JP5014116B2

JP5014116B2 - ポリペプチドの精製

Info

Publication number: JP5014116B2
Application number: JP2007502982A
Authority: JP
Inventors: スーザンラングウーン−ラム，; ジェイムズアール．スウォーツ，
Original assignee: ジェネンテック，インコーポレイテッド
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2005-03-10
Publication date: 2012-08-29
Anticipated expiration: 2025-03-10
Also published as: US20110059484A1; BRPI0507233B8; US8389242B2; EP1733037B1; DK1733037T3; HRP20150077T1; PT1733037E; ZA200606913B; CN1954074B; RU2006135933A; WO2005087802A2; ME02058B; AU2005222397A1; KR20070029144A; CA2558911C; EP1733037A2; BRPI0507233A; CA2946323A1; NZ549266A; JP2007537725A

Description

発明の背景
関連出願
この出願は、２００４年３月１１日に出願された米国仮出願番号第６０／５５２６７８号に基づく米国特許法第１１９条の優先権を主張するものであり、出典明示によりその内容がここに取り込まれる。

１．発明の分野
本発明は、大腸菌に対して異種性のポリペプチドを産生するための方法に関する。より具体的には、本発明は有機リン酸塩を用いてそのポリペプチドの回収率を改善することに関する。

２．関連技術の説明
分子生物学の深い理解と微生物の遺伝的操作性の容易さによって、大腸菌による異種タンパク質の発現は、研究及び産業の両方で非常に意味のあるものであった。一般的に、誘導性プロモータ（例えばアルカリホスファターゼプロモータ、ｔａｃプロモータ、アラビノースプロモータなど）は、異種タンパク質発現の調節のために使用される。誘導現象の必要条件により、研究者が標的タンパク質の発現のタイミングを操ることができる。この能力は、宿主が高濃度でも十分な耐性がない異種タンパク質にとって重要である。発現の誘導の前に望ましい細胞密度にすることによって、所望のタンパク質の容積効率は最大になりうる。

微生物が必須の栄養分を奪われると、細胞の成長が止まる。制限成分は、炭素、窒素、リン酸、酸素又は何か細胞によって必要な要素であり得る。このような条件下で、細胞は増殖期から脱する。栄養制限によるストレス応答の培養物を緩和する方法は、欠損要素の供与である。流加発酵法に用いられる一般的な栄養分には、グルコース、アミノ酸、酸素などがある。

細胞性リン（Ｐ）の場合、そのＰが炭素、酸素、窒素及び水素に続いて細胞で５番目に多い要素であるので、リン酸供給の必要性は驚くべきことではない。Slanier, Adelberg及びIngraham, The Microbial World, 第４版. (Prentice Hall, NJ 1976), 1357頁。リンは、数多くの巨大分子、例えば核酸、リポサッカライド及び膜脂質の必須成分である。さらに、高エネルギーのリン酸無水物結合は、特にエネルギー代謝において重要な役割がある。大腸菌は一次Ｐ供与源として無機リン酸塩（Ｐｉ）、有機リン酸塩又はホスホン酸塩を利用することが可能である。環境からのＰｉの取り込みは、２つの輸送体系、Ｐｉｔ系及びＰｓｔ系によって成されうる。有機リン酸塩は、ほとんどは非可運搬性であり、放出されたＰｉがＰｉ輸送系によって取り込まれる前に有機リン酸塩はまず周辺質の加水分解された酵素処理に必要である。ほんのわずかな有機リン酸塩だけは移動可能であり、グリセロール-３-リン酸塩（Ｇ３Ｐ）はその例である。Ｇ３Ｐ及びグリセロリン酸-１-リン酸塩（Ｇ１Ｐ）はα-グリセロリン酸として知られている。Ｐｉ-制限及び炭素-制限に応答して、大腸菌は細胞内区画に外部環境から利用可能な完全なＧ３Ｐを取り込むことが可能であり、Ｇ３Ｐは代謝されて必要なリン酸塩又は炭素を得る。Wanner, 「Phosphorus Assimulation and Control of the Phosphate Regulon」, Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Neidhardt, 編, (第２版), American Society for Microbiology Press (1996), 1357-1365頁。

Ｇ３Ｐについての更なる文献は、大腸菌のｓｎ-グリセロール-３-リン酸塩輸送系に関する細胞質周辺タンパク質についてのSilhavy等, J. Bacteriol., 126: 951-958 (1976)；大腸菌のｓｎ-グリセロール-３-リン酸塩の第二輸送系についてのArgast等, J. Bacteriol., 136: 1070-1083 (1978)；ｇｌｐＴ依存性Ｇ3Ｐ輸送系によって媒介されるＰｉ交換についてのElvin等, J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985)；大腸菌のｐｈｏＡ遺伝子の発現におけるｇｌｐＴ及びｇｌｐＤ突然変異の効果についてのRao等, J. Bacteriol., 175: 74-79 (1993)；そして、大腸菌Ｋ-１２の有機リン酸塩の利用を上げるｐｈｎＥ及びｇｌｐＴ遺伝子についてのElashvili等, Appl. Environ. Microbiol., 64: 2601-2608 (1998)である。更に、Vergeles等, Eur. J. Biochem., 233: 442-447 (1995)は、グリセロール-２-リン酸塩（Ｇ2Ｐ）、別名β-グリセロリン酸、及びヘビ毒ホスホジエステラーゼエステル生成のヌクレオチジル受容基としてのＧ３Ｐの高い効率を開示する。

大腸菌の外因性Ｇ３Ｐの取り込みのための２つの輸送系、Ｕｇｐ輸送系及びＧｌｐＴ輸送系の現在の理解は、Neidhardt等により編集されたthe book Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology (第２版), 上掲, 1364頁の文献１３から８１に十分要約されている。Ｕｇｐオペロンはｐｈｏレギュロンに帰属する。それは、リン酸制限によって誘発されて、ｐｈｏＢタンパク質によって明らかに制御される。Ｕｇｐ系は、周辺質結合タンパク質をコードするｕｇｐＢ、必要不可欠な膜チャネルタンパク質をコードするｕｇｐＡ及びｕｇｐＣ、及びＡＴＰアーゼをコードするｕｇｐＣを有する、周辺質結合タンパク質依存性多成分輸送系である。ＧｌｐＴは、グリセロール、Ｇ3Ｐ及びグリセロールホスホリルホスホジエステルの取り込み及び代謝を媒介するｇｌｐ系の一部である(Lin等, Annu. Rev. Microbiol., 30: 535-578 (1976); Chapter 20; pg 307-342 Dissimilatory Pathways for sugars, polyols and carboxylates. Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, 第２版)。この輸送系は、外的Ｇ3Ｐとの交換によって細胞質からＰｉの流出を媒介することが知られている陰イオン交換体である。Ｇ3Ｐについての野生型株では、ＰｉがＵｇｐ系を経てＧ３Ｐを取り込んでいる細胞によってほとんど放出されないが、Ｇ３ＰがＧｌｐＴ系を介して取り込まれる場合、Ｐｉは周辺質に放出されうる。Ｐｉの鎮圧量がｇｌｐＴ-パーミアーゼ媒介性流出の結果として放出される場合、Ｕｇｐ系が含まれるｐｈｏレギュロン活性は遮断されるであろう。特定の条件下では、ＧｌｐＴは、外的Ｇ３Ｐとの交換による細胞からのＰｉの放出の唯一の経路である。Elvin等, J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985)；Rosenberg, 「Phosphate transport in prokaryotes」, 205-248頁. B. P. Rosen及びS. Silver (編), Ion Transport in Prokaryotes (Academic Press, Inc., New York, 1987)。

Ｕｇｐ系及びＧｌｐＴ系の能力を運搬Ｇ３Ｐと比較すると、２つの系の最大の速度は同じである。Ｇ３Ｐの見かけの親和性は、ＧｌｐＴ系よりＵｇｐ系に対して高い。おそらく、細胞増殖培養液中で利用可能であれば、両系は細胞成長に十分なＧ３Ｐを供給することが可能であろう。しかしながら、Ｕｇｐ系を介してもっぱら輸送されるＧ３Ｐが炭素ではなくリン酸塩のみの唯一の供給源となりうる一方、ＧｌｐＴ輸送型Ｇ３Ｐは両方の唯一の供給源となりうる(Schweizer等, J Bacteriol., 150: 1154-1163 (1982))。ｐｈｏ-レギュロン依存性Ｇ３Ｐ輸送系をコードする２つのｕｇｐ遺伝子はマッピングされ(Schweizer等, J. Bacteriol., 150: 1164-1171 (1982))、これらの遺伝子を含有するｕｇｐ領域は特徴化され(Schweizer等, Mol. and Gen. Genetics, 197: 161-168 (1984))、そして、ｕｇｐオペロンの制御は研究された(Schweizer等, J. Bacteriol., 163: 392-394 (1985)；Kasahara等, J. Bacteriol., 173: 549-558 (1991)；Su等, Molecular & General Genetics, 230: 28-32 (1991)；Brzoska等, 「ugp-dependent transport system for sn-glycerol 3-phosphate of Escherichia coli」, 170-177頁 A. Torriani-Gorini, F. G. Rothman, S. Silver, A. Wright, 及びE. Yagil (編), Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms (American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1987)；Brzoska等, J. Bacteriol., 176: 15-20 (1994)；そして、Xavier等, J. Bacteriol., 177: 699-704 (1995))。

野生型株では、Ｇ３Ｐの安定した細胞内プールが存在し、それはおよそ２００μＭに維持される。内部では、唯一の炭素源としてグリセロールがある場合、Ｇ３Ｐはグリセロールキナーゼ（ｇｌｐＫによってコードされる）によるＧ３Ｐへのグリセロールの酵素変換によって、あるいはグリセロール以外に炭素源がある間はｇｐｓＡ遺伝子の遺伝子産物であるＧ３Ｐ合成酵素による糖分解の中間体であるジヒドロキシアクトンリン酸塩の還元から合成されうる。Ｇ３Ｐはすべてのリン脂質分子の骨格を形成する重要な中間体であり、内部グリセロールリン酸塩はまたリン脂質及びトリアシルグリセロールの分解から生成されうる。代謝産物として、内部Ｇ３Ｐは、リン脂質生合成経路に用いられるか、Ｇ３Ｐ脱水素酵素によって酸化されてジヒドロキシアセトンリン酸に形成され、解糖系に用いられてもよい。

大腸菌中での異種タンパク質発現を制御するためにＡＰプロモータが使用される状況では、培地のＰｉが減少した後にのみ誘導が起こるので、ＡＰプロモータ活性のために誘発される細胞は一般的にリン酸塩の飢えにある状態で健康を損なった状態にある。それらは、細胞性機能のために必要とされるリン酸塩を除去しなければならないかもしれない。このようなリン酸塩排除の起こりうる結果には、リボソームの代謝回転、より低細胞エネルギー、及び増加したプロテアーゼ発現及びタンパク質分解があり(St. John及びGoldberg, J. Bacteriol., 143: 1223-1233 (1980))、潜在的にタンパク質蓄積能が低減した健康でない細胞となる。

大腸菌の代謝期を改良すると、おそらく細胞のタンパク質合成能を増加するであろう。リン酸塩がゆっくり与えられる場合、細胞は周辺質の低いＰｉ濃度でも感知し、それによって、Ｐ原子が細胞内で飢えずにｐｈｏレギュロンを誘発する（米国特許第５,３０４,４７２号を参照）。異種ポリペプチドを大腸菌内で生産するための更なる方法が求められている。

発明の概要
本願明細書における本発明では、大腸菌内での異種性のポリペプチドの発現を改良する方法が提供される。野生型ｇｌｐＴ遺伝子を有するものと有さないもの、及び野生型ｐｈｏＡ遺伝子を有するものと有さないもの、例えば（ｕｇｐ+ΔｇｌｐＴｐｈｏＡ-）大腸菌などの、様々な大腸菌宿主にα-グリセロリン酸のような輸送可能な有機リン酸塩を与えると、振とうフラスコ及び１０Ｌ-発酵糟スケールでの異種タンパク質の発現の改良が見られ、より大きなスケール、例えば１００００Ｌでも同様に実行されると思われる。異種タンパク質の発現のために、ｔａｃ、Ｔ７又はＡＰプロモータのような誘導性プロモータを含む様々なプロモータを使用した複数のモデル系にわたって産物回収率の利点が観察された。更なる利点は、産物が活性増殖期の早期、すなわち、別の方法より短時間で得られるということである。ある種の実施態様では、より多くの産物は活性増殖期の早期に得られ、有意に生産性が改善されうる。

したがって、本発明は特許請求の通りである。本発明の一態様では、（ａ）核酸が発現するように、輸送可能な有機リン酸塩を培養液に与えながら培養液中でポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌細胞を培養し、（ｂ）細胞からポリペプチドを回収することを含む、大腸菌に対して異種性のポリペプチドを産生する方法を提供する。好ましい実施態様では、有機リン酸塩は、グリセロリン酸、より好ましくはα-グリセロリン酸塩及び／又はβ-グリセロリン酸塩、およびより好ましくは、グリセロール-２-リン酸塩とグリセロール-３-リン酸塩の混合物又はグリセロール-３-リン酸塩単独である。他の好適な態様では、振とうフラスコ又は発酵槽、好ましくは発酵槽で培養する。さらに他の好ましい実施態様では、ポリペプチドは、細胞質、周辺質又は細胞の培養液から回収される。また、核酸の発現は誘導性プロモータ、例えばアルカリホスファターゼプロモータ、ｔａｃプロモータ又はＴ7プロモータによって制御されることが好ましく、培養工程の活性増殖期の間に核酸の発現が起こることが好ましい。一実施態様では、大腸菌は野生型である。他の実施態様では、大腸菌は染色体性ｇｌｐＴと染色体性ｐｈｏＡに欠損があるが、染色体性ｕｇｐに欠損がないことが好ましい。好ましくはまた、無機リン酸塩は培養工程中に存在する。

ある理論に縛られるものではないが、この方法では輸送可能な有機リン酸塩化合物が細胞に与えられると、Ｐｈｏ系のｐｓｔＳによってリン酸塩供給が感知されないが細胞質中の分解にリン酸塩が供給されること、さらにＧ３Ｐなどの輸送可能な有機リン酸塩の供給により重要な代謝経路内へ容易に供給される有用な代謝中間体で細胞が豊かになると思われる。

発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する「ポリペプチド」とは、約１０より多いアミノ酸を有するペプチド及びタンパク質を指す。「異種の」ポリペプチドは、大腸菌によって産生されるヒトタンパク質のような、利用される宿主細胞にとって外来のポリペプチドである。ポリペプチドは原核生物のものでも真核生物のものでもよいが、好ましくは真核生物のものであり、より好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトのものである。

哺乳類ポリペプチドの例は、例えば、レニン、ヒト成長ホルモン又はウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク；１−アンチトリプシン；インスリンＡ−鎖；インスリンＢ−鎖；プロインスリン；トロンボポエチン；濾胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、及びフォン・ヴィレブランド因子等の凝固因子；プロテインＣ等の抗凝固因子；心房性ナトリウム利尿因子；肺界面活性剤；ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）等のプラスミノーゲン活性化因子；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；２Ｃ４等のＥｒｂＢ２ドメインに対する抗体（WO 01/00245; ハイブリドーマATCC HB-12697）であって、ＥｒｂＢ２の細胞外ドメイン内の領域に結合するもの（例えば、ＥｒｂＢ２の概ね残基２２〜残基５８４の領域内における１又は複数の残基）、エンケファリナーゼ；ミューラー阻害物質；リラキシンＡ−鎖；リラキシンＢ−鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；ベータ−ラクタマーゼ等の微生物タンパク質；DNase；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモン又は成長因子のレセプター；インテグリン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５又は−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）などの栄養因子、又はＮＧＦ等の神経成長因子；カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）等のカルジオトロフィン（心臓肥大因子）；血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）；ａＦＧＦ及びｂＦＧＦ等の線維芽細胞成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；ＴＧＦ−１、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、ＴＧＦ−４、又はＴＧＦ−５を含むＴＧＦ−α及びＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉ及び−ＩＩ（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ(１−３)−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、及びＣＤ−１９などのＣＤタンパク質；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；骨形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン−アルファ、−ベータ、及び−ガンマ等のインターフェロン；ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）又はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの血清アルブミン；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＳＣＦ、及びＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬｓ）、例えば、ＩＬ−１からＩＬ−１０；抗−ＨＥＲ−２抗体；Ａｐｏ２リガンド（Ａｐｏ２Ｌ）；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞レセプター；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス性抗原、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部等；輸送タンパク質；ホーミングレセプター；アドレシン；調節タンパク質；抗体；及び上に列挙した任意のポリペプチドの断片などの分子を含む。

好適な対象のポリペプチドには、ＨＳＡ、ＢＳＡ、抗ＩｇＥ、抗ＣＤ２０、抗ＩｇＧ、ｔ-ＰＡ、ｇｐ１２０、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、２Ｃ４、抗ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ-β、アクチビン、インヒビン、抗ＨＥＲ-２、ＤＮＡ分解酵素、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、脳ＩＧＦ-Ｉ、成長ホルモン、リラキシン鎖、成長ホルモン放出因子、インスリン鎖又はプロインシュリンなどのポリペプチド、抗体及び抗体断片、ＮＧＦ、ＮＴ-３、ＢＤＮＦ、Ａｐｏ２Ｌ及びウロキナーゼが含まれる。ポリペプチドは、最も好ましくはＩＧＦ-Ｉ又はＡｐｏ２Ｌである。

「Ａｐｏ２リガンド」、「Ａｐｏ２Ｌ」、及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、図６に示されたアミノ酸配列(配列番号：２)のアミノ酸残基１１４-２８１、包括的残基９５-２８１、包括的残基９２-２８１、包括的残基９１-２８１、包括的残基４１-２８１、包括的残基１５-２８１、又は包括的残基１-２８１、並びに上記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入又は置換変異体を含むポリペプチド配列を称するために、互換性を持ってここでは使用される。一実施態様において、ポリペプチド配列は、図６(配列番号：２)の残基１１４-２８１を含む。場合によっては図６(配列番号：２)の残基９２-２８１又は残基９１-２８１を含む。Ａｐｏ２Ｌポリペプチドは、図６に示す天然のヌクレオチド配列(配列番号：１)によりコードされ得る。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９(図６；配列番号：１)をコードするコドンは、「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」であってよい。他の好適な実施態様では、断片又は変異体は生物学的に活性であり、列挙された配列の何れかと、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、そして更により好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。本定義は、少なくとも一の天然アミノ酸がアラニン残基によって置換された、Ａｐｏ２リガンドの置換変異体を包含する。また本定義は、組換え又は合成法により調製されるか、又はＡｐｏ２リガンド供給源から単離された、天然配列Ａｐｏ２リガンドも包含する。本発明のＡｐｏ２リガンドには、国際公開第９７／０１６３３号、国際公開第９７／２５４２８号及び国際公開第０１／００８３２号に開示されたＡｐｏ２リガンド又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドも含まれる。「Ａｐｏ２リガンド」及び「Ａｐｏ２Ｌ」なる用語は、一量体、二量体又は三量体形態のポリペプチドを含む、Ａｐｏ２リガンドの形態のものを一般的に称するために使用される。特に記載しない限りは、Ａｐｏ２Ｌ配列に記載されているアミノ酸残基の全ての番号付けは、図６(配列番号：２)の番号付けに使用されている。例えば「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は、図６に付与された配列(配列番号：２)の位置２０３にあるアスパラギン酸残基を意味する。

「Ａｐｏ２リガンド細胞外ドメイン」又は「Ａｐｏ２リガンドＥＣＤ」なる用語は、膜貫通及び細胞質ドメインが本質的にないＡｐｏ２リガンドの形態を称する。通常、ＥＣＤはこのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはこのようなドメインを０．５％未満有している。Ａｐｏ２Ｌに関する「生物学的な活性」又は「生物活性」とは、（ａ）インビボ又はエクスビボのウイルス感染細胞又は少なくとも一つの型の哺乳動物の癌細胞にアポトーシスを誘導するないしは刺激する能力を有する、（ｂ）抗体を産生することができる（すなわち免疫原性である）、（ｃ）Ａｐｏ２Ｌのレセプターを結合する及び／又は刺激することができる、又は（ｄ）天然のないしは天然に生じるＡｐｏ２Ｌポリペプチドの活性を有することを意味する。

「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合されたコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な対照配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合され」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならそのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合されている；プロモーターは、配列の転写に影響を及ぼすならばコード配列に作用可能に結合されている；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならコード配列と作用可能に結合されている。一般的に、「作用可能に結合される」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成されたオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。

本明細書で使用する「細胞」、「細胞系」、及び「細胞培養」という表現は、互いに交換可能に使用され、そのような名称は全て子孫を含んでいる。従って、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、形質移入回数には関係無く、それに由来する初代の対象細胞及び培養物を含んでいる。また、故意又は偶然の変異のために、全ての産物のＤＮＡ含量が正確に一致しないかもしれないことも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされるのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異子孫が含まれる。明確な規定が意図される場合には、それは文脈から明らかになるだろう。

本明細書中で用いられる「有機リン酸塩」なる用語は、一つ又は複数の炭素原子を含有してなるリン酸化合物であり、またハロゲン化物原子を含有するものを指す。このようなリン酸化合物は、供給されて細胞培養に利用されなければならない。これらの化合物はしばしば農薬として用いられる。「輸送可能な」有機リン酸塩は、いかなる形であっても事前に加水分解を受けずに細胞の外的環境から細胞内に輸送されうる。大腸菌株が有機リン酸塩でよく増殖しない場合、このような有機リン酸塩の利用は、大腸菌内のｐｈｎＥ遺伝子産物を過剰発現させることによって亢進されうる。このような遺伝子により、形質転換した大腸菌株は自然発生の有機リン酸塩利用表現型となる。上掲のElashvili等を参照。適切な有機リン酸塩の例には、アルキルハロリン酸塩、例えばジイソプロピルフルオロリン酸、アルキルホスフェート、例えばジイソプロピルリン酸塩及び３,４-ジヒドロキシブチル-１-リン酸塩、並びに糖-又はアルカノール-含有リン酸塩、例えばヘキソース-６-リン酸塩及びグリセロール-３-リン酸塩が含まれる。グルコース-１-リン酸、ヘキソース-６-リン酸塩及びグリセロリン酸塩、例として、グルコース-１-グリセロリン酸塩、フラクトース-６-グリセロリン酸塩、α-グリセロリン酸塩、例として、グリセロール-１-リン酸塩及びグリセロール-３-リン酸塩、及びβ-グリセロリン酸塩（グリセロール-２-リン酸塩）が好ましく、グリセロリン酸塩がより好ましく、α-及び／又はβ-グリセロリン酸塩がより好ましく、グリセロール-２-リン酸塩及び／又はグリセロール-３-リン酸塩がより好ましい、グリセロール-２-とグリセロール-３-リン酸塩の混合物又はグリセロール-３-リン酸塩が本明細書中の使用のために特に好ましい。本明細書中で用いる混合物中にない「Ｇ３Ｐ」又は「Ｇ３Ｐ単独」は、少なくとも約８０％のグリセロール-３-リン酸塩を含有してなる組成物を指す；それは、最高約２０％の不純物、例えばＧ２Ｐを含有してもよい。Ｇ３Ｐ及びＧ２Ｐの混合物は、約８０％未満のＧ３Ｐを含有しうる。

無機リン酸塩は、一般的にカリウム、カルシウム、マグネシウム又はリン酸ナトリウムのようなアルカリ又はアルカリ土金属と関連するリン酸塩を有し、炭素原子を全く含有しないリン酸化合物である。
「活性増殖期」とは、細胞が活動的に成長しており、細胞が静止期にあるなどの非常に栄養制限されていない培養工程の時期を指す。

発明の実行形態
本発明は大腸菌に対して異種性のポリペプチドを産生する方法を提供する。この方法では、ポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌細胞は、核酸を発現するように輸送可能な有機リン酸塩を培養液に供給しながら培養液中で培養される。次いでポリペプチドは細胞から回収される。細胞質、周辺質又は細胞の培養液から回収されてよい。任意の好適な容器で培養してもよく、振とうフラスコ又は発酵糟が好ましく、より発酵糟が好ましい。
培養パラメータを用いて、ポリペプチド産生を従来法、以下に記載する手順で管理してもよい。

Ａ．核酸の選択及びその修飾
核酸が対象のポリペプチドをコードするならば、対象のポリペプチドをコードする核酸は、任意のソースに由来するRNA、cDNA、又はゲノムDNAが適当である。大腸菌で、異種性のポリペプチド（その変異体を含む）の発現に適切な核酸の選択方法は周知である。
モノクローナル抗体を産生する場合、モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましいソースとして役に立つ。一度単離されると、DNAは発現ベクター中に配置され、次いで、微生物宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を行うためにここで示す細菌宿主細胞へ形質転換させる。抗体をコードするDNAの細菌中での組換体発現に関する総説には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993)及びPluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992)が含まれる。

非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の１つ又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、超可変領域配列をヒト化抗体の対応配列と置換することによりWinter及び共同研究者（Jonesら, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmannら, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyenら, Science, 239:1534-1536 (1988)）の方法に従って実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には超可変領域残基及びおそらく幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。

抗原性の軽減のためには、ヒト化抗体を作成するために使用するヒトの可変ドメイン、軽鎖及び重鎖両方の選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」に従うと、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のものと最も近いヒトの配列を次にヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる（Sims等, J. Immunol., 151：2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196：901(1987)）。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285(1992)；Presta等, J. Immunol., 151：2623 (1993)）。

さらに、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、超可変領域残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
ヒト化抗体又は親和性成熟抗体の種々の形態が考えられる。例えばヒト化抗体又は親和性成熟抗体は、免疫結合体を調製するために一又は複数の標的薬剤(類)と随意に結合している抗体断片、例えばＦａｂであってもよい。あるいは、ヒト化抗体又は親和性成熟抗体は無傷抗体、例えば無傷IgG1抗体であってもよい。

Fab'-SH断片は、大腸菌から直接回収され、F(ab')₂断片（Carter等, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)）を形成するために化学的にカップルされる。他のアプローチによると、F(ab')₂断片は組換体宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の産生のための他の技術は、熟達した技術者にとっては明白である。他の実施態様において、選択された抗体は、単鎖Fv断片（scFv）（WO93/16185；米国特許第5,571,894号及び5,587,458号）である。また、抗体断片は、例えば、米国特許第5,641,870号中に記載されているような「直鎖抗体」であってもよい。このような直鎖抗体断片は単一特異的又は二重特異的であってもよい。

二重特異的抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに対して特異的に結合する抗体である。例示的な二重特異的抗体は、Dkk-1タンパク質の２つの異なるエピトープに結合してもよい。二重特異的抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、F(ab')₂二重特異的抗体）として調製することができる。これらは様々な抗体鎖の融合でもよいし、一鎖でもあり得る。一重鎖はそれ自体で適格性を有する。

二重特異性抗体を生産する一方法では、二重特異性のイムノアドヘシンは、軽鎖結合部位を欠いているイムノグロブリン重鎖定常ドメイン配列に融合した第一結合ドメインをを含んでなる第一融合体；軽鎖結合部位を保持しているイムノグロブリン重鎖定常ドメイン配列に融合した第二結合ドメインを含んでなる第二融合体；そしてイムノグロブリン軽鎖をそれぞれコードするＤＮＡ配列を宿主細胞に導入することによって調製される。次いで、宿主細胞は、（i）第二融合体-イムノグロブリン軽鎖対と共有結合した第一融合体を含んでなるヘテロ三量体；（ii）第二融合体-イムノグロブリン軽鎖対を共有結合した２つを含んでなるヘテロ四量体；そして、（iii）第一融合体の分子共有結合した２つを含んでなるホモ二量体の混合物を産生するためにＤＮＡ配列を発現するように培養される。産物の混合物は細胞培養物から除去され、ヘテロ三量体は他の産物から単離される。このアプローチ法は、国際公開第94/04690号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。

米国特許第5,731,168号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常領域のＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。

二重特異性抗体は、架橋した又は「ヘテロコンジュゲート」抗体もまた含む。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体の一方はアビジンに結合され、他方はビオチンに結合され得る。そのような抗体は、例えば、不要の細胞に対する免疫系細胞をターゲティングするため(米国特許第4,676,980号)、及びHIV感染の治療のために提案された(国際公開第91/00360号、同92/200373号、及び欧州特許第03089号)。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋法を用いて作製することができる。好適な架橋剤は当該分野において良く知られており、幾つかの架橋技術と共に米国特許第4,676,980号等に開示されている。

抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してF(ab')₂断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab'-TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab'-チオールに再転換し、他のFab'-TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作製された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
さらに、Fab'-SH断片は大腸菌から直接回収され、二重特異的抗体を形成するために化学的にカップリングされ得る（Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)）。

組換体の細胞培養物から直接二重特異的抗体断片を調製し、単離するための種々の方法も、記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して産生されている（Kostelny等, J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)）。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの産生に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）に重鎖可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと強制的に対形成させられ、これにより２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている（Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)）。

二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる（Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)）。
ポリペプチド変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、これらに限られないが、天然源からの単離（天然発生アミノ酸配列変異体の場合）又はオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、又は該ポリペプチドの初期調製された変異体又は非変異体種のカセット突然変異誘発を含む。
エフェクター機能に関する本発明の抗体を修飾することは、例えばFcレセプター結合性を増強するために、望ましい。このことは、抗体のＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸置換を導入することで達成される。あるいは、又は付加的にシステイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。

抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第5,739,277号に記載されたようにして、抗体(特に抗体断片)にサルベージレセプター結合エピトープが導入される。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインヴィボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。
ここでは、抗体の他の修飾が考慮される。例えば、抗体は種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーに結合してもよい。

Ｂ．複製可能なベクターへの核酸の挿入
異種の核酸（例えば、cDNA又はゲノムDNA）は、適切なプロモーターのコントロールの下、大腸菌中における発現のための複製可能なベクターへ適切に挿入される。多くのベクターは、かかる目的のために利用可能であり、適当なベクターの選択は、主として挿入されるべき核酸のサイズ、及びベクターにより形質転換される特定の宿主細胞に依存する。各ベクターは、それが適合する特定の宿主細胞に依存する種々の成分を含む。特定の宿主タイプに依存し、一般にベクター成分には、限定はしないが、以下の一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、プロモーター、及び転写終結配列。

一般には、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコン及びコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、大腸菌宿主との関連で用いられる。そのベクターは、通常、複製部位、並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を保持する。例えば、大腸菌は、典型的には、E.coli種由来のプラスミドであるpBR322を使って形質転換される（例えば、Bolivar等、Gene, 2: 95 (1977)参照）。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、よって形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。そのpBR322プラスミド、もしくは他の微生物プラスミド又はファージもまた、選択マーカー遺伝子の発現のために宿主によって使用され得るプロモーターを含むか、又は含むよう改変される。

（i）シグナル配列成分
ここで対象となるポリペプチドをコードするDNAは、直接発現されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟ポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合体としても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、又はベクターに挿入されたポリペプチドコードDNAの一部であってもよい。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。
天然又は真核生物のポリペプチドシグナル配列を認識しない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換できる。

（ii）複製開始点成分
発現ベクターは、一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は様々な細菌に対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大腸菌などの大部分のグラム陰性細菌に好適である。

（iii）選択遺伝子成分
通常、発現ベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換された宿主細胞の生存又は増殖に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されない宿主細胞は、培地中で生存できない。この選択可能マーカーは、この発明で利用され、定義されるような遺伝学的マーカーとは区別される。典型的な選択遺伝子は、(a)例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質又はその他の毒素に耐性を付与し、(b)遺伝学的マーカーの存在によって誘導される欠陥以外の栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバチラス菌に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。

選択技術の一例においては、宿主細胞の増殖を抑止する薬物が用いられる。この場合、対象の核酸で首尾よく形質転換したこれらの細胞は、抗薬物性を付与し、選択療法を生存するポリペプチドを産生する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン（Southern等, J. Molec. Appl. Genet, 1:327 (1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan等, Science, 209:1422 (1980)）又はハイグロマイシン（Sugden等, Mol. Cell. Biol., 5:410-413 (1985)）が使用される。上述の３つの例は、各々、適当な薬剤であるG418又はネオマイシン（ジェネティシン）、xgpt（ミコフェノール酸）、又はハイグロマイシンに対する耐性を伝達するために、真核生物でのコントロールの下、細菌性遺伝子を利用する。

（iv)プロモーター成分
対象のポリペプチドを産生するための発現ベクターは、大腸菌によって認識され、対象のポリペプチドをコードする核酸と作用可能に連結される適切なプロモーターを含む。大腸菌宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)）、アラビノースプロモータシステム（Guzman等, J. Bacteriol., 174:7716-7728 (1992)）、アルカリホスファターゼ、Ｔ７プロモーター、トリプトファン(trp)プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776）、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)）を含む。しかし、他の既知の細菌性プロモーターも適当である。それらのヌクレオチド配列は公表されており、それにより、任意の必要な制限酵素サイトを供給するためのリンカー又はアダプターを用いて、当業者は対象のポリペプチドをコードするDNAにそれらを作用可能に連結する（Siebenlist等, Cell, 20:269 (1980)）ことが可能となる。

好ましくは、本明細書中で用いられるプロモーターは誘発性プロモーター、すなわち薬剤又は条件（例えば周辺質リン酸塩枯渇）を誘発することによって活性化されるものである。本明細書中のそのような誘発性プロモーターはアルカリフォスファターゼプロモーター、ｔａｃプロモーター又はＴ７プロモーターである。
また、細菌のシステムで使用されるプロモーターも、通常、対象のポリペプチドをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガルノ(S.D.)配列を有する。該プロモーターは、制限酵素による切断により細菌由来のDNAから取り外すことができ、所望のDNAを含むベクター中へ挿入することができる。

（v）ベクターの構築及び解析
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの作成には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を切断させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
構築されたプラスミド中において正しい配列であることを確認する解析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ATCC31446)又は他の株を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、成功した形質転換細胞を選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により解析し、及び／又はSanger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977)又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法により、又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499（1980）の方法により配列決定を行った。

Ｃ．宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書中の発現プラスミドの親宿主として好適な大腸菌宿主には、大腸菌W3110(ATCC27,325)、大腸菌294(ATCC31,446)、大腸菌B、及び大腸菌X1776(ATCC31,537)が含まれる。これらの例は制限ではなく例示を目的としている。上述の菌株のうちいずれかの突然変異細胞もまた、開始宿主として使用することができ、この開始宿主はその後変異して、本発明で必要とされる少なくとも最少の遺伝子型を含む。大腸菌株W3110は、組換えＤＮＡ産物の発酵に広く用いられる宿主株であるので、好ましい親大腸菌宿主である。親宿主として使用される開始大腸菌宿主の例を、その遺伝子型と共に、下記の表に示す。

また、36F8を作製する際の中間体、即ち、27B4（米国特許第5,304,472号）及び35E7（27B4より増殖の優れた自発的温度耐性単離コロニー）も適当である。さらに適当な株は、1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示されている突然変異体周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株である。

一実施態様では、使用した大腸菌宿主細胞は、ｇｌｐＴ遺伝子に関する、又は、に関して野生型のもの、例えば４３Ｅ７であるかまたは、ｇｌｐＴ遺伝子を欠損したもの、例えば４３Ｆ６又は６１Ｇ１である。他の実施態様では、使用した大腸菌宿主細胞は、ｐｈｏＡ遺伝子に関する、又は、に関して野生型である。好ましい実施態様では、大腸菌は染色体性ｐｈｏＡに欠陥がある。他の好ましい実施態様では、大腸菌は染色体性ｇｌｐＴ及び染色体ｐｈｏＡに欠陥がある。より好ましい実施態様では、大腸菌は、染色体ｕｇｐではなく染色体ｇｌｐＴ及び染色体ｐｈｏＡに欠陥がある。突然変異体大腸菌宿主が４３Ｆ６又は６１Ｇ１であるのが最も好ましく、その遺伝子型は上記の表に示す。ここで使用する「ｇｌｐＴに関する野生型」は、ｇｌｐＴ＋であるか又はｇｌｐＴ能を有する細胞である大腸菌宿主、すなわち染色体性ｇｌｐＴに欠陥のないものを指す。同様に、本願明細書において用いられる「ｐｈｏＡに関する野生型」はｐｈｏＡ＋であるか又はｐｈｏＡ能を有する細胞である大腸菌宿主、すなわち染色体性ｐｈｏＡに欠陥のないものを指す。

本発明の株は、親株の染色体を組み込むこと、又は後述の実施例に記載する技術を含む他の技術により生成できる。
ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へ挿入する。好ましくは、宿主細胞を上述の発現ベクターで形質転換し、種々のプロモーターを誘導するのに適するように変更された通常の栄養培地中で培養することにより達成される。

形質転換は、ＤＮＡが複製されるように染色体外因子としてないしは染色体構成要素によって微生物内にＤＮＡを導入することを意味する。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそれらの細胞に適する標準的な技術を用いて行われる。Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)のセクション1.82に記載されるように、塩化カルシウムを利用するカルシウム処理は、一般的に、原核細胞又は実質的に細胞壁障壁を含む他の細胞に用いられる。形質転換のための他の方法では、Chung及びMiller, Nucleic Acids Res., 16:3580 (1988)に記載されるように、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯが用いられる。更なる他の方法は技術的にはエレクトロポレーションの使用である。

Ｄ．宿主細胞の培養
対象のポリペプチドを生産するのに使用される大腸菌細胞は、一般的に上掲のSambrook等に記載の好適な培地中で培養される。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択した宿主細胞に以前用いたものであり、通常の当業者に明らかであろう。
細胞は培養液に輸送可能な有機リン酸塩、例として、グリセロリン酸塩、例えばα-グリセロリン酸及び／又はβ-グリセロリン酸、そして、特にグリセロール-２-リン酸塩及び／又はグリセロール-３-リン酸塩を供給しながら培養される。振とうフラスコ又は発酵槽、好ましくは発酵槽において培養されてもよい。ポリペプチドは、細胞質、周辺質又は細胞の培養液から回収されるのが好ましい。

本発明の方法では、核酸の発現は培養工程の任意の期間に始まりうる。しかしながら、核酸の発現は、細胞密度がまだ増加している間に始まるのが好ましい。これは、好適な誘導因子でプロモーターを誘導するか、細胞の成長が停止する前に誘導することによって達成されうる。

ポリペプチドを最大の産生にするための培養液への有機リン酸塩の流加速度は、有機リン酸塩のタイプ、有機リン酸塩の濃度、産生されるポリペプチドのタイプ、プロモーターのタイプ、用いる宿主細胞株、ブロス中の細胞密度を含む多くの因子による。ポリペプチドがＩＧＦ-１であり、産生持続時間の延長を意図して、有機リン酸塩がグリセロール-３-リン酸塩で、記載の培養条件下で１０Ｌスケールである場合、有機リン酸塩の流加速度は約８から約１０リットルにつき約１から約７ｍｍｏｌ／時間が好ましく（図４参照）、約１から約６ｍｍｏｌ／時間がより好ましく、約２から約６ｍｍｏｌ／時間がさらにより好ましく、約２から約５ｍｍｏｌ／時間がさらにより好ましく、約３から約４ｍｍｏｌ／時間が最も好ましい。好適な流加速度は方法、細胞密度、呼吸速度などに依存する。

ポリペプチドがＡｐｏ２Ｌであり、活性増殖期と同調して産物発現を変化させることを意図して、有機リン酸塩がグリセロール-３-リン酸塩で、１０Ｌスケールである場合、有機リン酸塩の流加速度は約８から約１０リットルにつき約４から約１７ｍｍｏｌ／時間が好ましく（図７参照）、約６から約１６ｍｍｏｌ／時間がより好ましく、約８から約１５ｍｍｏｌ／時間がさらにより好ましく、約１０から約１４ｍｍｏｌ／時間が最も好ましい。有機リン酸塩の好適な流加速度は特定の異種性タンパク質の発現に用いる個々の方法ごとに決定する必要がある。

炭素、窒素及び無機リン酸塩供与源の他のいかなる必要な培地成分もまた、適当な濃度で、単独で導入されるか、他の成分ないしは複合体窒素源などの培地との混合物として含まれてもよい。好ましくはまた、無機リン酸塩は、培養工程の開始時の培養液に存在する。このような無機リン酸塩、好ましくはナトリウム及び／又はリン酸カリウムが存在する場合、有機リン酸塩に対する無機リン酸塩の比率は発現するポリペプチドのタイプや用いる有機リン酸塩などの因子に依存する。この割合は当分野の技術者によって容易に決定されるように任意の割合でよく、一般的におよそ１：１０（１０の有機リン酸塩に対して１のＰｉ）から１：０．２５の範囲内である。Ａｐｏ２リガンドについては、およそ１：４から１：０．２５の範囲が好ましく、より好ましくは、およそ１：３から１：０．５、より好ましくはおよそ１：３から１：１、さらにより好ましくはおよそ１：２から１：１、最も好ましくはおよそ１:１である。このような比率は、タンパク質発現の誘発をより早くし、いくつかの例ではより早く産生される産物を得る。培地のｐＨはおよそ５から９の任意の値であり、主に宿主生物に依存する。

起こるべき誘導のためのプロモーターが誘発性プロモーターの場合、一般的に細胞を特定の光学密度に達するまで、例えば誘導が始まる値（例えば誘導因子を添加するまで、培地成分が枯渇するまでなど）である高細胞密度法のおよそ２００Ａ_５５０まで培養し、対象のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を誘導する。

アルカリホスフェートプロモーターが用いられる場合、本発明の対象のポリペプチドの生産のために使用される大腸菌細胞は、上掲のSambrook等に一般的に記載されるようにアルカリホスフェートプロモーターが誘導され得る適切な培地中で培養される。第一に、培地は細菌が成長するために十分な量の無機リン酸塩を含有し、十分な細胞成長を担保してプロモーター制御下にある標的異種ポリペプチドの合成の誘導を抑制する。細胞が増殖し、リン酸塩を利用する場合、培地中の無機リン酸塩レベルを低下させ、それにより無機リン酸塩がなくなるとポリペプチド合成の誘導を引き起こす。例えばＧ２ＰとＧ３Ｐの混合物を含有する供与物又はＧ３Ｐ供与物を添加することによって、無機リン酸塩のない、又は周辺質での無機リン酸塩の飢餓レベルで培養液を変えない条件下で２００ＯＤ_５５０又はそれ以上の高い細胞密度にまで更なる成長が起こり、産物の蓄積が増加又は延長する。

Ｅ．発現検出
遺伝子の発現は、ポリペプチドをコードする配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来のmRNAの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(ＲＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識が使用され、最も一般的なものは、放射性同位体、特に^３２Ｐである。しかしながら、ポリヌクレオチドへの導入のためにビオチン修飾ヌクレオチドを用いるなど、他の技術も使用してよい。次いで、ビオチンはアビジンまたは抗体と結合するための部位として機能し、広範な種々の標識、例えば放射性核種、蛍光、酵素などで標識されてよい。あるいは、タンパク質の検出のためにアッセイ又はゲルが用いられてもよい。

発現される遺伝子産物の分泌には、宿主細胞を遺伝子産物の分泌のために十分な条件下で培養する。そのような条件には、細胞によって分泌されるような例えば細胞密度条件、栄養分及び温度がある。さらに、このような条件は、当分野の技術者に周知な、細胞が転写、翻訳及び一細胞分画から他の分画へのタンパク質の運搬といった基本的な細胞機能を行うことができる条件である。

Ｆ．ポリペプチドの精製
単独で又は組合せて行われる以下の手順は、適切な精製の手順の例であり、ポリペプチドのタイプに応じて特定の方法を使用する。それらは、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、疎水性相互作用クロマトグラフィー、シリカ上のクロマトグラフィー、イオン交換樹脂、例としてＳ-ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭ及びＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法、及び例えばＳＥＰＨＡＤＥＸ^ＴＭＧ-７５培地を用いたゲル濾過である。モノクローナル抗体は従来の抗体精製手法、例えばプロテインＡ-ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭ培地、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、透析又は親和性クロマトグラフィによって培養物から単離してもよい。

以下の実施例を参照することにより、本発明に対する理解を深めることができる。しかしながら、以下の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。本明細書に記載する特許文献及び文献のすべては、参照により本明細書に包含される。

実施例１
ラマ抗体断片（重鎖）及びＡｐｏＬの産生のための振とうフラスコ培養へのＧ３Ｐの供給
基礎環境
低リン酸塩培養液（ＣＲＡＰ）あるいは高リン酸塩培養液（ＴＨＣＤ）の２００ｍＭＧ３Ｐ（終濃度）混合液を、振とうフラスコ培養物中の異種タンパク質の発現についてそれぞれの対照添加液（水）と比較した。この実施例の第一部では、標的異種タンパク質は１３ｋＤラマ抗ＨＣＧラクダ科モノボディ(monobody)である。ラクダ科抗体は２種、モノボディ(monobody)と称する軽鎖を欠損した２つの軽鎖及び１つの重鎖ＩｇＧ分子と２つの重鎖から成る標準的なＩｇＧ分子を有することが既に示されている。ラクダ科モノボディは、低リン酸塩培養液（ＣＲＡＰ）又は高リン酸塩培養液（ＴＨＣＤ）の何れかにおいてｔａｃプロモータを用いてＢＬ２１（大腸菌Ｂ株）によって発現される。抗体断片コード化配列の前のｍａｌＥ結合タンパク質シグナル配列は、宿主の周辺質内に発現タンパク質を分泌させる。この実施例の第二部では、Ｇ３Ｐ添加培地及び無添加ＣＲＡＰ培地中でＴ7プロモータを用いてＨＭＳ１７４（大腸菌Ｋ１２株）内でのＡｐｏ２リガンドの発現を制御した。所望の細胞密度に達するとすぐに、両方の実験で異種タンパク質の産生をＩＰＴＧの添加によって誘発した。

材料と方法
ｐＣＢ３６６２４８６.ＲＩＧプラスミド構築
ｐＣＢ３６６２４＿８６.ＲＩＧは、ベクターｐＬ１６０２(Sidhu等, J. Mol. Biol., 296:487-495 (2000))を修飾することによって構築した。ｐＴａｃプロモータ配列及びｍａｌＥ分泌シグナル配列を有するベクターｐＳ１６０２は、ファージｍｕの遺伝子-３微量コートタンパク質（ｐ３）のＣ末端ドメインに融合したヒト成長ホルモンの１つの配列を含有した。ｈＧＨをコードする配列は除去され、結果として生じるベクター配列はラマ抗ＨＣＧ抗体をコードする合成ＤＮＡ断片の挿入のためのベクター主鎖として機能した(Spinelli等, Nat. Struct. Biol. 3(9): 752-757 (1996))。結果として生じるファジミド（ｐＣＢ３６６２４）は、ＩＰＴＧ誘導可能なＰｔａｃプロモータの管理下で融合産物をコードした(Amman及びBrosius, Gene, 40: 183-190 (1985))。発現されるポリペプチドには、マルトース-結合タンパク質シグナルペプチド、その後に抗ＨＣＧコード領域が続き、ＦＬＡＧエピトープタグが続き、抑圧停止コドンを含有するＧｌｙ／Ｓｅｒリッチリンカーペプチドが続き、その後にＰ３Ｃ（ファージコートタンパク質のＣ末端ドメイン）が含まれる。

ファージディスプレイライブラリは、適当に設定された「停止テンプレート」ファジミドを用いてSidhu等, J. Mol. Biol., 296: 487-495 (2000)の方法により構築した。ライブラリＮＮＳ１７については、コドン９３、９４、１００及び１０１の位置にＴＡＡ停止コドンを含有するｐＣＢ３６６２４の誘導体をＫｕｎｋｅｌ突然変異誘発法(Kunkel等, Methods Enzymol., 154: 367-382 (1987))のテンプレートとして、停止コドンを同時に修復してＧｌｙ９５とＴｒｐ１０３の間に１７ＮＮＫ変性コドンを導入するように設定した突然変異オリゴヌクレオチドＮＮＳ１７と共に用いた。
NNS17: GCC GTC TAT ACT TGT GGT GCT GGT NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGG GGT CAG GGT (配列番号:3)

すべてのモノボディと同様に、ラマ抗ＨＣＧはＶｈ３ファミリーメンバーでありプロテインＡにより認識される。プロテインＡ結合相互作用をＣＤＲ３媒介性安定の代わりに用いた。結果として生じたファージライブラリをスキャホルド(足場、scaffold)安定性及び発現の読み取りとしてプロテインＡに対する複数回の振り分けによって分類した。分類したライブラリをＮＮＳライブラリ中のアミノ酸分布における選択バイアスについて分析した。位置９６、９７及び９８の配列により命名されたスキャホルドＲＩＧは配列残基に基づいて最も有力なクローンとなった。スキャホルドＲＩＧの１７アミノ酸長ＣＤＲ３配列をRIGRSVFNLRRESWVTW(配列番号:4)と決定した。スキャホルドＲＩＧを有するファジミドはｐＣＢ３６６２４＿８６.ＲＩＧと再呼称し、以下のＤＮＡ配列を有する：
5'-GATGTTCAGT TGCAGGAATC AGGCGGTGGC TTGGTACAGG CCGGAGGTTC GTTGCGTTTG TCCTGTGCTG CCTCGGGTGC TACTGGTTCT ACTTATGATA TGGGCTGGTT TCGTCAGGCT CCGGGTAAAG AACGTGAATC GGTTGCCGCC ATTAACTGGG GGTCGGCTGG GACTTACTAT GCTTCGTCCG TCCGTGGTCG TTTTACTATT TCACGTGATA ATGCCAAAAA AACTGTCTAT TTGCAGATGA ATTCATTGAA ACCAGAAGAT ACTGCCGTCT ATACTTGTGG TGCTGGTAGG ATCGGCCGGT CGGTCTTCAA CTTGAGGAGG GAGAGCTGGG TCACGTGGTG GGGTCAGGGT ACCCAGGTCA CTGTCTCCTC TGCCGGTGGT ATGGATTATA AAGATGATGA TGATAAA-3' (配列番号: 5)。

ｐｅｔ１９ｂ.ｎｏｈｉｓプラスミドの構築
標準的な分子生物学的技術を用いて、Ａｐｏ２Ｌコドン１１４-２８１をヒト胎盤ｃＤＮＡから単離した完全長Ａｐｏ２Ｌクローンからポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。クローニングを容易にするために制限酵素部位を含有する付加的ヌクレオチドを５'及び３'配列にそれぞれ付加した。５'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
5’ GCTTGCTACATATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGA 3’ (配列番号:6)
を有し、下線で示すＮｄｅＩ制限酵素部位を含有する。３'オリゴヌクレオチドプライマーは、配列
5’ CTTGAATAGGATCCCTATTAGCCAACTAAAAAGGCCCCAAAA AAACTGGC 3’ (配列番号:7)
を有し、下線で示すＢａｍＨＩ制限酵素部位を含有する。結果として生じた断片を制限酵素部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いて、修飾したバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９２(Pharmingen)のＨｉｓ１０タグを含有する配列とエンテロキナーゼ切断部位の下流とフレーム内にサブクローニングした(Pitti等, J. Biol. Chem., 271:12687-12690 (1997))。ｐＶＬ１３９２-Ａｐｏ２ＬをＮｄｅＩとＢａｍＨＩを用いて消化し、生成されたＮｄｅＩからＢａｍＨＩの断片をｐＥＴ-１９ｂ(Novagen)内にサブクローニングして、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩにて消化した。その結果生じたプラスミドをｐｅｔ１９ｂ.ｎｏｈｉｓと命名した。

細菌株
ＢＬ２１（Stratagene）及びＨＭＳ１７４（Merck）の受容細胞をそれぞれｐＣＢ３６６２４＿８６.ＲＩＧ及びｐｅｔ19ｂ.ｎｏｈｉｓにより、標準的方法を用いて形質転換した。形質転換体は、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン（ＬＢ＋ＣＡＲＢ５０^ＴＭカルベニシリン）を含有するＬＢプレート上で生育させた後に回収し、素早く精製し、３０℃の恒温器中で５０μｇ／ｍＬＣＡＲＢ５０^ＴＭカルベニシリンを有するＬＢ培養液中で生育させた。ｐＣＢ３６６２４＿８６.ＲＩＧは、産生宿主ＢＬ２１／ｐＣＢ３６６２４＿８６.ＲＩＧに、ｐｅｔ１９ｂ.ｎｏｈｉｓはＨＭＳ１７４／ｐｅｔ１９ｂ.ｎｏｈｉｓにカルベニシリン耐性を与え、抗生物質存在下で形質転換した宿主を生育させた。

発酵培養液
低リン酸塩（ＣＲＡＰ）培養液及び高リン酸塩（ＴＨＣＤ）培養液を用いてラマ抗体断片及びＡｐｏ２リガンド産生を評価した。培地組成物（初期の培地のリットル当たり利用される各々の成分の量）を以下に示す：

２００ｍＭのＧ３Ｐ-添加培地を調製するために、５ｍｌの１ＭＤＬ-α-グリセロリン酸塩（Ｇ３Ｐ）(Sigma Chem. Co.)を、接種の前に、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む低ＰＯ_４培地（低ＰＯ_４培地＋ＣＡＲＢ５０^ＴＭカルベニシリン）又は５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む高ＰＯ４培地（高ＰＯ_４培地＋ＣＡＲＢ５０^ＴＭカルベニシリン）２０ｍｌに加えた。無添加の（対照）培地は、Ｇ３Ｐの代わりに５ｍｌの水を用いた。

振とうフラスコ発酵
振とうフラスコ発酵は、対照又はＧ３Ｐ-添加培地を２５ｍｌ含有する１２５ｍｌの整流装置上のフラスコにて行った。ＬＢ＋ＣＡＲＢ５０ＴＭカルベニシリン中でのＢＬ２１／ｐＣＢ３６６２４＿８６.ＲＩＧ又はＨＭＳ１７４／ｐｅｔ１９ｂ.ｎｏｈｉｓ生育の終夜培養物を対照又はＧ３Ｐ-添加培地への接種のためにおよそ１：１００に逆希釈した。培養物は２５０回転数／分で振とう装置上で３０℃で暖め、細胞密度が培地で担保される潜在的細胞発育のおよそ５０−６０％に達するときに、１ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって産物発現を誘発した。誘導因子の添加の直前と接種後およそ２４時間に１ｍｌの培養液培養物から取り出した細胞ペレットを調整し、−２０℃で保存した。

ＰＡＧＥ及び濃度測定によって分析したラマ抗体断片蓄積
１ｍｌの培養物試料から調製した凍結（−２０℃）細胞ペレットを解凍し、１０ｍＭトリス, ｐＨ７．６＋１ｍＭＥＤＴＡ, ｐＨ８．０(ＴＥ)の十分量に再懸濁して細胞懸濁液を１ＯＤ／２５μｌ濃度にした。２５μｌのＴＥ-細胞懸濁液を、２５μｌのβ-メルカプトエタノールを含有する2Ｘサンプルバッファと混合した。混合液を９５℃より高い温度で５分間熱し、１０μｌ（０．２ＯＤと等量）をＮＵ-ＰＡＧＥ^ＴＭ成形１０％Ｂｉｓ-トリスゲル（Novex）上のウェルに流した。電気泳動は、ＭＥＳ緩衝液（１ＮＮａＯＨなどにより適当なｐＨに調整した脱イオン化水中の２-(Ｎ-モルホリノ)エタンスルホニック酸）にて行った。分析されたゲルを、ＣＯＯＭＡＳＳＩＥＢＬＵＥＲ２５０^ＴＭ染色液で染色してから、脱色した。１３ｋＤ抗体断片のバンド強度は、コダック画像処理システムで湿性ゲルをスキャンした後にコダックＤＩＧＩＴＡＬＳＣＩＥＮＣＥ 1ＤＴＭ画像処理ソフトウェアを用いて測定した。

逆相ＨＰＬＣにより分析したＡｐｏ２リガンド蓄積
１ｍｌの培養物試料から調製した凍結（−２０℃）細胞ペレットを、十分量のＴＥ緩衝液に再懸濁して細胞懸濁液を１ＯＤ／２５μｌ濃度にした。２０μｌの細胞懸濁液を、４８０μｌの６ＭグアニジンＨＣｌ, ｐＨ９．０＋１００ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）と混合し、１時間室温にてインキュベートし、１３，０００回転数／分で１５分間遠心分離して、上清／抽出物を回収した。抽出物を、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥＴＭスピンフィルタにて濾過し、２０μｌを逆相クロマトグラフィのためにＨＰＬＣカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＰＯＲＯＳＲＲ１／１０培地）に流した。８０℃で１．０ｍｌ／分で移動相に流してＨＰＬＣ分離を行い、混入タンパク質からＡｐｏ２Ｌを分離するために２０分にわたって０．１％のＴＦＡを含む２８％〜３５％勾配のアセトニトリルを用いた。２８０ｎｍ波長でピークを検出した。試料に存在する単量体の量は、同じ方法によって分析される５−２０μｇの精製標準物質に関するピークの下で領域から得られる平均応答因子（ｍＡＵ／μｇ）を用いて算出した。

結果
図１は、対照に対して２００ｍＭのＧ３Ｐを添加した高ＰＯ_４（ＴＨＣＤ）培地と低ＰＯ_４（ＣＲＡＰ）培地の両方において抗体が高レベルに発現されたことを示す。
図２は、対照に対して２００ｍＭのＧ３Ｐを添加した低ＰＯ_４（ＣＲＡＰ）培地においてＡｐｏ２Ｌタンパク質が高レベルに発現されたことを示す。

実施例２
アルカリンホスファターゼプロモーターにより制御されるＩＧＦ-Ｉの産生のための野生型宿主又は(ΔglpT phoA- ugp+)宿主細胞の１０Ｌ発酵培養物へのＧ３Ｐの供給
材料と方法
ＩＧＦ-Ｉの発現のためのpBKIGF-2Bプラスミド
米国特許第５,３４２,７６３号において詳述されるように、本願明細書においてＩＧＦ-Ｉの発現のために用いるプラスミドｐＢＫＩＧＦ-２を構築した。このプラスミドはｐＢＲ３２２の基本的な主鎖から構築した。大腸菌のＩＧＦ-Ｉ遺伝子の発現に必要な転写及び翻訳配列は、アルカリホスファターゼプロモータ及びｔｒｐシャイン‐ダルガーノ配列によって提供された。転写終末因子に対するラムダを、ＩＧＦ-Ｉ終止コドンに隣接させた。ｌａｍＢシグナル配列によって細胞質からのタンパク質の分泌を意図した。大多数のｒｈＩＧＦ-Ｉは、細胞細胞膜周辺腔に見られた。プラスミドｐＢＫＩＧＦ-２Ｂは形質転換宿主にテトラサイクリン耐性を与えた。

細菌株と生育条件
ＩＧＦ-Ｉ発酵に用いられる宿主は大腸菌Ｗ3110の派生物である (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁)。野生型ｇｌｐＴを有する宿主に関する実験は43Ｅ7菌株（大腸菌Ｗ3110 ｆｈｕＡ(ｔｏｎＡ)Δ(ａｒｇＦ-ｌａｃ)ｐｔｒ３ｄｅｇＰ４１ΔｏｍｐＴΔ(ｎｍｐｃ-ｆｅｐＥ)ｉｌｖＧ＋ｐｈｏＡ）を用いて行い、ΔｇｌｐＴ突然変異を有する宿主に関する実験は４３Ｆ６菌株（大腸菌Ｗ３１１０ｆｈｕＡ(ｔｏｎＡ)Δ(ａｒｇＦ-ｌａｃ)ｐｔｒ３ｄｅｇＰ４１ΔｏｍｐＴΔ(ｎｍｐｃ-ｆｅｐＥ)ｉｌｖＧ＋ｐｈｏＡΔｇｌｐＴ）を用いて行った。４３Ｅ７又は４３Ｆ６のコンピテント細胞は、標準的方法を用いてｐＢＫＩＧＦ-２Ｂを形質転換した。形質転換体は、２０μｇ／ｍＬテトラサイクリン（ＬＢ＋ＴＥＴ２０^ＴＭテトラサイクリン）を含有するＬＢプレート上で生育した後に回収し、すぐに精製して、３７℃の振とう／恒温器中で２０μｇ／ｍＬＴＥＴ２０^ＴＭテトラサイクリンを含有するＬＢ培養液中で生育させた後に発酵糟中で試験した。ｐＢＫＩＧＦ-2Ｂによって、産生宿主にテトラサイクリン耐性が生じ、形質転換宿主は抗生物質存在下でも成長し得る。

１０Ｌ発酵工程
ＩＧＦ-Ｉの発現に用いられる発酵培養液組成及び動作手順は、米国特許第５,３４２,７６３号に記載されるＩＧＦ-Ｉ方法で用いられるものと多少類似していた。簡単に言うと、４３Ｅ７／ｐＢＫＩＧＦ-２又は４３Ｆ６／ｐＢＫＩＧＦ-２の振とうフラスコ種培養物を豊富な産生培養液に植えた。培養液の組成物（初期培地のリットル当たり利用される各々の成分の量）を以下に示す：

＊グルコース、酵母抽出物、メチオニン及びＮＺアミンＡＳの一部は最初に培養液に加え、残りは発酵期間中に与えた。

１０Ｌ発酵は、以下に示す発酵パラメータを用いたバッチ法であった：

グリセロール-３-リン酸塩（Ｇ３Ｐ）を供給する実験では、１ＭＧ３Ｐ原液の適量を複合体窒素供給体内に閉じこめ、続く供給物の流加速度を増やして所望の量の複合体窒素とＧ３Ｐを培養物に与えた。
Ｇ３Ｐ供給の有無によるΔｇｌｐＴ突然変異の影響をＩＧＦ-Ｉ蓄積の違いによって評価した。６Ｍグアニジン＋１００ｍＭＤＴＴに溶解した試料のＩＧＦ-Ｉの総量を、米国特許第６,５５９,１２２号にて詳述されるように、逆相ＨＰＬＣ法で測定した。

結果
図３は、野生型宿主（４３Ｅ７）でＡＰプロモータを有し連続的にグルコースを与えたものでＧ３Ｐを培養液に与えたものは、与えなかったものよりＩＧＦ-Ｉの分泌量が顕著に高かったことを示す。
図４は、ΔｇｌｐＴ宿主（４３Ｆ６）及びＡＰプロモータを有するもので、培養液におよそ８リットル当たり１．１８ｍｍｏｌ／時又は３．２８ｍｍｏｌ／時でＧ３Ｐを与えたものは、Ｇ３Ｐを与えなかったものよりＩＧＦ-Ｉの分泌量が顕著に高かったが、およそ８リットル当たり８．２２ｍｍｏｌ／時でＧ３Ｐを与えたものはそれほど高くなかった。産物、有機リン酸塩のタイプなどに応じて当分野の技術者は最適な流加速度を容易に測定可能である。記載された発酵方法、ＩＧＦ-Ｉ産生のための１０Ｌ発酵糟での培養の条件下では、最適なＧ３Ｐ流加速度があり、それはおよそ８ないし１０リットル当たり好ましくは約１ないし約７ｍｍｏｌ／時の範囲、より好ましくは約１ないし約６ｍｍｏｌ／時、より好ましくは約２ないし約６ｍｍｏｌ／時、さらにより好ましくは約２ないし約５ｍｍｏｌ／時、最も好ましくは約３ないし約４ｍｍｏｌ／時である。この流加速度の範囲のものは対照に対して産生物の量は増加しなかったが、対照と比較して産生の持続時間が延長した。

実施例３
１０Ｌ法におけるＡｐｏ２リガンド蓄積の改良のためのグリセロ-３-リン酸塩の供給
Ａｐｏ２リガンドの基礎環境
腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）(Wiley等, Immunity, 3: 673-682 (1995))とも称するアポトーシス誘発リガンド２（Ａｐｏ２Ｌ）(Pitti等, J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996))は、タイプＩＩ膜タンパク質及びリガンドのＴＮＦファミリのメンバーである。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、同系の死レセプターに結合することによって、多種多様な癌細胞においてアポトーシスを誘導するがほとんどの正常細胞では誘導しない。（国際公報９９／００４２３；Ashkenazi, FASEB J., 13: (7) A1336 (April 23, 1999)；Ashkenazi, Nature Reviews - Cancer, 2: 420-430 (2002)）。アミノ酸残基１１４-２８１に対応するＡｐｏ２リガンドの細胞外ドメインの可溶性断片（以降はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬと称する））は、現在潜在的臨床研究の調査中にあり、大腸菌においてうまく発現された。

発酵法の基礎的説明
発現ベクターは、およそ１９．５ｋＤａのポリペプチドの産生を制御するようにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）プロモータをコード化している。リボソームから放出された発現された新生ポリペプチドは細胞質中で単量体に折り畳まれ、さらに集積して生物学的に活性なホモ三量体になる。発酵の間、方法パラメータは、細胞活性がおよそ３．０ｍｍｏｌｅ／Ｌ-分の最大酸素摂取速度で行われるように設定した。培養液を回収した後、細胞質にとどまっている異種タンパク質は物理的な細胞破壊によって回復されうる細胞溶解物内に放出される。

材料と方法
ｐＡＰＡｐｏ２-Ｐ２ＲＵプラスミド構築
ｐＡＰＡｐｏ２-Ｐ２ＲＵは、２００１年１月４日公開の国際公報０１／００８３２に記載される。簡単に言うと、図５に示すコンストラクトのプラスミドは、Ａｐｏ-２Ｌ（アミノ酸残基１１４-２８１）とｐｒｏ２及びａｒｇＵによってコードされるまれなコドンｔＲＮＡとの共発現をコード化する、この共発現はアルカリホスファターゼプロモータによって制御される。ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド(Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43:77-90 (1978)) であるｐＡＰＡｐｏ２-Ｐ２ＲＵを用いて、大腸菌内でＡｐｏ-２Ｌを産生された。プラスミドｐｈＧＨ１について記載のあるように (Chang等, Gene, 55:189-196 (1987))、Ａｐｏ-２Ｌの発現に必要な転写及び翻訳配列はアルカリホスファターゼプロモータ及びｔｒｐシャイン‐ダルガーノ配列によって提供される。Ａｐｏ-２Ｌのコード配列（１１４-２８１に由来）は、プロモータとシャイン‐ダルガーノ配列の下流に位置し、開始メチオニンの後にある。コード配列は、コードするコドンが潜在的な二次構造を取り除くために残基Ｐｒｏ１１９が「ＣＣＴ」の代わりに「ＣＣＧ」に変化されていること以外は、Ａｐｏ-２Ｌの残基１１４-２８１をコードするヌクレオチド（図６に示す）を含む（図６、配列番号：１及び２はそれぞれヌクレオチド配列及びアミノ酸配列）。転写終末因子に対するラムダをコードする配列(Scholtissek等, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987))を、Ａｐｏ-２Ｌコード配列に続けた。

さらにまた、このプラスミドはｔＲＮＡのｐｒｏ２(Komine等, J. Mol. Biol., 212:579-598 (1990))とargU/dnaY (Garcia等, Cell, 45:453-459 (1986))の発現のための配列を含む。これらの遺伝子は大腸菌Ｗ３１１０からのＰＣＲにてクローニングし、lambda t_o転写終末因子の下流に配置した。このプラスミドは産生宿主にテトラサイクリン耐性とアンピシリン耐性を与える。

細菌株と生育条件
４３Ｅ７菌株（大腸菌Ｗ３１１０ｆｈｕＡ(ｔｏｎＡ)ｐｈｏＡΔ(ａｒｇＦ−ｌａｃ)ｐｔｒ３ｄｅｇＰｏｍｐＴｉｌｖＧ＋)）を野生型産生宿主として用いて、４３Ｆ６、Ａｐｏ２リガンドの発現のためのｇｌｐＴ突然変異宿主及びまれなコドンｔＲＮＡと比較した。４３Ｅ７又は４３Ｆ６のコンピテント細胞を調製し、標準的方法を用いてｐＡＰＡｐｏ２-Ｐ２ＲＵにて形質転換した。形質転換体は、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン（ＬＢ＋Ｔｅｔ２０）を含有するＬＢプレートから回収し、すぐに精製して、３０℃の振とう／恒温器中で２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬＢ培養液において生育させて、ＤＭＳＯ中で−８０℃で保存した。

Ａｐｏ２Ｌ産生のための発酵方法
振とうフラスコの種菌は、４−６ｍＭリン酸ナトリウムを含有する無菌のＬＢ培養液に新たに解凍した保存培養物バイアルを接種することによって調製した。適当な抗生物質を培養液に含ませて選択性を与え、プラスミドの保有を確認した。フラスコ培養物は、およそ３０℃（２８℃−３２℃）で１４−１８時間、浸透しながらインキュベートした。次いで、この培養物を産生用発酵容器に播種した。播種容量は、培養液の初期容積の０．１％と１０％の間とした。

表１に示す産生培養液中でＡｐｏ２Ｌの産生を行い、およそ１０リットルの最終的な培養物容量を得た。発酵工程は、およそｐＨ７．０（６．５−７．５）に調整し、３０℃（２８℃−３２℃）で行った。空気飽和率と撹拌速度は、培養物に十分な酸素が供給されるように設定した。バッチ処理されたリン酸塩がなくなる直前に（およそ７５−８５ＯＤ）、ＤＬ-α-グリセロリン酸の供給を開始し（ベンダー製品仕様は、８０−９０％の産物純度で、主要な不純物としてβ-グリセロリン酸を示す）、所望の流加速度で与えた。発酵工程の全体にわたって、好気条件を確認しながらコンピュータアルゴリズムに基づいて、一次炭素供給源としてグルコースを細胞培養物に与えた。

発酵工程の間におよそ５０−１５０μＭ（終濃度）ＺｎＳＯ_４を２つのバッチで添加した。一つは産生物発現誘導の直前で、他方はホモ三量体集積のための産生期間のおよそ中間時とした。この実験では、光学濃度およそ８０−１２０ＯＤ_５５０の培養物で、播種からおよそ２８時間後に添加した。
回収するまでおよそ３４−４５時間発酵を行った。

表１ＡＰプロモーター発現系のための産生培養液組成

ａこれら成分の一部は発酵中に培養液に与えてもよい。水酸化アンモニウムはｐＨを調整するために必要に応じて添加した。

イオン交換ＨＰＬＣクロマトグラフィ法による発酵工程中の可溶性産生物蓄積の評価
発酵工程後の培養液試料を用いた。細胞密度を２０ＯＤ_５５０に希釈した発酵液試料の１ミリリットルから遠心分離によって細胞を回収し、結果として生じた細胞ペレットを分析時まで−２０℃に保存した。細胞ペレットを解凍して、０．５ｍｌの抽出緩衝液（５０ｍＭＨＥＰＥＳ, ｐＨ８．０、５０ｍＭＥＤＴＡ及び０．２ｍｇ／ｍｌ雌鶏卵白リゾチーム）中に再懸濁し、細胞質から産生物を放出させるために機械的に粉砕した。固形物を遠心分離によって細胞溶解物から取り除いて、浄化した溶解物を三量体定量化のためにＨＰＬＣカラム（ＤＩＯＮＥＸＰＲＯＰＡＣ^ＴＭＩＥＸ培養液）に流した。ＨＰＬＣアッセイ法により、５％−２２％の勾配を付けた１ＭＮａＣｌを含む２５ｍＭリン酸塩(ｐＨ７．５)緩衝液を０．５ｍｌ／分の流速で、２５分にわたって用いて、混入している大腸菌タンパク質から産生物を分離した。

逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィによる発酵工程中の相単量体Ａｐｏ２Ｌ発現の評価
新鮮培養液又は予め凍結しておいたものと解凍した試料を用いて総単量体産生物を定量化した。２０μｌの試料を４８０μｌの１００ｍＭＤＴＴを含む６ＭグアニジンＨＣｌ, ｐＨ９．０に混合して、室温で１時間インキュベートして、１３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して抽出物を回収した。抽出物をスピンフィルターに濾過して、逆相クロマトグラフィのために２０μｌをＨＰＬＣカラム(PerSeptive Biosystems POROS(登録商標) R1/10培養液)に流した。８０℃で移動相を１．０ｍｌ／分で流し手ＨＰＬＣ分離を行い、混入したタンパク質からのＡｐｏ２Ｌの分離のために２０分間にわたって０．１％ＴＦＡを含む２８％から３５％のアセトニトリル勾配を用いた。２８０ｎｍ波長でピークを検出した。試料中に存在する単量体の量を、同じ方法で分析した５−２０μｇの精製標準物質に関するピークの下での領域の平均応答因子（ｍＡＵ／μｇ）を用いて算出した。

結果
図７は、ΔｇｌｐＴ宿主（４３Ｆ６）への最適なＧ３Ｐ流加速度により特異的な産生物タイターが改善されたことを示す（グラフ中の特異的タイター、μｇ／ＯＤ-分で示す）。すべてのＧ３Ｐ供給試料は供給のない対照よりよい結果となった。この実験では、およそ８リットルの培養液を流加速度を６〜１２ｍｍｏｌ／時間から増やすと、特定の産生物タイターが改善されたが、１２ｍｍｏｌ／時から１８ｍｍｏｌ／時以上に流加速度を上げると、特定のタイターは低かった。最適なＧ３Ｐの流加速度により、産生物、有機リン酸塩のタイプなどに応じて当分野の技術者により容易に測定できるであろう。これら特異的条件下での、この特定の産生物であるＡｐｏ２Ｌを産生させるための１０Ｌ発酵糟での培養では、およそ８−１０リットル当たりのＧ３Ｐの好適な流加速度は、好ましくは約４から約１７ｍｍｏｌ／時、より好ましくは約６から約１６ｍｍｏｌ／時間、より好ましくは約８から約１５ｍｍｏｌ／時間、最も好ましくは約１０から約１４ｍｍｏｌ／時間の範囲である。

図８は、野生型ｇｌｐＴ宿主（４３Ｅ７）への無機リン酸塩の供給に対してＧ３Ｐを供給により特定の産生物タイターが改善されたことを示す（グラフ中の特異的総蓄積、μｇ／ＯＤ-ｍｌで示す）。グリセロリン酸塩の供給によりＡｐｏ２Ｌの特異的な総蓄積が改善された一方で、無機リン酸塩の供給は供給なしの対照と比較して特異的な総蓄積に負の影響があった。用いたよりもより低いグリセロリン酸を用いると同様な傾向となるであろう。この結果は、野生型ｇｌｐＴ宿主にグリセロリン酸を与えることによって発現レベルが高くなりうることを意味するし、そのことを示す。さらに、この特定の実験では、無機リン酸塩供給の場合と同様に、グリセロリン酸が供給される場合、培養物細胞密度が２００ＯＤ_５５０以上に増加する。これは供給しない場合にはみられない。

実施例４
活性増殖期の間のＡＰプロモータ制御Ａｐｏ２Ｌ産生物の発現
同じプラスミドコンストラクト、産生宿主菌株、培養液組成、発酵工程及び産生物アッセイ方法を、リン酸塩バッチング及びＧ３Ｐ添加を除いて実施例３にて説明したように用いた。対照工程の塩バッチングに一般的に含まれる一部の無機リン酸塩を、等量モルのＧ3Ｐに置換し、播種直後かあるいはバッチした無機リン酸塩がなくなる２、３時間前の何れかの時期に加えた。これらの例では、添加したＧ3Ｐは、添加後の重大な細胞発育期間でのリン酸塩の供与源であると思われた。

活性増殖期の間のＡｐｏ２Ｌ産生のための発酵工程
種菌調製手順は実施例３に記載される通りである。７５％又は５０％のリン酸塩塩類を初期バッチングから取り除き、播種後のバッチ添加として等量モルのＧ3Ｐに置き換えたことを除いては、表１に示す産生培養液中でＡｐｏ２Ｌの産生を行った。標準的な手順に従って、およそ３０℃（２８℃−３２℃）で発酵を行い、およそｐＨ７．０（６．５−７．５）に調整した。空気飽和率及び撹拌速度は実施例３に記載される通りである。５０％の無機リン酸塩をＧ３Ｐに置換する場合、無機リン酸塩は、培養液殺菌の前にバッチ処理したのに対して、グリセロール-３-リン酸塩はバッチ処理したリン酸塩が流れ出すと思われるおよそ１−２時間前（およそ３０−４０ＯＤ_５５０）に置換した。７５％の無機リン酸塩をＧ３Ｐに置換する場合、無機リン酸塩とＧ３Ｐを、発酵槽の播種の直後に加た。発酵工程の間、好気条件を確認しながら、コンピュータアルゴリズムに基づいて一次炭素供給源として細胞培養物にグルコースを与た。Ｚｎは、先の項にて説明したように、発酵プロセスの間に添加した。約３４−４５時間発酵させた。

結果
図９は、５０％−７５％のＰＯ４バッチを野生型宿主及びｇｌｐＴ突然変異宿主の両方でＧ３Ｐに置換した場合、活性増殖期の有意により早い時期に異種タンパク質発現の誘導が起こることを示し、特異的総蓄積曲線はＧ３Ｐ置換を行わなかった野生型宿主を用いて行った２通りの対照が示す曲線の左側にシフトした。これは、発酵工程中のより早い時期に産生物が得られるという点で利点があることを示す。

本明細書で試験したＧ３Ｐに対するＰｉのすべての割合で宿主の種類にかかわらず利点を有するのに対して、表２は、ｇｌｐＴ突然変異宿主４３Ｆ６にＧ３Ｐに対するＰｉを１：１又は１：３の比率で用いると最もＡｐｏ２Ｌ容量生産性が高かったことを示す（平均およそ０．３４ｍｇ／ｍｌ-時に対して、対照宿主については平均およそ０．２４ｍｇ／ｍｌ-時）。さらに、何れかの比率と野生型宿主又は突然変異形宿主を用いるとより早く特異的蓄積のピーク（μｇ／ＯＤ-ｍｌ）に達する（２２−２６時間に対して２８−３０時間）。これは、特定の好ましい実施態様では、本発明は生産性上有意に方法を改善する別の方法よりもおよそ１０％から２５％短い発酵時間で、高くはないが同量の単量体Ａｐｏ２Ｌを産生することができることを示す。

表２発酵の初めの３０時間の間の無機リン酸塩開始バッチングをグリセロリン酸塩添加で置換した効果

実施例５
α-及びβ-グリセロリン酸塩の５０／５０混合物を用いたプロモータ制御Ａｐｏ２Ｌ産生物の発現
６１Ｇ１菌株（ｇｌｐＴ突然変異宿主）を用いて供給源としてＧ３Ｐの代わりにα-及びβ-グリセロリン酸塩のおよそ５０：５０混合物のより低い等級物を用いること以外は、実施例３に記載のものと同じ手順で行った。
結果
図１０は、混合物を用いてもより高い等級のＧ３Ｐ材料を用いても、供給なしの対照に対して同等の回収率の改善が得られたことを示す。α／β混合物の使用により生産結果を損なうことなく原料のコストを抑えることができるであろう。

振とうフラスコ培養にｔａｃプロモータを用いたＢＬ２１大腸菌宿主の分泌されたラマ抗体断片の発現を示す。低リン酸塩（ＣＲＡＰ）又は高リン酸塩（ＴＨＣＤ）培地の添加物として水又は２００ｍＭのＧ３Ｐの何れかを利用している。振とうフラスコ培養にＴ７プロモータを用いたＨＭＳ１７４大腸菌宿主の細胞質のＡｐｏ２Ｌの発現を示す。ＣＲＡＰ培地の添加物として水又は２００ｍＭのＧ３Ｐの何れかを利用している。時間とともに分泌されたＩＧＦ-１蓄積に対する発酵中のＧ３Ｐの供給の効果を示す。これには野生型大腸菌宿主、ＡＰプロモータ、及び、連続的に与えられたグルコースを用いた。時間とともに分泌されたＩＧＦ-１蓄積に対するｇｌｐＴ突然変異と発酵中のＧ３Ｐ供給との効果を示す。これにはΔｇｌｐＴ大腸菌宿主、ＡＰプロモータ、及び、様々なＧ３Ｐ流加速度を用いた。ｐＡＰＡｐｏ２-Ｐ２ＲＵのプラスミド線図を示す。ヒトＡｐｏ-２のリガンドｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）及びその得られたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。ヌクレオチド位置４４７（配列番号：１中）の「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であってもよいことを示す。３つの異なる流加速度でＧ３Ｐを供給されるΔｇｌｐＴ大腸菌（４３Ｆ６）宿主とＧ３Ｐ供給のない対照のＡｐｏ２Ｌの特異的な蓄積に対する効果を示す。野生型ｇｌｐＴ宿主（４３Ｅ７）に無機リン酸塩以上のグリセロリン酸塩を与えたときのＡｐｏ２Ｌの特異的な全蓄積における利点を示す。菌体密度は２００ＯＤ_５５０以上に増加する。野生型ｇｌｐＴ大腸菌宿主（４３Ｅ７）及びΔｇｌｐＴ大腸菌（４３Ｆ６）宿主におけるグリセロリン酸と無機リン酸塩を交換したときのＡｐｏ２Ｌの特異的な全蓄積に対する効果を示す。 ΔｇｌｐＴ大腸菌（６１Ｇ１）宿主における、α-グリセロリン酸とα-グリセロリン酸及びβ-グリセロリン酸の５０：５０の混合物を交換して与えたものの、与えない対照に対する全Ａｐｏ２Ｌ蓄積への効果を示す。

Claims

大腸菌に対して異種性のポリペプチドを産生し、且つ生産量を増大させる方法であって、
（ａ）輸送可能なグリセロリン酸を培養液に供給しながら培養液中でポリペプチドをコードする核酸を含む大腸菌細胞を培養し、核酸を発現させる工程、及び
（ｂ）細胞からポリペプチドを回収し、それによりポリペプチドの生産量を増大させる工程
を含む方法。
グリセロリン酸がα-グリセロリン酸又はβ-グリセロリン酸、又はその混合物である、請求項１に記載の方法。
グリセロリン酸がグリセロール-２-リン酸塩とグリセロール-３-リン酸塩の混合物であるか又はグリセロール-３-リン酸塩である、請求項２に記載の方法。
振とうフラスコ又は発酵槽において培養される、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
ポリペプチドが、細胞質、周辺質又は細胞の培養液から回収される、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
核酸の発現が誘導性プロモータによって調整される、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
誘導性プロモータがアルカリホスファターゼプロモータである、請求項６に記載の方法。
誘導性プロモータがｔａｃプロモータである、請求項６に記載の方法。
誘導性プロモータがＴ７プロモータである、請求項６に記載の方法。
核酸の発現が培養工程の活発な増殖期の間に発生する、請求項６から９の何れか一項に記載の方法。
大腸菌が染色体性ｐｈｏＡを欠損している、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
大腸菌が染色体性ｇｌｐＴに関して野生型である、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
大腸菌が染色体性ｇｌｐＴを欠損している、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
大腸菌が染色体性ｐｈｏＡ及びｇｌｐＴを欠損している、請求項１から１１及び１３の何れか一項に記載の方法。
大腸菌が染色体性ｕｇｐを欠損していない、請求項１４に記載の方法。
ポリペプチドが真核生物ポリペプチドである、請求項１から１５の何れか一項に記載の方法。
ポリペプチドが哺乳類のポリペプチドである、請求項１から１６の何れか一項に記載の方法。
ポリペプチドがインスリン様成長因子-１である、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
グリセロリン酸の流加速度が８から１０リットルにつき１から７ｍｍｏｌ／時間であり、１０リットル発酵糟で培養される、請求項１８に記載の方法。
グリセロリン酸の流加速度が８から１０リットルにつき２から６ｍｍｏｌ／時間である、請求項１９に記載の方法。
グリセロリン酸の流加速度が８から１０リットルにつき３から４ｍｍｏｌ／時間である、請求項２０に記載の方法。
ポリペプチドがＡｐｏ２Ｌである、請求項１から１７の何れか一項に記載の方法。
グリセロリン酸の流加速度が８から１０リットルにつき４から１７ｍｍｏｌ／時間であり、１０リットル発酵糟で培養される、請求項２２に記載の方法。
流加速度が８から１０リットルにつき６から１６ｍｍｏｌ／時間である、請求項２３に記載の方法。
流加速度が８から１０リットルにつき８から１５ｍｍｏｌ／時間である、請求項２４に記載の方法。
流加速度が８から１０リットルにつき１０から１４ｍｍｏｌ／時間である、請求項２５に記載の方法。
また、無機リン酸塩が培養工程中に存在する、請求項１から２６の何れか一項に記載の方法。
グリセロリン酸塩に対する無機リン酸塩の比率がおよそ１:１０からおよそ１：０．２５までの範囲である、請求項２７に記載の方法。
ポリペプチドがＡｐｏ２Ｌであり、比率がおよそ１：３からおよそ１：０．５である、請求項２８に記載の方法。
比率がおよそ１:１である、請求項２９に記載の方法。