KR101210083B1

KR101210083B1 - 폴리펩티드의 생산 방법

Info

Publication number: KR101210083B1
Application number: KR1020067018372A
Authority: KR
Inventors: 수잔 륭 운-람; 제임스 알. 스와르쯔
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2004-03-11
Filing date: 2006-09-08
Publication date: 2012-12-07
Also published as: JP5014116B2; EP1733037A2; US7294483B2; CN1954074B; US8389242B2; CA2946323A1; PL1733037T3; PT1733037E; ME02058B; AU2005222397A1; WO2005087802A3; HRP20150077T1; CA2558911A1; JP2007537725A; KR20070029144A; DK1733037T3; CA2558911C; RS53774B1; BRPI0507233B8; ZA200606913B

Abstract

수송가능한 유기 인산염이 공급되는 배양 배지에서 이. 콜라이에 대해 이종인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 이. 콜라이 세포를 배양하여 상기 핵산이 발현되도록 하는 것을 포함하여, 이. 콜라이에 대해 이종인 폴리펩티드를 생산하는 방법이 기재되어 있다. 이어서, 상기 폴리펩티드를 세포로부터 회수한다.

유기 인산염, 글리세롤-3-포스페이트, 이. 콜라이, 이종 폴리펩티드

Description

폴리펩티드의 생산 방법 {Process for Producing Polypeptides}

관련 출원

본 출원은 2004년 3월 11일자로 출원된 미국 가출원 제60/552,678호에 대한 우선권을 청구하고 있는데, 이러한 미국 가출원에 대한 본 출원은 35 U.S.C. §119 하에 우선권을 청구하고 있고, 그 전문이 본원에 참조로 도입된다.

본 발명은 이. 콜라이 (E. coli)에 대해 이종인 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 상기 폴리펩티드의 수율을 개선시키기 위해 유기 인산염을 사용하는 것에 관한 것이다.

널리 이용되고 있는 분자 생물학의 도움을 받고 있고 미생물의 유전자 조작에 있어 비교적 용이한 에스케리챠 콜라이 (Escherichia coli)에 의해 이종 단백질을 발현하는 것은 학계와 산업계 모두에 있어 매우 생산적이었다. 전형적으로, 이종 단백질 발현 조절을 위해 유도성 프로모터 (예를 들어, 알칼리성 포스파타제 프로모터, tac 프로모터, 아라비노스 프로모터 등)이 이용된다. 유도 사건을 필수 요건으로 함으로써, 연구가는 표적 단백질의 발현 시기를 관리할 수 있는 기회를 얻게된다. 이러한 능력은 고 농도에서는 숙주에 의해 널리 관용되지 않는 이종 단 백질의 경우에 특히 중요하다. 발현을 유도시키기에 앞서 요망하는 세포 밀도를 달성함으로써, 목적하는 단백질의 체적 수율을 최대화시킬 수 있다.

미생물에 필수 영양분이 고갈되면 세포는 성장을 멈춘다. 이러한 제한 성분은 탄소, 질소, 인산염, 산소, 또는 세포에 의해 요구되는 어떠한 요소들일 수 있다. 이러한 조건 하에서는 세포가 성장기로부터 빠져나온다. 영양분 제한에 의해 야기된 스트레스 반응이 지속되는 것을 경감시키기 위한 한 가지 방식은 결핍된 성분을 공급하는 것이다. 공급-배치식 발효 공정 내로 도입되는 통상적인 공급물에는 글루코스, 아미노산, 산소 등이 포함된다.

세포성 인 (P)의 경우에는, P가 탄소, 산소, 질소 및 수소 다음으로 세포에 가장 풍부한 5번째 요소라고 가정하면, 인산염이 반드시 공급되어야 하는 것은 놀라운 일도 아니다 [참고: Slanier, Adelberg and Ingraham, The Microbial World, 4^th ed. (Prentice Hall, NJ 1976), p. 1357]. 인은 핵산, 지질당류 및 막 지질과 같은 수 많은 거대분자에 있어 필수 성분이다. 더우기, 고-에너지 인-무수물 결합에 있어서의 그의 역할로 인해, 에너지 대사에 있어서도 인이 특히 중요해진다. 이. 콜라이는 주요 P 공급원으로서 무기 인산염 (Pi), 유기 인산염 또는 포스포네이트를 활용할 수 있다. 환경으로부터 Pi를 흡수하는 것은 2개의 수송인자 시스템, 즉 Pit 시스템과 Pst 시스템을 통하여 달성할 수 있다. 유기 인산염의 경우에는, 대부분이 수송가능하지 않고, 방출된 Pi가 Pi 수송 시스템(들)에 의해 흡수될 수 있기 전에 먼저 주변세포질 (periplasm)에서 효소적으로 가수분해될 필요가 있 다. 단지 소수의 유기 인산염 만이 수송가능하고, 글리세롤-3-포스페이트 (G3P)가 이러한 예 중의 하나이다. G3P와 글리세로포스페이트-1-포스페이트 (G1P)는 알파-글리세로포스페이트로서 공지되어 있다. Pi-제한과 탄소-제한에 반응하여, 이. 콜라이는 외부 환경으로부터 이용 가능한 본래의 G3P를 흡수하여 세포내 구획 내로 전달할 수 있는데, 여기서 G3P는 대사되어 필요로 하는 인산염 또는 탄소를 산출한다 [참고: Wanner, "Phosphorus Assimulation and Control of the Phosphate Regulon", in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Neidhardt, ed., (second edition), American Society for Microbiology Press (1996), pp. 1357-1365].

G3P에 대한 추가의 참고 문헌은 다음과 같다: 문헌 [참고: Silhavy et al., J. Bacteriol, 126: 951-958 (1976)]에는 이. 콜라이의 sn-글리세롤-3-포스페이트 수송 시스템과 관련된 주변세포질 단백질에 관해 기재되어 있고; 문헌 [참고: Argast et al., J. Bacteriol., 136: 1070-1083 (1978)]에는 이. 콜라이에서 sn-글리세롤-3-포스페이트에 대한 제2 수송 시스템에 관해 기재되어 있으며; 문헌 [참고: Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985)]에는 glpT-의존성 G3P 수송 시스템에 의해 매개된 Pi 교환에 관해 기재되어 있고; 문헌 [참고: Rao et al., J. Bacteriol., 175: 74-79 (1993)]에는 이. 콜라이에서 phoA 유전자의 발현에 대한 glpT 및 glpD 돌연변이물의 효과에 관해 기재되어 있으며; 문헌 [참고: Elashvili et al., Appl. Environ. Microbiol., 64: 2601-2608 (1998)]에는 이. 콜라이 K-12에서 유기 인산염의 활용을 증강시키는 phnE 및 glpT 유전자에 관해 기재 되어 있다. 추가로, 문헌 [참고: Vergeles et al., Eur. J. Biochem., 233: 442-447 (1995)]에는 베타-글리세로포스페이트로서 공지되기도 하는 글리세롤-2-포스페이트 (G2P)와, 사독 (snake venom) 포스포디에스테라제 에스테르화 반응에서 뉴클레오티딜 수용체로서 공지되기도 하는 G3P의 고 효율이 기재되어 있다.

이. 콜라이에서 외인성 G3P 흡수를 위한 2가지 수송 시스템, 즉 Ugp 및 GlpT 수송 시스템에 관한 현재의 지식 수준은 참고 문헌 13 및 81을 참고로 하여 다음 책에 잘 요약되어 있다 [참고: Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology edited by Neidhardt et. al. (second edition), supra, pp. 1364]. Ugp 오페론 (operon)은 pho 레굴론 (regulon)에 속한다. 이는 인산염 제한에 의해 유도되고, phoB 단백질에 의해 양성적으로 조절된다. Ugp 시스템은 주변세포질 결합성 단백질-의존성 다중-성분 수송 시스템인데, ugpB는 주변세포질 결합성 단백질을 암호화하고, ugpA 및 ugpC는 완전한 막 채널 단백질을 암호화하며, ugpC는 ATP아제를 암호화한다. GlpT는 글리세롤, G3P 및 글리세롤 포스포릴 포스포디에스테르의 흡수와 대사를 매개하는 glp 시스템의 일부이다 [참고: Lin et al., Annu. Rev. Microbiol., 30: 535-578 (1976); Chapter 20; pg 307-342 Dissimilatory Pathways for sugars, polyols and carboxylates. Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology, second edition]. 이러한 수송 시스템은 외부 G3P와의 교환에 의해 세포질로부터의 Pi의 유출을 매개하는 것으로 공지되어 있는 음이온 교환체이다. G3P 상에서 성장하는 야생형 균주에서는, Ugp 시스템을 통하여 G3P를 흡수하는 세포에 의해서는 Pi가 거의 방출되지 하지만, G3P 가 GlpT 시스템을 통하여 흡수되는 경우에는 Pi가 주변세포질 내로 방출될 수 있다. pho 레굴론 활성인 glpT-퍼메아제-매개된 유출 결과로서 억제량의 Pi가 방출되는 경우에는, 이에 포함된 Ugp 시스템이 차단될 것이다. 특정 상황 하에서는, 외부 G3P와의 교환에 의해 세포로부터 Pi를 배출시키기 위한 유일한 경로가 GlpT이다 [참고: Elvin et al., J. Bacteriol., 161: 1054-1058 (1985); Rosenberg, "Phosphate transport in prokaryotes," p. 205-248. In B. P. Rosen and S. Silver (ed.), Ion Transport in Prokaryotes (Academic Press, Inc., New York, 1987)].

G3P를 수송할 수 있는 Ugp 시스템과 GlpT 시스템의 능력을 비교할 경우, 두 시스템의 최대 속도는 유사하다. G3P에 대한 겉보기 친화도는 GlpT 시스템을 이용한 경우 보다 Ugp 시스템을 이용한 경우에 더 높다. 마찬가지로, 양 시스템은 성장 배지에서 이용 가능한 경우에는 세포 성장을 위해 충분한 G3P를 공급할 수 있을 것이다. 그러나, Ugp 시스템을 통해서만 수송된 G3P는 단지 인산염의 유일한 공급원으로서만 제공되며, 탄소원으로서는 제공되지 않는 반면, GlpT-수송된 G3P는 인산염과 탄소 둘 다에 대한 단독 공급원으로서 제공될 수 있다 [참고: Schweizer et al., J Bacteriol., 150: 1154-1163 (1982)]. pho-레굴론-의존성 G3P 수송 시스템을 암호화하는 2개의 ugp 유전자가 지도화되었고 [참고: Schweizer et al., J. Bacteriol., 150: 1164-1171 (1982)], 이들 유전자를 함유하는 ugp 영역이 성상 확인되었으며 [참고: Schweizer et al., Mol. and Gen. Genetics, 197: 161-168 (1984)], ugp 오페론의 조절에 관한 연구가 수행되었다 [참고: Schweizer et al., J. Bacteriol., 163: 392-394 (1985); Kasahara et al., J. Bacteriol., 173: 549-558 (1991); Su et al., Molecular & General Genetics, 230: 28-32 (1991); Brzoska et al.," ugp-dependent transport system for sn-glycerol 3-phosphate of Escherichia coli," p. 170-177 in A. Torriani-Gorini, F. G. Rothman, S. Silver, A. Wright, and E. Yagil (ed.), Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms (American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1987); Brzoska et al., J. Bacteriol., 176: 15-20 (1994); and Xavier et al., J. Bacteriol., 177: 699-704 (1995)].

야생형 균주에서는, G3P의 안정한 세포내 풀이 존재하고, 이는 대략 200 μM로 유지된다. 내부적으로, G3P는 단독 탄소원으로서 글리세롤 상에서 성장시킨 경우에 글리세롤 키나제 (glpK에 의해 암호화됨)에 의해 글리세롤을 G3P로 효소적으로 전환시킴으로써 합성할 수 있거나, 또는 글리세롤 이외의 탄소원 상에서 성장하는 동안 gpsA 유전자의 유전자 생성물인 G3P 신타제에 의해 당분해 중간체인 디히드록시아세톤 포스페이트를 환원시킴으로써 합성할 수 있다. G3P는 모든 인지질 분자의 스캐폴드 (scaffold)를 형성하는 중요한 중간체이기 때문에, 인지질과 트리아실글리세롤의 붕괴로부터 내부 글리세롤 포스페이트가 생성될 수도 있다. 대사물로서 내부 G3P를 인지질 생합성 경로에 전달할 수 있거나, 또는 G3P 데히드로게나제에 의해 산화시켜 디히드록시아세톤 포스페이트를 형성시키고, 이를 당분해 경로에 공급할 수 있다.

이. 콜라이에서 이종 단백질 발현을 조절하기 위해 AP 프로모터를 이용하는 상황 하에서는, 배지로부터 Pi가 고갈된 후에만 유도 사건이 발생하기 때문에, AP 프로모터 활성을 위해 유도된 세포에는 전형적으로 인산염이 결핍되어 있고 건강 상태가 급속히 나빠진다. 이들 세포는 세포 기능에 필요한 인산염을 찾아 다녀야할 것 같다. 이와 같이 인산염을 찾아 다닌 결과, 리보솜이 교체되고, 세포 에네르기(학)가 보다 낮아지며, 프로테아제 발현과 단백질 분해가 증가될 수도 있는데 [참고: St. John and Goldberg, J. Bacteriol., 143: 1223-1233 (1980)], 이로 인해 잠재적으로는 단백질 축적 능력이 저하된 덜 건강한 세포가 유발된다.

이. 콜라이의 대사 상태를 개선시킴으로써 생각할 수 있는 바로는, 단백질을 합성할 수 있는 세포의 능력이 증가될 수 있다는 것이다. 인산염이 느리게 공급된다면, 세포는 주변세포질에서 낮은 Pi 농도 만을 감지할 수 있기 때문에, P 원자가 세포내적으로 고갈되지 않고서도 pho 레굴론을 유도시킬 수 있다 [참고: 미국 특허 제5,304,472호]. 이. 콜라이에서 이종 폴리펩티드를 생성시키기 위한 추가의 방법을 제공할 필요가 있다.

발명의 요약

본 발명에서는, 이. 콜라이에서 이종 폴리펩티드의 발현을 개선시키기 위한 방법이 제공된다. 알파-글리세로포스페이트와 같은 수송가능한 유기 인산염을 각종 이. 콜라이 숙주 [이에는 야생형 glpT 유전자를 수반한 것과 수반하지 않은 것, 및 야생형 phoA 유전자를 수반한 것과 수반하지 않은 것, 예를 들어 (ugp+ △glpT phoA-) 이. 콜라이가 포함된다]에 공급하는 것이 진탕-플라스크 규모와 10-L용 발효기 규모 둘 다에서 이종 단백질의 발현을 개선시키는 것으로 밝혀졌고, 10,000 L 와 같은 보다 큰 규모에서도 유사하게 수행되는 것으로 예상된다. 이종 단백질의 발현을 위해 유도성 프로모터, 예를 들어, tac, T7 또는 AP 프로모터를 포함한 각종 프로모터를 이용한 다중 모델 시스템을 통하여 생성물 수율 이점이 관찰되었다. 추가의 이점은 생성물을 활성 성장기에서 보다 초기에, 즉 보다 짧은 시간 내에 수득할 수 있다는 것이다. 특정 양태에서는, 활성 성장기에서 보다 초기에 보다 많은 양의 생성물을 수득하여 생산성을 상당히 향상시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 청구되는 바와 같다. 한 국면에서 본 발명은 (a) 수송가능한 유기 인산염이 공급되는 배양 배지에서 이. 콜라이에 대해 이종인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 이. 콜라이 세포를 배양하여 상기 핵산이 발현되도록 하는 단계; 및 (b) 상기 폴리펩티드를 상기 세포로부터 회수하는 단계를 포함하여, 이. 콜라이에 대해 이종인 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서는, 유기 인산염이 글리세로포스페이트이고, 보다 바람직하게는 알파-글리세로포스페이트 및(또는) 베타-글리세로포스페이트, 보다 더 바람직하게는 글리세롤-2-포스페이트와 글리세롤-3-포스페이트의 혼합물, 또는 글리세롤-3-포스페이트 단독이다. 또다른 바람직한 국면에서는, 배양 단계가 진탕 플라스크 또는 발효기, 바람직하게는 발효기에서 수행된다. 또다른 바람직한 국면에서는, 폴리펩티드를 세포의 세포질, 주변세포질 또는 배양 배지로부터 회수한다. 핵산의 발현이 유도성 프로모터, 예를 들어 알칼리성 포스파타제 프로모터, tac 프로모터 또는 T7 프로모터에 의해 조절되는 것이 또한 바람직하고, 핵산의 발현이 배양 단계의 활성 성장기 동안에 시작하는 것이 바람직하다. 한 양태에서는, 이. 콜라이가 야생형이 다. 또다른 양태에서는, 이. 콜라이에 염색체성 glpT 및 염색체성 phoA가 결여되었지만, 염색체성 ugp는 결여되지 않은 것이 바람직하다. 바람직하게는, 무기 인산염도 배양 단계 동안에 존재한다.

특정 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에서는 수송가능한 유기 인산염 화합물을 세포에 공급하여 인산염 공급물이 Pho 시스템의 pstB에 의해 감지되지 않도록 하지만, 세포질 내에서의 붕괴시 여전히 인산염을 제공할 것으로 여겨지며; 추가로 수송가능한 유기 인산염, 예를 들어 G3P를 공급하는 것은 잠재적으로, 중요한 대사 경로 내로 용이하게 공급될 수 있는 활용 가능한 대사 중간체를 해당 세포에 보강시켜 줄 것으로 여겨진다.

도 1은 저-인산염 (CRAP) 또는 고-인산염 (THCD) 배지에서 보충물로서 물 또는 200 mM G3P를 활용하여, 진탕 플라스크 배양물에서 tac 프로모터를 이용한 BL21 이. 콜라이 숙주에서 분비된 엘라마 (Llama) 항체 단편의 발현을 도시한 것이다.

도 2는 CRAP 배지에서 보충물로서 물 또는 200 mM G3P를 활용하여, 진탕 플라스크 배양물에서 T7 프로모터를 이용한 HMS174 이. 콜라이 숙주에서 세포질성 Apo2L의 발현을 도시한 것이다.

도 3은 시간에 따른, 분비된 IGF-1 축적에 대한 발효 동안의 G3P의 공급 효과를 도시한 것이다. 이는 야생형 이. 콜라이 숙주, AP 프로모터 및 지속적으로 공급된 글루코스를 이용한다.

도 4는 시간에 따른, 분비된 IGF-1 축적에 대한 발효 동안의 glpT 돌연변이 와 G3P 공급의 효과를 도시한 것이다. 이는 △glpT 이. 콜라이 숙주, AP 프로모터 및 다양한 G3P 공급 속도를 이용한다.

도 5는 pAPApo2-P2RU에 대한 플라스미드 다이아그램을 도시한 것이다.

도 6은 인간 Apo-2 리간드 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1) 및 그의 유래된 아미노산 서열 (서열 2)을 도시한 것이다. 뉴클레오티드 위치 447 (서열 1 중)에서의 "N"은 뉴클레오티드 염기가 "T" 또는 "G"일 수 있다는 것을 지시하기 위해 사용된 것이다.

도 7은 △glpT 이. 콜라이 (43F6) 숙주에서 Apo2L의 특이적 축적에 대한 G3P 공급 효과를 도시한 것인데, 3가지 상이한 공급 속도와, G3P가 공급되지 않은 대조군이 이용되었다.

도 8은 Apo2L의 특이적 총 축적치에 대한, 야생형 glpT 숙주 (43E7)에 무기 인산염을 공급하는 것에 비해 글리세로포스페이트를 공급하는 것의 이점을 도시한 것인데, 여기서 세포 밀도는 200 OD550 이상으로 증가한다.

도 9는 Apo2L의 특이적 총 축적치에 대한, 야생형 glpT 이. 콜라이 숙주 (43E7) 및 △glpT 이. 콜라이 (43F6) 숙주에서 무기 인산염을 글리세로포스페이트로 대체시킨 것의 효과를 도시한 것이다.

도 10은 총 Apo2L 축적에 대한, △glpT 이. 콜라이 (61G1) 숙주에서 공급물을 부가하지 않은 대조군에 비해 공급물로서 알파-글리세로포스페이트를 알파-글리세로포스페이트와 베타-글리세로포스페이트의 50:50 혼합물로 대체시킨 효과를 도시한 것이다.

정의

본원에 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"는 일반적으로, 대략 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 지칭한다. "이종" 폴리펩티드는 활용되고 있는 숙주 세포에 대해 외래인 폴리펩티드, 예를 들면 이. 콜라이에 의해 생산된 인간 단백질이다. 상기 폴리펩티드가 원핵성 또는 진핵성일 수 있지만, 바람직하게는 진핵성, 보다 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간이다.

포유류 폴리펩티드의 예에는 분자, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬, 예를 들어 인간 성장 호르몬 또는 소의 성장 호르몬; 성장-호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선-자극 호르몬; 지단백질; 1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 트롬보포이에틴; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 (von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; ErbB2의 세포외 도메인 내의 특정 영역 (예를 들어, ErbB2의 대략 잔기 22에서부터 대략 잔기 584까지의 영역 내의 1개 이상의 잔기)과 결합하는, ErbB2 도메인(들)에 대한 항체, 예를 들어 2C4 (WO 01/00245; 하이브리도마 ATCC HB-12697); 엔케팔리나제; 뮐러의 억제성 물질; 렐락신 A-쇄; 렐락신 B-쇄; 프로렐락신; 마우스 고나도트로핀 (gonadotropin)-관련 펩티드; 미생물성 단백질, 예를 들어 베타-락타마제; DN아제; 인히빈 (inhibin); 악티빈 (activin); 혈관성 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린 (integrin); 단백질 A 또는 D; 류마티스양 인자; 향신경성 인자, 예를 들어 뇌-유래 향신경성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6) 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF; 카디오트로핀 (심장 비대증 인자), 예를 들어 카디오트로핀-1 (CT-1); 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF; 표피 성장 인자 (EGF); 전환 성장 인자 (TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타 (TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 또는 TGF-5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I); 인슐린-유사 성장 인자 결합성 단백질; CD 단백질, 예를 들어 CD-3, CD-4, CD-8, 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도성 인자; 면역독소; 골 형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 소 혈청 알부민 (BSA); 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터루킨 (ILs), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10; 항-HER-2 항체; Apo2 리간드 (Apo2L); 슈퍼옥사이드 디스무타제; T-세포 수용체; 표면-막 단백질; 붕괴-가속 인자; 바이러스성 항원, 예를 들어 AIDS 외피의 일부; 수송 단백질; 귀소 (homing) 수용체; 아드레신; 조절성 단백질; 항체; 및 상기-열거된 폴리펩티드의 단편이 포함된다.

관심있는 바람직한 폴리펩티드에는 HSA, BSA, 항-IgE, 항-CD20, 항-IgG, t-PA, gpl20, 항-CDlla, 항-CD18, 2C4, 항-VEGF, VEGF, TGF-베타, 악티빈, 인히빈, 항-HER-2, DN아제, IGF-I, IGF-II, 뇌 IGF-I, 성장 호르몬, 렐락신 쇄, 성장 호르몬 방출 인자, 인슐린 쇄 또는 프로-인슐린, 항체 및 항체 단편, NGF, NT-3, BDNF, Apo2L, 및 유로키나제와 같은 폴리펩티드가 포함된다. 가장 바람직한 폴리펩티드는 IGF-I 또는 Apo2L이다.

용어 "Apo2 리간드", "Apo2L" 및 "TRAIL"은 본원에서 상호 교환적으로, 도 6에 제시된 아미노산 서열 (서열 2)의 아미노산 잔기 114 내지 281, 잔기 95 내지 281, 잔기 92 내지 281, 잔기 91 내지 281, 잔기 41 내지 281, 잔기 15 내지 281 또는 잔기 1 내지 281을 포함하는 폴리펩티드 서열 뿐만 아니라 상기 서열의 생물학적 활성 단편, 및 결실, 삽입 또는 치환 변이체를 지칭하는데 사용된다. 한 양태에서는, 폴리펩티드 서열이 도 6 (서열 2)의 잔기 114 내지 281을 포함한다. 임의로, 폴리펩티드 서열은 도 6 (서열 2)의 잔기 92 내지 281 또는 잔기 91 내지 281을 포함한다. Apo2L 폴리펩티드는 도 6에 제시된 본래의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)에 의해 암호화될 수 있다. 임의로, 잔기 Proll9 (도 6; 서열 1)를 암호화하는 코돈은 "CCT" 또는 "CCG"일 수 있다. 또다른 바람직한 양태에서는, 상기 단편 또는 변이체가 생물학적으로 활성이고, 상기 서열 중의 어느 하나와 약 80％ 이상의 아미노산 서열 동일률, 보다 바람직하게는 약 90％ 이상의 서열 동일률, 보다 더 바람직하게는 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 이상의 서열 동일률을 나타낸다. 상기 정의에는 그의 본래의 아미노산 중의 적어도 하나가 알라닌 잔기에 의해 치환되는, Apo2 리간드의 치환 변이체가 포괄된다. 상기 정의에는 또한, Apo2 리간드로부터 분리되거나 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조된 본래 서열 Apo2 리간드가 포괄된다. 본 발명의 Apo2 리간드에는 WO 97/01633, WO 97/25428, 및 WO 01/00832에 기재된 TRAIL 또는 Apo2 리간드로서 지칭된 폴리펩티드가 포함된다. 용어 "Apo2 리간드" 및 "Apo2L"은 일반적으로, 해당 폴리펩티드의 단량체, 이량체 또는 삼량체 형태를 포함하는 Apo2 리간드 형태를 지칭하기 위해 사용된다. Apo2L 서열에서 지칭된 아미노산 잔기에 관한 모든 넘버링은 달리 구체적으로 지시되지 않는 한 도 6 (서열 2)에 따르는 넘버링을 사용한다. 예를 들어, "D203" 또는 "Asp203"은 도 6에 제공된 서열 (서열 2) 내의 위치 203에서의 아스파르트산 잔기를 지칭한다.

용어 "Apo2 리간드 세포외 도메인" 또는 "Apo2 리간드 ECD"는 본질적으로 막관통 도메인과 세포질성 도메인이 없는 Apo2 리간드 형태를 지칭한다. 통상적으로, ECD는 이러한 막관통 도메인과 세포질성 도메인을 1％ 미만 가질 것이고, 바람직하게는 이러한 도메인들을 0.5％ 미만 가질 것이다. "생물학적으로 활성인" 또는 "생물학적 활성"은 이것이 Apo2L와 관계되기 때문에, (a) 생체내 또는 생체 외에서 포유류 암 세포 또는 바이러스적으로 감염된 세포 중의 적어도 한 가지 유형에서의 세포소멸을 유도하거나 자극할 수 있는 능력을 지니고 있거나; (b) 항체를 생성시킬 수 있거나 (즉, 면역원성); (c) Apo2L에 대한 수용체와 결합할 수 있고/있거나 자극할 수 있거나; 또는 (d) 본래의 또는 천연 발생적 Apo2L 폴리펩티드의 활성을 유지하는 것으로 지칭된다.

표현 "제어 서열"은 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 암호화 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵 생물에 적합한 제어 서열에는 프로모터, 임의로 작동인자 서열, 및 리보솜-결합 부위가 포함된다.

핵산은 이것이 또다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓여있을 때 "작동적으로 연결된"다. 예를 들어, 프리-서열 또는 분비성 리더에 대한 DNA는 이것이 해당 폴리펩티드의 분비에 참여하는 프리-단백질로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동적으로 연결되어 있거나; 프로모터는 이것이 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 이러한 서열과 작동적으로 연결되어 있거나; 또는 리보섬-결합 부위는 이것이 해독을 촉진시키도록 위치 설정된 경우에 암호화 서열과 작동적으로 연결되어 있다. 일반적으로, "작동적으로 연결된"이란 연결되는 DNA 서열이 연속된 것이고, 분비성 리더인 경우에는 연속된 판독 기에 있다는 것을 의미한다. 편리한 제한 부위에서 연결시킴으로써 연결을 수행한다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 적응인자 또는 링커를 통상적인 실시에 따라서 사용할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고, 이러한 명칭 모두는 자손을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"에는 1차 대상 세포와, 전이 횟수에 상관없이 이로부터 유래된 배양물이 포함된다. 의도하였거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해, 모든 자손이 DNA 함량에 있어 정확하게 동일할 수는 없다는 것을 인지해야 한다. 최초로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝한 바와 동일한 기능적 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 포함된다. 별개의 명칭을 고려하는 경우에도, 이는 본문 내용으로부터 명백할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "유기 인산염"은 1개 이상의 탄소 원자를 함유하고, 할라이드 원자를 함유할 수도 있는 인산염 화합물을 지칭한다. 이러한 인산염 화합물은 세포 배양물에 공급되어 이에 의해 활용될 수 있어야만 한다. 이들 화합물은 종종 살충제로서 사용되기도 한다. "수송가능한" 유기 인산염은 세포의 외부 환경으로부터, 어떠한 방식으로든 미리-가수분해되지 않고서 세포 내로 수송될 수 있다. 유기 인산염을 이용한 경우에 이. 콜라이 균주가 잘 성장하지 않는 다면, 이러한 유기 인산염의 활용은 phnE 유전자 생성물을 이. 콜라이에서 과발현시킴으로써 증강시킬 수 있다. 이러한 유전자는 형질전환시 이. 콜라이 균주에게 자발적인 유기 인산염 활용 표현형을 부여해준다 [Elashvili et al., 상기 문헌 참고]. 적합한 유기 인산염의 예에는 알킬 할로포스페이트, 예를 들어 디이소프로필 플루오로포스페이트, 알킬 포스페이트, 예를 들어 디이소프로필 포스페이트 및 3,4-디히드록시부틸-1-포스페이트 뿐만 아니라 당- 또는 알칸올-함유 포스페이트, 예를 들어 헥소스-6-포스페이트 및 글리세롤-3-포스페이트가 포함된다. 글루코스-1-포스페이트, 헥소스-6-포스페이트 및 글리세로포스페이트, 예를 들어 글루코스-1-글리세로포스페이트, 프럭토스-6-글리세로포스페이트, 알파-글리세로포스페이트, 예를 들어 글리세롤-1-포스페이트 및 글리세롤-3-포스페이트, 및 베타-글리세로포스페이트 (글리세롤-2-포스페이트)가 바람직하고, 글리세로포스페이트가 보다 바람직하고, 알파- 및(또는) 베타-글리세로포스페이트가 보다 더 바람직하며, 글리세롤-2-포스페이트 및(또는) 글리세롤-3-포스페이트가 보다 더 바람직하고, 글리세롤-2-포스페이트와 글리세롤-3-포스페이트의 혼합물 또는 글리세롤-3-포스페이트가 본원에서 사용하기에 가장 특히 바람직하다. 본원에 사용된 바와 같이, 혼합물에서가 아닌 용어 "G3P" 또는 "G3P 단독"은 글리세롤-3-포스페이트를 약 80％ 이상 함유하는 조성물을 지칭하는데; 이는 불순물 (예: G2P)을 약 20％ 이하 함유할 수 있다. G3P와 G2P의 혼합물은 G3P를 약 80％ 미만 함유할 것이다.

무기 인산염은 탄소 원자를 전혀 함유하지 않는 인산염 화합물인데, 이러한 인산염은 전형적으로, 알칼리 또는 알칼리 토금속, 예를 들어 칼륨, 칼슘, 마그네슘 또는 나트륨 포스페이트와 연합되어 있다.

"활성 성장기"는 세포가 활성적으로 성장하고 있고, 정지 상에서와 같이 심각하게 영양분-제한되지 않은 세포를 배양하는 단계의 일정 기를 지칭한다.

본 발명을 수행하기 위한 방식

본 발명은 이. 콜라이에 대해 이종인 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 이. 콜라이 세포를, 배양 배지에 수송가능한 유기 인산염을 공급하면서 이러한 배양 배지에서 배양하여 상기 핵산이 발현되도록 한다. 그 다음, 폴리펩티드를 세포로부터 회수한다. 회수는 세포의 세포질, 주변세포질 또는 배양 배지로부터일 수 있다. 배양은 적합한 모든 용기, 예를 들어 진탕 플라스크 또는 발효기, 보다 바람직하게는 발효기에서 수행할 수 있다.

배양 파라미터를 사용하고, 폴리펩티드 생산은 통상적인 방식, 예를 들어 다음에 기재된 과정으로 수행할 수 있다.

A. 핵산 및 이의 변형물의 선별

관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산은 적합하게는, 이것이 관심있는 폴리펩티드(들)를 암호화한다면 어떠한 공급원으로부터의 RNA, cDNA 또는 게놈성 DNA이기도 하다. 이. 콜라이에서 이종 폴리펩티드 (그의 변이체 포함)를 발현하기 위해 적당한 핵산을 선별하는 방법은 널리 공지되어 있다.

모노클로날 항체를 생성하고자 하는 경우에는, 이러한 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA를 통상적인 과정 (예를 들어, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 이용하여 용이하게 분리 및 서열 분석한다. 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 하이브리도마 세포가 제공된다. 일단 분리하면, DNA를 발현 벡터 내에 놓아둔 다음, 본원의 세균성 숙주 세포 내로 형질전환시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 항체를 암호화하는 DNA를 세균에서 재조합 발현하는 것에 관한 문헌에는 다음이 포함된다 [참고: Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) and Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)].

비-인간 항체를 인간화하는 방법은 당해 분야에 보고된 바 있다. 바람직하게는, 인간화 항체가 비-인간 공급원으로부터 도입된 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖고 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종, "유입 (import)" 잔기로서 지칭되는데, 이는 전형적으로 "유입" 가변 도메인으로부터 취한 것이다. 인간화 과정은 본질적으로, 인간 항체의 상응하는 서열을 초가변 영역 서열로 대체함으로써, 윈터 (Winter) 등의 방법에 따라서 수행할 수 있다 [참고: Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)]. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호 참고)인데, 여기서는 본래의 인간 가변 도메인보다 실질적으로 덜한 서열이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열로 대체되었다. 실제적으로, 인간화 항체는 전형적으로, 몇몇 초가변 영역 잔기와 가능하게는 몇몇 FR 잔기가 설치류 항체에서의 유사한 부위로부터의 잔기로 대체된 인간 항체이다.

인간화 항체를 제조하는데 있어 사용될 인간 가변 도메인 (경쇄와 중쇄 둘 다)을 선택하는 것은 항원성을 저하시키는데 있어 극히 중요하다. 소위 "최량적합 (best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대항하여 스크리닝한다. 그 다음, 설치류 서열과 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 골격 영역 (FR)으로서 허용한다 [참고: Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)]. 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 아군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정한 골격 영역을 이용한다. 몇 가지 상이한 인간화 항체에 대해 동일한 골격을 사용할 수도 있다 [참고: Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol, 151: 2623 (1993)].

항원에 대한 높은 친화성을 보유하고 있고 기타 바람직한 생물학적 특성을 지니도록 항체를 인간화시키는 것이 추가로 중요하다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라서 인간화 항체를, 모 서열과 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모 서열과 각종 개념적 인간화 생성물을 분석하는 공정에 의해 제조한다. 3차원적 면역글로불린 모델은 통상적으로 입수 가능하고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 추정 가능한 3차원적 입체 형태적 구조를 예시하고 표시해주는 컴퓨터 프로그램이 입수 가능하다. 이러한 표시물을 검사함으로써, 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서의 해당 잔기들의 가능한 역할을 분석할 수 있는데, 즉 그의 항원과 결합할 수 있는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, 수용자 및 유입 서열로부터의 FR 잔기를 선별하고 합하여, 목적하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성 증가가 달성되도록 할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기는 항원 결합성에 영향을 미치는데 있어 직접적이고도 가장 실질적으로 관여한다.

각종 형태의 인간화 항체 또는 친화성-성숙된 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화 항체 또는 친화성-성숙된 항체는 면역접합체를 생성시키기 위해 한 가지 이상의 표적화제(들)와 임의로 접합되는 항체 단편, 예를 들어 Fab일 수 있다. 또다른 한편, 인간화 항체 또는 친화성-성숙된 항체는 본래의 항체, 예를 들어 본래의 IgGl 항체일 수 있다.

Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접적으로 회수하고 화학적으로 커플링시켜 F(ab')₂ 단편을 형성시킬 수 있다 [참고: Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)]. 또다른 접근법에 따르면, 재조합 숙주 세포 배양물로부터 F(ab')₂ 단편을 직접 분리할 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 기타 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 기타 양태에서는, 선택되는 항체가 단일-쇄 Fv 단편 (scFv) [참고: WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호]이다. 항체 단편은, 예를 들어 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일-특이적 또는 이중-특이적일 수 있다.

이중-특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 지닌 항체이다. 예시되는 이중-특이적 항체는 동일한 단백질의 2개의 상이한 에피토프와 결합할 수 있다. 이중-특이적 항체는 완전한 길이의 항체로서 또는 항체 단편 [예: F(ab')₂ 이중-특이적 항체]로서 제조할 수 있다. 이들은 각종 항체 쇄의 융합물로서 존재할 수 있거나 또는 1개의 쇄일 수 있다. 1개의 중쇄는 그것만으로도 적격할 수 있다.

이중-특이적 항체를 생성하기 위한 한 가지 접근법에서는, 경쇄 결합 부위가 결여된 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열과 융합된 제1의 결합 도메인을 포함하는 제1 융합물; 경쇄 결합 부위를 보유하고 있는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인 서열과 융합된 제2의 결합 도메인을 포함하는 제2 융합물; 및 면역글로불린 경쇄를 각각 암호화하는 DNA 서열을 숙주 세포 내로 도입함으로써, 이중-특이적 면역부착인자를 제조한다. 이어서, 이러한 DNA 서열이 발현되도록 숙주 세포를 배양하여 (i) 제2 융합물-면역글로불린 경쇄 쌍과 공유적으로 연결된 제1 융합물을 포함하는 이종-삼량체 (heterotrimer); (ii) 2개의 공유적으로 연결된 제2 융합물-면역글로불린 경쇄 쌍을 포함하는 이종-사량체; 및 (iii) 2개의 공유적으로 연결된 제1 융합물 분자를 포함하는 동종-이량체의 혼합물을 생성시킨다. 이러한 생성물의 혼합물을 세포 배양물로부터 꺼내고, 이종-삼량체를 기타 생성물로부터 분리한다. 이러한 접근법은 문헌 [참고: WO 94/04690]에 기재되어 있다. 이중-특이적 항체를 생성하기 위한 추가의 상세 내역은, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다 [참고: Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986)].

미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또다른 접근법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 간의 계면을 공학적으로 처리하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종-이량체의 비율을 최대화시킬 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체시킨다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예: 알라닌 또는 트레오닌)로 대체시킴으로써, 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 대상성 "공동"이 창출된다. 이는 기타 불필요한 최종 생성물 (예: 동종-이량체)에 비해 이종-이량체의 수율을 증가시키는 기전을 제공해준다.

이중-특이적 항체에는 가교 결합된 항체 또는 "이종-접합체" 항체가 포함된다. 예를 들어, 이종-접합체 내의 항체들 중의 하나가 아비딘과 커플링될 수 있고, 다른 하나는 바이오틴과 커플링될 수 있다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포가 불필요한 세포를 표적화하도록 하고 [참고: 미국 특허 제4,676,980호], HIV 감염증을 치료하는 것으로 제안되었다 [참고: WO 91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089]. 이종-접합체 항체는 편리한 모든 가교 결합 방법을 사용하여 만들 수 있다. 적합한 가교 결합제는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 수 많은 가교 결합 기술과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

항체 단편으로부터 이중-특이적 항체를 생성시키는 기술 또한, 당해 분야의 문헌에 기재되었다. 예를 들어, 이중-특이적 항체는 화학적 연쇄를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [참고: Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)]에는 본래의 항체를 단백질 분해적으로 절단시켜 F(ab')₂ 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편은 디티올 착화제 아비산나트륨의 존재 하에 환원시켜 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지시킨다. 그 다음, 이로써 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중의 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중-특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중-특이적 항체를 효소의 선별적 고정화를 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

부가적으로, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하고 화학적으로 커플링시켜 이중-특이적 항체를 형성시킬 수 있다 [참고: Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)].

재조합 세포 배양물로부터 이중-특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 분리시키기 위한 각종 기술이 또한 보고되었다. 예를 들어, 루이신 지퍼 (zipper)를 이용하여 이중-특이적 항체를 생성하였다 [참고: Kostelny et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터의 루이신 지퍼 단백질을 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시킨다. 항체 동종-이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 이종-이량체를 형성시킨다. 이러한 방법은 또한, 항체 동종-이량체를 생성시키는데 활용할 수 있다. 문헌 [참고: Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아보디 (diabody)" 기술은 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기전을 제공하였다. 이러한 단편은 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개의 도메인들 간에 쌍을 형성하기 어려운 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 접속된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 도메인과 V_L 도메인이 또다른 단편의 상보성 V_L 도메인 및 V_H 도메인과 쌍을 형성하도록 함으로써, 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중-특이적 항체 단편을 제조하기 위한 또다른 전략이 또한 보고되었다 [참고: Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)].

2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어, 삼중-특이적 항체를 제조할 수 있다 [참고: Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991)].

폴리펩티드 변이체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조한다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 분리 방법 (천연 발생적 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 해당 폴리펩티드의 보다 앞서 제조된 변이체 또는 비-변이체 버젼의 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 또는 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

예를 들어, Fc 수용체 결합성을 증강시키기 위해 효과기 기능과 관련하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 하나 이상의 아미노산 치환물을 항체의 Fc 영역 내로 도입함으로써 달성할 수 있다. 또다른 한편 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입함으로써, 이러한 영역에서의 쇄간 디설파이드 결합 형성을 허용할 수 있다.

항체의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 재이용 (salvage) 수용체 결합성 에피토프를 항체 (특히, 항체 단편) 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "재이용 수용체 결합성 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는데 책임이 있는 IgG 분자 (예: IgG_l, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 지칭한다.

항체의 기타 변형물이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체를 각종 비-단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체 중의 하나에 연결시킬 수 있다.

B. 핵산을 복제 가능한 벡터에 삽입함

이종 핵산 (예: cDNA 또는 게놈 DNA)을 적합한 프로모터의 제어 하에 이. 콜라이에서 발현시키기 위해 복제 가능한 벡터 내로 삽입하는 것이 적합하다. 이러한 목적에 이용 가능한 수 많은 벡터가 있으며, 적당한 벡터의 선별은 주로, 벡터 내로 삽입될 핵산의 크기와, 벡터를 이용하여 형질전환시키고자 하는 특정한 숙주 세포에 좌우될 것이다. 각 벡터는 화합성인 특정한 숙주 세포에 따라서 각종 성분을 함유한다. 숙주의 특정한 유형에 따라서, 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 성분들 중의 하나 이상이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 프로모터, 및 전사 종결 서열.

일반적으로, 숙주 세포와 화합성인 종으로부터 유래되는 제어 서열 및 레플리콘을 함유하는 플라스미드 벡터를 이. 콜라이 숙주와 연계해서 사용한다. 이러한 벡터는 통상적으로, 복제 부위 뿐만 아니라 형질전환된 세포에서 표현형별 선별을 제공할 수 있는 제조 서열을 수반하고 있다. 예를 들어, 이. 콜라이는 전형적으로, 이. 콜라이 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질전환시킨다 [참고: Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)]. pBR322는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하므로, 형질전환된 세포를 확인하기 위한 용이한 수단을 제공해준다. pBR322 플라스미드 또는 기타 세균성 플라스미드 또는 파지는 또한 일반적으로, 선별성 마커 유전자의 발현을 위해 이. 콜라이 숙주에 의해 사용될 수 있는 프로모터를 함유하거나 이를 함유하도록 변형시킨다.

(i) 신호 서열 성분

본원에서 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 직접적으로 발현시킬 수 있을 뿐만 아니라 또다른 폴리펩티드, 예를 들어 신호 서열 또는 성숙한 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를 갖는 기타 폴리펩티드와의 융합물로서 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 한 구성분일 수 있거나 또는 벡터 내로 삽입되는 폴리펩티드-암호화 DNA의 일부일 수도 있다. 선별된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되고 프로세싱되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단되는) 것이어야 한다.

본래의 또는 진핵성 폴리펩티드 신호 서열을 인식 및 프로세싱하지 못하는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 신호 서열을, 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열-안정한 엔테로톡신 II 리더로 이루어진 군 중에서 선택된 원핵성 신호 서열에 의해 치환시킨다.

(ii) 복제 기점 성분

발현 벡터는 이러한 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제될 수 있게 해주는 핵산 서열을 함유한다. 각종 세균에 대한 상기 서열은 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 세균 (예: 이. 콜라이)에 적합하다.

(iii) 선별 유전자 성분

발현 벡터는 일반적으로, 선별성 마커로 명명되기도 하는 선별 유전자를 함유한다. 이러한 유전자는 선택적인 배양 배지에서 성장시킨 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 암호화한다. 선별 유전자를 함유하는 벡터를 이용하여 형질전환되지 않은 숙주 세포는 이러한 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 이러한 선별성 마커는 본 발명에 의해 활용되고 정의되는 바와 같은 유전자 마커로부터 격리시킨다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 기타 독소, 예를 들어 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여해주는 단백질; (b) 유전자 마커(들)의 존재 하에 유발된 것 이외의 영양요구성 결핍증을 보충해주는 단백질; 또는 (c) 복합 배지로부터 입수 가능하지 않은 중요한 영양분, 예를 들어 바실루스 (Bacillus)에 대한 D-알라닌 라세마제를 암호화하는 유전자를 공급해 주는 단백질을 암호화한다.

선별 도식의 한 가지 예는 숙주 세포의 성장을 중지시키기 위한 약물을 활용한다. 이러한 경우, 관심있는 핵산을 이용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여해 주는 폴리펩티드를 생산하므로, 선별 섭생에서 살아 남는다. 이러한 우성 선별의 예들은 약물 네오마이신을 이용하거나 [참고: Southern et al., J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)], 미코페놀산을 이용하거나 [참고: Mulligan et al., Science, 209: 1422 (1980)] 또는 히그로마이신을 이용한다 [참고: Sugden et al., Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985)]. 상기 소정의 3가지 예들은 진핵성 제어 하에 세균성 유전자를 이용하여 적당한 약물 G418 또는 네오마이신 (제네티신: geneticin), xgpt (미코페놀산) 또는 히그로마이신 각각에 대한 내성을 전달한다.

(iv) 프로모터 성분

관심있는 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현 벡터는 이. 콜라이에 의해 인식되고 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 작동적으로 연결되는 적합한 프로모터를 함유한다. 이. 콜라이 숙주를 이용하는 경우에 사용하기 적합한 프로모터에는 베타-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [참고: Chang et al., Nature, 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)], 아라비노스 프로모터 시스템 [참고: Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)], 알칼리성 포스파타제, T7 프로모터, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [참고: Goeddel, Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980) and EP 36,776] 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 [참고: deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)]가 포함된다. 그러나, 기타 공지된 세균성 프로모터도 적합하다. 그들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있기 때문에, 당업자는 요구되는 어떠한 제한 부위도 공급해주는 링커 또는 적응인자를 이용하여 이들 서열을 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결시킬 수 있다 [참고: Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)].

바람직하게는, 본원에 이용된 프로모터가 유도성 프로모터, 즉 유도제 또는 유도성 조건 (예를 들어, 주변세포질성 인산염 고갈)에 의해 활성화되는 프로모터이다. 본원에서 이러한 유도성 프로모터 중에 바람직한 것은 알칼리성 포스파타제 프로모터, tac 프로모터 또는 T7 프로모터이다.

세균성 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 또한 일반적으로, 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA에 작동적으로 연결된 샤인-달가르노 (Shine-Dalgarno; S. D.) 서열을 함유한다. 프로모터는 제한 효소 분해에 의해 세균성 공급원 DNA로부터 제거한 다음, 목적하는 DNA를 함유하는 벡터 내로 삽입할 수 있다.

(v) 벡터의 구축 및 분석

상기 열거된 성분들 중의 하나 이상을 함유하는 적합한 벡터의 구축은 표준 연결 기술을 이용한다. 분리된 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단하고, 이를 재단한 다음, 목적하는 형태로 재연결시켜 요구되는 플라스미드를 생성시킨다.

구축된 플라스미드에서 정확한 서열을 확인하기 위해 분석하는 경우에는, 상기 연결 혼합물을 사용하여 이. 콜라이 K12 균주 294 (ATCC 31,446) 또는 기타 균주를 형질전환시키고, 경우에 따라 앰피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 성공적인 형질전환체를 선별한다. 이러한 형질전환체로부터 플라스미드를 제조하고, 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 분석하고/하거나 다음 문헌의 방법에 의해 서열 분석한다 [참고: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977); Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981); or Maxam et al., Methods in Enzymology, 65: 499 (1980)].

C. 숙주 세포의 선별 및 형질전환

본원에서 발현 플라스미드에 대한 모 숙주로서 적합한 이. 콜라이 숙주에는 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325), 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 B, 및 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537)이 포함된다. 이들 예는 제한적이기 보다는 예시적이다. 상기 언급된 균주 중의 어떠한 것의 돌연변이체 세포도 출발 숙주로서 이용한 다음, 이들이 본원에서 요구하는 적어도 최소한의 표현형을 함유하도록 추가로 돌연변이시킨다. 이. 콜라이 균주 W3110이 바람직한 모 숙주인데, 이는 이것이 재조합 DNA 생성물 발효를 위해 흔히 사용되고 있는 숙주 균주이기 때문이다. 모 숙주로서 사용될 출발 이. 콜라이 숙주의 예가 그들의 유전자형과 함께 다음 표에 포함되어 있다:

균주 36F8을 제조하는데 있어서의 중간체, 즉 27B4 (참고: 미국 특허 제5,304,472호) 및 35E7 (27B4 보다는 우수하게 성장하는 자발적 온도-내성 집락 분리물)이 또한 적합하다. 부가의 적합한 균주는 미국 특허 제4,946,783호 (1990년 8월 7일자로 허여됨)에 기재된 돌연변이체 주변세포질성 프로테아제(들)를 갖는 이. 콜라이 균주이다.

한 양태에서는, 이용된 이. 콜라이 숙주 세포가 glpT 유전자에 대하여 야생형, 예를 들어 43E7이거나, 또는 glpT 유전자가 결핍된 형태, 예를 들어 43F6 또는 61G1이다. 또다른 양태에서는, 이용된 이. 콜라이 숙주 세포가 phoA 유전자에 대하여 야생형이다. 바람직한 양태에서는, 이. 콜라이에 염색체성 phoA가 결핍되어 있다. 또다른 바람직한 양태에서는, 이. 콜라이에 염색체성 glpT와 염색체성 phoA가 결핍되어 있다. 보다 바람직한 양태에서는, 이. 콜라이에 염색체성 glpT와 염색체성 phoA가 결핍되어 있지만, 염색체성 ugp는 결핍되어 있지 않다. 이러한 돌연변이체 중의 가장 바람직한 이. 콜라이 숙주는 43F6 또는 61G1인데, 이의 유전자형은 상기 표에 제시되어 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "glpT에 대하여 야생형"이란 glpT+ 또는 glpT 적격한 세포, 즉 염색체성 glpT가 결핍되지 않은 세포인 이. 콜라이 숙주를 지칭한다. 유사하게, 본원에 사용된 바와 같이, "phoA에 대하여 야생형"이란 phoA+ 또는 phoA 적격한 세포, 즉 염색체성 phoA가 결핍되지 않은 세포인 이. 콜라이 숙주를 지칭한다.

본 발명의 균주는 모 균주를 염색체성 통합하거나 또는 기타 기술 (다음 실시예에 기재된 것을 포함함)에 의해 생성시킬 수 있다.

당해 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 숙주 세포 내로 삽입한다. 바람직하게는, 상기 언급된 발현 벡터를 이용하여 숙주 세포를 형질전환시키고, 각종 프로모터를 유도하는데 적당한 바 대로 변형시킨 통상적인 영양 배지에서 배양함으로써 상기 과정을 달성한다.

형질전환은 DNA가 염색체외 요소로서 또는 염색체성 통합체에 의해 복제 가능하도록 DNA를 특정 유기체 내로 도입하는 것을 의미한다. 사용된 숙주 세포에 따라서, 이러한 세포에 적당한 표준 기술을 사용하여 형질전환을 수행한다. 문헌 [참고: section 1.82 of Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은, 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리법은 일반적으로, 원핵성 세포 또는 실질적 세포-벽 장벽을 함유하고 있는 기타 세포에 사용한다. 또다른 형질전환 방법은 문헌 [참고: Chung and Miller, Nucleic Acids Res., 16: 3580 (1988)]에 기재된 바와 같이 폴리에틸렌 글리콜/DMSO를 이용한다. 또다른 방법은 전기천공으로 지칭되는 기술을 사용하는 것이다.

D. 숙주 세포의 배양

관심있는 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용되는 이. 콜라이 세포는 문헌 [Sambrook et al., 상기 참고]에 일반적으로 기재된 바와 같은 적합한 배지에서 배양한다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등은 발현을 위해 선별된 숙주 세포의 경우에 기존에 사용된 것이며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.

배양 배지에 수송가능한 유기 인산염, 예를 들어 글리세로포스페이트, 예를 들면 알파-글리세로포스페이트 및(또는) 베타-글리세로포스페이트, 및 특히 글리세롤-2-포스페이트 및(또는) 글리세롤-3-포스페이트를 공급하면서 상기 세포를 배양한다. 배양은 진탕 플라스크 또는 발효기, 바람직하게는 발효기에서 수행할 수 있다. 폴리펩티드는 세포의 세포질, 주변세포질 또는 배양 배지로부터 회수하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법에서는, 배양 단계의 어떠한 기에서도 핵산의 발현을 시작할 수 있다. 그러나, 세포 밀도를 지속적으로 증가시키면서 핵산의 발현을 시작하는 것이 바람직하다. 이는 세포 성장이 멈추기 전에 적당한 유도제 또는 유도 조건을 이용하여 프로모터를 유도시킴으로써 달성할 수 있다.

폴리펩티드를 최대로 생산하기 위해 이용하고자 하는 배양 배지 내로 공급되는 유기 인산염의 공급 속도는 유기 인산염의 유형, 유기 인산염의 농도, 생산되는 폴리펩티드의 유형, 프로모터의 유형, 이용된 숙주 세포 균주, 및 육즙 내에서의 세포 밀도를 포함한 수 많은 인자들에 의해 좌우된다. 폴리펩티드가 IGF-I이고 유기 인산염이, 10-L 공정을 이용하고 상기 언급된 배양 조건 하에 생산 기간을 확장시키고자 한 글리세롤-3-포스페이트인 경우에는, 유기 인산염의 공급 속도가 바람직하게는 약 8 내지 10 리터 당 약 1 내지 7 mmol/시간 (도 4 참고), 보다 바람직하게는 약 1 내지 6 mmol/시간, 보다 더 바람직하게는 약 2 내지 6 mmol/시간, 보다 더 바람직하게는 약 2 내지 5 mmol/시간, 가장 바람직하게는 약 3 내지 4 mmol/시간이다. 최적의 공급 속도는 해당 공정, 세포 밀도, 호흡 속도 등에 좌우된다.

또한 바람직한 양태에서, 폴리펩티드가 Apo2L이고 유기 인산염이, 10-L 공정을 이용하고 생성물 발현이 활성 성장기와 동시에 발생하도록 이동시키고자 한 글리세롤-3-포스페이트인 경우에는, 유기 인산염의 공급 속도가 약 8 내지 10 리터 당 약 4 내지 17 mmol/시간 (도 7 참고), 보다 바람직하게는 약 6 내지 16 mmol/시간, 보다 더 바람직하게는 약 8 내지 15 mmol/시간, 가장 바람직하게는 약 10 내지 14 mmol/시간이다. 유기 인산염의 최적의 공급 속도는 특이적 이종 단백질의 발현을 위해 이용된 개개 공정에 대해 결정할 필요가 있다.

탄소, 질소 및 무기 인산염 공급원 이외의 기타 필수 배지 성분들이, 단독으로서 또는 또다른 성분 또는 배지와의 혼합물 (예: 복합 질소원)로서 도입된 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 바람직하게는, 배양 단계 출발시에 무기 인산염도 배양 배지에 존재하기도 한다. 이러한 무기 인산염, 바람직하게는 인산 나트륨 및(또는) 인산 칼륨이 존재하는 경우에는, 무기 인산염 대 유기 인산염의 비가 발현된 폴리펩티드의 유형 및 이용된 유기 인산염의 유형과 같은 요인들에 의해 좌우된다. 이러한 비는 당업자에 의해 용이하게 결정되는 바와 같이 어떠한 비율일 수 있는데, 전형적으로 약 1:10 (Pi 1부 대 유기 인산염 10부) 내지 1:0.25의 범위이다. Apo2 리간드의 경우에는, 이러한 비가 바람직하게는 약 1:4 내지 1:0.25, 보다 바람직하게는 약 1:3 내지 1:0.5, 보다 더 바람직하게는 약 1:3 내지 1:1, 보다 더 바람직하게는 약 1:2 내지 1:1, 가장 바람직하게는 약 1:1이다. 이러한 비는 단백질 발현의 보다 이른 유도를 허용해 주고, 몇몇 경우에는 보다 많은 생성물을 보다 초기에 생산시켜 준다. 배지의 pH는 주로 숙주 유기체에 따라서 약 5 내지 9의 범위 내일 수 있다.

프로모터가, 유도가 일어나게 하기 위한 유도성 프로모터인 경우에는, (예를 들어, 유도제를 부가하거나, 배지 성분을 고갈시킴으로써) 전형적으로 특정 광밀도가 달성될 때까지, 예를 들어, 고-세포 밀도 공정의 경우에는 약 200의 A₅₅₀가 달성될 때까지 (이러한 지점에서 유도가 개시된다) 세포를 배양하여, 관심있는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 유도시킨다.

알칼리성 포스파타제 프로모터를 이용하는 경우에는, 본 발명의 관심있는 폴리펩티드를 생산하기 위해 사용된 이. 콜라이를 적합한 배지에서 배양하는데, 이러한 배지에서는, 상기 알칼리성 포스파타제 프로모터가 일반적으로, 문헌 [Sambrook et al., 상기 참고]에 기재된 바와 같이 유도될 수 있다. 처음에는, 상기 배지가 상당한 세포 성장을 지지해주고 프로모터 제어 하에 표적 이종 폴리펩티드의 합성 유도를 피하기에 충분한 많은 양으로 세균을 성장시키기 위한 무기 인산염을 함유할 수 있다. 세포가 성장하고 인산염을 활용함에 따라, 이들은 배지 중의 무기 인산염의 수준을 감소시킴으로써, 무기 인산염이 소진될 때 폴리펩티드의 합성 유도를 중지시킨다. 예를 들어, G2P와 G3P의 혼합물로 구성되는 공급물 또는 G3P 공급물을 부가함으로써, 무기 인산염의 부재 하에서도 또는 주변세포질 및 지지성 배양 배지 내의 무기 인산염의 고갈 수준에서도 보다 높은 세포 밀도, 예를 들어 200 OD550 이상 까지의 추가 성장이 이루어짐으로써, 생성물 축적량이 증가하거나 확대된다.

E. 발현 탐지

유전자 발현은, 예를 들어, 해당 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 이용하여, mRNA의 전사를 정량화하기 위한 통상적인 노던 (northern) 블롯팅 [참고: Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)], 도트 블롯팅 (RNA 분석) 또는 계내 혼성화 방법에 의해 샘플 내에서 직접 측정할 수 있다. 각종 표지를 이용할 수 있는데, 가장 통상적으로는 방사성 동위원소, 특히 ³²P를 이용한다. 그러나, 폴리뉴클레오티드 내로 도입하기 위하여 바이오틴-변형된 뉴클레오티드를 사용하는 바와 같은 기타 기술을 이용할 수도 있다. 이때, 바이오틴은 아비딘 또는 항체와 결합하기 위한 부위로서 제공되는데, 이는 광범위한 표지, 예를 들어 방사성 핵종, 형광제, 효소 등으로 표지시킬 수 있다. 또다른 한편, 단백질 탐지를 위해 검정 또는 겔을 이용할 수 있다.

발현된 유전자 생성물을 분비시키기 위해, 숙주 세포를 이러한 유전자 생성물 분비에 충분한 조건 하에 배양한다. 이러한 조건에는, 예를 들어 상기 세포에 의한 분비를 허용해주는 온도, 영양분, 및 세포 밀도 조건이 포함된다. 더우기, 이러한 조건은 당업자에게 공지된 바와 같이, 하나의 세포성 구획으로부터 또다른 세포성 구획으로의 단백질 통과, 전사 및 해독과 같은 기본적인 세포 기능을 세포가 수행할 수 있게 하는 조건이다.

F. 폴리펩티드의 정제

다음 과정들은 개별적으로 또는 병용해서, 적합한 정제 과정을 예시한 것인데, 사용된 구체적 방법(들)은 폴리펩티드의 유형에 따라서 결정된다: 면역친화성 또는 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 소수성-상호 작용 크로마토그래피; 실리카 상에서의 크로마토그래피; 이온-교환 수지, 예를 들어 S-SEPHAROSE™ 및 DEAE 상에서의 크로마토그래피; 크로마토포커싱 (chromatofocusing); SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 및, 예를 들어 SEPHADEX™ G-75 배지를 이용한 겔 여과. 모노클로날 항체는 적합하게는, 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들어 단백질 SEPHADEX™ 배지, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피에 의해 배양 배지로부터 격리시킬 수 있다.

본 발명은 다음 실시예를 참고로 하여 보다 상세히 인식될 것이다. 그러나, 다음 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본원에 인용된 모든 문헌과 특허는 본원에 참고로 도입된다.

실시예 1

엘라마 항체 단편 (중쇄) 및 Apo2L를 생산하기 위해 G3P를 진탕 플라스크 배양물에 공급함

배경:

저-인산염 (CRAP) 또는 고-인산염 배양 배지 (THCD) 중의 200 mM G3P (최종 농도)의 봉입물을, 진탕 플라스크 배양에서 이종 단백질을 발현을 알아보기 위해 각각의 대조군 부가물 (물)과 비교하였다. 본 실시예의 제1 파트에서는, 표적 이종 단백질이 13kD 엘라마 항-HCG 카멜리드 모노보디 (camelid monobody)이다. 카멜리드 항체에는 2가지 종류가 있는 것으로 기존에 밝혀졌는데, 즉 2개의 중쇄와 2개의 경쇄로 이루어진 전통적인 IgG 분자와, 경쇄가 결여된 중쇄 IgG 분자 (모노보디로서 지칭됨)이다. 카멜리드 모노보디는 저-인산염 (CRAP)- 또는 고-인산염 (THCD)-풍부 배지에서 tac 프로모터를 사용하여 이. 콜라이 B 균주인 BL21에 의해 발현되었다. 항체 단편-암호화 서열 바로 앞에 위치한 malE 결합성 단백질 신호 서열은 발현 단백질이 숙주의 주변세포질 내로 분비하도록 지시하였다. 본 실시예의 제2 파트에서는, T7 프로모터를 사용하여 G3P-보충된 CRAP 배지 및 보충되지 않 은 CRAP 배지에서 이. 콜라이 K12 균주인 HMS174에서의 Apo2 리간드의 발현을 조절하였다. 양 실험에서 이종 단백질의 생산은, 목적하는 세포 밀도에 도달할 때 IPTG를 부가하는 경우에 유도되었다.

재료 및 방법:

pCB36624 86.RIG 플라스미드 구축:

벡터 pL1602를 변형시킴으로써 pCB36624_86.RIG를 구축하였다 [참고: Sidhu et al., J. Mol.Biol., 296: 487-495 (2000)]. pTac 프로모터 서열과 malE 분비 신호 서열을 갖는 벡터 pS1602는 파지 mu의 유전자-3 작은 외피 단백질 (p3)의 C-말단 도메인과 융합된 인간 성장 호르몬 서열을 함유하였다. hGH를 암호화하는 서열을 제거하고, 이로써 생성된 벡터 서열은 엘라마 항-HCG 항체를 암호화하는 합성 DNA 단편을 삽입하기 위한 벡터 주쇄로서 제공되었다 [참고: Spinelli et al., Nat. Struct. Biol. 3(9): 752-757 (1996)]. 이로써 생성된 파지미드 (pCB36624)는 IPTG-유도성 P_tac 프로모터의 제어 하에 융합 생성물을 암호화하였다 [참고: Amman and Brosius, Gene, 40: 183-190 (1985)]. 발현된 폴리펩티드는 말토스-결합성 단백질 신호 펩티드 다음에 항-HCG 암호화 영역을 포함하고, 그 다음에 FLAG 에피토프 태그를 포함하고, 그 다음에 억제 가능한 중지 코돈을 함유하는 Gly/Ser-풍부 링커 펩티드를 포함하고, 그 다음에 P3C (파지 외피 단백질의 C-말단 도메인)을 포함하였다.

적절하게 고안된 "중지 주형" 파지미드를 이용하고 문헌 [참고: Sidhu et al., J. Mol. Biol., 296: 487-495 (2000)]의 방법을 사용하여 파지-표시된 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리 NNS17에 대해서는, 코돈 93, 94, 100 및 101 대신 TAA 중지 코돈을 함유한 pCB36624의 유도체를 쿤켈 (Kunkel) 돌연변이 유발 방법 [참고: Kunkel et al., Methods Enzymol., 154: 367-382 (1987)]에 대한 주형으로서 사용하였는데, 여기서는 중지 코돈을 자발적으로 복구시키고 Gly95를 암호화하는 코돈과 Trpl03를 암호화하는 코돈 사이에 17 NNK 축중 (degenerate) 코돈을 도입하도록 고안된 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오티드 NNS17을 사용하였다:

NNS17 : GCC GTC TAT ACT TGT GGT GCT GGT NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNS TGG GGT CAG GGT (서열 3)

모든 모노보디와 마찬가지로, 엘라마 항-HCG는 Vh3 계열 구성원이므로, 단백질 A에 의해 인식된다. 단백질 A 결합성 상호 작용을 CDR3-매개된 안정성에 대한 대용 활성으로서 사용하였다. 이로써 생성된 파지 라이브러리를 대상으로 하여, 스캐폴드 안정성과 발현에 관한 판독정보로서 단백질 A에 대항하여 수 차례 분류 작업을 수행하였다. 이와 같이 하여 분류한 라이브러리를 대상으로 하여, NNS 라이브러리 내의 아미노산 분포에 있어서의 선별 편재 (bias)에 대해 분석하였다. 위치 96, 97 및 98에서의 서열로써 명명된 바와 같은 스캐폴드 RIG는, 서열 분석한 잔기들을 근거로 했을 때 가장 우성인 클론인 것으로 밝혀졌다. 스캐폴드 RIG에 대한 17개 아미노산의 장 CDR3 서열은 RIGRSVFNLRRESWVTW (서열 4)인 것으로 결정되었다. 스캐폴드 RIG를 수반한 파지미드는 pCB36624_86.RIG로 재명명되었으며, 이의 DNA 서열은 다음과 같다:

petl9b.nohis 플라스미드 구축

표준 분자 생물학 기술을 사용하여, 인간 태반 cDNA로부터 분리한 완전한 길이의 Apo2L 클론으로부터 폴리머라제 연쇄 반응시킴으로써 Apo2L 코돈 114-281을 증폭시켰다. 클로닝을 촉진시키기 위한 제한 부위를 함유하는 부가의 뉴클레오티드를 5' 및 3' 서열에 각각 부가하였다. 5' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 밑줄쳐진 NdeI 제한 부위를 함유하는 다음 서열을 갖는다:

5' GCTTGCTACATATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAGAGA 3' (서열 6).

3' 올리고뉴클레오티드 프라이머는 밑줄쳐진 BamHI 제한 부위를 함유하는 다음 서열을 갖는다:

5' CTTGAATAGGATCCCTATTAGCCAACTAAAAAGGCCCCAAAA AAACTGGC 3' (서열 7).

이로써 생성된 단편은 제한 부위 NdeI 내지 BamHI를 사용하여, His10 태그와 엔테로키나제 절단 부위를 함유하는 특정 서열의 하단 및 동일 프레임 내의 변형된 바쿨로바이러스 (baculovirus) 발현 벡터 pVL1392 (공급처: Pharmingen) 내로 아클로닝하였다 [참고: Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1997)]. pVL1392-Apo2L을 NdeI 및 BamHI로 분해시키고, 이로써 생성된 NdeI-대-BamHI 단편 을, 또한 NdeI 및 BamHI로 분해시킨 pET-19b (공급처: Novagen) 내로 아클로닝하였다. 이로써 생성된 플라스미드는 petl9b.nohis로 명명되었다.

세균성 균주:

BL21 (공급처: Stratagene) 및 HMS174 (공급처: Merck)의 적격한 세포를, 표준 과정을 이용하여 pCB36624_86.RIG 및 petl9b.nohis로 각각 형질전환시켰다. 50 ㎍/ml 카르베니실린 (LB+CARB50™ 카르베니실린)을 함유하는 LB 판 상에서 성장시킨 후에 형질전환체를 골라 내고, 스트리크-정제한 다음, 30℃ 항온 배양기에서 50 ㎍/ml CARB50™ 카르베니실린을 수반한 LB 육즙에서 성장시켰다. pCB36624_86.RIG는 생산 숙주 BL21/pCB36624_86.RIG 및 petl9b.nohis 내지 HMS174/petl9b.nohis에 카르베니실린 내성을 부여하여, 형질전환된 숙주가 상기 항생제의 존재 하에서 성장할 수 있도록 하였다.

발효 배지:

엘라마 항체 단편과 Apo2 리간드의 생성을 평가하기 위해, 저-인산염 (CRAP) 배양 배지와 고-인산염 (THCD) 배양 배지 둘 다를 사용하였다. 배지 조성 (초기 배지 1 리터 당 활용된 각 성분의 양으로 표시됨)이 다음에 열거되었다:

성분 저-PO₄ 배지 고-PO₄ 배지

(1 L당 양) (1 L당 양)

글루코스 5.5 g 5.5 g

황산암모늄 3.57 g 3.57 g

Na₂HP0₄ - 1.86 g

NaH₂P0₄-H₂0 - 0.93 g

나트륨 시트레이트, 이수화물 0.71 g 0.71 g

염화칼륨 1.07 g 1.07 g

1M 황산마그네슘 7 ml 7 ml

히카세 SF 5.36g -

효모 추출물 5.36 g 5.36 g

카사미노산 - 5.36 g

1M MOPS, ph 7.3 110 ml 110 ml

pH 7.3이 되도록 pH를

조정하기 위한 KOH 적당량 적당량

200 mM의 G3P-보충 배지를 제조하기 위해, 접종에 앞서 5 ml의 1 M DL-알파-글리세로포스페이트 (G3P) (공급처: Sigma Chem. Co.)를, 50 ㎍/ml의 카르베니실린을 수반한 20 ml의 저-PO₄ 배지 (저-P0₄ 배지 + CARB50™ 카르베니실린) 또는 50 ㎍/ml의 카르베니실린을 수반한 20 ml의 고-PO₄ 배지 (고-P0₄ 배지 + CARB50™ 카르베니실린)에 부가하였다. 보충시키지 않은 (대조군) 배지에 대해서는, G3P 대신 5 ml의 물을 사용하였다.

진탕 플라스크 발효:

25 ml의 대조군 배지 또는 G3P-보충된 배지를 함유하는 125-ml의 조절판이 있는 플라스크에서 진탕 플라스크 발효를 수행하였다. LB+CARB50™ 카르베니실린에서 성장시킨 BL21/pCB36624_86.RIG 또는 HMS174/petl9b.nohis의 밤새 배양물을 대략 1:100으로 역-희석시켜, 이를 대조군 또는 G3P-보충된 배지 내로 접종하였다. 배양물을 250 RPM의 진탕기 상에서 30℃ 하에 항온 배양하고, 세포 밀도가 상기 배지에 의해 지지된 잠재적 세포 성장의 대략 50 내지 60％에 도달하면 1 mM의 IPTG를 부가함으로써 생성물 발현을 유도하였다. 유도제를 부가하기 직전 및 접종한지 대략 24시간 후에 취한 1 ml의 육즙 배양물로부터 세포 펠릿을 제조하고, 이를 -20℃ 하에 저장하였다.

PAGE 및 밀도측정법에 의해 분석한 엘라마 항체 단편 축적:

1 ml의 배양 샘플로부터 제조된 냉동 (-20℃) 세포 펠릿을 해동시키고, 이를 충분 량의 lO mM TRIS, pH 7.6 + 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE)에 재현탁시켜 세포 현탁물이 1 OD/25 ㎕ 농도가 되도록 하였다. 25 ㎕의 TE-세포 현탁물을, 베타-머캅토에탄올을 함유하는 25 ㎕의 2X 샘플 완충액과 혼합하였다. 혼합물을 5분 동안 >95℃에서 가열한 후, 웰당 10 ㎕ (0.2 OD에 등가량)을 NU-PAGE™ 예비주조된 10％ 비스-트리스 (Bis-Tris) 겔 (공급처: Novex) 상으로 부하하였다. 전기영동을 MES 완충액 [예를 들어, 1 N NaOH를 사용하여 적당한 pH로 조정시킨 탈이온수 중의 (2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산]에서 수행하였다. 분해된 겔을 COOMASSIE BLUE R250™ 염색물로 염색한 다음, 탈색하였다. 습윤 겔을 코닥 (Kodak) 영상화 시스템으로 스캐닝한 후 코닥 DIGITAL SCIENCE 1D™ 영상화 소프트웨어를 이용하여, 13-kD 항 체 단편의 밴드 세기를 결정하였다.

역상 HPLC에 의해 분석한 Apo2 리간드 축적:

1 ml의 배양 샘플로부터 제조된 냉동 (-20℃) 세포 펠릿을 충분 량의 TE 완충액에 재현탁시켜 세포 현탁물이 1 OD/25 ㎕ 농도가 되도록 하였다. 20 ㎕의 세포 현탁물을 480 ㎕의 6 M 구아니딘 HCl, pH 9.0 + 100 mM 디티오트레이톨 (DTT) 내로 혼합하며, 실온에서 1시간 동안 항온 배양한 후, 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하여 상등액/추출물을 회수하였다. 이 추출물을 MILLIPORE™ 스핀-필터 내로 여과시킨 다음, 20 ㎕를 HPLC 칼럼 (PerSeptive Biosystems POROS^® R1/10 배지) 상으로 부하하여 역상 크로마토그래하였다. 1.0 ml/분으로 유동하고 0.1％ TFA를 수반한 28％ 내지 35％의 아세토니트릴 구배를 20분에 걸쳐 이용하는 이동 상을 사용하여 HPLC 분리를 80℃에서 수행함으로써, Apo2L을 오염성 단백질로부터 멀리 떨어뜨려 분석하였다. 피크는 280 nm 파장에서 탐지되었다. 동일한 방법에 의해 분석한 5 내지 25 ㎍의 정제된 표준물과 연합된 피크하 면적으로부터 유래된 평균 반응 인자 (mAU/㎍)를 사용하여, 샘플 내에 존재하는 단량체의 양을 계산하였다.

결과:

도 1은 항체가 대조군에 비해 200 mM G3P이 보충된 고-PO₄ (THCD) 및 저-PO₄ (CRAP) 배지 둘 다에서 보다 높은 수준으로 발현되었다는 것을 도시한 것이다.

도 2는 Apo2L 단백질이 대조군에 비해 200 mM G3P이 보충된 저-PO₄ (CRAP) 배지에서 보다 높은 수준으로 발현되었다는 것을 도시한 것이다.

실시예 2

알칼리성 포스파타제 프로모터에 의해 조절된 IGF-I을 생산하기 위해 야생형 또는 ( △glpT phoA -ugp+) 숙주의 10-L 발효기 배양물에 G3P를 공급함

재료 및 방법:

IGF-I 발현용 pBKIGF-2B 플라스미드:

본원에서 IGF-I의 발현을 위해 사용된 플라스미드 pBKIGF-2를 미국 특허 제5,342,763호에 상세된 바와 같이 구축하였다. 이 플라스미드는 pBR322의 기본 주쇄로부터 구축하였다. 이. 콜라이에서 IGF-I 유전자의 발현을 위해 필요한 전사 및 해독 서열이 알칼리성 포스파타제 프로모터 및 trp 샤인-달가르노 서열에 의해 제공되었다. 람다 t_o 전사 종결 인자를 IGF-I 종결 코돈에 인접하게 위치시켰다. 세포질로부터의 상기 단백질의 분비는 lamB 신호 서열에 의해 지시된다. 대다수의 rhIGF-I이 세포 주변세포질성 공간에서 발견되었다. 플라스미드 pBKIGF-2B는 형질전환된 숙주 상에 테트라사이클린 내성을 부여해준다.

세균성 균주 및 성장 조건:

IGF-I 발효에 사용된 숙주는 이. 콜라이 W3110의 유도체이다 [참고: Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D. C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219]. 야생형 glpT를 수반한 숙주에 관한 실험은 균주 43E7 [이. 콜라이 W3110 fhuA(tonA) △(argF-lac) ptr3 degP41 △ompT△(nmpc-fepE) ilvG + phoA]을 사용하여 수행하였고, △glpT 돌연변이를 수반한 숙주에 관한 실험은 균주 43F6 [이. 콜라이 W3110 fhuA(tonA) △(argF-lac) ptr3 degP41 △ompT△(nmpc-fepE) ilvG + phoA △glpT]을 사용하여 수행하였다. 43E7 또는 43F6의 적격한 세포는 표준 과정을 사용하여 pBKIGF-2B로 형질전환시켰다. 20 ㎍/ml 테트라사이클린 (LB + TET20™ 테트라사이클린)을 함유하는 LB 판 상에서 성장시킨 후에 형질전환체를 골라 내고, 스트리크-정제한 다음, 37℃ 진탕기/항온 배양기에서 20 ㎍/ml TET20™ 테트라사이클린을 수반한 LB 육즙에서 성장시킨 후에 발효기에서 시험하였다. pBKIGF-2B는 생산 숙주에 테트라사이클린 내성을 부여해주고, 형질전환된 숙주가 상기 항생제의 존재 하에서 성장할 수 있게 해준다.

10-L 발효 공정:

IGF-I의 발현을 위해 사용된 발효 배지 조성과 수행 프로토콜은 미국 특허 제5,342,763호에 기재된 IGF-I 공정에 사용된 것과 다소 유사하였다. 간략하게 언급하면, 43E7/pBKIGF-2 또는 43F6/pBKIGF-2의 진탕-플라스크 시드 배양물을 사용하여 풍부한 생산 배지를 접종하였다. 배지 조성 (초기 배지 1 리터 당 활용된 각 성분의 양으로 표시됨)이 다음에 기재되었다:

성분 양/L

글루코스^* 200-500 g

황산암모늄 2-10 g

인산나트륨, 1가 이수화물 1-5 g

인산칼륨, 2가 1-5 g

나트륨 시트레이트, 이수화물 0.5-5 g

염화칼륨 0.5-5 g

황산마그네슘, 칠수화물 0.5-5 g

PLURONIC™ 폴리올, L61 0.1-5 mL

염화철, 칠수화물 10-100 mg

황산아연, 칠수화물 0.1-10 mg

염화코발트, 육수화물 0.1-10 mg

나트륨 몰리브데이트, 이수화물 0.1-10 mg

황산구리, 오수화물 0.1-10 mg

붕산 0.1-lOmg

황산마그네슘, 일수화물 0.1-10 mg

염산 10-100 mg

테트라사이클린 4-30 mg

효모 추출물^* 5-25 g

NZ 아민 AS^* 5-25g

메티오닌^* 0-5 g

수산화암모늄 pH를 제어하는데 요구되는 양

황산 pH를 제어하는데 요구되는 양

^* 글루코스, 효모 추출물, 메티오닌 및 NZ 아민 AS의 일정 부분을 상기 배지에 초기에 가하고, 나머지는 발효 전반에 걸쳐 공급하였다.

상기 10-리터 발효는 다음과 같이 설정된 발효 파라미터를 이용한 공급-배치식 공정이었다:

진탕: 1000 RPM

통기성: 10.0 slpm

pH 제어: 7.3

온도: 37℃

역압: 0.3 bar

글루코스 공급물: 용해 산소 농도 (DO₂)가 30％로 떨어진 후

30％의 공기 포화도로 DO₂를 유지시키기 위한

알고리즘을 사용하여 컴퓨터-제어시킴

복합 질소 공급물: OD₅₅₀이 40에 도달할 때 시작하고, 나머지 수행 시간 동안

유지시킨 0.2 ml/분의 일정 공급 속도

수행 기간: 40 내지 50 시간.

글리세롤-3-포스페이트 (G3P) 공급을 포함하는 실험에서는, 적당량의 1 M G3P 원액을 복합 질소 공급물 내로 스파이킹하고, 후속 보충시킨 공급물 공급 속도 를 증가시켜 목적 량의 복합 질소 + G3P가 배양물에 전달되도록 하였다.

G3P 공급을 수반하거나 수반하지 않은 경우의 △glpT 돌연변이의 영향은 IGF-I 축적 상의 차이점에 의해 평가하였다. 6 M 구아니딘 + 100 mM DTT에 가용화된 샘플 중의 IGF-1 총량은 미국 특허 제6,559,122호에 기재된 바와 같은 역상 HPLC 방법에 의해 측정하였다.

결과:

도 3은 야생형 숙주 (43E7)와 AP 프로모터 및 지속적으로 공급된 글루코스를 사용하는 경우에, G3P를 배지에 부가하지 않은 경우 보다 G3P를 배지에 공급한 경우에 IGF-I 분비량이 현저하게 더 많았다는 것을 보여준다.

도 4는 △glpT 숙주 (43F6)와 AP 프로모터를 사용하는 경우에, G3P를 부가하지 않은 경우 보다 G3P를 대략 8 리터 당 1.18 또는 3.28 mmol/시간으로 배양물에 공급한 경우에 IGF-I 분비량이 현저하게 더 많았지만, G3P를 대략 8 리터 당 8.22 mmol/시간으로 공급한 경우에는 더 많지 않았다는 것을 보여준다. 최적의 공급 속도는 생성물, 유기 인산염의 유형 등에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 본원에 기재된 발효 공정 조건 하에서 IGF-I를 생산하기 위해 10-리터 발효기에서 배양하는 경우에는, 최적의 G3P 공급 속도가 대략 8 내지 10 리터 당 바람직하게는 약 1 내지 7 mmol/시간, 보다 바람직하게는 약 1 내지 6 mmol/시간, 보다 더 바람직하게는 약 2 내지 6 mmol/시간, 보다 더 바람직하게는 2 내지 5 mmol/시간, 가장 바람직하게는 3 내지 4 mmol/시간이다. 이러한 범위 내의 공급 속도는 대조군에 비해 생성물의 양을 증가시킬 뿐만 아니라 대조군에 비해 생산 기간도 연 장시킨다.

실시예 3

10-L 공정에서 Apo2 리간드 축적을 개선시키기 위해 글리세로-3-포스페이트를 공급함

Apo2 리간드에 관한 배경

종양 괴사 인자-관련 세포소멸 유도성 리간드 (TRAIL) [참고: Wiley et al., Immunity, 3: 673-682 (1995)]로서 공지되기도 한, 세포소멸-유도성 리간드 2 (Apo2L) [참고: Pitti et al., J. Biol. Chem., 271: 12687-12690 (1996)]은 유형 II 막 단백질이고 TNF 계열 리간드의 한 구성원이다. Apo2L/TRAIL은 그의 동족 사멸 수용체와의 결합을 통하여 광범위한 암 세포에서 세포 소멸을 촉발시키지만, 대부분의 정상 세포에서는 그렇치 않다 [참고: WO 99/00423; Ashkenazi, FASEB J., 13: (7) A1336 (April 23, 1999); Ashkenazi, Nature Reviews-Cancer, 2: 420-430 (2002)]. 아미노산 잔기 114-281 (이제부터는 Apo2L/TRAIL과 관련해서 지칭됨)에 상응하는, Apo2 리간드의 세포외 도메인의 가용성 단편은 잠재적 임상 연구를 위해 현재 연구 중이며 이. 콜라이에서 성공적으로 발현된 바 있다.

발효 공정에 관한 일반적인 설명:

발현 벡터는 대략 19.5-kDa 폴리펩티드의 생산을 조절하기 위해 알칼리성 포스파타제 (AP) 프로모터의 사용을 암호화한다. 발현된 신생 폴리펩티드는 리보솜으로부터의 방출시 세포질에서 단량체로 폴딩되고 추가로 연합하여 생물학적 활성 동종-삼량체가 되었다. 발효 동안에는, 대략 3.0 mmol/L-min의 피크 산소 흡수 속 도에서 세포성 활성이 수행되도록 공정 파라미터를 설정하였다. 육즙 수거 후, 세포질적으로 트래핑된 이종 단백질은 기계적 세포 붕괴에 의해 세포 용해물 내로 방출되어, 이로부터 회수할 수 있다.

재료 및 방법:

pAPApo2-P2RU 플라스미드 구축:

pAPApo2-P2RU는 2001년 1월 4일자로 공개된 WO 01/00832에 기재되었다. 간략하게 언급하면, 이 플라스미드 (이의 구조물이 도 5에 도시되어 있다)는 Apo-2L (아미노산 잔기 114-281)과, pro2 및 argU에 의해 암호화된 희귀-코돈 tRNA's의 공동-발현을 암호화하는데, 이러한 공동-발현은 알칼리성 포스파타제 프로모터에 의해 조절되었다. pBR322에 의거한 플라스미드 [참고: Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)] pAPApo2-P2RU를 사용하여 이. 콜라이에서 Apo-2L을 생산하였다. Apo-2L의 발현을 위해 요구되는 전사 및 해독 서열은 플라스미드 phGHl에 대해 기재된 바와 같이 [참고; Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987)], 알칼리성 포스파타제 프로모터 및 trp 샤인-달가르노 서열에 의해 제공되었다. Apo-2L에 대한 암호화 서열 (114-281)을 상기 프로모터와 샤인-달가르노 서열 하단에 위치시키고, 그 앞에 개시 메티오닌을 위치시켰다. 이러한 암호화 서열에는 Apo-2L의 잔기 114-281 (도 6 - 각각 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 대한 서열 1 및 2)를 암호화하는 뉴클레오티드 (도 6에 도시됨)가 포함되는데, 단 잠재적 이차 구조를 제거하기 위해 잔기 Prol19를 암호화하는 코돈을 "CCT" 대신 "CCG"로 변경하였다. 이러한 Apo-2L 암호화 서열 다음에 람다 t_o 전사 종결인자를 암호화하는 서열 [참고: Scholtissek et al., Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)]이 위치하였다.

부가적으로, 상기 플라스미드에는 또한, tRNA's pro2 [참고: Komine et al., J. Mol. Biol., 212: 579-598 (1990)] 및 argU/dnaY [참고: Garcia et al., Cell, 45: 453-459 (1986)]의 발현을 위한 서열이 포함된다. 이들 유전자는 이. 콜라이 W3110으로부터 PCR에 의해 클로닝하였고, 람다 t_o 전사 종결인자 서열의 하단에 위치시켰다. 상기 플라스미드는 생산 숙주에 대해 테트라사이클린 내성과 앰피실린 내성 둘 다를 부여해주었다.

세균성 균주 및 성장 조건:

균주 43E7 [이. 콜라이 W3110 fhuA(tonA) phoA △(argF-lac) ptr3 degP ompT ilvG+]을 43F6과의 비교를 위한 야생형 생산 숙주, Apo2 리간드의 발현을 위한 glpT-돌연변이된 숙주 및 희귀 코돈 tRNA's로서 사용하였다. 43E7 또는 43F6의 적격한 세포를 제조하고, 표준 과정을 이용하여 pAPApo2-P2RU로 형질전환시켰다. 20 ㎍/ml 테트라사이클린 (LB + Tet20)을 함유하는 LB 판으로부터 형질전환체를 골라 내고, 스트리크-정제한 다음, 30℃ 진탕기/항온 배양기에서 20 ㎍/ml 테트라사이클린을 수반한 LB 육즙에서 성장시킨 후, -80℃ 하에 DMSO에서 저장하였다.

Apo2L 생산을 위한 발효 공정:

신선하게 해동된 원액 배양 바이알에 4 내지 6 mM 인산나트륨을 함유하는 멸 균성 LB 배지를 접종함으로써 진탕-플라스크 접종물을 제조하였다. 적당한 항생제를 상기 배지에 포함시켜 플라스미드를 유지시키기 위한 선택적인 압력을 제공하였다. 플라스크 배양물을 14 내지 18시간 동안 약 30℃ (28 내지 32℃)에서 진탕시키면서 항온 배양하였다. 그 다음, 이 배양물을 생산 발효 용기에 접종하는데 사용하였다. 접종 용적은 배지 초기 용적의 0.1％ 내지 10％였다.

표 1에 제시된 생산 배지에서 Apo2L의 생산을 수행하여 대략 10 리터의 최종 배양 용적을 달성하였다. 발효 공정은 약 30℃ (28 내지 32℃) 및 대략 7.0 (6.5 내지 7.5)로 제어된 pH 하에서 수행하였다. 산소가 배양물에 적당한 수준으로 전달되도록 통기 속도와 진탕 속도를 설정하였다. (대략 75-85 OD에서) 배치된 인산염을 고갈시키기 직전에, DL-알파-글리세로포스페이트 공급 (판매자 생성물 명세서에는 생성물 순도가 80 내지 90％이고, 베타-글리세로포스페이트가 주요 불순물로서 열거되었다)을 개시하고, 목적하는 공급 속도로 공급하였다. 발효 공정 전반에 걸쳐, 호기성 조건을 보장하면서 컴퓨터 알고리즘에 기초하여 주요 탄소원으로서 글루코스를 세포 배양물에 공급하였다.

발효 공정 동안 대략 50 내지 150 μM (최종 농도) ZnS0₄의 2가지 배치 부가물을 만들었는데, 하나는 생성물 발현을 유도시키기 직전에 만들었고, 다른 하나는 동종-삼량체 어셈블리를 개선시키기 위해 생산 기간의 대략 중간 시점에서 만들었다. 본 실시예에서는, 약 80 내지 120 OD₅₅₀의 배양물 광밀도와 접종 후 약 28 시간째에 부가물을 만들었다.

발효를 약 34 내지 45시간 동안 진행시킨 후에 수거하였다.

^a이들 성분의 일부는 발효 동안 배양물에 공급될 수 있다. pH 제어를 위해 요구되는 양의 수산화암모늄을 부가하였다.

이온 교환 HPLC 크로마토그래피 방법에 의한 발효 공정 동안의 가용성 생성물 축적에 관한 평가:

발효 공정의 일정 시간에 경과함에 따라 육즙 샘플을 취하였다. 20 OD₅₅₀의 세포 밀도로 희석시킨 육즙 샘플 1 밀리리터로부터의 샘플을 원심분리시킴으로써 수집하고, 이로써 생성된 세포 펠릿을 분석할 때까지 -20℃ 하에 저장하였다. 이러한 세포 펠릿을 해동시키고, 0.5 ml의 추출용 완충액 (50 mM HEPES, pH 8.0, 50 mM EDTA 및 0.2 mg/ml 암탉 난백 리소자임)에 재현탁시키며, 기계적으로 붕괴시켜 생성물을 세포질로부터 방출시켰다. 원심분리시킴으로써 고형물을 세포 용해물로부터 제거한 후, 정화된 용해물을 HPLC 칼럼 (DIONEX PROPAC™ IEX 배지) 상으로 부하하여 삼량체를 정량화하였다. HPLC 검정 방법은, 0.5 ml/분의 유속으로 25분에 걸쳐 25-mM 인산염 (pH 7.5) 완충액 중의 5 내지 22％ 구배의 1 M NaCl을 사용함으로써 생성물이 오염성 이. 콜라이 단백질로부터 벗어나게 용해시켰다.

역상 HPLC 크로마토그래피에 의한 발효 공정 동안의 총 단량체성 Apo2L 발현에 관한 평가:

신선한 배양 육즙 또는 기존에 동결시킨 다음 해동시킨 샘플을 대상으로 하여 총 단량체 생성을 정량화하였다. 20 ㎕의 샘플을, 100 mM DTT를 수반한 480 ㎕의 6 M 구아니딘 HC1, pH 9.0 내로 혼합하고, 실온에서 1시간 동안 항온 배양한 후, 15분 동안 13,000 rpm으로 원심분리시켜 추출물을 회수하였다. 이 추출물을 스핀-필터 내로 여과시킨 다음, 20 ㎕을 HPLC 칼럼 (PerSeptive Biosystems PORO^® R1/10 배지) 상으로 부하하여 역상 크로마토그래하였다. 1.0 ml/분으로 유동하고 0.1％ TFA를 수반한 28％ 내지 35％의 아세토니트릴 구배를 20분에 걸쳐 이용하는 이동 상을 사용하여 80℃에서 HPLC 분리를 수행함으로써, Apo2L을 오염성 단백질로부터 멀리 떨어뜨려 분석하였다. 피크는 280 nm 파장에서 탐지되었다. 동일한 방법에 의해 분석한 5 내지 25 ㎍의 정제된 표준물과 연합된 피크하 면적으로부터 유래된 평균 반응 인자 (mAU/㎍)를 사용하여, 샘플 내에 존재하는 단량체의 양을 계산하였다.

결과:

도 7은 △glpT 숙주 (43F6)에 대한 최적의 G3P 공급 속도를 이용한 경우에 특이적 생성물 역가 [그래프에서 특이적 역가 (㎍/OD-ml)로서 지칭됨]가 개선되었다는 것을 나타낸다. G3P가 공급된 수행물 모두는, 공급물을 부가하지 않은 대조군 보다 더 우수하게 수행되었다. 본 실시예에서는, 대략 8 리터 배양물에 대한 공급 속도가 6에서 12 mmol/시간으로 상승함에 따라, 특이적 생성물 역가도 개선되었지만, 공급 속도가 12 mmol/시간 내지 18 mmol/시간 이상으로 상승하면, 오히려 특이적 생성물 역가가 낮아졌다. G3P의 최적의 공급 속도는 생성물, 유기 인산염의 유형 등에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 이들 특정한 조건 하에서 이러한 특이적 생성물, 즉 Apo2L을 생성하기 위해 10-리터 발효기에서 세포를 배양하는 경우에는, 바람직한 G3P 공급 속도가 대략 8 내지 10 리터 당 바람직하게는 약 4 내지 17 mmol/시간, 보다 바람직하게는 약 6 내지 16 mmol/시간, 보다 더 바람직하게는 약 8 내지 15 mmol/시간, 가장 바람직하게는 약 10 내지 14 mmol/시간이다.

도 8은 야생형 glpT 숙주 (43E7)에 무기 인산염을 공급하는 것에 비해 G3P를 공급하는 것이 특이적 생성물 역가 [그래프에서 특이적 총 축적치 (㎍/OD-ml)로서 지칭됨]를 개선시켰다는 것을 나타낸다. 글리세로포스페이트 공급이 Apo2L의 특이적 총 축적치를 증가시켰지만, 무기 인산염을 공급하는 것은, 공급물을 부가하지 않은 대조군에 비해 특이적 총 축적치에 불리한 영향을 미쳤다. 이용된 것 보다 더 낮은 양의 글리세로포스페이트를 공급한 경우에도 유사한 성향이 예상될 것이다. 이러한 결과는 글리세로포스페이트를 야생형 glpT 숙주에 공급함으로써 고 수준의 발현을 수득할 수 있다는 것을 나타내거나 나타내고자 한 것이다. 추가로, 상기 특정한 실험에서 무기 인산염 공급 경우와 유사하게, 글리세로포스페이트를 공급한 경우에는 배양물 세포 밀도가 200 OD550 이상으로 증가하였는데, 공급물을 부가하지 않은 상황 하에서는 그렇치 못하였다.

실시예 4

활성 성장기 동안 AP 프로모터-구동된 Apo2L 생성물의 발현

인산염 배칭과 G3P 부가를 제외하고는, 실시예 3에 기재된 바와 동일한 플라스미드 구축, 생산 숙주 균주, 배지 조성, 발효 공정 및 생성물 검정 방법을 사용하였다. 대조군 공정에서 염 배칭에 전형적으로 포함되는 무기 인산염의 일부를, 접종 직후에 부가하거나 배치된 무기 인산염이 고갈되기 수 시간 전에 등 몰수의 G3P로 대체시켰다. 이들 예에서는 부가된 G3P가, 이러한 부가 공정의 후속으로 상당 부분의 세포 성장을 달성하기 위한 인산염의 공급원인 것으로 예상되었다.

활성 성장기 동안 Apo2L를 생산시키기 위한 발효 공정:

접종물 제조 프로토콜은 실시예 3에 기재된 바와 동일하였다. 75％ 또는 50％의 인산염을 초기 배칭으로부터 제거하고, 접종 후 배치 부가물로서 다시 부가된 등 몰수의 G3P로 대체시키는 것을 제외하고는, 표 1에 제시된 생산 배지에서 Apo2L 생산 과정을 수행하였다. 표준 프로토콜에 따라서 발효를 약 30℃ (28 내지 32℃) 및 대략 7.0 (6.5 내지 7.5)로 제어된 pH 하에서 수행하였다. 통기 속도와 진탕 속도는 실시예 3에 기재된 바와 같았다. 무기 인산염의 50％를 G3P로 대체시킨 경우에는, 배치시킨 인산염이 소모 (대략 30 내지 40 OD₅₅₀)될 것으로 예상되기 대략 1 내지 2시간 전에 글리세롤-3-포스페이트로 대체시키면서 배지 멸균화에 앞서 무기 인산염을 배칭시켰다. 무기 인산염의 75％를 G3P로 대체시킨 경우에는, 무기 인산염과 G3P 둘 다를 발효기에 접종한 직후에 가하였다. 발효 공정 전반에 걸쳐, 호기성 조건을 보장하면서 컴퓨터 알고리즘에 기초하여 주요 탄소원으로서 글루코스를 세포 배양물에 공급하였다. 앞서 섹션에 기재된 바와 같이 발효 공정 동안 Zn 부가물을 만들었다. 발효는 약 34 내지 45시간 동안 진행하였다.

결과:

도 9는 PO₄ 배칭의 50％ 내지 75％를 야생형 숙주와 glpT-돌연변이된 숙주 둘 다에 대해 G3P 부가물로 대체시킨 경우에, 이종 단백질 발현이 활성 성장기에서 상당히 초기에 유도되어, 특이적 총 축적 곡선이 G3P 치환물을 전혀 수반하지 않은 야생형 숙주를 이용하여 수행한 이중 대조군 경우에 대한 것의 좌측으로 이동하였다는 것을 나타낸다. 이는 발효 공정의 보다 초기에 생성물을 수득할 수 있다는 점에서 본 발명의 이점을 지시해준다.

본원에서 시험된 모든 Pi 대 G3P 비가 숙주 유형에 상관없이 상기 이점을 달성시켜 주었지만, 표 2는 glpT-돌연변이된 숙주 43F6에 대해 1:1 또는 1:3의 Pi 대 G3P 비를 사용하면, 가장 높은 체적 Apo2L 생산성 (대조군 숙주에 대한 평균 약 0.24 mg/ml-hr에 비해 평균 약 0.34 mg/ml-hr)이 달성되었다는 것을 보여준다. 추가로, 어느 한 비율과 야생형 또는 돌연변이된 숙주를 사용하면, 피크 특이적 축적치 (㎍/OD-ml)가 보다 초기에 (28 내지 30시간에 비해 22 내지 26시간) 달성되었다. 이는 특정의 바람직한 양태에서는, 본 발명이 유사한 (보다 높지 않을 경우) 양의 단량체성 Apo2L을 그 밖의 다른 것 보다 대략 10 내지 25％ 이른 발효 시간 내에 생성시켜 공정 생산성을 상당히 개선시킬 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 5

알파-글리세로포스페이트와 베타-글리세로포스페이트의 50/50 혼합물을 이용한 AP 프로모터-구동된 Apo2L 생성물의 발현

균주 61G1 (glpT 돌연변이체 숙주)를 사용하여 공급물로서 G3P 대신 보다 저렴한 등급의 대략 50:50의 알파-글리세로포스페이트와 베타-글리세로포스페이트의 혼합물을 이용하는 것을 제외하고는, 실시예 3에 기재된 바와 유사한 과정을 수행하였다.

결과:

도 10은 상기 혼합물 또는 보다 높은 등급의 G3P 재료를 이용하는 경우에는, 공급물을 부가하지 않은 대조군에 비해 유사한 수율 개선이 달성되었다는 것을 보여준다. 상기 알파/베타 혼합물을 사용하는 것이, 생산 결과를 손상시키지 않고서도 원료 단가를 줄일 수 있을 것이다.

<110> Genentech et al. <120> PROCESS FOR PRODUCING POLYPEPTIDES <130> P2019R1PCT <140> PCT/US2005/007880 <141> 2005-03-10 <150> US 60/552,678 <151> 2004-03-11 <160> 7 <210> 1 <211> 1042 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Unsure <222> 447 <223> Unknown base <400> 1 tttcctcact gactataaaa gaatagagaa ggaagggctt cagtgaccgg 50 ctgcctggct gacttacagc agtcagactc tgacaggatc atggctatga 100 tggaggtcca ggggggaccc agcctgggac agacctgcgt gctgatcgtg 150 atcttcacag tgctcctgca gtctctctgt gtggctgtaa cttacgtgta 200 ctttaccaac gagctgaagc agatgcagga caagtactcc aaaagtggca 250 ttgcttgttt cttaaaagaa gatgacagtt attgggaccc caatgacgaa 300 gagagtatga acagcccctg ctggcaagtc aagtggcaac tccgtcagct 350 cgttagaaag atgattttga gaacctctga ggaaaccatt tctacagttc 400 aagaaaagca acaaaatatt tctcccctag tgagagaaag aggtccncag 450 agagtagcag ctcacataac tgggaccaga ggaagaagca acacattgtc 500 ttctccaaac tccaagaatg aaaaggctct gggccgcaaa ataaactcct 550 gggaatcatc aaggagtggg cattcattcc tgagcaactt gcacttgagg 600 aatggtgaac tggtcatcca tgaaaaaggg ttttactaca tctattccca 650 aacatacttt cgatttcagg aggaaataaa agaaaacaca aagaacgaca 700 aacaaatggt ccaatatatt tacaaataca caagttatcc tgaccctata 750 ttgttgatga aaagtgctag aaatagttgt tggtctaaag atgcagaata 800 tggactctat tccatctatc aagggggaat atttgagctt aaggaaaatg 850 acagaatttt tgtttctgta acaaatgagc acttgataga catggaccat 900 gaagccagtt ttttcggggc ctttttagtt ggctaactga cctggaaaga 950 aaaagcaata acctcaaagt gactattcag ttttcaggat gatacactat 1000 gaagatgttt caaaaaatct gaccaaaaca aacaaacaga aa 1042 <210> 2 <211> 281 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr 1 5 10 15 Cys Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys 20 25 30 Val Ala Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met 35 40 45 Gln Asp Lys Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu 50 55 60 Asp Asp Ser Tyr Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser 65 70 75 Pro Cys Trp Gln Val Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys 80 85 90 Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu 95 100 105 Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln 110 115 120 Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr 125 130 135 Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys 140 145 150 Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser 155 160 165 Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Gly Lys Gly 170 175 180 Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu 185 190 195 Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile 200 205 210 Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser 215 220 225 Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr 230 235 240 Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg 245 250 255 Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His 260 265 270 Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly 275 280 <210> 3 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <220> <221> Unsure <222> 25-26,28-29,31-32,34-35,37-38,40-41,43-44,46-47,49-50,52-53,55-56,58-59,61-62,64-65,67-68,70-71,73-74 <223> Unknown base <400> 3 gccgtctata cttgtggtgc tggtnnsnns nnsnnsnnsn nsnnsnnsnn 50 snnsnnsnns nnsnnsnnsn nsnnstgggg tcagggt 87 <210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 4 Arg Ile Gly Arg Ser Val Phe Asn Leu Arg Arg Glu Ser Trp Val 1 5 10 15 Thr Trp <210> 5 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 5 gatgttcagt tgcaggaatc aggcggtggc ttggtacagg ccggaggttc 50 gttgcgtttg tcctgtgctg cctcgggtgc tactggttct acttatgata 100 tgggctggtt tcgtcaggct ccgggtaaag aacgtgaatc ggttgccgcc 150 attaactggg ggtcggctgg gacttactat gcttcgtccg tccgtggtcg 200 ttttactatt tcacgtgata atgccaaaaa aactgtctat ttgcagatga 250 attcattgaa accagaagat actgccgtct atacttgtgg tgctggtagg 300 atcggccggt cggtcttcaa cttgaggagg gagagctggg tcacgtggtg 350 gggtcagggt acccaggtca ctgtctcctc tgccggtggt atggattata 400 aagatgatga tgataaa 417 <210> 6 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 6 gcttgctaca tatggtgaga gaaagaggtc ctcagaga 38 <210> 7 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Sequence is synthesized <400> 7 cttgaatagg atccctatta gccaactaaa aaggccccaa aaaaactggc 50

Claims

(a) 당 포스페이트 또는 글리세로포스페이트인 수송가능한 유기 인산염이 공급되는 배양 배지에서 이. 콜라이에 대해 이종인 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 포함하는 이. 콜라이 세포를 배양하여 상기 핵산이 발현되도록 하는 단계; 및

(b) 상기 폴리펩티드를 상기 세포로부터 회수하여 폴리펩티드의 수율이 증가하도록 하는 단계

를 포함하며, 무기 인산염이 상기 배양 단계 동안 배양 배지에 첨가되는 것인, 이. 콜라이에 대하여 이종인 폴리펩티드를 그의 수율을 증가시키면서 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 유기 인산염이 글리세로포스페이트인 방법.
제2항에 있어서, 글리세로포스페이트가 알파-글리세로포스페이트 또는 베타-글리세로포스페이트, 또는 이들의 혼합물인 방법.
제3항에 있어서, 글리세로포스페이트가 글리세롤-2-포스페이트와 글리세롤-3-포스페이트의 혼합물이거나, 또는 글리세롤-3-포스페이트인 방법.
제1항에 있어서, 배양이 진탕 플라스크 또는 발효기에서 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 세포의 세포질, 주변세포질 또는 배양 배지로부터 회수되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 핵산의 발현이 유도성 프로모터에 의해 조절되는 것인 방법.
제7항에 있어서, 유도성 프로모터가 알칼리성 포스파타제 프로모터인 방법.
제7항에 있어서, 유도성 프로모터가 tac 프로모터인 방법.
제7항에 있어서, 유도성 프로모터가 T7 프로모터인 방법.
제7항에 있어서, 핵산의 발현이 배양 단계의 활성 성장기 동안에 시작되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 이. 콜라이에 염색체성 phoA가 결여된 것인 방법.
제1항에 있어서, 이. 콜라이의 염색체성 glpT가 야생형인 방법.
제1항에 있어서, 이. 콜라이에 염색체성 glpT가 결여된 것인 방법.
제1항에 있어서, 이. 콜라이에 염색체성 phoA 및 glpT가 결여된 것인 방법.
제15항에 있어서, 이. 콜라이에 염색체성 ugp가 결여되지 않은 것인 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 진핵성 폴리펩티드인 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 포유류 폴리펩티드인 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 인슐린-유사 성장 인자-1인 방법.
제19항에 있어서, 유기 인산염의 공급 속도가 8 내지 10 리터 당 1 내지 7 mmol/시간이고, 배양이 10-리터 발효기에서 수행되는 것인 방법.
제20항에 있어서, 유기 인산염의 공급 속도가 8 내지 10 리터 당 2 내지 6 mmol/시간인 방법.
제21항에 있어서, 유기 인산염의 공급 속도가 8 내지 10 리터 당 3 내지 4 mmol/시간인 방법.
제1항에 있어서, 첨가된 무기 인산염 대 유기 인산염의 비율이 1:10 내지 1:0.25의 범위인 방법.
제1항에 있어서, 유기 인산염이 헥소스-6-포스페이트인 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드가 Apo2L인 방법.
제25항에 있어서, 유기 인산염의 공급 속도가 8 내지 10 리터 당 4 내지 17 mmol/시간이고, 배양이 10-리터 발효기에서 수행되는 것인 방법.
제26항에 있어서, 공급 속도가 8 내지 10 리터 당 6 내지 16 mmol/시간인 방법.
제27항에 있어서, 공급 속도가 8 내지 10 리터 당 8 내지 15 mmol/시간인 방법.
제28항에 있어서, 공급 속도가 8 내지 10 리터 당 10 내지 14 mmol/시간인 방법.
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