BR112012016807B1 - cepa de hospedeiro bacteriano que compreende um gene spr mutante e um gene tsp do tipo selvagem - Google Patents
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Abstract
cepa de hospedeiro bacteriano que compreende um gene spr mutante e um gene tsp do tipo selvagem. a presente invenção proporciona uma célula bacteriana gram negativa recombinante que compreende um gene spr mutante que codifica uma proteína spr mutante e em que a célula compreende um gene tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante.
Description
“CEPA DE HOSPEDEIRO BACTERIANO QUE COMPREENDE UM GENE SPR MUTANTE E UM GENE TSP DO TIPO SELVAGEM” [0001] A invenção diz respeito a uma cepa de hospedeiro bacteriano recombinante, particularmente da E. coli. A invenção diz respeito ainda a um método para produção de uma proteína de interesse nessa célula.
Antecedentes da Invenção [0002] Células bacterianas, tais como E. coli, são comumente utilizadas para produzir proteínas recombinantes. Existem muitas vantagens para o uso de células bacterianas, tais como a E. coli, para a produção de proteínas recombinantes, particularmente devido à natureza versátil das células bacterianas como células hospedeiras que habilitam a inserção do gene através de plasmídeos. A E. coli tem sido utilizada na produção de diversas proteínas recombinantes, inclusive da insulina humana.
[0003] A despeito das muitas vantagens do uso de células bacterianas para a produção de proteínas recombinantes, ainda existem limitações significativas, incluindo-se a tendência à lise das células bacterianas durante a expressão de uma proteína recombinante de interesse. Esse fenótipo de lise pode ser observado em células bacterianas do tipo selvagem e também na célula geneticamente manipulada, tais como as células deficientes em proteases bacterianas. As proteases desempenham um papel importante na renovação (turnover) de proteínas velhas, danificadas ou dobradas incorretamente no periplasma e citoplasma de E. coli. As proteases bacterianas agem para degradar a proteína recombinante de interesse, e dessa maneira, com frequência reduzem de forma significativa o rendimento da proteína ativa. Portanto, é desejável que se reduza a atividade da protease para que a proteólise das proteínas de interesse seja diminuída. No entanto, cepas bacterianas carentes de proteases, tais como Tsp (também denominada Prc), também exibem lise celular.
[0004] A Tsp (também denominada Prc) é uma protease periplasmática 60kDa. A redução da atividade da Tsp (prc) é desejável para que a proteólise das proteínas de interesse seja reduzida. No entanto, constatou-se que as células carentes da
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2/75 protease prc mostram crescimento termossensível em baixa osmolaridade. Hara et al isolou cepas deficientes em Tsp que eram revertentes termorresistentes e que continham mutações supressoras extragênicas (spr) (Hara et al., Microbial Drug Resistência, 2: 63-72 (1996)). A spr é uma protease periplasmática de ligação da membrana de 18kDa e os substratos de spr são Tsp e peptidoglicanos na membrana externa envolvidos na hidrólise da parede celular durante a divisão celular. O gene spr é designado UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4 (SPR_ECOLI). Cepas bacterianas deficientes em protease portadoras de um gene spr mutante foram descritas em Chen et al (Chen C, Snedecor B, Nishihara JC, Joly JC, McFarland N, Andersen DC, Battersby JE, Champion KM. Biotechnol Bioeng. março de 2004 5;85(5):463-74) que descreve a construção de cepas de E. coli portadoras de diferentes combinações de mutações na prc (Tsp) e outra protease, DegP, criada pela amplificação das regiões a montante e a jusante do gene e unindo-as em um vetor que compreende marcadores de seleção e uma mutação sprW174R.
[0005] Foi surpreendente a constatação de que uma célula bacteriana gram negativa portadora de um gene spr mutante e de um gene Tsp do tipo selvagem proporciona uma célula com característica de lise reduzida. Por conseguinte, os presentes inventores forneceram uma nova cepa que exibe propriedades vantajosas para a produção de uma proteína de interesse.
[0006] Surpreendentemente as células de acordo com a presente invenção mostram fenótipo de rendimento de proteína e crescimento vantajoso pelo fato de que spr e Tsp são conhecidos como supressores mútuos e, portanto, seria possível prever que, se uma delas dominar, a célula pode exibir um fenótipo de baixo crescimento, por exemplo, tornar-se permeável ou mostrar maior propensão à lise celular. No entanto, as células da presente invenção exibiram uma redução significativa do fenótipo de lise celular em comparação às células do tipo selvagem e às células que compreendem um gene Tsp mutado inativado.
Sumário da Invenção [0007] A presente invenção proporciona uma célula bacteriana gram negativa recombinante que compreende um gene spr mutante que codifica uma proteína spr
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3/75 mutante e em que a célula compreende um gene Tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante.
[0008] Em uma modalidade, o genoma da célula de acordo com a presente invenção é Isogênico ao genoma de uma célula bacteriana do tipo selvagem, salvo pelo gene spr mutado.
[0009] As células fornecidas pela presente invenção mostram fenótipos de produção de proteína e crescimento vantajoso.
[0010] A presente invenção fornece ainda um método para produzir uma proteína recombinante de interesse que compreende expressar a proteína recombinante de interesse em uma célula bacteriana gram negativa recombinante como definido acima.
Breve Descrição dos Desenhos [0011] A Figura 1 mostra o crescimento de MXE012 e MXE017 em comparação a W3110 e MXE001 do tipo selvagem.
[0012] A Figura 2 mostra a expressão de Fab’ anti-TNFa em MXE012 e MXE017 em comparação a W3110 e MXE001 do tipo selvagem.
[0013] A Figura 3 mostra o perfil de crescimento de W3110 e MXE012 durante uma fermentação que produz Fab’ anti-TNFa.
[0014] A Figura 4 mostra acúmulo de Fab’ anti-TNFa periplasmático (símbolos e linhas cheias) e o acúmulo de Fab’ no meio (linhas pontilhadas e símbolos abertos) para W3110 e MXE012 (W3110 spr H119A) durante uma fermentação que produz Fab’ anti-TNFa.
[0015] A Figura 5 mostra o perfil de crescimento das cepas W3110 e MXE012 que expressam Fab’ anti-TNFa e das cepas W3110 e MXE012 que expressam DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[0016] A Figura 6 mostra o rendimento do Fab’ anti-TNFa do periplasma (símbolos sombreados) e sobrenadante (símbolos não sombreados abertos) das cepas W3110 e MXE012 que expressam Fab’ anti-TNFa e das cepas W3110 e MXE012 que expressam DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[0017] A Figura 7 mostra os resultados de um ensaio de dsDNA das cepas
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W3110, ΜΧΕ001, ΜΧΕ008 e ΜΧΕ012.
[0018] A Figura 8 mostra os resultados de um ensaio de proteína das cepas W3110, MXE001, MXE008 e MXE012.
[0019] A Figura 9a mostra o terminal 5’ da proteína ptr do tipo selvagem (protease III) e ptr mutada inativada (protease III) e sequências gênicas.
[0020] A Figura 9b mostra o terminal 5’ da proteína Tsp do tipo selvagem e Tsp mutada inativada e sequências gênicas.
[0021] A Figura 9c mostra uma região da proteína DegP do tipo selvagem e proteína DegP mutada e sequências gênicas.
[0022] A Figura 10 mostra a construção de um vetor para uso na produção de uma célula de acordo com uma modalidade da presente invenção.
[0023] A Figura 11 mostra os perfis de crescimento de 200L de fermentações da cepa MXE012 que expressa a DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[0024] A Figura 12 mostra os títulos de Fab’ anti-TNFa de 200L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[0025] A Figura 13 mostra as viabilidades de 200L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[0026] A Figura 14 mostra os perfis de crescimento de 3000L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[0027] A Figura 15 mostra os títulos de Fab’ anti-TNFa de 3000L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa. Breve Descrição das Sequências [0028] ID de SEQ N°:1 é a sequência de DNA do gene Tsp do tipo selvagem que inclui os 6 nucleotídeos ATGAAC a montante do códon de iniciação.
[0029] ID de SEQ N°:2 é a sequência de aminoácido da proteína Tsp do tipo selvagem.
[0030] ID de SEQ N°:3 é a sequência de DNA de um gene Tsp inativado do tipo selvagem que inclui os 6 nucleotídeos ATGAAT a montante do códon de iniciação.
[0031] ID de SEQ N°:4 é a sequência de DNA do gene da protease III do tipo selvagem.
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5/75 [0032] ID de SEQ N°:5 é a sequência de aminoácido da proteína Protease III do tipo selvagem.
[0033] ID de SEQ N°:6 é a sequência de DNA de um gene da Protease III de inativado mutado.
[0034] ID de SEQ N°:7 é a sequência de DNA do gene DegP do tipo selvagem. [0035] ID de SEQ N°:8 é a sequência de aminoácido da proteína DegP do tipo selvagem.
[0036] ID de SEQ N°:9 é a sequência de DNA de um gene DegP mutado.
[0037] ID de SEQ N°:10 é a sequência de aminoácido de uma proteína DegP mutada.
[0038] ID de SEQ N°: 11 é a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de um anticorpo anti-TNF.
[0039] ID de SEQ N°:12 é a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de um anticorpo anti-TNF.
[0040] ID de SEQ N°:13 é a sequência de aminoácido da cadeia leve de um anticorpo anti-TNF.
[0041] ID de SEQ N°:14 é a sequência de aminoácido da cadeia pesada de um anticorpo anti-TNF.
[0042] ID de SEQ N°: 15 é a sequência do iniciador do oligonucleotídeo 3’ para a região do gene Tsp mutado que compreende o sítio de restrição Ase I.
[0043] ID de SEQ N°: 16 é a sequência do iniciador do oligonucleotídeo 5’ para a região do gene Tsp mutado que compreende o sítio de restrição Ase I.
[0044] ID de SEQ N°: 17 é a sequência do iniciador do oligonucleotídeo 3’ para a região do gene da Protease III mutada que compreende o sítio de restrição Ase I.
[0045] ID de SEQ N°: 18 é a sequência do iniciador do oligonucleotídeo 5’ para a região do gene da Protease III mutada que compreende o sítio de restrição Ase I.
[0046] ID de SEQ N°: 19 é a sequência do iniciador do oligonucleotídeo 5’ para a região do gene DegP mutado que compreende o sítio de restrição Ase I.
[0047] ID de SEQ N°: 20 é a sequência do iniciador do oligonucleotídeo 3’ para a região do gene DegP mutado que compreende o sítio de restrição Ase I.
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6/75 [0048] ID de SEQ N°: 21 é a sequência do gene spr do tipo selvagem que inclui a sequência de sinal que é os primeiros 26 resíduos de aminoácidos.
[0049] ID de SEQ N°:22 é a sequência do gene spr não mutado sem a sequência de sinal.
[0050] ID de SEQ N°: 23 é a sequência de nucleotídeo de uma sequência OmpT mutada que compreende as mutações D210A e H212A.
[0051] ID de SEQ N°: 24 é a sequência de aminoácido de uma sequência OmpT mutada que compreende as mutações D210A e H212A.
[0052] ID de SEQ N°: 25 é a sequência de nucleotídeo de uma sequência OmpT mutada inativada.
[0053] ID de SEQ N°: 26 é a sequência de nucleotídeo de DsbC com cauda de histidina.
[0054] ID de SEQ N°: 27 é a sequência de aminoácido de DsbC com cauda de histidina.
[0055] ID de SEQ N°: 28 mostra a sequência de aminoácido de CDRH1 de hTNF40.
[0056] ID de SEQ N°: 29 mostra a sequência de aminoácido de CDRH2 de hTNF40 que é uma CDR híbrida em que os seis aminoácidos do terminal-C são da sequência CDR H2 de um anticorpo da linhagem germinativa do subgrupo 3 humano e as alterações do aminoácido na sequência resultante dessa hibridização são sublinhados da seguinte forma: WINTYIGEPI YADSVKG.
[0057] | ID | de | SEQ | N°: | 30 | mostra | a | sequência | de | aminoácido | de | CDRH3 | de |
hTNF40. | |||||||||||||
[0058] | ID | de | SEQ | N°: | 31 | mostra | a | sequência | de | aminoácido | de | CDRL1 | de |
hTNF40. | |||||||||||||
[0059] | ID | de | SEQ | N°: | 32 | mostra | a | sequência | de | aminoácido | de | CDRL2 | de |
hTNF40. | |||||||||||||
[0060] | ID | de | SEQ | N°: | 33 | mostra | a | sequência | de | aminoácido | de | CDRL3 | de |
hTNF40. | |||||||||||||
[0061] | ID | de | SEQ | N°: | 34 | mostra | a | sequência | de | aminoácido | de | CDRH2 | de |
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7/75 hTNF40.
[0062] ID de SEQ N°: 35 mostra a sequência do adaptador do oligonucleotídeo de OmpA.
[0063] ID de SEQ N°: 36 mostra o cassete do oligonucleotídeo que codifica a sequência intergênica 1 (IGS1) para a expressão de Fab de E. coli.
[0064] ID de SEQ N°: 37 mostra o cassete do oligonucleotídeo que codifica a sequência intergênica 2 (IGS2) para a expressão de Fab de E. coli.
[0065] ID de SEQ N°: 38 mostra o cassete do oligonucleotídeo que codifica a sequência intergênica 3 (IGS3) para a expressão de Fab de E. coli.
[0066] ID de SEQ N°: 39 mostra o cassete do oligonucleotídeo que codifica a sequência intergênica 4 (IGS4) para a expressão de Fab de E. coli.
Descrição Detalhada das Modalidades Preferenciais da Invenção [0067] A presente invenção proporciona uma célula bacteriana gram negativa recombinante adequada para a expressão de uma proteína de interesse que compreende um gene spr mutado e um gene Tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante.
[0068] Constatou-se surpreendentemente que as células portadoras de um spr mutado e de um Tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante exibem crescimento celular aumentado e exibem fenótipo de lise celular reduzida em comparação a uma célula do tipo selvagem ou a uma célula que compreende um gene Tsp mutado.
[0069] Ademais, em uma modalidade, as células portadoras de um Tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante e de um spr mutante exibem maior rendimento de uma proteína recombinante de interesse em comparação a uma célula bacteriana do tipo selvagem ou uma célula que compreende um gene Tsp mutado. O aumento de rendimento da proteína aumentado pode ser do rendimento da proteína periplasmática e/ou do rendimento da proteína do sobrenadante. Em uma modalidade, as células da presente invenção mostram maior rendimento da proteína periplasmática em comparação a uma célula do tipo selvagem devido à reduzida permeabilidade da célula. As células bacterianas
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8/75 recombinantes são capazes da expressão prolongada de uma proteína recombinante de interesse devido à lise celular reduzida.
[0070] As células de acordo com a presente invenção expressam preferencialmente um rendimento máximo no periplasma e/ou meio de aproximadamente 1 ,Og/L, 1,5g/L, 1,8g/L, 2,0g/L, 2,4g/L, 2,5g/L, 3,0g/L, 3,5g/L ou 4,0g/L de uma proteína de interesse.
[0071] Uma desvantagem associada às cepas geneticamente manipuladas conhecidas, tais como as cepas bacterianas deficientes em protease, previamente criadas e utilizadas para expressar proteínas recombinantes envolve o uso de mutações dos genes envolvidos no metabolismo celular e replicação de DNA, tais como, por exemplo, phoA, fhuA, lac, rec, gal,ara, arg, thi e pro nas cepas de E. coli. Essas mutações podem exercer diversos efeitos nocivos sobre a célula do hospedeiro, o que inclui efeitos sobre o crescimento celular, estabilidade, rendimento da expressão da proteína recombinante e toxidez. Cepas dotadas de uma ou mais dessas mutações genômicas, em particular as cepas que tem um número elevado dessas mutações, podem exibir uma perda de adequação que reduz a taxa de crescimento bacteriano a um nível inadequado para a produção industrial de proteína. Ademais, qualquer uma das mutações genômicas acima pode afetar outros genes em cis e/ou trans de maneiras imprevisivelmente danosas, com isso alterando o fenótipo da cepa, adequação e perfil de proteína. Além disso, o uso de células altamente mutadas em geral não é adequado à produção de proteínas recombinantes para uso comercial, particularmente terapêutico, pois essas cepas geralmente dispõem de vias metabólicas defeituosas e, portanto, podem crescer precariamente ou não crescer em meios definidos quimicamente ou mínimos.
[0072] Em uma modalidade preferencial da invenção, as células são portadoras somente de mutações mínimas no genoma requeridas para a introdução do mutante spr. Nesta modalidade, o genoma da célula bacteriana difere somente do genoma de uma célula bacteriana do tipo selvagem por uma ou mais mutações no gene spr e não são portadoras de quaisquer outras mutações que possam exercer efeitos nocivos sobre o crescimento da célula e/ou capacidade de expressar uma proteína
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9/75 de interesse. Por conseguinte, uma ou mais células hospedeiras recombinantes de acordo com a presente invenção podem exibir a expressão de proteína aprimorada e/ou características de crescimento aprimoradas em comparação às células que compreendem adicionalmente mutações manipuladas geneticamente na sequência genômica. As células fornecidas pela presente invenção também são mais adequadas para uso na produção de proteínas terapêuticas em comparação às células que adicionalmente compreendem rupturas no genoma celular.
[0073] A presente invenção fornece ainda uma célula bacteriana gram negativa recombinante que compreende um gene spr mutante que codifica uma proteína spr mutante, em que o genoma da célula é isogênico ao genoma de uma célula bacteriana do tipo selvagem, salvo pelo gene spr mutado. Neste aspecto da presente invenção, a célula é portadora de um gene Tsp do tipo selvagem. O gene Tsp cromossômico do tipo selvagem é preferencialmente um gene Tsp cromossômico não recombinante.
[0074] O indivíduo versado na técnica facilmente seria capaz de testar um clone de célula candidata para verificar se tem o rendimento desejado de uma proteína de interesse usando métodos consagrados na técnica, os quais incluem um método de fermentação, ELISA e hplc de proteína G. Métodos de fermentação adequados são descritos em Humphreys D P, et al. (1997). Formation of dimeric Fabs in E. coli: effect of hinge size and isotype, presence of interchain disulphide bond, Fab’ expression leveis, tail piece sequences and growth conditions. J. IMMUNOL. METH. 209: 193-202; Backlund E. Reeks D. Markland K. Weir N. Bowering L. Larsson G. Fedbatch design for periplasmic product retention in Escherichia coli, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Journal of Biotechnology. 135(4):358-65, 31 de julho de 2008; Champion KM. Nishihara JC. Joly JC. Arnott D. Similarity of the Escherichia coli proteome upon completion of different biopharmaceutical fermentation processes. [Journal Article] Proteomics. 1(9):1133-48, setembro de 2001; e Horn U. Strittmatter W. Krebber A. Knupfer U. Kujau M. Wenderoth R. Muller K. Matzku S. Pluckthun A. Riesenberg D. High volumetric yields of functional dimeric miniantibodies in Escherichia coli, using an optimized expression vector and highPetição 870190051974, de 03/06/2019, pág. 17/89
10/75 cell-density fermentation under non-limited growth conditions, Journal Article. Research Support, Non-U.S. Gov't Applied Microbiology & Biotechnology. 46(5-
6):524-32, dezembro de 1996. O indivíduo versado na técnica também facilmente seria capaz de testar a proteína secretada para verificar se a proteína está corretamente dobrada usando métodos consagrados na técnica, tais como os métodos de HPLC da proteína G, dicroismo circular, NMR, cristalografia de raios X e medição de afinidade de epítopo.
[0075] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a célula compreende adicionalmente um polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC. [0076] A presente invenção será descrita a partir de agora em mais profundidade.
[0077] Os termos “proteína” e “polipeptídeo” são aqui utilizados de modo intercambiável, salvo quando o contexto indicar o contrário. “Peptídeo” se refere a 10 ou menos aminoácidos.
[0078] O termo “polinucleotídeo” inclui um gene, DNA, cDNA, RNA, mRNA, etc., salvo quando o contexto indicar o contrário.
[0079] Conforme aqui utilizado, o termo “que compreende” no contexto do presente relatório descritivo deve ser interpretado como “que inclui”.
[0080] A célula não mutada ou célula de controle no contexto da presente invenção significa uma célula do mesmo tipo da célula gram negativa recombinante da invenção em que a célula não foi modificada para portar o gene spr mutante. Por exemplo, uma célula não mutada pode ser uma célula do tipo selvagem e pode ser derivada da mesma população de células hospedeiras que as células da invenção antes da modificação para a introdução de quaisquer mutações.
[0081] As expressões “célula”, “linhagem celular”, “cultura celular” e “cepa” são utilizadas de modo intercambiável.
[0082] A expressão “fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado” no contexto da presente invenção significa o fenótipo exibido por uma célula que abriga um gene Tsp mutante. Tipicamente, as células que compreendem um gene Tsp mutante podem realizar lise, especialmente em densidades celulares
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11/75 elevadas. A lise dessas células faz com que qualquer proteína recombinante escape para o sobrenadante. As células portadoras do gene Tsp mutado também podem mostrar crescimento termossensível em baixa osmolaridade. Por exemplo, as células não exibem ou exibem uma taxa de crescimento reduzida ou as células perecem em meio hipotônico em uma temperatura elevada, por exemplo, igual ou acima de 40°C.
[0083] O termo “isogênico” no contexto da presente invenção significa que o genoma da célula da presente invenção tem substancialmente a mesma ou a mesma sequência genômica em comparação à célula do tipo selvagem da qual a célula é derivada, exceto pelo gene spr mutado. Nesta modalidade o genoma da célula de acordo com a presente invenção não compreende outras mutações de ocorrência não natural ou mutações manipuladas geneticamente. Em uma modalidade, a célula de acordo com a presente invenção pode ter substancialmente a mesma sequência genômica que a célula do tipo selvagem, salvo pelo gene spr mutado, considerando quaisquer mutações de ocorrência natural que possam ocorrer. Em uma modalidade, a célula de acordo com a presente invenção pode ter exatamente a sequência genômica que a célula do tipo selvagem, salvo pelo gene spr mutado.
[0084] Na modalidade da presente invenção em que a célula compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC, o polinucleotídeo que codifica DsbC pode estar presente em um vetor de expressão adequado transformado na célula e/ou integrado ao genoma da célula hospedeira. Na modalidade em que o polinucleotídeo que codifica DsbC é inserido no genoma do hospedeiro, a célula da presente invenção também diferirá de uma célula do tipo selvagem devido à sequência do polinucleotídeo inserida que codifica DsbC. Preferencialmente o polinucleotídeo que codifica DsbC é em um vetor de expressão na célula, causando desse modo uma ruptura mínima no genoma da célula hospedeira.
[0085] O termo “tipo selvagem” no contexto da presente invenção significa uma cepa de uma célula bacteriana gram negativa na forma em que possa ocorrer na natureza ou que possa ser isolada do ambiente, que não porta quaisquer mutações
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12/75 manipuladas geneticamente. Um exemplo de uma cepa do tipo selvagem de E. coli é a W3110, tal como a cepa K-12 de W3110.
[0086] Qualquer bactéria gram negativa adequada pode ser utilizada como célula parental para produzir a célula recombinante da presente invenção. Bactérias gram negativas incluem Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens, Erwinia carotovora, Shigella, Klebsiella pneumoniae, Legionella pneumophila, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii e E. coli. Preferencialmente a célula parental é E. coli. qualquer cepa adequada de E. coli pode ser utilizada na presente invenção, mas preferencialmente uma cepa do tipo selvagem W3110 cepa, tal como a K-12 W3110, é utilizada.
[0087] Em uma modalidade preferencial, a célula é isogênica a uma célula de E. coli do tipo selvagem, tal como W3110, salvo pelo gene spr mutado.
[0088] Em uma modalidade, a célula da presente invenção compreende um polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse. Nesta modalidade, o polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse pode estar contido em um vetor de expressão adequado transformado na célula e/ou integrado ao genoma da célula hospedeira. Na modalidade em que o polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse é inserido no genoma do hospedeiro, o genoma da presente invenção também diferirá de uma célula do tipo selvagem devido à sequência inserida do polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse. Preferencialmente o polinucleotídeo é em um vetor de expressão na célula, causando desse modo uma ruptura mínima no genoma da célula hospedeira.
[0089] As células de acordo com a presente invenção portam um gene Tsp do tipo selvagem. Em um aspecto da presente invenção as células portam um gene Tsp cromossômico não recombinante do tipo selvagem. O gene Tsp cromossômico não recombinante do tipo selvagem se refere a um Gene Tsp cromossômico que não é construído, produzido ou inserido no cromossoma com o uso de tecnologia de DNA recombinante.
[0090] Conforme aqui utilizado, “gene Tsp” significa um gene que codifica a protease Tsp (também denominada Prc) que é uma protease periplasmática capaz
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13/75 de agir sobre a proteína 3 de ligação à penicilina (PBP3) e proteínas da cauda do fago. A sequência do gene Tsp do tipo selvagem é mostrada no ID de SEQ N°: 1 e a sequência da proteína Tsp do tipo selvagem é mostrada no ID de SEQ N°: 2.
[0091] A proteína spr é uma protease periplasmática de ligação da membrana de 18kDa e os substratos de spr são Tsp e peptidoglicanos na membrana externa envolvidos na hidrólise da parede celular durante a divisão celular.
[0092] A sequência de aminoácido do tipo selvagem da proteína spr é mostrada no ID de SEQ N°:21 com a sequência de sinal no terminal N e no ID de SEQ N°:22 sem a sequência de sinal de 26 aminoácidos (de acordo com o Número de Acesso UniProt P0AFV4). A numeração de aminoácido da sequência da proteína spr na presente invenção inclui a sequência de sinal. Por conseguinte, o aminoácido 1 da proteína spr é o primeiro aminoácido (Met) mostrado no ID de SEQ N°: 21.
[0093] O gene spr mutado é preferencialmente um gene spr cromossômico da célula.
[0094] O gene spr mutado codifica uma proteína spr capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado. As células portadoras do gene Tsp mutado podem ter uma boa taxa de crescimento celular, mas uma limitação dessas células é sua tendência à lise, especialmente em altas densidades celulares. Por conseguinte, o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado é uma tendência à lise, especialmente em altas densidades celulares. As células portadoras do gene Tsp mutado também mostram crescimento termossensível em baixa osmolaridade. No entanto, as mutações de spr que portam as células da presente invenção, quando introduzidas em uma célula portadora de um gene Tsp mutado suprimem o fenótipo de Tsp mutante e, portanto, a célula exibe lise reduzida, particularmente em uma alta densidade celular. O fenótipo de crescimento de uma célula pode ser facilmente medido por um indivíduo versado na técnica durante a técnica de frascos agitados ou de fermentação em alta densidade celular. A supressão do fenótipo de lise celular pode ser observada pelo aumento da taxa de crescimento e/ou da produção de proteína recombinante, particularmente no periplasma, exibidos por uma célula portadora de mutante spr e mutante de Tsp em
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14/75 comparação a uma célula portadora do mutante de Tsp e um spr do tipo selvagem. [0095] Qualquer mutação ou mutações adequadas podem ser realizadas no gene spr, o que resulta em uma proteína spr capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado. Esta atividade pode ser testada por um indivíduo versado na técnica criando uma célula portadora de um gene spr mutante e gene Tsp mutante e comparando o fenótipo a uma célula portadora do gene Tsp mutante somente. Mutações adequadas no gene Tsp são descritas em detalhe abaixo. A referência a um gene Tsp mutado ou gene Tsp mutado que codifica Tsp, se refere tanto a um gene Tsp mutado que codifica uma proteína de Tsp com reduzida atividade da protease quanto a um gene Tsp mutado inativado, salvo indicação em contrário.
[0096] A expressão “gene Tsp mutado que codifica uma proteína de Tsp que tem reduzida atividade da protease” significa que o gene Tsp mutado não exibe atividade plena da protease em comparação ao gene Tsp não mutado do tipo selvagem. O gene Tsp mutado pode codificar uma proteína de Tsp que tem 50% ou menos, 40% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos ou 5% ou menos da atividade da protease de uma proteína Tsp não mutada do tipo selvagem. O gene Tsp mutado pode codificar uma proteína de Tsp desprovida de atividade da protease. A célula não é deficiente em Tsp cromossômico, isto é, a sequência do gene Tsp não foi deletada ou mutada para impedir a expressão de qualquer forma da proteína de Tsp.
[0097] Qualquer mutação adequada pode ser introduzida no gene Tsp para que seja produzida uma proteína que tenha reduzida atividade da protease. A atividade da protease de uma proteína de Tsp expressada a partir de uma bactéria gram negativa pode ser testada facilmente por um indivíduo versado na técnica com o uso de qualquer método adequado na técnica, tal como o método descrito em Keiler et al (Identification of Active Site Residues of the Tsp Protease* THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 270, N° 48, Edição de 1o de dezembro 1, pp. 28864-28868, 1995 Kenneth C. Keiler e Robert T. Sauer) onde a atividade da protease de Tsp foi testada.
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15/75 [0098] Keiler et al (supra) relatou que a Tsp tem um sítio ativo que compreende os resíduos S430, D441 e K455 e os resíduos G375, G376, E433 e T452 são importantes para a manutenção da estrutura de Tsp. Keiler et al (supra) relatou achados onde os genes Tsp mutados S430A, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A e T452A não apresentavam atividade detectável da protease. Foi ainda relatado que o gene Tsp mutado S430C exibia cerca de 5-10% de atividade do tipo selvagem. Por conseguinte, A mutação de Tsp para produzir uma proteína com atividade da protease reduzida pode compreender uma mutação, tal como uma mutação de sentido trocado em um ou mais dos resíduos S430, D441, K455, G375, G376, E433 e T452. Preferencialmente a mutação de Tsp para produzir uma proteína com atividade da protease reduzida pode compreender uma mutação, tal como uma mutação de sentido trocado em um, dois ou todos os três dos resíduos do sítio ativo S430, D441 e K455.
[0099] Por conseguinte o gene Tsp mutado pode compreender:
uma mutação em S430; ou uma mutação em D441; ou uma mutação em K455; ou uma mutação em S430 e D441; ou uma mutação em S430 e K455; ou uma mutação em D441 e K455; ou uma mutação em S430, D441 e K455.
[00100] Um ou mais de S430, D441, K455, G375, G376, E433 e T452 podem ser mutados em qualquer aminoácido adequado que resulte em uma proteína com reduzida atividade da protease. Exemplos de mutações adequadas são S430A, S430C, D441A, K455A, K455H, K455R, G375A, G376A, E433A e T452A. O gene Tsp mutado pode compreender uma, duas ou três mutações nos resíduos do sítio ativo, por exemplo, o gene pode compreender:
S430A ou S430C; e/ou
D441A; e/ou
K455A ou K455H ou K455R.
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16/75 [00101] Preferencialmente, o gene Tsp compreende a mutação pontual S430A ou S430C.
[00102] A expressão “gene Tsp mutado inativado” significa que o gene compreende uma ou mais mutações, não causando com isso qualquer expressão da proteína codificada pelo gene para fornecer uma célula deficiente na proteína codificada pelo gene mutado inativado. O gene inativado pode ser transcrito parcialmente ou completamente, mas não traduzido na proteína codificada. O gene Tsp mutado inativado pode ser mutado usando qualquer modo adequado, por exemplo, através de uma ou mais entre as mutações por deleção, inserção, pontual, de sentido trocado, sem sentido e deslocamento do quadro de leitura, para não causar qualquer expressão da proteína. Por exemplo, o gene pode ser mutado inativado pela inserção de uma sequência de DNA estranho, tal como um marcador de resistência a antibiótico, na sequência codificadora gênica.
[00103] O gene Tsp mutado pode compreender uma mutação no códon de iniciação do gene e/ou em um ou mais códons de parada posicionados a jusante do códon de iniciação do gene e a montante do códon de parada do gene impedindo com isso a expressão da proteína de Tsp. A mutação no códon de iniciação pode ser uma mutação de sentido trocado de um, dois ou todos os três nucleotídeos do códon de iniciação. Alternativamente ou adicionalmente, o códon de iniciação pode ser mutado por uma mutação de deslocamento do quadro de leitura de inserção ou deleção. O gene Tsp compreende dois códons ATG no terminal 5’ da sequência codificadora, um ou os dois códons ATG podem ser mutados por uma mutação de sentido trocado. O gene Tsp pode ser mutado no segundo códon ATG (códon 3) em TCG, como mostra a Figura 9b. O gene Tsp, em alternativa ou em acréscimo, pode compreender um ou mais códons de parada posicionados a jusante do códon de iniciação do gene e a montante do códon de parada do gene. Preferencialmente o gene Tsp mutado inativado compreende tanto uma mutação de sentido trocado no códon de iniciação quanto um ou mais códons de parada inseridos. O gene Tsp pode ser mutado para deletar “T” do quinto códon, causando desse modo um deslocamento do quadro de leitura que resulta em códons de parada nos códons 11
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17/75 e 16, como mostra a Figura 9b. O gene Tsp pode ser mutado para inserir um sítio de restrição Ase I e criar um terceiro códon de parada no deslocamento no códon 21, como mostra a Figura 9b.
[00104] O gene Tsp mutado inativado pode ter a sequência de DNA do ID de SEQ N°: 3, que inclui os 6 nucleotídeos ATGAAT a montante do códon de iniciação. As mutações que foram realizadas na sequência de Tsp mutado inativado do ID de SEQ N°: 3 são mostradas na Figura 9b. Em uma modalidade, o gene Tsp mutado tem a sequência de DNA dos nucleotídeos 7 a 2048 do ID de SEQ N°:3.
[00105] Por conseguinte, uma vez identificada uma célula portadora de um gene Tsp mutante adequado, é possível identificar mutações do gene spr adequadas que resultam em uma proteína spr capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado.
[00106] As células de acordo com uma modalidade preferencial da presente invenção compreendem um gene spr mutante que codifica uma proteína spr que tem uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados entre N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147, H157 e W174, mais preferencialmente em um ou mais aminoácidos selecionados entre C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147, H157 e W174. Nesta modalidade, a proteína spr preferencialmente não tem quaisquer outras mutações. Preferencialmente o gene spr mutante codifica uma proteína spr que tem uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados entre N31, R62, I70, Q73, C94, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144, H145, G147 e H157, mais preferencialmente em um ou mais aminoácidos selecionados entre C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 e H157. Nesta modalidade, a proteína spr preferencialmente não tem quaisquer outras mutações. Preferencialmente, o gene spr mutante codifica uma proteína spr que tem uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados entre N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 e G147, mais preferencialmente em um ou mais aminoácidos selecionados entre S95, V98, Y115, D133, V135 e G147. Nesta modalidade, a proteína spr preferencialmente não tem
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18/75 quaisquer outras mutações.
[00107] Em um aspecto da presente invenção é fornecida uma célula bacteriana gram negativa que compreende um gene spr mutante que codifica uma proteína spr que tem uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados entre C94, S95, V98, Y115, D133, V135, H145, G147 e H157, preferencialmente em um ou mais aminoácidos selecionados entre S95, V98, Y115, D133, V135 e G147, e em que a célula compreende um gene Tsp do tipo selvagem. Nesta modalidade, a proteína spr preferencialmente não tem quaisquer outras mutações.
[00108] O gene Tsp cromossômico do tipo selvagem é preferencialmente um gene Tsp cromossômico não recombinante. Preferencialmente, a célula compreende adicionalmente um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC.
[00109] A mutação em um ou mais dos aminoácidos acima pode ser qualquer mutação adequada de sentido trocado em um, dois ou três dos nucleotídeos que codificam o aminoácido. A mutação modifica o resíduo do aminoácido para qualquer aminoácido adequado que resulte em uma proteína spr mutada capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado. A mutação de sentido trocado pode modificar o aminoácido para um que tenha um tamanho diferente e/ou tem propriedades químicas diferentes em comparação ao aminoácido do tipo selvagem.
[00110] Em uma modalidade a mutação é em um, dois ou três da tríade catalítica dos resíduos de aminoácido de C94, H145, e H157 (Solution NMR Structure of the NlpC/P60 Domain of Lipoprotein Sprfrom Escherichia coli Structural Evidence for um Novel Cysteine Peptidase Catalytic Triad, Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717).
[00111] Por conseguinte, o gene spr mutado pode compreender:
uma mutação em C94; ou uma mutação em H145; ou uma mutação em H157; ou uma mutação em C94 e H145; ou uma mutação em C94 e H157; ou uma mutação em H145 e H157; ou
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19/75 uma mutação em C94, H145 e H157.
[00112] Nesta modalidade, a proteína spr preferencialmente não tem quaisquer outras mutações.
[00113] Um, dois ou três de C94, H145 e H157 podem ser mutados em qualquer aminoácido adequado que resulte em uma proteína spr capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado. Por exemplo, um, dois ou três de C94, H145, e H157 podem ser mutados em um aminoácido pequeno, tal como Gly ou Ala. Por conseguinte, a proteína spr pode ter uma, duas ou três das mutações C94A, H145A e H157A. Preferencialmente, o gene spr compreende a mutação de sentido trocado H145A, a qual demonstrou produzir uma proteína spr capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado.
[00114] A designação para um mutante de substituição consiste em uma letra seguida por um número seguido por uma letra. A primeira letra designa o aminoácido na proteína do tipo selvagem. O número se refere à posição do aminoácido em que a substituição do aminoácido está sendo feita, e a segunda letra designa o aminoácido que é utilizado para substituir o aminoácido do tipo selvagem.
[00115] Em uma modalidade preferencial a proteína spr mutante compreende uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados entre N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 e G147, preferencialmente uma mutação em um ou mais aminoácidos selecionados entre S95, V98, Y115, D133, V135 e G147. Nesta modalidade, a proteína spr preferencialmente não tem quaisquer outras mutações. Por conseguinte, o gene spr mutado pode compreender:
uma mutação em N31; ou uma mutação em R62; ou uma mutação em I70; ou uma mutação em Q73; ou uma mutação em S95; ou uma mutação em V98; ou uma mutação em Q99; ou
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20/75 uma mutação em R100; ou uma mutação em L108; ou uma mutação em Y115; ou uma mutação em D133; ou uma mutação em V135; ou uma mutação em L136; ou uma mutação em G140; ou uma mutação em R144; ou uma mutação em G147.
[00116] Em uma modalidade a proteína spr mutante compreende múltiplas mutações nos aminoácidos:
S95 e Y115; ou
N31, Q73, R100eG140; ou
Q73, R100e G140; ou
R100eG140; ou
Q73 e G140; ou
Q73 e R100;or
R62, Q99 e R144; ou
Q99 e R144.
[00117] Um ou mais dos aminoácidos N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140, R144 e G147 pode ser mutado em qualquer aminoácido adequado que resulte em uma proteína spr capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado. Por exemplo, um ou mais entre N31, R62, I70, Q73, S95, V98, Q99, R100, L108, Y115, D133, V135, L136, G140 e R144 pode ser mutado em um aminoácido pequeno, tais como Gly ou Ala.
[00118] Em uma modalidade preferencial a proteína spr compreende uma ou mais das seguintes mutações: N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D ou V135G, L136P, G140C, R144C e G147C. Preferencialmente a proteína spr compreende uma ou mais das seguintes mutações: S95F, V98E, Y115F, D133A, V135D ou V135G e G147C. Nesta modalidade, a
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21/75 proteína spr preferencialmente não tem quaisquer outras mutações.
[00119] Em uma modalidade a proteína spr tem uma mutação selecionada entre N31Y, R62C, I70T, Q73R, S95F, V98E, Q99P, R100G, L108S, Y115F, D133A, V135D ou V135G, L136P, G140C, R144C e G147C. Nesta modalidade, a proteína spr preferencialmente não tem quaisquer outras mutações.
[00120] Em uma modalidade adicional a proteína spr tem múltiplas mutações selecionadas entre:
S95FeY115F
N31Y, Q73R, R100G e G140C;
Q73R, R100GeG140C;
R100G e G140C;
Q73R e G140C;
Q73R e R100G;
R62C, Q99P e R144C; ou
Q99P e R144C.
[00121] Em uma modalidade, a proteína spr tem a mutação W174R. Em uma modalidade alternativa a proteína spr não tem a mutação W174R.
[00122] Em uma modalidade preferencial a célula de acordo com a presente invenção compreende o gene spr mutado e um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC.
[00123] Conforme aqui utilizado, um “polipeptídeo recombinante” se refere a uma proteína que é construída ou produzida com o uso da tecnologia de DNA recombinante. A sequência de polinucleotídeo que codifica DsbC pode ser idêntica à sequência endógena que codifica DsbC encontrada nas células bacterianas. Alternativamente, a sequência de polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC é uma versão mutada da sequência de DsbC do tipo selvagem, por exemplo, que tem um sítio de restrição removido, tal como um sítio EcoRI, e/ou uma sequência que codifica uma cauda de histidina. Um exemplo de sequência de nucleotídeo de Dsbc modificada para uso na presente invenção é mostrado no ID de SEQ N°: 26, que codifica a sequência de aminoácido com cauda de histidina de Dsbc mostrada no ID
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22/75 de SEQ N°: 27.
[00124] Em um aspecto da presente invenção é fornecida uma célula bacteriana gram negativa que compreende um gene spr mutante que codifica uma proteína spr mutante, um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC e em que a célula compreende um gene Tsp do tipo selvagem. O gene Tsp do tipo selvagem é preferencialmente um gene Tsp cromossômico não recombinante.
[00125] DsbC é uma proteína procariótica encontrada no periplasma de E.coli que catalisa a formação de ligações dissulfídicas em E.coli. A DsbC tem um comprimento de sequência de aminoácido equivalente a 236 (que inclui o peptídeo de sinal) e um peso molecular de 25,6 KDa (UniProt No. P0AEG6). A DsbC foi identificada pela primeira vez em 1994 (Missiakas et ai. The Escherichia coli dsbC (xprA) gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation, The EMBO Journal vol 13, n° 8, p2013-2020, 1994 e Shevchik et ai. Characterization of DsbC, a periplasmic protein of Erwinia chrysanthemi and Escherichia coli with disulfide isomerase activity, The EMBO Journal vol 13, n° 8, p2007-2012, 1994).
[00126] Sabe-se que a coexpressam de proteínas que catalisam a formação de ligações dissulfídicas aumenta a expressão da proteína em uma célula do hospedeiro. O documento WO98/56930 revela um método para produção de polipeptídeos que contém ligação dissulfídica heteróloga em células bacterianas em que uma isomerase dissulfídica procariótica, tal como DsbC ou DsbG, é coexpressada com um polipeptídeo eucariótico. O documento US6673569 revela um óperon artificial que compreende polinucleotídeos que codificam DsbA, DsbB, DsbC e DsbD individualmente para uso na produção de uma proteína estranha. O documento EP0786009 revela um processo de produção de um polipeptídeo heterólogo em bactérias em que a expressão do ácido nucleico que codifica DsbA ou DsbC é induzida antes da indução da expressão do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo heterólogo.
[00127] Constatamos que a combinação específica da expressão do polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC em uma célula bacteriana que compreende um gene spr mutado e um gene Tsp do tipo selvagem proporciona um
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23/75 hospedeiro melhor para a expressão das proteínas de interesse. Foi surpreendente a constatação de que as novas cepas exibem taxa de crescimento celular e duração da sobrevivência celular mais altas que uma célula do tipo selvagem ou uma célula que compreende um gene Tsp mutado. Especificamente, as células portadoras de um gene DsbC recombinante, uma mutação de spr e uma Tsp do tipo selvagem exibem fenótipo de lise celular reduzida em comparação às células portadoras de um gene Tsp mutado.
[00128] Em uma modalidade a célula de acordo com a presente invenção também expressa uma ou mais proteínas adicionais da seguinte forma:
uma ou mais proteínas capazes de facilitar o dobramento de proteínas, tais como FkpA, Skp, SurA, PPiA e PPiD; e/ou uma ou mais proteínas capazes de facilitar a secreção ou translocação da proteína, tais como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY e Lep; e/ou uma ou mais proteínas capazes de facilitar a formação de ligação dissulfídica, tais como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.
[00129] Uma ou mais das proteínas acima podem ser integradas no genoma da célula e/ou inseridas em um vetor de expressão.
[00130] Em uma modalidade, a célula de acordo com a presente invenção não compreende o polinucleotídeo recombinante que codifica uma ou mais das outras proteínas adiante:
uma ou mais proteínas capazes de facilitar o dobramento de proteínas, tais como FkpA, Skp, SurA, PPiA e PPiD;
uma ou mais proteínas capazes de facilitar a secreção ou translocação da proteína, tais como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY e Lep; e uma ou mais proteínas capazes de facilitar a formação de ligação dissulfídica, tais como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG.
[00131] Em uma modalidade preferencial da presente invenção a célula bacteriana gram negativa recombinante compreende adicionalmente um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP que tem atividade da chaperona e reduzida atividade da protease e/ou um gene ptr mutado, em que o gene ptr mutado codifica
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24/75 uma proteína Protease III que tem reduzida atividade da protease ou é um gene ptr mutado inativado e/ou um gene OmpT mutado, em que o gene OmpT mutado codifica uma proteína OmpT que tem reduzida atividade da protease ou é um gene OmpT mutado inativado.
[00132] Em uma modalidade a presente invenção proporciona uma célula bacteriana gram negativa recombinante que compreende um gene spr mutado;
um gene Tsp cromossômico não recombinante do tipo selvagem; e um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP que tem atividade da chaperona e reduzida atividade da protease e/ou um gene OmpT mutado em que o gene OmpT mutado codifica uma proteína OmpT que tem reduzida atividade da protease ou é um gene OmpT mutado inativado.
[00133] Preferencialmente nesta modalidade, a célula é isogênica a uma célula bacteriana do tipo selvagem, exceto pelas mutações acima.
[00134] Em uma modalidade a presente invenção proporciona uma célula bacteriana gram negativa recombinante que compreende:
um gene spr mutado;
um gene Tsp cromossômico não recombinante do tipo selvagem; e um gene ptr mutado, em que o gene ptr mutado codifica uma proteína Protease III que tem reduzida atividade da protease ou é um gene ptr mutado inativado e/ou um gene OmpT mutado em que o gene OmpT mutado codifica uma proteína OmpT que tem reduzida atividade da protease ou é um gene OmpT mutado inativado.
[00135] Preferencialmente nesta modalidade a célula é isogênica a uma célula bacteriana do tipo selvagem exceto pelas mutações acima.
[00136] Em uma modalidade a presente invenção proporciona uma célula que compreende um gene spr mutado;
um gene Tsp cromossômico não recombinante do tipo selvagem;
um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP que tem
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25/75 atividade da chaperona e reduzida atividade da protease;
um gene ptr mutado, em que o gene ptr mutado codifica uma proteína Protease III que tem reduzida atividade da protease ou é um gene ptr mutado inativado; e opcionalmente um OmpT mutado em que o gene OmpT mutado codifica uma proteína OmpT que tem reduzida atividade da protease ou é um gene OmpT mutado inativado.
[00137] Preferencialmente nesta modalidade, a célula é isogênica a uma célula bacteriana do tipo selvagem, exceto pelas mutações acima.
[00138] Em uma modalidade da presente invenção a célula é portadora de um gene DegP mutado. Conforme aqui utilizado, “DegP” significa um gene que codifica a proteína DegP (também denominada HtrA), que tem atua duplamente como uma chaperona e uma protease (Families of serine peptidases; Rawlings ND, Barrett AJ. Methods Enzymol. 1994;244:19-61). A sequência do gene DegP não mutado é mostrada no ID de SEQ N°: 7 e a sequência da proteína DegP não mutada é mostrada no ID de SEQ N°: 8.
[00139] Em baixas temperaturas a DegP atua como uma chaperona e em altas temperaturas a DegP tem preferência por atuar como uma protease (A TemperatureDependent Switch from Chaperone to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Edição 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) e The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperaturas, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658).
[00140] Nas modalidades onde a célula compreende a mutação de DegP a mutação de DegP na célula proporciona um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP que tem atividade da chaperona, mas não a atividade plena da protease.
[00141] A expressão “que tem atividade da chaperona” no contexto da presente invenção significa que a proteína DegP mutada tem a mesma ou substancialmente a mesma atividade da chaperona em comparação à proteína DegP não mutada do tipo selvagem. Preferancialmente, o gene DegP mutado codifica uma proteína DegP
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26/75 que tem 50% ou mais, 60% ou mais, 70% ou mais, 80% ou mais, 90% ou mais ou 95% ou mais da atividade da chaperona de uma proteína DegP não mutada do tipo selvagem. Mais preferencialmente, o gene DegP mutado codifica uma proteína DegP que tem a mesma atividade da chaperona que a DegP do tipo selvagem.
[00142] A expressão “que tem reduzida atividade da protease” no contexto da presente invenção significa que a proteína DegP mutada não exibe atividade plena da protease em comparação à proteína DegP não mutada do tipo selvagem. Preferencialmente, o gene DegP mutado codifica uma proteína DegP que tem 50% ou menos, 40% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos ou 5% ou menos da atividade da protease de uma proteína DegP não mutada do tipo selvagem. Mais preferencialmente, o gene DegP mutado codifica uma proteína DegP que é desprovida de atividade da protease. A célula não é deficiente na DegP cromossômica, isto é, as sequências gênicas da DegP não foram deletadas ou mutadas para impedir a expressão de qualquer forma da proteína DegP.
[00143] Qualquer mutação adequada pode ser introduzida no gene DegP para que seja produzida uma proteína que tem atividade da chaperona e reduzida atividade da protease. A atividade da protease e da chaperona de uma proteína DegP expressada a partir de uma bactéria gram negativa pode ser testada facilmente por um indivíduo versado na técnica através de qualquer método adequado, tal como o método descrito em Spiess et al, onde as atividades da protease e da chaperona da DegP foram testada em MalS, um substrato natural da DegP (A Temperature-Dependent Switch from Chaperona to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Edição 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M) e ainda o método descrito em The proteolytic activity of the HtrA (DegP) protein from Escherichia coli at low temperatures, Skorko-Glonek J et al Microbiology 2008, 154, 3649-3658.
[00144] A DegP é um serina protease e tem um centro ativo consistindo em uma tríade catalítica dos resíduos de aminoácido de His105, Asp135 e Ser210 (Families of serine peptidases, Methods Enzymol., 1994, 244:19-61 Rawlings N e Barrett A). A mutação de DegP para produzir uma proteína que tenha atividade da chaperona e
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27/75 reduzida atividade da protease pode compreender uma mutação, tal como uma mutação de sentido trocado em um, dois ou três entre His105, Asp135 e Ser210. [00145] Por conseguinte, o gene DegP mutado pode compreender:
uma mutação em His105; ou uma mutação em Asp135; ou uma mutação em Ser210; ou uma mutação em His105 e Asp135; ou uma mutação em His105 e Ser210; ou uma mutação em Asp135 e Ser210; ou uma mutação em His105, Asp135 e Ser210.
[00146] Um, dois ou três entre His105, Asp135 e Ser210 podem ser mutados em qualquer aminoácido adequado que resulte em uma proteína que tenha atividade da chaperona e reduzida atividade da protease. Por exemplo, um, dois ou três de His105, Asp135 e Ser210 podem ser mutadas em um aminoácido pequeno, tal como Gly ou Ala. Uma mutação adequada adicional é modificar um, dois ou três de His105, Asp135 e Ser210 em um aminoácido que tenha propriedades contrárias, tal como a Asp135 que é mutada em Lys ou Arg, His105 polar que é mutada em um aminoácido não polar, tais como Gly, Ala, Vai ou Leu e Ser210 pequena e hidrofílica que é mutada em um resíduo hidrofóbico ou grande, tais como Vai, Leu, Phe ou Tyr. Preferencialmente, o gene DegP compreende a mutação pontual S210A, como mostra a Figura 9c, que demonstrou produzir uma proteína que tem atividade da chaperona, mas não atividade da protease (A Temperature-Dependent Switch from Chaperona to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Edição 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).
[00147] A DegP tem dois domínios PDZ, PDZ1 (resíduos 260-358) e PDZ2 (resíduos 359-448), que mediam a interação proteína-proteína (A TemperatureDependent Switch from Chaperona to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Edição 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M). Em uma modalidade da presente invenção, o gene degP é mutado para deletar o domínio PDZ1 e/ou domínio PDZ2. A deleção de PDZ1 e PDZ2 resulta na perda
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28/75 completa da atividade da protease da proteína DegP e na diminuição da atividade da chaperona em comparação à proteína DegP do tipo selvagem, enquanto a deleção de PDZ1 ou PDZ2 resulta em 5% da atividade da protease e atividade similar da chaperona em comparação à proteína DegP do tipo selvagem (A TemperatureDependent Switch from Chaperona to Protease in a Widely Conserved Heat Shock Protein. Cell, Volume 97, Edição 3, Páginas 339 - 347. Spiess C, Beil A, Ehrmann M).
[00148] O gene DegP mutado pode ainda compreender um sítio de restrição silencioso de ocorrência não natural, tal como o Ase I, para auxiliar nos métodos de identificação e avaliação, por exemplo, como mostra a Figura 9c.
[00149] A sequência preferencial do gene DegP mutado que compreende a mutação pontual S210A e um sítio do marcador de restrição Ase I é fornecida no ID de SEQ N°: 9 e a proteína codificada sequência é mostrada no ID de SEQ N°: 10. As mutações que foram realizadas na sequência de DegP mutada do ID de SEQ N°: 9 são mostradas na Figura 9c.
[00150] Nas modalidades da presente invenção em que a célula compreende um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP que tem atividade da chaperona e reduzida atividade da protease, um ou mais das células fornecidas pela presente invenção podem proporcionar um rendimento aumentado de proteínas dobradas corretamente da célula em relação às células mutadas em que o gene DegP foi mutado em DegP inativado que impede a expressão da DegP, tal como deficiente na DegP cromossômica. Em uma célula que compreende um gene DegP mutado inativado que impede a expressão de DegP, a atividade da chaperona de DegP é completamente perdida, ao passo que na célula de acordo com a presente invenção a atividade da chaperona da DegP é mantida, enquanto a atividade plena da protease é perdida. Nestas modalidades, uma ou mais células de acordo com a presente invenção têm menor atividade da protease para impedir a proteólise da proteína, mantendo ao mesmo tempo a atividade da chaperona para permitir o dobramento correto e o transporte da proteína na célula do hospedeiro.
[00151] O indivíduo versado na técnica facilmente seria capaz de testar a proteína
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29/75 secretada para verificar se a proteína está corretamente dobrada usando métodos consagrados na técnica, tais como os métodos HPLC da proteína G, dicroismo circular, NMR, cristalografia de raios X e medição de afinidade de epítopo.
[00152] Nestas modalidades, uma ou mais células de acordo com a presente invenção podem apresentar crescimento celular maior que das células portadoras de um gene DegP inativado mutado que impede a expressão de DegP. Sem querer nos restringir a qualquer teoria especial, o crescimento celular aumentado talvez seja exibido em decorrência da preservação da atividade da chaperona pela DegP protease, o que pode aumentar a capacidade da célula de processar todas as proteínas que requeiram a atividade da chaperona. Por conseguinte, a produção de proteínas dobradas corretamente necessárias ao crescimento e reprodução da célula pode ser maior em uma ou mais das células da presente invenção que nas células portadoras de uma mutação de DegP inativado, aprimorando dessa maneira as vias celulares que regulam o crescimento. Ademais, as cepas deficientes na protease DegP conhecidas geralmente são sensíveis à temperatura e tipicamente não crescem em temperaturas acima de cerca de 28°C. No entanto, as células de acordo com a presente invenção não são sensíveis à temperatura e conseguem crescer em temperaturas iguais ou superiores a 28°C, incluindo-se temperaturas de aproximadamente 30°C a aproximadamente 37°C, que são tipicamente utilizadas para a produção em escala industrial das proteínas derivadas de bactérias.
[00153] Em uma modalidade da presente invenção a célula é portadora de um gene ptr mutado. Conforme aqui utilizado, “gene ptr” significa um gene que codifica a Protease III, uma protease que degrada proteínas de alto peso molecular. A sequência do gene ptr não mutado é mostrada no ID de SEQ N°: 4e a sequência da proteína Protease III não mutada é mostrada no ID de SEQ N°: 5.
[00154] A referência ao gene ptr mutado ou gene ptr mutado que codifica a Protease III, se refere tanto a um gene ptr mutado que codifica uma proteína Protease III com reduzida atividade da protease quanto a um gene ptr mutado inativado, salvo indicação em contrário.
[00155] A expressão “gene ptr mutado que codifica uma proteína Protease III que
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30/75 tem reduzida atividade da protease” no contexto da presente invenção, significa que o gene ptr mutado não tem a atividade plena da protease em comparação ao gene ptr não mutado do tipo selvagem.
[00156] Preferencialmente, o gene ptr mutado codifica uma Protease III que tem 50% ou menos, 40% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos ou 5% ou menos da atividade da protease de uma proteína Protease III do tipo selvagem não mutada. Mais preferencialmente, o gene ptr mutado codifica uma proteína Protease III que é desprovida de atividade da protease. Nesta modalidade, a célula não é deficiente na ptr cromossômica, isto é, a sequência do gene ptr não foi deletada ou mutada para impedir a expressão de qualquer forma da proteína Protease III.
[00157] Qualquer mutação adequada pode ser introduzida no gene ptr para que seja produzida uma proteína Protease III com reduzida atividade da protease. A atividade da protease de uma proteína Protease III expressada a partir de uma bactéria gram negativa pode ser testada facilmente por um indivíduo versado na técnica com o uso de qualquer método adequado na técnica.
[00158] A expressão “gene ptr mutado inativado” no contexto da presente invenção significa que o gene compreende uma ou mais mutações que não causam qualquer expressão da proteína codificada pelo gene para fornecer uma célula deficiente na proteína codificada pelo gene mutado inativado. O gene inativado pode ser parcialmente ou completamente transcrito, mas não traduzido na proteína codificada. O gene ptr mutado inativado pode ser mutado usando qualquer forma adequada, por exemplo, através de uma ou mais mutações entre deleção, inserção, pontual, sentido trocado, sem sentido e deslocamento do quadro de leitura, para não causar qualquer expressão da proteína. Por exemplo, o gene pode sofrer inativado pela inserção de uma sequência de DNA estranho, tal como um marcador de resistência a antibiótico, na sequência codificadora gênica.
[00159] Em uma modalidade preferencial o gene não é mutado pela inserção de uma sequência de DNA estranho, tal como um marcador de resistência a antibiótico, na sequência codificadora gênica. Preferencialmente o gene da Prótese III
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31/75 compreende uma mutação no códon de iniciação do gene e/ou em um ou mais códons de parada posicionados a jusante do códon de iniciação do gene e a montante do códon de parada do gene impedindo desta forma a expressão da proteína Protease III.
[00160] A mutação no códon de iniciação do gene inativado alvo causa a perda de função do códon de iniciação, garantindo desta forma que o gene alvo não compreenda um códon de iniciação adequado no começo da sequência codificadora. A mutação no códon de iniciação pode ser uma mutação de sentido trocado de um, dois ou de todos os três nucleotídeos do códon de iniciação. Alternativamente ou adicionalmente, o códon de iniciação pode ser mutado por uma mutação de deslocamento do quadro de leitura por inserção ou deleção.
[00161] Em uma modalidade preferencial o gene ptr é mutado para mudar o códon de iniciação ATG para ATT, como mostra a Figura 9a.
[00162] O gene ptr mutado inativado pode compreender, alternativamente ou adicionalmente, um ou mais códons de parada posicionados a jusante do códon de iniciação do gene e a montante do códon de parada do gene. Preferencialmente o gene ptr mutado inativado compreende uma mutação de sentido trocado no códon de iniciação e um ou mais códons de parada inseridos.
[00163] Os um ou mais códons de parada inseridos são preferencialmente códons de parada em fase de leitura. No entanto os um ou mais códons de parada inseridos podem, alternativamente ou adicionalmente, ser códons de parada não em fase de leitura. Um ou mais códons de parada não em fase de leitura podem ser requeridos para interromper a tradução onde um códon de iniciação não em fase de leitura é modificado para um códon de iniciação em fase de leitura por uma mutação de deslocamento do quadro de leitura por inserção ou deleção. Os um ou mais códons de parada pode ser introduzidos por qualquer mutação adequada, incluindo-se uma mutação pontual sem sentido e um mutação por deslocamento do quadro de leitura. Os um ou mais códons de parada são preferencialmente introduzidos através de uma mutação por deslocamento do quadro de leitura e/ou uma mutação por inserção, preferencialmente pela substituição de um segmento da sequência gênica
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32/75 por uma sequência que compreenda um códon de parada. Por exemplo, um sítio de restrição Ase I pode ser inserido, o qual compreende o códon de parada TAA.
[00164] Em uma modalidade preferencial, o gene ptr é mutado para inserir um códon de parada em fase de leitura pela inserção de um sítio de restrição Ase I, como mostra a Figura 9a. Em uma modalidade preferencial o gene ptr mutado inativado tem a sequência de DNA do ID de SEQ N°: 6. As mutações que foram realizadas na sequência do gene ptr mutado inativado do ID de SEQ N°: 6 são mostradas na Figura 9a.
[00165] As mutações inativado descritas acima são vantajosas em virtude de não causarem ruptura, ou causarem rupturas mínimas, no DNA cromossômico a montante ou a jusante do sítio do gene alvo inativado e não requererem a inserção e retenção de DNA estranho, tal como o marcador de resistência a antibióticos, que pode afetar a adequabilidade da célula para a expressão de uma proteína de interesse, particularmente proteínas terapêuticas. Por conseguinte, uma ou mais das células de acordo com a presente invenção podem exibir características de crescimento e/ou de expressão da proteína aprimoradas em comparação às células em que o gene da protease sofreu inativado pela inserção de DNA estranho na sequência codificadora gênica.
[00166] Em uma modalidade, as células de acordo com a presente invenção são portadoras de um gene OmpT mutado. Conforme aqui utilizado, “gene OmpT” significa um gene que codifica a protease OmpT (protease T da membrana externa) que é uma protease da membrana externa. A sequência do gene OmpT não mutado do tipo selvagem é SWISS-PROT P09169.
[00167] A referência a um gene OmpT mutado ou gene OmpT mutado que codifica OmpT, se refere tanto a um gene OmpT mutado que codifica uma proteína OmpT com reduzida atividade da protease quanto a um gene OmpT mutado inativado, salvo indicação em contrário.
[00168] A expressão “gene OmpT mutado que codifica uma proteína OmpT que tem reduzida atividade da protease” no contexto da presente invenção, significa que o gene OmpT mutado não exibe atividade plena da protease em comparação ao
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33/75 gene OmpT não mutado do tipo selvagem. O gene OmpT mutado pode codificar uma proteína OmpT que tem 50% ou menos, 40% ou menos, 30% ou menos, 20% ou menos, 10% ou menos ou 5% ou menos da atividade da protease de uma proteína OmpT não mutada do tipo selvagem. O gene OmpT mutado pode codificar uma proteína OmpT que é desprovida de atividade da protease. Nesta modalidade a célula não é deficiente em OmpT cromossômica isto é, a sequência gênica de OmpT não foi deletada ou mutada para impedir a expressão de qualquer forma da proteína OmpT.
[00169] Qualquer mutação adequada pode ser introduzida no gene OmpT para que seja produzida uma proteína que tem reduzida atividade da protease. A atividade da protease de uma proteína OmpT expressada a partir de uma bactéria gram negativa pode ser testada facilmente por um indivíduo versado na técnica com o uso de qualquer método adequado na técnica, tal como o método descrito em Kramer et al (Identification of essential acidic residues of outer membrane protease OmpT supports a novel active site, FEBS Letters 505 (2001) 426-430) e Dekker et al (Substrate Specitificity of the Integral Membrane Protease OmpT Determined by Spatially Addressed Peptide Libraries, Biochemistry 2001,40, 1694-1701).
[00170] A OmpT foi relatada em Kramer et al (Identification of active site serine and histidine residues in Escherichia coli outer membrane protease OmpT FEBS Letters 2000 468, 220-224) e revela que a substituição de serinas, histidinas e resíduos ácidos por alaninas resulta em uma atividade 10 vezes menor para Glu27, Asp97, Asp208 ou His101, 500 vezes menor para Ser99 e 10000 vezes menor para Asp83, Asp85, Asp210 ou His212. Vandeputte-Rutten et al (Crystal Structure of the Outer Membrane Protease OmpT from Escherichia coli suggests a novel catalytic site, The EMBO Journal 2001, Vol 20 N° 18 5033-5039) revela a existência de um sítio ativo que compreende um par Asp83-Asp85 e um para His212-Asp210. Adicionalmente, Kramer et al (Lipopolysaccharide regions involved in the activation of Escherichia coli outer membrane protease OmpT, Eur. J. Biochem. FEBS 2002, 269, 1746-1752) revela que todas as mutações D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K/K217G, K217T e R218L na alça L4 resultaram na perda parcial ou
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34/75 quase completa da atividade enzimática.
[00171] Por conseguinte, a mutação de OmpT para produzir uma proteína que tem reduzida atividade da protease pode compreender uma mutação, tal como uma mutação de sentido trocado em um ou mais dos resíduos E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218&E250.
[00172] Uma ou mais de E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 & E250 podem ser mutados em qualquer aminoácido adequado que resulte em uma proteína que tenha reduzida atividade da protease. Por exemplo, um ou mais dentre E27, D43, D83, D85, D97, S99, H101 E111, E136, E193, D206, D208, D210, H212 G216, K217, R218 & E250 podem ser mutados em alanina. Exemplos de mutações adequadas são E27A, D43A, D83A, D85A, D97A, S99A, H101A E111A, E136A, E193A, D206A, D208A, D210A, H212A, H212N, H212Q, G216K, K217G, K217T, R218L & E250A. Em uma modalidade o gene OmpT mutado compreende as mutações D210A e H212A. Uma sequência de OmpT mutada adequada que compreende as mutações D210A e H212A é mostrada no ID de SEQ N°: 23.
[00173] A expressão “gene OmpT mutado inativado” no contexto da presente invenção significa que o gene compreende uma ou mais mutações que não causam qualquer expressão da proteína codificada pelo gene para fornecer uma célula deficiente na proteína codificada pelo gene mutado inativado. O gene inativado pode ser parcialmente ou completamente transcrito, mas não traduzido na proteína codificada. O gene OmpT mutado inativado pode ser mutado usando qualquer modo adequado, por exemplo, através de uma ou mais dentre as mutações por deleção, inserção, pontual, sentido trocado, sem sentido e deslocamento do quadro de leitura, para não causar qualquer expressão da proteína. Por exemplo, o gene pode sofrer inativado pela inserção de uma sequência de DNA estranho, tal como um marcador de resistência a antibiótico, na sequência codificadora gênica.
[00174] Em uma modalidade, o gene OmpT compreende uma mutação no códon de iniciação do gene e/ou um ou mais códons de parada posicionados a jusante do códon de iniciação do gene e a montante do códon de parada do gene impedindo
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35/75 desta forma a expressão da proteína OmpT. A mutação no códon de iniciação pode ser uma mutação de sentido trocado de um, dois ou de todos os três nucleotídeos do códon de iniciação. Alternativamente ou adicionalmente, o códon de iniciação pode ser mutado por uma mutação de deslocamento do quadro de leitura por inserção ou deleção.
[00175] Uma sequência adequada da OmpT mutada inativada é mostrada no ID de SEQ N°: 24.
[00176] Em uma modalidade a célula bacteriana gram negativa de acordo com a presente invenção não é portadora de um gene OmpT mutado inativado, por exemplo, é deficiente na OmpT cromossômica.
[00177] Em uma modalidade a célula bacteriana gram negativa de acordo com a presente invenção não é portadora de um gene DegP mutado inativado, por exemplo, é deficiente na DegP cromossômica. Em uma modalidade a célula bacteriana gram negativa de acordo com a presente invenção não é portadora de um gene DegP mutado.
[00178] Em uma modalidade a célula bacteriana gram negativa de acordo com a presente invenção não é portadora de um gene ptr mutado inativado, por exemplo, é deficiente na ptr cromossômica.
[00179] Diversas mutações manipuladas geneticamente que incluem mutações inativado envolvem o uso do marcador de resistência a antibióticos, o qual permite a seleção e identificação de células que foram mutadas com sucesso. No entanto, há inúmeras desvantagens ao uso do marcador de resistência a antibióticos.
[00180] Em uma modalidade da presente invenção, os genes mutados podem compreender um ou mais sítios do marcador de restrição. Portanto, o gene spr e/ou um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP que tem atividade da chaperona, mas não atividade da protease e/ou um gene ptr mutado e/ou um gene OmpT mutado podem ser mutados para compreender um ou mais sítios do marcador de restrição. Os sítios de restrição são manipulados geneticamente no gene e não ocorrem naturalmente. Os sítios do marcador de restrição são vantajosos porque permitem a triagem e identificação de células corretamente
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36/75 modificadas que compreendem as mutações cromossômicas requeridas. As células que foram modificadas para portar um ou mais dos genes mutados podem ser analisadas por PCR do DNA genômico oriundo dos lisados celulares usando pares de oligonucleotídeo designados para amplificar uma região do DNA genômico que compreende um sítio do marcador de restrição que não ocorre naturalmente. O DNA amplificado pode ser então analisado por eletroforese em gel de agarose antes e depois da incubação com uma enzima de restrição adequada capaz de digerir o DNA no sítio do marcador de restrição que não ocorre naturalmente. A presença de fragmentos de DNA depois da incubação com a enzima de restrição confirma que as células foram modificadas com sucesso para portar os um ou mais genes mutados. [00181] Na modalidade em que a célula compreende um gene ptr mutado inativado que tem a sequência de DNA do ID de SEQ N°: 6, as sequências do iniciador do oligonucleotídeo mostradas no ID de SEQ N°: 17 e ID de SEQ N°:18 podemos ser utilizadas para amplificar a região do DNA que compreende o sítio de restrição Ase I de ocorrência não natural do DNA genômico das células transformadas. O DNA genômico amplificado pode ser então incubado com a enzima de restrição Ase I e analisado por gel de eletroforese para confirmar a presença do gene ptr mutado no DNA genômico.
[00182] Na modalidade em que a célula compreende um gene DegP mutado que tem a sequência de DNA do ID de SEQ N°: 9, as sequências do iniciador do oligonucleotídeo mostradas no ID de SEQ N°: 19 e ID de SEQ N°:20 podem ser utilizadas para amplificar a região do DNA que compreende o sítio de restrição Ase I de ocorrência não natural do DNA genômico das células transformadas. O DNA genômico amplificado pode ser então incubado com a enzima de restrição Ase I e analisado por gel de eletroforese para confirmar a presença do gene DegP mutado n DNA genômico.
[00183] Os um ou mais sítios de restrição podem ser introduzidos através de qualquer mutação adequada, inclusive por meio de uma ou mais dentre as mutações por deleção, inserção, pontual, sentido trocado, sem sentido e deslocamento do quadro de leitura. Um sítio de restrição pode ser introduzido através da mutação do
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37/75 códon de iniciação e/ou mutação para introduzir o um ou mais códons de parada, como descrito acima. Essa modalidade é vantajosa porque o sítio do marcador de restrição é um marcador único e direto das mutações por inativado introduzidas. [00184] É possível inserir um sítio do marcador de restrição que compreenda um códon de parada em fase de leitura, tal como um sítio de restrição Ase I. Isso é particularmente vantajoso porque o sítio de restrição inserido atua tanto como um sítio do marcador de restrição quanto um códon de parada para impedir a transcrição completa da sequência codificadora gênica. Por exemplo, na modalidade em que um códon de parada é introduzido no gene ptr através da introdução de um sítio Ase I, isso cria ainda um sítio de restrição, como mostra a Figura 9a.
[00185] Um sítio do marcador de restrição pode ser inserido através da mutação no códon de iniciação e opcionalmente de uma ou mais mutações pontuais adicionais. Nesta modalidade, o sítio do marcador de restrição é preferencialmente um sítio de restrição EcoR I. Isso é particularmente vantajoso porque a mutação no códon de iniciação cria ainda um sítio do marcador de restrição. Por exemplo, na modalidade em que o códon de iniciação do gene ptr é modificado para ATT, isso cria um sítio do marcador EcoR I, como mostra a Figura 9a.
[00186] Na modalidade da presente invenção, em que a célula é portadora de um gene OmpT mutado, os um ou mais sítios de restrição podem ser introduzidos através de qualquer mutação adequada, inclusive por meio de uma ou mais dentre as mutações por deleção, inserção, pontual, sentido trocado, sem sentido e deslocamento do quadro de leitura. Por exemplo, na modalidade em que o gene OmpT compreende as mutações D210A e H212A, essas mutações introduzem sítio de restrição silencioso Hindlll que pode ser utilizado como um marcador de seleção. [00187] No gene spr mutado e no gene DegP mutado, um sítio de restrição do marcador pode ser introduzido por meio de alterações no códon silencioso. Por exemplo, um sítio Ase I pode ser utilizado como um sítio do marcador de restrição silencioso, em que o códon de parada TAA não está em fase de leitura, como mostra a Figura 9c para a DegP.
[00188] Nas modalidades da presente invenção, em que o gene ptr é mutado para
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38/75 codificar uma protease III que tem reduzida atividade da protease, um ou mais sítios de restrição do marcador podem ser introduzidos por meio de alterações no códon silencioso.
[00189] A célula bacteriana gram negativa recombinante de acordo com a presente invenção pode ser produzida usando qualquer meio adequado.
[00190] O indivíduo versado na técnica dispõe de conhecimento acerca de técnicas adequadas passíveis de uso para a substituição de uma sequência gênica cromossômica por uma sequência gênica mutada para que seja introduzido o gene spr mutante. É possível empregar vetores adequados que permitam a integração no cromossoma do hospedeiro por recombinação homóloga.
[00191] Métodos adequados para a substituição de gene são descritos, por exemplo, em Hamilton et al (New Method for Generating Deletions and Gene Replacements in Escherichia coli, Hamilton C. M. Et al., Journal of Bacteriology setembro de 1989, Vol. 171, N° 9 p 4617-4622), Skorupski et al (Positive selection vectors for allelic exchange, Skorupski K e Taylor R. K., Gene, 1996, 169, 47-52), Kiel et al (A general method for the construction of Escherichia coli mutants by homologous recombination and plasmid segregation, Kiel J.A.K.W. Et al, Mol Gen Genet 1987, 207:294-301), Blomfield et al (Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperatura sensitive pSC101 replicon, Blomfield I. C. Et al., Molecular Microbiology 1991, 5(6), 1447-1457) e Ried et al. (An nptl-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gramnegative bactéria by marker exchange-eviction mutagenesis, Ried J. L. E CollmerA., Gene 57 (1987) 239-246). Um plasmídeo adequado que permite a recombinação homóloga/substituição é o plasmídeo pKO3 (Link et al., 1997, Journal de Bacteriology, 179, 6228-6237).
[00192] Na modalidade em que a célula compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC, o indivíduo versado na técnica conhece técnicas adequadas que podem ser utilizadas para inserir o polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC. O polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC pode ser integrado ao genoma da célula usando um vetor adequado, tal como o plasmídeo
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39/75 ρΚ03.
[00193] Na modalidade em que a célula compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica uma proteína de interesse, o indivíduo versado na técnica também conhece técnicas adequadas que podem ser utilizadas para inserir o polinucleotídeo recombinante que codifica a proteína de interesse. O polinucleotídeo recombinante que codifica a proteína de interesse pode ser integrado no genoma da célula usando um vetor adequado, tal como o plasmídeo pKO3.
[00194] Alternativamente ou adicionalmente, o polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC e/ou o polinucleotídeo recombinante que codifica uma proteína de interesse pode não ser integrado em um cassete de expressão recombinante. Em uma modalidade um cassete de expressão é empregado na presente invenção para ser o portador do polinucleotídeo que codifica a DsbC e/ou a proteína de interesse e uma ou mais sequências de expressão reguladoras. As uma ou mais sequências de expressão reguladoras podem incluir um promotor. As uma ou mais sequências de expressão reguladoras podem incluir adicionalmente um região 3’ não traduzida, tal como uma sequência de terminação. Promotores adequados são discutidos abaixo em mais detalhes.
[00195] Em uma modalidade, um cassete de expressão é empregado na presente invenção para ser o portador do polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse e/ou o polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC. Um cassete de expressão tipicamente compreende uma ou mais sequências de expressão reguladoras, uma ou mais sequências de codificação que codificam uma ou mais proteínas de interesse e/ou uma sequência codificadora que codifica DsbC. As uma ou mais sequências de expressão reguladoras podem incluir um promotor. As uma ou mais sequências de expressão reguladoras podem incluir adicionalmente uma região 3’ não traduzida, tal como uma sequência de terminação. Promotores adequados são discutidos abaixo em mais detalhes.
[00196] Em uma modalidade, a célula de acordo com a presente invenção compreende um ou mais vetores, tal como um plasmídeo. O vetor compreende preferencialmente um ou mais dos cassetes de expressão como definido acima. Em
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40/75 uma modalidade, a sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse e o polinucleotídeo que codifica a DsbC é inserida em um vetor. Alternativamente, a sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse e o polinucleotídeo que codifica DsbC é inserida em vetores separados. [00197] Na modalidade em que a proteína de interesse é um anticorpo que compreende cadeias leves e pesadas, a linhagem celular pode ser transfectada com dois vetores, um primeiro vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia leve e um segundo vetor que codifica um polipeptídeo de cadeia pesada. Alternativamente, um único vetor pode ser utilizado, o vetor incluindo sequências que codifica polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada. Alternativamente, a sequência de polinucleotídeo que codifica o anticorpo e o polinucleotídeo que codifica a DsbC é inserida em um vetor. Preferencialmente o vetor compreende as sequências que codificam os polipeptídeos de cadeia leve e de cadeia pesada do anticorpo.
[00198] Na modalidade em que a célula também expressa uma ou mais proteínas adicionais da seguinte forma:
uma ou mais proteínas capazes de facilitar o dobramento de proteínas, tais como FkpA, Skp, SurA, PPiA e PPiD; e/ou uma ou mais proteínas capazes de facilitar a secreção ou translocação da proteína, tais como SecY, SecE, SecG, SecYEG, SecA, SecB, FtsY e Lep; e/ou uma ou mais proteínas capazes de facilitar a formação de ligação dissulfídica, tais como DsbA, DsbB, DsbD, DsbG;
as uma ou mais proteínas adicionais podem ser expressas a partir de um ou mais polinucleotídeos inseridos no mesmo vetor como o polinucleotídeo que codifica a DsbC e/ou a sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse. Alternativamente os um ou mais polinucleotídeos podem ser inseridos em vetores separados.
[00199] O vetor para uso na presente invenção pode ser produzido inserindo um ou mais cassetes de expressão, como definido acima, em um vetor adequado. Alternativamente, as sequências de expressão reguladoras para direcionar a expressão da sequência de polinucleotídeo podem estar contidas no vetor e,
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41/75 portanto, pode ser que, para completar o vetor, somente a região de codificação do polinucleotídeo venha a ser requerida.
[00200] O polinucleotídeo que codifica a DsbC e/ou o polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse é inserido convenientemente em um vetor replicável, tipicamente um vetor de replicação autônoma, para expressão na célula sob controle de um promotor adequado para a célula. Muitos vetores são conhecidos na técnica para essa finalidade e a seleção do vetor apropriado pode depender do tamanho do ácido nucleico e do tipo de célula particular.
[00201] Exemplos de vetores que podem ser empregados para transformar a célula do hospedeiro com um polinucleotídeo de acordo com a invenção incluem:
um plasmídeo, tal como pBR322 ou pACYC184, e/ou um vetor viral, tal como um fago bacteriano um elemento genético transponível, tal como um transposon.
[00202] Esses vetores normalmente compreendem uma origem de replicação de DNA do plasmídeo, um marcador selecionável de antibiótico, um promotor e terminador de transcrição separado por um sítio de múltiplas clonagens (cassete de expressão) e uma sequência de DNA que codifica um sítio de ligação ao ribossomo.
[00203] Os promotores empregados na presente invenção podem estar ligados ao polinucleotídeo relevante diretamente ou, como alternativa, podem estar localizados em uma posição apropriada, por exemplo, em um vetor de modo que, quando o polipeptídeo relevante é inserido, o promotor relevante pode atuar sobre o mesmo. Em uma modalidade, o promotor está localizado antes da porção codificadora do polinucleotídeo na qual atua, por exemplo, um promotor relevante antes de cada porção codificadora de polinucleotídeo. “Antes”, conforme aqui utilizado, implica que o promotor está localizado no terminal 5 em relação à porção do polinucleotídeo codificador.
[00204] Os promotores podem ser endógenos ou exógenos às células hospedeiras. Promotores adequados incluem Lac, tac, trp, PhoA, Ipp, Arab, Tet e T7. [00205] Um ou mais promotores empregados podem ser promotores induzíveis.
[00206] Na modalidade em que o polinucleotídeo que codifica a DsbC e o
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42/75 polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse são inseridos em um vetor, as sequências de nucleotídeo que codifica a DsbC e a proteína de interesse podem estar sob o controle de um único promotor ou de promotores separados. Na modalidade em que as sequências de nucleotídeo que codificam a DsbC e a proteína de interesse estão sob o controle de promotores separados, o promotor pode ser um promotor independentemente induzível.
[00207] Unidades de expressão para uso em sistemas bacterianos geralmente contêm ainda uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) ligada operacionalmente ao DNA que codifica o polipeptídeo de interesse. O promotor pode ser removido do DNA da fonte bacteriana pela digestão da enzima de restrição e inserido no vetor contendo o DNA desejado.
[00208] Nas modalidades da presente invenção em que uma sequência de polinucleotídeo compreende duas ou mais sequências de codificação para duas ou mais proteínas de interesse, por exemplo, uma cadeia leve do anticorpo e cadeia pesada do anticorpo, a sequência de polinucleotídeo pode compreender uma ou mais sequências do sítio interno de entrada do ribossomo (IRES) que permitem o início da tradução na parte média de um mRNA. Uma sequência IRES pode estar posicionada entre sequências de polinucleotídeo codificadoras para intensificar a tradução separada do mRNA e produzir as sequências de polipeptídeo codificadas.
[00209] O vetor de expressão preferencialmente também compreende uma mensagem dicistrônica para produzir o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como descrito no documento WO 03/048208 ou W02007/039714 (o conteúdo desses documentos é aqui incorporado por meio de citação). Preferencialmente o cístron a montante contém o DNA que codifica para a cadeia leve do anticorpo e o cístron a jusante contém DNA que codifica para a cadeia pesada correspondente, e a sequência intergênica dicistrônica (IGS) compreende preferencialmente uma sequência selecionada entre IGS1 (ID de SEQ N°: 36), IGS2 (ID de SEQ N°: 37), IGS3 (ID de SEQ N°: 38) e IGS4 (ID de SEQ N°: 39).
[00210] Os terminadores podem ser endógenos ou exógenos às células
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43/75 hospedeiras. Um terminador adequado é rrnB.
[00211] Outros reguladores de transcrição adequados, inclusive promotores e terminadores e métodos de endereçamento de proteínas podem ser encontrados em “Strategies for Achieving High-Level Expression of Genes in Escherichia coli” Savvas C. Makrides, Microbiological Reviews, setembro de 1996, p 512-538.
[00212] O polinucleotídeo de DsbC inserido no vetor de expressão compreende preferencialmente o ácido nucleico que codifica a sequência de sinal de DsbC e a sequência codificadora de DsbC. O vetor preferencialmente contém uma sequência de ácido nucleico que permite ao vetor replicar em uma ou mais células hospedeiras selecionadas, preferencialmente replicar independentemente do cromossoma do hospedeiro. Essas sequências são amplamente conhecidas para um grande número de bactérias.
[00213] Em uma modalidade a DsbC e/ou a proteína de interesse compreende uma cauda de histidina no terminal N e/ou terminal C.
[00214] A molécula do anticorpo pode ser secretada pela célula ou endereçada ao periplasma por sequências de sinal adequadas. Alternativamente, as moléculas do anticorpo podem acumular no interior do citoplasma da célula. Preferencialmente, a molécula do anticorpo é endereçada ao periplasma.
[00215] O polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse pode ser expresso como uma fusão com outro polipeptídeo, preferencialmente uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo que tem um sítio de divagem específico no terminal N do polipeptídeo maduro. A sequência de sinal heteróloga selecionada deve ser reconhecida e processada pela célula do hospedeiro. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a sequência nativa ou uma sequência de sinal do polipeptídeo eucariótico, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica. Sequências de sinal adequadas incluem OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA e DsbC.
[00216] A construção de vetores adequados contendo um ou mais dos componentes listados acima emprega técnicas padronizadas de ligação. Plasmídeos isolados ou fragmentos de DNA são clivados, individualizados, e religados na forma
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44/75 desejada para gerar os plasmídeos requeridos.
[00217] Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a presente invenção proporciona um vetor multicistrônico que compreende a sequência de polinucleotídeo que codifica a DsbC e a sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse. O vetor multicistrônico pode ser produzido por um método de clonagem vantajoso que permite clonagem sequencial repetida das sequências de polinucleotídeo em um vetor. O método utiliza terminais coesivos compatíveis de um par de sítios de restrição, tais como os terminais “AT” dos sítios de restrição Ase I e Nde I. Uma sequência de polinucleotídeo compreendendo uma sequência codificadora e que tem terminais coesivos compatíveis, tal como um fragmento Asel-Ndel, pode ser clonada em um sítio de restrição no vetor, tal como Nde I. A inserção da sequência de polinucleotídeo destrói o sítio de restrição 5’, mas cria um novo sítio de restrição 3’, tal como Ndel, que pode ser então utilizado para inserir uma sequência de polinucleotídeo adicional que compreende terminais coesivos compatíveis. O processo pode ser então repetido para inserir outras sequências. Cada sequência de polinucleotídeo inserido no vetor compreende a sequência não codificadora 3’ no códon de parada, que pode compreender um sítio Ssp I para triagem, uma sequência de ligação de ribossomo Shine Dalgarno, um espaçador rico em A e um sítio Ndel codificador de um códon de iniciação.
[00218] Uma representação diagramática da criação de um vetor que compreende uma sequência de polinucleotídeo codificadora de uma cadeia leve de um anticorpo (LC), uma cadeia pesada de um anticorpo (HC), uma sequência de polinucleotídeo de DsbC e uma sequência de polinucleotídeo adicional é mostrada na Figura 10.
[00219] Cepas que sofreram mutações bem sucedidas podem ser identificadas através de métodos consagrados na técnica, os quais incluem sequenciamento de DNAS por PCR de colônia e mapeamento de enzima de restrição por PCR de colônia.
[00220] Na modalidade em que a célula compreende dois ou mais genes mutados, a protease mutada pode ser introduzida na bactéria gram negativa em um mesmo vetor ou em vetores diferentes.
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45/75 [00221] Em uma modalidade a célula bacteriana gram negativa de acordo com a presente invenção não é portadora de um gene OmpT mutado inativado, por exemplo, é deficiente na OmpT cromossômica.
[00222] A célula de acordo com a presente invenção pode compreender adicionalmente uma sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse. A sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse pode ser exógena ou endógena. A sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse pode estar integrada no cromossoma do hospedeiro ou pode não estar integrada em um vetor, tipicamente um plasmídeo.
[00223] Em uma modalidade a célula de acordo com a presente invenção expressa uma proteína de interesse. “Proteína de interesse” no contexto do presente relatório descritivo se refere ao polipeptídeo para expressão, normalmente de um polipeptídeo recombinante. No entanto, a proteína de interesse pode ser uma proteína endógena expressada a partir de um gene endógeno na célula do hospedeiro.
[00224] Conforme aqui utilizado, um “polipeptídeo recombinante” se refere a uma proteína que é construída ou produzida através da tecnologia de DNA recombinante. A proteína de interesse pode ser uma sequência exógena idêntica à proteína endógena ou uma versão mutada dessa, por exemplo, com atividade biológica atenuada, ou um fragmento dela, expressada a partir de um vetor exógeno. Alternativamente, a proteína de interesse pode ser uma proteína heteróloga, normalmente não expressada pela célula do hospedeiro.
[00225] A proteína de interesse pode ser qualquer proteína adequada que inclua uma proteína terapêutica, profilática ou diagnóstica.
[00226] Em uma modalidade a proteína de interesse é útil no tratamento de doenças ou disfunções, incluindo-se doenças e disfunções inflamatórias, doenças e disfunções imunes, disfunções fibróticas e cânceres.
[00227] O termo “doença” ou “disfunção inflamatória” e “doença ou disfunção imune” inclui artrite reumatoide, artrite psoriática, doença de still, doença de Muckle Wells, psoríase, doença de Crohn, colite ulcerativa, SLE (Lúpus Sistêmico
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Eritematoso), asma, rinite alérgica, dermatite atópica, esclerose múltipla, vasculite, diabetes mellitus do tipo I, transplante e doença enxerto-hospedeiro.
[00228] O termo “disfunção fibróticas” inclui fibrose pulmonar idiopática (IPF), esclerose sistêmica (ou escleroderma), fibrose renal, neuropatia diabética, nefropatia IgA, hipertensão, doença renal em estágio final, fibrose peritoneal (diálise peritoneal ambulatorial contínua), cirrose hepática, degeneração macular relacionada à idade (ARMD), retinopatia, fibrose reativa cardíaca, cicatrizes, queloides, queimaduras, úlceras dérmicas, angioplastia, cirurgia de bypass coronário, artroplastia e cirurgia da catarata.
[00229] O termo “câncer” inclui um crescimento maligno que surge do epitélio, encontrado na derme, mais comumente, no revestimento dos órgãos do corpo, por exemplo: mama, ovário, próstata, pulmões, rim, pâncreas, estômago, bexiga ou intestino. Os cânceres tendem a infiltrar para o tecido adjacente e se disseminam (metástase) para órgãos distantes, por exemplo: ossos, fígado, pulmões ou cérebro. [00230] A proteína pode ser um polipeptídeo dotado de sensibilidade proteolítica, isto é, proteínas que são propensas à divagem, suscetíveis à divagem, ou clivadas por uma ou mais proteases bacterianas gram-negativas, tais como as proteases da E. coli, seja no estado nativo seja durante a secreção. Em uma modalidade, a proteína de interesse é proteoliticamente sensível a uma protease selecionada entre DegP, Protease III e Tsp. Em uma modalidade a proteína de interesse é proteoliticamente sensível à protease Tsp. Em uma modalidade a proteína de interesse é proteoliticamente sensível às proteases DegP e Protease III. Em uma modalidade a proteína de interesse é proteoliticamente sensível às proteases DegP e Tsp. Em uma modalidade a proteína de interesse é proteoliticamente sensível às proteases Tsp e Protease III. Em uma modalidade a proteína de interesse é proteoliticamente sensível às proteases DegP, Protease III e Tsp.
[00231] Preferencialmente a proteína é um polipeptídeo eucariótico.
[00232] A proteína de interesse expressada pelas células de acordo com a invenção pode ser, por exemplo, um imunógeno, uma proteína de fusão que compreende duas proteínas heterólogas ou um anticorpo. Anticorpos para uso como
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47/75 a proteína de interesse incluem anticorpos monoclonais, multivalentes, multiespecíficos, humanizados, totalmente humanos ou quiméricos. O anticorpo pode ser de qualquer espécie, mas preferencialmente é derivado de um anticorpo monoclonal, um anticorpo humano, ou um fragmento humanizado. O anticorpo pode ser derivado de qualquer classe (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD ou IgA) ou subclasse de molécula da imunoglobulina, podendo ser obtido de qualquer espécie, incluindo-se, por exemplo, camundongo, rato, tubarão, coelho, porco, hamster, camelo, lhama, cabra ou humano. Partes do fragmento do anticorpo podem ser obtidas de mais de uma espécie, por exemplo, os fragmentos do anticorpo podem ser quiméricos. Em um exemplo, as regiões constantes são de uma espécie e as regiões variáveis de outra.
[00233] O anticorpo pode ser uma molécula de anticorpo completa que tem cadeias leves e pesadas completas ou um fragmento dessas, por exemplo, VH, VL, VHH, Fab, Fab modificado, Fab’, F(ab’)2, Fv, fragmento scFv, Fab-Fv, ou um anticorpo com dupla especificidade, tal como um Fab-dAb, como descrito no documento PCT/GB2008/003331.
[00234] O anticorpo pode ser específico para qualquer antígeno alvo. O antígeno pode ser uma proteína associada à célula, por exemplo, uma proteína da superfície celular em células tais como células bacterianas, células de levedura, células T, células endoteliais ou células tumorais, ou pode ser uma proteína solúvel. Os antígenos de interesse também podem ser qualquer proteína de relevância médica, tais como as proteínas que aumentam sua expressão durante período de doença ou infecção, por exemplo, receptores e/ou seus ligantes correspondentes. Exemplos particulares de proteínas da superfície celular incluem moléculas de adesão, por exemplo, integrinas, tais como as integrinas β1, por exemplo, VLA-4, E-selectina, P selectina ou L-selectina, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD11a, CD11b, CD18, CD19, CD20, CD23, CD25, CD33, CD38, CD40, CD40L, CD45, CDW52, CD69, CD134 (0X40), ICOS, BCMP7, CD137, CD27L, CDCP1, receptor CSF1 ou CSF1, DPCR1, DPCR1, dudulin2, FLJ20584, FLJ40787, HEK2, KIAA0634, KIAA0659, KIAA1246, KIAA1455, LTBP2, LTK, MAL2, MRP2, nectin-like2, NKCC1, PTK7,
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RAIG1, TCAM1, SC6, BCMP101, BCMP84, BCMP11, DTD, antígeno carcinoembriogênico (CEA), globulina da gordura do leite humano (HMFG1 e 2), antígenos da Classe I e da Classe II de MHC, KDR e VEGF, e quando apropriado, receptores dos citados.
[00235] Antígenos solúveis incluem interleucina, tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13, IL-14, IL-16 ou IL-17, tais como IL17A e/ou IL17F, antígenos virais, por exemplo, antígenos de citomegalovírus ou vírus sincicial respiratório, imunoglobulinas, tais como IgE, interferons tais como interferon a, interferon β ou interferon γ, fator de necrose tumoral TNF (anteriormente denominado fator de necrose tumoral-oc), fator de necrose tumoral-β, fatores estimulantes de colônia, tais como G-CSF ou GM-CSF, e fatores de crescimento derivado das plaquetas, tais como PDGF-α, e PDGF-β e quando apropriado seus receptores. Outros antígenos incluem os antígenos da superfície da célula bacteriana, toxinas bacterianas, vírus, como os vírus da influenza, EBV, HepA, B e C, agentes bioterroristas, radionuclídeos e metais pesados, e toxinas e venenos de ofídios e aracnídeos.
[00236] Em uma modalidade, o anticorpo pode ser utilizado para alterar funcionalmente a atividade do antígeno de interesse. Por exemplo, o anticorpo pode neutralizar, antagonizar ou estimulam a atividade do dito antígeno, diretamente ou indiretamente.
[00237] Em um aspecto da presente invenção é fornecida uma célula bacteriana gram negativa recombinante que compreende um gene spr mutante que codifica uma proteína spr mutante, um gene Tsp do tipo selvagem e uma sequência de polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo específico para o TNF. O gene Tsp cromossômico do tipo selvagem é preferencialmente um gene Tsp cromossômico não recombinante. Preferencialmente, a célula compreende adicionalmente um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC.
[00238] Em uma modalidade preferencial a proteína de interesse expressada pelas células de acordo com a presente invenção é um anticorpo anti-TNF, mais
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49/75 preferencialmente um Fab’ anti-TNF, como descrito no documento W001/094585 (o conteúdo desses documentos é aqui incorporado por meio de citação).
[00239] Em uma modalidade o anticorpo que tem especificidade para o TNFa humano, compreende uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende uma CDR que tem a sequência mostrada no ID de SEQ N°:28 para CDRH1, a sequência mostrada no ID de SEQ N°:29 ou ID de SEQ N°:34 para CDRH2 ou a sequência mostrada no ID de SEQ N°:30 para CDRH3.
[00240] Em uma modalidade o anticorpo compreende uma cadeia leve em que o domínio variável compreende uma CDR que tem a sequência mostrada no ID de SEQ N°:31 para CDRL1, a sequência mostrada no ID de SEQ N°:32 para CDRL2 ou a sequência mostrada no ID de SEQ N°:33 para CDRL3.
[00241] As CDRs fornecidas nas SEQ IDS NOS:28 e 30 a 34 citadas acima são derivadas de um anticorpo monoclonal de camundongo hTNF40. No entanto, a ID de SEQ N°:29 consiste em uma CDR híbrida. A CDR híbrida compreende parte de CDR2 de cadeia pesada do anticorpo monoclonal de camundongo hTNF40 (ID de SEQ N°:34) e parte de CDR2 de cadeia pesada de uma sequência da região V da linhagem germinativa do grupo 3 humana.
[00242] Em uma modalidade o anticorpo compreende uma cadeia pesada em que o domínio variável compreende uma CDR que tem a sequência mostrada no ID de SEQ N°:28 para CDRH1, a sequência mostrada no ID de SEQ N°:29 ou ID de SEQ N°:34 para CDRH2 ou a sequência mostrada no ID de SEQ N°:30 para CDRH3 e uma cadeia leve em que o domínio variável compreende uma CDR que tem a sequência mostrada no ID de SEQ N°:31 para CDRL1, a sequência mostrada no ID de SEQ N°:32 para CDRL2 ou a sequência mostrada no ID de SEQ N°:33 para CDRL3.
[00243] Em uma modalidade o anticorpo compreende a ID de SEQ N°:28 para CDRH1, ID de SEQ N°: 29 ou ID de SEQ N°:34 para CDRH2, ID de SEQ N°:30 para CDRH3, ID de SEQ N°:31 para CDRL1, ID de SEQ N°:32 para CDRL2 e ID de SEQ N°:33 para CDRL3. Preferencialmente, o anticorpo compreende a ID de SEQ N°:29 para CDRH2.
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50/75 [00244] O anticorpo anti-TNF é preferencialmente uma molécula do anticorpo enxertada por CDR. Em uma modalidade preferencial, o domínio variável compreende regiões da estrutura do aceptor humano e CDRs de doador não humano.
[00245] Preferencialmente a molécula do anticorpo tem especificidade para TNF humano (anteriormente denominado TNFa), em que a cadeia leve compreende a região variável de cadeia leve do ID de SEQ N°: 11 e a cadeia pesada compreende a região variável de cadeia pesada do ID de SEQ N°: 12.
[00246] O anticorpo anti-TNF é preferencialmente um fragmento de Fab ou Fab’.
[00247] Preferencialmente a molécula do anticorpo que tem especificidade para TNF humano é um Fab’ e tem uma sequência de cadeia leve que compreende ou consiste no ID de SEQ N°: 13 e uma sequência de cadeia pesada que compreende ou consiste no ID de SEQ N°: 14.
[00248] Depois da expressão, os fragmentos do anticorpo podem ser adicionalmente processados, por exemplo, por conjugação a outra entidade, como uma molécula efetora.
[00249] O termo molécula efetora conforme aqui utilizado inclui, por exemplo, agentes antineoplásicos, drogas, toxinas (tais como toxinas com atividade enzimática de origem bacteriana ou vegetal e fragmentos dessas, por exemplo, ricina e seus fragmentos) proteínas biologicamente ativas, por exemplo, enzimas, outro anticorpo ou fragmentos do anticorpo, polímeros de ocorrência sintética ou natural, ácidos nucleicos e seus fragmentos, por exemplo, DNA, RNA e fragmentos dos mesmos, radionuclídeos, particularmente radioiodeto, radioisótopos, metais quelados, nanopartículas e grupos repórter, tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por espectroscopia de NMR ou ESR. A molécula efetora pode ser fixada ao anticorpo ou fragmento do mesmo usando qualquer método adequado, por exemplo, um fragmento do anticorpo pode ser modificado para fixar pelo menos uma molécula efetora como descrito no documento W005/003171 ou W005/003170 (o conteúdo desses documentos é aqui incorporado por meio de citação). Os documentos W005/003171 ou W005/003170
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51/75 também descrevem moléculas efetoras apropriadas.
[00250] Em uma modalidade o anticorpo ou seu fragmento, como um Fab, é PEGuilado para gerar um produto com as propriedades requeridas, por exemplo, similares aos anticorpos completos, se necessário. Por exemplo, o anticorpo pode ser um Fab’ anti-TNF-α PEGuilado, como descrito no documento WO01/094585, preferencialmente que ter afixado um dos resíduos de cisteína na ponta do terminal C da cadeia pesada um grupo derivado de lisil-maleimida em que cada um dos dois grupos amino do resíduo lisil tem uma ligação covalente com um resíduo de metoxipoli(etileneglicol) que tem um peso molecular de cerca de 20.000 Da, de modo que o peso molecular médio total dos resíduos de metoxipoli(etileneglicol) é de cerca de 40.000Da, mais preferencialmente o grupo derivado de lisil-maleimida é [1[[[2-[[3-(2,5-dioxo-1 -pirrol idin il)-1 -oxopropil]amino]etil]amino]-carbonil]-1,5pentanodiil]bis(iminocarbonil).
[00251] A célula pode ainda compreender outras sequências de polinucleotídeo codificadoras de uma ou mais proteínas adicionais de interesse.
[00252] Em uma modalidade uma ou mais proteínas do hospedeiro de E.coli que, no tipo selvagem, são conhecidas por co-purificar com a proteína recombinante de interesse durante a purificação, são selecionadas para modificação genética, como descrito em Humphreys et ai. “Engineering of Escherichia coli to improve the purification of periplasmic Fab’ fragments: changing the pl of the chromosomally encoded PhoS/PstS protein”, Protein Expression and Purification 37 (2004) 109-118 e WO04/035792 (o conteúdo desses documentos é aqui incorporado por meio de citação). O uso dessas proteínas modificadas do hospedeiro aperfeiçoa o processo de purificação para as proteínas de interesse, especialmente os anticorpos, produzidas na E.coli alterando as propriedades físicas das proteínas de E.coli selecionadas, de modo que não mais co-purificam com o anticorpo recombinante. Preferencialmente a proteína de E. coli que é alterada é selecionada entre uma ou mais entre a proteína de ligação a Fosfato (PhoS/PstS), proteína de ligação a Dipeptídeo (DppA), proteína de ligação a Maltose (MBP) e Tioredoxina.
[00253] Em uma modalidade, uma propriedade física de uma proteína de
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52/75 hospedeiro contaminante é alterada pela adição de uma tag de aminoácido ao terminal C ou terminal N. Em uma modalidade preferencial, a propriedade física que é alterada é o ponto isoelétrico e a tag do aminoácido é uma tag do ácido poliaspártico fixada ao terminal C. Em uma modalidade, as proteínas de E. coli alteradas pela adição da dita tag são a proteína de ligação a Dipeptídeo (DppA), a proteína de ligação a Maltose (MBP), a Tioredoxina e a proteína de ligação a Fosfato (PhoS/PstS). Em uma modalidade específica, o pl da proteína de ligação a Fosfato (PhoS/PstS) da E.coli é reduzido de 7,2 a 5,1 pela adição de uma tag de ácido poliaspártico (polyD), que contém 6 resíduos de ácido aspártico no terminal C.
[00254] É ainda preferencial a modificação de resíduos específicos da proteína de E. coli contaminante para alterar suas propriedades físicas, isoladamente ou em combinação com a adição de tags do terminal N ou C. Essas alterações podem incluir inserções ou deleções para alterar o tamanho das substituições de aminoácido ou proteína para alterar pl ou hidrofobicidade. Em uma modalidade, esses resíduos estão localizados na superfície da proteína. Em uma modalidade preferencial os resíduos da superfície da proteína de PhoS são alterados para reduzir o pl da proteína. Preferencialmente, os resíduos que estavam implicados por serem importantes na ligação ao fosfato (Bass, US 5.304.472) são evitados para manter a funcionalidade de uma proteína de PhoS. Preferencialmente, são endereçados os resíduos de lisina que se projetam muito além da superfície da proteína ou estão em ou próximos a grandes grupos de resíduos básicos. Em uma modalidade, a proteína de PhoS tem uma tag do hexa-ácido poliaspártico fixada ao terminal C, enquanto os resíduos da superfície na extremidade oposta da molécula são endereçados para substituição. Preferencialmente, os resíduos de lisina selecionados são substituídos por ácido glutâmico ou ácido aspártico para conferir uma alteração de pl de potencial mais alto do que quando os resíduos neutros são alterados para resíduos ácidos. A designação de um mutante de substituição consiste em uma letra seguida por um número seguido por uma letra. A primeira letra designa o aminoácido na proteína do tipo selvagem. O número se refere à posição do aminoácido quando a substituição do aminoácido está sendo realizada, e
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53/75 a segunda letra designa o aminoácido que é utilizado para substituir o aminoácido do tipo selvagem. Nas mutações preferenciais de PhoS na presente invenção os resíduos de lisina (K) 275, 107, 109, 110, 262, 265, 266, 309, 313 são substituídos pelo ácido glutâmico (E) ou glutamina (Q), como mutações únicas ou combinadas, além disso, a lisina (K)318 pode ser substituída pelo ácido aspártico (D) como uma mutação única ou combinada. Preferencialmente as mutações únicas são K262E, K265E e K266E. Preferencialmente as mutações combinadas são K265/266E e Κ110/265/266E. Mais preferencialmente, todas as mutações são combinadas com a tag do ácido poliaspártico (polyD) fixada ao terminal C e opcionalmente também com a substituição de K318D. Em uma modalidade preferencial as mutações resultam em uma redução em pl de pelo menos 2 unidades. Preferencialmente as mutações da presente invenção reduzem o pl de PhoS de 7,2 até cerca de 4 a cerca de 5,5. Em uma modalidade da presente invenção o pl da proteína de PhoS de E.coli é reduzido de 7,2 a cerca de 4,9, cerca de 4,8 e cerca de 4,5 usando as mutações K318D de polyD, K265/266E de polyD e Κ110/265/266E de polyD, respectivamente.
[00255] O polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse pode ser expresso como uma fusão com outro polipeptídeo, preferencialmente uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo que tenha um sítio de divagem específico no terminal N do polipeptídeo maduro. A sequência de sinal heteróloga selecionada deve ser reconhecida e processada pela célula do hospedeiro. Para as células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam a sequência nativa ou uma sequência de sinal do polipeptídeo eucariótico, a sequência de sinal é substituída por uma sequência de sinal procariótica. Sequências de sinal adequadas incluem OmpA, PhoA, LamB, PelB, DsbA e DsbC.
[00256] As modalidades da invenção aqui descritas com referência ao polinucleotídeo são igualmente aplicadas às modalidades alternativas da invenção, por exemplo, vetores, cassetes de expressão e/ou células hospedeiras que compreendem os componentes empregados nos mesmos, na medida em que o aspecto relevante possa ser aplicado ao mesmo.
[00257] A presente invenção fornece ainda um método para produzir uma
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54/75 proteína recombinante de interesse, sendo que o método compreende cultivar uma célula bacteriana gram negativa recombinante como descrito acima em um meio de cultura em condições efetivas para expressar a proteína recombinante de interesse e recuperar a proteína recombinante de interesse do periplasma da célula bacteriana gram negativa recombinante e/ou meio de cultura. Em uma modalidade em que a célula compreende um polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC, a célula é cultivada em condições efetivas para expressar o polinucleotídeo recombinante que codifica a DsbC.
[00258] A célula bacteriana gram negativa e a proteína de interesse preferencialmente empregadas no método da presente invenção são descritas em detalhes acima.
[00259] Quando o polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse é exógeno, o polinucleotídeo pode ser incorporado na célula do hospedeiro usando qualquer meio apropriado conhecido na técnica. A sequência de polinucleotídeo que codifica a DsbC também pode ser incorporada na célula do hospedeiro usando qualquer meio apropriado conhecido na técnica. Tipicamente, o polinucleotídeo é incorporado como parte de um vetor de expressão que é transformado na célula. Por conseguinte, em um aspecto, a célula de acordo com a presente invenção compreende um cassete de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse e um cassete de expressão que compreende o polinucleotídeo que codifica a DsbC.
[00260] A sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse e a sequência de polinucleotídeo que codifica a DsbC podem ser transformadas em uma célula usando técnicas padronizadas, por exemplo, empregando cloreto de rubídio, PEG ou eletroporação.
[00261] O método de acordo com a presente invenção também pode empregar um sistema de seleção para facilitar a seleção de células estáveis que tenham sido transformadas com sucesso com o polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse. O sistema de seleção tipicamente emprega a cotransformação de uma sequência de polinucleotídeo que codifica um marcador de seleção. Em uma
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55/75 modalidade, cada polinucleotídeo transformado na célula compreende adicionalmente uma sequência de polinucleotídeo que codifica um ou mais marcadores de seleção. Por conseguinte, a transformação do polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse e opcionalmente do polinucleotídeo que codifica a DsbC e os um ou mais polinucleotídeos que codificam o marcador ocorrem juntas e o sistema de seleção pode ser empregado para selecionar as células que produzem as proteínas desejadas.
[00262] As células capazes de expressar os um ou mais marcadores são capazes de sobreviver/crescer/multiplicar sob determinadas condições impostas artificialmente, por exemplo, a adição de uma toxina ou antibiótico, devido às propriedades dotadas pelo polipeptídeo/gene ou componente do polipeptídeo do sistema de seleção incorporado no mesmo (por exemplo, resistência a antibióticos). As células que não conseguem expressar os um ou mais marcadores não são capazes de sobreviver/crescer/multiplicar sob condições impostas artificialmente. As condições impostas artificialmente podem ser selecionadas para que sejam mais ou menos vigorosas, de acordo com a necessidade.
[00263] Qualquer sistema de seleção adequado pode ser empregado na presente invenção. Tipicamente o sistema de seleção pode estar baseado, incluindo-se no vetor, em um ou mais genes que proporcionam resistência a um antibiótico conhecido, por exemplo, um gene de resistência à tetraciclina, cloranfenicol, canamicina ou ampicilina. Células que crescem na presença de um antibiótico relevante podem ser selecionadas na medida em que expressem tanto o gene que confere resistência ao antibiótico quanto a proteína desejada.
[00264] Um sistema de expressão induzível ou um promotor constitutivo podem ser utilizados na presente invenção para expressar a proteína de interesse e/ou a DsbC. Em uma modalidade, a expressão da sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse e o polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC é induzida pela adição de um indutor ao meio de cultura. Sistemas de expressão induzível e promotores constitutivos são consagrados na técnica.
[00265] Qualquer meio apropriado pode ser utilizado para cultivar a célula
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56/75 transformada. O meio pode ser adaptado para um sistema de seleção específico, por exemplo, o meio pode compreender um antibiótico, para permitir o crescimento no meio somente daquelas células que tenham sido transformadas com sucesso. [00266] As células obtidas do meio podem ser submetidas à triagem e/ou purificação adicional, conforme necessário. O método pode compreender adicionalmente uma ou mais etapas de extração e purificação da proteína de interesse, de acordo com a necessidade.
[00267] O polipeptídeo pode ser recuperado da cepa, incluindo-se do citoplasma, periplasma e/ou sobrenadante.
[00268] O método (s) específico utilizado para purificar uma proteína depende do tipo da proteína. Métodos adequados incluem fracionamento em colunas de imunoafinidade ou troca iônica; precipitação com etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia em sílica; cromatografia em uma resina de troca iônica, como S-SEPHAROSE e DEAE; focagem isoelétrica; precipitação com sulfato de amônio; e filtração em gel.
[00269] Em uma modalidade o método compreende adicionalmente separar a proteína recombinante de interesse de DsbC.
[00270] Os anticorpos podem ser convenientemente separados do meio de cultura e/ou extrato citoplasmático e/ou extrato periplasmático usando procedimentos convencionais de purificação do anticorpo tais como, por exemplo, proteína Asefarose, cromatografia da proteína G, cromatografia da proteína L, tiofílico, resinas de modo misto, Cauda de histidina, FLAGTag, cromatografia com hidroxilapatita, gel de eletroforese, diálise, cromatografia de afinidade, fracionamento/precipitação com sulfato de amônio, etanol ou PEG, membranas de troca iônica, cromatografia de adsorção de leito expandido (EBA) ou cromatografia de leito móvel simulado.
[00271] O método pode incluir adicionalmente uma etapa adicional de medição da quantidade de expressão da proteína de interesse e seleção das células com níveis elevados de expressão da proteína de interesse.
[00272] O método pode ainda incluir uma ou mais etapas adicionais a jusante, tais como PEGuilação da proteína de interesse, tais como um anticorpo ou fragmento do
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57/75 anticorpo.
[00273] Uma ou mais etapas do método aqui descrito podem ser praticadas em combinação em um recipiente adequado, como um biorreator.
[00274] Exemplos [00275] Exemplo 1 - Cepa da Célula de Geração MXE001 (ATsp) [00276] A cepa MXE001 foi gerada da seguinte forma:
[00277] O cassete de Tsp foi movido como fragmentos de restrição Sal I, Not I em plasmídeos pKO3 similarmente restringidos. O plasmídeo pKO3 utiliza o mutante sensível à temperatura da origem de replicação de pSC101 (RepA) junto com um marcador de cloranfenicol para forçar e selecionar eventos de integração cromossômica. O gene sacB que codifica a levansucarase é letal para E. coli cultivada em sacarose e portanto, (junto com o marcador de cloranfenicol e origem de pSC101) é utilizado para forçar e selecionar a eventos de cura de plasmídeo e desagregação. Essa metodologia foi previamente descrita (Hamilton et al., 1989, Journal of Bacteriology, 171, 4617-4622 e Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). O sistema pKO3 remove todos os marcadores seletivos do genoma do hospedeiro, salvo pelo gene inserido.
[00278] Os seguintes plasmídeos foram construídos.
[00279] pMXE191 que compreende o gene Tsp mutado inativado como mostrado no ID de SEQ N°: 3 que compreende os marcadores de restrição EcoR I e Ase I.
[00280] O plasmídeo foi então transformado nas células W3110 de E. coli eletrocompetentes preparadas usando o método encontrado em Miller, E.M. E Nickoloff, J.A., “Escherichia coli electrotransformation”, em Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995).
[00281] Dia 1 40μΙ de células de E. coli foram misturadas com (1 Opg) 1 μΙ de DNA de pKO3 em um cuveta de eletroporação de 0,2 cm Bio Rad, resfriadas antes da eletroporação a 2500V, 25μΕ e 200Ω. 1000μΙ de 2xPY foram adicionados imediatamente, as células recuperadas por agitação a 250rpm em uma incubadora a 30°C por 1 hora. As células foram diluídas serialmente em 1/10 em 2xPY antes que alíquotas de 100μΙ fossem plaqueadas em placas de agar 2xPY contendo
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58/75 cloranfenicol a 20pg/ml, pré-aquecidas a 30°C e 43°C. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C e 43°C.
[00282] Dia 2 O número de colônias que cresceram a 30°C forneceu uma estimativa acerca da eficiência de eletroporação, enquanto as colônias que sobreviveram ao crescimento a 43°C representam eventos de integração potencial. Colônias únicas da placa de 43°C foram coletadas e ressuspendidas em 10ml de 2xPY. 10ΟμΙ dessa fração foram plaqueados em placas de agar 2xPY contendo 5% (p/v) de sacarose pré-aquecida a 30°C para gerar colônias únicas. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C.
[00283] Dia 3 As colônias representam aqui potenciais eventos simultâneos de cura de plasmídeo e desagregação. Se os eventos de cura e desagregação ocorressem no início do crescimento, então a maior parte da massa da colônia seria clonal. Colônias únicas foram coletadas e replicadas em agar 2xPY que continha cloranfenicol a 20pg/ml ou 5% (p/v) sacarose. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C.
[00284] Dia 4 Colônias que crescem em sacarose e perecem em cloranfenicol representam potenciais eventos de substituição cromossômica e cura de plasmídeo. Essas colônias foram coletadas e avaliadas por PCR com um oligonucleotídeo específico para mutação. As colônias que geraram uma banda de PCR positiva do tamanho correto foram removidas para produzir colônias únicas em agar 2xPY contendo 5% (p/v) sacarose e , as placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C.
[00285] Dia 5 Colônias únicas de E. coli positivas em PCR, sensíveis ao cloranfenicol e resistentes à sacarose foram utilizadas para produzir estoques de glicerol, células quimicamente competentes e atuar como moldes de PCR para uma reação de PCR com oligonucleotídeos de flanqueamento 5’ e 3’ para gerar o produto de PCR para sequenciamento de DNA direto usando Taq polimerase.
[00286] A cepa celular MXE001 foi testada para confirmar a modificação bem sucedida do DNA genômico portador do gene Tsp mutado por amplificação de PCR da região do gene Tsp que compreende um sítio de restrição Ase I de ocorrência
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59/75 não natural, como mostram as Figuras 1a, 1b e 1c, usando iniciadores de oligonucleotídeos. As regiões amplificadas do DNA foram então analisadas por gel de eletroforese antes e depois da incubação com a enzima de restrição Ase I para confirmar a presença do sítio de restrição Ase I de ocorrência não natural nos genes mutados. Este método foi conduzido da seguinte forma:
[00287] Os oligonucleotídeos a seguir foram utilizados para amplificar, usando PCR, o DNA genômico dos lisados celulares de E. coli preparados com MXE001 e W3110:
[00288] 6284 Tsp 3' 5’-GCATCATAATTTTCTTTTTACCTC-3’ (ID de
SEQ N°: 15) [00289] 6283 Tsp 5' 5’-GGGAAATGAACCTGAGCAAAACGC-3’ (ID de
SEQ N°: 16) [00290] Os lisados foram preparados aquecendo uma única colônia de células por 10 minutos a 95°C em 20ul de tampão de PCR 1x. A mistura resfriou até a temperatura ambiente e em seguida foi centrifugada a 13.200rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi removido e rotulado como ‘lisado celular’.
[00291] Cada cepa foi amplificada usando o par de oligonucleotídeos Tsp.
[00292] O DNA foi amplificado usando um procedimento de PCR padrão.
[00293] 5ul [00294] 1ul [00295] 1 5ul [00296] 1 5ul [00297] 2ul [00298] 05ul [00299] 38.5ul
Tampão x10 (Roche) mistura de dNTP (Roche, mistura de 10mM)
5’ oligo (5 pmol)
3’ oligo (5 pmol)
Lisado celular
Taq DNA polimerase (Roche 5U/ul)
H2O [00300] ciclo de PCR.
[00301] 94°C [00302] 94°C [00303] 55°C [00304] 72°C minuto minuto) minuto) repetido por 30 ciclos minuto)
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60/75 [00305] 72 °C 10 minutos [00306] Uma vez completadas as reações, 25ul foram removidos para um tubo novo de microcentrífuga para digestão com Ase I. A 25ul da reação de PCR, 19ul de H2O, 5ul de tampão 3 (NEB), 1 ul de Ase I (NEB) foram adicionados, misturados e incubados a 37 °C por 2 horas.
[00307] À reação de PCR restante foram adicionados 5ul de tampão de carregamento (x6) e 20ul foram carregados em um 200 ml de gel de agarose TAE a 0,8% (Invitrogen) mais brometo de etídio (5ul do estoque de 10mg/ml) e a corrida processada em 100 volts por 1 hora. 10ul do marcador de tamanho (Perfect DNA marker 0,1-12Kb, Novagen) foi carregado na faixa final.
[00308] Uma vez completadas as digestões de Ase I, foram adicionados 10ul do tampão de carregamento (x6) e 20ul foram carregados em um gel de agarose TAE a 0,8% (Invitrogen) mais Brometo de etídio (5ul do estoque de 10mg/ml) e a corrida processada em 100 volts por 1 hora. 10ul de marcador de tamanho (Perfect DNA marker 0.1-12Kb, Novagen) foi carregado na faixa final. Os dois géis foram visualizados usando transluminador UV.
[00309] O fragmento genômico amplificado mostrou a banda de tamanho correto equivalente a 2,8Kb para Tsp. Em seguida, a digestão com Ase I confirmou a presença dos sítios Ase I introduzidos na cepa deficiente em Tsp MXE001, mas não no controle W3110.
[00310] MXE001: o DNA genômico amplificado usando o conjunto de iniciador de
Tsp e o DNA resultante foi digerido com Ase I para produzir bandas com 2,2 e 0,6 Kbps.
[00311] O DNA amplificado por PCR de W3110 não foi digerido pela enzima de restrição Ase I.
[00312] Exemplo 2 - Geração de mutantes de spr [00313] As mutações de spr foram geradas e selecionadas usando um ensaio de complementação.
[00314] O gene spr foi mutado usando o kit de PCR para diversidade mutagênese aleatória Clontech® que introduziu 1 a 2 mutações por 1000bp. O DNA PCR spr
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61/75 mutado foi clonado em um vetor de expressão induzível [pTTO CDP870] que expressa Fab’ CDP870 junto com o mutante spr. Essa ligação foi então eletrotransformada na cepa de E.coli MXE001 (ATsp) preparada usando o método encontrado em Miller, E.M. E Nickoloff, J.A., “Escherichia coli electrotransformation”, em Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995). Utilizou-se o protocolo adiante, 40ul de MXE001 eletrocompetente, 2,5ul da ligação (100pg de DNA) foram adicionados a uma cuveta de eletroporação de 0,2cm, a eletrotransformação foi realizada usando BioRad Genepulser Xcell com as seguintes condições, 2500V, 25pF e 200Ω. Depois da eletrotransformação, 1ml de SOC (Invitrogen) (pré-aquecido a 37 °C) foi adicionado e permitiu-se a recuperação das células a 37 °C por 1 hora com agitação suave.
[00315] As células foram plaqueadas em agar Hipotônico (5g/L de extrato de levedura, 2,5g/L de Triptona, 15g/L Agar (todos Difco)) e incubadas a 40 °C. As células que formaram colônias foram novamente plaqueadas em HLB a 43 °C para confirmar a recuperação da capacidade de crescimento em baixas condições osmóticas em alta temperatura para a cepa MXE001. O DNA do plasmídeo foi preparado a partir dos clones selecionados e sequenciados para identificação das mutações de spr.
[00316] Usando este método, oito mutações únicas, uma mutação dupla e duas mutações múltiplas na proteína spr foram isoladas e complementavam o fenótipo ATsp da seguinte forma:
[00317] V98E [00318]D133A [00319]V135D [00320]V135G [00321]G147C [00322] S95FeY115F [00323] I70T [00324] N31T, Q73R, R100G, G140C [00325] R62C, Q99P, R144C
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62/75 [00326] L108S [00327] L136P [00328] Exemplo 3 - Geração de Cepas de células de E. coli mutantes portadoras de mutações de spr [00329] As mutações individuais 1 a 5 identificadas no Exemplo 2 e três mutações de tríade catalítica de spr (C94A, H145A, H157A) e W174R foram utilizadas para gerar novas cepas usando a cepa de E. coli W3110 do tipo selvagem (genótipo: FLAM- IN (rrnD-rrnE)l rph1 (ATCC n° 27325)) para criar as cepas mutadas de spr portadoras de um gene Tsp cromossômico não recombinante do tipo selvagem ou a cepa MXE001 (ATsp) do Exemplo 1 para produzir as cepas ATsp/spr mutante combinadas.
[00330] As seguintes cepas de células de E. coli mutantes foram geradas usando um sistema de vetor de substituição gênica usando o plasmídeo pKO3 de substituição/ recombinação homóloga (Link et al., 1997, Journal de Bacteriology, 179, 6228-6237), como descrito no Exemplo 1 para a geração de MXE001.
[00331] Quadro 1
Cepa de Célula de E. coli Mutante | Genótipo | Vetores Spr |
MXE001 | ATsp | - |
MXE008 | ATsp, spr D133A | pMXE339, pK03 spr D133A (- Sall) |
MXE009 | ATsp, spr H157A | pMXE345, pK03 spr H157A (- Sall) |
MXE010 | sprG147C | pMXE338, pK03 spr G147C (- Sall) |
MXE011 | spr C94A | pMXE343, pK03 spr C94A (- Sall) |
MXE012 | sprH145A | pMXE344, pK03 spr H145A (- Sall) |
MXE013 | sprW174R | pMXE346, pK03 spr W174R (- |
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Sall) | ||
MXE014 | ATsp, spr V135D | pMXE340, pK03 spr V135D (- Sall) |
MXE015 | ATsp, spr V98E | pMXE342, pK03 spr V98E (- Sall) |
MXE016 | ATsp, spr C94A | pMXE343, pK03 spr C94A (- Sall) |
MXE017 | ATsp, spr H145A | pMXE344, pK03 spr H145A (- Sall) |
MXE018 | ATsp, spr V135G | pMXE341, pK03 sprV135G (- Sall) |
[00332] Os cassetes de integração de spr mutante foram movidos como fragmentos de restrição Sal I, Not I em plasmídeos pKO3 similarmente restringidos.
[00333] O plasmídeo utiliza o mutante sensível à temperatura da origem de replicação de pSC101 (RepA) junto com um marcador de cloranfenicol para forçar e selecionar eventos de integração cromossômica. O gene sacB que codifica a levansucarase é letal para E. coli cultivada em sacarose e portanto, (junto com o marcador de cloranfenicol e origem de pSC101) é utilizado para forçar e selecionar eventos de cura de plasmídeo e desagregação. Essa metodologia foi previamente descrita (Hamilton et al., 1989, Journal de Bacteriology, 171, 4617-4622 e Blomfield et al., 1991, Molecular Microbiology, 5, 1447-1457). O sistema pKO3 remove todos os marcadores seletivos do genoma do hospedeiro, salvo pelo gene inserido.
[00334] Os seguintes vetores de pK03 foram construídos, compreendendo os genes spr mutados que incluem uma mutação silenciosa dentro da sequência de spr que remove um sítio de restrição Sall para identificação do clone:
pMXE336, pK03 spr S95F (-Sall) pMXE337, pK03 spr Y115F (-Sall) pMXE338, pK03 spr G147C (-Sall) pMXE339, pK03 spr D133A (-Sall)
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64/75 pMXE340, pK03 spr V135D (-Sall) pMXE341, pK03 sprV135G (-Sall) pMXE342, pK03 spr V98E (-Sall) pMXE343, pK03 spr C94A (-Sall) pMXE344, pK03 spr H145A (-Sall) pMXE345, pK03 spr H157A (-Sall) pMXE346, pK03 spr W174R (-Sall).
[00335] Esses plasmídeos foram então transformados em células de W3110 de E. coli W3110 quimicamente competentes preparadas utilizando o método encontrado em Miller, E.M. E Nickoloff, J.A., “Escherichia coli electrotransformation”, em Methods in Molecular Biology, vol. 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 105 (1995) ou na cepa MXE001 do Exemplo 1 para produzir as cepas combinadas ATsp/spr mutante, como mostra o Quadro 1.
[00336] Dia 1 40μΙ de células de E. coli eletrocompetentes ou células MXE001 foram misturadas com (10pg) 1 μΙ de DNA de pKO3 em uma cuveta de eletroporação de 0,2 cm Bio Rad resfriada antes da eletroporação a 2500V, 25pF e 200Ω. 1000μΙ de 2xPY foram adicionados imediatamente, as células recuperadas por agitação a 250rpm em uma incubadora a 30°C por 1 hora. As células foram diluídas serialmente em 1/10 em 2xPY antes que alíquotas de 100μΙ fossem plaqueadas em placas de agar 2xPY contendo cloranfenicol a 20pg/ml pré-aquecidas a 30°C e 43°C. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C e 43°C.
[00337] Dia 2 O número de colônias que cresceram a 30°C forneceu uma estimativa da eficiência de eletroporação, enquanto as colônias que sobreviveram ao crescimento a 43°C representam eventos de integração potencial. Colônias únicas da placa de 43°C foram coletadas e ressuspendidas em 10ml de 2xPY. 100μΙ dessa fração foram plaqueados em placas de agar 2xPY contendo 5% (p/v) de sacarose pré-aquecido a 30°C para gerar colônias únicas. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C.
[00338] Dia 3 As colônias representam aqui potenciais eventos simultâneos de cura de plasmídeo e de-integração. Se os eventos de cura e desagregação
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65/75 ocorressem no início do crescimento, então a maior parte da massa da colônia seria clonal. Colônias únicas foram coletadas e replicadas em agar 2xPY que continha cloranfenicol a 20pg/ml ou 5% (p/v) de sacarose. As placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C.
[00339] Dia 4 Colônias que crescem em sacarose e perecem em cloranfenicol representam potenciais eventos de substituição cromossômica e cura de plasmídeo. Essas colônias foram coletadas e avaliadas por PCR mais digestão de restrição para a perda de um sítio Sall. Colônias que geraram uma banda de PCR positiva do tamanho correto e resistência à digestão por Sall foram removidas para produzir colônias únicas em agar 2xPY contendo 5% (p/v) de sacarose e as placas foram incubadas de um dia para o outro a 30°C.
[00340] Dia 5 Colônias únicas de E. coli positivas em PCR, sensíveis ao cloranfenicol e resistentes à sacarose foram utilizadas para produzir estoques de glicerol, células quimicamente competentes e atuar como moldes de PCR para uma reação de PCR com oligonucleotídeos de flanqueamento 5’ e 3’ para gerar o produto de PCR para sequenciamento de DNA direto usando Taq polimerase para confirmar a mutação correta.
[00341] Exemplo 4 - Geração de plasmídeo para coexpressão de Fab’ e DsbC [00342] Construiu-se um plasmídeo que continha sequências de cadeia pesada e leve de um Fab’ anti-TNF (um Fab’ anti-TNF que tem uma sequência de cadeia leve mostrada no ID de SEQ N°: 13 e uma sequência de cadeia pesada mostrada no ID de SEQ N°: 14) e a sequência codificadora da DsbC.
[00343] Foi criada uma mensagem dicistrônica do fragmento Fab’ anti-TNFa (denominado CDP870) descrito no documento WO01/94585. O cístron a montante codificou a cadeia leve do anticorpo (ID de SEQ N°: 13) enquanto o cístron a jusante codificou a cadeia pesada do anticorpo (ID de SEQ N°: 14). Uma sequência de DNA que codifica o peptídeo de sinal OmpA foi fundida ao terminal 5’ do DNA que codifica cada da cadeia leve e cadeia pesada para permitir a secreção eficiente para o periplasma. A sequência intergênica (IGS2) foi utilizada como mostra o ID de SEQ N°: 37.
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66/75 [00344] O plasmídeo pDPH358 (ρΤΤΟ 40.4 CDP870 IGS2), um vetor de expressão para o Fab’ CDP870 (um Fab’ anti-TNF) e DsbC (um polipeptídeo periplasmático), foi construído com o uso de metodologias de clonagem de restrição convencionais que podem ser encontradas em Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y. O plasmídeo pDPH358 exibia as seguintes características; uma sequência de operador lac e promotor tac forte. Como mostra a Figura 10, o plasmídeo continha um único sítio de restrição EcoRI depois da região de codificação da cadeia pesada do Fab’, seguido por uma sequência não codificadora e depois um único sítio de restrição Ndel. O gene DsbC foi clonado por PCR usando o DNA cromossômico bruto de W3110 como molde, de modo que o produto de PCR codificou um sítio EcoRI 5’ seguido por uma forte ligação de ribossomo, seguida pelo códon de iniciação nativo, sequência de sinal e sequência de DsbC madura, terminando em uma cauda de histidina do terminal C e finalmente um sítio não codificador Ndel. O fragmento de PCR EcoRI-Ndel foi restringido e ligado no vetor de expressão de modo que todos os três polipeptídeos: cadeia leve de Fab’, cadeia pesada de Fab’e DsbC foram codificados em um único mRNA policistrônico.
[00345] Os genes da cadeia pesada, cadeia leve de Fab e o gene DcbC foram transcritos como uma única mensagem policistrônica. O DNA que codifica o peptídeo de sinal da proteína OmpA de E. coli foi fundido ao terminal 5’ das sequências gênicas de cadeia leve e pesada, que direcionaram a translocação dos polipeptídeos ao periplasma de E. coli. A transcrição foi terminada usando um terminador de dupla transcrição rrnB t1t2. O gene laclq codificou a proteína repressora Lac I constitutivamente expressada. Essa transcrição reprimida do promotor tac até a desrepressão foi induzida pela presença de alolactose ou IPTG. A origem de replicação utilizada foi a p15A, que mantinha um baixo número de cópia. O plasmídeo continha um gene de resistência à tetraciclina para seleção de antibiótico.
[00346] Exemplo 5 - Expressão de Fab’ anti-TNF ou Fab’ anti-TNF e DsbC nas cepas de E.coli
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67/75 [00347] Expressão de Fab’ anti-TNF e DsbC [00348] A linhagem celular W3110 do tipo selvagem, a cepa W3110 fornecida no Exemplo 1 e a cepa mutante MXE012 (cepa mutante spr H145A) fornecida no Exemplo 3 foram transformadas com o plasmídeo gerado no Exemplo 4.
[00349] A transformação das cepas foi conduzida utilizando o método encontrado em Chung C.T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989).
[00350] Expressão de Fab’ anti-TNF [00351] A linhagem celular W3110 do tipo selvagem, as cepas mutantes spr MXE008, MXE012, MXE017 e MXE012 (cepa mutante spr H145A) fornecidas no Exemplo 3 e a cepa W3110 fornecida no Exemplo 1 foram transformadas com o plasmídeo pMXE117 (pTTO CDP870 ou 40.4 IGS17), um vetor de expressão para o Fab’ CDP870 (um Fab’ anti-TNF que tem uma sequência de cadeia leve mostrada no ID de SEQ N°: 13 e uma sequência de cadeia pesada mostrada no ID de SEQ N°: 14), foi construído com o uso de metodologias de clonagem de restrição convencionais que podem ser encontradas em Sambrook et al 1989, Molecular cloning: a laboratory manual. CSHL press, N.Y. O plasmídeo pMXE117 (pTTO CDP870 ou 40.4 IGS17) exibia as seguintes características; uma sequência de operador lac e promotor tac forte. Os genes de cadeia leve e pesada de Fab foram transcritos como uma única mensagem dicistrônica. O DNA que codifica o peptídeo de sinal da proteína OmpA de E. coli foi fundido ao terminal 5’ das sequências gênicas de cadeia leve e de cadeia pesada, que direcionaram a translocação dos polipeptídeos ao periplasma de E. coli. A transcrição foi terminada usando um terminador de dupla transcrição rrnB t1t2. O gene laclq codificou a proteína repressora Lac I constitutivamente expressada. Essa transcrição reprimida do promotor tac até a desrepressão foi induzida pela presença de alolactose ou IPTG. A origem de replicação utilizada foi a p15A, que mantinha um baixo número de cópia. O plasmídeo continha um gene de resistência à tetraciclina para seleção de antibiótico.
[00352] A transformação das cepas foi conduzida usando o método encontrado
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68/75 em Chung C.T et al Transformation and storage of bacterial cells in the same solution. PNAS 86:2172-2175 (1989).
[00353] Exemplo 6 - Expressão de um Fab’ anti-TNF em cepas de E. coli mutadas usando culturas em frasco agitado [00354] As seguintes cepas conforme produzidas pelo Exemplo 5 as quais expressam Fab’ anti-TNF: W3110, MXE001, MXE012 e MXE017 foram testadas em um experimento em frascos agitados que compara o crescimento e a expressão do Fab’.
[00355] O protocolo experimental de frascos agitados utilizado foi realizado da seguinte forma:
[00356] Experimento em frascos agitados de 5 ml [00357] Uma única colônia foi colocada em 5ml LB mais tetraciclina a 10ug/ml e o crescimento permitido de um dia para o outro a 30°C com agitação a 250rpm.
[00358] A cultura de um dia foi utilizada para inocular 100ml mais tetraciclina em OD600 0,1. (isto é, para OD de 4, 100/4x01 = 2,5mls em 100ml.) [00359] Tubos de cultura 3x5ml foram definidos para cada ponto no tempo requerido usando essa cultura mestre. Uma (1) cultura de referência foi ajustada para amostragem para medição de OD.
[00360] As culturas foram agitadas a 30°C 250rpm monitorando primeiramente o crescimento por observação visual, em seguida amostrando a cultura de referência para capturar culturas a OD600 0,5 (normalmente cerca de 2 horas). IPTG foi adicionado a cada tubo de cultura até uma concentração de 200uM (25ul de 0,04M) uma vez que a cultura tivesse atingido um OD superior a 0,5.
[00361] Os tubos de cultura foram removidos nos pontos no tempo requeridos, por exemplo, 1 hora, 2 horas, pós- indução e mantido no gelo.
[00362] Depois da centrifugação a 13.200 rpm por 5 minutos, o pélete de célula foi ressuspendido em 200ul de tampão de extração periplasmática (Tris.Cl 100mM/EDTA 10mM pH 7,4). Os extratos periplasmáticos foram agitados a 250rpm de um dia para o outro a 30°C. No dia seguinte, os extratos foram centrifugados por 10 minutos a 13.200 rpm, o sobrenadante decantado e armazenado a -20°C como
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69/75 ‘extrato periplasmático’. O pélete de célula usado foi descartado.
[00363] Quantificação por ELISA.
[00364] Placas de ELISA com 96 poços foram revestidas de um dia para o outro a 4°C com AB141 (anti-CH1 humano de coelho, UCB) em 2 pgml-1 em PBS. Depois de lavar três vezes com 300ul de tampão conjugado/amostra (PBS, BSA a 0,2% (p/v), Tween 20 0,1% (v/v)), foram realizadas diluições seriais à metade das amostras e padrões na placa em 100 pl de tampão conjugado/amostra, e a placa agitada a 250 r.p.m na temperatura ambiente por 1 hora. Depois de lavar três vezes com 300ul de tampão de lavagem (PBS, Tween 20 0,1% (v/v)), 100 pl do anticorpo revelador 6062 (anti-kappa HRP humano de coelho conjugado, The Binding Site, Birmingham, Reino Unido) foram adicionados, depois diluição a 1/1000 no tampão conjugado/amostra. A placa foi então agitada a 250 r.p.m na temperatura ambiente por 1 hora. Depois de lavar três vezes com 300ul do tampão de lavagem, 100μΙ do substrato TMB foram adicionados (mistura da solução TMB 50:50 (Calbiochem): dH2O) e A63o registrado com uma leitora de placa automatizada. A concentração de Fab' nos extratos periplasmáticos foi calculada por comparação com padrões de Fab' purificados do isotipo apropriado.
[00365] A Figura 1 mostra o crescimento aumentado de MXE012 e MXE017 em comparação à W3110 e MXE001 do tipo selvagem.
[00366] A Figura 2 mostra a maior expressão do Fab’ em MXE012 e MXE017 em comparação à W3110 e MXE001 do tipo selvagem.
[00367] Exemplo 7 - Crescimento de cepas de E. coli que expressam Fab’ antiTNF ou Fab’ anti-TNF e DsbC usando fermentações em alta densidade [00368] As seguintes cepas, conforme produzidas pelo exemplo 5, foram testadas em experimentos de fermentação que comparam o crescimento e a expressão de um Fab’ anti-TNFcc [00369] Cepas que expressam Fab’ anti-TNF produzidas no Exemplo 5:
[00370] W3100 [00371] MXE012 (Cepa mutante de spr H145A) [00372] Cepas que expressam Fab’ anti-TNF e DsbC produzidas no Exemplo 5:
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70/75 [00373] W3110 [00374] ΜΧΕ012 (cepa mutante de spr H145A) [00375] Meio de crescimento.
[00376] O meio de crescimento de fermentação se baseou no meio SM6E (descrito em Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309320) com 3,86 g/l de NahhPCM.hhO e 112 g/l de glicerol.
[00377] Inóculo. As culturas de inóculo cresceram no mesmo meio suplementado com 10 pg/ml de tetraciclina. As culturas foram incubadas a 30°C com agitação por aproximadamente 22 horas.
[00378] Fermentação. Os fermentadores (volume total de 2,5 litros) foram semeados junto com a cultura do inóculo em 0,3-0,5 de Οϋθοο. A temperatura foi mantida a 30°C durante a fase de crescimento e reduzida a 25°C antes da indução. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida acima de 30% da saturação do ar por fluxo de ar e agitação variável. O pH da cultura foi controlado em 7,0 por titulagem automática com NH4OH a 15% (v/v) e H2SO4 conc. a 10% (v/v). A espumagem foi controlada pela adição da solução Struktol J673 a 10% (v/v) (Schill e Seilacher).
[00379] Foram realizadas diversas adições em diferentes estágios da fermentação. Quando a concentração da biomassa atingiu aproximadamente o nível 40 de OD600, sais de magnésio e NaH2PO4.H2O foram adicionados. Outras adições de NaH2PO4.H2O foram realizadas antes e durante a fase de indução para garantir que fosse mantido o excedente de fosfato. Quando o glicerol presente no início da fermentação havia sido depletado (aproximadamente OD600 de 75) aplicou-se uma alimentação contínua de glicerol a 80% (p/p). No mesmo ponto na fermentação aplicou-se uma alimentação de IPTG a 170μΜ. O início da alimentação de IPTG adotado como início da indução. As fermentações foram tipicamente processadas por 64-120 horas nas taxas de alimentação de glicerol (variando entre 0,5 e 2,5 ml/h).
[00380] Medição da concentração da biomassa e taxa de crescimento. A concentração da biomassa foi determinada pela medição da densidade óptica de
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71/75 culturas em 600 nm.
[00381] Extração Periplasmática. Células foram coletadas das amostras de cultura por centrifugação. A fração do sobrenadante foi retida (a -20°C) para análise posterior. Uma fração do pélete da célula foi ressuspendido até o volume original da cultura em tampão de extração (Tris-HCI 100 mM, EDTA 10 mM; pH 7,4). Em seguida à incubação a 60°C por aproximadamente 16 horas, o extrato foi clarificado por centrifugação e a fração do sobrenadante retida (a -20°C) para análise.
[00382] Quantificação de Fab’. As concentrações de Fab’ nos extratos periplasmáticos e sobrenadantes da cultura foram determinadas por ELISA para congregação de Fab' conforme descrito em Humphreys et al., 2002, Protein Expression and Purification, 26, 309-320, e usando HPLC da proteína G. Uma coluna de 1ml de Hitrap Protein HP (GE-Healthcare ou equivalente) foi carregada com analito (pH aproximadamente neutro, 30°C, filtrado 0,2um) em 2ml/min, a coluna foi lavada com fosfato 20mM, NaCI 50mM pH 7,4 e em seguida o Fab’ eluído usando uma injeção de Glicina/HCI 50mM pH 2,7. O Fab’ eluído foi medido por A280 em um sistema de HP de Agilent 1100 ou 1200 e quantificado por referência a uma curva padrão de uma proteína Fab’ purificada de concentração conhecida.
[00383] A Figura 3 mostra o perfil de crescimento de W3110 e MXE012 que expressam Fab’ anti-TNF durante a fermentação com um tempo de processamento estendido. Os dados ilustram um pequeno aumento na taxa de crescimento inicial da cepa spr em relação ao tipo selvagem durante o acúmulo de biomassa e o prolongamento do tempo de sobrevivência da cepa mutante spr MXE012 em relação à cepa W3110 do tipo selvagem nas últimas 20 horas aproximadamente da fermentação.
[00384] A Figura 4 mostra o acúmulo de Fab’ periplasmático (símbolos e linhas cheias) e acúmulo de Fab’ no meio (linhas pontilhadas e símbolos abertos) para W3110 e MXE012 (W3110 spr H145A) que expressam Fab’ anti-TNF durante fermentação com um tempo de processamento estendido. Os dados mostram que as taxas iniciais de acúmulo de Fab’ periplasmático são bastante similares para as duas cepas, mas que as células W3110 do tipo selvagem são permeáveis ao Fab’
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72/75 periplasmático posteriormente na fermentação em comparação a MXE012.
[00385] A Figura 5 mostra o perfil de crescimento das cepas W3110 e MXE012 que expressam Fab’ anti-TNFa e das cepas W3110 e MXE012 que expressam DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa. Pode-se observar que as cepas que expressam DsbC exibem crescimento maior que as cepas celulares correspondentes que não expressam a DsbC recombinante. É possível observar ainda que a presença da mutação de spr nas cepas aumenta o crescimento celular.
[00386] A Figura 6 mostra o rendimento total de Fab do periplasma (símbolos sombreados) e sobrenadante (símbolos não sombreados abertos) do Fab’ anti-TNFa que expressa as cepas de E. coli W3110 e MXE012 e do Fab’ anti-TNFa e DsbC recombinante que expressa as cepas de E. coli W3110 e MXE012. Pode-se observar a partir deste gráfico que as cepas que expressam a DsbC recombinante produziram um alto rendimento de Fab’ anti-TNFa, com a cepa MXE012 produzindo mais de 3,0 g/L em aproximadamente 92 horas. É possível observar ainda que as cepas MXE012 portadoras de um gene spr mutante exibiram lise reduzida em comparação às cepas W3110, as quais podem ser observadas como menos Fab’ anti-TNFa do sobrenadante (símbolos abertos).
[00387] Exemplo 8 - Determinação do Escape de DNA e quantidade de proteína total nas cepas [00388] Ensaio de dsDNA:
[00389] O escape do duplo filamento de DNA no sobrenadante das cepas W3110, MXE001, MXE008 e MXE012 foi determinado usando o kit de ensaio de dsDNA Quant-IT Picogreen kit (Invitrogen, Ref: P11496). Uma curva padrão foi preparada diluindo o DNA padrão fornecido na faixa de 1-1000 ng/mL. As amostras foram diluídas em tampão TE, para que a leitura de fluorescência recaísse na faixa linear do método (500 a 1000 vezes). Em uma placa de 96 poços, 100 pL de amostra diluída ou padrão foram misturados com 100 pL do reagente Picogreen, e a placa foi incubada por 5 minutos na temperatura ambiente, ao abrigo da luminosidade. As contagens de fluorescência foram medidas por 0,1s usando um filtro de excitação de 485nm, e um filtro de emissão de 535nm. Os resultados são mostrados na Figura 7.
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73/75 [00390] Ensaio de proteína:
[00391] A concentração de proteínas totais das cepas W3110, MXE001, MXE008 e MXE012 foi determinada usando o kit de ensaio Coomassie Plus Bradford (Pierce, Ref: 23236). Uma curva padrão foi efetuada diluindo albumina de soro bovino padronizada em uma faixa de 25-1000pg/ml_. As amostras foram diluídas em água para que a densidade óptica recaísse dentro da faixa linear do método (5 a 10 vezes), e 33 pL da amostra ou padrão foram misturados com 1 mL do reagente coomassie. Depois de incubação por 10 minutos na temperatura ambiente, ODs95nm foi lido em um espectrofotômetro com o reagente de coomassie utilizado como branco. A concentração de proteínas total foi calculada com base na curva padrão. Os resultados são mostrados na Figura 8.
[00392] Exemplo 9 Crescimento de cepas de E. coli que expressam Fab’ anti-TNF e DsbC usando fermentações em larga escala [00393] A seguinte cepa, conforme produzida pelo exemplo 5, foi testada em experimentos de fermentação que comparam o crescimento e a viabilidade da cepa e a expressão de um Fab’ anti-TNFcc [00394] MXE012 (mutante H145A de spr) que expressa Fab’ anti-TNF e DsbC produzida no Exemplo 5 [00395] As fermentações foram conduzidas da seguinte forma:
[00396] As células de MXE012 que expressam Fab’ anti-TNF e DsbC cresceram inicialmente usando um meio complexo de extrato de levedura e peptona em cultura de frascos de agitação. As células foram então transferidas para um fermentador de estágio de semente usando um meio quimicamente definido. As células cresceram em condições não limitantes de nutriente até um ponto de transferência definido. As células foram então transferidas para um fermentador de produção de 250L usando um meio quimicamente definido similar com um volume final de aproximadamente 230L. A cultura foi inicialmente cresceu no modo de batelada até o esgotamento da fonte de carbono. Após o esgotamento da fonte de carbono uma alimentação limitante de fonte de carbono o foi alimentada em uma taxa exponencialmente crescente. Depois da adição de uma quantidade definida da fonte de carbono, a taxa
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74/75 de adição da solução de alimentação foi reduzida e IPTG adicionado para induzir a expressão de Fab’. A fermentação prosseguiu e o Fab’ acumulado no periplasma. Em um período definido depois da indução, a cultura foi coletada por centrifugação e o Fab’ foi extraído das células ressuspendendo as células coletadas em um tampão Tris e EDTA e aquecendo até 59°C.
[00397] Os perfis de crescimento das fermentações foram determinados medindo a densidade óptica da cultura em 600 nm.
[00398] Os títulos do Fab’ foram determinados por HPLC da proteína G, como descrito no Exemplo 7 acima, exceto que, durante a extração periplasmática, foram utilizadas células frescas e 1ml_ de tampão de extração foi adicionado à cultura celular. O Fab’ do sobrenadante e periplasmático foram medidos conforme descrito no Exemplo 7. A Figura 12 mostra o título do Fab’ periplasmático.
[00399] A viabilidade da cultura celular foi medida por citometria de fluxo usando Fluorescence-Activated Cell Sorting.
[00400] A Figura 11 mostra os perfis de crescimento de 200L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[00401] A Figura 12 mostra os títulos periplasmáticos de Fab’ anti-TNFa de 200L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[00402] A Figura 13 mostra as viabilidades de 200L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[00403] Exemplo 10 Crescimento de cepas de E. coli que expressam Fab’ antiTNF e DsbC usando fermentações em larga escala [00404] A seguinte cepa, conforme produzida pelo exemplo, 5 foi testada em experimentos de fermentação que comparam o crescimento da cepa e a expressão de um Fab’ anti-TNFa:
[00405] MXE012 que expressa Fab’ anti-TNF e DsbC produzida no Exemplo 5 [00406] As fermentações foram conduzidas conforme descrito no Exemplo 9, com um fermentador de produção de 3000L, contendo um volume final de aproximadamente 2650L.
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75/75 [00407] Os perfis de crescimento das fermentações foram determinados medindo a densidade óptica de cultura em 600 nm.
[00408] Os títulos do Fab’ foram determinados por HPLC da proteína G conforme descrito no Exemplo 9 acima.
[00409] A Figura 14 mostra os perfis de crescimento de 3000L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[00410] A Figura 15 mostra os títulos periplasmáticos de Fab’ anti-TNFa de 3000L de fermentações da cepa MXE012 que expressa DsbC recombinante e Fab’ anti-TNFa.
[00411] Apesar de a invenção ter sido particularmente apresentada e descrita fazendo referência às modalidades preferenciais, os indivíduos versados na técnica perceberão que é possível efetuar diversas alterações em sua forma e detalhes sem desviar do escopo da invenção, conforme definido pelas reivindicações em anexo.
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Claims (13)
- REIVINDICAÇÕES:1. Método para produzir uma proteína recombinante de interesse compreendendo cultivar uma célula bacteriana gram negativa recombinante em um meio de cultura sob condições efetivas para expressar a proteína recombinante de interesse e recuperar a proteína recombinante de interesse do periplasma da célula bacteriana gram negativa recombinante e/ou do meio de cultura, caracterizado pelo fato de que a célula bacteriana gram negativa recombinante compreende:a) um gene spr mutante que codifica uma proteína spr mutante capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado, em que o gene spr mutante codifica uma proteína spr tendo uma mutação no aminoácido H145 conforme a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21; eb) um gene Tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante;em que a célula é isogênica a uma célula E. coli do tipo selvagem, exceto pelo gene spr mutado.
- 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene spr mutante codifica uma proteína spr que tem uma mutação H145A, conforme a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21.
- 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a célula compreende ainda um polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC.
- 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a célula compreende ainda um ou mais dos seguintes genes mutados:a) um gene DegP mutado que codifica uma proteína DegP que tem atividade da chaperona e atividade da protease reduzida;b) um gene ptr mutado, em que o gene ptr mutado codifica uma proteína Protease III que tem atividade da protease reduzida ou é um gene ptr mutado inativado; ec) um gene OmpT mutado, em que o gene OmpT mutado codifica uma proteína OmpT que tem atividade da protease reduzida ou é um gene OmpT mutadoPetição 870190051974, de 03/06/2019, pág. 84/892/3 inativado.
- 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a célula compreende um vetor compreendendo o polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC e a sequência de polinucleotídeo que codifica a proteína de interesse.
- 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um promotor que controla a expressão do polinucleotídeo recombinante que codifica DsbC e a sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína de interesse.
- 7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que a proteína de interesse é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.
- 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é específico para TNF.
- 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteína recombinante de interesse é recuperada a partir do periplasma e/ou sobrenadante.
- 10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de processamento a jusante de peguilação da proteína de interesse.
- 11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a célula E. coli é W3110.
- 12. Célula bacteriana gram negativa recombinante caracterizada pelo fato de que compreende:a) um gene spr mutante que codifica uma proteína spr mutante capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado, em que o gene spr mutante codifica uma proteína spr tendo uma mutação no aminoácido H145 conforme a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21; eb) um gene Tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante;em que a célula é isogênica a uma célula E. coli do tipo selvagem, excetoPetição 870190051974, de 03/06/2019, pág. 85/893/3 pelo gene spr mutado.
- 13. Célula E. coli W3110 recombinante caracterizada pelo fato de que compreende:a) um gene spr mutante que codifica uma proteína spr mutante capaz de suprimir o fenótipo de uma célula que compreende um gene Tsp mutado, em que o gene spr mutante codifica uma proteína spr tendo uma mutação no aminoácido H145 conforme a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21; eb) um gene Tsp cromossômico do tipo selvagem não recombinante.
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US5508192A (en) | 1990-11-09 | 1996-04-16 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides |
US5264365A (en) | 1990-11-09 | 1993-11-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides |
GB9215540D0 (en) | 1992-07-22 | 1992-09-02 | Celltech Ltd | Protein expression system |
US5304472A (en) | 1992-11-20 | 1994-04-19 | Genentech, Inc. | Method of controlling polypeptide production in bacterial cells |
US5639635A (en) | 1994-11-03 | 1997-06-17 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
AU2660397A (en) | 1996-04-05 | 1997-10-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing soluble, biologically-active disulfide bond-containing eukaryotic proteins in bacterial cells |
US6083715A (en) | 1997-06-09 | 2000-07-04 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells |
JP2000083670A (ja) | 1998-09-09 | 2000-03-28 | Hsp Kenkyusho:Kk | DsbA/DsbB/DsbC/DsbD発現プラスミド |
US6306619B1 (en) | 1999-06-29 | 2001-10-23 | Washington University | DegP periplasmic protease a new anti-infective target and an in vitro assay for DegP protease function |
GB0006398D0 (en) | 2000-03-16 | 2000-05-03 | Novartis Ag | Organic compounds |
GB0013810D0 (en) | 2000-06-06 | 2000-07-26 | Celltech Chiroscience Ltd | Biological products |
AU2001287040A1 (en) | 2000-09-01 | 2002-03-13 | Biogen, Inc. | Methods of designing and producing novel compounds having improved binding affinity for cd154 or other trimeric proteins |
AU8867501A (en) | 2000-09-01 | 2002-03-13 | Biogen Inc | Co-crystal structure of monoclonal antibody 5c8 and cd154, and use thereof in drug design |
US7041479B2 (en) | 2000-09-06 | 2006-05-09 | The Board Of Trustess Of The Leland Stanford Junior University | Enhanced in vitro synthesis of active proteins containing disulfide bonds |
CA2430182C (en) * | 2000-12-14 | 2011-01-25 | Genentech, Inc. | Prokaryotically produced antibodies and uses thereof |
DE60117601T2 (de) | 2000-12-14 | 2006-11-16 | Genentech Inc., San Francisco | Bakterielle wirtstämme |
TWI334439B (en) | 2001-08-01 | 2010-12-11 | Centocor Inc | Anti-tnf antibodies, compositions, methods and uses |
CA2454731C (en) | 2001-08-27 | 2010-11-02 | Genentech, Inc. | A system for antibody expression and assembly |
GB0124317D0 (en) | 2001-10-10 | 2001-11-28 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
CA2467363A1 (en) | 2001-11-16 | 2003-06-12 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Polycistronic expression of antibodies |
GB0129105D0 (en) | 2001-12-05 | 2002-01-23 | Celltech R&D Ltd | Expression control using variable intergenic sequences |
DK1517921T3 (da) | 2002-06-28 | 2006-10-09 | Domantis Ltd | Immunglobulin-enkeltvariable antigen-bindende domæner og dobbeltspecifikke konstruktioner deraf |
GB0224082D0 (en) | 2002-10-16 | 2002-11-27 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
EP1578447A4 (en) | 2002-10-31 | 2009-06-03 | Genentech Inc | METHODS AND COMPOSITIONS THAT CAN INCREASE ANTIBODY PRODUCTION |
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ATE482235T1 (de) | 2003-06-13 | 2010-10-15 | Biogen Idec Inc | Aglycosyl-anti-cd154 (cd40-ligand) antikörper und deren verwendungen |
PT1639011E (pt) | 2003-06-30 | 2009-01-20 | Domantis Ltd | Anticorpos (dab) de domínio único peguilados |
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KR20070047327A (ko) | 2004-07-26 | 2007-05-04 | 비오겐 아이덱 엠에이 아이엔씨. | 항-cd154 항체 |
MX2007002856A (es) * | 2004-09-02 | 2007-09-25 | Genentech Inc | Metodos para el uso de ligandos receptores de muerte y anticuerpos c20. |
US7563443B2 (en) | 2004-09-17 | 2009-07-21 | Domantis Limited | Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof |
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EA019636B1 (ru) | 2007-03-22 | 2014-05-30 | Байоджен Айдек Ма Инк. | Связывающие белки, включающие антитела, производные антител и фрагменты антител, которые специфически связываются с cd154, и их применения |
US7662587B1 (en) | 2009-03-05 | 2010-02-16 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Gene knockout mutations that increase peptide production |
HUE040306T2 (hu) | 2009-09-24 | 2019-03-28 | Ucb Biopharma Sprl | Baktériumtörzs rekombináns fehérje expresszálására, amely tartalmaz proteázhiányos, de chaperonaktivitását megtartott DEGP-t és génkiütött TSP és PTR gént |
US8470552B2 (en) | 2009-10-12 | 2013-06-25 | Keck Graduate Institute | Strategy to reduce lactic acid production and control PH in animal cell culture |
SI2496601T1 (sl) | 2009-11-05 | 2017-09-29 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tehnike in sestavek za sekrecijo heterolognih polipeptidov |
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