鹽，例如醫藥學上可接受之鹽形式投與。適合的醫藥學上可接受之酸加成鹽包括衍生自無機酸及有機酸的鹽，無機酸，諸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸及硫酸，有機酸，諸如酒石酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、反丁烯二酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、丁二酸及芳基磺酸，例如對甲苯磺酸。活性成分可截留於微膠囊、膠態藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或巨乳液中。在某些實施例中，醫藥組合物調配為包合錯合物，諸如環糊精包合錯合物；或調配為脂質體。脂質體可用於使宿主細胞(例如T細胞或NK細胞)靶向特定組織。多種方法可供用於製備脂質體，諸如以下文獻中所描述之彼等方法：例如Szoka等人, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467 (1980)，及美國專利4,235,871、4,501,728、4,837,028及5,019,369。在一些態樣中，醫藥組合物可採用定時釋放型、延遲釋放型及持續釋放型遞送系統，使得組合物之遞送在所治療之位點敏感化之前發生且其時間足以引起所治療之部位的敏感化。多種類型之釋放遞送系統為可供使用且已知的。此類系統可避免重複投與組合物，從而提高個體及醫師的便利性。在一些實施例中，醫藥組合物含有有效治療或預防疾病或病況之量，諸如治療有效或預防有效量之細胞。在一些實施例中，治療或預防功效藉由定期評定所治療之個體來監測。對於經數天或更長時間之重複投與，視病況而定，重複治療直至出現疾病症狀之所需抑止為止。然而，其他給藥方案可為適用的且可加以確定。所期望之劑量可藉由單次快速投與組成物、藉由多次快速投與組成物或藉由連續輸注投與組成物來遞送。可使用標準投與技術、調配物及/或裝置投與細胞。提供調配物及用於儲存及投與組合物之裝置，諸如注射器及小瓶。細胞之投與可為自體或異源的。舉例而言，免疫反應性細胞或祖細胞可自一位個體獲得且向同一個體或不同的相容個體投與。來源於周邊血液之免疫反應性細胞或其後代(例如活體內、離體或活體外來源)可經由局域化注射投與，包括導管投與、全身性注射、局域化注射、靜脈內注射或非經腸投與。當投與治療組合物(例如含有經基因修飾之免疫反應性細胞的醫藥組合物)時，其通常調配成單位劑量可注射形式(溶液、懸浮液、乳液)。調配物包括用於經口、靜脈內、腹膜內、皮下、經肺、經皮、肌肉內、鼻內、經頰、舌下或栓劑投與之彼等調配物。在一些實施例中，細胞群體係非經腸投與。如本文所用，術語「非經腸」包括靜脈內、肌肉內、皮下、經直腸、經陰道及腹膜內投與。在一些實施例中，細胞群體係利用周邊全身性遞送、藉由靜脈內、腹膜內或皮下注射來向個體投與。在一些實施例中，組合物提供為無菌液體製劑，例如等滲水溶液、懸浮液、乳液、分散液或黏滯組合物，其可在一些態樣中緩衝至所選pH。液體製劑的製備通常比凝膠、其他黏稠組合物及固體組合物更容易。另外，投與液體組合物在某種程度上更方便，尤其藉由注射投與。另一方面，黏稠組合物可在適當黏度範圍內調配以使得與特定組織接觸的時段更長。液體或黏稠組合物可包含載劑，載劑可為含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其適合混合物的溶劑或分散介質。無菌可注射溶液可藉由將細胞併入溶劑中，諸如使細胞與適合之載劑、稀釋劑或賦形劑(諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或其類似物)混合來製備。組合物亦可經凍乾。視投與途徑及所需製劑而定，組合物可含有輔助物質，諸如濕潤劑、分散劑或乳化劑(例如甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝或黏度增強添加劑、防腐劑、調味劑、顏料及其類似物。在一些態樣中，可查詢標準文本以製備適合製劑。可添加增強組合物之穩定性及無菌性的各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩衝劑。可藉由各種抗細菌劑及抗真菌劑(例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及其類似物)來確保防止微生物之作用。可注射醫藥形式之延長吸收可藉由使用延遲吸收劑(諸如單硬脂酸鋁及明膠)來實現。可製備延釋製劑。持續釋放型製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形製品形式，例如膜或微膠囊。用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。B. 投與之方法 提供投與細胞、群體及組合物之方法，及此類細胞、群體及組合物用於治療或預防疾病、病況及病症，包括癌症之用途。在一些實施例中，向患有待治療之特定疾病或病況之患者投與細胞、群體及組合物，例如經由授受細胞療法(諸如授受T細胞療法)投與。在一些實施例中，藉由提供之方法製備之細胞及組合物，諸如培育及/或其他處理步驟之後的工程改造組合物及生產結束組合物係向個體，諸如患有疾病或病況或處於患有疾病或病況之風險下的個體投與。在一些態樣中，方法藉以治療，例如改善疾病或病況之一或多種症狀，諸如藉由減輕癌症中之腫瘤負荷，該癌症表現藉由工程改造T細胞識別之抗原。投與用於授受細胞療法之細胞的方法已知且可聯合所提供之方法及組合物使用。舉例而言，授受T細胞療法方法描述於例如Gruenberg等人之美國專利申請公開案第2003/0170238號；Rosenberg之美國專利第4,690,915號；Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)中。參見例如Themeli等人 (2013)Nat Biotechnol . 31(10): 928-933；Tsukahara等人 (2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9；Davila等人 (2013)PLoS ONE 8(4): e61338中。如本文所用，「個體」為哺乳動物，諸如人類或其他動物，且通常為人類。在一些實施例中，投與細胞、細胞群體、或組合物之個體，例如患者為哺乳動物，通常為靈長類動物，諸如人類。在一些實施例中，靈長類動物為猴或猿。個體可為雄性或雌性且可為任何適齡(包括嬰兒、幼年、青年、成年及老年)個體。在一些實施例中，個體為非靈長類哺乳動物，諸如嚙齒動物。如本文所用，「治療(treatment)」(及其文法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指疾病或病況或病症、或症狀、不良作用或後果、或與其相關聯之表型完全或部分改善或減輕。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發，緩解症狀，減輕疾病之任何直接或間接病理性結果，預防癌轉移，減緩疾病進展速率，改善或緩和疾病病況及緩解或改良預後。該術語不表示疾病之完全治癒或任何症狀之完全排除或對所有症狀或結果均有作用。如本文所用，「延遲疾病發展」意謂延緩、阻礙、減緩、阻滯、穩定及/或延遲疾病(諸如癌症)之發展。此延遲可具有不同時間長度，視所治療之疾病及/或個體之病史而定。如熟習此項技術者顯而易見，足夠或顯著延遲可實際上涵蓋預防，從而使個體不出現疾病。舉例而言，可延遲晚期癌症，諸如癌轉移發展。如本文所用，「預防」包括在個體疾病出現或復發方面提供預防作用，該個體可能易患該疾病但尚未診斷患有該疾病。在一些實施例中，所提供之細胞及組合物用於延緩疾病發展或減緩疾病進展。如本文所用，「抑止」功能或活性為當與除相關條件或參數以外在其他方面相同之條件相比或者與另一條件相比時，減小功能或活性。舉例而言，抑制腫瘤生長之細胞與在不存在該等細胞之情況下的腫瘤生長速率相比，減小腫瘤生長速率。在投藥之情況下，試劑，例如醫藥調配物、細胞或組合物之「有效量」係指在劑量/量下且持續獲得期望結果，諸如治療或預防結果所需之時段有效的量。試劑，例如醫藥調配物或細胞之「治療有效量」係指在劑量下且持續獲得所需治療結果，諸如治療疾病、病況或病症，及/或治療之藥物動力學或藥效動力學效應所需之時段有效的量。治療有效量可根據諸如以下因素來變化：疾病病況、個體之年齡、性別及體重，及所投與之細胞群體。在一些實施例中，提供之方法包含投與有效量(例如治療有效量)的細胞及/或組合物。「預防有效量」係指以必要的劑量及時間段有效達成所需預防結果之量。由於個體在患病之前或在疾病早期使用預防劑量，因此預防有效量將通常(但不一定)小於治療有效量。 治療之疾病或病況可為其中抗原之表現與疾病、病況或病症之病源學，例如病因相關及/或涉及於其中，加重或以其他方式涉及此類疾病、病況或病症之任何疾病或病況。例示性疾病和病況可包括與細胞之惡性腫瘤或轉化(例如癌症)、自體免疫或發炎疾病或感染性疾病相關，例如由細菌、病毒或其他病原體引起之疾病或病況。上文描述例示性抗原，其包括與可治療之各種疾病及病況相關之抗原。在特定實施例中，嵌合抗原受體或轉殖基因TCR特異性結合至與疾病或病況相關之抗原。 因此，所提供之方法及用途包括用於授受細胞療法之方法及用途。在一些實施例中，方法包括向個體、組織或細胞(諸如處於疾病、病況或病症之風險中或懷疑患有疾病、病況或病症)投與細胞或含有細胞的組合物。在一些實施例中，向患有待治療之特定疾病或病況之個體投與細胞、群體及組合物，例如經由授受細胞療法，諸如授受T細胞療法。在一些實施例中，向個體，諸如患有或處於患有疾病或病況之風險下之個體投與細胞或組合物，改善疾病或病況之一或多種症狀。 在一些實施例中，通過自體移植進行細胞療法，例如授受T細胞療法，其中細胞分離及/或另外製備自待接受細胞療法之個體，或來源於此類個體之樣品。因此，在一些態樣中，細胞來源於需要治療之個體，例如患者，且該等細胞在分離及處理後投與至相同個體。在一些實施例中，細胞療法，例如授受T細胞療法係藉由同種異體移植進行，其中細胞分離及/或另外製備自除待接受或最終接受細胞療法之個體，例如第一個體以外的個體。在此類實施例中，隨後向相同物種之不同個體(例如第二個體)投與該等細胞。在一些實施例中，第一及第二個體在基因上相同。在一些實施例中，第一及第二個體在基因上類似。在一些實施例中，第二個體表現的HLA種類或超類型與第一個體相同。細胞可藉由任何適合方法投與。給藥及投藥可部分地視投藥是否為短暫或長期而定。各種給藥時程包括(但不限於)單次投藥或在各時間點多次投藥、推注投藥及脈動輸注。 在某些實施例中，細胞或細胞亞型之個別群體係以約一百萬至約1000億細胞之範圍及/或每公斤體重之細胞量向個體投與，諸如1百萬至約500億細胞(例如約5百萬細胞、約2.5千萬細胞、約5億細胞、約10億細胞、約50億細胞、約200億細胞、約300億細胞、約400億細胞，或藉由任何兩個前述值限定的範圍)，諸如約1千萬至約1000億細胞(例如約2千萬細胞、約3千萬細胞、約4千萬細胞、約6千萬細胞、約7千萬細胞、約8千萬細胞、約9千萬細胞、約100億細胞、約250億細胞、約500億細胞、約750億細胞、約900億細胞，或藉由任何兩個前述值限定的範圍)，且在一些情況下，為約1億細胞至約500億細胞(例如約1.2億細胞、約2.5億細胞、約3.5億細胞、約4.5億細胞、約6.5億細胞、約8億細胞、約9億細胞、約30億細胞、約300億細胞、約450億細胞)或此等範圍之間及/或以每公斤體重計的任何值。此外，劑量可視疾病或病症特有之性質及/或患者及/或其他療法而變化。在一些實施例中，細胞作為組合治療之一部分投與，諸如與另一治療性干預(諸如抗體或經工程改造之細胞或受體或試劑，諸如細胞毒性劑或治療劑)同時或按任何次序依次投與。在一些實施例中，細胞與一或多種額外治療劑一起共投與或與另一治療性干預結合同時或按任何次序依次投與。在一些情形中，細胞與另一療法在足夠接近的時間上共投與，使得細胞群體增強一或多種其他治療劑之作用，或反之亦然。在一些實施例中，細胞在一或多種額外治療劑之前投與。在一些實施例中，細胞在一或多種額外治療劑之後投與。在一些實施例中，一或多種額外試劑包括細胞介素(諸如IL-2)以例如增強持久性。在一些實施例中，方法包含投與化學治療劑。在投與細胞後，在一些實施例中量測工程改造細胞群體之生物活性，例如藉由多種已知方法中之任一者。評估之參數包括工程改造或天然T細胞或其他免疫細胞與抗原在活體內之特異性結合，例如藉由成像，或離體，例如藉由ELISA或流動式細胞測量術。在某些實施例中，工程改造細胞破壞靶細胞的能力可使用此項技術中已知的任何適合方法量測，諸如以下文獻中所述之細胞毒性分析：例如Kochenderfer等人, J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)，及Herman等人, J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)。在某些實施例中，細胞之生物活性係藉由分析一或多種細胞介素，諸如CD 107a、IFNγ、IL-2及TNF之表現及/或分泌來量測。在一些態樣中，藉由評定臨床結果(諸如腫瘤負荷之減小)來量測生物活性。在某些實施例中，經工程改造之細胞係以多種方式進一步修飾，從而增加其治療或預防功效。舉例而言，群體所表現之經工程改造之CAR或TCR可與靶向部分直接結合或經由連接子間接結合。使化合物(例如CAR或TCR)結合至靶向部分之實踐為此項技術中已知的。參見例如Wadwa等人, J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995)及美國專利5,087,616。 VI. 定義 如本文所用，除非上下文以另外方式除非本文另外明確規定，否則如本文所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括複數個指示物。舉例而言，「一(a/an)」意謂「至少一個/種」或「一或多個/種」。應瞭解，本文所述之態樣及變化形式包括「組成」及/或「主要組成」態樣及變化形式。 在通篇本發明中，所主張之標的物的各種態樣均以範圍形式呈現。應瞭解，範圍形式之描述僅為了方便及簡潔起見，且不應解釋為對所主張之主題之不靈活限制。因此，範圍之描述應視為已特定揭示所有可能之子範圍以及該範圍內之個別數值。舉例而言，在提供值範圍的情況下，應理解，該範圍之上限與下限之間的各中間值及該陳述範圍內的任何其他陳述值或中間值均涵蓋於所主張的標的物內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內且亦涵蓋於所主張之主題內，在所陳述範圍內受到任何特定排他性限制。在所述範圍包括一個或兩個限值的情況下，排除彼等包括性限值中之任一者或兩者之範圍亦包括於所主張的標的物中。不管範圍之寬度如何，此均適用。 如本文所用，術語「約」係指此技術領域之技術人員易於知曉之相應值的常見誤差範圍。本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。舉例而言，涉及「約X」之描述包括「X」之描述。在特定實施例中，「約」為±25%、±20%、±15%、±10%、±5%、±1%、±0.5%、±0.1%、±0.01%、或±0.001%。 如本文所用，組合物係指兩種或兩種以上產物、物質或化合物(包括細胞)之任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、膏劑、水溶液、非水溶液或其任何組合。 如本文所用，當參考一或多種特定細胞類型或細胞群體時，「富集」係指增加細胞類型或群體之數目或百分比，例如相較於組合物中之細胞之總數目或組合物體積，或相對於其他細胞類型，諸如藉由基於經群體或細胞表現之標記物之陽性選擇，或藉由基於不存在於待耗盡之細胞群體或細胞上之標記物之陰性選擇。該術語不需要自組合物完全移除其他細胞、細胞類型或群體且不需要細胞富集至以或甚至接近100%存在於富集組合物中。 如本文所用，細胞或細胞群體對具體標記呈「陽性」之表述係指細胞表面或細胞內可偵測的存在具體標記(通常表面標記)。當提及表面標記時，該術語係指如藉由流動式細胞測量術所偵測存在表面表現，例如藉由用特異性結合至標記之抗體染色且偵測該抗體，其中該染色可藉由流動式細胞測量術偵測，其水準實質上高於使用同型匹配對照物在其他方面相同的條件下執行相同程序所偵測之染色，及/或水準實質上類似於已知對標記呈陽性之細胞，及/或水準實質上高於已知對標記呈陰性之細胞。 如本文所用，細胞或細胞群體對特定標記物呈「陰性」的表述係指特定標記物(典型地為表面標記物)沒有實質性可偵測地存在於細胞表面或細胞內。提及表面標記物時，術語係指缺乏表面表現，如藉由流式細胞術所偵測，例如用專一性結合至標記物的抗體染色且偵測該抗體，其中該染色在實質上高於使用同型匹配對照物、在原本相同條件下執行相同程序所偵測之染色的水準下，及/或在實質上低於已知對標記物呈陽性之細胞的水準下，及/或在實質上類似於已知對標記物呈陰性之細胞的水準下不可藉由流式細胞術偵測到。 如本文所用之術語「表現」係指基於核酸分子，諸如基因之編碼序列產生多肽之方法。方法可包括轉錄、轉錄後控制、轉錄後修飾、轉譯、轉譯後控制、轉譯後修飾，或其任何組合。 如本文所用，個體包括任何活有機體，諸如人類及其他哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)人類及非人類動物，包括農畜、競賽動物、嚙齒動物及寵物。 如本文所用，對照係指與測試樣品大體上相同之樣品，除了其不藉由測試參數處理，或若其為血漿樣品，則其可獲自不受所關注之病況影響之正常志願者。對照亦可為內部對照。 VII. 例示性實施例 在所提供之實施例中包括： 1. 一種包含複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑之尺寸包含i)大於25 nm之半徑，ii)至少5×106 g/mol之分子量；及/或(iii)每一寡聚粒子試劑至少100個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 2. 如實施例1之寡聚粒子試劑，其中抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子結合至或能夠結合至生物素、抗生物素蛋白、生物素類似物或突變蛋白、抗生物素蛋白類似物或突變蛋白及/或其生物學活性片段，或抗生蛋白鏈菌素結合肽。 3. 如實施例2之寡聚粒子試劑，其中抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子可逆地結合至或能夠可逆地結合至生物素、抗生物素蛋白、生物素類似物或突變蛋白、抗生物素蛋白類似物或突變蛋白及/或其生物學活性片段，或抗生蛋白鏈菌素結合肽。 4. 如實施例1至3中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，其中該抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在參看SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列中之抗生蛋白鏈菌素之位置，對應於位置44至47之序列位置處包含胺基酸序列Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 。 5. 如實施例1至4中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含複數個包含以下各者之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子： a)SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者中所闡述之胺基酸序列； b)與SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性且含有對應於Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 之胺基酸序列及/或可逆地結合至生物素或其生物學活性形式、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽之胺基酸序列；或 c)可逆地結合至生物素或其生物學活性形式、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽之a)或b)之功能片段。 6. 如實施例1至5中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，該等分子包含SEQ ID NO: 6或61中所闡述之胺基酸序列。 7. 如實施例4至6中任一項之寡聚粒子試劑，其中該抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在參看SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列中之抗生蛋白鏈菌素之位置，對應於117、120及/或121之位置處進一步包含一或多個胺基酸置換。 8. 如實施例7之寡聚粒子試劑，其中： 該一或多個胺基酸置換係選自Glu117、Asp117、Arg117、Ser120、Ala120、Gly120、Trp121、Tyr121或Phe121；或 該一或多個胺基酸置換係選自Glu117、Gly120或Tyr121中之一或多者；或 該等胺基酸置換係選自Glu117、Gly120或Tyr121。 9. 如實施例1至8中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含複數個包含以下各者之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子： a) SEQ ID NO: 27或28中所闡述之胺基酸序列； b)與SEQ ID NO: 28展現至少85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性且含有對應於Va144 、Thr45 、Ala46 、Arg47 、Glu117 、Gly120 及Tyr121 之胺基酸序列及/或可逆地結合至生物素或生物學活性片段、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽；或 c)可逆地結合至生物素或生物學活性片段、生物素類似物或突變蛋白或其生物學活性片段或抗生蛋白鏈菌素結合肽之a)或b)之功能片段。 10. 如實施例1至9中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑結合至或能夠結合至一或多種試劑。 11. 如實施例10之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑包含結合搭配物，其中結合搭配物能夠結合(視情況可逆地結合)至寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點。 12. 如實施例11之寡聚粒子試劑，其中結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽。 13. 如實施例11或12之寡聚粒子試劑，其中該結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。 14. 如實施例10至13中任一項之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑結合或能夠結合至表現於靶細胞表面上之分子。 15. 如實施例10至14中任一項之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑為或包含抗體或其抗原結合片段。 16. 如實施例15之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑為或包含單價抗體片段。 17. 如實施例15或實施例16之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑為或包含Fab。 18. 如實施例10至17中任一項之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體的受體結合劑。 19. 如實施例10至18中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子之刺激劑，其中結合誘導或調節靶細胞中之信號。 20. 如實施例18或實施例19之寡聚粒子試劑，其中靶細胞為免疫細胞。 21. 如實施例18至20中任一項之寡聚粒子試劑，其中靶細胞為T細胞。 22. 如實施例18至21中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。 23. 如實施例22之寡聚粒子試劑，其中刺激劑為第一受體結合劑且寡聚粒子試劑包含第二受體結合劑，其中第二受體結合劑能夠特異性結合至靶細胞表面上之第二分子，該結合至第二分子視情況能夠誘導或調節靶細胞中之信號。 24. 如實施例23之寡聚粒子試劑，其中第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 25. 如實施例22或實施例23之寡聚粒子試劑，其中該第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子且該共刺激分子為CD28。 26. 如實施例10至25中任一項之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑為抗CD3抗體及抗CD28抗體，視情況為抗CD3 Fab及抗CD28 Fab。 27. 如實施例18至21中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 28. 如實施例18至21、23或24中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)結合至共刺激或輔助分子且共刺激或輔助分子係選自CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。 29. 如實施例18至21、23或24中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至細胞介素受體且細胞介素受體係選自IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2。 30. 如實施例18至21、23或24中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至趨化因子受體且趨化因子受體係選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4。 31. 如實施例18至21、23、或24中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為誘導細胞介素或趨化因子產生之因子且該因子為特異性結合至細胞介素或趨化因子受體之配位體。 32. 如實施例31之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至細胞介素受體之配位體，其中 配位體特異性結合IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2；及/或 配位體係選自IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17及TNF，或為其生物學活性片段。 33. 如實施例30之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至趨化因子受體之配位體，其中 配位體特異性結合至選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4之趨化因子受體；或 配位體係選自CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21及CCL25或為其生物學活性片段。 34. 如實施例18至21、23或24中任一項之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為黏附分子且黏附分子係選自CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)及CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)或為其生物學活性片段。 35. 如實施例10至34中任一項之寡聚粒子試劑，其中一或多種試劑包含選擇劑，其中選擇劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。 36. 如實施例35之寡聚粒子試劑，其中靶細胞為免疫細胞。 37. 如實施例35或實施例36之寡聚粒子試劑，其中靶細胞為淋巴細胞或抗原呈遞細胞。 38. 如實施例35至37中任一項之寡聚粒子試劑，其中靶細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。 39. 如實施例35至38中任一項之寡聚粒子試劑，其中靶細胞為T細胞。 40. 如實施例35至39中任一項之寡聚粒子試劑，其中選擇標記物為CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。 41. 如實施例1至40中任一項之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑包含大於25 nm、大於50 nm、大於60 nm、大於70 nm、大於80 nm或大於90 nm之半徑。 42. 如實施例1至41中任一項之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑包含25 nm與150 nm之間、50 nm與150 nm之間、75 nm與125 nm之間、80 nm與115 nm之間或90 nm與110 nm之間(含上下限值)或90 nm±15 nm或95 nm±20-25 nm之半徑。 43. 如實施例1至42中任一項之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑具有小於150 nm之半徑。 44. 如實施例41至43中任一項之寡聚粒子試劑，其中半徑為流體動力半徑。 45. 如實施例1至44中任一項之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑包含至少1×107 g/mol、至少5×107 g/mol或至少1×108 g/mol之分子量。 46. 如實施例1至45中任一項之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑包含1×106 g/mol與1×1010 g/mol之間、1×107 g/mol與1×109 g/mol之間、5×107 g/mol與5×108 g/mol之間、1×108 g/mol與5×108 g/mol之間或1×108 g/mol與2×108 g/mol之間的分子量。 47. 如實施例1至46中任一項之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑包含至少100個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少500個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少1,000個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少1,500個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體或至少2,000個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 48. 如實施例1至47中任一項之寡聚粒子試劑，其中寡聚粒子試劑包含100與50,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、1,000與20,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、1,000與10,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體或2,000與5,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。 49. 如實施例1至48中任一項之寡聚粒子試劑，其中複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白包含離胺酸殘基，其中小於20%、10%、5%、1%之離胺酸殘基包含N經取代之亞胺基硫雜環戊烷。 50. 一種組合物，其包含一或多種如實施例1至49中任一項之寡聚粒子試劑。 51. 如實施例50之組合物，其中該一或多種寡聚粒子試劑為複數種寡聚粒子試劑。 52. 如實施例51之組合物，其中複數種寡聚粒子試劑包含i)大於70 nm之平均半徑；ii)至少1×108 g/mol之平均分子量；及/或iii)每一寡聚粒子試劑至少2,000之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚物之平均數量；及/或iv)其中至少95%之複數種寡聚粒子試劑包含10 nm至150 nm之間的半徑之半徑尺寸分佈。 53. 如實施例51或52之組合物，其中複數種寡聚粒子試劑包含大於25 nm、大於50 nm、大於60 nm、大於70 nm、大於80 nm、大於90 nm或大於100 nm之平均半徑。 54. 如實施例51至53中任一項之組合物，其中： 複數種寡聚粒子試劑包含25 nm與150 nm之間、50 nm與150 nm之間、75 nm與125 nm之間、80 nm與110 nm之間或90 nm與110 nm之間(含上下限值)的平均半徑；或 複數種寡聚粒子試劑包含90 nm ±15 nm、95 nm±20-25nm或97±10 nm之平均半徑。 55. 如實施例51至54中任一項之組合物，其中至少95%之複數種寡聚粒子試劑包含50 nm與150 nm之間、70 nm與140 nm之間、80 nm與120 nm之間、80 nm與115 nm之間、80 nm與100 nm之間、90 nm與110 nm之間及/或100 nm與120 nm之間的半徑。 56. 如實施例51至55中任一項之組合物，其中至少95%之寡聚粒子試劑包含複數種寡聚粒子試劑之平均及/或中值半徑之±50%、±25%、±20%、±15%、±10%及/或±5%之間的半徑。 57. 如實施例51至56中任一項之組合物，其中複數種寡聚粒子試劑包含80 nm與115 nm之間的平均半徑且其中至少95%之寡聚粒子試劑包含平均半徑之±25%之間的半徑。 58. 如實施例51至57中任一項之組合物，其中複數個粒子包含1×108 g/mol與5×108 g/mol之間、或1×108 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)的平均分子量。 59. 如實施例51至58中任一項之組合物，其中複數種寡聚粒子試劑包含每一寡聚粒子試劑至少100、至少500、至少1,000、至少1,500或至少2,000之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚體之平均數量。 60. 如實施例51至59中任一項之組合物，其中複數種寡聚粒子試劑包含每一寡聚粒子試劑在100與50,000之間、1,000與20,000之間、1,000與10,000之間或2,000與5,000之間(各含上下限值)的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚體之平均數量。 61. 如實施例51之60中任一項之組合物，其中當在大約或低於-80℃、大約或低於-20℃、及/或大約或低於4℃下儲存至少1、3、9、27或46週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過25%或10%。 62. 如實施例51至61中任一項之組合物，其中當在大約或低於4℃下儲存至少一週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過10%。 63. 如實施例61至62中任一項之組合物，其中當在大約或低於4℃下儲存至少3週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過10%。 64. 如請求項51至63中任一項之組合物，其中當在大約或低於4℃下儲存至少9週時，複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過10%。 65. 一種用於產生包含抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之寡聚粒子試劑之方法，該方法包含： 培育複數個包含能夠與硫醇官能基反應之硫醇反應性官能基的活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個包含一或多個硫醇官能基之硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，藉此產生寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白粒子； 從單體及/或較小寡聚分子中分離寡聚粒子；以及 使寡聚粒子與穩定劑接觸，藉此產生寡聚粒子試劑。 66. 如實施例65之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與能夠將一或多個胺轉化為硫醇反應性官能基之活化試劑一起培育而產生。 67. 如實施例65或實施例66之方法，其中複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與添加或能夠添加硫醇官能基至一或多個離胺酸殘基之硫醇化試劑一起培育而產生。 68. 一種用於產生寡聚粒子試劑之方法，該方法包含： (a)在將一或多個胺轉化為能夠與硫醇官能基反應之硫醇反應性基團之條件下將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育，藉此產生複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子； (b)將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與添加或能夠添加硫醇官能基至一或多個離胺酸殘基之硫醇化試劑一起培育，藉此產生複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子；以及 (c)將複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子一起培育，藉此產生包含寡聚粒子試劑之粒子組合物； 其中該方法係在如下條件下進行：其中在起始(c)中之培育時，複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子使得至少60%之離胺酸平均包含一個硫醇官能基，及/或每一硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體平均至少10個離胺酸包含一個硫醇官能基。 69. 如實施例68之方法，其進一步包含分離寡聚粒子試劑與單體及/或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子。 70. 如實施例65至69中任一項之方法，其中培育第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑係在1:1與1:10之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與活化試劑之莫耳比下進行。 71. 如實施例66至70中任一項之方法，其中培育第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑係在1:2±2%之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與活化試劑之莫耳比下進行。 72. 如實施例66至71中任一項之方法，其中活化試劑包含雜雙官能基交聯劑。 73. 如實施例66至72中任一項之方法，其中該活化試劑包含4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基SMCC)及/或6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)。 74. 如實施例65至73中任一項之方法，其中硫醇反應性官能基為鹵乙醯基、順丁烯二醯亞胺基、氮丙啶基、丙烯醯基、芳化劑、乙烯基碸基、吡啶基二硫化物、TNB-硫醇或二硫化物還原劑。 75. 如實施例65至74中任一項之方法，其中硫醇反應性官能基為順丁烯二醯亞胺基。 76. 如實施例65至75中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在中性pH下培育。 77. 如實施例65至76中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在6.8與7.5之間的pH下培育。 78. 如實施例65至77中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在7.0與7.4之間，視情況為或大約7.2的pH下培育。 79. 如實施例65至78中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在4℃與39℃之間的溫度下培育。 80. 如實施例65至79中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間，視情況在約23℃或約24℃下培育。 81. 如實施例65至80中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係培育15分鐘至6小時或30分鐘至2小時之間(各含上下限值)。 82. 如實施例65至81中任一項之方法，其中第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化試劑係培育45分鐘至1.5小時之間(含上下限值)，視情況培育1小時或約1小時。 83. 如實施例66至82中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑之培育係在硫醇化試劑與每一抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之各一級胺為10:1與1:1之間(含上下限值)之莫耳比下進行。 84. 如實施例66至83中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑之培育係在1:50與1:500之間(含上下限值)的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與硫醇化試劑之莫耳比下進行。 85. 如實施例66至84中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑之培育係在1:100或大約1:100的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與活化試劑之莫耳比下進行。 86. 如實施例66至85中任一項之方法，其中硫醇化試劑為或包含2-亞胺基硫雜環戊烷。 87. 如實施例66至86中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在7.0或大於7.0，視情況7.0與8.0之間(含上下限值)的pH下培育。 88. 如實施例66至87中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在約7.7之pH下培育。 89. 如實施例66至88中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑之培育係在pH為8.0或大於8.0，視情況在8.0與9.0之間(含上下限值)的緩衝液存在下起始。 90. 如實施例66至89中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑之培育係在pH為8.5或約8.5之緩衝液存在下起始。 91. 如實施例89或90之方法，其中緩衝液包含硼酸鹽。 92. 如實施例89至91中任一項之方法，其中緩衝液包含10 mM至200 mM硼酸鹽或50 mM至100 mM硼酸鹽(各含上下限值)，視情況約100 mM硼酸鹽。 93. 如實施例65至92中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在4℃與39℃之間的溫度下培育。 94. 如實施例65至93中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間，視情況在23℃或約23℃下或在24℃或約24℃下培育。 95. 如實施例66至94中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係培育15分鐘至2小時或15分鐘至1.5小時之間。 96. 如實施例66至95中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係培育15分鐘至2小時或25分鐘至1小時之間(各含上下限值)。 97. 如實施例66至96中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子及硫醇化試劑係培育1小時或約1小時。 98. 如實施例66至97中任一項之方法，其中第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化試劑係培育25分鐘或約25分鐘。 99. 如實施例65至98中任一項之方法，其中培育期間的複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在1:X之莫耳比下，其中X為每一抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子可用於硫醇化之離胺酸殘基的數目。 100. 如實施例65至99中任一項之方法，其中該莫耳比為1:1至1:8或1:2至1:6，視情況為或為大約1:4。 101. 如實施例65至100中任一項之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在6.8與7.5之間(含上下限值)的pH下培育。 102. 如實施例65至101中任一項之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在7.0與7.4之間(含上下限值)的pH下培育。 103. 如實施例65至102中任一項之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在7.2或約7.2之pH下培育。 104. 如實施例65至103中任一項之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在4℃與39℃之間(含上下限值)的溫度下培育。 105. 如實施例65至104中任一項之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間(含上下限值)，視情況在23℃或約23℃下或在24℃或約24℃下培育。 106. 如實施例65至105中任一項之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子係培育15分鐘至6小時或30分鐘至2小時之間(各含上下限值)。 107. 如實施例65至106中任一項之方法，其中複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子係培育45分鐘至1.5小時之間(含上下限值)，視情況培育1小時或約1小時。 108. 如實施例65至107中任一項之方法，其中培育活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由使分子與N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)接觸而結束。 109. 如實施例68至108中任一項之方法，其中將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育的至少一部分與將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑一起培育的至少一部分係同時分開地進行。 110. 如實施例109之方法，其中將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育及將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與硫醇化試劑一起培育係持續基本上相同的時間量進行及/或在基本上相同的時間完成。 111. 如實施例68至110中任一項之方法，其中在培育硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之前，該方法包含： (i)自包含活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除活化試劑；及/或 (ii)自包含硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除硫醇化試劑。 112. 如實施例68至111中任一項之方法，其中培育複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在將第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子與硫醇化試劑一起培育結束之後及/或在自包含硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除硫醇化試劑之後15分鐘內起始。 113. 一種用於產生寡聚粒子試劑之方法，其包含： 將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)在7.2或約7.2之pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生複數個包含順丁烯二醯亞胺硫醇反應性官能基之活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子； 將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與2-亞胺基硫雜環戊烷在7.5與8.5之間(含上下限值)的pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生複數個包含一或多個硫醇官能基之硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子；及 將複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子在7.2或約7.2之pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生包含寡聚粒子試劑之粒子組合物； 其中將複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子與複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子一起培育係在將第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子與2-亞胺基硫雜環戊烷一起培育結束之後10分鐘內起始。 114. 如實施例68至113中任一項之方法，其中該方法進一步包含使寡聚粒子試劑與穩定劑接觸。 115. 如實施例65至67或114中任一項之方法，其中穩定劑降低存在於寡聚粒子試劑之離胺酸殘基上之N經取代之亞胺基硫雜環戊烷的量。 116. 如實施例65至67或114至115中任一項之方法，其中穩定劑降低存在於寡聚粒子試劑之離胺酸殘基上之N經取代之亞胺基硫雜環戊烷的量至少25%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%。 117. 如實施例65至67及114至116中任一項之方法，其中穩定劑包含羥胺。 118. 如實施例65至67及114至117中任一項之方法，其中穩定劑係藉由層析，視情況藉由尺寸排阻層析(SEC)自寡聚粒子試劑移除。 119. 如實施例65至118中任一項之方法，其中寡聚粒子試劑之半徑小於150 nm。 120. 如實施例65至119中任一項之方法，其進一步包含對寡聚粒子試劑進行過濾滅菌。 121. 如實施例65至67及69至120中任一項之方法，其中寡聚粒子試劑係藉由尺寸排阻層析與單體或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子分離。 122. 如實施例113之方法，其中尺寸排阻極限大於或大於約100 kDa、500 kDa、750 kDa、1000 kDa或2000 kDa。 123. 如實施例121或實施例122之方法，其中尺寸排阻極限為或為約500 kDa至1000 kDa。 124. 如實施例121至123中任一項之方法，其中尺寸排阻極限為或為約75 kDa。 125. 如實施例65至67及69至124中任一項之方法，其包含收集一或多個包含空隙體積之部分，藉此將寡聚粒子試劑與單體或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子分離。 126. 如實施例65至125中任一項之方法，其進一步包含將寡聚粒子試劑儲存於大約或低於4℃、大約或低於-20℃或大約或低於-80℃之溫度下。 127. 如實施例65至126中任一項之方法，其進一步包含在將一或多種試劑可逆地結合至寡聚粒子試劑之條件下混合寡聚粒子試劑與一或多種試劑。 128. 一種寡聚粒子試劑，其由如實施例65至127中任一項之方法產生。 129. 一種將一或多種試劑多聚化為寡聚粒子試劑之方法，該方法包含在將一或多種試劑可逆地結合至寡聚粒子試劑之條件下將如請求項1至49中任一項之寡聚粒子試劑、如請求項50至64中任一項之包含寡聚粒子試劑之組合物，或藉由如實施例65至128中任一項之方法產生之寡聚粒子試劑與一或多種試劑混合。 130. 如實施例127或實施例129之方法，其中一或多種試劑包含結合搭配物，其中結合搭配物能夠結合至寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點。 131. 如實施例130之方法，其中結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽。 132. 如實施例130或實施例131之方法，其中該結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。 133. 如實施例130至132中任一項之方法，其中一或多種試劑結合或能夠結合至表現於靶細胞表面上之分子。 134. 如實施例130至133中任一項之方法，其中一或多種試劑包含抗體或其抗原結合片段。 135. 如實施例134之方法，其中一或多種試劑為或包含單價抗體片段。 136. 如實施例134或實施例135之方法，其中一或多種試劑為或包含Fab。 137. 如實施例130至136中任一項之方法，其中一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體的受體結合劑。 138. 如實施例137之方法，其中受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子的刺激劑，其中結合誘導或調節靶細胞中之信號。 139. 如實施例137或實施例138之方法，其中靶細胞為免疫細胞。 140. 如實施例137至139中任一項之方法，其中靶細胞為T細胞。 141. 如實施例137至140中任一項之方法，其中受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。 142. 如實施例141之方法，其中刺激劑為第一受體結合劑且該方法進一步包含將第二受體結合劑可逆地結合至寡聚粒子試劑，其中第二受體結合劑能夠特異性結合至靶細胞表面上之第二分子，該結合至第二分子視情況能夠誘導或調節靶細胞中之信號。 143. 如實施例142之方法，其中第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 144. 如實施例142或實施例143之方法，其中第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子且共刺激分子為CD28。 145. 如實施例127及129至144中任一項之方法，其中一或多種試劑為抗CD3抗體及抗CD28抗體，視情況為抗CD3 Fab及抗CD28 Fab。 146. 如實施例137或實施例138之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 147. 如實施例137、138、143或144中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)結合至共刺激或輔助分子且共刺激或輔助分子係選自CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。 148. 如實施例137、138、143或144中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至細胞介素受體且細胞介素受體係選自IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2。 149. 如實施例137、138、143或144中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至趨化因子受體且趨化因子受體係選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4。 150. 如實施例137、138、143或144中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為誘導細胞介素或趨化因子產生之因子且該因子為特異性結合至細胞介素或趨化因子受體之配位體。 151. 如實施例150之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至細胞介素受體之配位體，其中 配位體特異性結合IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2；及/或 配位體係選自IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17及TNF，或為其生物學活性片段。 152. 如實施例151之寡聚粒子試劑，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至趨化因子受體之配位體，其中配位體特異性結合至選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1 CXCR3及CXCR4之趨化因子受體；或 配位體係選自CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21及CCL25或為其生物學活性片段。 153. 如實施例137、138、143或144中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為黏附分子且黏附分子係選自CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)及CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)或為其生物學活性片段。 154. 如實施例127至153中任一項之方法，其中一或多種試劑包含選擇劑，其中選擇劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。 155. 如實施例154之方法，其中靶細胞為免疫細胞。 157. 如實施例154或實施例155之方法，其中靶細胞為淋巴細胞或抗原呈遞細胞。 158. 如實施例154至156中任一項之方法，其中靶細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。 159. 如實施例154至158中任一項之方法，其中靶細胞為T細胞。 160. 如實施例154至159中任一項之方法，其中選擇標記物為CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。 161. 一種組合物，其包含藉由實施例65至160中任一項之方法產生之寡聚粒子試劑。 162. 一種組合物，其包含複數種藉由實施例65至161中任一項之方法產生之寡聚粒子試劑。 163. 一種製品，其包含如實施例1至49中任一項之寡聚粒子試劑或如實施例50至64或161至162中任一項之組合物。 164. 一種用於調節細胞之方法，該方法包含在如實施例1至49中任一項之寡聚粒子試劑存在下或在如實施例50至64或161至163中任一項之組合物存在下培育包含靶細胞之細胞組合物，藉此調節靶細胞。 165. 如實施例164之方法，其中調節靶細胞包含活化、富集及/或擴增靶細胞。 166. 一種用於培養細胞之方法，該方法包含在如實施例1至49中任一項之寡聚粒子試劑存在下或在如實施例50至64或161至163中任一項之組合物存在下培育包含靶細胞之細胞組合物。 167. 如實施例164至166中任一項之方法，其中寡聚粒子試劑可逆地結合至一或多種試劑。 168. 如實施例167之方法，其中一或多種試劑包含結合搭配物，其中結合搭配物能夠結合至寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點，藉此將一或多種試劑可逆地結合至寡聚粒子試劑。 169. 如實施例168之方法，其中結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽。 170. 如實施例168或169之方法，其中結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。 171. 如實施例167至170中任一項之方法，其中一或多種試劑結合或能夠結合至表現於靶細胞表面上之分子。 172. 如實施例167至171中任一項之方法，其中一或多種試劑包含抗體，視情況為Fab。 173. 如實施例167至172中任一項之方法，其中一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體的受體結合劑。 174. 如實施例173之方法，其中受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子，藉此誘導或調節靶細胞中之信號的刺激劑。 175. 如實施例173或實施例174之方法，其中受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。 176. 如實施例175之方法，其中刺激劑為第一受體結合劑且該方法進一步包含將第二受體結合劑可逆地結合至寡聚粒子試劑，其中第二受體結合劑能夠特異性結合至靶細胞表面上之第二分子，該結合至第二分子視情況能夠誘導或調節靶細胞中之信號。 177. 如實施例176之方法，其中第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 178. 如實施例176或177之方法，其中受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 179. 如實施例174、175、177或178中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)結合至共刺激或輔助分子且共刺激或輔助分子係選自CD28、CD90 (Thy-1)、CD95 (Apo-/Fas)、CD137 (4-1BB)、CD154 (CD40L)、ICOS、LAT、CD27、OX40或HVEM。 180. 如實施例174、175、177或178中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至細胞介素受體且細胞介素受體係選自IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2。 181. 如實施例174、175、177或178中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)特異性結合至趨化因子受體且趨化因子受體係選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4。 182. 如實施例174、175、177或178中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為誘導細胞介素或趨化因子產生之因子且該因子為特異性結合至細胞介素或趨化因子受體之配位體。 183. 如實施例182之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至細胞介素受體之配位體，其中 配位體特異性結合IL-2R、IL-1R、IL-15R、IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、I型IFNR、IL-12R、IL-15R、IL-17R、TNFR1及TNFR2；及/或 配位體係選自IL-2、IL-1、IL-15、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17及TNF，或為其生物學活性片段。 184. 如實施例183之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為特異性結合至趨化因子受體之配位體，其中 配位體特異性結合至選自CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、CCR9、CXCR1、CXCR3及CXCR4之趨化因子受體；或 配位體係選自CXCL9、CXCL10、CCL19、CCL21及CCL25或為其生物學活性片段。 185. 如實施例174、175、177或178中任一項之方法，其中受體結合劑(第二受體結合劑)為黏附分子且黏附分子係選自CD44、CD31、CD18/CD11a (LFA-1)、CD29、CD54 (ICAM-1)、CD62L (L-選擇素)及CD29/CD49d (VLA-4)、CD106 (VCAM-1)或為其生物學活性片段。 186. 如實施例164至185中任一項之方法，其中一或多種試劑包含選擇劑，其中選擇劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。 187. 如實施例186之方法，其中靶細胞為免疫細胞。 188. 如實施例186或實施例187之方法，其中靶細胞為淋巴細胞或抗原呈遞細胞。 189. 如實施例186至188中任一項之方法，其中靶細胞為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞或樹突狀細胞。 190. 如實施例186至189中任一項之方法，其中靶細胞為T細胞。 191. 如實施例186至190中任一項之方法，其中選擇標記物為CD25、CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA及/或CD45RO。 192. 如實施例186至191中任一項之方法，其中靶細胞包含血細胞、白血球、淋巴細胞、B細胞、B細胞群體、T細胞、T細胞群體、NK細胞、樹突狀細胞及/或巨噬細胞。 193. 如實施例186至192中任一項之方法，其中靶細胞表現重組受體。 194. 如實施例186至193中任一項之方法，其中靶細胞表現重組T細胞受體及/或嵌合抗原受體(CAR)。 195. 如實施例186至194中任一項之方法，其中靶細胞表現結合至與疾病及/或癌症相關之抗原的CAR。 196. 如實施例195之方法，其中抗原為αvβ6整合素(avb6整合素)、B細胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9 (CA9，亦稱為asCAIX或G250)、一種癌症-睾丸抗原-癌症/睾丸抗原1B (CTAG，亦稱為NY-ESO-1及LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、一種細胞週期蛋白-細胞週期蛋白A2、C-C基序趨化因子配位體1 (CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生長因子蛋白(EGFR)、截短表皮生長因子蛋白(tEGFR)、III型表皮成長因子受體突變體(EGFR vIII)、上皮醣蛋白2 (EPG-2)、上皮醣蛋白40 (EPG-40)、ephrinB2、腎上腺素受體A2(EPHa2)、雌激素受體、Fc受體樣5 (FCRL5；亦稱為Fc受體同系物5或FCRH5)、胎兒乙醯膽鹼受體(胎兒AchR)、葉酸結合蛋白(FBP)、葉酸受體α、胎兒乙醯膽鹼受體、神經節苷脂GD2、O-乙醯化GD2 (OGD2)、神經節苷脂GD3、醣蛋白100 (gp100)、Her2/neu (受體酪胺酸激酶erbB2)、Her3 (erb-B3)、Her4 (erb-B4)、erbB二聚體、人類高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)、B型肝炎表面抗原、人類白血球抗原A1 (HLA-AI)、人類白血球抗原A2 (HLA-A2)、IL-22受體α (IL-22Ra)、IL-13受體α2 (IL-13Ra2)、激酶插入域受體(kdr)、κ輕鏈、L1細胞黏附分子(L1CAM)、L1-CAM之CE7抗原決定基、含有8個家族成員A之富含白胺酸之重複序列(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相關抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、間皮素、c-Met、鼠類巨細胞病毒(CMV)、黏蛋白1 (MUC1)、MUC16、自然殺手第2組成員D (NKG2D)配位體、melan A (MART-1)、神經細胞黏附分子(NCAM)、癌胚抗原、黑色素瘤之優先表現抗原(PRAME)、孕酮受體、前列腺特異性抗原-前列腺幹細胞抗原(PSCA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)、存活素、滋胚層醣蛋白(TPBG，亦稱為5T4)、腫瘤相關醣蛋白72 (TAG72)、血管內皮生長因子受體(VEGFR)、血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)、威爾姆氏腫瘤1 (WT-1)或病原體特異性抗原。 197. 如實施例186至196中任一項之方法，其進一步包含破壞一或多種試劑與寡聚粒子試劑之間的可逆結合。 198. 如實施例197之方法，其中該破壞包含向靶細胞中引入包含能夠逆轉一或多種試劑與寡聚粒子試劑之間的結合之物質之組合物。 199. 如實施例198之方法，其中該物質為自由結合搭配物及/或為競爭劑。 200. 如實施例197至199中任一項之方法，其中該破壞終止或減少藉由一或多種試劑於靶細胞，視情況T細胞中誘導或調節之信號。 201. 如實施例197至200中任一項之方法，其中該物質包含抗生蛋白鏈菌素結合肽、生物素或生物學活性片段，視情況為D-生物素或生物素類似物或生物學活性片段。 202. 如實施例201之方法，其中該物質為選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。 203. 如實施例197至202中任一項之方法，其中該破壞係在該培育起始之後5天內進行。 204. 如實施例164至203中任一項之方法，其中一或多種受體結合劑為包含抗體或其抗原結合片段。 205. 如實施例204之方法，其中一或多種受體結合劑為或包含單價抗體片段。 206. 如實施例204或實施例205之方法，其中一或多種試劑為或包含Fab。 207. 如實施例164至206中任一項之方法，其中靶細胞為免疫細胞。 208. 如實施例164至207中任一項之方法，其中靶細胞為T細胞。 209. 如實施例176至208中任一項之方法，其中受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子之刺激劑，其中結合誘導或調節靶細胞中之信號。 210. 如請求項176至209中任一項之方法，其中受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。 211. 如請求項209或請求項210之方法，其中刺激劑為第一受體結合劑且寡聚粒子試劑包含第二受體結合劑，其中第二受體結合劑能夠特異性結合至靶細胞表面上之第二分子，其中結合至第二分子視情況能夠誘導或調節靶細胞中之信號。 212. 如請求項211之方法，其中第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。 213. 如請求項211或請求項212之方法，其中第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子且共刺激分子為CD28。 214. 如請求項176至213中任一項之方法，其中一或多種試劑為抗CD3抗體及抗CD28抗體，視情況為抗CD3 Fab及抗CD28 Fab。 VIII. 實例 包括以下實例僅為達成說明之目的，且不意欲限制本發明之範疇。 實例1：用於製備包含抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之寡聚試劑之方法。 寡聚試劑係藉由聚合稱為STREP-TACTIN® M2之例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白(含有SEQ ID NO: 61中所闡述之突變蛋白胺基酸序列之抗生蛋白鏈菌素均四聚體，參見例如美國專利第6,103,493號以及Voss及Skerra (1997) Protein Eng., 1:975-982)製備。為了製備用於寡聚之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白，含有一或多個反應性硫醇基之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與順丁烯二醯亞胺活化之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白一起培育。為了製備硫醇化抗生蛋白鏈菌素突變蛋白，約100 mg之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體藉由與2-亞胺基硫雜環戊烷鹽酸鹽在1:100之莫耳比下在約8.5之pH下在24℃下持續1小時以2.6 mL總體積在100 mM硼酸鹽緩衝液中一起培育而硫醇化。關於引入順丁烯二醯亞胺之活化反應，約400 mg之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)在1:2之莫耳比下在約7.2之pH值下在24℃下持續1小時以約10.4 mL之總體積在磷酸鈉緩衝液中一起培育。硫醇化及順丁烯二醯亞胺活化反應經協調以在大約相同時間開始，且反應之持續時間經控制。 在反應之後，未與STREP-TACTIN® M2反應之2-亞胺基硫雜環戊烷鹽酸鹽及SMPH連同低分子量反應副產物(主要為NHS)係藉由用PD-10去鹽管柱(GE Healthcare)個別地進行樣品之凝膠過濾而自樣品移除。對於各2.5 mL體積之樣品，PD-10管柱(8.3 ml床體積)經平衡且負載有硫醇化突變蛋白抗生蛋白鏈菌素或順丁烯二醯亞胺突變蛋白抗生蛋白鏈菌素且藉由添加3.5 mL偶合緩衝液(100 mM NaH2 P4 ，150 mM NaCl，5 mM EDTA，pH 7.2)進行溶離。在4個管柱上進行順丁烯二醯亞胺突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之凝膠過濾以顧及＞10 mL體積且混合溶離液。小心地控制活化及硫醇化反應之時序以及活化及硫醇化反應結束與寡聚反應開始之間的時序。一般而言，使得自凝膠過濾開始，亦即活化及硫醇化反應結束至寡聚反應起始經過十分鐘或大致十分鐘。 關於寡聚，順丁烯二醯亞胺抗生蛋白鏈菌素突變蛋白及硫醇化抗生蛋白鏈菌素突變蛋白樣品接著組合為約17.5 mL之總體積且在pH 7.2下在24℃下在約600 rpm之攪拌條件下培育1小時。由於相較於2-亞胺基硫雜環戊烷鹽酸鹽多四倍之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與SMPH一起培育，因此在寡聚反應期間的硫醇化抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與順丁烯二醯亞胺抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之莫耳比為1:4。在反應之後，寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之剩餘的SH基團藉由在24℃下在攪拌(約600 rpm)下與N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)一起培育15 min，接著在4℃下再培育16-20小時而飽和。 在與NEM一起培育之後，含有寡聚Strep-Tactin突變蛋白之樣品經離心且經由0.45 µm膜(獲自Merck Millipore之Millex-HP 0.45 μm)過濾上清液。過濾之溶液接著負載至管柱(Sephacryl S-300 HR HiPrep 26/60，GE Healthcare)上以藉由AKTA Explorer層析系統(GE Healthcare)進行尺寸排阻層析(SEC)。在收集結束時毫吸收率單位(mAU)大於或等於1500 mAU之部分經混合。 含有寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之混合樣品藉由在室溫下持續15分鐘添加890 mM pH 6.35而用100 mM羥胺處理。為了在處理後移除羥胺，將樣品負載至經100 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、1 mM EDTA，pH 7.2平衡之PD10管柱(2.5 mL/管柱)上且用3.5 mL之相同緩衝液(100 mM NaH2PO4，140 mM NaCl，1 mM EDTA，pH 7.2)溶離。PD10溶離液經混合且用0.45 μm過濾器，接著用0.22 μm過濾器無菌過濾，且接著將樣品冷凍及儲存於-80℃下。在冷凍之前，量測寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之最終濃度且藉由動態光散射(DLS)測定寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之尺寸。 為了評估寡聚方法之一致性，使用上文所述之方法自五個不同批次之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白(SAM)製備10份寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑。評估寡聚物之平均尺寸、產率% (藉由在不基線校正的情況下於280 nm處量測吸收率而測定)及活性(生物素結合)且結果顯示於表E1中。結果指示所得寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之此等參數一致，其中平均半徑為97 nm±10 nm且生物素結合為40 nmol/mg±3 nmol/mg。表 E1 ： 比較來自不同批料之寡聚 STREP - TACTIN 。 如上文所述產生之三種寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之平均分子量(MW)係藉由以HPLC系統(AGILENT 1100及Wyatt ECLIPSE DUALTEC)進行之非對稱流場流分離(AF4)與UV偵測(與MALLS DAWN HELEOS(Wyatt)耦接之Agilent UV偵測器)來量測。藉由AF4之量測允許假設抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之平均分子量為52,500 g/mol (52.5 kDa)而計算各寡聚試劑中之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之平均數目(表E2)。表 E2 ：寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之尺寸及分子量 實例2：評估影響抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之寡聚的參數 評估描述於實例1中之方法之各種參數以評估程序之不同態樣對產生寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之影響。A . pH 水準 評估在不同pH下進行硫醇化反應對寡聚物尺寸及產物產率之影響。亞胺基硫雜環戊烷以鹽酸鹽形式購買，且將其於pH 8.5之100 mM硼酸鹽緩衝液中溶解至100 mg/mL之濃度，誘發pH下降±0.7單位至pH 7.8。當使用較低強度，亦即25 mM之硼酸鹽緩衝液時，添加亞胺基硫雜環戊烷鹽酸鹽至100 mg/mL之濃度誘發1.6單位之較大pH下降至pH 6.9。藉由在pH 7.5、pH 8.5及pH 9.5之25 mM硼酸鹽緩衝液中以1:100之莫耳比培育100 mg抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與2-亞胺基硫雜環戊烷鹽酸鹽而在不同pH下進行硫醇化反應。硫醇化抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與順丁烯二醯亞胺活化抗生蛋白鏈菌素突變蛋白組合且寡聚方法係基本上如實例1中所述地進行。如表E3中所示，降低用於硫醇化反應之硼酸鹽緩衝液之pH導致寡聚物尺寸及產率減小，而增加pH導致尺寸及產率增加。在pH 9.5條件下之實驗期間出現材料之無意損失，其導致產率降低。表E3中帶圓括號之值反映未出現損失之計算產率。 表E3：在不同pH下進行硫醇化之後的STREP-TACTIN寡聚物尺寸及產率 為了評估較強緩衝液(亦即100 mM硼酸鹽緩衝液相較於25 mM，伴以最終反應混合物中之pH增加)是否改變反應動力學，如實例1中所述地進行亞胺基硫雜環戊烷活化反應。藉由Ellman試劑在反應期間的多個時間點處測定淨硫醇官能基含量。100 mM硼酸鹽緩衝液中之反應速度描繪於圖1中，且觀測為相較於當在25 mM硼酸鹽緩衝液中進行反應時更快且引入更多SH基團。相較於在25 mM硼酸鹽緩衝液中進行反應時的50與150分鐘之間(其為當使用100 mM緩衝液而非25 mM緩衝液時發生反應之較高最終pH之結果)，亞胺基硫雜環戊烷活化反應在100 mM硼酸鹽緩衝液中早在反應起始之後25分鐘開始達成硫醇官能基之峰值濃度。 亦評估pH對寡聚方法之其他步驟之影響。藉由不同pH (pH 8.3及8.5)之反應緩衝液(25 mM硼酸鹽)，且藉由不同pH (pH 7.0及7.2)之偶合緩衝液(100 mM磷酸鹽)進行寡聚反應。相較於在較低pH (7.0而非7.3)下進行活化或偶合反應，在較低pH (8.3而非8.5)下進行硫醇化反應對寡聚物尺寸具有更大影響。然而，相較於在pH 7.2下進行反應，在pH 7.0下進行活化反應或偶合反應減小寡聚物尺寸。B . 時序及 pH 對 硫醇化反應之影響 對亞胺基硫雜環戊烷活化(硫醇化)抗生蛋白鏈菌素突變蛋白進行分析以確定硫醇官能基之衰減是否歸因於二硫鍵形成(其無法與順丁烯二醯亞胺反應)或朝向N經取代之亞胺基硫雜環戊烷之異構化。 在一個實驗中，藉由在與亞胺基硫雜環戊烷之硫醇化反應之後在412 nm處量測吸收率而用Ellman試劑在不同時間點處偵測淨硫醇官能基含量。反應係藉由起始pH為8.3或8.5之25 mM硼酸鹽緩衝液進行，儘管反應期間的實際pH略微低於7。如圖2中所示，硫醇官能基含量在50與150分鐘之間達到最大值(使用pH 8.5較早且pH 8.3較晚)且高度為pH依賴性的(相較於使用pH 8.3，使用pH 8.5更高)。在兩種pH下之反應期間的抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之硫醇官能基含量均在3小時之後收斂，表明在3小時之後，使用較高pH 8.5產生之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白包括更多N經取代之亞胺基硫雜環戊烷。額外實驗指示SH官能基減少不受添加還原劑參(2-羧乙基)膦(TCEP)影響，若二硫鍵形成為SH官能基減少之原因，則其已逆轉。 另外，抗生蛋白鏈菌素突變蛋白係藉由使用pH 8.3及8.5之25 mM硼酸鹽緩衝液與亞胺基硫雜環戊烷一起培育10分鐘、50分鐘或390分鐘而硫醇化，且反應產物係經由尺寸排阻層析(SEC)，使用0.4 mL/min流動速率之100 mM NaH2PO4、140 mM NaCl、1 mM EDTA，pH 7.0及使用Agilent Bio SEC-3 3 µm 300Å管柱進行分析。為測定尺寸，採用分子量標準(在圖3中藉由158,000 Da、44,000 Da、17,000 da或1,350 Da處之峰指示)。對SEC之分析顯示於圖3中，其中非活化抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體係藉由虛線顯示。觀測到非活化突變蛋白四聚體具有最低滯留時間，而硫醇化樣品遷移愈慢(與較小分子量一致)，其與亞胺基硫雜環戊烷反應愈久。與亞胺基硫雜環戊烷反應之樣品之觀測峰基本上尺寸一致且未在較低滯留時間下觀測到峰。因此，根據分析，可推斷未在與亞胺基硫雜環戊烷之長期反應期間產生二聚體或高階寡聚物，在二硫鍵形成之情況下應如此。 為了評估時序對SH含量衰減之影響，評估在25 mM硼酸鹽緩衝液中之不同pH (pH 8.3、8.5或8.7)下，在抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之1 h或3 h亞胺基硫雜環戊烷活化結束時之淨硫醇官能基含量。在反應及PD10凝膠過濾之後，藉由在添加Ellman試劑5,5'-二硫基雙-(2-硝基苯甲酸酯)(DTNB)之後量測412 nM處之吸收率而測定SH含量。反應釋放5-硫基-2-硝基苯甲酸酯離子TNB2−，其在412 nm處具有吸收最大值。藉由量測412 nm處之吸收率增加且除以412 nm處之TNB2−離子之莫耳消光係數，可計算分子之游離巰基含量。如圖4中所示，儘管1小時反應之後的硫醇官能基含量為pH依賴性的，在3 h反應之後，pH對硫醇官能基含量之極小影響為顯而易見的。假設較長時間之活化反應可減小pH對硫醇官能基含量之影響，且藉此使得反應就pH依賴性尺寸變化而言更穩定，但亦可增加N經取代之亞胺基硫雜環戊烷，其可為由再異構化所致之長期尺寸不穩定性之來源。 為量測在不存在硫醇形成之情況下的硫醇官能基衰減，在硫醇化反應結束之後，亦即在移除亞胺基硫雜環戊烷試劑之後的若干時間點處量測硫醇官能基含量。硫醇化抗生蛋白鏈菌素之SH含量係在藉由PD10凝膠過濾移除2-亞胺基硫硫環戊烷之後的各個時間處用Ellman試劑量測。如圖5中所示，在反應結束之後10分鐘偵測到硫醇官能基之5%衰減，在反應之後60分鐘偵測到26%衰減，且在反應之後120分鐘處偵測到硫醇官能基之45%衰減。SH損失之半衰期計算為139 min。此指示在亞胺基硫雜環戊烷及SMPH活化結束與多聚化反應起始之間使用不同時間表之影響。C . 抗生蛋白鏈菌素突變蛋白及 SMPH 之莫耳比 為了評估SMPH活化反應中之SMPH及抗生蛋白鏈菌素突變蛋白濃度對抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚之影響，以不同濃度(範圍±10%)之SMPH及抗生蛋白鏈菌素突變蛋白進行寡聚程序。SMPH或抗生蛋白鏈菌素之濃度增加或減少百分之十導致抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚物尺寸之可偵測差異。在一些態樣中，推薦此等參數(Strep-Tactin及SMPH之濃度)之精確性最好應為±2%。D . 寡聚物穩定化 來自硫醇化之未反應N經取代之亞胺基硫雜環戊烷可保持於離胺酸殘基上及抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之自由N端處且促進寡聚物尺寸之合成後增加。為評估羥胺處理對合成後寡聚物生長之影響，如實例1中所述地進行寡聚程序，除了程序包括與亞胺基硫雜環戊烷之1小時活化反應(樣品1及2)或與亞胺基硫雜環戊烷之3.5小時活化反應(樣品3及4)。另外，在此等研究中，在進行SEC之後，含有寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之樣品接受在室溫下用pH 6.35之100 mM羥胺(HA)處理15分鐘(樣品1及3)或不接受羥胺處理(樣品2及4)。將樣品分成儲存於-80℃、4℃或37℃下之小份。緊接在合成之後(第0天)及合成後1週、3週、及9週藉由DLS來量測寡聚物尺寸。結果顯示於表E4中。 表E4：儲存溫度及羥胺處理對合成後生長之影響 如表E4中所示，羥胺處理在儲存於4℃及37℃之溫度下期間減少寡聚物生長。觀測到不管羥胺處理，尺寸在儲存於-80℃下期間穩定。樣品3及4經活化3.5小時且顯示寡聚物之更顯著合成後生長。不希望受理論所束縛，在一些態樣中，3.5小時活化時間不如1小時活化時間對pH變化敏感(參見實例2B)，但可產生較高含量之N經取代之亞胺基硫雜環戊烷。共同地，結果顯示羥胺處理降低抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚物之合成後生長。資料亦展示儲存於-80℃下增強寡聚物之穩定性。因此，在一些態樣中，組合羥胺處理，接著儲存於-80℃的溫度下可提供增強之穩定性以維持一致尺寸，包括在長期儲存期間。 實例3：產生含有可逆地結合至抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚物之寡聚抗CD3及抗CD28 Fab片段的可溶刺激試劑。 刺激試劑(抗CD3及抗CD28 Fab片段)係藉由可逆地結合至如實例1中所述產生之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑而多聚化。抗CD3及抗CD28 Fab片段係經由融合至各Fab片段之抗生蛋白鏈菌素肽結合搭配物可逆地結合至抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚物。抗CD3 Fab片段衍生自藉由融合瘤細胞株OKT3 (ATCC® CRL-8001™；亦參見美國專利第4,361,549號)產生之CD3結合單株抗體，且含有Arakawa等人 J. Biochem. 120, 657-662 (1996)中所述之抗CD3抗體OKT3之重鏈可變域及輕鏈可變域。此等序列分別闡述於SEQ ID NO: 31及32中。抗CD28 Fab片段衍生自抗體CD28.3 (以GenBank寄存編號AF451974.1寄存為合成單鏈Fv構築體；亦參見Vanhove等人, BLOOD, 2003年7月15日, 第102卷, 第2期, 第564-570頁)且含有分別闡述於SEQ ID NO: 33及34中之抗CD28抗體CD28.3之重鏈及輕鏈可變域。Fab片段在其重鏈之羧基端處個別地稠合至抗生蛋白鏈菌素肽結合序列，該序列含有兩個具有胺基酸序列SAWSHPQFEK(GGGS)2GGSAWSHPQFEK (SEQ ID NO: 16)之抗生蛋白鏈菌素結合模組之連續配置。肽標記之Fab片段係以重組方式產生(參見國際專利申請公開案第WO 2013/011011及WO 2013/124474號)。 為進行可逆結合，將肽標記之抗CD3及抗CD28 Fab片段與寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑在大致室溫下混合，藉此經由Fab片段上之雙strep標籤之間的相互作用將其可逆地結合至試劑，該等Fab片段為能夠可逆地結合至試劑上之結合位點的結合搭配物。在一些情況下，肽標記之Fab片段在固定至寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑上之前預混，其在一些情況下可導致不同Fab分子之更均勻分佈。 實例4:可逆地結合至抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚物之寡聚抗CD3及抗CD28 Fab片段的活性評估 對藉由描述於實例1中之方法可逆地結合至來自表E1中所述之批次中之每一者之各種寡聚抗生蛋白鏈菌素試劑的抗CD3及抗CD28 Fab片段評估刺激T細胞之能力。此等寡聚抗生蛋白鏈菌素試劑之平均半徑為約95 nm。藉由比色監測穩定四唑鎓鹽WST-1裂解為可溶甲臢染料複合物來評估作為細胞增殖之指標的細胞代謝活性。 來自三個不同供體之T細胞與可逆地結合於寡聚抗生蛋白鏈菌素試劑上之抗CD3/抗CD28多聚化Fab片段一起培育。細胞亦與平均半徑為101 (內部參考)或36 nm之對照寡聚試劑一起培育，該等寡聚試劑亦可逆地結合至抗CD3/抗CD28 Fab片段。在培育之後，將WST-1試劑施加至細胞且藉由量測450 nm處之吸收率作為讀數來評估代謝活性水準。將結果標準化為分析之培養物中之細胞的數目且描繪為WST-1/細胞數目之比率。 如圖6B中所示，經測試試劑中之每一者刺激之T細胞之平均WST-1活性為類似的。此外，刺激程度對於所有測試試劑而言類似且與類似尺寸之內部參考試劑類似(一般在±2標準差內改變)。圖6A顯示對於各試劑描繪為獨立資料點之WST-1活性。圖6A及圖6B指示使用多聚化於較小36 nm寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑主鏈上之抗CD3/抗CD28 Fab，如藉由WST-1活性觀測之T細胞刺激較低。 實例5：製備寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之例示性方法。 寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑係藉由與描述於實例1中之方法類似之例示性方法產生，伴以一些修改。特定言之，在與NEM一起培育之後，含有寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之樣品經離心且經由0.45 µm膜過濾上清液。過濾之溶液接著在室溫下用pH 6.35之100 mM羥胺處理15分鐘。樣品接著負載至管柱上以藉由AKTA Explorer層析系統(GE Healthcare)進行尺寸排阻層析(SEC)。具有大於或等於1500 mAU之毫吸收率單位(mAU)之部分經混合且接著用0.45 μm過濾器，接著用0.22 μm過濾器無菌過濾。寡聚抗生蛋白鏈菌素儲存於-80℃下。因此，不同於描述於實例1中之方法，不另外進行基於PD-10之凝膠過濾。 藉由例示性方法產生之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之尺寸及穩定性係相較於藉由描述於實例1中之方法產生之寡聚物。將寡聚物分成儲存於-80℃、4℃或37℃下之小份。緊接在合成之後(第0天)及合成後之各種時間點藉由DLS來量測寡聚物尺寸。無論在SEC之後或在SEC之前移除羥胺，兩種方法均產生類似尺寸及穩定性之寡聚物。如圖11中所示，儲存於-80℃或4℃下之寡聚物持續長至合成後46週顯示小於10%之平均尺寸變化。儲存於37℃下之寡聚物在合成後9週內顯示大致50%之尺寸增加。 實例6：評估不同製造批次之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑 評估由不同原料批次組成之不同批次之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑作為經嵌合抗原受體(CAR)對T細胞進行工程改造之方法的一部分。自個別批次之基本上如上文所述之STREP-TACTIN® M2產生三個離散寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑批次。含有來自相同製造之稠合抗生蛋白鏈菌素肽結合搭配物之抗CD3及抗CD28 Fab可逆地結合至來自基本上如上文所述之各批次之個別抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚物。三個離散寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑批次之平均直徑在100 nm與109 nm之間。 三個個別批次之抗CD3/抗CD28 Fab結合之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑用於刺激初生CD4+及CD8+ T細胞。CD4+及CD8+ T細胞個別地選自來自三個個別供體之血球分離術樣品，隨後以CD4+與CD8+ T細胞之指定比率組合所選細胞。組合之CD4+及CD8+ T細胞接著藉由例示性工程改造方法經嵌合抗原受體(CAR)工程改造，該方法包括用大量抗CD3/抗CD28 Fab結合之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑培育細胞，用慢病毒轉導，且接著培養以進行擴增。在擴增完成之前，細胞用生物素處理以將抗CD3/抗CD28 Fab自抗生蛋白鏈菌素寡聚試劑解離。培育、轉導及培養條件對於所有測試批次之抗CD3/抗CD28 Fab結合之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑相同，且各批次針對三個供體樣品中之每一者測試至多四個複本。為了顯示工程改造T細胞之轉導效率，慢病毒遞送編碼藉由核糖體跳躍序列與截短受體分離之CAR的聚核苷酸用作偵測CAR表現之替代標記物。 例示性工程改造過程之各個階段處之活細胞之總數目經定量。細胞在添加Fab結合之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑之前(第0天)，及方法之每天經活力染色標記。如圖12A及12B中所示，在工程改造過程之不同階段處量測之活細胞之總量及活細胞之百分比在獲自不同供體及使用不同批次之Fab結合之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑的細胞之間一致。 在收集自例示性工程改造過程之細胞中量測轉導效率。細胞經特異於CD4、CD8及替代標記物之抗體標記且藉由流動式細胞測量術分析。總活T細胞中之百分比CAR+、CAR+CD4+、CAR+CD8+細胞顯示於圖13中。轉導效率在不同Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑批次之間一致，且觀測之變化性主要取決於供體來源。 亦關於與記憶或耗盡表型相關之不同標記物檢查工程改造CAR+ T細胞。T細胞經特異於CD3、CD4、CD8及替代標記物之抗體以及記憶相關標記物CCR7、CD27 CD28、CD45RA、CD45RO及CD62L或耗盡相關標記物CCR7、LAG3、PD-1及TIM3標記且接著藉由流動式細胞測量術分析。針對記憶相關或耗盡相關標記物，未觀測到染色之顯著變化。進行根據記憶相關及耗盡相關表型標記物之主組分分析。衍生自累積資料比較、根據供體而非個別批次之Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑分離之集群與可在工程改造過程期間出現之試劑針對T細胞之記憶及耗盡相關表型之一致性一致。 藉由以StrepTactin-PE染色偵測殘餘抗CD3及抗CD28 Fab或藉由以特異於StrepTactin之抗體偵測殘餘突變蛋白抗生蛋白鏈菌素而對於工程改造CAR+ T細胞分析細胞表面上之殘餘Fab或突變蛋白抗生蛋白鏈菌素之存在。如圖14中所示，小於1%之活T細胞對於Fab或突變蛋白抗生蛋白鏈菌素呈陽性。 藉由共培養工程改造CAR+ T細胞與表現CAR之靶抗原之照射細胞來評估CAR依賴性抗原活性。在不存在照射抗原表現細胞的情況下培養之T細胞充當陰性對照。在四小時之共培養之後，T細胞藉由細胞內細胞介素染色(ICS)評估細胞內IL-2、IFN-γ及TNF-α，對於指示CAR表現及CD3之替代標記物進行染色，且藉由流動式細胞測量術評估。在源自不同供體之CAR+ CD3+ T細胞中且在不同批次之Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑存在下產生之細胞中觀測到類似百分比的對於IL-2、IFN-γ及TNF-α呈陽性之細胞，以及類似百分比的表現兩種或三種細胞介素之細胞。 在以5:1之效應細胞與靶細胞之比共培養細胞與表現CAR之靶抗原的靶細胞之後評估工程改造CAR+ T細胞之溶細胞活性。將黏附靶細胞接種於電子微量滴定盤之孔中且藉由量測附接電極之間的電流阻抗來定量靶細胞數目。關於對照，單獨或與T細胞一起培養靶細胞，該等T細胞已在例示性工程改造過程期間用參考抗CD3/抗CD28抗體結合之順磁珠粒試劑培育。如圖15中所示，CAR+ T細胞在檢定中展示有效殺死。觀測之溶細胞活性在獲自不同個別供體之T細胞中及不同製造批次之Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑中類似。 結合在一起，此等資料與藉由所提供方法產生之Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之較高程度的一致性一致。 本發明不意欲限制在特定揭示之實施例的範疇中，該等實施例被提供用於例如說明本發明之各種態樣。對所述組合物及方法之各種修改將由本文中之描述及教示而變得顯而易見。此類變化形式可在不背離本發明之真正範疇及精神的情況下加以實踐且意欲屬於本發明之範疇內。 序列
1‧‧‧寡聚試劑
2‧‧‧刺激劑/試劑
3‧‧‧細胞
4‧‧‧分子
5‧‧‧物質
6‧‧‧擔體
B1‧‧‧結合位點
B2‧‧‧結合位點
B3‧‧‧結合位點
B4‧‧‧結合位點
C1‧‧‧結合搭配物
C2‧‧‧結合搭配物
Z1‧‧‧結合位點
Z2‧‧‧結合位點
圖 1 描繪例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白STREP-TACTIN® M2與2-亞胺基硫雜環戊烷在100 mM硼酸鹽存在下之時程培育期間，連接至抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之硫醇官能基之水準。圖 2 顯示一圖，該圖顯示在pH 8.3或8.5下在25 mM硼酸鹽緩衝液中培育例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白STREP-TACTIN® M2與2-亞胺基硫雜環戊烷期間，連接至抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體之硫醇官能基之水準。圖 3 顯示與2-亞胺基硫雜環戊烷一起培育之抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之SEC溶離概況。分子量標準之溶離峰對於顯示之158,000 Da、44,000 Da、17,000 Da或1350 Da之分子量顯示為實線。非硫醇化例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白STREP-TACTIN® M2之溶離概況顯示為藍色點線。其餘的溶離概況描繪在pH 8.3或pH 8.5之25 mM硼酸鹽緩衝液存在下培育10分鐘、50分鐘或390分鐘之各種硫醇化STREP-TACTIN® M2抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之溶離概況。特定顯示在pH 8.3之25 mM硼酸鹽緩衝液存在下持續10分鐘、在pH 8.3之25 mM硼酸鹽緩衝液存在下持續50分鐘、在pH 8.3之25 mM硼酸鹽緩衝液存在下持續390分鐘或在pH 8.5之25 mM硼酸鹽緩衝液存在下持續10分鐘、在pH 8.5之25 mM硼酸鹽緩衝液存在下持續50分鐘或在pH 8.5之25 mM硼酸鹽緩衝液存在下持續390分鐘培育例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白STREP-TACTIN® M2與2-亞胺基硫雜環戊烷之後的溶離概況。圖 4 描繪在pH 8.3、8.5及8.7之25 mM硼酸鹽緩衝液之情況下培育例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白STREP-TACTIN® M2與2-亞胺基硫雜環戊烷1小時或3小時之後的硫醇官能基之濃度(SH含量)。圖 5 描繪例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白STREP-TACTIN® M2在與2-亞胺基硫雜環戊烷一起培育且藉由PD10管柱凝膠過濾之後的不同時間點處之硫醇官能基損失(SH含量)。圖 6A 及 6B 顯示與抗CD3/抗CD28一起培育的來自三個不同供體之T細胞之WST代謝檢定之結果，抗CD3/抗CD28在不同批次的由例示性抗生蛋白鏈菌素突變蛋白STREP-TACTIN® M2組成之寡聚試劑上多聚化。圖6A概括相較於含有抗CD3/抗CD28之參考批次之所有測試批次(混合)之WST代謝活性，抗CD3/抗CD28在平均流體動力半徑為36 nm或101 nm之寡聚主鏈上多聚化。關於個別測試批次及參考試劑的來自不同供體之T細胞之平均WST代謝活性顯示於圖6B中。圖 7 提供例示性實施例之示意性圖示。圖 7A 顯示具有複數個用於可逆地結合至試劑之結合位點之試劑(或其代表性部分)，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑之示意性圖示。在此狀況下，試劑顯示為能夠可逆地結合至兩種試劑，其各自能夠特異性結合至細胞上之分子。試劑具有複數個結合位點，包括複數個結合位點Z1，其各自能夠可逆地結合至試劑。所示之示意性圖示中之第一及第二試劑(其在一些情況下可相同)各含有至少一種結合搭配物C1。結合搭配物C1可逆地結合至結合位點Z1。第一及第二試劑亦各含有結合位點B2，其可特異性結合至細胞表面上之分子，該分子在一些情況下可在相同細胞上。此處，第一及第二試劑顯示為特異性結合至相同細胞上之分子。圖 7B 顯示具有複數個能夠可逆地結合至第一及第二試劑之結合位點之試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑之示意性圖示，該等試劑各自能夠分別特異性結合至第一及第二細胞上之分子。試劑具有複數個結合位點Z1，其各自能夠可逆地結合至試劑。第一及第二試劑(其在一些情況下可相同)各含有結合搭配物C1，其可逆地結合至結合位點Z1。第一及第二試劑各自含有結合位點B2，其可特異性結合至細胞表面上之分子，該分子在一些情況下可在相同細胞或不同細胞上。此處，第一試劑結合至第一細胞表面上之分子且第二試劑結合至第二細胞表面上之分子。圖 7C 顯示能夠可逆地結合至第一及第二試劑之試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑，該等試劑各自能夠分別特異性結合至第一及第二細胞上之分子。試劑具有複數個結合位點Z1及Z2，其可相同或不同，各自能夠可逆地結合至試劑中之一者或兩者。第一試劑含有可逆地結合至Z1之結合搭配物C1；第二試劑含有可逆地結合至Z2之結合搭配物C2。在一些情況下，C1及C2不同。在一些情況下，C1及C2相同或基本上相同。第一試劑含有一個可特異性結合至細胞表面上之分子之結合位點B1，且第二試劑含有至少一個可特異性結合至細胞表面上之分子之結合位點B3。結合位點B1及B3在一些情況下結合至兩個不同細胞表面分子，或單分子上之不同抗原決定基，或不同細胞表面上之相同或不同分子。此處，第一試劑顯示為經由B1結合至第一細胞表面上之分子，且第二試劑結合至第二細胞表面上之分子。圖 7D 顯示能夠可逆地結合至第一及第二試劑，諸如選擇劑之試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑，該等試劑各自能夠特異性結合至細胞上之分子。試劑具有複數個結合位點，包括Z1及Z2，其可相同或不同，各自能夠可逆地結合至試劑。第一試劑含有一個可特異性結合至結合位點Z1之結合搭配物C1且第二試劑含有至少一個可特異性結合至結合位點Z2之結合搭配物C2。在一些情況下，C1及C2不同。在一些情況下，C1及C2相同或基本上相同。第一試劑含有一個可特異性結合至細胞表面上之分子之結合位點B1，且第二試劑含有一個可特異性結合至細胞表面上之分子之結合位點B3。在一些實施例中，第一試劑及第二試劑可為選擇劑。結合位點B1及B3可結合細胞表面上之相同或不同分子(例如受體)、分子上之相同或不同抗原決定基，或不同細胞表面上之相同或不同分子。此處，第一試劑結合至細胞表面上之第一分子且第二試劑結合至相同細胞表面上之第二分子。圖 7E 顯示可逆地結合至第一及第二試劑之試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑，該等試劑各自能夠特異性結合至細胞上之分子。試劑具有複數個結合位點，包括Z1及Z2，其可相同或不同，各自能夠可逆地結合至試劑。第一試劑含有能夠可逆地結合至試劑之Z1之結合搭配物C1且第二試劑含有能夠可逆地結合至Z2之結合搭配物C2。在一些情況下，C1及C2不同。在一些情況下，C1及C2相同或基本上相同。第一試劑含有一個可特異性結合至細胞表面上之分子之結合位點B2，且第二試劑含有至少一個可特異性結合至細胞表面上之分子之結合位點B4。在一些實施例中，第一試劑及第二試劑可為刺激劑。結合位點B2及B4可結合細胞表面上之相同或不同分子、分子上之相同或不同抗原決定基或不同細胞表面上之相同或不同分子。此處，第一試劑結合至細胞表面上之第一分子且第二試劑結合至相同細胞表面上之第二分子。圖 8 包括圖8A - 8E ，其分別提供如圖 7A - 7E 中所示之例示性實施例之示意性表示，除了描繪之試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑顯示為固定於諸如固定相之擔體上。圖 9 提供例示性實施例之示意性圖示，其中寡聚試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑用於多聚合刺激劑及與細胞一起培育之所得複合物以向細胞遞送信號，接著逆轉該結合。圖A顯示寡聚試劑1 ，其顯示為不結合至任何擔體且顯示為可撓性的。在此處顯示為Fab片段且能夠特異性結合至細胞表面上之分子的刺激劑2 與試劑組合。試劑包含能夠可逆地結合至試劑上之結合位點(例如結合位點Z)，使試劑多聚化之結合搭配物(例如結合搭配物C)。圖B描繪可逆結合至試劑上之結合位點的結合搭配物。將細胞3 添加至系統。圖C描繪特異性結合至細胞3 表面上之分子4 的多聚化試劑(Fab片段)。在圖C中，描繪之試劑為刺激受體結合劑(例如第一受體結合劑及/或第二受體結合劑)，其可在將試劑結合至細胞上之分子後誘導或調節細胞中之信號。如圖D中所示，將諸如競爭性試劑(例如生物素)之物質5 添加至組合物，該物質可為相較於針對試劑上之結合搭配物，針對試劑上之結合位點展現較高結合親和力，藉此破壞試劑1 與試劑2 之間的可逆結合之物質。在一些情況下，例如Fab片段之試劑亦可自其與細胞3 上之分子4 之相互作用解離。在一些情況下，此可破壞、減少及/或終止細胞中之信號傳導。圖 10 提供可逆系統之例示性實施例之示意性圖示，該可逆系統包含連接至擔體，諸如固體擔體或表面，包括固定相之寡聚試劑，諸如抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白寡聚試劑。圖A顯示含有試劑1 之擔體6 。將能夠特異性結合至細胞表面上之分子的試劑2 ，諸如Fab片段添加至該系統。諸如Fab片段之試劑2 包含能夠可逆地結合至試劑上之結合位點(例如結合位點Z)之結合搭配物(例如結合搭配物C)。圖B描繪可逆結合至試劑上之結合位點的結合搭配物。將細胞3 添加至系統。圖C描繪結合至細胞3 表面上之分子4 的試劑2 ，例如Fab片段。在一些實施例中，scFv包含受體結合劑或選擇劑。在一些實施例中，試劑，例如Fab片段可為受體結合劑或選擇劑。圖C描繪一或多種例示性受體結合劑(例如第一受體結合劑及/或第二受體結合劑)，其可在將例如Fab片段之試劑結合至細胞上之分子後誘導或調節細胞中之信號。添加物質5 ，諸如競爭性試劑(例如生物素)，其可為相較於針對例如Fab片段之試劑上之結合搭配物，針對試劑上之結合位點展現較高結合親和力，藉此破壞試劑與試劑之間的結合之物質。圖D描繪例如Fab片段之試劑2 與試劑之間的結合之破壞，藉此導致試劑自試劑解離，且藉此自細胞解離。在一些情況下，例如Fab片段之試劑亦可自其與細胞3 上之分子4 之相互作用解離。在一些情況下，此可破壞、減少及/或終止細胞中之信號傳導。圖 11 顯示如在-80℃、4℃或37℃下儲存之後的各個時間點處藉由寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑之動態光散射量測之尺寸變化之圖。圖 12A 及 B 顯示在用於產生含有表現嵌合抗原受體(CAR)之T細胞之T細胞組合物的例示性工程改造過程期間，在與不同個別批次之抗CD3/抗CD28 Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑一起培育期間隨時間推移之活細胞總量(圖 12A )及百分比(圖 12B )之圖。圖 13 顯示一圖，該圖顯示在用於產生CAR T細胞組合物之例示性工程改造過程期間與不同個別批次之抗CD3/抗CD28 Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑一起培育之T細胞組合物之總CAR+、CD4+CAR+及CD8+CAR+細胞之百分比以及CD4+ T細胞中之CAR+CD4+ T細胞之百分比及CD8+ T細胞中之CAR+CD8+ T細胞之百分比。圖 14 顯示若干圖，該等圖顯示在與不同個別批次之Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑一起培育之細胞組合物中，針對殘餘Fab染色(上圖)或殘餘抗生蛋白鏈菌素突變蛋白(下圖)呈陽性之細胞的百分比。圖 15 顯示一圖，該圖顯示含有CAR T細胞之T細胞組合物之溶細胞活性，該等T細胞組合物係藉由包括與不同個別批次之抗CD3/抗CD28 Fab結合之寡聚抗生蛋白鏈菌素突變蛋白試劑一起培育之例示性工程改造過程產生。

Claims (121)

  1. 一種包含複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑之尺寸包含i)大於50 nm之半徑，ii)至少5×106 g/mol之分子量；及/或(iii)每一寡聚粒子試劑至少100個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。
  2. 如請求項1之寡聚粒子試劑，其中該等抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係可逆地結合至或能夠可逆地結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽。
  3. 如請求項1至2中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，其中該等抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在參看SEQ ID NO: 1中所闡述之胺基酸序列中之抗生蛋白鏈菌素之位置，對應於位置44至47之序列位置處包含胺基酸序列Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 。
  4. 如請求項1至3中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，其包含： a)SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者中所闡述之胺基酸序列； b)與SEQ ID NO: 3-6、27、28、60或61中之任一者展現至少85%、86%、87%、88%、89%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性且含有對應於Va144 -Thr45 -Ala46 -Arg47 或lle44 -Gly45 -Ala46 -Arg47 之胺基酸序列及/或可逆地結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽之胺基酸序列；或 c)可逆地結合至生物素、生物素類似物或抗生蛋白鏈菌素結合肽之a)或b)之功能片段。
  5. 如請求項1至4中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含複數個抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，該等分子包含SEQ ID NO: 6或61中所闡述之胺基酸序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑結合至或能夠結合至一或多種試劑。
  7. 如請求項6之寡聚粒子試劑，其中該一或多種試劑包含結合搭配物，其中該結合搭配物能夠結合，視情況可逆地結合至該寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點。
  8. 如請求項7之寡聚粒子試劑，其中該結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽。
  9. 如請求項7或8之寡聚粒子試劑，其中該結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。
  10. 如請求項7至9中任一項之寡聚粒子試劑，其中該一或多種試劑為或包含抗體或其抗原結合片段。
  11. 如請求項10之寡聚粒子試劑，其中該一或多種試劑為或包含單價抗體片段。
  12. 如請求項10或請求項11之寡聚粒子試劑，其中該一或多種試劑為或包含Fab。
  13. 如請求項7至12中任一項之寡聚粒子試劑，其中該一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體的受體結合劑。
  14. 如請求項7至13中任一項之寡聚粒子試劑，其中該受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子之刺激劑，其中結合誘導或調節該靶細胞中之信號。
  15. 如請求項13或請求項14之寡聚粒子試劑，其中該靶細胞為免疫細胞。
  16. 如請求項13至15中任一項之寡聚粒子試劑，其中該靶細胞為T細胞。
  17. 如請求項13至16中任一項之寡聚粒子試劑，其中該受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。
  18. 如請求項13至17中任一項之寡聚粒子試劑，其中該刺激劑為第一受體結合劑且該寡聚粒子試劑包含第二受體結合劑，其中該第二受體結合劑能夠特異性結合至該靶細胞表面上之第二分子，其中結合至該第二分子視情況能夠誘導或調節該等靶細胞中之信號。
  19. 如請求項18之寡聚粒子試劑，其中該第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。
  20. 如請求項18或請求項19之寡聚粒子試劑，其中該第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子且該共刺激分子為CD28。
  21. 如請求項7至20中任一項之寡聚粒子試劑，其中該一或多種試劑為抗CD3抗體及抗CD28抗體，視情況為抗CD3 Fab及抗CD28 Fab。
  22. 如請求項13至16中任一項之寡聚粒子試劑，其中該受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。
  23. 如請求項7至22中任一項之寡聚粒子試劑，其中該一或多種試劑包含選擇劑，其中該選擇劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。
  24. 如請求項23之寡聚粒子試劑，其中該靶細胞為免疫細胞，視情況為T細胞。
  25. 如請求項23或請求項24之寡聚粒子試劑，其中該選擇標記物為CCR7、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD27、CD45RA、CD45RO、CD62L及/或CD127。
  26. 如請求項1至25中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含：大於60 nm、大於70 nm、大於80 nm、或大於90 nm之半徑。
  27. 如請求項1至26中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含： 50 nm與150 nm之間、75 nm與125 nm之間、80 nm與115 nm之間或90 nm與110 nm之間(含上下限值)的半徑；或 90 nm±15 nm，或95 nm±20-25 nm之半徑。
  28. 如請求項26或請求項27之寡聚粒子試劑，其中該半徑為流體動力半徑。
  29. 如請求項1至28中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含如下分子量：至少5×107 g/mol，或至少1×108 g/mol；及/或 5×107 g/mol與5×108 g/mol之間、1×108 g/mol與5×108 g/mol之間或1×108 g/mol與2×108 g/mol之間。
  30. 如請求項1至29中任一項之寡聚粒子試劑，其中該寡聚粒子試劑包含至少500個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少1,000個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、至少1,500個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體或至少2,000個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體；及/或 1,000與20,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體、1,000與10,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體或2,000與5,000個之間的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體。
  31. 如請求項1至30中任一項之寡聚粒子試劑，其中該複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白包含離胺酸殘基，其中小於20%、10%、5%、1%之該等離胺酸殘基包含N經取代之亞胺基硫雜環戊烷。
  32. 一種組合物，其包含複數種如請求項1至31中任一項之寡聚粒子試劑。
  33. 如請求項32之組合物，其中該複數種寡聚粒子試劑包含i)大於70 nm之平均半徑；ii)至少1×108 g/mol之平均分子量；及/或iii)每一寡聚粒子試劑之抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚物之平均數量為至少2,000；及/或iv)其中至少95%之該複數種寡聚粒子試劑包含10 nm至150 nm之間的半徑之半徑尺寸分佈。
  34. 如請求項32或33之組合物，其中該複數種寡聚粒子試劑包含大於50 nm、大於60 nm、大於70 nm、大於80 nm、大於90 nm、或大於100 nm之平均半徑。
  35. 如請求項32至34中任一項之組合物，其中： 該複數種寡聚粒子試劑包含在50 nm與150 nm之間、75 nm與125 nm之間、80 nm與110 nm之間或90 nm與110 nm之間(含上下限值)的平均半徑；或 該複數種寡聚粒子試劑包含90 nm ±15 nm、95 nm±20-25nm或97±10 nm之平均半徑。
  36. 如請求項32至35中任一項之組合物，其中至少95%之該複數種寡聚粒子試劑包含在50 nm與150 nm之間、70 nm與140 nm之間、80 nm與120 nm之間、80 nm與115 nm之間、80 nm與100 nm之間、90 nm與110 nm之間及/或100 nm與120 nm之間的半徑。
  37. 如請求項32至36中任一項之組合物，其中至少95%之該等寡聚粒子試劑包含在該複數種寡聚粒子試劑之平均及/或中值半徑之±50%、±25%、±20%、±15%、±10%及/或±5%之間的半徑。
  38. 如請求項32至37中任一項之組合物，其中該複數種寡聚粒子試劑包含在80 nm與115 nm之間的平均半徑且其中至少95%之該等寡聚粒子試劑包含在該平均半徑之±25%之間的半徑。
  39. 如請求項32至38中任一項之組合物，其中該複數個粒子包含：(i) 1×108 g/mol與5×108 g/mol之間或1×108 g/mol與2×108 g/mol之間(含上下限值)的平均分子量；及/或 (ii)每一寡聚粒子試劑的抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素四聚體之平均數量為至少100、至少500、至少1,000、至少1,500或至少2,000，或在1,000與20,000之間、1,000與10,000之間或2,000與5,000之間(各含上下限值)。
  40. 如請求項32至39中任一項之組合物，其中當在大約或低於-80℃、大約或低於-20℃及/或大約或低於4℃下儲存至少1週時，該複數個寡聚物粒子之平均半徑不增加超過25%或10%。
  41. 一種產生包含抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白之寡聚粒子試劑之方法，該方法包含： 培育複數個包含能夠與硫醇官能基反應之硫醇反應性官能基的活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及複數個包含一或多個硫醇官能基之硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子，藉此產生包含寡聚粒子之粒子組合物； 從單體及/或較小寡聚分子中分離該等寡聚粒子；以及 使該寡聚粒子與穩定劑接觸，藉此產生該寡聚粒子試劑。
  42. 如請求項41之方法，其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與能夠將一或多個胺轉化為硫醇反應性官能基之活化試劑一起培育而產生。
  43. 如請求項41或請求項42之方法，其中該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係藉由將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與添加或能夠添加硫醇官能基至一或多個離胺酸殘基之硫醇化試劑一起培育而產生。
  44. 一種產生寡聚粒子試劑之方法，該方法包含： (a)在將一或多個胺轉化為能夠與硫醇官能基反應之硫醇反應性基團之條件下，將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與活化試劑一起培育，藉此產生複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子； (b)將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與添加或能夠添加硫醇官能基至一或多個離胺酸殘基之硫醇化試劑一起培育，藉此產生複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子；以及 (c)將該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子一起培育，藉此產生包含該等寡聚粒子試劑之粒子組合物； 其中該方法係在如下條件下進行：其中在開始(c)之培育時，該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子使得至少60%之該等離胺酸平均包含一個硫醇官能基，及/或每一硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體平均至少10個離胺酸包含一個硫醇官能基。
  45. 如請求項44之方法，其進一步包含從單體及/或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子中分離該等寡聚粒子試劑。
  46. 如請求項41至45中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該活化試劑之培育係在抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與活化試劑之1:1與1:10之間莫耳比下進行。
  47. 如請求項41至46中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該活化試劑之培育係在抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白與活化試劑之1:2±2%之莫耳比下進行。
  48. 如請求項41至47中任一項之方法，其中該活化試劑包含雜雙官能基交聯劑，視情況為4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸磺基丁二醯亞胺酯(磺基SMCC)及/或6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)。
  49. 如請求項41至48中任一項之方法，其中該硫醇反應性官能基為順丁烯二醯亞胺基。
  50. 如請求項41至49中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該活化試劑係在6.8與7.5之間、7.0與7.4之間(各含上下限值)，視情況在或在約7.2之pH下培育。
  51. 如請求項41至50中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該活化試劑係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間(含上下限值)，視情況在或在約23℃或24℃下培育。
  52. 如請求項41至51中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該活化試劑係培育15分鐘至6小時之間、30分鐘至2小時之間(各含上下限值)，視情況培育1小時或約1小時。
  53. 如請求項43至52中任一項之方法，其中： 該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該硫醇化試劑之培育係在硫醇化試劑與每一抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之各一級胺為10:1與1:1之間(含上下限值)之莫耳比下進行； 該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該硫醇化試劑之培育係在抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與該硫醇化試劑之1:50與1:500之間(含上下限值)的莫耳比下，視情況在或在抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白四聚體與該活化試劑之約1:100的莫耳比下進行。
  54. 如請求項43至53中任一項之方法，其中該硫醇化試劑為或包含2-亞胺基硫雜環戊烷。
  55. 如請求項43至54中任一項之方法，其中： 該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該硫醇化試劑係在7.0或大於7.0，視情況7.0與8.0之間(含上下限值)的pH下，視情況在約7.7之pH下培育；及/或 該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該硫醇化試劑之培育係在pH為8.0或大於8.0，視情況在8.0與9.0之間(含上下限值)，視情況為8.5或約8.5之緩衝液存在下開始。
  56. 如請求項43至55中任一項之方法，其中該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該硫醇化試劑係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間(含上下限值)，視情況在23℃或約23℃下或在24℃或約24℃下培育。
  57. 如請求項43至56中任一項之方法，其中該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該硫醇化試劑係培育15分鐘至2小時、15分鐘至1.5小時或25分鐘至1小時之間(各含上下限值)，視情況培育1小時或約1小時或培育25分鐘或約25分鐘。
  58. 如請求項41至57中任一項之方法，其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在培育期間之莫耳比為X:1，其中X為每一抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子可用於硫醇化之離胺酸殘基的數目。
  59. 如請求項41至58中任一項之方法，其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子在培育期間之莫耳比為1:1至8:1或2:1至6:1，視情況為或為約4:1。
  60. 如請求項41至59中任一項之方法，其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在6.8與7.5之間，或7.0與7.4之間(各含上下限值)的pH下，視情況在或在約7.2之pH下培育。
  61. 如請求項41至60中任一項之方法，其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子係在室溫下，視情況在20℃與25℃之間(含上下限值)，視情況在23℃或約23℃下或在24℃或約24℃下培育。
  62. 如請求項41至61中任一項之方法，其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子及該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子係培育15分鐘至6小時或30分鐘至2小時之間(各含上下限值)，視情況培育1小時或約1小時。
  63. 如請求項41至62中任一項之方法，其中產生包含該等寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白粒子之該粒子組合物進一步包含藉由使該等活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該等硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與N-乙基順丁烯二醯亞胺(NEM)接觸而結束該等分子之反應。
  64. 如請求項44至63中任一項之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該活化試劑一起培育的至少一部分及該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該硫醇化試劑一起培育的至少一部分係同時分開地進行。
  65. 如請求項64之方法，其中該第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該活化試劑一起培育及該第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該硫醇化試劑一起培育係實質上進行相同時間長度及/或實質上在相同時間完成。
  66. 如請求項44至65中任一項之方法，其中在培育硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該等活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之前，該方法包含： (i)自包含該等活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除該活化試劑；及/或 (ii)自包含該等硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除該硫醇化試劑。
  67. 如請求項44至66中任一項之方法，其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子及該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之培育係在該第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子與該硫醇化試劑一起培育結束之後及/或在自包含該等硫醇化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子之組合物移除該硫醇化試劑之後15分鐘內開始。
  68. 一種產生寡聚粒子試劑之方法，其包含： 將第一複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯(SMPH)在7.2或約7.2之pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生複數個包含順丁烯二醯亞胺硫醇反應性官能基之活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子； 將第二複數個抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與2-亞胺基硫雜環戊烷在7.5與8.5之間(含上下限值)的pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生複數個包含一或多個硫醇官能基之硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子；及 將該複數個活化抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子與該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子在7.2或約7.2之pH下一起培育1小時或約1小時，藉此產生包含該等寡聚粒子試劑之粒子組合物； 其中該複數個活化抗生蛋白鏈菌素分子與該複數個硫醇化抗生蛋白鏈菌素分子之一起培育係在該第二複數個抗生蛋白鏈菌素分子與2-亞胺基硫雜環戊烷一起培育結束之後10分鐘內開始。
  69. 如請求項44至68中任一項之方法，其中該方法進一步包含使該等寡聚粒子試劑與穩定劑接觸。
  70. 如請求項41至43及69中任一項之方法，其中該穩定劑降低該等寡聚粒子試劑之離胺酸殘基上之N經取代之亞胺基硫雜環戊烷的存在量。
  71. 如請求項41至43、69及70中任一項之方法，其中該穩定劑包含羥胺。
  72. 如請求項41至43及69至71中任一項之方法，其中該穩定劑係藉由層析，視情況藉由尺寸排阻層析(SEC)自該等寡聚粒子試劑移除。
  73. 如請求項41至72中任一項之方法，其進一步包含對該等寡聚粒子試劑進行過濾滅菌。
  74. 如請求項41至43及45至73中任一項之方法，其中該等寡聚粒子試劑係藉由尺寸排阻層析(SEC)與單體或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子分離。
  75. 如請求項74之方法，其中該SEC包含尺寸排阻極限且該尺寸排阻極限大於或大於約100 kDa、500 kDa、750 kDa、1000 kDa或2000 kDa。
  76. 如請求項75之方法，其中該尺寸排阻極限為或為約500 kDa至1000 kDa，視情況為或為約75 kDa。
  77. 如請求項41至43及45至76中任一項之方法，其包含收集一或多個包含空隙體積之部分，藉此從該等單體或較小寡聚抗生蛋白鏈菌素或抗生蛋白鏈菌素突變蛋白分子中分離寡聚粒子試劑。
  78. 如請求項41至77中任一項之方法，其進一步包含在將一或多種試劑可逆地結合至該等寡聚粒子試劑之條件下混合該等寡聚粒子試劑與該一或多種試劑。
  79. 一種寡聚粒子試劑，其藉由如請求項41至78中任一項之方法產生。
  80. 一種將一或多種試劑多聚化為寡聚粒子試劑之方法，該方法包含在將該一或多種試劑可逆地結合至該等寡聚粒子試劑之條件下，將如請求項1至31中任一項之寡聚粒子試劑、如請求項32至40中任一項之包含複數種寡聚粒子試劑之組合物、或藉由如請求項41至78中任一項之方法產生之寡聚粒子試劑與一或多種試劑混合。
  81. 如請求項78或請求項80之方法，其中該一或多種試劑包含結合搭配物，其中該結合搭配物能夠結合至該寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點。
  82. 如請求項81之方法，其中該結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽。
  83. 如請求項81或請求項82之方法，其中該結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。
  84. 如請求項80至83中任一項之方法，其中該一或多種試劑為或包含抗體或其抗原結合片段。
  85. 如請求項84之方法，其中該一或多種試劑為或包含單價抗體片段。
  86. 如請求項84或請求項85之方法，其中該一或多種試劑為或包含Fab。
  87. 如請求項80至86中任一項之方法，其中該一或多種試劑為結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體的受體結合劑。
  88. 如請求項87之方法，其中該受體結合劑為或包含能夠結合至靶細胞表面上之分子的刺激劑，其中該結合會誘導或調節該靶細胞中之信號。
  89. 如請求項87或請求項88之方法，其中該靶細胞為免疫細胞。
  90. 如請求項87至89中任一項之方法，其中該靶細胞為T細胞。
  91. 如請求項87至90中任一項之方法，其中該受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。
  92. 如請求項87至91中任一項之方法，其中該刺激劑為第一受體結合劑且該方法進一步包含將第二受體結合劑可逆地結合至寡聚粒子試劑，其中該第二受體結合劑能夠特異性結合至該靶細胞表面上之第二分子，該結合至該第二分子視情況能夠誘導或調節該靶細胞中之信號。
  93. 如請求項92之方法，其中該第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。
  94. 如請求項93或請求項94之方法，其中該第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子且該共刺激分子為CD28。
  95. 如請求項78及80至94中任一項之方法，其中該一或多種試劑為抗CD3抗體及抗CD28抗體，視情況為抗CD3 Fab及抗CD28 Fab。
  96. 如請求項87至90中任一項之方法，其中該受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。
  97. 如請求項78及80至96中任一項之方法，其中該一或多種試劑包含選擇劑，其中該選擇劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之選擇標記物。
  98. 如請求項97之方法，其中該靶細胞為免疫細胞，視情況為T細胞。
  99. 如請求項97或請求項98之方法，其中該選擇標記物為CCR7、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD27、CD45RA、CD45RO、CD62L及/或CD127。
  100. 一種組合物，其包含複數種藉由如請求項41至78及80至99中任一項之方法產生之寡聚粒子試劑。
  101. 一種製品，其包含如請求項1至31中任一項之寡聚粒子試劑、如請求項32至40及100中任一項之包含複數種寡聚試劑之組合物、或藉由如請求項41至78及80至99中任一項之方法產生之寡聚試劑。
  102. 一種調節細胞之方法，該方法包含在如請求項1至31中任一項之寡聚粒子試劑、如請求項32至40及100中任一項之包含複數種寡聚試劑之組合物、或藉由如請求項41至78及80至99中任一項之方法產生之寡聚試劑存在下，培育包含靶細胞之細胞組合物，藉此調節靶細胞。
  103. 一種培養細胞之方法，該方法包含在如請求項1至31中任一項之寡聚粒子試劑、如請求項32至40及100中任一項之包含複數種寡聚試劑之組合物、或藉由如請求項41至78及80至99中任一項之方法產生之寡聚試劑存在下，培育包含靶細胞之細胞組合物。
  104. 如請求項102或請求項103之方法，其中該寡聚粒子試劑可逆地結合至一或多種受體結合劑，該一或多種受體結合劑結合至或能夠結合至表現於靶細胞表面上之受體。
  105. 如請求項104之方法，其中該一或多種受體結合劑包含結合搭配物，其中該結合搭配物可逆地結合至該寡聚粒子試劑上之一或多個結合位點。
  106. 如請求項105之方法，其中該結合搭配物包含抗生蛋白鏈菌素結合肽。
  107. 如請求項105或請求項106之方法，其中該結合搭配物包含選自由以下組成之群的抗生蛋白鏈菌素結合肽：Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 8)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)3 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys ((SEQ ID NO: 17)、Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 -Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 18)及Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys-(GlyGlyGlySer)2 Gly-Gly-Ser-Ala-Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys (SEQ ID NO: 19)。
  108. 如請求項87至107中任一項之方法，其中該一或多種受體結合劑為或包含抗體或其抗原結合片段。
  109. 如請求項108之方法，其中該一或多種受體結合劑為或包含單價抗體片段。
  110. 如請求項108或請求項109之方法，其中該一或多種試劑為或包含Fab。
  111. 如請求項102至110中任一項之方法，其中該靶細胞為免疫細胞。
  112. 如請求項102至111中任一項之方法，其中該靶細胞為T細胞。
  113. 如請求項104至112中任一項之方法，其中該受體結合劑為或包含能夠結合至該靶細胞表面上之分子之刺激劑，其中該結合會誘導或調節該靶細胞中之信號。
  114. 如請求項104至113中任一項之方法，其中該受體結合劑能夠在T細胞中引發TCR/CD3複合物相關信號，結合至TCR/CD3複合物之成員；及/或特異性結合至CD3。
  115. 如請求項113或請求項114之方法，其中該刺激劑為第一受體結合劑且寡聚粒子試劑包含第二受體結合劑，其中該第二受體結合劑能夠特異性結合至該靶細胞表面上之第二分子，其中結合至該第二分子視情況能夠誘導或調節該靶細胞中之信號。
  116. 如請求項115之方法，其中該第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子、輔助分子、免疫檢查點分子，為TNF家族成員或TNF家族受體、細胞介素受體、趨化因子受體，或為或包含黏附分子或誘發細胞介素產生、趨化因子產生及/或黏附分子表現之因子。
  117. 如請求項115或請求項116之方法，其中該第二受體結合劑特異性結合至共刺激分子且該共刺激分子為CD28。
  118. 如請求項104至117中任一項之方法，其中該一或多種試劑為抗CD3抗體及抗CD28抗體，視情況為抗CD3 Fab及抗CD28 Fab。
  119. 如請求項102至118中任一項之方法，其中該等靶細胞表現重組受體，視情況為重組T細胞受體及/或嵌合抗原受體(CAR)。
  120. 如請求項104至119中任一項之方法，其進一步包含破壞該一或多種試劑與該寡聚粒子試劑之間的可逆結合，該破壞包含向該等靶細胞中引入能夠逆轉該一或多種試劑與該寡聚粒子試劑之間的結合或與該結合競爭之物質。
  121. 如請求項120之方法，其中該物質包含生物素或生物素類似物，視情況為D-生物素。
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