CN113308393A - 一种降解氨氮和总氮的制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种降解氨氮和总氮的制剂及其制备方法，用于筛选驯化出复合微生物菌群，对于200mg/L氨氮浓度的培养基包括：柠檬酸钠5.0‑7.0g/L，硫酸铵或氯化铵0.8‑1.0g/L，硫酸镁或氯化镁0.9‑1.1g/L，氯化钠或氯化钾0.1‑0.15g/L，硫酸锰0.01‑0.02g/L，硫酸亚铁或氯化铁0.05‑0.06g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.1‑0.3g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.2‑0.4g/L。本发明通过对填埋场渗坑底泥中土著微生物菌种的筛选驯化，获得一种能高效持久降解氨氮和总氮的复合菌剂，对高浓度氨氮或总氮污染废水具有长期高效降解的作用。本发明的微生物菌剂扩培所需的营养物质配置简便，各菌群在污染水体中协同作用，具有高效、快速、无二次污染、操作简便等特点，有利于大规模推广应用于污染水体的治理。
Description
技术领域
本发明涉及污染水体微生物修复领域，具体地，涉及一种降解氨氮和总氮的制剂及其制备方法。
背景技术
随着经济的快速发展，大量工业废水和固体垃圾被排入河道、湖泊，同时污染了土壤和地下水，对我国的环境造成了巨大的破坏。近年来，城市的地表水和地下水中存在着越来越多的氨氮、总氮污染物，工业场地中的污染废水或渗坑、基坑水中也存在着大量的氨氮(NH3-N)、硝态氮(NO3 --N)以及亚硝态氮(NO2 --N)等污染。如何去除超标氨氮及总氮，成为污染水体治理的关键。
常用的氨氮去除方法，如吹脱法、膜技术、吸附法、化学沉淀法等，已经广泛应用于工业废水的治理中。这些物理化学方法在对污染地表水、地下水或工业场地中的污染废水的治理过程中，不但成本高，而且治理效果易反复，容易出现二次污染。生物处理技术，尤其是微生物处理技术，具有工艺操作简单、反应过程稳定性高、成本低、不易产生二次污染物等优点，在污染水体治理中应用越来越广泛。
但微生物处理技术的要点在于筛选出合适的微生物菌剂，能耐受高浓度氨氮污染并持久高效地去除污染废水中的氨氮及总氮污染物。常见的菌种筛选技术最后筛选出的是单菌株，具有一定的缺点，影响其实际应用价值：(1))纯化后的单菌株，失去了与自然条件下长期处于协同关系的其它菌种共存的机会，导致该单菌株功能大大降低；(2)单菌株孤立生长，容易受到其它微生物的污染和抑制，难以生长及发挥作用；(3)后期实际工程应用中构建复合菌群时需要考虑各菌种之间的拮抗作用，需要重新试验进行复合菌剂的配比。
因此，有必要提出一种降解氨氮和总氮的制剂及其制备方法，以解决上述问题。
发明内容
在发明内容部分中引入了一系列简化形式的概念，这将在具体实施方式部分中进一步详细说明。本发明的发明内容部分并不意味着要试图限定出所要求保护的技术方案的关键特征和必要技术特征，更不意味着试图确定所要求保护的技术方案的保护范围。
针对现有技术的不足，本发明提出了一种降解氨氮和总氮的制剂，用于筛选驯化出复合微生物菌群，对于200mg/L氨氮浓度的培养基包括：柠檬酸钠5.0-7.0g/L，硫酸铵或氯化铵0.8-1.0g/L，硫酸镁或氯化镁0.9-1.1g/L，氯化钠或氯化钾0.1-0.15g/L，硫酸锰0.01-0.02g/L，硫酸亚铁或氯化铁0.05-0.06g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.1-0.3g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.2-0.4g/L。
可选地，柠檬酸钠6.536g/L，硫酸铵或氯化铵0.945g/L，硫酸镁或氯化镁1.0g/L，氯化钠或氯化钾0.12g/L，硫酸锰0.01g/L，硫酸亚铁或氯化铁0.05g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.25g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.3g/L。
可选地，对于更高氨氮浓度的培养基，只需成倍增加含氮及含碳制剂的量。
可选地，降解氨氮和总氮的制剂还包括氢氧化钠溶液或盐酸溶液，用以调节pH。
可选地，所述制剂的pH为7.0-7.5。
可选地，所述复合微生物菌群为假单胞菌。
一种降解氨氮和总氮的制剂的制备方法，该方法包括：
S1、选配制选择性培养基，所述培养基为根据上述的降解氨氮和总氮的制剂；
S2、获取耐受氨氮的菌源；
S3、将S2中的菌源加入适量无菌水震荡培养4-8h后接种于S1的培养基中，在25-35℃、150-250rpm的环境中培养6-30h；
S4、重复S3，在培养基中传代培养10-20代，之后增加S1中培养基的氨氮浓度至2倍，再次重复S3并传代培养复合微生物10-20代；
S5、重复S3-S4至少3次，得到耐受高浓度氨氮的复合微生物菌群。
可选地，在步骤S4中还包括同时将每代微生物菌液以1：1的比例和30％甘油混匀后，-20℃冻存。
可选地，在步骤S3中将S2中的菌源加入适量无菌水震荡培养6h后接种于S1的培养基中，在35℃、150rpm的环境中培养24h。
可选地，在步骤S2中，耐受氨氮的菌源是从填埋场修复项目渗滤液坑塘底泥中选取的泥水混合物。
本发明通过对填埋场渗坑底泥中土著微生物菌种的筛选驯化，获得一种能高效持久降解氨氮和总氮的复合菌剂，经鉴定由不同的假单胞菌菌种构成，对高浓度氨氮或总氮污染废水具有长期高效降解的作用。本发明的微生物菌剂扩培所需的营养物质配置简便，对高浓度污染水体中的氨氮和总氮具有高效持久的降解作用。本发明各菌群在污染水体中协同作用，具有高效、快速、无二次污染、操作简便等特点，有利于大规模推广应用于污染水体的治理。
附图说明
本发明的下列附图在此作为本发明的一部分用于理解本发明。附图中示出了本发明的实施例及其描述，用来解释本发明的方法及原理。在附图中，
图1为根据本发明的一个实施例中的降解氨氮和总氮的制剂的制备方法的流程图；
图2为根据本发明的一个实施例的筛选出的复合菌剂对实验室自配高浓度氨氮废水中氨氮的降解示意图；
图3为根据本发明的一个实施例的筛选出的复合菌剂对实验室自配高浓度氨氮废水中总氮的降解示意图；
图4为根据本发明的一个实施例的筛选出的复合菌剂对实际场地修复工程废水中高浓度氨氮的降解示意图；
图5为为根据本发明的一个实施例的筛选出的复合菌剂对实际场地修复工程废水中高浓度总氮的降解示意图。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
为了彻底理解本发明，将在下列的描述中提出详细的步骤，以便阐释本发明提出的方法。显然，本发明的施行并不限定于本领域的技术人员所熟悉的特殊细节。本发明的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本发明还可以具有其他实施方式。
应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在所述特征、整体、步骤、操作、元件和/或组件，但不排除存在或附加一个或多个其他特征、整体、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组合。
一种筛菌方法中所用到的活化富集培养基，组分包括：柠檬酸钠5.0-7.0g/L，硫酸铵或氯化铵0.8-1.0g/L，硫酸镁或氯化镁0.9-1.1g/L，氯化钠或氯化钾0.1-0.15g/L，硫酸锰0.01-0.02g/L，硫酸亚铁或氯化铁0.05-0.06g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.1-0.3g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.2-0.4g/L。
在一个实施例中，搅拌溶解后用氢氧化钠溶液或盐酸溶液调节PH至7.0～7.5。
一种筛选驯化出的复合微生物菌群，
(1)本发明筛选驯化出的菌群为复合菌群，经多样性鉴定显示99.99％为各种假单胞菌；
(2)将复合菌群中的典型菌分离纯化后，经16s rRNA测序和NCBI数据库比对，与数据库中三种现有菌种100％匹配，分别为Pseudomonas monteilii strain、Pseudomonasbaetica strain和Pseudomonas putida strain；
(3)该复合菌群具有耐受高浓度氨氮的特点，最高耐受氨氮浓度能达到1000mg/L；
(4)该复合菌群降解氨氮能力强，根据样品条件的不同，氨氮降解率最终能达到85-94％；
(5)该复合菌群也能有效降解总氮，根据样品条件的不同，总氮的降解率达到60％以上；
(6)该复合菌群降解氨氮和总氮能力较为持久，根据样品条件的不同，能持续25天以上长时间降解氨氮和总氮浓度，并且保持氨氮或总氮浓度不再反弹。
大多数微生物形成一种特殊群体，依靠整个群体内部各成员的协同作用充分发挥应有的功能。研究发现，当微生物从原来栖息的生态环境中被分离、纯化培养时，许多功能被削弱甚至丧失。为保持菌群的活性及对超标氨氮污染物的降解效率，本发明中筛选的微生物选择复合菌剂，通过保留协同作用复合菌群的菌种分离方法，以微生物群的功能为核心，在不破坏功能群体协同作用的前提下，采用限制性手段逐渐排除与功能无关的微生物种类，保留核心功能群体，定向驯化成具有高效稳定协同作用的微生物复合菌群。
本发明的目的是克服现有的缺陷和不足，通过一种简单方便的菌种驯化方法，筛选出高效、持久降解高浓度氨氮和总氮的微生物复合菌群。
下面结合附图对本发明的降解氨氮和总氮的制剂及其制备方法做进一步的说明。
在一个实施例中，本发明的筛菌方法，由以下步骤构成，具体包括：
(1)选配制选择性培养基，即一定氨氮浓度的硝化培养基(NM)：柠檬酸钠或葡萄糖5-7g/L，硫酸铵或氯化铵0.8-1g/L，硫酸镁或氯化镁0.9-1.1g/L，氯化钠或氯化钾0.1-0.15g/L，硫酸锰0.01-0.02g/L，硫酸亚铁或氯化铁0.05-0.06g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.1-0.3g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.2-0.4g/L，搅拌溶解后调节PH至中性；
(2)取可能存在耐受氨氮的菌源，即从某填埋场修复项目渗滤液坑塘底泥中选取泥水混合物；
(3)将上述步骤(2)中的菌源加入适量无菌水震荡培养4-8h后接种于上述步骤(1)的硝化培养基中，在25-35℃、150-250rpm的环境中培养8-16h；
(4)重复上述步骤(3)，在一定浓度的硝化培养基中传代培养10-20代，之后增加步骤(1)中NM培养基的氨氮浓度至2倍，再次重复步骤(3)并传代培养复合微生物10-20代；
(5)重复步骤(3)-(4)3次，最后得到耐受高浓度氨氮(1000mg/L)的微生物复合菌群。
如图1所示，在一个实施例中，一种降解氨氮和总氮的制剂的制备方法，该方法包括：
S1、选配制选择性培养基，所述培养基为根据上述的降解氨氮和总氮的制剂；
S2、获取耐受氨氮的菌源；
S3、将S2中的菌源加入适量无菌水震荡培养4-8h后接种于S1的培养基中，在25-35℃、150-250rpm的环境中培养6-30h；
S4、重复S3，在培养基中传代培养10-20代，之后增加S1中培养基的氨氮浓度至2倍，再次重复S3并传代培养复合微生物10-20代；
S5、重复S3-S4至少3次，得到耐受高浓度氨氮的复合微生物菌群。
实施例1：实验室自配高浓度氨氮的废水的处理
(1)配置筛选微生物的硝化富集培养基(NM)包括(g/L)：(NH4)2SO4 0.945，柠檬酸钠6.536，MgSO4·7H2O 1.0，NaCl 0.12，MnSO4·H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO4 0.25，Na2HPO4 0.3，pH 7.0～7.5；
(2)对某填埋场修复工程中氨氮超标的渗坑底泥进行微生物筛选驯化，将底泥以1：50的比例稀释在纯水中，35℃、150rpm培养6h后留用；
(3)按1％的比例接入50mL氨氮浓度为200mg/L的NM培养基中，35℃、150rpm培养24h；
(4)重复步骤(3)，同时每代微生物菌液以1：1的比例和30％甘油混匀后，-20℃冻存；
(5)重复步骤(3)-(4)，20次后，待微生物已经适应200mg/L氨氮浓度时，重复步骤(3)-(4)，将菌液接入氨氮浓度为400mg/L的NM培养基中进行筛选驯化，直至菌液接入氨氮浓度为1000mg/L的NM培养基中培育；
(6)筛选出适应氨氮浓度高达1000mg/L的微生物复合菌剂后，将菌液以1：1的比例和30％甘油混匀后，-20℃冻存；
(7)配置实验室使用的高浓度氨氮废水，包括(g/L)：(NH4)2SO4 4.725，柠檬酸钠32.68，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.25，Na2HPO4 0.3，pH 7.0～7.5；
(8)将筛选出的复合菌液以0.2％的比例接入100mL氨氮浓度为1000mg/L的实验室自配高浓度氨氮废水中，35℃、150rpm恒温连续培养，每天取接入微生物的废水和空白样检测氨氮、总氮浓度，持续25天，氨氮浓度持续下降，最终降至约100mg/L，降解率达90％以上，同时总氮浓度下降至约250mg/L。接入微生物复合菌剂后的实验室自配高浓度氨氮废水中氨氮或总氮的降解情况详见图2和图3。
在一个实施方式中，(3)中按1％的比例接入50mL氨氮浓度为200mg/L的NM培养基中，35℃、150rpm培养16h。
在另一个实施方式中，(7)中配置实验室使用的高氨氮浓度的NM培养基，包括(g/L)：(NH4)2SO4 4.725，柠檬酸钠32.68，MgSO4·7H2O 5.0，KH2PO4 1.25，Na2HPO4 1.5，pH 7.0～7.5。
在实际操作中，只需成倍增加含氮的(NH4)2SO4以及含碳的柠檬酸钠即可，其他为微量可不再添加。例如当氨氮浓度由200mg/L提高到1000mg/L时，含氮的(NH4)2SO4以及含碳的柠檬酸钠的量相应增加5倍。
实施例2：对修复场地高浓度氨氮废水的处理
(1)重复实施例1中步骤(1)-(6)，筛选驯化复合微生物菌群，将冻存的菌剂活化扩培后备用；
(2)取某修复场地氨氮超标污水，氨氮浓度检测数值约为900mg/L，属于高浓度氨氮污水，取100mL废水接入0.7243g柠檬酸钠等微生物生长所需的营养物质，溶解后121℃高温灭菌20min后备用；
(3)将筛选出的复合菌剂以0.1％的比例接入100mL废水中，35℃、150rpm恒温连续培养；
按照菌液体积比样品体积为0.2％的比例将(1)中制得的菌剂接入样品中，30℃、摇床150rpm恒温连续培养。培养过程中氨氮持续下降，至第25天氨氮浓度下降至40mg/L左右，氨氮降解率达到95％左右，同时总氮浓度下降至约350mg/L，也有一定程度的下降，如图4、5所示。
与现有技术相比，本发明专利的优点在于：
(1)本发明专利申请中所用的微生物筛选驯化方法简单、方便易操作，培养基经济易配置，中试扩培操作简单易实施；
(2)本发明专利申请中筛选出的为复合菌群，具有耐受高浓度氨氮污染物的特点，对外界环境的适应能力强；
(3)本发明专利申请中筛选出的为复合菌群，相较于单一菌种，具有降解氨氮能力强、作用持久、不会出现反复现象，并对总氮也有较强的降解作用等特点；
(4)本发明专利申请中筛选出的为复合菌群，如只针对氨氮和总氮这种单一污染物，可直接应用于实际生产或工程项目中，无需再与其他菌种联合，也不需要考虑与其他菌种联合时出现的拮抗作用；
(5)本发明专利申请中筛选出的复合菌群，可直接大规模扩培制成菌剂，与其它复合菌剂不同，不需要针对每一单菌种单独扩培后再混合制成复合菌剂；
(6)本发明专利申请中复合菌群作用效果持久，实际修复工程应用中在保证修复效果的前提下，能大量减少投菌的次数和使用量
本发明专利通过菌种筛选(strain screening)，从工业场地污染底泥中选出具有氨氮降解效果的菌株，同时不断增加培养基中氨氮浓度，最终驯化出能高效降解超标氨氮和总氮污染物的复合菌种。通过验证实验，证明筛选出的复合菌剂对高浓度氨氮和总氮污染废水具有高效持久的降解效果。
因此，本发明专利通过菌种筛选技术，驯化出能高效持久地降解氨氮和总氮的复合微生物菌剂，更好地为实际环境修复工程项目服务。
除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语与本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中使用的术语只是为了描述具体的实施目的，不是旨在限制本发明。本文中出现的诸如“设置”等术语既可以表示一个部件直接附接至另一个部件，也可以表示一个部件通过中间件附接至另一个部件。本文中在一个实施例中描述的特征可以单独地或与其它特征结合地应用于另一个实施例，除非该特征在该另一个实施例中不适用或是另有说明。
本发明已经通过上述实施例进行了说明，但应当理解的是，上述实施例只是用于举例和说明的目的，而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。此外本领域技术人员可以理解的是，本发明并不局限于上述实施例，根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改，这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。
Claims (10)
1.一种降解氨氮和总氮的制剂，用于筛选驯化出复合微生物菌群，其特征在于，对于200mg/L氨氮浓度的培养基包括：柠檬酸钠5.0-7.0g/L，硫酸铵或氯化铵0.8-1.0g/L，硫酸镁或氯化镁0.9-1.1g/L，氯化钠或氯化钾0.1-0.15g/L，硫酸锰0.01-0.02g/L，硫酸亚铁或氯化铁0.05-0.06g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.1-0.3g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.2-0.4g/L。
2.根据权利要求1所述的降解氨氮和总氮的制剂，其特征在于，柠檬酸钠6.536g/L，硫酸铵或氯化铵0.945g/L，硫酸镁或氯化镁1.0g/L，氯化钠或氯化钾0.12g/L，硫酸锰0.01g/L，硫酸亚铁或氯化铁0.05g/L，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠0.25g/L，磷酸氢二钠或磷酸氢二钾0.3g/L。
3.根据权利要求1或2所述的降解氨氮和总氮的制剂，其特征在于，对于更高氨氮浓度的培养基，只需成倍增加含氮及含碳制剂的量。
4.根据权利要求1或2所述的降解氨氮和总氮的制剂，其特征在于，还包括氢氧化钠溶液或盐酸溶液，用以调节pH。
5.根据权利要求4所述的降解氨氮和总氮的制剂，其特征在于，所述制剂的pH为7.0-7.5。
6.根据权利要求1或2所述的降解氨氮和总氮的制剂，其特征在于，所述复合微生物菌群为假单胞菌。
7.一种降解氨氮和总氮的制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：
S1、选配制选择性培养基，所述培养基为根据权利要求1-6任一项所述的降解氨氮和总氮的制剂；
S2、获取耐受氨氮的菌源；
S3、将S2中的菌源加入适量无菌水震荡培养4-8h后接种于S1的培养基中，在25-35℃、150-250rpm的环境中培养6-30h；
S4、重复S3，在培养基中传代培养10-20代，之后增加S1中培养基的氨氮浓度至2倍，再次重复S3并传代培养复合微生物10-20代；
S5、重复S3-S4至少3次，得到耐受高浓度氨氮的复合微生物菌群。
8.根据权利要求7所述的降解氨氮和总氮的制剂的制备方法，其特征在于，在步骤S4中还包括同时将每代微生物菌液以1：1的比例和30％甘油混匀后，-20℃冻存。
9.根据权利要求7所述的降解氨氮和总氮的制剂的制备方法，其特征在于，在步骤S3中将S2中的菌源加入适量无菌水震荡培养6h后接种于S1的培养基中，在35℃、150rpm的环境中培养24h。
10.根据权利要求7所述的降解氨氮和总氮的制剂的制备方法，其特征在于，在步骤S2中，耐受氨氮的菌源是从填埋场修复项目渗滤液坑塘底泥中选取的泥水混合物。
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