ES2319061B1 - Metodo de conservacion de peptidos o proteinas. - Google Patents
Metodo de conservacion de peptidos o proteinas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2319061B1 ES2319061B1 ES200702475A ES200702475A ES2319061B1 ES 2319061 B1 ES2319061 B1 ES 2319061B1 ES 200702475 A ES200702475 A ES 200702475A ES 200702475 A ES200702475 A ES 200702475A ES 2319061 B1 ES2319061 B1 ES 2319061B1
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- proteins
- matrix
- protein
- peptides
- solid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 123
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 121
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 43
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 87
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 49
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 40
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 18
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 15
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 15
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 13
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 12
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960001231 choline Drugs 0.000 claims description 7
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 claims description 6
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 claims description 4
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 3
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 3
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical group OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N trimethylamine Chemical compound CN(C)C GETQZCLCWQTVFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 DLZKEQQWXODGGZ-KCJUWKMLSA-N 0.000 claims description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 claims description 2
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 claims description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 claims description 2
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 claims description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 claims description 2
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 2
- 102000028861 calmodulin binding Human genes 0.000 claims description 2
- 108091000084 calmodulin binding Proteins 0.000 claims description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 2
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 claims description 2
- NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N iminodiacetic acid Chemical compound OC(=O)CNCC(O)=O NBZBKCUXIYYUSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 claims 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 5
- 238000001816 cooling Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 53
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 12
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 11
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 6
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 description 5
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 description 5
- 208000005156 Dehydration Diseases 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 description 5
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 5
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 5
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 4
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 4
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 4
- QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N propylene Natural products CC=C QQONPFPTGQHPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 2
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108091005942 ECFP Proteins 0.000 description 1
- 238000012424 Freeze-thaw process Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000003715 calcium chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000012569 microbial contaminant Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 238000000859 sublimation Methods 0.000 description 1
- 230000008022 sublimation Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000009834 vaporization Methods 0.000 description 1
- 230000008016 vaporization Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
- C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
- C07K17/04—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel, hollow fibre
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Método de conservación de péptidos o
proteínas.
El objeto de la presente invención es un método
de conservación de péptidos o proteínas durante periodos de tiempo
prolongados. Constituye igualmente un objeto de la presente
invención la utilización de dicho método de conservación para el
transporte de péptidos o proteínas etiquetadas sin necesidad de
refrigeración, así como el conjunto de útiles para la puesta en
práctica de dicho método.
Description
Método de conservación de péptidos o
proteínas.
El sector de la técnica en el que se encuadra la
presente invención es el biotecnológico, y su ámbito de aplicación
es la conservación y el transporte de péptidos o proteínas de
interés sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico o
industrial. También es de interés en el campo de la investigación
en ciencias de la vida.
Los péptidos o proteínas generalmente son
inestables cuando son conservados a temperatura ambiente
(aproximadamente entre 18 y 25ºC) en medios líquidos o soluciones
acuosas, así en pocas horas comienzan a aparecer fenómenos de
degradación, desnaturalización y/o crecimiento de contaminantes
microbianos (Jaenicke, R., (2000). J Biotechnol, 79,
193-203; Meyer, J. D., et al (2002). Pharm
Biotechnol, 13, 85-107). Con objeto de evitar
dichos fenómenos se utilizan diversos métodos de conservación de
péptidos y proteínas, los más habituales pueden ser resumidos en:
(i) conservación a temperatura refrigerada; (ii) adición de agentes
estabilizantes; y, (iii) deshidratación o liofilización.
Tradicionalmente los péptidos o proteínas han
sido conservados en solución acuosa a temperatura refrigerada, bien
de forma líquida a 4ºC ó bien de forma congelada a -20ºC. De esta
forma se reduce la velocidad de las reacciones de degradación. No
obstante, los procesos de congelación-descongelación
repetida provocan alteraciones en la estructura y/o actividad de
los péptidos y proteínas (Tang, X.C., et al (2005). Pharm
Res, 22, 1167-1175). Asimismo, los péptidos y
proteínas conservados de esta forma no evitan la aparición de los
fenómenos de degradación, desnaturalización y/o contaminación
microbiana.
Los agentes estabilizantes son sustancias
inertes que modifican las características
físico-químicas de las soluciones acuosas empleadas
para conservar péptidos o proteínas, reduciendo así el riesgo de
degradación. Ejemplos de tales agentes son: glicerol, azúcares
(glucosa, galactosa, sacarosa, trealosa), polietilenglicoles,
amino-ácidos (metionina, histidina), detergentes (Triton
X-100, Tween-20), y otras proteínas
(albúmina) (Arakawa, T., (1991). Pharm Res, 8,
285-291; Crowe, J.H., et al (1987).
Biochem J, 242, 1-10; Levine, R.L. (1983).
J Biol Chem, 258, 11828-11833). El glicerol
es un agente estabilizante tradicional que reduce el punto de
congelación de la solución acuosa con los péptidos o proteínas,
permitiendo conservarlos en estado líquido sin congelar a baja
temperatura (-20ºC) (Scharnagl, C., et al (2005). Biochim
Biophys Acta, 1749, 187-213). Los agentes
estabilizantes suelen utilizarse conjuntamente a otros métodos de
conservación de péptidos o proteínas (Carpenter, J.F. et al
(1987). Biochim Biophys Acta, 923, 109-115).
Sin embargo, a menudo los agentes estabilizantes pueden interferir
en la actividad o aplicación posterior del péptido o proteína de
interés, y deben ser eliminados utilizando sistemas de diálisis u
otros procedimientos más agresivos (precipitación salina o ácida)
que alteran dicho péptido o proteína (Prive, G.G. (2007)
Methods, 41, 388-397).
La liofilización es un proceso de deshidratación
en el cual las moléculas de agua son eliminadas de una muestra
congelada en el interior de un sistema de vacío. Este método de
conservación requiere que el péptido o proteína, disuelto en un
medio o solución acuosa, sea congelado preferentemente de forma
rápida. Un procedimiento utilizado para congelar rápidamente la
solución con el péptido o proteína consiste en su inmersión en
nitrógeno líquido. Entonces se aplica a la muestra congelada un
sistema de vació, que provoca la sublimación o vaporización de la
fase helada a temperaturas bajo cero (deshidratación primaria). La
humedad residual puede ser posteriormente eliminada permitiendo la
elevación gradual de la temperatura (deshidratación secundaria). El
resultado del proceso de liofilización es un polvo o sustancia seca
y cristalina que contiene el péptido o proteína a conservar
(Randolph, T.W., (1997). J Pharm Sci, 86,
1198-1203; Wang, W. (2000). Int J Pharm, 203,
1-60). En la liofilización, durante las fases de
deshidratación primaria y secundaria los péptidos o proteínas
sufren cambios físicos y químicos, como incremento de la
concentración salina, agregación/precipitación, estrés físico, pH
extremos, que producen alteraciones en su estructura y/o actividad.
Adicionalmente, los péptidos o proteínas liofilizados usualmente
son muy higroscópicos, y tienen tendencia a absorber la humedad
ambiental, lo que también ocasiona fenómenos de degradación y
descenso de la actividad de dichos péptidos o proteínas (Webb,
S.D., et al (2003). J Pharm Sci, 92,
715-729).
Las etiquetas de afinidad (tags) se han
convertido en un sistema habitual de purificar proteínas y
complejos protéicos nativos por evidentes razones: permiten
purificar o enriquecer de cientos a miles de veces dichos péptidos o
proteínas desde extractos crudos en un solo paso, sin la necesidad
de eliminar previamente ácidos nucléicos u otros materiales
celulares; y, sobre todo, permiten utilizar protocolos generales de
purificación con una gran diversidad proteínas, en contraste con el
diseño y puesta a punto de protocolos específicos para cada
material peptídico que necesita la cromatografia convencional
(Waugh, D.S., (2005). Trends Biotechnol, 23,
316-320; Esposito, D. et al (2006). Curr
Opin Biotechnol, 17, 353-358). Gracias a estas
ventajas, la purificación usando etiquetas de afinidad ha
facilitado a los investigadores la producción de multitud de
proteínas recombinantes de interés en investigación y en
diagnóstico, siendo el procedimiento típicamente usado en los
proyectos de alto rendimiento (Braun, P., et al. (2002)
PNAS; 99, 2654-2659).
Actualmente, las colaboraciones científicas o
los servicios especializados cliente-proveedor
requieren el intercambio o envío de péptidos o proteínas, de interés
sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico, industrial o en
el campo de la investigación en ciencias de la vida, entre
laboratorios de centros públicos o empresas privadas localizados en
el mismo país o países diferentes. Uno de los problemas del envío
de estos materiales, consiste en evitar los fenómenos de
degradación, desnaturalización y/o crecimiento de contaminantes
microbianos referidos anteriormente. El sistema de transporte más
habitual consiste en usar cajas voluminosas que contienen hielo,
nieve carbónica o acumuladores de frío para garantizar que los
péptidos o proteínas se conservan una temperatura refrigerada
durante el tiempo establecido para el transporte (de 24 horas a
4-5 días para este tipo de envíos). Estos sistemas
son engorrosos y suponen un elevado coste económico. Además,
cualquier retraso en el tiempo de transporte (retención en aduanas,
retrasos por la empresa de mensajería, etc) provoca que el material
llegue a su destino a temperatura ambiente, motivando su devolución
o la comprobación de la integridad del material enviado por parte
del receptor. Por ello son necesarios nuevos métodos que permitan
resolver el problema de conservación y transporte de péptidos o
proteínas a temperatura ambiente. La presente invención describe un
método sencillo, económico y versátil orientado a resolver este
problema, así como los útiles necesarios para realizarlo.
El objeto de la invención se refiere un método
para conservar péptidos o proteínas etiquetados durante varios
días, e incluso meses, que evita el uso de refrigeración, y su
aplicación en el almacenamiento y el transporte de péptidos o
proteínas de interés para los sectores sanitario, diagnóstico,
farmacéutico, agronómico o industrial. La presente invención
describe un método alternativo más cómodo y seguro que los ya
existentes, tales como la conservación y/o transporte de péptidos o
proteínas en solución acuosa a temperatura refrigerada o la
liofilización. (Tang, X.C., et al (2005). Pharm Res,
22, 1167-1175; Webb, S.D., et al (2003).
J Pharm Sci, 92, 715-729). Así, el objeto de
la invención comprende el uso de matrices sólidas o
semi-sólidas derivatizadas con compuestos que
tienen afinidad por secuencias específicas o etiquetas (tags)
presentes en los péptidos o proteínas a conservar.
El método para conservar péptidos o proteínas
objeto de la invención incluye las siguientes etapas:
- (a)
- paso de un fluido o solución que contenga el péptido o proteína etiquetado a través de una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada, en condiciones tales que la etiqueta (tag) del péptido o proteína se une por afinidad a los grupos funcionales presentes en dicha matriz.
- (b)
- paso de una solución de lavado a través de la matriz para eliminar el material biológico, péptidos o proteínas, u otras sustancias del fluido o solución no unidos a la matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.
- (c)
- secado parcial o total de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado a temperatura moderada (a partir de 15ºC evitando temperaturas desnaturalizantes), preferentemente a temperatura ambiente o menos de 45ºC.
- (d)
- conservación de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado en un envoltorio limpio y aséptico durante el tiempo necesario hasta su uso.
- (e)
- recuperación del péptido o proteína inmovilizado mediante el paso a través de la matriz de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de dicha matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.
La presente invención describe concretamente el
uso de matrices sólidas o semi-sólidas compuestas
por cualquier material poroso, fibroso o reticular que permita el
paso de líquidos, preferentemente alguno de los siguientes
materiales o sus derivados: celulosas, agarosas, poliacrilatos,
polimetacrilatos, polivinilos, chitosanos, poliestirenos y
cualquier polímero natural o de síntesis derivatizable con
estructura porosa o fibrosa. En general, puede usarse cualquier
polímero caracterizado por tener una alta relación
superficie/volumen y que suelen ser utilizados como soportes de
purificación sólidos o semi-sólidos en
cromatografia de afinidad para purificación de péptidos o proteínas.
Asimismo se describe que dichas matrices estarían derivatizadas con
compuestos que tienen afinidad por secuencias específicas o
etiquetas (tags) presentes en los péptidos o proteínas a conservar.
Concretamente, la unión a la matriz se produce por medio de una
zona del péptido o proteína que no afectaría a su actividad o
funcionalidad, ya que las etiquetas o tags suelen fusionarse al
extremo amino o carboxilo terminal del péptido o proteína,
manteniendo una distancia con los sitios activos suficiente para que
ambos dominios o regiones no interaccionen.
Preferentemente se utilizarían matrices
derivatizadas con alguno de los siguientes compuestos: ácido
iminodiacético (IDA) o ácido nitrilotriacético (NTA) unidos a
metales dicatiónicos como el níquel (Ni), el cobalto (Co) o el cobre
(Cu); aminas terciarias o cuaternarias como el dietilaminoetanol
(DEAE) o el trimetilamonio (QAE); glutation; amilosa; avidina o
estreptavidina; calmodulina; proteína A; proteína G; o cualquier
otro compuesto que permita la purificación por cromatografia de
afinidad de péptidos o proteínas conocidos por los expertos en
dicha materia. Las etiquetas o tags que permiten la unión por
afinidad a los grupos funcionales presentes en las matrices pueden
ser preferentemente colas de histidinas (Histag), dominios de unión
a colina (Lytag), glutation S-transferasa
(GST-tag), maltose binding protein
(MBP-tag), biotina o Streptag, calmodulin binding
domain (CBD-tag) o calmodulin binding protein
(CBP-tag) o calmodulin regulated proteins,
secuencias totales o parciales de cadenas pesadas de
inmunoglobulinas, o cualquier otro tipo de etiqueta que permita la
purificación por cromatografia de afinidad de péptidos o proteínas
conocidas por los expertos en dicha materia.
También se describe en la presente invención que
los péptidos o proteínas conservados en las matrices, pueden ser
recuperados a solución acuosa mediante el paso a través de la matriz
de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión
por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los
grupos funcionales de dicha matriz sólida o
semi-sólida derivatizada. Preferentemente se
utilizarían alguno de los siguientes compuestos: imidazol; colina;
glutation; maltosa; biotina; agentes quelantes del calcio;
soluciones ácidas; o cualquier otro compuesto que permita la
elución de péptidos o proteínas unidas por afinidad a soportes
cromatográficos conocidos por los expertos en la materia.
A partir del método para conservar péptidos o
proteínas y de la variedad de compuestos descritos anteriormente,
puede utilizarse alguna de las configuraciones descritas en la
siguiente tabla:
Las características más novedosas y ventajosas
del objeto de la presente invención se pueden resumir en los
siguientes puntos:
- 1.
- La inmovilización de péptidos o proteínas en matrices sólidas o semi-sólidas que son deshidratadas parcial o totalmente permite conservar dichos péptidos o proteínas por periodos de tiempo desde varias horas a varios meses a temperatura ambiente (aproximadamente 18-25ºC) sin necesidad de refrigeración. De la misma forma se podrían conservar una gran proporción de péptidos o proteínas por periodos de tiempo superiores a menor temperatura.
- 2.
- El uso de matrices sólidas o semi-sólidas derivatizadas permite conservar directamente péptidos o proteínas etiquetados que hayan sido purificados previamente, o estén contenidos en extractos de células que los expresen o cualquier otro formato soluble no purificado.
- 3.
- Frente a otros métodos de conservación péptidos o proteínas, el método descrito tiene la ventaja de que puede realizarse en un periodo de tiempo corto y no requiere instrumentos costosos ni voluminosos.
- 4.
- El método descrito evita los procesos de congelación-descongelación, que pueden provocan alteraciones en la estructura y/o actividad de los péptidos y proteínas a conservar, así como los cambios físico-químicos y los fenómenos de higroscopicidad aparecidos durante los procesos de liofilización.
- 5.
- El método descrito también puede evitar el uso de agentes estabilizantes, que pueden interferir con la aplicación posterior del péptido o proteína.
Mediante el empleo de técnicas habituales en
laboratorios bioquímicos, la presente invención comprende también
el uso de un conjunto de útiles (kits) o dispositivos que permitan
realizar el método para conservar péptidos o proteínas etiquetados,
caracterizados porque incluyen:
- (a)
- una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada en forma de membrana para la inmovilización del péptido o proteína etiquetado.
- (b)
- un soporte para contener la matriz y pasar a través de ella los distintos fluidos o soluciones utilizados, con las dimensiones y estanqueidad apropiadas para que encaje la matriz y todo el flujo pase necesariamente a través de su superficie derivatizada.
- (c)
- tubos o jeringas acoplables al soporte para introducir el fluido o solución que contiene el péptido o proteína etiquetado, la solución de lavado de la matriz, y la solución de recuperación con componentes específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.
- (d)
- un dispositivo que permita ejercer la presión necesaria para que los distintos fluidos o soluciones utilizados pasen a través de la matriz, que puede ser por ejemplo: un émbolo acoplado a la jeringa (Figura 1a); una salida del soporte acoplable a un sistema de vacío (Figura 1b); un tubo acoplable al soporte compatible con sistemas de centrifugación (Figura 1c).
- (e)
- envoltorio para la conservación y/o envío de matriz con el péptido o proteína inmovilizado.
- (f)
- solución de lavado de la matriz.
- (g)
- solución de recuperación con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.
Asimismo, el objeto de la invención comprende la
utilización de este método, mediante dichos kits o dispositivos,
para conservar y/o transportar péptidos o proteínas de interés
sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico, industrial o en el
campo de la investigación en ciencias de la vida, sin necesidad de
refrigeración con objeto de:
- 1.
- conservar péptidos o proteínas que serán utilizadas para estudio como muestras o controles en ensayos biológicos, inmunológicos, bioquímicos o analíticos.
- 2.
- intercambiar péptidos o proteínas de interés entre laboratorios de centros públicos o empresas privadas.
- 3.
- envío péptidos o proteínas para inmunizar animales de laboratorio con el fin de obtener anticuerpos contra dichos péptidos o para investigación sobre vacunas.
Ejemplo
1
El presente ejemplo describe como conservar a
temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado
proteínas etiquetadas con colas de histidinas (Histag) en membranas
derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha
etiqueta.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen
forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.65 mm de grosor, y están
derivatizadas con IDA-Ni. En primer lugar, se
colocan cuatro discos de membrana en el interior de un soporte de
propileno para filtración con las dimensiones apropiadas
(support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se
lavan con 10 ml de una solución de lavado compuesta por 50 mM tampón
fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y 10 mM imidazol, utilizando
una jeringa acoplada al soporte.
La proteína a conservar, 1 mg de green
fluorescen protein (GFP) fusionada en su extremo carboxilo
terminal a un Histag (GFP-Histag), se disuelve en 10
ml de la solución de lavado y se pasa dos veces a través del
soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada.
Después se lavan los discos de membrana con 25 ml de la solución de
lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se
secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60
min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de
petri, etc). Estos discos de membrana con la proteína inmovilizada
se introducen en una placa de petri y se envían a otro laboratorio,
por sistemas de correo-mensajería convencionales a
temperatura ambiente, donde tras 15 días es utilizada por un
usuario distinto en la siguiente fase del ensayo.
Para recuperar la proteína inmovilizada en los
discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y
se lavan con 10 ml de la solución de lavado, utilizando una jeringa
acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con
los discos de membrana 5 ml de una solución de recuperación
compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y
250 mM imidazol, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el
resultado en un tubo limpio. La figura 2 muestra un esquema general
del procedimiento y los materiales empleados. La figura 3 muestra
los resultados de este ejemplo analizados por
SDS-PAGE en geles con 12% de acrilamida teñidos con
Coomassie. Como puede observarse, la casi totalidad de la
GFP-Histag es inmovilizada a su paso a través de
los discos de membrana, y puede recuperarse fácilmente a solución
pasando a través de los discos de membrana la solución de
recuperación.
\newpage
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo
2
El presente ejemplo describe como conservar a
temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado
proteínas etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag) en
membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad
por dicha etiqueta.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen
forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están
derivatizadas con DEAE (dietilaminoetilo). En primer lugar, se
colocan seis discos de membrana en el interior de un soporte de
propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support
de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10
ml de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato
potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando
una jeringa acoplada al soporte.
La proteína a conservar, 1 mg de proteína A
fusionada en su extremo amino terminal a un Lytag
(Lytag-proteína A) usando un kit comercial de
Biomedal, se disuelve en 10 ml de la solución de lavado y se pasa
dos veces a través del soporte con los discos de membrana,
utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de
membrana con 25 ml de la solución de lavado. Entonces se extraen los
discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente
durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio
(campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de
membrana con la proteína inmovilizada se introducen en una placa de
petri y se envían a otro laboratorio, por sistemas de
correo-mensajería convencionales a temperatura
ambiente, donde tras 15 días es utilizada por un usuario distinto en
la siguiente fase del ensayo.
Para recuperar la proteína inmovilizada en los
discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y
se lavan con 10 ml de la solución de lavado, utilizando una jeringa
acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con
los discos de membrana 5 ml de una solución de recuperación
compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y
250 mM cloruro de colina, utilizando la jeringa acoplada y
recogiendo el resultado en un tubo limpio. La figura 4 muestra los
resultados de este ejemplo analizados por SDS-PAGE
en geles con 12% de acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede
observarse, la casi totalidad del polipéptido de fusión
Lytag-proteína A es inmovilizado a su paso a través
de los discos de membrana, y puede recuperarse fácilmente a
solución pasando a través de los discos de membrana la solución de
recuperación.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El presente ejemplo describe como proteínas
etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag) mantienen su
estructura y/o actividad cuando son conservadas inmovilizadas a
temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado en
membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad
por dicha etiqueta, y también cuando son recuperadas nuevamente a
solución acuosa.
Las proteínas fluorescentes utilizadas, GFPmut3,
ECFP, EYFP y EGFP (Cormack, B.P., et al (1996). Gene,
173, 33-38; Heim, R., et al (1994)
Proc Natl Acad Sci, 91, 12501-12504; Ormö,
M. et al (1996) Science, 273,
1392-1395; Prasher, D. C., et al (1992)
Gene, 111, 229-233), fueron fusionadas en su
extremo amino terminal a un Lytag (Lytag-GFPmut3;
Lytag-ECFP; Lytag-EYFP; y
Lytag-EGFP) y expresadas en E. coli usando
el sistema CASCADE-LYTAG comercial de Biomedal. Las
membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5
cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están derivatizadas con DEAE.
En primer lugar, se colocan cuatro discos de membrana en el
interior de un soporte de propileno para filtración con las
dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex
polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 ml de una solución
de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM
NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando una jeringa acoplada al
soporte.
Extractos de cultivos de E. coli que
superexpresan las distintas proteínas fluorescentes fusionadas a
Lytag, se pasan dos veces a través del soporte con los discos de
membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los
discos de membrana con 25 ml de la solución de lavado. Entonces se
extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura
ambiente durante al menos 30-60 minutos en un
ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc).
Estos discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes
inmovilizadas se conservan a temperatura ambiente durante 24 horas.
Tras este periodo de tiempo se analiza la fluorescencia de dichas
proteínas observándolas bajo una lámpara de luz ultravioleta.
Después, se colocan estos discos de membrana con las distintas
proteínas fluorescentes inmovilizadas en el interior del soporte y
se lavan con 10 ml de la solución de lavado, utilizando una jeringa
acoplada al soporte. Seguidamente, se pasan a través del soporte
con los discos de membrana 2 ml de una solución de lavado compuesta
por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 250 mM
cloruro de colina, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo los
resultados en tubos limpios. Estos tubos, con las distintas
proteínas fluorescentes en solución acuosa, así como los discos de
membrana utilizados son analizados bajo una lámpara de luz
ultravioleta. La figura 5 muestra los resultados de este ejemplo.
Como puede observarse, las distintas proteínas fluorescentes
mantienen su estructura y/o actividad cuando son conservadas en las
membranas derivatizadas, y también cuando son recuperadas
nuevamente a solución acuosa.
\newpage
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El presente ejemplo describe como conservar a
temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado
anticuerpos o inmunoglobulinas en membranas derivatizadas con
proteína A inmovilizada.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen
forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están
derivatizadas con DEAE (dietilaminoetilo). En primer lugar, se
colocan tres discos de membrana en el interior de un soporte de
propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support
de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10
ml de una solución de inmovilización compuesta por 20 mM tampón
fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina,
utilizando una jeringa acoplada al soporte. Seguidamente, se
disuelve 1 mg de proteína A fusionada en su extremo amino terminal
a un Lytag (Lytag-proteína A) en 10 ml de la
solución de inmovilización y se pasa dos veces a través del soporte
con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después
se lavan los discos de membrana con 25 ml de la solución de
inmovilización. Estos discos de membrana con
Lytag-proteína A inmovilizada se utilizan para
conservar anticuerpos o inmunoglobulinas.
El anticuerpo monoclonal a conservar, 2.5 mg de
inmunoglobulina IgG_{2a} de ratón, se disuelve en 10 ml de una
solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH
7.0 y se pasa cuatro veces a través del soporte con los discos de
membrana con Lytag-proteína A inmovilizada,
utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de
membrana tres veces con 20 ml de la solución de lavado. Entonces se
extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura
ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente
limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos
discos de membrana con el anticuerpo o inmunoglobulina inmovilizado
se conservan a temperatura ambiente durante 24 horas.
Para recuperar anticuerpo o inmunoglobulina
inmovilizado en los discos de membrana, estos se colocan en el
interior del soporte y se lavan con 10 ml de la solución de lavado,
utilizando una jeringa acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a
través del soporte con los discos de membrana 6 ml de una solución
de recuperación compuesta por 1 M Tris-HC1 pH 9.0,
utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el resultado en
fracciones de 2 ml. La figura 6 muestra los resultados de este
ejemplo analizados por SDS-PAGE en geles con 10% de
acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede observarse: (i) en la
primera fase del ensayo se consigue saturar los discos de membrana
con Lytag-proteína A, para evitar interacciones
inespecíficas entre el anticuerpo y los discos de membrana; (ii)
una porción importante del anticuerpo o inmunoglobulina es
inmovilizado a su paso a través de los discos de membrana con
Lytag-proteína A; (iii) dicho anticuerpo o
inmunoglobulina puede recuperarse a solución pasando a través de
los discos de membrana la solución de recuperación.
La proteína LYTAG-proteína A
podría previamente ser inmovilizada a la membrana por activación de
una unión covalente a la membrana por agentes que lo conjuguen y
que son conocidos por expertos en la materia. De esta forma, el
anticuerpo puede ser despegado de la membrana sin dicha proteína,
usando una solución de pH ácido y decepcionando la inmunoglobulina
en una solución tamponada.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
El presente ejemplo describe como proteínas
etiquetadas con colas de histidinas (Histag) mantienen su
estructura y/o actividad cuando son conservadas inmovilizadas a
temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado en
membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad
por dicha etiqueta.
Las membranas empleadas en este ejemplo tienen
forma de láminas adaptables a equipos de Vacuum Manifold para hacer
Dot-Blot, y están derivatizadas con
IDA-Ni. En primer lugar, se incuban las láminas de
membrana durante 10 min a temperatura ambiente en una solución de
lavado compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM
NaCl y 10 mM imidazol. Seguidamente, se colocan las láminas de
membrana en el interior de un equipo de Vacuum Manifold con
adaptador para hacer Dot-Blot conectado a un
sistema de vacío, y por cada uno de los pocillos se pasan 0.2 ml de
extractos de cultivos de E. coli que superexpresan
\beta-galactosidasa fusionada en su extremo amino
terminal a un Histag
(Histag-\beta-galactosidasa).
Después se lavan los pocillos con 4 ml de la solución de lavado.
Entonces se extraen las láminas de membrana del equipo de Vacuum
Manifold y se secan a temperatura ambiente durante al menos
30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo
laminar). Cada uno de los puntos (dots) se recortan en segmentos de
igual tamaño y se conservan a temperatura ambiente hasta su
utilización en el ensayo de actividad
\beta-galactosidasa. La figura 7 muestra que la
Histag-\beta-galactosidasa
conservada en láminas de membrana mantiene al menos un 50% de su
actividad inicial después de 15 días a temperatura ambiente.
Figura 1. Esquema reflejando distintas formas de
hacer pasar a través de la matriz derivatizada el fluido o solución
que contiene el péptido o proteína etiquetado. Puede utilizarse: un
soporte con la matriz en su interior, al que se le acopla una
jeringa con émbolo para introducir el fluido o solución y ejercer
la presión necesaria (a); un soporte con la matriz en su interior y
con una salida a un sistema de vacío para ejercer la presión
necesaria, al que se le acopla una jeringa para introducir el fluido
o solución (b); o bien, un soporte con la matriz en su interior
adaptable a un tubo compatible con sistemas de centrifugación para
ejercer la presión necesaria (c). La flecha negra muestra donde se
dispone la matriz en cada uno de los ejemplos.
Figura 2. Esquema general del método de
conservación y recuperación de proteínas etiquetadas en membranas
derivatizadas.
Figura 3. Conservación y recuperación de
GFP-Histag en membranas derivatizadas con
IDA-Ni. Marcador de pesos moleculares (M); solución
de GFP-Histag antes de su paso por los discos de
membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2);
solución de GFP-Histag recuperada de los discos de
membrana (3).
Figura 4. Conservación y recuperación de
Lytag-proteína A en membranas derivatizadas con
DEAE. Marcador de pesos moleculares (M); solución de
Lytag-proteína A antes de su paso por los discos de
membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2);
solución de Lytag-proteína A recuperada de los
discos de membrana (3).
Figura 5. Actividad de proteínas fluorescentes
conservadas y recuperadas en membranas derivatizadas con DEAE.
Proteínas fluorescentes: control sin proteínas (1);
Lytag-GFPmut3 (2); Lytag-ECFP (3);
Lytag-EYFP (4); y Lytag-EGFP (5).
Discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes
inmovilizadas (A). Soluciones acuosas con las distintas proteínas
fluorescentes recuperadas de los discos de membrana (B). Discos de
membrana tras recuperar a solución acuosa las distintas proteínas
fluorescentes (C).
Figura 6. Conservación y recuperación de un
anticuerpo o inmunoglobulina en membranas derivatizadas con
proteína A inmovilizada. Marcador de pesos moleculares (M);
solución de Lytag-proteína A antes de su paso por
los discos de membrana (1) y después de su paso por los discos de
membrana (2); lavado de los discos de membrana con proteína A
inmovilizada (3); solución de anticuerpo o inmunoglobulina (IgG)
antes de su paso por los discos de membrana con proteína A
inmovilizada (4) y después de su paso por los discos de membrana
con proteína A inmovilizada (5); 1^{er}, 2º y 3^{er} lavado de
los discos de membrana con el anticuerpo o inmunoglobulina
inmovilizado (6-8); distintas fracciones con el
anticuerpo o inmunoglobulina recuperado de los discos de membrana
(9-11).
Figura 7. Estabilidad de
Histag-\beta-galactosidasa
conservada en membranas derivatizadas.
Claims (13)
1. Método para conservar o almacenar péptidos o
proteínas etiquetados mediante su unión reversible a matrices
sólidas o semi-sólidas derivatizadas que incluye las
siguientes etapas:
- (a)
- paso de un fluido o solución que contenga el péptido o proteína etiquetado a través de una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada, en condiciones tales que la etiqueta (tag) del péptido o proteína se une por afinidad a los grupos funcionales presentes en dicha matriz.
- (b)
- paso de una solución de lavado a través de la matriz para eliminar el resto de material biológico, péptidos o proteínas, u otras sustancias del fluido o solución no unidos a la matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.
- (c)
- secado parcial o total de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado a temperatura moderada (desde 12º a 60ºC), preferentemente a temperatura ambiente.
- (d)
- conservación de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado en un envoltorio limpio y aséptico durante el tiempo necesario hasta su uso.
- (e)
- recuperación del péptido o proteína inmovilizado mediante el paso a través de la matriz de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de dicha matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.
2. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según la reivindicación 1, caracterizado porque
las matrices están derivatizadas con compuestos que tienen afinidad
por las etiquetas (tags) presentes en dichos péptidos o
proteínas.
3. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado
porque la matriz está compuesta por cualquier material poroso,
fibroso o reticular que permita el paso de líquidos.
4. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado
porque la matriz está compuesta por cualquier polímero caracterizado
por tener una alta relación superficie/volumen y que suelen ser
utilizados como soportes de purificación sólidos o
semi-sólidos en cromatografia de afinidad para
purificación de péptidos o proteínas.
5. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque la matriz está compuesta por alguno de los siguientes
materiales o sus derivados: celulosas, agarosas, poliacrilatos,
polimetacrilatos, polivinilos, chitosanos, poliestirenos y
cualquier polímero natural o de síntesis derivatizable con
estructura porosa o fibrosa.
6. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado
porque la matriz está compuesta por celulosa o cualquiera de sus
derivados.
7. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según las reivindicaciones de 1 a 3,
caracterizado porque la matriz está derivatizada con alguno
de los siguientes compuestos: ácido iminodiacético (IDA) o ácido
nitrilotriacético (NTA) unidos a metales dicatiónicos como el
níquel (Ni), el cobalto (Co) o el cobre (Cu); aminas terciarias o
cuaternarias como el dietilaminoetanol (DEAE) o el trimetilamonio
(QAE); glutation; amilosa; avidina o estreptavidina; calmodulina;
proteína A; proteína G; o cualquier otro compuesto que permita la
purificación por cromatografia de afinidad de péptidos o proteínas
conocidos por los expertos en dicha materia.
8. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según las reivindicaciones de 1 a 3,
caracterizado porque la matriz está derivatizada con ácido
iminodiacético (IDA) o ácido nitrilotriacético (NTA) unidos a
metales dicatiónicos como el níquel (Ni), el cobalto (Co) o el
cobre (Cu).
9. Método para conservar péptidos o proteínas
etiquetados según las reivindicaciones de 1 a 3,
caracterizado porque la matriz está derivatizada con aminas
terciarias o cuaternarias como el dietilaminoetanol (DEAE) o el
trimetilamonio (QAE).
10. Utilización del método para conservar
péptidos o proteínas etiquetados de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para conservar péptidos o proteínas con
alguna de las siguientes etiquetas o tags: colas de histidinas
(Histag), dominios de unión a colina (Lytag), glutation
S-transferasa (GST-tag), maltose
binding protein (MBP-tag), biotina o Streptag,
calmodulin binding domain (CBD-tag) o calmodulin
binding protein (CBP-tag) o calmodulin regulated
proteins, secuencias totales o parciales de cadenas pesadas de
inmunoglobulinas, o cualquier otro tipo de etiqueta que permita la
purificación por
\hbox{cromatografia de afinidad de péptidos o
proteínas conocidas por los expertos en dicha materia.} 11. Utilización del método para conservar
péptidos o proteínas etiquetados de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para conservar péptidos o proteínas
etiquetados con colas de histidinas (Histag).
12. Utilización del método para conservar
péptidos o proteínas etiquetados de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, para conservar péptidos o proteínas
etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag).
13. Conjunto de útiles (kit) para realizar el
método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
caracterizado porque comprende al menos tres de los
siguientes componentes:
- (a)
- una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada en forma de membrana para la inmovilización del péptido o proteína etiquetado;
- (b)
- un soporte para contener la matriz y pasar a través de ella los distintos fluidos o soluciones utilizados, con las dimensiones y estanqueidad apropiadas para que encaje la matriz y todo el flujo pase necesariamente a través de su superficie derivatizada;
- (c)
- tubos o jeringas acoplables al soporte para introducir el fluido o solución que contiene el péptido o proteína etiquetado, la solución de lavado de la matriz, y la solución de recuperación con componentes específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada;
- (d)
- un dispositivo que permita ejercer la presión necesaria para que los distintos fluidos o soluciones utilizados pasen a través de la matriz, que puede ser por ejemplo: un embolo acoplado a la jeringa (Figura 1a); una salida del soporte acoplable a un sistema de vacío (Figura 1b); un tubo acoplable al soporte compatible con sistemas de centrifugación (Figura 1c);
- (e)
- envoltorio para la conservación y/o envío de matriz con el péptido o proteína inmovilizado;
- (f)
- solución de lavado de la matriz;
- (g)
- solución de recuperación con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702475A ES2319061B1 (es) | 2007-09-11 | 2007-09-11 | Metodo de conservacion de peptidos o proteinas. |
| PCT/ES2008/000579 WO2009034204A1 (es) | 2007-09-11 | 2008-09-05 | Método de conservación de péptidos o proteínas |
| US12/682,690 US8283125B2 (en) | 2007-09-11 | 2008-09-05 | Peptide and protein preservation method |
| EP08830430A EP2196471A4 (en) | 2007-09-11 | 2008-09-05 | PEPTIDE AND PROTEIN CONSERVATION PROCESS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200702475A ES2319061B1 (es) | 2007-09-11 | 2007-09-11 | Metodo de conservacion de peptidos o proteinas. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2319061A1 ES2319061A1 (es) | 2009-05-01 |
| ES2319061B1 true ES2319061B1 (es) | 2010-02-10 |
Family
ID=40451606
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200702475A Expired - Fee Related ES2319061B1 (es) | 2007-09-11 | 2007-09-11 | Metodo de conservacion de peptidos o proteinas. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8283125B2 (es) |
| EP (1) | EP2196471A4 (es) |
| ES (1) | ES2319061B1 (es) |
| WO (1) | WO2009034204A1 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8993715B2 (en) * | 2009-07-06 | 2015-03-31 | Canon Kabushiki Kaisha | Labeled protein and method for obtaining the same |
| WO2012018294A1 (en) * | 2010-08-05 | 2012-02-09 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method for storage and stabilization of a target substance |
| US10392611B2 (en) | 2013-05-30 | 2019-08-27 | Duke University | Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same |
| US10364451B2 (en) | 2013-05-30 | 2019-07-30 | Duke University | Polymer conjugates having reduced antigenicity and methods of using the same |
| ES2502691B1 (es) * | 2013-09-25 | 2015-07-07 | Sani-Red, S.L. | Método de conservación y estabilización de proteínas, aplicable para desarrollos industriales de formulaciones de productos sanitarios, farmacéuticos y cosméticos |
| US10385115B2 (en) | 2015-03-26 | 2019-08-20 | Duke University | Fibronectin type III domain-based fusion proteins |
| US11458205B2 (en) | 2015-08-04 | 2022-10-04 | Duke University | Genetically encoded intrinsically disordered stealth polymers for delivery and methods of using same |
| MA45489A (fr) | 2015-10-22 | 2018-08-29 | Juno Therapeutics Gmbh | Procédés de culture de cellules, kits et appareil associés |
| US11752213B2 (en) | 2015-12-21 | 2023-09-12 | Duke University | Surfaces having reduced non-specific binding and antigenicity |
| US11467156B2 (en) | 2016-06-01 | 2022-10-11 | Duke University | Nonfouling biosensors |
| RU2019110848A (ru) | 2016-09-14 | 2020-10-15 | Дьюк Юниверсити | Наночастицы на основе триблочных полипептидов для доставки гидрофильных лекарственных средств |
| KR20190064600A (ko) | 2016-09-23 | 2019-06-10 | 듀크 유니버시티 | Lcst 거동을 갖는 비구조화된 비-반복적 폴리펩티드 |
| WO2018132732A1 (en) | 2017-01-12 | 2018-07-19 | Duke University | Genetically encoded lipid-polypeptide hybrid biomaterials that exhibit temperature triggered hierarchical self-assembly |
| NZ758485A (en) | 2017-04-27 | 2024-02-23 | Juno Therapeutics Gmbh | Oligomeric particle reagents and methods of use thereof |
| WO2018213320A1 (en) | 2017-05-15 | 2018-11-22 | Duke University | Recombinant production of hybrid lipid-biopolymer materials that self-assemble and encapsulate agents |
| WO2019006374A1 (en) | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Duke University | ORDER AND DISORDER AS A DESIGN PRINCIPLE FOR STIMULI-SENSITIVE BIOPOLYMER NETWORKS |
| CN107652352B (zh) * | 2017-10-31 | 2021-02-26 | 苏州博进生物技术有限公司 | 一种用于组氨酸标签蛋白纯化的亲和层析介质 |
| EP3829622A4 (en) | 2018-08-02 | 2022-05-11 | Duke University | DUAL AGONIST FUSION PROTEINS |
| US11512314B2 (en) | 2019-07-12 | 2022-11-29 | Duke University | Amphiphilic polynucleotides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5691152A (en) * | 1995-11-09 | 1997-11-25 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Stable avidin composition |
| US6268191B1 (en) * | 1998-09-21 | 2001-07-31 | Robert K. Prud'homme | Enzyme immobilization by imbibing an enzyme solution into dehydrated hydrocolloid gel beads |
| US20040229330A1 (en) * | 2003-02-27 | 2004-11-18 | Bayer Pharmaceuticals Corporation | Integrated method for capture and purification of tagged proteins |
| TW200517398A (en) * | 2003-11-21 | 2005-06-01 | Ind Tech Res Inst | Method for recombinant protein purification, modification and immobilization |
-
2007
- 2007-09-11 ES ES200702475A patent/ES2319061B1/es not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-09-05 EP EP08830430A patent/EP2196471A4/en not_active Withdrawn
- 2008-09-05 WO PCT/ES2008/000579 patent/WO2009034204A1/es active Application Filing
- 2008-09-05 US US12/682,690 patent/US8283125B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2009034204A1 (es) | 2009-03-19 |
| US20100256301A1 (en) | 2010-10-07 |
| EP2196471A4 (en) | 2011-08-24 |
| US8283125B2 (en) | 2012-10-09 |
| ES2319061A1 (es) | 2009-05-01 |
| EP2196471A1 (en) | 2010-06-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2319061B1 (es) | Metodo de conservacion de peptidos o proteinas. | |
| Cheung et al. | Immobilized metal ion affinity chromatography: a review on its applications | |
| Ueda et al. | Current and prospective applications of metal ion–protein binding | |
| CN100500837C (zh) | 分离分子的方法 | |
| TWI392685B (zh) | 利用親和力色析之連續蛋白質分離及純化流程 | |
| US8198409B2 (en) | Polypeptide, an affinity chromatography material, and a method for separating and/or purifying immunoglobulin | |
| CN113980089A (zh) | 一种检测试样中的细胞外膜囊泡的方法和检测用试剂盒的用途 | |
| Petty | Metal‐chelate affinity chromatography | |
| ES2862580T3 (es) | Procesos de purificación por captura para proteínas expresadas en un sistema no de mamífero | |
| EP2555918A1 (en) | Stabilized chemical dehydration of biological material | |
| CA2455499A1 (en) | Method for purification of viral vectors having proteins which bind sialic acid | |
| CN105358565B (zh) | 多孔基质蛋白递送与功能强化 | |
| JP7094565B2 (ja) | ストレプトアビジン突然変異タンパク質およびそれらを使用する方法 | |
| EP2949750A1 (en) | Antibody-binding peptide | |
| Kielkopf et al. | Purification of polyhistidine-tagged proteins by immobilized metal affinity chromatography | |
| JPWO2014034457A1 (ja) | ミックスモード抗体アフィニティー分離マトリックスとそれを用いた精製方法および標的分子 | |
| CN110004169A (zh) | 一种难溶蛋白的表达、纯化方法及其应用 | |
| JPWO2017195641A1 (ja) | アフィニティ分離マトリックスの製造方法およびアフィニティ分離マトリックス | |
| Goldring | Concentrating proteins by salt, polyethylene glycol, solvent, SDS precipitation, three-phase partitioning, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, lyophilization, affinity chromatography, immunoprecipitation or increased temperature for protein isolation, drug interaction, and proteomic and peptidomic evaluation | |
| WO2018092867A1 (ja) | ＩｇＧ結合ペプチドを含む固相担体及びＩｇＧの分離方法 | |
| WO2012083424A1 (en) | Novel amino acid linker sequences for ligand immobilization | |
| O’Shaughnessy et al. | Purification of proteins from baculovirus-infected insect cells | |
| JP6818305B2 (ja) | 非天然型立体構造を形成した抗体に親和性を示すポリペプチド | |
| US9797871B2 (en) | Method for storage and stabilization of a target substance | |
| US10844112B2 (en) | Method for purifying antibody or antibody fragment containing κ-chain variable region |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EC2A | Search report published |
Date of ref document: 20090501 Kind code of ref document: A1 |
|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 2319061B1 Country of ref document: ES |
|
| FD2A | Announcement of lapse in spain |
Effective date: 20211122 |