CN1954074A - 多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了相对于大肠杆菌异源的多肽的制备方法，其中在培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的大肠杆菌细胞，同时向该培养基进料可转运的有机磷酸酯，从而表达所述核酸。然后从所述细胞回收所述多肽。

Description

多肽的制备方法

背景技术

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119要求2004年3月11日提交的美国临时申请号为60/552,678的美国临时申请的优先权，其内容引入本文作为参考。

1.技术领域

本发明涉及相对于大肠杆菌(E.coli)异源的多肽的制备方法。更具体地，本发明针对使用有机磷酸酯来提高所述多肽的产量。

2.相关技术描述

借助于公知的分子生物学以及微生物遗传操纵的相对简易性，在实验室和工业中用大肠杆菌表达异源蛋白质极为高产。通常，用可诱导型启动子(例如碱性磷酸酶启动子、tac启动子、阿拉伯糖启动子等)来调控异源蛋白质的表达。对诱导的需要给予研究者控制靶向蛋白质表达的时间的机会。这种能力对于那些在高浓度时不被宿主良好耐受的异源蛋白质尤为重要。通过在诱导表达前达到理想的细胞密度，所需蛋白质的高量产出可以实现最大化。

当微生物缺乏一种需要的养分时细胞停止生长。限制型组分可以是碳、氮、磷、氧或任何细胞所需元素。在这种情况下，细胞不再处于生长期。缓解由养分限制而造成的应激反应的培养的方法是提供所缺组分的饲料(feed)。在补料分批(fed-batch)发酵方法中引入的常用饲料包括葡萄糖、氨基酸、氧等等。

就细胞磷(P)而言，对于磷供给的需要并不令人惊讶，因为P是在细胞中排在碳、氧、氮、氢之后、量位居第五的元素。Slanier，Adelberg and Ingraham，The Microbial World，4^th ed.(Prentice Hall，NJ 1976)，p.1357。磷是大量大分子如核酸、脂质糖类和膜脂质中的必需元素。并且，它在高能磷酸酐键中的作用使其对于能量代谢尤为重要。大肠杆菌能利用无机磷酸酯(盐)(Pi)、有机磷酸酯(盐)(organophosphate)或磷酸酯作为主要的P源。从环境摄入Pi可以通过两个转运系统-Pit和Pst系统来实现。有机磷酸酯(盐)大多数是非转运型的，它们首先需要先在周质中被酶解，之后释放的Pi能够被Pi转运系统摄入。只有几种有机磷酸酯(盐)是转运型的，3-磷酸-甘油(G3P)就是这样一个例子。已知G3P和甘油磷酸-1-磷酸(G1P)是α-磷酸甘油。响应于Pi-限制和碳-限制，大肠杆菌能从外部环境摄取存在的完整G3P到细胞内区室(compartment)，其中G3P经代谢产生需要的磷酸酯(盐)或碳。Wanner，“Phosphorus Assimulation and Control of the Phosphate Regulon”，inEscherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology，Neidhardt，ed.，(second edition)，American Society for Microbiology Press(1996)，pp.1357-1365。

G3P的更多文献有，Silhavy et al.， J.Bacteriol.， 126：951-958(1976)，它涉及与大肠杆菌的sn-3-磷酸-甘油转运系统有关的周质蛋白；Argast et al.， J. Bacteriol.， 136：1070-1083(1978)，它涉及大肠杆菌中sn-3-磷酸-甘油的第二转运系统；Elvin et al.， J.Bacteriol.，161：1054-1058(1985)，它涉及由glpT-依赖型G3P转运系统介导的Pi互换；Rao et al.， J.Bacteriol.， 175：74-79(1993)，它涉及glpT和glpD突变对phoA基因在大肠杆菌中表达的影响；和Elashviliet al.， Appl.Environ.Microbiol.， 64：2601-2608(1998)，它涉及phnE和glpT基因增强大肠杆菌K-12中有机磷酸酯(盐)的利用。另外，Vergeles et al.， Eur. J.Biochem.， 233：442-447(1995)公开了也称为β-磷酸甘油的2-磷酸-甘油(G2P)和G3P作为蛇毒磷酸二酯酶酯化作用中核苷酸基受体的高度有效性。

对于两种将外源性G3P摄入大肠杆菌中的转运系统Ugp和GlpT转运系统的现有理解，已经详细描述于Neidhardt等编辑的书 Escherichia coli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology(第二版)如上所述，pp.1364中，参照参考文献13和81。Ugp操纵子属于pho调节子。它由对磷酸酯(盐)的限制诱导并受phoB蛋白质正向调控。Ugp系统是周质结合蛋白质-依赖性的多组分转运系统，其中ugpB编码周质结合蛋白质，ugpA和ugpC编码完整的膜通道蛋白质，并且ugpC编码ATPase。GlpT是介导甘油、G3P、和甘油磷酰基磷酸二酯的摄入和代谢的glp系统的一部分(Lin et al.， Annu.Rev. Microbiol.， 30：535-578(1976)；Chapter 20；pg 307-342 Dissimilatory Pathwaysfor sugars，polyols and carboxylates.Escherichia coli and Salmonella，Cellularand Molecular Biology，第二版)。此转运系统是已知通过与外部G3P交换而介导Pi从细胞质流出的阴离子交换器(exchanger)。在G3P上生长的野生型菌株中，虽然通过Ugp系统摄入G3P的细胞所释放的Pi不多，当通过GlpT系统摄入G3P时，Pi可被释放到周质中。如果由于glpT-通透酶-介导的外流而释放减低量的Pi，pho调节子活性，包括Ugp系统都将关闭。在某些情况下，GlpT是Pi通过与外部G3P交换而从细胞流出的唯一途径。Elvin et al.， J. Bacteriol.， 161：1054-1058(1985)；Rosenberg，“Phosphate transport inprokaryotes，”p.205-248.In B.P.Rosen and S.Silver(ed.)， Ion Transport in Prokaryotes(Academic Press，Inc.，New York，1987)。

比较Ugp和GlpT系统转运G3P的能力，这两个系统的最大速度相似。对于G3P的明显亲和力，Ugp系统比GlpT系统高。很可能，如果在生长培养基中存在G3P，那么两个系统将能为细胞生长提供足够的G3P。然而，经过Ugp系统排它转运的G3P可作为磷酸酯(盐)的唯一来源，而不是碳的唯一来源，但GlpT-转运的G3P可用作这两者的的唯一来源(Schweizer et al.， J Bacteriol.， 150：1154-1163(1982))。已经为编码pho-调节子-依赖性G3P转运系统的两种ugp基因制作图谱(Schweizer et al.， J.Bacteriol.， 150：1164-1171(1982))，已经鉴定了包含这些基因的ugp区(Schweizer et al.， Mol.and Gen. Genetics， 197：161-168(1984))并且研究了ugp操纵子的调控作用(Schweizeret al.， J.Bacteriol.，163：392-394(1985)；Kasahara et al.， J.Bacteriol.， 173：549-558(1991)；Su et al.， Molecular & General Genetics， 230：28-32(1991)；Brzoska et al.，“ugp-dependent transport system for sn-glycerol 3-phosphate ofEscherichia coli，”p.170-177 in A.Torriani-Gorini，F.G.Rothman，S.Silver，A.Wright，and E.Yagil(ed.)， Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms(American Society for Microbiology，Washington，D.C.，1987)；Brzoska et al.， J.Bacteriol.， 176：15-20(1994)；和Xavier et al.， J.Bacteriol.， 177：699-704(1995))。

在野生型菌株中，存在G3P的稳定细胞内池并且维持在大约200μM。在菌株内部，当菌株生长在作为唯一碳源的甘油上时，可以将甘油用甘油激酶(由glpK编码)通过酶转化为G3P，或者当菌株生长在甘油以外的碳源上时，通过用gpsA基因的基因产物G3P合酶还原糖酵解中间物磷酸二羟丙酮(dihydroxyactone phosphate)来合成G3P。因为G3P是重要的形成所有磷脂分子支架的中间物，内部的磷酸甘油也可以由磷脂和三乙酰甘油分解而产生。作为代谢产物，内部的G3P可以传送到磷脂生物合成途径，或者被G3P脱氢酶氧化形成磷酸二羟丙酮并进料到糖酵解途径。

在用AP启动子来调控大肠杆菌中的异源蛋白质表达时，因为诱导仅仅在培养基耗竭Pi后出现，诱导AP启动子活性的细胞通常磷酸酯(盐)饥饿并处于健康下降状况。它们可能必须搜寻细胞功能所需的磷酸酯(盐)。搜寻这类磷酸酯(盐)的可能结果可包括核糖体更新(turnover)、细胞能量下降和蛋白酶表达及蛋白质水解增加(St.John and Goldberg， J.Bacteriol.， 143：1223-1233(1980))，潜在的结果是导致健康细胞变少并且伴随蛋白质积累量下降。

提高大肠杆菌的代谢状态可以可察觉地提高细胞合成蛋白质的能力。如果缓慢地进料磷酸酯(盐)，细胞仅会觉察到周质中低Pi浓度，从而诱导pho调控子而不会造成细胞内P原子饥饿(见美国专利5,304,472)。需要提供更多方法来在大肠杆菌中制备异源多肽。

发明概述

本发明提供了一种提高大肠杆菌中异源多肽表达的方法。进料可转运的有机磷酸酯(盐)如α-磷酸甘油到各种大肠杆菌宿主包括那些带或不带野生型glpT基因的宿主及那些带或不带野生型phoA基因的宿主，如(ugp+ΔglpTphoA-)大肠杆菌，显示出在摇瓶和10-L-发酵规模中提高了异源蛋白质的表达，并预期在更大规模如10,000L有类似表现。在应用了多种启动子，包括可诱导型启动子如tac、T7或AP启动子的多个模型系统中观察对于异源蛋白质表达的产物产量益处。进一步的有利之处在于产物可以在活动生长期较早获得，即在相对其它较短的时间内获得。在某些实施方案中，更多产物可以在活动生长期较早获得以显著提高生产率。

因此，本发明如下所述。本发明一方面提供了相对于大肠杆菌异源的多肽的制备方法，其包含(a)在培养基中培养大肠杆菌细胞，所述细胞包含编码所述多肽的核酸，同时向培养基进料可转运的有机磷酸酯(盐)，从而表达所述核酸，和(b)从所述细胞回收所述多肽。在优选实施方案中，有机磷酸酯(盐)是磷酸甘油，更优选是α-磷酸甘油和/或β-磷酸甘油，并更优选2-磷酸-甘油和3-磷酸-甘油的混合物或3-磷酸-甘油自身。在另一优选的方面，培养在摇瓶或发酵罐，优选发酵罐中进行。在另一优选实施方案中，从细胞的细胞质、周质或培养基中回收所述多肽。也优选所述核酸的表达受可诱导型启动子，如碱性磷酸酶启动子、tac启动子、或T7启动子的调控，并优选其中所述核酸的表达在培养步骤的活动生长期中开始。在一项实施方案中，大肠杆菌是野生型的。在另一项实施方案中，大肠杆菌是染色体glpT和染色体phoA缺陷型的，但优选不是染色体ugp缺陷型的。优选，无机磷酸酯(盐)在培养步骤中也存在。

不受任何理论所限，相信在本方法中给细胞进料可转运的有机磷酸酯(盐)化合物可使Pho系统的pstS不会察觉磷酸酯(盐)供给，但仍会在细胞质中分解时提供磷酸酯(盐)，而且进料可转运的有机磷酸酯如G3P，会有效地使细胞富集可利用的代谢中间物，所述中间物可被容易地进料到重要的代谢途径。

附图简述

图1显示在摇瓶培养中利用tac启动子在BL21大肠杆菌宿主中表达分泌型llama抗体片段，该培养过程用水或200mM G3P作为低磷酸酯(盐)(CRAP)或高磷酸酯(盐)(THCD)培养基的补充物。

图2显示在摇瓶培养中利用T7启动子在HMS174大肠杆菌宿主中表达细胞质Apo2L，该培养过程用水或200mM G3P作为CRAP培养基的补充物。

图3显示在发酵中进料G3P对于分泌型IGF-1随时间累积的作用。它使用了野生型大肠杆菌宿主、AP启动子和持续进料的葡萄糖。

图4显示glpT突变和在发酵中进料G3P对于分泌型IGF-1随时间累积的作用。它使用了ΔglpT大肠杆菌宿主、AP启动子和多种G3P进料速度。

图5显示pAPApo2-P2RU的质粒图谱。

图6显示人类Apo-2配体cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及其衍生的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在核苷酸447位的“N”(SEQ ID NO：1中)用于表示该核苷酸碱基可以是“T”或“G”。

图7显示进料G3P对于ΔglpT大肠杆菌(43F6)宿主中Apo2L的比累积(specific accumulation)的作用，其中具有三个不同的进料速度和一个无G3P进料的对照。

图8显示向野生型glpT宿主(43E7)进料磷酸甘油相比无机磷酸酯(盐)对Apo2L的比总累积(specific total accumulation)的益处，其中细胞密度增加到OD550超过200。

图9显示在野生型glpT大肠杆菌宿主(43E7)和ΔglpT大肠杆菌(43F6)宿主中，用磷酸甘油替代无机磷酸酯(盐)对Apo2L的比总累积的作用。

图10显示在ΔglpT大肠杆菌(61G1)宿主中，用α-磷酸甘油和β-磷酸甘油的50∶50混合物替代α-磷酸甘油进料，相比无进料的对照，对于总Apo2L累积的作用。

优选实施方案详述

定义

“多肽”在本文中一般指具有10个以上氨基酸的肽和蛋白质。“异源”多肽是指相对于所用的宿主细胞而言外来的那些多肽，如大肠杆菌产生的人类蛋白质。所述多肽可以是原核多肽或真核多肽，优选真核多肽，更优选哺乳动物多肽，最优选人类多肽。

哺乳动物多肽的实例包括下列分子，例如肾素；生长激素，包括人生长激素或牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺素；甲状腺刺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A-链；胰岛素B-链；前胰岛素；血小板生成素；卵泡刺激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如凝血因子VIIIC，凝血因子IX，组织因子，和von Willebrands因子；抗-凝血因子，如蛋白C；心房钠尿肽(atrial naturietic factor)；肺表面活性物质；纤溶酶原激活剂，例如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；蛙皮素(bombesin)；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；抗ErbB2结构域抗体如2C4(WO01/00245；杂交瘤ATCC HB-12697)，其与ErbB2胞外结构域中的区域(例如，ErbB2的约残基22-584所示区域中所含的任何一或多个残基)结合；脑啡肽酶；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；前松弛素；小鼠绒毛膜促性腺激素相关肽；微生物蛋白质，例如β-内酰胺酶；DNase；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；整联蛋白；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，例如脑衍生神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)或神经生长因子如NGF；心肌营养蛋白(心脏肥大因子)如心营养蛋白-1(CT-1)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，例如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，例如CD3、CD4、CD8和CD19；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生(morphogenetic)蛋白(BMP)；干扰素，例如干扰素-α、-β和γ；血清白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)；集落刺激因子(CSF)，例如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白细胞介素(IL)，例如IL-1到IL-10；抗-HER-2抗体；Apo2配体(Apo2L)；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变(decay)加速因子；病毒抗原，例如AIDS包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素(adderssin)；调节蛋白；抗体；以及上述任何多肽的片段。

优选多肽包括多肽如HAS、BSA、抗-IgE、抗-CD20、抗-IgG、t-PA、gp120、抗-CD11a、抗-CD18、2C4、抗-VEGF、VEGF、TGF-β、激活素、抑制素、抗-HER-2、DNase、IGF-I、IGF-II、脑IGF-I、生长激素、松弛素链、生长激素释放因子、胰岛素链或前胰岛素、抗体和抗体片段、NGF、NT-3、BDNF、Apo2L、和尿激酶。所述多肽最优选IGF-I或Apo2L。

术语“Apo2配体”、“Apo2L”和“TRAIL”在本文中可以互换使用，它们指包括图6所示氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的含氨基酸残基114-281、含残基95-281、含残基92-281、含残基91-281、含残基41-281、含残基15-281、或含残基1-281的多肽序列，以及上述序列的生物活性片段，以及上述序列的缺失、插入或取代的变体。一个实施方案中，所述多肽序列包含图6(SEQ IDNO：2)的残基114-281。任选地，所述多肽序列包含图6(SEQ ID NO：2)的残基92-281或残基91-281。Apo2L多肽可以用图6所示的天然核苷酸序列(SEQID NO：1)编码。任选地，编码残基Pro119(图6；SEQ ID NO：1)的密码子可以是“CCT”或“CCG”。另一个优选实施方案中，所述片断或变体是具有生物活性的并与上述任一上述序列具有至少大约80％的氨基酸同一性，更优选至少大约90％的序列同一性，甚更优选至少95％、96％、97％、98％、或99％的序列同一性。此定义包含Apo2配体的取代变体，其中至少它的天然氨基酸之一被丙氨酸残基取代。此定义也包含从Apo2配体来源分离的天然序列Apo2配体或通过重组或合成方法制备的天然序列Apo2配体。本发明的Apo2配体包括在WO 97/01633、WO 97/25428和WO 01/00832公开的称为Apo2配体或TRAIL的多肽。术语“Apo2配体”和“Apo2L”通常指包括该多肽的单体、二聚体或三聚体形式的Apo2配体形式。除非特别指出，Apo2L序列中所指的氨基酸残基的所有编号使用根据图6(SEQ ID NO：2)的编号。例如，“D203”或“Asp203”指在图6所示序列(SEQ ID NO：2)的位置203的天冬氨酸残基。

术语“Apo-2配体胞外结构域”或“Apo2配体ECD”指基本无跨膜和细胞质结构域的Apo2配体的形式。通常地，ECD具有1％以下的所述跨膜和细胞质结构域，并优选具有0.5％以下的这种结构域。“生物学活性的”或“生物学活性”在涉及Apo2L时指(a)具有活体(in vivo)或离体(ex vivo)诱导或刺激至少一种哺乳动物癌细胞或病毒感染的细胞的凋亡的能力；(b)能够产生抗体(即免疫原性)；(c)能够结合和/或刺激Apo2L的受体；或(d)保留天然或天然出现的Apo2L多肽的能力。

术语“控制序列”是指在具体宿主生物中表达可操作相连的编码序列所必需的DNA序列。适宜于原核生物的控制序列包括启动子，任选还有操纵子序列，和核糖体结合位点。

当核酸与另一核酸序列产生功能上的关联时，该核酸与所述另一核酸序列是“可操作相连的”。例如，前序列或分泌前导序列被表达为参与多肽分泌的前蛋白时，编码前序列或分泌前导序列的DNA与编码该多肽的DNA是可操作相连的；启动子影响编码序列的转录时，所述启动子与该编码序列是可操作相连的；或核糖体结合位点处在促进翻译的位置时，它与编码序列是可操作相连的。通常，“可操作相连”是指相连的DNA序列是邻接的(contiguous)，而且，在分泌前导序列的情况中，是邻接并处在同一个阅读框中的。连接可通过在便利的限制性位点进行连接来完成。如果不存在这类位点，可根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

“细胞”，“细胞系”以及“细胞培养物”在本文中可以互换使用，它们都包括其后代。因此，“转化体”和“转化细胞”包括原代细胞及其衍生的培养物，而不考虑转移的次数。还应理解，由于有意或无意的突变，所有后代在DNA含量方面不一定完全相同。在最初的转化细胞中筛选出的、具有相同功能或生物活性的突变后代也包括在内。不管命名有否不同，从上下文可以清楚显示其含义。

本文所用的术语“有机磷酸酯”指包含一或多个碳原子、也可包含卤素原子的磷酸酯(盐)化合物。这种磷酸酯(盐)化合物必须是这样，即它能被进料到细胞培养中并被利用。这些化合物通常用作杀虫剂。“可转运的”有机磷酸酯可以从细胞的外环境转运到细胞内而不必需用任一种方式预先水解。如果大肠杆菌株在有机磷酸酯存在时生长得不好，可以通过在大肠杆菌中过表达phnE基因产物来增强对此有机磷酸酯的利用。此基因经转化赋予大肠杆菌株自发利用有机磷酸酯的表型。见Elashvili et al.，如上所述。适当的有机磷酸酯举例包括烷基卤代磷酸酯(盐)(halophosphate)如二异丙基氟磷酸，烷基磷酸酯(盐)如二异丙基磷酸酯(盐)和3，4-二羟基丁基-1-磷酸，以及含糖或含链烷醇(alkanol)的磷酸酯(盐)，如6-磷酸-己糖和3-磷酸-甘油。优选葡萄糖-1-磷酸，己糖-6-磷酸和磷酸甘油，如葡萄糖-1-磷酸甘油，果糖-6-磷酸甘油，α-磷酸甘油如甘油-1-磷酸和3-磷酸-甘油，和β-磷酸甘油(2-磷酸-甘油)，更优选磷酸甘油，更优选α-和/或β-磷酸甘油，还优选2-磷酸-甘油和/或3-磷酸-甘油，本文所用最优选的是2-磷酸-甘油和3-磷酸-甘油的混合物或3-磷酸-甘油。本文所用的不是混合物或“G3P自身”的术语“G3P”指包含至少约80％3-磷酸-甘油的组合物；它可包含最多约20％的杂质如G2P。G3P与G2P的混合物可包含不足约80％的G3P。

无机磷酸酯(盐)是磷酸酯(盐)化合物，不包含任何碳原子，磷酸酯(盐)通常与碱金属或碱土金属连接如磷酸钾、磷酸钙、磷酸镁或磷酸钠。

“活动生长期”指培养步骤所处的时段，其中细胞正在活跃生长，它们不是养分严重受限的细胞，如在静止期的那些细胞。

进行本发明的方式

本发明提供了相对于大肠杆菌异源的多肽的制备方法。在此方法中，在培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的大肠杆菌细胞，同时向培养基进料可转运的有机磷酸酯，从而表达所述核酸。然后从所述细胞回收所述多肽。该回收可以来自细胞的细胞质、周质或培养基。培养可以在任何合适的容器，优选摇瓶或发酵罐，更优选发酵罐中进行。

使用培养参数并且以常规方式进行多肽的制备，如下面所述的那些方法。

A.核酸及其修饰的选择

编码目标多肽的核酸可以适当地来自任何来源的、编码目标多肽的RNA、cDNA或基因组DNA，只要其编码所述目标多肽。选择合适的核酸来在大肠杆菌中表达异源多肽(包括其变体)的方法公知。

如果制备了单克隆抗体，编码所述单克隆抗体的DNA可以容易地用常规方法分离并测序(例如通过使用能特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞是优选的这种DNA的来源。一旦分离，所述DNA可置于表达载体中，然后将该载体转化到本文所述的细菌宿主细胞中来获得在重组宿主细胞中合成的单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra et al.， Curr.Opinion in Immunol.，5：256-262(1993)和Plückthun， Immunol.Revs.， 130：151-188(1992)。

对非人抗体进行人源化的方法在本领域已经作了描述。优选地，人源化抗体含有一或多个从非人来源引入其中的氨基酸残基。那些非人的氨基酸残基通常称为“引进(import)”残基，它们通常取自“引进的”可变区。人源化基本可以按照Winter及其合作者的方法进行(Jones et al.， Nature， 321：522-525(1986)；Riechmann et al.， Nature， 332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.， Science，239：1534-1536(1988))，用高变区序列取代人类抗体的相应序列。因此，所述“人源化”抗体是嵌合的抗体(美国专利4,816,567)，其中少于整个人可变区的部分已经被来自非人物种的相应序列所取代。实践中，人源化抗体通常是人抗体，其中一些高变区残基以及可能还有一些FR残基被来自啮齿类动物抗体类似位点的残基所取代。

对用于制备人源化抗体的人的轻链和重链可变区的选择对于降低抗原性是很重要的。根据所谓的“最适合(best-fit)”方法，针对已知的人可变区序列的整个文库筛选啮齿类动物抗体的可变区序列。接受与啮齿类动物序列最接近的人的序列作为人源化抗体的人的框架区(FR)(Sims et al.， J.Immunol.，151：2296(1993)；Chothia et al.， J.Mol.Biol.， 196：901(1987))。另一种方法采用轻链或重链特定亚型的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区。相同的框架可用于多种不同的人源化抗体(Carter et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285(1992)；Presta et al.， J.Immunol.， 151：2623(1993))。

更重要的是，将抗体人源化后仍保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物特性。为达到此目的，根据一种优选方法，用亲本序列和人源化序列的三维模型，分析亲本序列和各种概念性人源化产物，以此制备人源化抗体。免疫球蛋白三维模型已有商品，是本领域技术人员所熟悉的。还有用于描述和展示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。通过观察这些展示结果，可分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中可能发挥的作用，即分析能影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可从受体(recipient)和引进序列中选出FR残基并组合，从而得到所需抗体性质，如对靶抗原的亲和力增加。总之，超变区残基直接并且最主要涉及对抗原结合的影响。

本申请还涉及人源化抗体或亲和力成熟的抗体的各种形式。例如，所述人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是抗体片段，如Fab，其可任选与一个或多个靶向试剂偶联以制备免疫偶联物。或者，所述人源化抗体或亲和力成熟的抗体可以是完整的抗体，例如完整的IgG1抗体。

Fab′-SH片段可从大肠杆菌直接回收，并经化学偶联形成F(ab′)₂片段(Carter et al.， Bio/Technology， 10：163-167(1992))。依据另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养中分离F(ab′)₂片段。其它产生抗体片段的技术对本领域技术人员是显而易见的。在其它实施方案中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)(WO 93/16185；美国专利5,571,894和美国专利5,587,458)。抗体片段也可以是“线性化抗体”，举例如美国专利5,641,870所述。这类线性化抗体片段可以是单特异性或双特异性的。

双特异性抗体是具有针对至少两种不同表位的结合特异性的抗体。例示性双特异性抗体可以与同一蛋白质的两个不同表位结合。双特异性抗体可制备成全长抗体或抗体片段(如F(ab′)₂双特异性抗体)。这些可以是多条抗体链的融合物或可以是一条链。一条重链自身可以是有活性的(competent)。

在制备双特异性抗体的方法中，双特异性免疫粘附素是通过将分别编码包含与免疫球蛋白重链恒定区序列融合的第一结合结构域但缺少轻链结合位点的第一融合物、包含与免疫球蛋白重链恒定区序列融合的第二结合结构域并保留轻链结合位点的第二融合物、以及免疫球蛋白轻链的DNA序列引入宿主细胞而制备的。然后培养所述宿主细胞以表达DNA序列来制备如下的混合物(i)包含与第二融合物-免疫球蛋白轻链配对物共价连接的第一融合物的异三聚体(heterotrimer)；(ii)包含两个共价连接的第二融合物-免疫球蛋白轻链配对物的异四聚体(heterotetramer)；和(iii)包含两个共价连接的第一融合物的分子的异二聚体。从细胞培养中除去产物的混合物，并从其它产物中分离异三聚体。此方法公开于WO 94/04690。制备双特异性抗体的进一步细节，见例如Suresh et al.， Methods in Enzymology， 121：210(1986)。

根据美国专利5,731,168所述的另一种方法，可以改造一对抗体分子之间的界面，使得从重组细胞培养中收获的异二聚体的百分比最大。优选的界面包括抗体恒定区C_H3结构域的至少一部分。在该方法中，源于第一种抗体分子界面上的一条或多条氨基酸小侧链被较大侧链(如酪氨酸或色氨酸)取代。与所述大侧链大小相同或相近的互补“沟”可通过将氨基酸大侧链用小侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代而在第二种抗体分子的界面上形成。此机制使得异二聚体的产量比其它不必要的终产物如同二聚体等的产量高。

双特异性抗体包括交联抗体或“异源偶联物”抗体。例如，可使异源偶联物中的抗体之一与抗生物素蛋白偶联，使另一抗体与生物素偶联。已有观点认为，这类抗体可用于将免疫系统细胞导向不想要的细胞(美国专利4676980)，和用于治疗HIV感染(WO91/00360，WO92/200373，和EP03089)。异源偶联物抗体可通过任何方便的交联方法制备。适当的交联制剂和多种交联技术为本领域公知，可公开在美国专利4,676,980中。

从抗体片段制备双特异性抗体的技术已在文献中描述。例如，双特异性抗体可利用化学连接来制备。Brennan et al.， Science， 229：81(1985)中描述了将完整抗体经蛋白水解制备成F(ab′)₂片段的方法。这些片段在二巯基复合剂亚砷酸钠存在时被还原，从而稳定相邻的二巯基，并阻止分子间形成二硫键。生成的Fab′片段之后被转化为硫代硝基苯甲酸(thionitrobenzoate)(TNB)衍生物。其中一种Fab′-TNB衍生物经巯基乙胺还原成Fab′-硫醇(thiol)，再与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合形成双特异性抗体。如此产生的双特异性抗体可用于选择性固定酶的试剂。

另外，Fab′-SH片段可从大肠杆菌直接回收，并经化学偶联形成双特异性抗体(Shalaby et al.， J.Exp.Med.， 175：217-225(1992))。

直接从重组细胞培养中制备并分离双特异性抗体片段的各种技术也已有描述。例如，可用亮氨酸拉链制备双特异性抗体(Kostelny et al.， J.Immunol.，148：1547-1553(1992))。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽与两种不同抗体的Fab′部分通过基因融合而连接。使抗体同二聚体在铰链区被还原，形成单体，然后被再氧化形成抗体异二聚体。该方法也可用于制备抗体同二聚体。由Hollinger et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 90：6444-6448(1993)描述的“二价抗体(diabody)”技术提供了另一种制备双特异性抗体片段的方法。所述片段中含有重链可变区(V H)，其通过接头与轻链可变区(V_L)相连，该接头非常短，使得同一链的两个结构域之间无法配对。因此，一个片段上的V_H和V_L结构域被迫与另一片段上的互补V_L和V_H结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。用单链Fv(sFv)二聚体来制备双特异性抗体片段的另一种策略也有报道(Gruber et al.， J.Immunol.， 152：5368(1994))。

本发明还涉及二价以上的抗体。例如可制备三特异性抗体(Tutt et al.， J. Immunol.， 147：60(1991))。

编码多肽变体的核酸分子用本领域已知的各种方法制备。这些方法包括，但不限于，从天然来源分离(在存在天然氨基酸序列变体的情况下)，或通过对早先制备的该多肽变体或非变体形式进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变，PCR诱变或盒式诱变来制备。

优选修饰本发明抗体的效应器功能(effector function)，以便，例如，增强与Fc受体的结合。这可以通过在抗体Fc区引入一或多个氨基酸取代而获得。或者，或另外，可在Fc区引入半胱氨酸残基，使得在此区形成链间二硫键。

为了延长该抗体的血清半寿期，可在该抗体(尤其抗体片段)中掺入补救(salvage)受体结合表位，如美国专利5,739,277所述。本文中术语“补救受体结合表位”是指IgG分子(例如IgG₁，IgG₂，IgG₃，或IgG₄)Fc区中负责延长该IgG分子的体内血清半寿期的表位。

本发明还涉及抗体的其它修饰。例如，可以使抗体与多种非蛋白质聚合物中的一种，如聚乙二醇，聚丙二醇，聚氧化烯(polyoxyalkylene)，或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物连接。

B.将核酸插入复制型载体

可以将异源核酸(如cDNA或基因组DNA)适当插入复制型载体中，以便在适宜启动子控制下在大肠杆菌中表达。许多载体可用于此目的，对合适的载体的选择主要取决于要被插入该载体的核酸的大小和要被该载体转化的具体宿主细胞。每种载体根据与其相容的具体宿主细胞而包含不同的组分。依具体的宿主种类不同，载体组分通常包括但不限于一或多个下述组分：信号序列，复制起点，一或多个标志基因，启动子和转录终止序列。

一般来说，包含复制子和源于与宿主细胞相容的物种的控制序列的质粒载体与大肠杆菌宿主联用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，大肠杆菌通常用pBR322转化，这是来源于大肠杆菌的质粒(参见例如，Bolivar et al.， Gene， 2：95(1977))。pBR322含有氨苄青霉素和四环素抗药性基因，并由此提供鉴定转化细胞的简便方法。pBR322质粒或其它细菌质粒或噬菌体也通常包含或在修饰后包含能被大肠杆菌宿主使用的启动子，以表达该选择标记基因。

(i)信号序列组分

编码本发明目标多肽的DNA不仅可以直接表达，也可作为与另一多肽的融合物来表达，所述另一多肽优选信号序列或在成熟多肽的N末端具有特异性裂解位点的其它多肽。通常，信号序列可以是载体的组分，或者是插入载体中编码多肽的DNA的一部分。所选异源信号序列应当是被宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶裂解)的一种序列。

对于不识别和加工天然或真核生物多肽信号序列的原核宿主细胞，信号序列则被选自，例如，下组的原核生物信号序列取代：碱性磷酸酶，青霉素酶，1pp或热稳定肠毒素II前导序列。

(ii)复制起点组分

表达载体包含能使该载体在一或多种所选宿主细胞中复制的核酸序列。在多种细菌中，这样的序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌。

(iii)选择基因组分

表达载体通常包含选择基因，也称为选择标志。该基因编码为生长在选择性培养基中的转化的宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在所述培养基中存活。选择标志与本发明使用和定义的遗传标志不同。典型的选择基因编码具有以下性质的蛋白：(a)赋予对抗生素或其它毒素(如氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素)的抗性，(b)弥补并非由遗传标记造成的营养缺陷型缺陷，或(c)提供复合培养基不能供给的关键营养物，例如编码芽孢杆菌(Bacilli)D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个实例是利用药物阻滞(arrest)宿主细胞的生长。在这种情况下，那些被目标核酸成功转化的细胞产生能赋予药物抗性的多肽，从而在选择中存活。这种显性选择的实例使用药物新霉素(Southern et al.， J.Molec. Appl.Genet.， 1：327(1982))，霉酚酸(Mulligan et al.， Science， 209：1422(1980))或潮霉素(Sugden et al.， Mol.Cell.Biol.， 5：410-413(1985))。这三个实例利用在真核控制下的细菌基因，来分别传递对适当的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。

(iv)启动子组分

用于产生目标多肽的表达载体含有可被大肠杆菌识别并与编码目标多肽的核酸可操作相连的适宜启动子。适用于大肠杆菌宿主的启动子包括，β-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang et al.， Nature， 275：615(1978)；Goeddel etal.， Nature， 281：544(1979))，阿拉伯糖启动子系统(Guzman et al.， J.Bacteriol.，174：7716-7728(1992))，碱性磷酸酶，T7启动子，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel， Nucleic Acids Res.， 8：4057(1980)；和EP 36,776)，和杂合(hybrid)启动子如tac启动子(deBoer et al.， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 80：21-25(1983))。但其它已知的细菌启动子也是适宜的。它们的核苷酸序列业已公开，因而技术人员可以利用连接子或衔接子(adaptor)提供任何所需限制酶位点，将这些核苷酸序列与编码目标多肽的DNA可操作连接(Siebenlist et al.， Cell，20：269(1980))。

优选地，本文使用的启动子是可诱导型启动子，即被诱导剂或条件(如周质磷酸酯(盐)耗竭)激活的启动子。优选本文的此类可诱导型启动子是碱性磷酸酶启动子、tac启动子或T7启动子。

用于细菌系统的启动子通常还含有Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其与编码目标多肽的DNA可操作连接。该启动子可通过限制酶消化，与细菌来源的DNA脱离，并插入到含有所需DNA的载体中。

(v)构建并分析载体

包含上述所列一或多个组分的适宜载体可使用标准连接技术构建。分离的质粒或DNA片段按所需形式裂解，剪裁(tailored)和再连接，以产生所需质粒。

为了分析证实所构建质粒中的正确序列，用连接混合物转化大肠杆菌K12株294(ATCC 31,446)或其它菌株，并用相应的氨苄青霉素或四环素抗性选择出成功的转化体。制备来自转化体的质粒，通过限制性内切核酸酶消化进行分析，和/或用Sanger et al.，Proc. Natl.Acad.Sci.USA， 74：5463-5467(1977)或Messing et al.， Nucleic Acids Res.， 9：309(1981)的方法，或用Maxamet al.， Methods in Enzymology， 65：499(1980)的方法测序。

C.选择并转化宿主细胞

作为表达本发明质粒的适宜亲代宿主的大肠杆菌宿主包括大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)、大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、和大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)。这些实例是为了说明而不是为了限制。上述任一种菌株的突变细胞都可用作起始宿主，它们通过进一步突变，可以包含至少本文所需的最少基因型。大肠杆菌菌株W3110是优选的亲代宿主，因为它是重组DNA产物发酵的通用宿主菌株。用作亲代宿主的起始大肠杆菌宿主的实例，与它们的基因型一起，都包括在如下表中：

菌株	基因型
		W3110	K-12F-lambda-IN(rrnD-rrnE)1
1A2	ΔfhuA(ΔtonA)
		9E4	ΔfhuA(ΔtonA)ptr3
27A7	ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 phoAΔE15(argF-lac)169
		27C6	ΔfhuA(ΔtonA)phoAΔE15(argF-lac)169ptr3 ompTΔ(nmpc-fepE)
27C7	ΔfhuA(ΔtonA)phoAΔE15(argF-lac)169ptr3 degP41∷kanR ompTΔ(nmpc-fepE)
		33D3	ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lacIq lacL8 ompTΔ(nmpc-fepE)degP∷kanR
36F8	ΔfhuA(ΔtonA)phoAΔE15(argF-lac)169ptr3 degP41∷kanR ilvG+
		43D3	ΔfhuA(ΔtonA)phoAΔE15(argF-lac)169ptr3 degP41∷kanR ompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+
43E7	ΔfhuA(ΔtonA)phoAΔE15(argF-lac)169 ptr3 degP41 ompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+
		43F6	ΔfhuA(ΔtonA)phoAΔE15(argF-lac)169ptr3 degP41∷kanR ompTΔ(nmpc-fepE)Δ(rbs7)ilvG+ΔglpT596
44D6	ΔfhuA(ΔtonA)(argF-lac)169ptr3 degP41∷kanR ompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+
		45F8	ΔfhuA(ΔtonA)(argF-lac)169ptr3 degP41 ompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoS(T10Y)
45F9	ΔfhuA(ΔtonA)(argF-lac)169ptr3 degP41 ompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoS(T10Y)cyo∷kanR
		61G1	ΔfhuAΔptrΔompTΔdegPΔphoA ilvG+ΔglpTQ

还优选在制备36F8菌株的过程中的中间物，即27B4(美国专利5,304,472)和35E7(一种比27B4生长好的自发、温度-耐受性菌落分离物)。另一种适宜的菌株是具有突变的周质蛋白酶的大肠杆菌菌株，见1990年8月7日授权的美国专利4,946,783。

一个实施方案中，所用的大肠杆菌宿主细胞就glpT基因而言是野生型的如43E7，或者是glpT基因缺陷型的如43F6或61G1。另一个实施方案中，所用的大肠杆菌宿主细胞就phoA基因而言是野生型的。在优选的实施方案中，大肠杆菌是染色体phoA缺陷型的。另一个优选的实施方案中，大肠杆菌是染色体glpT和染色体phoA缺陷型的。在更优选的实施方案中，大肠杆菌是染色体glpT和染色体phoA缺陷型的，但不是染色体ugp缺陷型的。最优选的这种突变型大肠杆菌宿主是43F6或61G1，其基因型已于上表中给出。上面的“就glpT而言是野生型的”是指glpT+或glpT感受态细胞的大肠杆菌宿主，即在染色体glpT无缺陷的那些。同样地，上面的“就phoA而言是野生型的”是指phoA+或phoA感受态细胞的大肠杆菌宿主，即在染色体phoA无缺陷的那些。

本发明菌株可以通过亲本菌株的染色体整合或其它技术来生产，包括以下实施例中所述的技术。

编码所述多肽的核酸被插入宿主细胞中。优选地，这可以通过用上述表达载体转化宿主细胞、并在为了诱导各种启动子而酌情改良的常规营养培养基上培养而完成。

转化是指将DNA作为染色体外元件或通过染色体整合体导入生物体从而使此DNA能够复制。根据所用的宿主细胞，采用适合该细胞的常规方法进行转化。使用氯化钙的钙处理法，如Sambrook et al.， Molecular Cloning： A Laboratory Manual(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)的部分1.82所述，通常用于原核细胞或基本含有细胞壁屏障的其它细胞。用于转化的另一方法可以使用聚乙二醇/DMSO，如Chung和Miller， Nucleic Acids Res.， 16：3580(1988)所述。另一种方法可以使用的技术为电穿孔。

D.培养宿主细胞

用于制备本发明多肽的大肠杆菌细胞在通常于Sambrook et al.出处同上，描述的合适培养基中培养。培养条件如温度、pH等等，是那些选作用来表达的宿主细胞以前所用的条件，对于一般技术人员来说是显而易见的。

培养细胞并且向培养基进料可转运的有机磷酸酯如磷酸甘油，例如α-磷酸甘油和/或β-磷酸甘油，尤其为2-磷酸-甘油和/或3-磷酸-甘油。培养可以在摇瓶或发酵罐、优选发酵罐中进行。多肽优选从细胞的细胞质、周质或培养基中回收。

在本发明方法中，所述核酸的表达可以在培养步骤中的任何时段开始。然而，优选所述核酸的表达在细胞密度仍上升时开始。这可以通过在细胞生长停止前用合适的诱导子或诱导条件诱导启动子来实现。

用于使多肽制备达到最大化的向培养基进料有机磷酸酯的速度，依赖于很多因素，包括有机磷酸酯的种类、有机磷酸酯的浓度、所制备多肽的种类、启动子种类、所用的宿主细胞菌株、及培养液中的细胞密度。如果多肽是IGF-I而有机磷酸酯是用于延续制备时间(extend the production duration)的3-磷酸-甘油，在所述的培养条件下，用10-L的方法，有机磷酸酯的进料速度优选每大约8-10升大约1-7mmoles/小时(见图4)，更优选大约1-6mmoles/小时，更优选大约2-6mmoles/小时，更优选大约2-5mmoles/小时，更优选大约3-4mmoles/小时。最适的进料速度取决于方法、细胞密度、及呼吸速度等等。

同样，在优选的实施方案中，其中多肽是Apo2L并且有机磷酸酯是用于使产物表达移向与活动生长期同步的3-磷酸-甘油，并用10-L的方法，有机磷酸酯的进料速度优选每大约8-10升大约4-17mmoles/小时(见图7)，更优选大约6-16mmoles/小时，更优选大约8-15mmoles/小时，最优选大约10-14mmoles/小时。最适的有机磷酸酯进料速度需要由具体异源蛋白的表达所用的个别方法来确定。

还可以包括除碳、氮和无机磷酸酯(盐)来源之外的任何其它必要培养基成分，它们可以合适的浓度单独加入，或与其它组分或培养基(如复合氮源)一起组合成混合物再加入。优选地，在培养步骤的起始培养基中也包含无机磷酸酯(盐)。如果存在所述的无机磷酸酯(盐)、优选磷酸钠和/或磷酸钾，那么无机磷酸酯(盐)与有机磷酸酯的比率取决于表达多肽的种类和使用的有机磷酸酯的种类等因素。此比率可以是本领域技术人员能容易确定的任何比例，通常从大约1∶10(1份的Pi比10份的有机磷酸酯)到1∶0.25。对于Apo2配体，优选从大约1∶4到1∶0.25，并更优选从大约1∶3到1∶0.5，还优选从大约1∶3到1∶1，更优选从大约1∶2到1∶1，最优选大约1∶1。这些比率可较早地诱导蛋白质的表达，在有些情况下可较早产生更多产物。培养基的pH主要取决于宿主生物体，可以是大约5-9的任何pH。

如果启动子是可诱导型启动子，那么，为了使诱导发生，通常用高细胞密度方法将细胞培养至一定光密度(如A₅₅₀约200)，以此启动诱导(例如，通过添加诱导物，通过耗竭培养基组分等)，从而诱导编码目标多肽的基因表达。

使用碱性磷酸酶启动子时，用于产生本发明目标多肽的大肠杆菌细胞在适宜培养基中培养，在所述适宜培养基中，碱性磷酸酶启动子可以通常如Sambrook等(出处同上)所述那样被诱导。首先，培养基可含有细菌生长所需的无机磷酸酯(盐)，其量足以支持明显的细胞生长并避免在启动子控制下对靶异源多肽合成的诱导。随细胞生长并利用磷酸酯(盐)，它们降低培养基中的无机磷酸酯(盐)水平，从而当无机磷酸酯(盐)被耗竭时诱导多肽的合成。通过添加例如含有G2P和G3P的混合物或G3P饲料的饲料，会在周质及支持培养基中在缺如无机磷酸酯(盐)情况下或处在无机磷酸酯(盐)饥饿水平的情况下，继续生长到较高的细胞密度，如达到OD550为200或更高，使产物的积累增加或延续。

E.检测表达

基因表达可以直接在样品中测定，例如用常规Northern印迹法来定量mRNA转录(Thomas， Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 77：5201-5205(1980))，斑点印迹(RNA分析)或原位杂交，它们使用基于编码多肽的序列适当标记的探针。可以使用各种标记物，最常见的是放射性同位素，尤其是³²P。然而，也可使用其它技术，例如使用生物素-修饰的核苷酸以便引入到多核苷酸中。生物素在以后作为与抗生物素蛋白或用各式各样标记物(如放射性核素，荧光体，酶等)标记的抗体相结合的位点。或者，可以使用各种检测(assays)或凝胶(gels)方法检测蛋白质。

为了使表达的基因产物分泌，在足以分泌基因产物的条件下培养宿主细胞。这些条件包括例如温度、养分及允许由细胞分泌的细胞密度条件。另外，这些条件是那些细胞能执行基本的转录、翻译、及从一个细胞区室向另一个细胞区室传递蛋白质的细胞功能的条件，如本领域技术人员已知的那样。

F.纯化多肽

以下方法单独或联合可以作为适当纯化方法的实例：免疫亲和或离子交换柱的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；疏水相互作用层析(HIC)；硅层析；离子交换树脂如S-SEPHAROSE^TM和DEAE层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；以及使用例如SEPHADEX^TMG-75介质的凝胶过滤，但具体用什么方法取决于多肽的类型。单克隆抗体可以通过常规抗体纯化方法从培养基适当分离，所述方法例如蛋白-A SEPHAROSE^TM介质层析、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、或亲和层析。

本发明通过参考以下实施例可以更全面地理解。但它们不应被理解为限制本发明的范围。本文引用的所有文献和专利都引入作为参考。

实施例1

向摇瓶培养进料G3P以制备Llama抗体片段(重链)和Apo2L

背景：

将把最终浓度200mM的G3P添加到低磷酸酯(盐)(CRAP)或高磷酸酯(盐)培养基(THCD)中与各自添加对照物(水)进行比较，观察在摇瓶培养中对表达异源蛋白的影响。在本实施例的第一部分，靶异源蛋白是13kD llama抗-HCGCamelid单体(camelid monobody)。以前显示Camelid抗体有两个种，由两条重链加上两条轻链组成的经典IgG分子，和缺少轻链的重链IgG分子称为单体(monobody)。Camelid单体由大肠杆菌B菌株BL21，用tac启动子在低磷酸酯(盐)(CRAP)或高磷酸酯(盐)(THCD)富集培养基中表达。位于抗体片段编码序列之前的malE结合蛋白质信号序列指导表达蛋白质分泌到宿主的周质。在本实施例的第二部分，用T7启动子来调控Apo2配体在G3P-补充的和未补充的CRAP培养基中的大肠杆菌K12菌株HMS174中的表达。在上述两个试验中制备异源蛋白是通过在达到理想的细胞密度后添加IPTG来诱导的。

材料和方法：

pCB36624 86.RIG质粒的构建

通过修饰载体pL1602来构建pCB36624_86.RIG(Sidhu et al.， J.Mol. Biol.， 296：487-495(2000))。有pTac启动子序列和malE分泌信号序列的载体pS1602，包含融合于噬菌体mu的基因-3次要衣壳蛋白(p3)C-末端结构域的人生长激素序列。去除编码hGH的序列，所得的载体序列作为载体骨架用于插入编码llama抗-HCG抗体的合成的DNA片段(Spinelli et al.， Nat. Struct.Biol.3(9)：752-757(1996))。所得的噬菌粒(pCB36624)受IPTG-可诱导型P_tac启动子控制编码融合产物(Amman and Brosius， Gene， 40：183-190(1985))。所表达的多肽依次包括麦芽糖结合蛋白信号肽、抗-HCG编码区、FLAG表位标签、含抑制性终止密码子的Gly/Ser-富集接头肽(linker peptide)、P3C(噬菌体衣壳蛋白的C-末端结构域)。

用Sidhu et al.， J.Mol.Biol.， 296：487-495(2000)的方法，通过适当设计的“终止模板”噬菌粒来构建噬菌体展示文库。对于文库NNS17，用包含取代了密码子93，94，100和101的终止密码子TAA的pCB36624衍生物作为Kunkel诱变方法的模板(Kunkel et al.， Methods Enzymol.， 154：367-382(1987))，该方法设计了诱变的寡核苷酸NNS17以在修复终止密码子的同时引入在编码Gly95和Trp103的密码子之间的17 NNK兼并密码子。

NNS17：GCC GTC TAT ACT TGT GGT GCT GGT NNS NNS NNS NNS

NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGG

GGT CAG GGT(SEQ ID NO：3)

像所有单体一样，llama抗-HCG是Vh3家族成员因此被蛋白质A识别。蛋白质A的结合相互作用可用作CDR3-介导的稳定性的替代物(surrogate)。所得噬菌体文库经多轮抗蛋白质A分选来作为支架稳定性和表达的读出信息(readout)。分析被分选文库在NNS文库中氨基酸分布的选择偏好。根据所测序的残基发现，以位置96，97和98的序列命名的支架RIG显示为最占优势的克隆。支架RIG的17个氨基酸长的CDR3序列被确定为RIGRSVFNLRRESWVTW(SEQ ID NO：4)。含支架RIG的噬菌粒重命名为pCB36624_86.RIG，其DNA序列如下。

5′-GATGTTCAGT  TGCAGGAATC    AGGCGGTGGC    TTGGTACAGG

CCGGAGGTTC      GTTGCGTTTG    TCCTGTGCTG    CCTCGGGTGC

TACTGGTTCT      ACTTATGATA    TGGGCTGGTT    TCGTCAGGCT

CCGGGTAAAG      AACGTGAATC    GGTTGCCGCC    ATTAACTGGG

GGTCGGCTGG      GACTTACTAT    GCTTCGTCCG    TCCGTGGTCG

TTTTACTATT      TCACGTGATA    ATGCCAAAAA    AACTGTCTAT

TTGCAGATGA      ATTCATTGAA    ACCAGAAGAT    ACTGCCGTCT

ATACTTGTGG      TGCTGGTAGG    ATCGGCCGGT    CGGTCTTCAA

CTTGAGGAGG      GAGAGCTGGG    TCACGTGGTG    GGGTCAGGGT

ACCCAGGTCA      CTGTCTCCTC    TGCCGGTGGT    ATGGATTATA

AAGATGATGA TGATAAA-3′(SEQ ID NO：5)

pet19b.nohis质粒的构建

用常用的分子生物学技术，用聚合酶链式反应从自人胎盘cDNA分离的全长Apo2L克隆扩增Apo2L的密码子114-281。将包含限制性位点以利于克隆的额外核苷酸分别添加到5’和3’序列。5’寡核苷酸引物具有如下序列：5’GCTTGCTA CATATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGA  3’(SEQ IDNO：6)，它含有用下划线表示的Nde I限制性位点。3’寡核苷酸引物具有如下序列：5’CTTGAATA GGATCCCTATTAGCCAACTAAAAAGGCCCCAAAAAAACTGGC3’(SEQ ID NO：7)，它含有用下划线表示的BamHI限制性位点。所得片段用限制性位点Nde I到BamH I亚克隆到经修饰的杆状病毒表达载体pVL1392(Pharmingen)的阅读框架中，并处于包含His10标签和肠激酶切割位点的序列的下游(Pitti et al.， J.Biol.Chem.， 271：12687-12690(1997))。用Nde I和BamH I消化pVL1392-Apo2L，所产生的Nde I-到-BamH I片段被亚克隆到也用Nde I和BamH I消化的pET-19b(Novagen)中。所得质粒被命名为pet19b.nohis。

细菌菌株：

用常规方法，用pCB36624_86.RIG和pet19b.nohis分别转化BL21(stratagene)和HMS174(Merck)的感受态细胞。在含50μg/mL羧苄青霉素(LB+CARB50^TM羧苄青霉素)的LB平板上生长并划线纯化后挑出转化体，并在含50μg/mL CARE50^TM羧苄青霉素的LB培养液中于30℃温箱中培养。pCB36624_86.RIG和HMS174/pet19b.nohis分别赋予制备宿主BL21/pCB36624_86.RIG和pet19b.nohis羧苄青霉素抗性，从而使转化的宿主在抗生素存在时生长。

发酵培养基：

用低磷酸酯(盐)(CRAP)培养基和高磷酸酯(盐)(THCD)培养基评估llama抗体片段和Apo2配体的产生。培养基组分(每升初始的培养基所用的每种成分的量)列表如下：

成分	低-PO4培养基量/L	高-PO4培养基量/L
			葡萄糖硫酸铵Na2HPO4NaH2PO4-H2O柠檬酸钠，二水合物氯化钾1M硫酸镁Hycase SF酵母提取物水解酪蛋白氨基酸1M MOPS，pH7.3KOH(为了将pH调节到pH7.3)	5.5g3.57g--0.71g1.07g7ml5.36g5.36g110ml按需	5.5g3.57g1.86g0.93g0.71g1.07g7ml5.36g5.36g110ml按需

为制备200mM的G3P-补充培养基，在接种前将5ml的1M DL-α-磷酸甘油(G3P)(Sigma Chem.Co.)添加到20ml的含50μg/ml羧苄青霉素的低-PO₄培养基(低-PO₄培养基+CARB50^TM羧苄青霉素)或含50μg/ml羧苄青霉素的高-PO₄培养基(高-PO₄培养基+CARB50^TM羧苄青霉素)。对于未补充的(对照)培养基，用5ml水替代G3P。

摇瓶发酵：

在含25ml对照或G3P-补充培养基的125-ml带挡板(baffled)烧瓶中进行摇瓶发酵。将在LB+CARB50^TM羧苄青霉素中生长的BL21/pCB36624_86.RIG或HMS174/pet19b.nohis的过夜培养物反向稀释大约1∶100来接种到对照或G3P-补充培养基中。在30℃在摇床上以250RPM温育培养物，在细胞密度达到培养基支持的潜在细胞生长的大约50-60％时添加1mM IPTG来诱导产物表达。在加入诱导物之前以及在接种后大约24hrs，从1ml液态培养物制备细胞沉淀颗粒(pellets)，并储存于-20℃。

用PAGE和光密度测定法分析Llama抗体片段的累积：

将从1ml培养物样本制备的冰冻(-20℃)细胞沉淀颗粒融化并重悬于足够量的10mM TRIS，pH7.6+1mM EDTA，pH8.0(TE)中，使细胞悬液达到1OD/25μl的浓度。将25μl的TE-细胞悬液与25μl含β-巯基乙醇的2×样品缓冲液混合。将混合物在95℃以上加热5分钟，之后向NU-PAGE^TM预制的10％Bis-Tris凝胶(Novex)的每孔上样10μl(相当于0.2OD)。在MES缓冲液(2-(N-morpholino)ethanesulphonic acid的去离子水溶液，用如1N NaOH调节到合适的pH)中进行电泳。用COOMASSIE BLUE R250^TM染料染色分离胶然后脱色。在用Kodak照像系统扫描湿的凝胶后，用Kodak DIGITALSCIENCE 1D^TM照像软件测定13-kD抗体片段的条带强度。

用反相HPLC分析的Apo2配体的累积：

将从1ml培养物样本制备的冰冻(-20℃)细胞沉淀颗粒重悬于足够量的TE缓冲液中以使细胞悬液达到1OD/25μl的浓度。将20μl的细胞悬液与480μl的6M盐酸胍，pH9.0+100mM二硫苏糖醇(DTT)混合，并可在于13,000rpm离心15分钟之前在室温温育1小时来回收上清/提取物。在将20μl上样到HPLC(PerSeptive Biosystems POROSR1/10介质)来进行反相层析之前，将此提取物通过MILLIPORE^TM旋转-滤器过滤。在80℃进行HPLC分离，流动相以1.0ml/min流动，并用0.1％TFA中28％到35％的乙腈梯度在20分钟中将Apo2L与污染蛋白质分离。在280nm波长进行峰值检测。样本中单体的量用来自与用相同方法分析的5-20μg纯化标准品相关的峰下面积的平均反应率(average response factor)(mAU/μg)来计算。

结果：

图1显示，相对于所述对照，在补充了200mM G3P的高-PO₄(THCD)和低-PO₄(CRAP)培养基中抗体以较高水平表达。

图2显示，相对于所述对照，在补充了200mM G3P的低-PO₄(CRAP)培养基中Apo2L蛋白质以较高水平表达。

实施例2

将G3P进料到野生型或(ΔglpTphoA-ugp+)宿主的10-L发酵培养来制备 受碱性磷酸酶启动子调控的IGF-I

材料与方法：

表达IGF-I的pBKIGF-2B质粒：

用于表达本文IGF-I的质粒pBKIGF-2，如美国专利5,342,763具体所述来构建。此质粒从pBR322的基本骨架构建。用于在大肠杆菌中表达IGF-I基因所需的转录和翻译序列是碱性磷酸酶启动子和trp Shine-Dalgarno序列提供的。lambda t_o转录终止子位于IGF-I终止密码子附近。从细胞质分泌蛋白质是由lamB信号序列指导的。大部分rhIGF-I发现在细胞周质空间中。质粒pBKIGF-2B赋予被转化的宿主四环素抗性。

细菌菌株和生长条件：

IGF-I发酵所用的宿主是大肠杆菌W3110的衍生物(Bachmann， Cellular and Molecular Biology，vol.2(Washington，D.C.：American Society forMicrobiology，1987)，pp.1190-1219)。用菌株43E7(大肠杆菌W3110fhuA(tonA)Δ(argF-lac)ptr3 degP41 ΔompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoA)进行有关野生型glpT宿主的试验，并用菌株43F6(大肠杆菌W3110 fhuA(tonA)Δ(argF-lac)ptr3 degP41 ΔompTΔ(nmpc-fepE)ilvG+phoA ΔglpT)进行有关ΔglpT突变的宿主的试验。通过常用方法，用pBKIGF-2B转化43E7或43F6的感受态细胞。转化体在含20μg/mL四环素(LB+TET20^TM四环素)的LB平板上生长并划线纯化后挑出转化体，并在含20μg/mL TET20^TM四环素的LB培养液中于37℃摇床/温箱中生长，之后在发酵罐中进行试验。pBKIGF-2B赋予制备的宿主四环素抗性，并允许转化的宿主在抗生素存在时生长。

10-L发酵方法：

发酵培养基组分和用于表达IGF-I的方案与美国专利5,342,763所描述的IGF-I方法有些类似。简言之，43E7/pBKIGF-2或43F6/pBKIGF-2的摇瓶接种培养物主要用于接种丰富制备(rich production)培养基。该培养基的组分(每升初始的培养基所用的每种成分的量)列表如下：

成分	量/L
		葡萄糖*硫酸铵磷酸二氢钠，二水合物磷酸氢二钾柠檬酸钠，二水合物氯化钾硫酸镁，七水合物PLURONICTMPolyol，L61氯化铁，七水合物硫酸锌，七水合物氯化钴，六水合物钼酸钠，二水合物硫酸铜，五水合物硼酸硫酸镁，一水合物盐酸四环素酵母提取物*NZ Amine AS*蛋氨酸*氨水硫酸	200-500g2-10g1-5g1-5g0.5-5g0.5-5g0.5-5g0.1-5mL10-100mg0.1-10mg0.1-10mg0.1-10mg0.1-10mg0.1-10mg0.1-10mg10-100mg4-30mg5-25g5-25g0-5g按需控制pH按需控制pH

^*初始时将部分葡萄糖、酵母提取物、蛋氨酸和NZ Amine AS添加到培养基中，剩下的在整个发酵过程中进料。

10-L发酵是补料分批方法，发酵参数设置如下：

搅拌：                      1000RPM

通气：                      10.0slpm

pH控制：                    7.3

温度：                      37℃

背压(Back pressure)：       0.3bar

葡萄糖进料：                用算式通过计算机控制、在DO₂跌至

                            30％后将溶解氧浓度(DO₂)维持在空气

                            饱和的30％。

复合氮进料：                当OD₅₅₀达到40时开始0.2mL/min的恒

                            定进料速度并在剩余时间内保持该速度

持续时间：                  40到50小时

在涉及进料3-磷酸-甘油(G3P)的试验中，适当量的1M G3P储存液掺料到复合氮进料中，随后的补充进料的进料速度增加到将所需量的复合氮和G3P给到培养物。

用IGF-I累积的差异来评估是否进料G3P对ΔglpT突变的影响。溶解于6M胍+100mM DTT的样品中的IGF-I的总量用反相HPLC方法如美国专利6,559,122所述来进行测量。

结果：

图3显示通过野生型宿主(43E7)和AP启动子以及持续进料的葡萄糖，向培养物进料G3P比不添加G3P时分泌型IGF-I的量显著升高。

图4显示通过ΔglpT宿主(43F6)和AP启动子，向每大约8升培养物以1.18或3.28mmoles/小时进料G3P，比不添加G3P时分泌型IGF-I的量显著升高，但不比每大约8升培养物以8.22mmoles/小时进料G3P时高。最适进料速度可以由本领域技术人员根据产物、有机磷酸酯种类等容易地确定。在所描述的发酵方法的条件下，在10-升发酵罐中进行培养来产生IGF-I，每大约8-10升，最适G3P进料速度在大约1-7mmoles/小时，更优选大约1-6mmoles/小时，更优选大约2-6mmoles/小时，更优选大约2-5mmoles/小时，最优选大约3-4mmoles/小时的优选范围。这个范围内的进料速度不仅会使产物的量超过对照，而且相对于对照它还会延长制备时间。

实施例3

进料3-磷酸-甘油可提高10-L方法中的Apo2配体累积

Apo2配体的背景

凋亡诱导配体2(Apo2L)(Pitti et al.， J.Biol.Chem.， 271：12687-12690(1996))，也称为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)(Wiley et al.，Immunity， 3：673-682(1995))是一种II类膜蛋白，并且是TNF家族配体的成员。Apo2L/TRAIL通过结合其相关(cognate)死亡受体引起在多种癌细胞而不是大多数正常细胞中的凋亡(WO 99/00423；Ashkenazi， FASEB J.， 13：(7)A1336(April 23，1999)；Ashkenazi， Nature Reviews-Cancer， 2：420-430(2002))。Apo2配体的细胞外结构域的可溶片段，对应于氨基酸残基114-281(从这里起称为Apo2L/TRAIL)，现正在作潜在的临床研究并已经在大肠杆菌中成功表达。

发酵方法的概述：

表达载体编码碱性磷酸酶(AP)启动子来调控大约19.5-kDa多肽的制备。所表达的新生多肽，从核糖体释放后，在细胞质中折叠成单体，进一步缔合成为有生物活性的同三聚体。发酵中，将方法参数设定为在大约3.0mmoles/L-min的峰值氧摄入速度时行使细胞活性。收获培养液后，细胞质诱捕(trapped)的异源蛋白通过机械细胞破裂而释放到细胞裂解物中，并可以从中回收。

材料和方法：

pAPApo2-P2RU质粒的构建：

pAPApo2-P2RU描述于2001年1月4日公开的WO 01/00832中。主要地，此质粒，其构建体如图5所示，编码了共表达的Apo-2L(氨基酸残基114-281)及pro2和argU编码的具有罕见密码子的tRNA，该共表达受碱性磷酸酶启动子的调控。基于pBR322的质粒(Sutcliffe， Cold Spring Harbor Symp. Quant.Biol.， 43：77-90(1978))pAPApo2-P2RU用于在大肠杆菌中制备Apo-2L。Apo-2L表达所需的转录和翻译序列是由碱性磷酸酶启动子和trpShine-Dalgarno序列提供的，如对于质粒所描述的(Chang et al.， Gene，55：189-196(1987))。Apo-2L的编码序列(来自114-281)位于所述启动子和Shine-Dalgarno序列的下游，并且在起始的蛋氨酸之前。此编码序列包括编码Apo-2L的残基114-281的核苷酸(图6所示，图6的SEQ ID NOs：1和2分别为核苷酸和氨基酸序列)，只是编码残基Pro119的密码子变为“CCG”而不是“CCT”，从而消除潜在的二级结构。编码lambda t_o转录终止子的序列(Scholtissek et al.， Nucleic Acids Res.， 15：3185(1987))在Apo-2L编码序列之后。

此外，该质粒也包括针对pro2 tRNA(Komine et al.， J.Mol.Biol.，212：579-598(1990))和argU/dnaY(Garcia et al.， Cell， 45：453-459(1986))的表达的序列。这些基因通过PCR从大肠杆菌W3110克隆，并置于lambda t_o转录终止子序列下游。该质粒赋予制备宿主四环素和氨苄青霉素的抗性。

细菌菌株和生长条件：

菌株43E7(大肠杆菌W3110 fhuA(tonA)phoAΔ(argF-lac)ptr3 degPompTilvG+))作为野生型制备宿主与glpT-突变宿主43F6比较Apo2配体和稀有密码子tRNA的表达。制备43E7或43F6的感受态细胞并用常用方法通过pAPApo2-P2RU转化。从含20μg/ml四环素的LB平板(LB+Tet20)挑出转化体、划线纯化，并在含20μg/mL四环素的LB培养液中于30℃摇床/温箱中生长，之后在-80℃储藏于DMSO中。

制备Apo2L的发酵方法：

通过用新解冻的库存培养小瓶接种含4-6nM磷酸钠的无菌LB培养基来制备摇瓶接种物。在培养基中加入适当的抗生素来施加选择性压力来确保质粒的保持。在大约30℃(28℃-32℃)振摇温育瓶中的培养物14-18小时。然后用此培养物来接种制备发酵容器。接种体积在最初培养基体积的0.1％到10％之间。

在表1所示的制备培养基中制备Apo2L，得到大约10升的最终培养体积。在大约30℃(28-32℃)和控制在大约7.0(6.5-7.5)的pH进行发酵。设定通气速度和搅拌速度以向培养物提供足够的氧。就在所述分批进料的磷酸盐耗竭前(在大约75-85OD)，开始进料DL-α-磷酸甘油进料(所购产品的说明显示产物纯度为80-90％，β-磷酸甘油列为主要杂质)并以理想的进料速度来进料。在整个发酵方法中，基于计算机算式向细胞培养进料葡萄糖作为主要碳源，同时确保有氧环境。

在发酵过程中二次分批添加大约50-150μM(最终浓度)的ZnSO₄，一批就在诱导产物表达前，另一批大约在改进的同三聚体装配的制备过程的中点(mid-point)。在此实施例中，在大约80-120OD₅₅₀的培养光学密度并在接种后大约28小时进行上述添加。

可在收获前大约34-45小时进行发酵。

表1

针对AP启动子表达系统的制备培养基组分

组分	量/升
		四环素	4-20mg
葡萄糖a	10-250g
		硫酸铵a	2-8g
磷酸二氢钠，二水合物a	1-5g
		磷酸氢二钾a	1-5g
磷酸二氢钾a	0-5g
		柠檬酸钠，二水合物a	0.5-5g
氯化钾	0-5g
		硫酸镁，七水合物a	1.0-10g
Antifoam	0-5ml
		氯化铁，六水合物a	20-200mg
硫酸锌，七水合物a	0.2-20mg
		氯化钴，六水合物a	0.2-20mg
钼酸钠，二水合物a	0.2-20mg
		硫酸铜，五水合物a	0.2-20mg
硼酸a	0.2-20mg
		硫酸镁，一水合物a	0.2-20mg
酪蛋白水解物a	5-25g
		酵母提取物a	5-25g

^a发酵时可将部分的这些组分进料到培养物中，按需加入氨水来控制pH。

用离子交换HPLC层析方法评估发酵方法中可溶产物的累积：

在发酵时程中取培养液样本。通过离心收集将来自1毫升培养液样本的细胞沉淀颗粒稀释到OD₅₅₀为20的细胞密度，并将所得细胞沉淀颗粒保存在-20℃等待分析。使细胞沉淀颗粒融化并在0.5ml的提取缓冲液(50mMHEPES，pH8.0，50mM EDTA和0.2mg/ml母鸡蛋白溶菌酶)中重悬，再经机械破坏从细胞质释放产物。通过离心从细胞裂解物中去除固体，之后将澄清过的裂解物上样到HPLC柱(DIONEX PROPAC^TMIEX介质)作三聚体定量。HPLC分析方法通过使用25-mM磷酸酯(盐)(pH7.5)缓冲液中的5％-22％的1M NaCl梯度，以0.5ml/min的流速经25分钟，将产物与污染的大肠杆菌蛋白质分离。

用反相HPLC层析评估发酵方法中的总单体Apo2L的表达：

用新鲜培养液或之前冰冻后融化的样本作总的制备的单体的定量。20μl样本与480μl6M盐酸胍，pH9.0和100mM DTT混合，并可在于13,000rpm离心15mins之前在室温温育1小时来回收提取物。在将20μl上样到HPLC柱(PerSeptive Biosystems POROSR1/10介质)来进行反相层析之前，将此提取物通过旋转-滤器过滤。在80℃进行HPLC分离，流动相以1.0ml/min流动，并用0.1％TFA中28％到35％的乙腈梯度在20分钟中将Apo2L与污染蛋白质分离。在280nm波长进行峰值检测。样本中单体的量用从相同方法分析的5-20μg纯化标准品相关的峰下面积得到的平均反应率(mAU/μg)来计算。

结果：

图7显示在对于ΔglpT宿主(43F6)用最适的G3P进料速度时比产物滴度(specific product titer)(指图中μg/OD-ml的比滴度(specific titer))提高。所有的G3P-进料都比无进料对照的表现好。此实施例中，当大约8升培养物的进料速度从6增加到12mmole/小时的时候，比产物滴度提高，但当速度增加12mmole/小时以上到18mmole/小时的时候，比滴度降低。本领域技术人员可以基于产物、有机磷酸酯种类等容易地确定G3P的最适进料速度。在这些具体条件下，在10升发酵罐中培养细胞来制备此具体产物Apo2L，每大约8-10升，G3P的优选进料速度在优选大约4-17mmole/小时，更优选大约6-16mmole/小时，更优选大约8-15mmole/小时，并最优选大约10-14mmole/小时的范围。

图8显示向野生型glpT宿主(43E7)进料G3P比进料无机磷酸酯(盐)的比产物滴度(指图中以μg/OD-ml表示的比总累积(specific total accumulation))提高。与无进料对照相比，进料甘油磷酸增加了Apo2L的比总累积，进料无机磷酸酯(盐)消极地(negatively)影响了比总累积。降低甘油磷酸进料，预期也产生类似的趋势。该结果显示，通过向野生型glpT宿主进料甘油磷酸可获得高水平表达。并且，在该具体试验中，与无机磷酸酯(盐)进料的情况类似，在进料甘油磷酸时培养细胞密度增加到OD550 200以上，而无进料甘油磷酸时，培养细胞密度不增加。

实施例4

在活动生长期中由AP启动子驱动的Apo2L产物的表达

与实施例3所述相同构建质粒、制备宿主菌株、设置培养基组分、实施发酵方法和产物分析，只是磷酸酯(盐)分批和G3P添加不同。在对照方法的盐分批进料中包括的无机磷酸盐部分由等摩尔量的G3P替代，所述G3P或者在接种后立即加入或者在分批进料的无机磷酸酯(盐)耗尽前几小时加入。在这些实施例中，预期加入的G3P是作为大部分加入后细胞生长的磷酸酯(盐)来源。

在活动生长期中制备Apo2L的发酵方法：

接种物制备方案与实施例3所描述的相同。在表1给出的制备培养基(除了从初始的分批进料中去除75％或50％的磷酸酯(盐)、并在接种后用等摩尔量的G3P替代作为分批添加物)中制备Apo2L。每个标准方案中在大约30℃(28-32℃)进行发酵，并将pH控制在大约7.0(6.5-7.5)。通气速率和搅拌速率如实施例3所述。对于用G3P替代50％无机磷酸酯(盐)的情况，在培养基灭菌前将无机磷酸酯(盐)分批进料，并在预计分批的磷酸酯(盐)耗尽前大约1-2小时(OD₅₅₀为大约30-40)用3-磷酸-甘油来替代。对于用G3P替代75％无机磷酸酯(盐)的情况，在接种发酵罐后立即加入无机磷酸酯(盐)和G3P。在整个发酵过程中，基于计算机的计算，向细胞培养物进料葡萄糖作为主要碳源，同时确保需氧条件。在发酵过程中如前面的部分所述加入Zn。发酵进行大约34-45小时。

结果：

图9显示对于野生型和glpT-突变宿主，当加入G3P来替代50％-75％的PO₄分批进料时，在活动生长期中明显地较早出现对异源蛋白质表达的诱导，比总累积曲线相对于用无G3P替代的野生型宿主进行的一式两份对照向左偏移。这表明本发明的优点在于可在发酵过程中较早获得产物。

本文试验的所有Pi与G3P的比率对于无论何种宿主都可实现此优点，表2显示对于glpT-突变宿主43F6使用Pi比G3P的1∶1或1∶3的比率，会产生最高容积的Apo2L产率(平均值大约为0.34mg/ml-hr，对照宿主的平均值大约为0.24mg/ml-hr)。并且，使用任一比率和野生型或突变型的宿主较早(22-26小时相比28-30小时)实现峰值比累积(peak specificaccumulation)(μg/OD-ml)。这显示在某些优选实施方案中，本发明在比其它短大约10％到25％的发酵时间内，可得到相等的(如果不是更高的)单体Apo2L的量，来显著提高方法的产率。

表2

在发酵的最初30小时通过加入磷酸甘油替代初始分批进料无机磷酸盐 的效果

试验	容量产率(mg/ml-hr)	达到比累积(Accum.)峰值的时间(ug/OD-ml)	峰值总单体Apo2L产量(g/L)
				对照(43E7)对照(43E7)Pi/G3P@1∶1(43F6)(50％替代)Pi/G3P@1∶1(43E7)(50％替代)Pi/G3P@1∶3(43F6)(75％替代)	0.270.210.340.250.34	283022.52226.0	2.92.83.32.03.0

实施例5

用α-和β-磷酸甘油的50/50混合物进行由AP启动子驱动的Apo2L产物 的表达

进行与实施例3所述类似的方法，除了用等级较低的α-和β-磷酸甘油的约50∶50的混合物而不是G3P作为使用菌株61G1(glpT突变宿主)的进料。

结果

图10显示用所述混合物或等级较高的G3P材料都会类似地获得比无进料对照提高的产量。应用α/β混合物会降低原材料的花费而不影响制备结果。

Claims (31)

1.相对于大肠杆菌异源的多肽的制备方法，其包含(a)在培养基中培养包含编码所述多肽的核酸的大肠杆菌细胞，同时向所述培养基进料可转运的有机磷酸酯，从而表达所述核酸，和(b)从所述细胞回收所述多肽。

2.权利要求1的方法1，其中所述有机磷酸酯是磷酸甘油。

3.权利要求2的方法，其中所述磷酸甘油是α-磷酸甘油或β-磷酸甘油或其混合物。

4.权利要求3的方法，其中所述磷酸甘油是2-磷酸-甘油和3-磷酸-甘油的混合物或是3-磷酸-甘油。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述培养在摇瓶或发酵罐中进行。

6.权利要求1-5任一项的方法，其中所述多肽从细胞的细胞质、周质或培养基中回收。

7.权利要求1-6任一项的方法，其中所述核酸的表达受可诱导型启动子的调控。

8.权利要求7的方法，其中所述可诱导型启动子是碱性磷酸酶启动子。

9.权利要求7的方法，其中所述可诱导型启动子是tac启动子。

10.权利要求7的方法，其中所述可诱导型启动子是T7启动子。

11.权利要求7-10任一项的方法，其中所述核酸的表达在处于培养步骤的活动生长期时开始。

12.权利要求1-11任一项的方法，其中所述大肠杆菌是染色体phoA缺陷型的。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中所述大肠杆菌是染色体glpT野生型的。

14.权利要求1-12任一项的方法，其中所述大肠杆菌是染色体glpT缺陷型的。

15.权利要求1-12或14任一项的方法，其中所述大肠杆菌是染色体phoA和glpT缺陷型的。

16.权利要求15的方法，其中所述大肠杆菌不是染色体ugp缺陷型的。

17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述多肽是真核生物多肽。

18.权利要求1-17任一项的方法，其中所述多肽是哺乳动物多肽。

19.权利要求1-18任一项的方法，其中所述多肽是是胰岛素样生长因子-1。

20.权利要求19的方法，其中有机磷酸酯的进料速度为每大约8-10升大约1-7mmoles/小时，并且在10升发酵罐中进行培养。

21.权利要求20的方法，其中有机磷酸酯的进料速度为每大约8-10升大约2-6mmoles/小时。

22.权利要求21的方法，其中有机磷酸酯的进料速度为每大约8-10升大约3-4mmoles/小时。

23.权利要求1-18任一项的方法，其中所述多肽为Apo2L。

24.权利要求23的方法，其中有机磷酸酯的进料速度为每大约8-10升大约4到17mmoles/小时，并且在10升发酵罐中进行培养。

25.权利要求24的方法，其中进料速度为每大约8-10升大约6-16mmole/小时。

26.权利要求25的方法，其中进料速度为每大约8-10升大约8-15mmole/小时。

27.权利要求26的方法，其中进料速度为每大约8-10升大约10-14mmole/小时。

28.权利要求1-27任一项的方法，其中在培养步骤中也存在无机磷酸酯(盐)。

29.权利要求28的方法，其中无机磷酸酯(盐)与有机磷酸酯的比率从大约1∶10到1∶0.25。

30.权利要求29的方法，其中所述多肽是Apo2L并且所述比率是大约1∶3到1∶0.5。

31.权利要求30的方法，其中所述比率是大约1∶1。

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