ES2324645T3 - Cambios de tasa metabolica en fermentaciones que expresen proteinas recombinantes. - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar el rendimiento de producto de un polipéptido de interés producido por células hospedadoras recombinantes, en el que la expresión del polipéptido por las células hospedadoras recombinantes está regulada por un sistema inducible, comprendiendo dicho método (a) cultivar las células hospedadoras recombinantes en condiciones de alta tasa metabólica y de crecimiento; y (b) reducir la tasa metabólica de las células hospedadoras recombinantes en el momento de la inducción de la expresión de polipéptido.

Description

Cambios de tasa metabólica en fermentaciones que expresan proteínas recombinantes.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a mejoras en el rendimiento de producto de fermentación para producir proteínas recombinantes, particularmente en sistemas procariotas y eucariotas sencillos. Más particularmente, esta invención aumenta enormemente el rendimiento de proteínas ensambladas apropiadamente en fermentaciones a gran escala.

Antecedentes de la invención

La producción de grandes cantidades de polipéptidos y proteínas biológicamente activos, relativamente puros es importante económicamente para la fabricación de formulaciones farmacéuticas humanas y animales, enzimas y otros agentes químicos de especialidad. Las técnicas de ADN recombinante se han convertido en el método de elección para producir grandes cantidades de proteínas exógenas usando bacterias y otras células hospedadoras. La expresión de proteínas mediante técnicas de ADN recombinante para la producción de células o partes de células que funcionen como biocatalizadores también es una aplicación importante.

La producción de proteína recombinante implica transfectar células hospedadoras con ADN que codifica la proteína y cultivar las células en condiciones que favorezcan la expresión de la proteína recombinante. Se prefiere el procariota E. coli como hospedador porque puede hacerse que produzca proteínas recombinantes con altos rendimientos. Existen numerosas patentes de Estados Unidos sobre expresión bacteriana en general de ADN que codifica proteínas, incluyendo la Patente de Estados Unidos Nº 4.565.785 sobre una molécula de ADN recombinante que comprende un gen bacteriano para una proteína transportadora extracelular o periplásmica y un gen no bacteriano; la Patente de Estados Unidos Nº 4.673.641 sobre la coproducción de un polipéptido extraño con un polipéptido formador de agregados; la Patente de Estados Unidos Nº 4.738.921 sobre un vector de expresión con un promotor/operador de trp y fusión de trp LE con un polipéptido tal como IGF-I; Patente de Estados Unidos Nº 4.795.706 sobre la expresión de secuencias de control para incluir con una proteína extraña; Patente de Estados Unidos Nº 4.710.473 sobre plásmidos de ADN circular específicos tales como los que codifican IGF-I; Patente de Estados Unidos Nº 5.342.763 sobre mejorar la expresión en bacterias mediante la manipulación del suministro de oxígeno; y Patente de Estados Unidos Nº 5.639.635 sobre la secreción de la proteína expresada al periplasma bacteriano.

En Cruz et al., Biotechnol. Bioeng. 1999, 66: 104-13, se investigan los mecanismos reguladores del metabolismo y la formación del producto en células de riñón de cría de hámster eucariotas que producen una proteína recombinante. Sin embargo, el artículo expone que no podían observarse efectos de concentraciones de glucosa o glutamina sobre la productividad específica de célula y concluye que pueden obtenerse títulos de producto final crecientes aumentando la concentración celular y la duración del cultivo.

Las proteínas recombinantes se abaratan si se mejora el rendimiento de fermentación. El rendimiento depende de la velocidad a la que la proteína recombinante se pliega apropiadamente y se forma proteína ensamblada y de la duración de tiempo durante el que se produce la proteína.

La velocidad de expresión de proteína recombinante se ve típicamente afectada por el crecimiento y las tasas metabólicas de las células. A velocidades de crecimiento superiores, la velocidad a la que puede expresarse una proteína cuando se induce típicamente aumenta (Curless et al. Biotechnol. Prog. 1990, 6: 149). Sin embargo, después de la inducción, altas velocidades de expresión de proteína pueden no siempre conducir a altas velocidades de formación de productos formados apropiadamente, activos. En otras palabras, aunque la cantidad de proteína traducida pueda maximizarse, otros factores pueden comprometer la calidad del producto, tales como la degradación de la proteína por proteasas u otras modificaciones post-traduccionales perjudiciales (Ryan et al., Biotechnol. Prog. 1996, 12: 596; Yoon et al., Biotechnol. Prog. 1994, 43: 995). Una fermentación eficaz requiere equilibrar la velocidad de crecimiento frente al rendimiento de proteína utilizable; soluciones intermedias entre estos factores dan como resultado una disminución del rendimiento global por debajo de su potencial teórico. Por consiguiente, algunas velocidades de crecimiento intermedias pueden ser más favorables para la producción de altas cantidades de producto de alta calidad.

Una complicación añadida es la inducción de la expresión de proteína recombinante, que esencialmente se apropia del proceso de ensamblaje de proteína celular para generar grandes cantidades de un producto sin beneficio y con frecuencia con un perjuicio significativo para la célula. De hecho, para casos en los que se desencadena la inducción mediante reducción de fosfato usando el promotor de fosfatasa alcalina, la velocidad de crecimiento se restringe radicalmente por la propia privación de fosfato. Sin embargo, este efecto no afecta a la tasa metabólica.

Por tanto, existe una necesidad en la técnica de aumentar el rendimiento de la producción de proteína recombinante utilizable. La presente invención aborda ventajosamente e inesperadamente esta necesidad permitiendo la síntesis, el ensamblaje y el plegamiento de altos niveles de proteínas. Debido a que diferentes factores pueden desempeñar papeles críticos en la maximización del rendimiento de proteína utilizable antes de la inducción durante la fase de crecimiento del cultivo y la post-inducción, el control independiente de estos dos factores puede conducir a rendimientos mejorados de productos utilizables, tal como para el caso de fragmentos de anticuerpos solubles apropiadamente plegados y ensamblados.

Sumario de la invención

La invención proporciona un método para aumentar el rendimiento de producto de un polipéptido de interés producido por células hospedadoras recombinantes, en el que la expresión del polipéptido por las células hospedadoras recombinantes está regulada por un sistema inducible. Más específicamente, el método implica cultivar las células hospedadoras recombinantes en condiciones de alta tasa metabólica y de crecimiento, reduciendo después la tasa metabólica de las células hospedadoras recombinantes en el momento de la inducción de la expresión del polipéptido.

En una realización específica, la invención proporciona un método para aumentar el rendimiento de producto de un anticuerpo, factor de crecimiento o proteasa producida por una célula hospedadora de E. coli recombinante regulada por un sistema inducible.

En una realización específica adicional, la invención proporciona un método para aumentar el rendimiento de proteínas activamente plegadas que tienen diferentes estructuras, por ejemplo, fragmentos de anticuerpos Fab_{2}' frente a Fab Fv, seleccionando el momento para iniciar una reducción en la tasa metabólica (el cambio de tasa), la velocidad de ajuste (cambio) de la tasa metabólica y la tasa metabólica final. El ajuste de estos parámetros de la invención aumenta el rendimiento de proteínas correctamente plegadas que tienen estructuras secundarias y terciarias diferentes, características de interacción y replegamiento, tamaño y área de contacto y otros factores que pueden afectar al ensamblaje y la función de proteínas.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra rendimiento anti-CD 18 (título) en una serie de fermentaciones de Fab'_{2} anti-CD 18. Eje X: tasa de captación de oxígeno aproximada que refleja la gravedad del cambio de tasa de uso de oxígeno.

La Figura 2 muestra el perfil de tasa de captación de oxígeno real de las fermentaciones en la Figura 1. Los títulos que superan 1000 mg/l se representa mediante una línea continua fina (-); los títulos entre 800-900 mg/l se representan mediante una línea de puntos (- - - - -); y el control sin cambio (\sim600 mg/l) se representa mediante una línea continua gruesa ().

La Figura 3 muestra los resultados de título para cuantificar producción de anticuerpo de los diversos procesamientos como una función del tiempo de fermentación. Un cambio menos grave se representa mediante cuadrados (- - -\boxempty- - -), un cambio más grave se representa mediante triángulos (\ding{115}- - -) y el control se representa mediante
rombos (\blacklozenge).

Las Figuras 4A y 4B muestran perfiles de título para una serie de fermentaciones anti-VEGF con (A) o sin (B) cambios de tasa de uso de oxígeno (OUR). Cada una de las gráficas presenta datos de tres procesamientos. El procesamiento 1 se representa mediante rombos (\blacklozenge), el procesamiento 2 se representa mediante cuadrados (\blacksquare) y el procesamiento 3 se representa mediante triángulos (\ding{115}).

Las Figuras 5A y 5B muestran perfiles de OUR para los procesamientos en la Figura 4. El procesamiento 1 se representa mediante rombos (\blacklozenge), el procesamiento 2 se representa mediante cuadrados (\blacksquare) y el procesamiento 3 se representa mediante triángulos (\ding{115}).

Descripción detallada

La presente invención proporciona ventajosamente un método para aumentar el rendimiento de una proteína recombinante heteróloga producida por células hospedadoras recombinantes, aumentando primero la capacidad de producción de proteína de las células en cultivo por cultivo de las células a una velocidad de crecimiento elevada y disminuyendo después la tasa metabólica de las células (cambio de tasa) para permitir un plegamiento o ensamblaje apropiado de la proteína heteróloga. En una realización específica, se descubrió que la aplicación de una alta velocidad de crecimiento prolongaba el periodo de expresión de gen heterólogo. En una realización específica adicional, el cambio de tasa metabólica aumenta el rendimiento de proteína apropiadamente plegada y, si es apropiado, ensamblada. Estas características, en conjunto, aumentan la eficacia de fermentación.

La invención se basa en observaciones en varias fermentaciones de Acaule que producen Fab'_{2} anti-CD 18 y Fab anti-VEGF, de que el cambio deliberado de reducción de velocidad de la tasa metabólica celular de las células (por manipulación de la tasa de transferencia de oxígeno y, proporcionalmente, de la tasa de suministro de glucosa en el fermentador) aumenta significativamente los rendimientos de producto. En particular, cultivar las células a una tasa metabólica relativamente alta y después reducir radicalmente la tasa metabólica después de la inducción de expresión de anticuerpo aumenta enormemente el rendimiento. Una cantidad sustancial de datos demuestra que este enfoque prolonga el periodo de ensamblaje de fragmentos de anticuerpo, conduciendo a títulos significativamente superiores.

Estos experimentos también establecían que para cualquier sistema de expresión de proteínas heterólogo dado, es decir, la naturaleza de la proteína y las características del hospedador, ajustar el cambio de tasa metabólica aumenta adicionalmente los rendimientos de proteína útil. Las variables de ajuste incluyen el ajuste del cambio de tasa metabólica, la velocidad de reducción (velocidad de disminución en la fuente de oxígeno o carbono/energía disponible o ambas) y la tasa metabólica final (nivel de oxígeno disponible, nivel de fuente de carbono/energía disponible o ambos).

Por consiguiente, post-inducción, la velocidad de expresión de proteína puede controlarse manipulando la tasa metabólica, siendo una media común de la misma la tasa de captación de oxígeno de las células en el fermentador. El control de la tasa metabólica puede lograrse controlando el suministro de la fuente de carbono primaria, comúnmente glucosa, con frecuencia junto con la manipulación de parámetros del fermentador tales como tasa de agitación y contrapresión, para controlar la tasa de transferencia de oxígeno a las células. A la inversa, el control de la tasa metabólica puede lograrse limitando el oxígeno disponible, junto con una reducción en la velocidad de suministro de glucosa. Existen elementos de compensación similares entre la velocidad de síntesis de proteína y la velocidad de formación de producto utilizable para controlar la tasa metabólica post-inducción como se ha analizado anteriormente para el control de la velocidad de crecimiento pre-inducción. Para el caso de maximizar el rendimiento de fragmentos de anticuerpo, la velocidad y el periodo de ensamblaje de producto soluble activo a partir de los polipéptidos de cadena ligera y de cadena pesada individuales se produce a cierta tasa metabólica post-inducción favorable.

Aunque los datos en la bibliografía sugieren que las fermentaciones pueden tener una velocidad de crecimiento favorable para la producción de proteína, los resultados en esta solicitud muestran que el cambio de tasas metabólicas en diferentes fases de la fermentación proporciona un beneficio crítico. En otras palabras, se observan rendimientos de producto significativamente mejorados cambiando la tasa metabólica en comparación con los títulos obtenidos por procesamiento de la fermentación a una tasa metabólica constante, previamente favorable. Aunque todos los datos hasta la fecha se han obtenido usando fermentaciones que producen fragmentos de anticuerpo en E. coli, este enfoque se aplica a una diversidad de proteínas, incluyendo hormona de crecimiento, expresada en otros sistemas procariotas y eucariotas sencillos.

Como se usa en este documento, las expresiones "reducir la tasa metabólica" o "reducir la velocidad de la tasa metabólica" significan alterar las condiciones de cultivo de célula hospedadora de modo que las células hospedadoras que están experimentando un crecimiento y expansión rápidos reducen (o detienen) el crecimiento y la expansión. Para el caso de células que ya estén en un estado de crecimiento reducido, se reducen las tasas de captación de oxígeno y las correspondientes tasas de captación de fuente de carbono/energía. Ya que, en el caso de células que respiran, las tasas metabólicas se determinan principalmente por la velocidad a la que la célula oxida la fuente de carbono/energía disponible usando el oxígeno disponible, la tasa metabólica puede reducirse limitando cualquiera de estos dos reactivos. De este modo, la reducción de tasa metabólica producirse por, entre otros (1) reducción de la cantidad de oxígeno disponible en el cultivo celular (es decir, fermentación); (2) reducción de la cantidad de fuentes de carbono/energía disponibles; o (3) reducción de ambos.

La expresión "oxígeno disponible" se refiere a oxígeno que puede usarse por las células, pudiendo efectuarse la "disminución de oxígeno disponible" por disminución de la velocidad de transferencia de oxígeno al cultivo o disminución de la transferencia de oxígeno por las células o ambos. Con frecuencia es deseable reducir la velocidad de suministro de glucosa (o fuente de carbono/energía alternativa) en la misma medida y, de este modo, la concentración de oxígeno disuelto puede disminuirse o no, dependiendo de qué reactivo limite más directamente la respiración.

Como se usa en este documento, la expresión "fuente de carbono/energía" se refiere a una fuente de carbono y energía para las células. Los ejemplos de dicha fuente incluyen glicerol, succinato, lactato y azúcares tales como, por ejemplo, glucosa, lactosa, sacarosa y fructosa. La selección de la fuente de carbono/energía particular a emplear dependerá principalmente de las características de la célula hospedadora. La fuente de carbono/energía preferida para fermentación en E. coli es glucosa.

Por tanto, la disminución de las fuentes de carbono/energía disponibles puede significar reducir la concentración o velocidad de suministro de la fuente de carbono/energía o reducir la velocidad de transferencia a las células hospedadoras o la captación por las células hospedadoras de la fuente de carbono/energía o ambos.

Como se usa en este documento, "cultivar las células hospedadoras en condiciones de alta tasa metabólica y de crecimiento" significa establecer las condiciones de cultivo de célula hospedadora para favorecer el crecimiento, por ejemplo, proporcionando velocidades de suministro de nutrientes, energía y oxígeno no limitadas o relativamente elevadas, de modo que las células tengan tasas de crecimiento y metabólicas rápidas, antes de reducir la tasa metabólica para aumentar "el rendimiento de producto". En estas condiciones, el tiempo de duplicación de célula hospedadora disminuye hacia su mínimo y el metabolismo en la célula hospedadora aumenta exponencialmente hacia su máximo, logrando potencialmente cualquiera o ambas condiciones. La medición de tasas metabólicas y de crecimiento se determina fácilmente usando técnicas de rutina, incluyendo, pero sin limitación, medir los aumentos en el número de células, medir aumentos en densidad celular (por ejemplo, densidad óptica), medición de cambios de pH del medio de cultivo que contiene las células, medición de metabolitos acumulados, medición de producción de calor, medición de conductividad eléctrica del medio, medición de velocidades de suministro de nutrientes y medición de captación de oxígeno y velocidades de evolución a dióxido de carbono.

Como se usa en este documento, la expresión "rendimiento de producto" se refiere a la cantidad de proteína recombinante útil producida por un sistema de fermentación. La cantidad de proteína se determina fácilmente usando técnicas de rutina, incluyendo, pero sin limitación, cromatografía, espectrometría, electroforesis en gel, Eminase, tinción con azul camas o plata y el ensayo de Lorry. La calidad de proteína se evalúa adicionalmente comparando el producto con un patrón en ensayos biofísicos o de actividad apropiados, por ejemplo, cromatografía líquida de alto rendimiento, análisis espectroscópicos o Eminase. Los ensayos de actividad pueden mostrar proteína funcional plegada o ensamblada apropiadamente. Por tanto, un anticuerpo ensamblado apropiadamente puede unirse a un antígeno, preferiblemente con una afinidad similar a la de un anticuerpo de control. Un factor de crecimiento, hormona o citoquina apropiadamente ensamblado se unirá a su receptor afín e inducirá señalización celular, de nuevo de una forma comparable a la del factor de crecimiento, hormona o citoquina de tipo silvestre. Una proteasa apropiadamente replegada escindirá enlaces peptídicos con una especificidad similar a una proteasa de tipo silvestre.

Como se usa en este documento, "polipéptido de interés" se refiere generalmente a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente 10 aminoácidos. Los polipéptidos pueden ser endógenos a la célula hospedadora bacteriana o, preferiblemente, pueden ser exógenos a la célula hospedadora, tales como polipéptidos de levaduras o, más preferiblemente, polipéptidos de mamífero. Los ejemplos de polipéptidos bacterianos incluyen, por ejemplo, fosfatasa alcalina y beta-lactamasa. Los ejemplos de polipéptidos de mamífero incluyen moléculas tales como, por ejemplo, renina, una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humana de des-N-metionilo y hormona de crecimiento bovina; factor liberador de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante de tiroides; tiroxina; lipoproteínas; alfa 1-antitripsina; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona folículo-estimulante; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón, factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor Von Willebrand; factores anti-coagulación tales como Proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar, un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina, factor de crecimiento hematopoyético, factor de necrosis tumoral alfa y beta; enquefalinasa; una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena A de relaxina; cadena B de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como beta-lactamasa; ADNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; receptores para hormonas o factores de crecimiento; integrina; trombopoyetina; proteína A o D, factores reumatoides, un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado del hueso (BDNF); neurotrofina -3, -4, - 5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6) o un factor de crecimiento nervioso, tal como NGF-beta; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta, incluyendo TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4 o TGF-beta5; factor de crecimiento similar a insulina I y II (IGF-I e IGF-II); proteínas de unión a factor de crecimiento similar a insulina; proteínas CD tales como CD-3, CD-4, CD-8 y CD-19; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética de hueso (BMP); somatotropinas; interferones tales como interferón-alfa, -beta y -gamma; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleuquinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-15; superóxido dismutasa, receptores de células T; proteínas de superficie de membrana; factor acelerador de la descomposición; antígenos virales, tales como, por ejemplo, una porción de la envuelta del SIDA; proteína de transporte; receptores de asentamiento; adresinas; proteínas reguladoras; anticuerpos; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" se refiere a inmunoglobulinas de longitud completa (IgA, IGD, IgE, IgG, IgM) y a todos los isotipos de las mismas, anticuerpos humanizados o quiméricos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos de CDR modificada y fragmentos de anticuerpos de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen Fab'_{2}, Fab, anticuerpos de cadena sencilla scFv y similares.

Los polipéptidos preferidos de interés son los que se producen fácilmente en células bacterianas con un mínimo de proteólisis y un máximo en material apropiadamente replegado o activo y que no necesitan glucosilarse para su utilidad deseada. Los ejemplos de tales polipéptidos de mamífero incluyen anticuerpos (o fragmentos de los mismos), IGF-I, hormona de crecimiento, ADNasa, relaxina, factor liberador de hormona de crecimiento, insulina, uroquinasa, inmunotoxinas y antígenos. Los polipéptidos de mamífero particularmente preferidos incluyen anticuerpos, IGF-I y hormona de crecimiento.

Una "célula hospedadora" modificada es una célula en la que se ha introducido un ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Como alternativa, el polipéptido de interés puede estar codificado por un gen que sea parte del genoma de la célula, pero para el que se hayan modificado secuencias reguladoras para proporcionar niveles aumentados de expresión.

Los ejemplos de células hospedadoras incluyen, pero sin limitación, organismos bacterianos (bacterias), arqueobacterias, eucariotas de una sola célula tales como levaduras u otros hongos, células vegetales y células animales. Las bacterias adecuadas para este fin incluyen bacterias aerobias y anaerobias facultativas, ya sean arqueobacterias o eubacterias, especialmente eubacterias y, más preferiblemente, Enterobacteriaceae. Los ejemplos de bacterias útiles incluyen Escherichia, Enterobacter, Azotobacter, Erwinia, Bacillus, Pseudomonas, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla y Paracoccus. Los hospedadores Acaule adecuados incluyen Acaule W3110 (ATCC 27.325), Acaule 294 (ATCC 31.446), Acaule B y Acaule X1776 (ATCC 31.537). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes. También pueden emplearse células mutantes de cualquiera de las bacterias mencionadas anteriormente. Por supuesto, es necesario seleccionar la bacteria apropiada teniendo en cuenta la replicabilidad del replicón en las células de una bacteria. Por ejemplo, pueden usarse convenientemente especies de Acaule, Serratia o Salmonella como el hospedador cuando se usen plásmidos bien conocidos tales como pBR322, pBR325, pACYC177 o pKN410 para suministrar el replicón. La cepa W3110 de Acaule es un hospedador parental particularmente preferido debido a que es una cepa hospedadora común para fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente, la célula hospedadora debería secretar cantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la cepa W3110 puede modificarse para efectuar una mutación genética en los genes que codifican proteínas, incluyendo los ejemplos de dichos hospedadores Acaule W3110 cepa 1A2, que tiene el genotipo completo \Delta fhuA; Acaule W3110 cepa 9E4, que tiene el genotipo completo \Delta fhuA- ptr3; Acaule W3110 cepa 27C7 (ATCC 55.244), que tiene el genotipo completo \Delta fhuA-ptr3 phoA-\Delta-E15-\Delta-(argF-lac)169 ompT-\Delta-degP41kan^{r}; Acaule W3110 cepa 37D6, que tiene el genotipo completo \Delta fhuA-ptr3 phoA-\Delta-E15-\Delta-(argF-Iac)169 ompT-\Delta- degP41kan^{r} rbs7-\Delta-ilvG; Acaule W3110 cepa 40B 4, que es la cepa 37D6 con una mutación de deleción de degP no resistente a kanamicina; y una cepa de Acaule que tiene una proteasa periplásmica mutante descrita en la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.783 expedida el 7 de agosto de 1990. Son ejemplos de células de mamífero células COS-1 o CHO, células HeLa, 293T (células de riñón humano), mioblastos primarios de ratón y células NIH 3T3. Son ejemplos de especies de levadura S. cerevisiae, Candida albicans, Candida utilis y Phaffia rhodozyma. Otras células hospedadoras adecuadas son células de insecto tales como células SF-9 celdas (Spodoptera frugiperda).

Las células hospedadoras crecen en condiciones de cultivo sensibles, es decir, condiciones apropiadas de temperatura (generalmente aproximadamente 25-37ºC), pH (generalmente pH 7-8), humedad (generalmente aproximadamente el 100%), oxígeno y disponibilidad de nutrientes incluyendo fuentes de carbono/energía. Como se describe en este documento, la disponibilidad de oxígeno y de una fuente de energía determina la velocidad de crecimiento de la célula hospedadora.

Como se usa en este documento, una fermentación "a gran escala" se refiere a fermentación en un fermentador que tiene al menos aproximadamente 1000 litros de capacidad volumétrica, es decir, volumen de trabajo, dejando espacio adecuado para espacio de cabeza. Una fermentación "a pequeña escala" se refiere generalmente a una fermentación en un fermentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, preferiblemente no más de aproximadamente 10 litros.

Células Hospedadoras Recombinantes

De acuerdo con la presente invención pueden emplearse técnicas de biología molecular, microbiología y ADN recombinante convencionales dentro de la especialidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York (en este documento "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes I y II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1985), Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986); Immovilized Cells And Encimes (IRL Press, 1986); A Practical Guide To Molecular Cloning (B. Perbel, 1984); Current Protocols actuales in Molecular Biology, (F. M. Ausubel et al. eds. 1994). Escherichia coli and Salmonella (Neidhardt et al., ASM Press, 1996) describe en particular tecnología recombinante en bacterias.

Una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que ha experimentado una manipulación biológica molecular.

Los polinucleótidos en este documento pueden estar flanqueados por secuencias reguladoras naturales (control de la expresión) o pueden asociarse con secuencias heterólogas, incluyendo promotores, sitios internos de entrada del ribosoma (IRES) y otras secuencias de sitio de unión del ribosoma, potenciadores, elementos de respuesta, supresores, secuencias señal, secuencias de poliadenilación, intrones, regiones no codificantes 5' y 3' y similares. Los ácidos nucleicos también pueden modificarse por cualquier medio conocido en la técnica. Los ejemplos no limitantes de dichas modificaciones incluyen metilación, "caperuzas", sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo y modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.) y enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.). Los polinucleótidos pueden contener uno o más restos adicionales unidos covalentemente, tales como, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, hierro, metales oxidativos, etc.) y alquilantes. Los polinucleótidos pueden derivatizarse por formación de un fosfotriester de metilo o etilo o un enlace fosforamidato de alquilo. Además, los polinucleótidos en este documento también pueden modificarse con un marcador capaz de proporcionar una señal detectable, directamente o indirectamente. Los marcadores ejemplares incluyen radioisótopos, moléculas fluorescentes, biotina y similares.

Una "secuencia codificante" o una secuencia "que codifica" un producto de expresión tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima es una secuencia de nucleótidos que, cuando se expresa, da como resultado la producción de ese ARN, polipéptido, proteína o enzima, es decir, la secuencia de nucleótidos codifica una secuencia de aminoácidos para ese polipéptido, proteína o enzima. Una secuencia codificante para una proteína puede incluir un codón de inicio (habitualmente ATG) y un codón de terminación.

El término "gen", también denominado un "gen estructural", se refiere a una secuencia de ADN que codifica o se corresponde con una secuencia particular de aminoácidos que comprenden toda o parte de una o más proteínas o enzimas y puede o no incluir secuencias reguladoras de ADN, tales como secuencias promotoras que determinan, por ejemplo, las condiciones en las que se expresa el gen. Algunos genes, que no son genes estructurales, pueden transcribirse a partir de ADN en ARN, pero no traducirse en una secuencia polipeptídica. Otros genes pueden funcionar como reguladores de genes estructurales o como reguladores de la transcripción de ADN.

Los términos "expresar" y "expresión" significan permitir o causar que la información en un gen o secuencia de ADN se manifieste, por ejemplo, produciendo una proteína por activación de las funciones celulares implicadas en la transcripción y traducción de un gen o secuencia de ADN correspondiente. Una secuencia de ADN se expresa en o por una célula para formar un "producto de expresión" tal como una proteína. El propio producto de expresión, por ejemplo, la proteína resultante, también puede decirse que se "expresa" por la célula. Un producto de expresión puede caracterizarse como intracelular, extracelular o secretado. El término "intracelular" significa algo que está en el interior de una célula. El término "extracelular" significa que algo está fuera de una célula. Una sustancia se "secreta" por una célula si aparece en una cantidad significativa fuera de la célula, desde algún lugar en o dentro de la célula.

La expresión "sistema de expresión" se refiere a una célula hospedadora y a un vector compatible en condiciones adecuadas, por ejemplo, para la expresión de una proteína codificada por un ADN extraño llevado por el vector e introducido en la célula hospedadora. En una realización específica, la proteína recombinante se expresa en células hospedadoras de E. coli.

El término "heterólogo" se refiere a una combinación de elementos que no son de origen natural. Por ejemplo, ADN heterólogo se refiere a un ADN que no está localizado de forma natural en la célula o en un sitio cromosómico de la célula. Preferiblemente, el ADN heterólogo incluye un gen extraño para la célula. Un elemento regulador de expresión heterólogo es un elemento de este tipo asociado operativamente con un gen diferente de aquél con el que se asocia operativamente en la naturaleza. En el contexto de la presente invención, un gen que codifica una proteína de interés es heterólogo para el ADN de vector en el que se inserta para la clonación o expresión y es heterólogo para una célula hospedadora que contiene dicho vector, en la que se expresa, por ejemplo, una célula de E. coli.

El término "transfección" se refiere a la introducción de un ácido nucleico extraño en una célula. El término "transformación" se refiere a la introducción de un gen, secuencia de ADN o ARN "extraño" (es decir, extrínseco o extracelular) en una célula hospedadora, de modo que la célula hospedadora replicará el ADN y expresará el gen o la secuencia introducida para producir una sustancia deseada, típicamente una proteína o enzima codificada por el gen o la secuencia introducida. El gen o secuencia introducida también pueden denominarse un gen o secuencia "clonada" o "extraña", puede incluir secuencias reguladoras o de control, tales como de inicio, terminación, promotoras, señal, secreción u otras secuencias usadas por la maquinaria genética de una célula. El gen o la secuencia pueden incluir secuencias no funcionales o secuencias con función desconocida. El ADN puede introducirse como un elemento extracromosómico mediante integración cromosómica o una célula hospedadora que recibe y expresa un ADN o ARN introducido se ha "transformado" y es un "transformante" o un "clon". El ADN o ARN introducido en una célula hospedadora puede proceder de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula hospedadora o células de un género o especie diferente.

Dependiendo de la célula hospedadora usada, la transformación se realiza usando técnicas convencionales apropiadas para tales células. El tratamiento con calcio que emplea cloruro de calcio, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., anteriormente, se usa generalmente para células bacterianas que contienen barreras de pared celular sustanciales. Otro método para transformación emplea polietilenglicol/DMSO, como se describe en Chung y Miller (Nucleic Acids Res. 1988, 16: 3580). Otro método más es el uso de la técnica denominada electroporación.

Los términos "vector", "vector de clonación" y "vector de expresión" se refieren al vehículo por el que puede introducirse una secuencia de ADN o ARN (por ejemplo, un gen extraño) en una célula hospedadora, para transformar el hospedador y promover la expresión (por ejemplo, transcripción y traducción) de la secuencia introducida. Los vectores incluyen plásmidos, fagos, virus, etc., se analizan con mayor detalle a continuación.

Los vectores comprenden típicamente el ADN de un agente transmisible, en el que se inserta un ADN extraño. Una forma común de insertar un segmento de ADN en otro segmento de ADN implica el uso de enzimas denominadas enzimas de restricción que escinden el ADN en sitios específicos (grupos específicos de nucleótidos) denominados sitios de restricción. Un "casete" se refiere a una secuencia codificante de ADN o segmento de ADN que codifica un producto de expresión que puede insertarse en un vector en sitios de restricción definidos. Los sitios de restricción del casete se diseñan para asegurar la inserción del casete en la fase de lectura apropiada. Generalmente, el ADN extraño se inserta en uno o más sitios de restricción del ADN vector y después se lleva por el vector hacia una célula hospedadora junto con el ADN vector transmisible. Un segmento o secuencia de ADN que tiene ADN insertado o añadido, tal como un vector de expresión, también puede denominarse una "construcción de ADN". Un tipo común de vector es un "plásmido" que generalmente es una molécula autocontenida de ADN bicatenario, habitualmente de origen bacteriano, que puede aceptar fácilmente ADN adicional (extraño) y que puede introducirse fácilmente en una célula hospedadora adecuada. Con frecuencia, un vector plasmídico contiene un ADN codificante y un ADN promotor y tiene uno o más sitios de restricción adecuados para insertar ADN extraño. El ADN codificante es una secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos particular para una proteína o enzima particular. Un promotor de ADN es una secuencia de ADN que inicia, regula o media de otro modo o controla la expresión del ADN codificante. El ADN promotor y el ADN codificante pueden ser del mismo gen o de genes diferentes y pueden ser del mismo o diferentes organismos.

Un gran número de vectores, incluyendo vectores plasmídicos y fúngicos, se han descrito para replicación y/o expresión en una diversidad de hospedadores eucariotas y procariotas.

Los ejemplos no limitantes incluyen plásmidos PKK (Clonetech), plásmidos pUC, plásmidos pET (Novagen, Inc., Madison, WI) o plásmidos pRSET o pREP (Invitrogen, San Diego, CA) o plásmidos pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y muchas células hospedadoras apropiadas, usando métodos descritos o citados en este documento o conocidos de otro modo por los especialistas en la técnica pertinente. Los vectores de clonación recombinantes incluirán con frecuencia uno o más sistemas de replicación para la clonación o expresión, uno o más marcadores para la selección en el hospedador, por ejemplo, resistencia a antibióticos y uno o más casetes de expresión.

Puede emplearse una amplia diversidad de combinaciones de hospedador/vector de expresión (es decir, sistemas de expresión) en la expresión de las proteínas de interés. Los vectores de expresión útiles, por ejemplo, pueden consistir en segmentos de secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas. Los vectores adecuados incluyen plásmidos bacterianos conocidos, por ejemplo, plásmidos de E. coli, col EI, pCR1, pBR322, pMal-C2, pET, pGEX (Smith et al., Gene 67: 31-40, 1988), pMB9 y sus derivados, plásmidos tales como RP4; ADN de fagos, por ejemplo, los numerosos derivados de fago 1, por ejemplo, NM989 y otro ADN de fago, por ejemplo, M13 y ADN monocatenario de fago filamentoso; plásmidos de levaduras tales como el plásmido 2m o derivados de los mismos; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fagos, tales como plásmidos que se han modificado para emplear ADN de fagos u otras secuencias de control de la expresión; y similares.

También pueden usarse sistemas de expresión en levaduras de acuerdo con la invención para expresar cualquier proteína de interés. Por ejemplo, el vector de no fusión pYES2 (sitios de clonación XbaI, SphI, ShoI, Notl, GstXI, EcoRI, BstXI, BamH1, SacI, Kpn1 y HindIII; Invitrogen) o el pYESHisA, B, C de fusión (sitios de clonación XbaI, SphI, ShoI, NotI, BstXI, EcoRI, BamH1, Sacl, KpnI y HindlII, péptido N-terminal purificado con resina ProBond y escindido con enteroquinasa; Invitrogen) por mencionar sólo dos, pueden emplearse de acuerdo con la invención.

Las células hospedadoras pueden albergar también intrínsicamente el polipéptido de interés. Por ejemplo, la fosfatasa alcalina es una proteína que es homóloga a Acaule y puede inducirse sin una transfección adicional de la célula con ADN vector. Para polipéptidos heterólogos, tales como, por ejemplo, anticuerpo y hormona de crecimiento, el ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, ADNc) se inserta adecuadamente en un vector replicable para la expresión en el medio de cultivo bajo el control de un promotor adecuado. Como se ha indicado anteriormente, están disponibles muchos vectores para este fin y la selección del vector apropiado dependerá principalmente del tamaño del ácido nucleico a insertar en el vector y de la célula hospedadora particular a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula hospedadora particular con la que es compatible. Los componentes de vector para transformación bacteriana incluyen generalmente, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores y un promotor.

El ADN que codifica el polipéptido de interés en este documento puede expresarse no sólo directamente, sino también como una fusión con otro polipéptido, preferiblemente una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal del polipéptido maduro. En general, la secuencia señal puede ser un componente del vector o puede ser una parte del ADN polipeptídico que se inserta en el vector. La secuencia señal heteróloga seleccionada debería ser una que se reconozca y se procese (es decir, se escinda por una peptidasa señal) por la célula hospedadora. Para células hospedadoras bacterianas que no reconocen y procesan la secuencia señal del polipéptido nativo, la secuencia señal se sustituye por una secuencia señal bacteriana seleccionada, por ejemplo, del grupo que consiste en líderes de fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o enterotoxina termoestable II.

Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células hospedadoras seleccionadas. Generalmente, en vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del hospedador e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una diversidad de bacterias. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas.

Los vectores de expresión y clonación también contienen generalmente un gen de selección, también denominado un marcador de selección. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformados con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina; (b) complementan deficiencias auxótrofas; o (c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para bacilos. Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula hospedadora. Esas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia a fármaco y, por lo tanto, sobreviven al régimen de selección.

El vector de expresión para producir un polipéptido heterólogo también contiene un promotor inducible que es reconocido por el organismo hospedador y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica el polipéptido de interés. Los promotores adecuados para usar con hospedadores bacterianos incluyen los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa (Chang et al., Nature 1978, 275: 615; Goeddel et al., Nature 1979, 281: 544), fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res. 1980, 8: 4057 y documento EPO 36.776) y promotores híbridos tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80: 21-25). Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias de nucleótidos se han publicado, permitiendo por lo tanto a un especialista ligarlos operativamente a ADN que codifica el polipéptido de interés (Siebenlist et al., Cell 1980, 20: 269) usando enlazadores o adaptadores para suministrar cualquier sitio de restricción necesario. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contienen generalmente una secuencia de Shine-Dalgarno (S. D.) unida operativamente al ADN que codifica el polipéptido de interés. El promotor puede retirarse del ADN de fuente bacteriana mediante digestión con enzima de restricción e insertarse en el vector que contiene el ADN deseado.

Una "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a ARN polimerasa en una célula e iniciar la transcripción de una secuencia codificante cadena abajo (dirección 3'). Para los fines de definir la presente invención, la secuencia promotora está unida en su extremo 3' por el sitio de inicio de la transcripción y se prolonga cadena arriba (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a niveles detectables por encima del fondo. Dentro de la secuencia promotora se encontrará un sitio de inicio de la transcripción (definido convenientemente, por ejemplo, por mapeo con nucleasa S1), así como dominios de unión a proteína (secuencias consenso) responsables de la unión de ARN polimerasa.

Un "promotor inducible" o "promotor regulado" es un promotor que regula la expresión en respuesta a un estímulo. El promotor puede unirse por una proteína reguladora de la transcripción, por ejemplo, un represor o un activador, que reprime o activa la expresión génica, respectivamente. La proteína represora o activadora a su vez es sensible al estímulo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente, tal como lactosa, un nutriente tal como fosfato, una toxina tal como un metal pesado, pH ácido, temperatura aumentada o alguna otra señal ambiental.

Una secuencia codificante está "bajo el control" o "asociada operativamente con" secuencias de control de la transcripción y de la traducción en una célula cuando la RNA polimerasa transcribe la secuencia codificante en ARNm, cortándose y empalmándose después el ARN en trans (si contiene intrones) y traduciéndose en la proteína codificada por la secuencia codificante.

La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes enumerados anteriormente emplea técnicas de ligación convencionales. Los plásmidos o fragmentos de ADN aislados se escinden, adaptan y religan en la forma deseada para generar los plásmidos necesarios.

Para un análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos, las mezclas de ligación se usan para transformar Acaule K12 cepa 294 (ATCC 31.446) u otras cepas y los transformantes con éxito se seleccionan mediante resistencia a ampicilina o tetraciclina según sea apropiado. Se preparan plásmidos a partir de los transformantes, se analizan mediante digestión con endonucleasa de restricción y/o se secuencian mediante el método de Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977, 74: 5463-5467 o Messing et al., Nucleic Acids Res. 1981, 9: 309) o mediante el método de Maxam et al. (Methods in Enzymology 1980, 65: 499).

Las células hospedadoras se transforman con los vectores de expresión descritos anteriormente de esta invención y se cultivan en medios de nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para el promotor utilizado.

Sistemas de expresión inducibles

En general, se usan vectores plasmídicos que contienen replicón o secuencias de control que proceden de especies compatibles con las células hospedadoras en relación con hospedadores bacterianos. El vector lleva generalmente un sitio de replicación, así como secuencias marcadoras que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, Acaule se transforma típicamente usando pBR322, un plásmido procedente de una especie de Acaule (véase, por ejemplo, Bolivar et al., Gene 1977, 2: 95), pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y, por lo tanto, proporciona medios fáciles para identificar células transformadas. El plásmido pBR322, u otros plásmidos microbianos o fagos, también contiene generalmente o se modifica para contener promotores que pueden usarse por el organismo microbiano para la expresión de los genes marcadores de selección.

Por tanto, la expresión del polipéptido de interés puede controlarse por cualquier elemento promotor/potenciador inducible conocido en la técnica, pero estos elementos reguladores deben ser funcionales en el hospedador seleccionado para expresión. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión de genes incluyen, pero sin limitación, vectores de expresión procariotas tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Komaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1978, 75: 3727 -3731) o el promotor de tac (DeBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983, 80: 21-25; véase también Sheibani, Prep. Biochem. Biotechnol. 1999, 29: 77; "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 242: 74-94, 1980; Gossen et al., Curr. Opin. Biotechnol. 1994, 5: 516). En una realización específica, un promotor de phoA proporciona una expresión regulada. Se han descrito sistemas de expresión para bacterias Gram-positivas industriales, tales como Bacillus, Clostridium, Lactococcus, Lactobacillus, Staphylococcus y Streptococcus basándose principalmente en la capacidad de estas bacterias de utilizar azúcares específicos o para secretar péptidos autoinductores que están implicados en la auto inducción (de Vos et al. Curr. Opin. Biotechnol. 1997, 8: 547) particularmente para bacterias ácido lácticas (de Vos, Curr. Opin. Microbiol. 1999, 2: 289; Djordjevic y Klaenhammer, Mol. Biotechnol. 1998, 9: 127). Otros sistemas de expresión incluyen, pero de ningún modo se limitan a, el promotor de triptófano (Chevalet et al. Biotechnol. Bioeng. 2000, 69: 351), el sistema Ntr de E. coli (Schroeckh et al., J. Biotechnol. 1999, 75: 241); el promotor de PalkBFGHJKL (Staijen et al., J. Bacteriol. 1999. 181: 1610), el sistema de promotor araBAD/regulador arac de E. coli (Newman y Fuqua, Gene 1999. 227: 197); sistemas regulados por tetraciclina (Liu et al., Biotechniques 1998, 24: 624; Gallia y Khalili, Ongogene 1998, 16: 1879); el sistema regulador de dos componentes VanS-VanR (Haldimann et al., J. Bacteriol. 1997. 179: 5903); un sistema regulado por potasio (Treuner-Lange et al., J. Bacteriol. 1997. 179: 4501); un sistema inducible por pH (San et al., Ann. NY Acad. Sci. 1994. 721: 268), un sistema inducible por peróxido/ascorbato (Bishai et al., J. Bacteriol. 1994. 176: 2914); sistemas basados en el promotor de T7 (véase Lama y Carrasco, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992, 188: 972); sistemas inducibles por antibióticos (véase Nielsen et al., Mol. Microbiol. 1991, 5: 1961); y otros sistemas regulados (véase Alksne y Rasmussen, J. Bacteriol. 1997. 179: 2006; Everett et al., Microbiology 1995. 141: 419).

También son bien conocidos elementos promotores inducibles de levaduras u otros hongos tales como el promotor de Gal 4, el promotor de ADC (alcohol deshidrogenasa), promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), promotor de fosfatasa alcalina.

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Fermentaciones

Están disponibles diversas fermentaciones semi-continuas a gran escala para la producción de proteínas recombinantes. Las fermentaciones de mayor tamaño tienen al menos 1000 litros de capacidad, preferiblemente aproximadamente de 1000 a 100.000 litros de capacidad, es decir, volumen de trabajo, dejando espacio adecuado para el espacio de cabeza. Estos fermentadores usan ruedas de paletas agitadoras u otros medios adecuados para distribuir el oxígeno y los nutrientes, especialmente la glucosa (la fuente de carbono/energía preferida). Las fermentaciones a pequeña escala se refieren generalmente a fermentación en un fermentador que no tiene más de aproximadamente 100 litros de capacidad volumétrica, preferiblemente no más de aproximadamente 10 litros.

Las células hospedadoras usadas para producir el polipéptido de interés de esta invención se cultivan en medios adecuados en los que el promotor puede inducirse de forma constitutiva o artificialmente como se describe de forma general, por ejemplo, en Sambrook et al., anteriormente. Se proporcionan ejemplos de medios adecuados a continuación en la sección de ejemplos.

Cualquier complemento necesario aparte de fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato inorgánico puede incluirse también en concentraciones apropiadas introducido en solitario o como una mezcla con otro complemento o medio tal como una fuente de nitrógeno complejo.

Inicialmente, antes de la expresión del polipéptido de interés, las células hospedadoras inoculadas en el fermentador se cultivan en condiciones de cultivo favorables, por ejemplo, con todas las fuentes de oxígeno y carbono/energía disponibles (o, preferiblemente, fuente), junto con nutrientes esenciales y control del pH, necesario para crecimiento logarítmico. De acuerdo con la invención, estas condiciones se mantienen, por ejemplo, por suministro de glucosa concentrada a una velocidad que controle el contenido de oxígeno disuelto en un punto de ajuste, hasta que las células hospedadoras se expandan en cultivo hasta el número o la densidad celular deseada.

Después de alcanzar la densidad celular diana, tienen lugar dos manipulaciones de la fermentación. La primera es proporcionar la señal para inducir la expresión del polipéptido de interés, por ejemplo, por reducción de los niveles de fosfato como se ejemplifica a continuación.

La segunda manipulación (que puede ser el resultado de la primera) es disminuir la velocidad o reducir la tasa metabólica de la célula hospedadora. Puesto que durante el crecimiento logarítmico la tasa metabólica es directamente proporcional a la disponibilidad de oxígeno y una fuente de carbono/energía, la reducción de los niveles de oxígeno o fuentes de carbono/energía disponibles o ambos reducirá la tasa metabólica. La manipulación de los parámetros de funcionamiento del fermentador, tales como la velocidad de agitación o contrapresión, así como la reducción de la presión de O_{2}, modulan los niveles disponibles de oxígeno. La reducción de la concentración o la velocidad de suministro o ambos de la fuente o fuentes de carbono/energía tiene un efecto similar. Además, dependiendo de la naturaleza del sistema de expresión, la inducción de expresión puede conducir a una disminución espectacular en la tasa metabólica. Por último, tras alcanzar la densidad celular máxima, el crecimiento se detiene o la velocidad disminuye radicalmente.

Como se ha analizado anteriormente, la reducción en la tasa metabólica de la célula hospedadora da como resultado una expresión más controlada del polipéptido de interés, que permite que se produzca el plegamiento y el ensamblaje de la proteína.

La expresión génica puede medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia de Northern convencional para cuantificar la transcripción de ARNm (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980. 77: 5201-5205). Pueden emplearse diversos marcadores, más comúnmente radioisótopos, particularmente ^{32}P. Sin embargo, también pueden emplearse otras técnicas, tales como usar nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. La biotina sirve después como el sitio para la unión a avidina o anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia diversidad de marcadores, tales como radionúclidos, elementos fluorescentes, enzimas o similares.

El polipéptido de interés se recupera preferiblemente del periplasma o del medio de cultivo como un polipéptido secretado, aunque también puede recuperarse de lisados de célula hospedadora cuando se expresa directamente sin una señal secretora. Como alternativa, las células o porciones de las mismas pueden usarse como biocatalizadores o para otras funciones sin una purificación sustancial.

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Con frecuencia se prefiere purificar el polipéptido de interés de proteínas o polipéptidos celulares recombinantes para obtener preparaciones que sean sustancialmente homogéneas en lo que se refiere al polipéptido de interés. Como primera etapa, el medio de cultivo o lisado se centrifuga para eliminar residuos celulares particulados. Las fracciones de proteína de membrana y soluble pueden separarse después si es necesario. Después, el polipéptido puede purificarse de la fracción de proteína soluble y de la fracción de membrana del lisado de cultivo, dependiendo de si el polipéptido está unido a membrana, es soluble o está presente en una forma agregada. El polipéptido se solubiliza después y se pliega, si es necesario, y se purifica de proteínas y polipéptidos solubles contaminantes, siendo ejemplares de procedimientos de purificación adecuados los siguientes procedimientos: fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice o una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; concentración cromatográfica, SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; y filtración en gel usando, por ejemplo, Sephadex G-75.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos ilustran sin limitación la invención.

Ejemplo 1 Fermentación de Anti-CD18 Materiales y Métodos

Fermentación. El hospedador usado en estas fermentaciones era un derivado de E. coli denominado 49A5. El genotipo completo de 49A5 es W3110 \DeltaAfuA phoA\DeltaE15\Delta (argF-lac) 169 deoC degP41 (\DeltaPstl-Kan^{r}) IN (rrnD-rmE)1 ilvG2096 (Val^{r}) \DeltafucP \DeltamalE. El plásmido, pS 1130, contiene los genes del fragmento de cadena ligera de anti-CD 18 y un fragmento de la cadena pesada con una cremallera de leucina C-terminal, ambos detrás del promotor de phoA y ambos precedidos por una secuencia señal STII. Por consiguiente, tras la inducción de la expresión, los fragmentos de cadena ligera y cadena pesada se sintetizan y se secretan al periplasma donde cierta fracción de los péptidos individuales se pliegan y ensamblan para formar un Fab'_{2} con cremalleras de leucina en las cadenas pesadas.

Para cada fermentación de 10 litros, se descongeló un solo vial que contenía 1,5 ml de cultivo en DMSO al 10-15% en un matraz de agitación de 1 l que contenía 500 ml de medio LB complementado con 0,5 ml de solución de tetraciclina (5 mg/ml) y 2,5 ml de solución de fosfato de sodio 1M. Este cultivo sembrado se cultivó durante aproximadamente 16 horas a 30ºC y después se usó para inocular un fermentador de 10 litros.

El fermentador contenía inicialmente aproximadamente 4,7 litros de medio que contenía aproximadamente 3,5 g de glucosa, 75 ml de sulfato de magnesio 1 M, 8 ml de una solución de oligoelementos (cloruro férrico hexahidrato
27 g/l, sulfato de zinc heptahidrato 8 g/l, cloruro de cobalto hexahidrato 7 g/l, molibdato de sodio 7 g/l, sulfato cúprico pentahidrato 8 g/l, ácido bórico 2 g/l, sulfato de manganeso monohidrato 5 g/l, ácido clorhídrico al 10%), 8 ml de una solución de cloruro férrico al 2,7%, 15 ml de una solución de tetraciclina (5 mg/ml en etanol), 7,5 ml de Fermax Adjuvant 27 (o algún agente antiespumante equivalente), 1 bolsa de sales HCD (19,5 g de fosfato de potasio dibásico, 9,75 g de fosfato de sodio monobásico dihidrato, 37,5 g de sulfato de amonio, 7,5 g de citrato de sodio dihidrato, 11,3 g de fosfato de potasio monobásico) y 150 g de NZ Amine A (un hidrolizado de proteína). Se realizaron fermentaciones a 30ºC con 10 slpm de flujo de aire y se controlaron a un pH de 7,0 \pm 0,2 (aunque se produjeron en algunos casos digresiones ocasionales fuera de este intervalo). La contrapresión del fermentador y la velocidad de agitación se variaron para manipular la velocidad de transferencia de oxígeno en el fermentador y, por consiguiente, controlar la tasa de respiración celular.

Después de la inoculación del fermentador con el medio que contiene células del matraz de agitación, el cultivo se cultivó en el fermentador hasta altas densidades celulares usando un algoritmo basado en ordenador para suministrar una solución de glucosa concentrada al fermentador. También se suministraron hidróxido de amonio (solución al 58%) y ácido sulfúrico (solución al 24%) al fermentador según fuera necesario para controlar el pH. También se usaron otras adiciones de anti-espumante en algunos casos para controlar la formación de espuma. Cuando el cultivo alcanzó una densidad celular de aproximadamente 40 de DO_{550}, se añadieron 75 ml adicionales de sulfato de magnesio 1 M al fermentador. Adicionalmente, se inició un suministro de sal concentrada (sulfato de amonio 10 g/l, fosfato de potasio dibásico 26 g/l, fosfato de sodio monobásico dihidrato 13 g/l, citrato de sodio dihidrato 2 g/l, fosfato de potasio monobásico 25 g/l, cloruro férrico al 2,7% 8 ml/l, solución de oligoelementos 8 ml/l) a una velocidad de 1,9 ml/min cuando el cultivo alcanzó aproximadamente 20 de DO_{550} y se continuó hasta que se añadieron aproximadamente
940 ml a la fermentación. Las fermentaciones se continuaron típicamente durante 72-80 horas.

Durante la fermentación, una vez que se alcanzó el punto de ajuste de oxígeno disuelto para la fermentación, la solución de glucosa concentrada se suministró basándose en la señal de sonda de oxígeno disuelto para controlar la concentración de oxígeno disuelto en el punto de ajuste sin un suministro de glucosa en exceso. Por consiguiente, en este esquema de control, las manipulaciones de los parámetros de funcionamiento del fermentador tales como la velocidad de agitación o contrapresión, que afectan a la capacidad de transferencia de oxígeno en la fermentación, manipulan en la misma medida la tasa de captación de oxígeno o tasa metabólica de las células.

Se usó un espectrómetro de masas para controlar la composición del gas de descarga de las fermentaciones y permitir el cálculo de las tasas de captación de oxígeno y evolución a dióxido de carbono en las fermentaciones.

Ensayos de Producto. Para evaluar la cantidad de producto de anticuerpo en las fermentaciones, se usaron varios ensayos. Para medir el Fab'_{2} anti-CD18-cremallera de leucina ensamblado, se usó un ensayo de HPLC de intercambio catiónico (cromatografía líquida de alto rendimiento). Para preparar muestras de células para este ensayo, el caldo de fermentación se diluyó primero en solución salina tamponada con fosfato hasta una concentración de 20 de DO_{550}. Después se centrífugo un ml de este caldo diluido durante 15 minutos a aproximadamente 15.000 x g y el sobrenadante restante se desechó dejando un sedimento celular para el análisis de HPLC. Este sedimento se congeló después a - 20ºC a - 70ºC hasta que fue necesario para el ensayo. Los sedimentos congelados se resuspendieron en un tampón de lisis que contenía 500 \mul de tampón TRIS 100 mM (o 200 mM) a pH 8, 20 \mul de lisocima 6 mg/ml en agua (recién preparada) y 10 \mul de EDTA 100 mM. Las muestras se sonicaron durante 10 pulsos y después se incubaron típicamente en hielo durante al menos treinta minutos antes del análisis adicional. En algunos casos, puede realizarse después una segunda vuelta de sonicación. Las muestras se centrifugaron después de nuevo durante quince minutos a aproximadamente 15.000 x g para obtener la fracción soluble del lisado (en el sobrenadante). Las muestras se diluyeron al menos 1:1 y se cargaron 250 \mul en una columna CsX en un sistema de HPLC 1090 de Hewlett-Packard. Las muestras se eluyeron usando un gradiente de fosfato de sodio de 5 a 50 mM (pH 7,0) durante catorce minutos y se controlaron los picos usando absorbancia de UV a 278 nm. El pico que contenía el Fab'2 anti-CD 18-cremallera de leucina se identificó y se cuantificó por comparación con patrones purificados.

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Resultados

Se procesó una serie de fermentaciones de Fab'_{2} anti-CD 18 en las que se usaron perfiles de tasa de captación de oxígeno variables (Figura 1). El control usaba una constante con una tasa de captación de oxígeno previamente favorable. El eje x muestra las tasas de captación de oxígeno aproximadas durante la fase de crecimiento y al final de la fermentación. El caso con el número sencillo de 3,5 representa un procesamiento de control sin cambio a aproximadamente 3,5 mmol/l/min O_{2}. Los controles representan un promedio de nueve procesamientos de fermentación usando condiciones similares a los casos con cambio con la excepción de que no se realizaron intentos para cambiar la OUR dando como resultado la OUR aproximadamente constante de 3,5.

Los perfiles de tasa de captación de oxígeno reales de las fermentaciones que se muestran en la Figura 1 se presentan y se agrupan de acuerdo con el título (Figura 2). Los procesamientos en los que el titulo superaba 1000 mg/l
se muestran en cuatro procesamientos (Nº 1-4) registrados con una línea continua delgada, los procesamientos en los que el título estaba entre 800-900 mg/l se muestran en cuatro procesamientos (Nº 5-8) registrados con una línea de puntos y el procesamiento de control sin cambio se muestra en el procesamiento (Nº 9) registrado con una línea continua gruesa. Estos resultados respaldan fuertemente la hipótesis de que mayores reducciones de la velocidad de las tasas de captación de oxígeno aumentan significativamente el rendimiento de fermentación de Fab'2 anti-CD 18.

Para investigar adicionalmente la causa de este efecto, se muestran los resultados de ensayo de título para estos diversos procesamientos como una función del tiempo de fermentación (Figura 3). Estos resultados sugieren que en los casos con los mayores cambios de OUR, el rendimiento de anti-CD 18 aumentaba como resultado de un periodo prolongado de formación de producto.

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Ejemplo 2 Fermentación de Anti-VEGF Materiales y Métodos

Fermentación. El organismo usado para estas fermentaciones era 43H1 W3110 \DeltafhuA phoA\DeltaE15 \Delta(argF-lac) 169 ptrA \DeltaompT degP41 (\DeltaPsti-Kan^{r}) IN (rrnD-rrnE) 1 ilvG209 (Val^{r}) prc::kan prc supresor. El plásmido usado en estos procesamientos era Y0317tet20 y confiere resistencia a ampicilina y tetraciclina. Se expresó Fab anti-VEGF a partir del promotor de phoA. Para el protocolo convencional, las condiciones del fermentador no cambiaron con el tiempo. Para los procesamientos de cambio de la tasa de uso de oxígeno (OUR), la agitación y la contrapresión se disminuyeron gradualmente desde 1000 RPM y 1,0 bar a 600 RPM y 0,3 bar respectivamente.

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Los protocolos de fermentación convencional y "OUR" se resumen en la Tabla 1.

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TABLA 1 Protocolos de Cambio de OUR y Convencional

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Preparación de Muestra de Producto y Ensayo de Producto. Se tomaron muestras de un mililitro del caldo de fermentación cada dos horas y se congelaron en nieve carbónica. Las muestras se almacenaron a largo plazo a -20ºC. Las muestras se descongelaron posteriormente y se diluyeron 6X en tampón de extracción (TrisCl 10 mM, pH 6,8, EDTA 1 mM, lisozima 0,2 mg/ml y yodoacetamida 5 mM) y se agitaron vorticialmente. Después de diez minutos en hielo, se añadió 1/100 en volumen de MgSO4 1 M y 1/100 en volumen de ADNasa 2 mg/ml y las muestras se agitaron vorticialmente de nuevo. Después de otros diez minutos de incubación en hielo, las muestras se sonicaron durante diez segundos (sonicador Branson, sonda de micropuntas, ajuste 4, por pulsos) y se colocaron de nuevo en hielo. La sonicación se repitió durante un total de dos vueltas. Después, las muestras se centrifugaron durante veinte minutos a 4ºC a 16.000 X g. Los sobrenadantes resultantes se analizaron después mediante cromatografía de afinidad usando VEGF inmovilizado en una resina de HPLC (Poros AL). La columna de VEGF columna se cargó y se equilibró en solución salina tamponada con fosfato y el producto se eluyó en HCl 12 mM con NaCl 150 mM. El producto se cuantificó por medición de la A_{280} de las muestras y comparación con una curva patrón generada por adición puntual de anti-VEGF purificado en caldo de concentración que contenía anti-CD18 de APO2L.

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Resultados

Las observaciones para fermentaciones de Fab anti-VEGF eran similares a las de Fab'_{2} anti-CD18. Los perfiles de título para una serie de fermentaciones de anti-VEGF con y sin cambios de OUR se muestran en la Figura 4. Estos datos demuestran una mejora estadísticamente significativa en el título como resultado de los cambios de OUR en comparación con el protocolo convencional (véase la Tabla 2).

TABLA 2 Perfiles de Título para Protocolos de Cambio de OUR Frente a Convencional

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Los perfiles de OUR correspondientes para estos procesamientos se muestran en la Figura 5.

La presente invención no debe limitarse en alcance por las realizaciones específicas descritas en este documento. De hecho, se harán evidentes diversas modificaciones de la invención además de las descritas en este documento para los especialistas en la técnica a partir de la descripción anterior y de las figuras adjuntas.

Claims (21)

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   1. Un método para aumentar el rendimiento de producto de un polipéptido de interés producido por células hospedadoras recombinantes, en el que la expresión del polipéptido por las células hospedadoras recombinantes está regulada por un sistema inducible, comprendiendo dicho método

   (a)

   cultivar las células hospedadoras recombinantes en condiciones de alta tasa metabólica y de crecimiento; y

   (b)

   reducir la tasa metabólica de las células hospedadoras recombinantes en el momento de la inducción de la expresión de polipéptido.

2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que reducir la tasa metabólica comprende disminuir el oxígeno disponible para las células hospedadoras.
3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que reducir la tasa metabólica comprende disminuir las fuentes de carbono/energía disponibles para las células hospedadoras.
4. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la fuente de carbono/energía es glucosa.
5. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que reducir la tasa metabólica comprende disminuir tanto la tasa de transferencia de oxígeno como la fuente de carbono/energía disponible para las células hospedadoras.
6. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tasa metabólica se reduce en aproximadamente la mitad en la etapa (b).
7. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cultivar las células hasta densidad máxima en la etapa (a).
8. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la tasa metabólica se reduce en aproximadamente la mitad en la etapa (b).
9. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora recombinante es una célula bacteriana seleccionada del grupo que consiste en E. coli y Salmonella.
10. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el sistema inducible es un sistema inducible por reducción de fosfato.
11. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido se ensambla en la célula hospedadora o en el que el polipéptido se secreta al periplasma de la célula hospedadora.
12. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo Fab'_{2} y un anticuerpo Fab u otra forma de anticuerpo.
13. 13. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tasa metabólica y de crecimiento de las células hospedadoras se maximiza en la etapa (a).
14. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido es un anticuerpo, factor de crecimiento o proteasa y en el que la célula hospedadora recombinante es una célula hospedadora de E. coli recombinante.
15. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el anticuerpo es un anticuerpo Fab'_{2} o en el que el anticuerpo es un anticuerpo Fab.
16. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que reducir la tasa metabólica comprende disminuir el oxígeno disponible para las células hospedadoras.
17. 17. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que reducir la tasa metabólica comprende disminuir las fuentes de carbono/energía disponibles para las células hospedadoras.
18. 18. El método de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la fuente de carbono/energía es glucosa.
19. 19. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la tasa metabólica se reduce en aproximadamente la mitad en la etapa (b).
20. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que el sistema inducible es un sistema de reducción de fosfato.
21. 21. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la tasa metabólica y de crecimiento de las células hospedadoras se maximiza en la etapa (a).

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