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Hintergrund der Erfindung
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von bezüglich der
Proteolyse defizienten, bakteriellen Wirtsstämmen. In besonderer Weise bezieht
sich die Erfindung auf solche Wirtsstämme, bei denen der Abbau heterologer
Polypeptide ausgeschaltet ist,– und
bei denen die Ausbeute solcher Polypeptide verbessert ist.
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2. Beschreibung der verwandten
Technik
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E.-coli-Stämme, die
bezüglich
Proteasen oder Genen, die die Regulation von Proteasen kontrollieren, defizient
sind, sind bekannt. Siehe zum Beispiel Beckwith und Strauch, WO
88/05821, veröffentlicht
am 11. August 1988; Chaudhury und Smith, J. Bacteriol., 160: 788-791
(1984); Elish et al., J. Gen. Microbiol., 134: 1355-1364 (1988);
Baneyx und Georgiou, "Expression
of proteolytically sensitive polypeptides in Escherichia coli" in Stability of
Protein Pharmaceuticals, Bd. 3: Chemical and Physical Pathways of
Protein Degradation, Ahern und Manning, Hrsg. (Plenum Press, New
York, 1992), S. 69-108.
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Einige
dieser Stämme
wurden in Versuchen eingesetzt, gegenüber Proteolyse empfindliche
Proben, insbesonders diejenigen von potentieller medizinischer oder
kommerzieller Bedeutung, auf effiziente Weise herzustellen. U.S.-Pat.-Nr.
5,508,192 (für
Georgiou et al.) beschreibt die Konstruktion vieler Protease-defizienter
und/oder Hitzeschockprotein-defizienter bakterieller Wirte. Solche
Wirte schließen
einfach-, doppelt-, dreifach- oder vierfach-Protease-defiziente
Bakterien und Bakterien mit einer einzelnen Protease, die auch eine Mutation
in dem rpoH-Gen tragen, ein. Beispiele der offenbarten, Protease-defizienten
Stämme
schließen
diejenigen ein, denen degP, ompT, ptr3, und/oder prc (tsp) fehlt,
sowie einen degP-rpoH-Stamm, von dem berichtet wurde, dass er hohe
Titer von rekombinanten Proteinen in E. coli herstellt. Park et
al., Biotechnol. Prog., 15: 164-167 (1999) berichteten außerdem,
dass ein Stamm (HM114), der bezüglich
zweier Zellhüll-Proteasen
(degP, prc) defizient ist, geringfügig schneller wuchs und mehr
Fusionsprotein produzierte als die anderen Stämme, denen mehrere Proteasen
fehlten. Sie gaben an, dass dieser Stamm bis zu einem Trockenzellgewicht
von 47,86 g/l innerhalb von 29 Stunden bei der Verwendung eines
pH-Staten in einer Zulaufkultivierung wuchs. Das hergestellte Protein
war das A-β-Lactamase-Fusionsprotein, das
eine um 30 % höhere β-Lactamase-Aktivität ergab,
als diejenige, die aus seinem Elternstamm KS272 gewonnen wurde.
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Das
Prc-Protein wurde zuerst von Hara et al., J. Bacteriol., 173: 4799-4813
(1991) als die plasmatische Protease isoliert, die den Carboxyterminus
des periplasmatischen Penicillin-Bindungsproteins 3 (PBP3) spaltet.
Danach wurde es auch als eine Protease, die selektiv Proteine mit
einem unpolaren C-Terminus abbaut, identifiziert und in Tsp umbenannt
(Silber et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 295-299 (1992)).
Es wurde gezeigt, dass das prc-Gen ein 75-kDa-Protein kodiert, das
für den
Schutz von Zellen vor kombiniertem thermischem und osmotischem Stress
erforderlich ist (Hara et al., supra). Es wurde bestätigt, dass
die C-terminalen Sequenzen die Substratpräferenz bestimmen (Keiler et
al., Protein Sci, 4: 1507-1515 (1995)). Das Ausmaß der Spaltung
hängt von
der Identität
der Reste oder funktionellen Gruppen an dem C-Terminus des Substratproteins
ab. Die Anwesenheit einer freien δ-Carboxylgruppe
ist wichtig, um zu bestimmen, ob nahe verwandte Peptide mit unpolaren
C-terminalen Sequenzen von Prc effizient gespalten werden.
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Prc-Homologe
wurden in einer divergenten Gruppe von Prokaryonten identifiziert,
die mehrere Cyanobakterien (Brand et al., Plant Mol. Bio, 20: 481-491
(1992); Shestakov et al., J. Biol. Chem., 269: 19354-19359 (1994)),
Neisseria gonorrhoeae (Black et al., J. Bacteriol., 177: 1952-1958
(1995)), Haemophilus influenzae (Fleischmann et al., Science, 269:
496-512 (1995)) und Bartonella bacilliformis (GenBank-Zugangsnr.
L37094) einschließen.
Eine Domäne
in der Prc-Proteinfamilie ist ähnlich
zu einer Domäne
bei den Retinol-Bindungsproteinen, was auf eine gemeinsame Faltungsdomäne hinweist,
die bei diesen Proteinen eine Bindungstasche für hydrophobe Substrate bilden
könnte
(Silber et al., supra; Shestakov et al., supra).
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Hara
et al., supra, entdeckten, dass die thermoresistenten Revertanten
von Δprc-Mutanten extragene Suppressor(spr)-Mutationen
enthalten. Sie identifizierten außerdem das Wildtyp-spr-Genprodukt
als ein Lipoprotein in der Hüllfraktion.
Sie vermuteten, dass das Wildtyp-spr-Gen ein Peptidoglycan-hydrolysierendes
Enzym sein könnte
(Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996)). Wenn
das spr in einem prc-positiven Hintergrund
nicht funktionell ist, wurde ein Suppressor für die spr-Mutation als PBP7,
ein weiteres Penicillin-Bindungsprotein, identifiziert (Hara et
al., 1996, supra). Die Klonierung von spr und die Herstellung einer Δprc-Mutante,
in der Spr von der Protease nicht abgebaut wird, ist ebenfalls in
Hara et al., Abstract for Table Ronde Roussel Uclat Nr. 86, Versailles,
Mai 1997, beschrieben, wo die Autoren schlussfolgerten, dass prc
und spr wechselseitige Suppressoren sind.
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Drei
Mehrfachkopie prc-Suppressoren wurden auch unter Verwendung des
konditional letalen Phänotyps
eines prc(tsp)-Nullstammes von E. coli isoliert (Bass et al., J.
Bacteriol., 178: 1154-1161 (1996)). Keiner von ihnen steht in Beziehung
zu dem spr-Gen. Ein Satz dieser Suppressoren besteht aus zwei vermutlichen Proteasegenen,
die in einer Tandemanordnung angeordnet sind, die bei 72,5 min auf
dem Chromosom kartieren. Diese beiden Gene sind htrA-Homologe, die
Proteine kodieren, die zu 58 bzw. 35 % mit der HtrA(DegP)-Serinprotease
identisch sind. Ein weiterer Typ eines identifizierten Suppressors
ist das dksA(dnak-Suppressor)-Gen, das ebenfalls ein Mehrfachkopie-Suppressor von Defekten
in den Hitzeschockgenen dnak, dnaj und grpE ist. Das dksA-Gen wurde auch unabhängig als
ein Mehrfachkopie-Suppressor einer mukB-Mutation isoliert, der für die chromosomale
Verteilung erforderlich ist. Der dritte Typ ist ein verkürztes Lipoprotein-A(rlpA)-Gen.
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Das
Gen degP scheint die Synthese einer Zellhüllprotease DegP (HtrA) zu kontrollieren.
Eine degP-defiziente Mutante wurde zuerst von Beckwith und Strauch,
supra, konstruiert und in ein E.-coli-Chromosom rekombiniert. HtrA
weist eine hohe molekulare Masse von in etwa 500 kDa auf, welches
ein Hitzeschockprotein ist, dessen proteolytische Aktivität essentiell
für das Überleben
von E. coli bei hohen Temperaturen, so wie über 42 °C, ist (Skorko-Glonek et al.,
Gene, 163: 47-52 (1995)). Eine Anzahl von normalerweise unstabilen Zellhüllproteinen
kann durch die degP-Mutation stabilisiert werden (Strauch und Beckwith,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 1676-1580 (1988)). Kürzlich wurde
mittels Elektronenmikroskopie und chemischer Kreuzvernetzungsanalysen
berichtet, dass das HtrA-Protein sich wie ein 12mer verhält, das
aus zwei Stapeln von sechsgliedrigen Ringen besteht (Kim et al.,
J. Mol. Biol., 294: 1363-1374
(1999)). Das Entfalten von Proteinsubstraten, so wie durch Exponierung
an hohe Temperatur oder Reduktion von Disulfid-Bindungen, ist essentiell
für deren
Zugang in die innere Kammer des HtrA mit Doppelringstruktur, wo
die Spaltung von Peptidbindungen erfolgen kann (Kim et al., supra).
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Viele
heterologe Polypeptide wurden in verschiedenen Stämmen hergestellt,
die bezüglich
Proteasen defizient sind. Jedoch wiesen viele der Stämme relativ
niedrige Produkttiter und/oder ein schwaches Wachstum auf. Es besteht
ein Bedarf, einen bakteriellen Stamm bereitzustellen, der bezüglich Proteasen
defizient ist, bei dem es nicht zur Spaltung des Produkts kommt,
und der einen hohen Produkttiter liefert.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Dementsprechend
ist die Erfindung wie beansprucht. Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende
Erfindung E.-coli-Stämme
bereit, die bezüglich
der chromosomalen degP und prc defizient sind, die die Protease DegP
bzw. Prc kodieren, und die eine Mutante des spr-Gens enthalten,
wobei das Produkt dieses Gens Wachstumsphänotypen unterdrückt, die
von Stämmen
gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten. Vorzugsweise ist der
Stamm bezüglich
des chromosomalen ptr3, das die Protease III kodiert, und/oder bezüglich des chromosomalen
ompT, das die Protease OmpT kodiert, nicht defizient. Vorzugsweise
wird der E.-coli-Stamm hergestellt, indem die Mutante des spr-Gens
in einen degPΔ-prcΔ-Stamm für das Überleben
in der stationären Phase
eines E.-coli-Fermentationsverfahrens mit hoher Zelldichte eingeführt wird.
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In
einem weiteren Ausführungsbeispiel
umfasst der Stamm eine Nukleinsäure,
die ein Polypeptid kodiert, das heterolog zu dem Stamm ist, vorzugsweise
ein Polypeptid, das gegenüber
Proteolyse empfindlich ist, und mehr bevorzugt ein eukaryontisches
Polypeptid.
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Gemäß einem
weiteren Ausführungsbeispiel
stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines heterologen
Polypeptids, d.h. das heterolog zu dem Stamm ist, bereit. Dieses
Verfahren umfasst zunächst
das Kultivieren eines wie in den Ansprüchen definierten E. coli-Stammes.
Dieser Stamm umfasst auch eine Nukleinsäure, die das heterologe Polypeptid
kodiert. Das Kultivieren erfolgt in einer solchen Weise, dass die
Nukleinsäure
exprimiert wird. In einem zweiten Schritt dieses Verfahrens wird
das Polypeptid aus dem Stamm, entweder aus dem Cytoplasma, Periplasma
oder dem Kulturmedium vorzugsweise dem Periplasma oder dem Kulturmedium,
und am meisten bevorzugt aus der Gesamt-Fermentationsbrühe, gewonnen.
Vorzugsweise ist das Polypeptid der Apo2-Ligand oder ein Antikörper, einschließlich eines
Antikörperfragments.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die 1A–1E zeigen
die vollständigen
Nukleotid- und kodierten Aminosäuresequenzen
(SEQ ID Nr: 1 bzw. 2) der Expressionkassette für die Herstellung von pY0317,
eines Produktionsplasmids für
anti-VEGF-Fab. Die Reste im Fettdruck bezeichnen die CDR-Reste des
ursprünglichen
murinen A.4.6.1-Antikörpers.
Die kursiv gedruckten und unterstrichenen Reste bezeichnen murine
Gerüstreste,
die für
die Antigenbindung erforderlich waren.
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Die 2A und 2B zeigen
ein Plasmiddiagram für
pY0317 (2A), sowie die Plasmidkonstruktion
von pY0317tet20 (2A und 2B).
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Die 3 zeigt
das Plasmiddiagram für
pAPApo2-P2RU.
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Die 4 zeigt
die Nukleotidsequenz der humanen Apo2-Ligand-cDNA (SEQ ID Nr: 3)
und ihre abgeleitete Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr: 4). Das „N" an der Nukleotidposition
447 (in SEQ ID Nr: 3) wird verwendet, um anzuzeigen, dass die Nukleotidbase
ein „T" oder „G" sein kann.
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Die 5 stellt
ein Diagramm der Ableitung der E. coli-Stämme 59A7, 49A5 und 43H1 dar.
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Die 6 stellt
das 2-D-Gel-Ergebnis des Fermentationszellsediments dar, das aus
dem Stamm 49A5 (prc-plus-Stamm) abgeleitet ist, der die rhuFab'2-anti-CD18-LZ-Fusion als ein heterologes
Polypeptid exprimiert. Alle LC-verwandten Flecken sind eingekreist.
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Die 7 stellt
das 2-D-Gel-Ergebnis des Fermentationszellsediments dar, das von
dem Stamm 43H1 (prc-minus-Stamm) abgeleitet ist, der die rhuFab'2-anti-CD18-LZ-Fusion als ein heterologes
Polypeptid exprimiert. In diesem Gel verschwinden die LC-Spaltungsprodukte.
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Die 8 zeigt
die fünf
Scheitelpunkte, die in einem Test unter Verwendung von AME5TM/Umkehrphase-Säulen aufgelöst wurden, und liefert dadurch
einen Vergleich der Aufteilung von rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Antikörperfragmenten, die auf diese
Weise aufgelöst
wurden. Die y-Achse ist die spezifische Scheitelpunktfläche der
Scheitelpunkte 1 bis 5. Die x-Achse zeigt die drei rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Produktionsstämme 43H1
(prc–), 49A5
(prc+) und 58H2 (prc-repariertes 43H1).
Der graue Balken mit dem dicken Rand ist LC-115, der schwarze Balken
ist LC, der weiße
Balken ist das LC-Dimer,
der graue Balken mit dem dünnen
Rand ist das Fab-ähnliche Molekül, und der
Balken mit dem ziegelartigem Muster ist Fab'2-LZ. Es ist zu erkennen, dass der Scheitelpunkt 1
(LC-115) aus dem prc-Deletionsstamm verschwand.
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Die 9 zeigt
die Wachstumsprofile von Standardfermentationen mit hoher Zelldichte
in prc-minus-Stämmen
ohne ein mutiertes spr-Gen (58B3 transformiert mit pS1130) (Quadrate)
und prc-minus-Stämmen
mit einem mutiertem spr-Gen (59A7 transformiert mit pS1130) (Diamanten),
ausgedrückt
als OD550 als eine Funktion der Fermentationsstunden.
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Die 10 stellt
die humanisierte anti-CD18-Kappa-LC-Sequenz (SEQ ID Nr: 5) mit den
berechneten pI-Werten von postulierten LC-Abbauprodukten dar. Die
hervorgehobenen Spaltungen mit Querstrichen wurden mittels Massenspektrometrie
bestätigt.
Siehe Tabelle 3 unten.
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Die 11 stellt
ein Gel mit sieben Spuren dar, bei dem verschiedene Wirte und drei
Typen von Proteinen verwendet wurden. Dieses Gel zeigt, dass der
20-kD-LC-Abschnitt
(LC182) in 43H1(prc–)-Zellen, die anti-VEGF-Fab
und anti-Prothrombinase(„tissue
factor")-Fab'2-LZ-Fusionsmoleküle exprimieren,
nicht vorhanden ist. Die Spur 1 ist anti-Prothrombinase(„tissue
factor")-F(ab')2-LZ-6xHis, Wirtsstamm
33B6, die Spur 2 ist anti-Prothrombinase(„tissue factor")-F(ab')2-LZ-6xHis, Wirtsstamm
43H1, die Spur 3 ist anti-CD18-F(ab')2-LZ-6xHis, Wirtsstamm 49A5, die Spur
4 ist anti-CD18-F(ab')2-LZ-6xHis,
Wirtsstamm 41H1, die Spur 5 ist pBR322, Wirtsstamm 49A5, die Spur
6 ist anti-VEGF-Fab, Wirtsstamm 43H1, und die Spur 7 ist anti-VEGF-Fab,
Wirtsstamm 43E7. Die Bezeichnungen HC und H stellen die schwere
Kette dar, und LC und L stellen die leichte Kette dar.
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Die 12 stellt
das 2-D-Gel-Ergebnis des Schüttelflaschen-Zellsediments
dar, das von dem Stamm 59A7 (prc-minus-Stamm) abgeleitet ist, der
anti-VEGF-Fab (pY0317tet20) als ein heterologes Polypeptid exprimiert.
In diesem Gel verschwinden die LC-Spaltungsprodukte und die beiden
HC-Spaltungsprodukte, die in prc-plus-Zellen gefunden werden. Es wurden auch
zwei gesonderte HC-Abschnitte gezeigt, die nur in 59A7 nachgewiesen
wurden, die entweder OmpT- oder Ptr3-gespaltene Produkte sind.
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Die 13 stellt
das 2-D-Gel-Ergebnis des Schüttelflaschen-Zellsediments
dar, das aus dem Stamm 60C1 (prc-plus-Stamm) abgeleitet ist, der
anti-VEGF-Fab (pY0317tet20) als ein heterologes Polypeptid exprimiert.
In diesem Gel wurden mehrere LC-Spaltungsfragmente und zwei HC-Spaltungsfragmente
nachgewiesen.
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Detaillierte Beschreibung
der bevorzugten Ausführunsgbeispiele
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Definitionen
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich „Polypeptid" im Allgemeinen auf
Peptide und Proteine, die mehr als in etwa zehn Aminosäuren aufweisen. „Heterologe" Polypeptide sind
diejenigen Polypeptide, die fremd zu der verwendeten Wirtszelle
sind, so wie ein von E. coli hergestelltes, humanes Protein. Während das
Polypeptid prokaryontisch oder eukaryontisch sein kann, ist es vorzugsweise
eukaryontisch, mehr bevorzugt ein Säugerpolypeptid.
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Beispiele
von Säugerpolypeptiden
schließen
Moleküle,
so wie z.B. Renin, ein Wachstumshormon, einschließlich das
humane Wachstumshormon, das Rinderwachstumshormon, den Wachstumsfaktor-Releasing-Faktor,
das Parathormon, das Thyreotropin, Lipoproteine, 1-Antitrypsin,
die Insulin-A-Kette, die Insulin-B-Kette, Proinsulin, Thrombopoietin,
das follikelstimulierende Hormon, Calcitonin, das Gelbkörperreifungshormon,
Glucagon, Gerinnungsfaktoren, so wie Faktor VIIIC, Faktor IX, Prothrombinase(„tissue
factor") und Willebrand-Faktor,
Antigerinnungsfaktoren, so wie Protein C, den atrialen natriuretrischen
Faktor, Lung Surfactant, einen Plasminogenaktivator, so wie die
Urokinase oder den humanen Urin- oder Gewebetyp-Plasminogenaktivator (t-PA), Bombesin,
Thrombin, den hämatopoetischen
Wachstumsfaktor, den Tumornekrosefaktor Alpha und Beta, Antikörper gegen
(eine) ErbB2-Domäne(n), so
wie 2C4 (WO 01/00245, Hybridom ATCC HB-12697), der an eine Region
in der extrazellulären
Domäne
von ErbB2 bindet (z.B. einen beliebigen oder mehrere Reste in der
Region von in etwa Rest 22 bis einschließlich in etwa Rest 584 von
ErbB2), die Enkephalinase, ein Serumalbumin, so wie humanes Serumalbumin,
das Anti-Müller-Hormon,
die Relaxin-A-Kette, die Relaxin-B-Kette, Prorelaxin, das Maus-Gonadotropin-assoziierte
Peptid, ein mikrobielles Protein, so wie die beta-Lactamase, DNase,
Inhibin, Activin, den vaskulären
endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), Rezeptoren für Hormone
oder Wachstumsfaktoren, Integrin, Protein A oder D, Rheumafaktoren,
einen neurotrophen Faktor, so wie den Brain-Derived-Neurotrophic-Factor
(BDNF), Neurotrophin-3, -4, -5 oder -6 (NT-3, NT-4, NT-5 oder NT-6)
oder einen Nervenwachstumsfaktor, so wie NGF, Cardiotrophine (Herzhypertrophie-Faktor), so
wie Cardiotrophin-1 (CT-1), den Plättchenwachstumsfaktor (PDGF),
einen Fibroblasten-Wachstumsfaktor, so wie aFGF und bFGF, den epidermalen
Wachstumsfaktor (EGF), einen Transforming-Growth-Factor (TGF), so
wie TGF-alpha und TGF-beta,
einschließlich
TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 oder TGF-5, Insulin-Like-Growth-Factor-I und -II
(IGF-I und IGF-II), des(1-3)-IGF-I (Gehirn-IGF-I), Insulin-Like-Growth-Factor-Bindungsproteine,
CD-Proteine, so wie CD-3, CD-4, CD-8 und CD-19, Erythropoietin,
Osteoinductive-Factors, Immuntoxine, ein knochenmorphogenetisches
Protein (BMP), ein Interferon, so wie Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma,
Serumalbumin, so wie humanes Serumalbumin (HSA) oder Rinderserumalbumin
(BSA), kolo niestimulierende Faktoren (CSF), z.B. M-CSF, GM-CSF und
G-CSF, Interleukine (ILs), z.B. IL-1 bis IL-10, anti-HER-2-Antikörper, Apo-2-Ligand,
die Superoxiddismutase, T-Zell-Rezeptoren, Oberflächenmembranproteine,
Decay Accelerating Factor, virales Antigen, so wie z.B. einen Teil
der AIDS-Hülle,
Transportproteine, Homing-Rezeptoren,
Addressine, regulatorische Proteine, Antikörper und Fragmente eines beliebigen
der oben genannten Polypeptide, ein.
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Die
bevorzugten Polypeptide von Interesse schließen Polypeptide, so wie HSA,
BSA, anti-IgE, anti-CD20, anti-IgG, t-PA, gp120, anti-CD11a, anti-CD18,
2C4, anti-VEGF, VEGF, TGF-beta, Activin, Inhibin, anti-HER-2, DNase,
IGF-I, IGF-II, Gehirn-IGF-I, Wachstumshormon, Relaxinketten, Wachstumshormon-Releasing-Factor,
Insulinketten oder Proinsulin, NGF, NT-3, BDNF, Apo2-Ligand und
die Urokinase ein. Besonders bevorzugte Säugerpolypeptide sind Antikörper, die
Antikörper
mit vollständiger
Länge,
Antikörperfragmente und
Apo2-Ligand einschließen.
Mehr bevorzugt sind diese Antikörper
humane oder humanisierte Antikörper. Diese
schließen
z.B. anti-IgE, anti-IgG,
anti-Her-2, anti-CD11a, anti-CD18, anti-CD20 und anti-VEGF, 2C4, BSA
oder HSA ein. Noch mehr bevorzugt, ist der Antikörper ein anti-CD18-, anti-VEGF-,
anti-Prothrombinase(„tissue
factor")-, 2C4-,
anti-Her-2-, anti-CD20-, anti-CD40- oder anti-CD11a-Antikörper. Antikörperfragmente, die in der Definition
von Polypeptid umfasst sind, schließen z.B. ein Fab, Fab', Fab'2 oder einen Fab'2-Leucinzipper (LZ)
ein und sind am meisten bevorzugt anti-CD18-Fab'2-LZ, anti-Prothrombinase(„tissue
factor")-Fab'2-LZ-6xHis, anti-VEGF-Fab,
anti-CD8-His-getaggtes-Fab'2-LZ
und anti-CD18-Lys-getaggtes-Fab'2-LZ.
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Wie
hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „gegenüber Proteolyse empfindlich" für Polypeptide
auf Polypeptide, die dazu neigen, gespalten zu werden, gegenüber einer
Spaltung empfindlich sind oder von einer oder mehreren E-coli-Proteasen,
entweder im nativen Zustand oder während der Sekretion, gespalten
werden.
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Fermentation
oder Kultivierung „mit
hoher Zelldichte" bezieht
auf ein Verfahren, bei dem typischerweise zunächst einige Nährstoffe
als Dosis zugegeben werden, um das Zellwachstum zu ermöglichen,
und das Verhältnis
zwischen dem O2-Verbrauch und dem Glucoseverbrauch
genutzt wird, um den gelösten
Sauerstoff, der leicht zu messen ist, dazu zu verwenden, um die
Glucosezugabe zu steuern. Um höhere
Zelldichten zu erreichen, kann Ammoniak kontinuierlich zugegeben
werden, und zusätzliche
Nebennährstoffe
(z.B. P, K, S und Mg) können
bei bestimmten Phasen der Fermentation zugegeben werden, um das
Wachstum zu unterstützen,
wie in den Beispielen unten näher
erläutert
wird.
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Eine „Mutante
des spr-Gens, deren Produkt Wachstumsphänotypen unterdrückt, die
von Stämmen
gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten", bezieht sich auf einen E-coli-prc-Suppressor
(spr) (Prcsup kodierend) mit der von Hara
et al., 1996, supra, angegebenen Sequenz oder einen, der mutiert
ist, vorausgesetzt, das Genprodukt funktioniert als ein Suppressor
von Wachstumsphänotypen
von Stämmen
mit prc-Mutanten. Vorzugsweise besteht die Mutation aus einer Punktmutation.
Am meisten bevorzugt ist die Punktmutation W148R, worin ein TGG-Kodon
zu CGG verändert
ist, was zu einer Veränderung
von Tryptophan zu Arginin bei der Aminosäure 148 führt.
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Der
Ausdruck „Antikörper" wird hierin in der
breitesten Bedeutung verwendet und umfasst besonders intakte monoklonale
Antikörper,
polyklonale Antikörper,
multispezifische Antikörper
(z.B. bispezifische Antikörper),
die aus wenigstens zwei intakten Antikörpern gebildet sind, und Antikörperfragmente,
solange sie die gewünschte
biologische Aktivität
zeigen.
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Der
Ausdruck „monoklonaler
Antikörper", wie er hierin verwendet
wird, bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population
von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wird, d.h. die
einzelnen Antikörper,
die in der Population enthalten sind, sind identisch mit Ausnahme
von möglichen,
natürlicherweise vorkommenden
Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale
Antikörper
sind hochspezifisch, da sie gegen eine einzige antigene Stelle gerichtet
sind. Außerdem
ist jeder monoklonale Antikörper
im Unterschied zu polyklonalen Antikörperzuberitungen, die verschiedene
Antikörper
umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet
sind, gegen eine einzige Determinante auf dem Antigen gerichtet.
Zusätzlich
zu ihrer Spezifität
sind die monoklonalen Antikörper
vorteilhaft, weil sie in nicht durch andere Antikörper kontaminierter
Form hergestellt werden können.
Der Ausdruck „monoklonal" zeigt die Eigenschaft
des Antikörpers
als aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern gewonnen
an und soll nicht so ausgelegt werden, dass er die Herstellung des
Antikörpers
durch irgendein bestimmtes Verfahren erfordert. Z.B. können die
monoklonalen Antikörper,
die in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, mittels
des zuerst von Koehler et al., Nature, 256; 495 (1975) beschriebenen Hybridomverfahrens
hergestellt sein oder können
durch rekombinante DNA-Verfahren (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,816,567)
hergestellt sein. Die „monoklonalen
Antikörper" können auch
aus Phagen-Antikörperbibliotheken
unter Verwendung der zum Beispiel in Clackson et al., Nature, 352:
624-628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)
beschriebenen Techniken isoliert sein.
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Die
monoklonalen Antikörper
hierin schließen
besonders „chimäre" Antikörper ein,
in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Kette identisch
mit oder homolog zu korrespondierenden Sequenzen in Antikörpern ist,
die von einer bestimmten Spezies abgeleitet sind oder zu einer bestimmten
Antikörperklasse
oder -unterklasse gehören,
während
der Rest der Kette(n) identisch mit oder homolog zu korrespondierenden
Sequenzen in Antikörpern
ist, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer
anderen Antikörperklasse
oder -unterklasse gehören,
sowie Fragmente von solchen Antikörpern, solange sie die gewünschte biologische
Aktivität
zeigen (US-Patent Nr. 4,816,567 und Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)). Chimäre Antikörper von Interesse hierin schließen „primatisierte" Antikörper ein,
die Antigen-bindende Sequenzen der variablen Domäne, die von einem nicht-humanen
Primaten (z.B. Altwelt-Affen, Menschenaffen etc.) abgeleitet sind,
und Sequenzen der humanen konstanten Region umfassen.
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„Antikörperfragmente" umfassen einen Teil
eines intakten Antikörpers,
wobei sie vorzugsweise dessen Antigenbindungs- oder variable Region
umfassen. Beispiele von Antikörperfragmenten
schließen
Fab-, Fab'-, F(ab')2-
und Fv-Fragmente, Diabodies, lineare Antikörper, einzelkettige Antikörpermoleküle und aus
Antikörperfragmenten)
gebildete, multispezifische Antikörper ein.
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Ein „intakter" Antikörper ist
einer, der eine Antigen-bindende variable Region sowie eine konstante
Domäne
der leichten Kette (CL) und konstante Domänen der
schweren Kette, CH1, CH2
und CH3, umfasst. Die konstanten Domänen können konstante
Domänen
mit der nativen Sequenz (z.B. humane konstante Domänen mit
der nativen Sequenz) oder Aminosäuresequenz-Varianten
davon sein. Vorzugsweise weist der intakte Antikörper eine oder mehrere Effektorfunktionen
auf.
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Antikörper-„Effektorfunktionen" beziehen sich auf
diejenigen biologischen Aktivitäten,
die der Fc-Region (einer Nativsequenz-Fc-Region oder einer Fc-Region
mit Aminosäuresequenz-Variation)
eines Antikörpers zugeschrieben
werden können.
Beispiele für
Antikörper-Effektorfunktionen
schließen
die C1q-Bindung, die Komplement-abhängige Zytotoxizität, die Fc-Rezeptorbindung,
die Antikörper-abhängige, zellvermittelte
Zytotoxizität
(ADCC), die Phagozytose, das Herunterregulieren von Zelloberflächenrezeptoren
(z.B. B-Zellrezeptor, BCR), etc. ein.
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Abhängig von
der Aminosäuresequenz
der konstanten Domäne
ihrer schweren Ketten, können
intakte Antikörper
verschiedenen „Klassen" zugeordnet werden.
Es gibt fünf Hauptklassen
von intakten Antikörpern: IgA,
IgD, IgE, IgG und IgM, und mehrere von diesen können weiter in „Unterklassen" (Isotypen), z.B.
IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgA2, unterteilt werden. Die konstanten
Domänen
der schweren Kette, die den verschiedenen Klassen von Antikörpern entsprechen,
werden ∀,
*, „ (,
bzw. μ genannt.
Die Untereinheit-Strukturen und dreidimensionalen Konfigurationen
verschiedener Klassen von Immunglobulinen sind wohl bekannt.
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„Antikörper-abhängige, zellvermittelte
Zytotoxizität" und „ADCC" beziehen sich auf
eine zellvermittelte Reaktion, bei der unspezifische zytotoxische
Zellen, die Fc-Rezeptoren
(FcRs) exprimieren (z.B. natürliche Killerzellen
(NK), Neutrophile und Makrophagen), gebundenen Antikörper auf
einer Zielzelle erkennen und anschließend die Lyse der Zielzelle
verursachen. Die primären
Zellen für
die Vermittlung von ADCC, NK-Zellen, exprimieren nur FcRIII, wogegen
Monozyten FcRI, FcRII und FcRIII exprimieren. Die FcR-Expression
auf hämatopoetischen
Zellen ist in der Tabelle 3 auf der Seite 464 von Ravetch und Kinet,
Annu. Rev. Immunol., 9: 457-492 (1991) zusammengefasst. Um die ADCC-Aktivität eines
Moleküls
von Interesse zu beurteilen, kann ein in-vitro-ADCC-Test, so wie
derjenige, der in dem US-Patent Nr. 5,500,362 oder 5,821,337 beschrieben
ist, durchgeführt
werden. Nützliche
Effektorzellen für
solche Tests schließen
mononukleäre
Zellen aus peripherem Blut (PBMC) und natürliche Killer(NK)-Zellen ein.
Alternativ oder zusätzlich
kann die ADCC-Aktivität
des Moleküls
von Interesse in vivo, z.B. in einem Tiermodell, so wie dem in Clynes
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 652-656 (1998) offenbarten,
beurteilt werden.
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„Humane
Effektorzellen" sind
Leukozyten, die ein oder mehrere FcRs exprimieren und Effektorfunktionen
ausüben.
Vorzugsweise exprimieren die Zellen wenigstens FcRIII und führen die
ADCC-Effektorfunktion aus. Beispiele humaner Leukozyten, die ADCC
vermitteln, schließen
mononukleäre
Zellen aus demperipherem Blut (PBMC), natürliche Killer(NK)-Zellen, Monozyten,
zytotoxische T-Zellen und Neutrophile ein, wobei PBMCs und NK-Zellen
bevorzugt sind. Die Effektorzellen können aus einer nativen Quelle
dafür,
z.B. aus Blut oder PBMCs, wie hierin beschrieben, isoliert werden.
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„Native
Antikörper" sind normalerweise
heterotetramere Glycoproteine von in etwa 150.000 Dalton, die aus
zwei identischen leichten (L-) Ketten und zwei identischen schweren
(H-) Ketten zusammengesetzt sind. Jede leichte Kette ist mittels
einer kovalenten Disulfidbindung mit einer schweren Kette verbunden,
während die
Anzahl der Disulfidbindungen zwischen den schweren Ketten verschiedener
Immunglobulinisotypen variiert. Jede schwere und leichte Kette weist
außerdem
regelmäßig beabstandete
Disulfidbrücken
innerhalb der Kette auf. Jede schwere Kette weist an einem Ende
eine variable Domäne
(VH), gefolgt von einer Anzahl von konstanten
Domänen
auf. Jede leichte Kette weist eine variable Domäne an einem Ende (VL) und eine konstante Domäne an ihrem anderen Ende auf.
Die konstante Domäne
der leichten Kette ist an der ersten konstanten Domäne der schweren
Kette ausgerichtet, und die variable Domäne der leichten Kette ist an
der variablen Domäne
der schweren Kette ausgerichtet. Man nimmt an, dass bestimmte Aminosäurereste
eine Grenzfläche
zwischen den variablen Domänen
der leichten Kette und der schweren Kette bilden.
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Der
Ausdruck „variabel" bezieht sich auf
die Tatsache, dass bestimmte Teile der variablen Domänen sich
beträchtlich
in der Sequenz zwischen Antikörpern
unterscheiden und bei der Bindung und der Spezifität jedes
bestimmten Antikörpers
für sein
bestimmtes Antigen verwendet werden. Jedoch ist die Variabilität nicht gleichmäßig über die
variablen Domänen
von Antikörpern
verteilt. Sie ist in drei Segmenten, die hypervariable Regionen
genannt werden, sowohl in den variablen Domänen der leichten Kette als
auch der schweren Kette konzentriert. Die stärker konservierten Teile der
variablen Domänen
werden die Gerüstregionen
(FRs) genannt. Die variablen Domänen
von nativen schweren und leichten Ketten umfassen jeweils vier FRs,
die weitgehend eine β-Blatt-Konfiguration
annehmen, die durch drei hypervariablen Regionen verbunden sind,
die Schlaufen bilden, die die β-Blatt-Struktur
verbinden und in einigen Fällen
einen Teil von ihr bilden. Die hypervariablen Regionen in jeder
Kette werden durch die FRs in naher Nachbarschaft zueinander gehalten
und tragen mit den hypervariablen Regionen der anderen Kette zu
der Bildung der Antigen-Bindungsstelle von Antikörpern bei (siehe Kabat et al.,
Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Aufl. Public
Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)).
Die konstanten Domänen
sind nicht direkt an der Bindung eines Antikörpers an ein Antigen beteiligt,
sondern zeigen verschiedene Effektorfunktionen, so wie die Beteiligung
des Antikörpers
an der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität (ADCC).
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Der
Ausdruck „hypervariable
Region" bezieht
sich, wenn er hierin verwendet wird, auf die Aminosäurereste
eines Antikörpers,
die verantwortlich für
die Antigenbindung sind. Die hypervariable Region umfasst im Allgemeinen
Aminosäurereste
von einer „Komplementaritäts-bestimmenden
Region" oder „CDR" (z.B. die Reste
24-34 (L1), 50-56 (L2) und 89-97 (L3) in der variablen Domäne der leichten
Kette und 31-35 (H1), 50-65 (H2) und 95-102 (H3) in der variablen
Domäne
der schweren Kette; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5. Aufl. Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD (1991)) und/oder die Reste aus einer „hypervariablen
Schlaufe" (z.B.
die Reste 26-32 (L1), 50-52 (L2) und 91-96 (L3) in der variablen
Domäne
der leichten Kette und 26-32 (H1), 53-55 (H2) und 96-101 (H3) in
der va riablen Domäne
der schweren Kette; Chothia und Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917
(1987)). „Gerüstregion"- oder „FR"-Reste sind diejenigen
Reste der variablen Domäne
außer
den hierin definierten Reste der hypervariablen Region.
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Die
Papain-Spaltung von Antikörpern
erzeugt zwei identische Antigen-bindende Fragmente, genannt „Fab"-Fragmente, jeweils
mit einer einzigen Antigen-Bindungsstelle, und ein restliches „Fc"-Fragment, dessen Name
seine Fähigkeit,
leicht zu kristallisieren, widerspiegelt. Die Pepsin-Behandlung
ergibt ein F(ab')2-Fragment, das zwei Antigen-Bindungsstellen
aufweist und noch fähig
ist, Antigen kreuzzuvernetzen.
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„Fv" ist das minimale
Antikörperfragment,
das eine vollständige
Antigenerkennungs- und
Antigen-Bindungsstelle enthält.
Diese Region besteht aus einem Dimer einer variablen Domäne einer
schweren Kette und einer leichten Kette in einer festen, nicht-kovalenten Bindung.
In dieser Anordnung interagieren die drei hypervariablen Regionen
jeder variablen Domäne
miteinander, um eine Antigen-Bindungsstelle auf der Oberfläche des
VH-VL-Dimers zu
definieren. Zusammen verleihen die sechs hypervariablen Regionen
dem Antikörper
die Antigen-Bindungsspezifität.
Jedoch weist auch eine einzelne variable Domäne (oder die Hälfte eines
Fv, die nur drei für
ein Antigen spezifische hypervariable Regionen umfasst) die Fähigkeit
auf, ein Antigen zu erkennen und zu binden, wenn auch mit einer
niedrigeren Affinität
als die gesamte Bindungsstelle.
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Das
Fab-Fragment enthält
auch die konstante Domäne
der leichten Kette und die erste konstante Domäne (CH1) der schweren Kette.
Fab'-Fragmente unterscheiden
sich von Fab-Fragmenten durch den Zusatz weniger Reste an dem Carboxyterminus
der CH1-Domäne der schweren
Kette, die ein oder mehrere Cysteine aus der Antikörper-Scharnier(„hinge")-Region einschließt. Fab'-SH ist hierin die
Bezeichnung für
Fab', worin der(die)
Cysteinrest(e) der konstanten Domänen zumindest eine freie Thiogruppe
tragen. F(ab')2-Antikörperfragmente
wurden ursprünglich
als Paare von Fab'-Fragmenten hergestellt,
die Scharnier(„hinge")-Cysteine zwischen
sich aufweisen. Andere chemische Kopplungen von Antikörperfragmenten
sind ebenfalls bekannt.
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Die „leichten
Ketten" von Antikörpern aus
einer beliebigen Vertebratenspezies lassen sich auf der Basis der
Aminosäuresequenzen
ihrer konstanten Domänen
einem von zwei klar unterschiedlichen Typen, die als Kappa (6) und
Lambda (8) bezeichnet werden, zuordnen.
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„Einzelkette-Fv"- oder „scFv"-Antikörperfragmente
umfassen die VH- und VL-Domänen eines
Antikörpers,
wobei diese Domänen
in einer einzelnen Polypeptidkette vorhanden sind. Vorzugsweise
umfasst das Fv-Polypeptid außerdem
einen Polypeptidlinker zwischen den VH-
und VL-Domänen, der es scFv ermöglicht, die
gewünschte
Struktur für
die Antigenbindung zu bilden. Für
einen Übersichtsartikel über scFv
siehe Plückthun
in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg
und Moore Hrsg. (Springer-Verlag, New York, 1994), S. 269-315. Anti-ErbB2-Antikörper-scFv-Fragmente sind
in WO 93/16185, US-Patent Nr. 5,571,894 und US-Patent Nr. 5,587,458
beschrieben.
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Der
Ausdruck „Diabodies" bezieht sich auf
kleine Antikörperfragmente
mit zwei Antigen-Bindungsstellen, wobei die Fragmente eine variable
schwere Domäne
(V
H), die mit einer variablen leichten Domäne (V
L) in der gleichen Polypeptidkette (V
H-V
L) verbunden ist,
umfassen. Durch die Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um
die Paarung zwischen den beiden Domänen auf der gleichen Kette
zu erlauben, werden die Domänen
gezwungen, sich mit den komplementären Domänen einer weiteren Kette zu
paaren und zwei Antigen-Bindungsstellen zu binden. Diabodies sind
ausführlicher
in zum Beispiel
EP 404,097 ,
WO 93/11161 und Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
6444-6448 (1993) beschrieben.
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„Humanisierte" Formen von nicht-humanen
(z.B. Nager-) Antikörpern
sind chimäre
Antikörper,
die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-humanem Immunglobulin
abgeleitet ist. Zumeist sind humanisierte Antikörper humane Immunglobuline
(Rezipienten-Antikörper),
in denen Reste aus einer hypervariablen Region des Rezipienten durch
Reste aus einer hypervariablen Region einer nicht-humanen Spezies
(Donor-Antikörper), so
wie Maus, Ratte, Kaninchen oder einem nicht-humanem Primaten, die
die gewünschte
Spezifität,
Affinität
und Kapazität
aufweist, ersetzt sind. Bei einigen Beispielen sind Gerüstregion(FR)-Reste
des humanen Immunglobulins durch entsprechende nicht-humane Reste
ersetzt. Außerdem
können
humanisierte Antikörper Reste
umfassen, die in dem Rezipienten-Antikörper oder in dem Donor-Antikörper nicht
gefunden werden. Diese Modifikationen werden hergestellt, um die
Leistung des Antikörpers
weiter zu verbessern. Im Allgemeinen wird der humanisierte Antikörper im
Wesentlichen alle von wenigstens einer und typischerweise zwei variablen Domänen umfassen,
wobei alle oder im Wesentlichen alle hypervariablen Schlaufen denjenigen
eines nicht-humanen Immunglobulins entsprechen, und alle oder im
Wesentlichen alle FRs diejenigen einer humanen Immunglobulinsequenz
sind. Der humanisierte Antikörper
wird wahlweise auch wenigstens einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion
(Fc) umfassen, typischerweise denjenigen eines humanen Immunglobulins.
Für weitere Details
siehe Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al.,
Nature, 332: 323-329 (1988) und Presta, Curr. Op. Struct. Biol.,
2: 593-596 (1992).
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Ein „isolierter" Antikörper ist
einer, der aus einem Bestandteil seiner natürlichen Umgebung identifiziert und
abgetrennt und/oder gewonnen wurde. Verunreinigende Bestandteile
seiner natürlichen
Umgebung sind Stoffe, die diagnostische oder therapeutische Verwendungen
für den
Antikörper
stören
würden,
und können Enzyme,
Hormone und andere proteinartige oder nicht-proteinartige gelöste Stoffe
einschließen.
In bevorzugten Ausführungsbeispielen
wird der Antikörper
(1) bis zu mehr als 95 Gew.-% des Antikörpers, wie mittels des Lowry-Verfahrens
bestimmt, und am meisten bevorzugt zu mehr als 99 Gew.-%, (2) bis
zu einem ausreichenden Grad, um wenigstens 15 Reste N-terminaler
oder interner Aminosäuresequenz
mittels eines Spinning-Cup-Sequenators
zu erhalten, oder (3) bis zur Homogenität in der SDS-PAGE unter reduzierenden
oder nicht-reduzierenden Bedingungen, unter Verwendung von Coomassie-Blau oder vorzugsweise
einer Silberfärbung
gereinigt werden. Der isolierte Antikörper schließt den Antikörper in
situ innerhalb rekombinanter Zellen ein, da wenigstens ein Bestandteil
der natürlichen
Umgebung des Antikörpers
nicht vorhanden sein wird. Gewöhnlicher
Weise wird der isolierte Antikörper
jedoch durch wenigstens einen Reinigungsschritt hergestellt werden.
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Der
Ausdruck „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf
DNA-Sequenzen, die für
die Expression einer funktionell verbundenen kodierenden Sequenz
in einem bestimmten Wirtsorganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen,
die für
Prokaryonten geeignet sind, schließen einen Promotor, wahlweise
eine Operatorsequenz und eine Ribosomenbindungsstelle ein.
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Eine
Nukleinsäure
ist „funktionell
verbunden", wenn
sie in einem funktionellen Verhältnis
mit einer weiteren Nukleinsäuresequenz
angeordnet ist. Zum Beispiel ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen
Leader mit einer DNA für
ein Polypeptid funktionell verbunden, wenn sie als ein Prä-Protein
exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids beteiligt
ist; ein Promotor ist funktionell mit einer kodierenden Sequenz
verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder
eine Ribosomenbindungsstelle ist funktionell mit einer kodierenden
Sequenz verbunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie die Translation erleichtert.
Im Allgemeinen bedeutet „funktionell
verbunden", dass
die DNA-Sequenzen aufeinanderfolgend und, in dem Fall eines sekretorischen
Leaders, aufeinanderfolgend und im Leserahmen miteinander verbunden
sind. Das Verbinden wird durch Ligation an passenden Restriktionsstellen
erreicht. Falls solche Stellen nicht vorhanden sind, können die
synthetischen Oligo nukleotidadapter oder Linker in Übereinstimmung
mit der herkömmlichen
Praxis verwendet werden.
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Wie
hierin verwendet, werden die Ausdrücke „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" austauschbar verwendet,
und alle diese Bezeichnungen schließen die Nachkommenschaft ein.
Somit schließen
die Worte „Transformanten" und „transformierte
Zellen" die primären gegenständlichen
Zellen und die davon abgeleiteten Kulturen ohne Berücksichtigung
der Anzahl der Transfers ein. Es ist auch klar, dass aufgrund von
beabsichtigten oder unbeabsichtigten Mutationen nicht die gesamte
Nachkommenschaft bezüglich
des DNA-Gehalts exakt identisch sein muss. Mutierte Nachkommen,
die die gleiche Funktion oder biologische Aktivität aufweisen,
wie diejenige, auf die die ursprünglich
transformierte Zelle gescreent wurde, sind eingeschlossen. Wo bestimmte Festlegungen
beabsichtigt sind, wird sich dies aus dem Zusammenhang ergeben.
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Ausführungsformen der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt E-coli-Stämme bereit, die bezüglich der
chromosomalen degP und prc defizient sind, die die Protease DegP
bzw. Prc kodieren und die eine Mutante des spr-Gens enthalten, wobei das
Produkt dieses Gens Wachstumsphänotypen
unterdrückt,
die von Stämmen
gezeigt werden, die prc-Mutanten enthalten. Der Stamm ist wahlweise
außerdem
bezüglich
des chromosomalen ptr3, das die Protease III kodiert, und/oder des
chromosomalen ompT, das die Protease OmpT kodiert, defizient.
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Gemäß einem
weiteren Ausführungsbeispiel
umfasst der Stamm eine Nukleinsäure,
die ein Polypeptid kodiert, das heterolog zu dem Stamm ist. Der
Stamm ist vorzugsweise mit der Nukleinsäure, die vorzugsweise DNA (cDNA
oder genomische DNA) ist, wie unter Verwendung eines rekombinanten
Expressionsvektors, transformiert.
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Gemäß einem
weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung
solcher heterologer Polypeptide bereit. Bei diesem Verfahren wird
der oben genannte E. coli-Stamm, der auch eine Nukleinsäure umfasst,
die das Polypeptid kodiert, auf solche eine Weise kultiviert, dass
die Nukleinsäure
exprimiert wird. Dann wird das Polypeptid aus dem Stamm gewonnen.
Die Gewinnung kann aus dem Periplasma oder dem Kulturmedium des
Stamms erfolgen. Vorzugsweise findet die Kultivierung in einem Fermenter
und, mehr bevorzugt, unter Bedingungen einer Fermentation mit hoher
Zelldichte statt.
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Die
Verwendung von Kulturparametern und die Polypeptidherstellung werden
auf eine herkömmliche Weise
durchgeführt,
so wie bei den unten beschriebenen Verfahren.
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A. Auswahl der Nukleinsäure und
ihre Modifizierungen
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Die
Nukleinsäure,
die das Polypeptid von Interesse kodiert, ist geeigneter Weise RNA,
cDNA oder genomische DNA aus einer beliebigen Quelle, vorausgesetzt,
dass sie das(die) Polypeptid(e) von Interesse kodiert. Verfahren
für die
Auswahl der geeigneten Nukleinsäure
für die
Expression heterologer Polypeptide (einschließlich Varianten davon) in E.
coli sind wohlbekannt.
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Falls
monoklonale Antikörper
hergestellt werden, wird die DNA, die die monoklonalen Antikörper kodiert,
auf einfache Weise unter Verwendung herkömmlicher Verfahren isoliert
und sequenziert (z.B. unter Verwendung von Oligonukleotidsonden,
die fähig
sind, spezifisch an Gene zu binden, die die schweren und leichten
Ketten von murinen Antikörpern
kodieren). Die Hybridomzellen dienen als eine bevorzugte Quelle
von solcher DNA. Einmal isoliert, kann die DNA in Expressionsvektoren
eingefügt
werden, die dann in die hierin genannten bakteriellen Wirtszellen
transformiert werden, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in
den rekombinanten Wirtszellen zu erhalten. Übersichtsartikel über die
rekombinante Expression von DNA, die Antikörper kodiert, in Bakterien
schließen
Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) und
Plückthun,
Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992) ein.
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Verfahren
zur Humanisierung von nicht-humanen Antikörpern wurden in der Technik
beschrieben. Vorzugsweise weist ein humanisierter Antikörper ein
oder mehrere Aminosäurereste
auf, die in ihn aus einer Quelle eingeführt wurden, die nicht-human
ist. Diese nicht-humanen Aminosäurereste
werden oft als „Import"-Reste bezeichnet,
die typischerweise aus einer variablen „Import"-Domäne
stammen. Die Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren
von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature, 321: 522-525
(1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen
et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)) durchgeführt werden, indem Sequenzen
einer hypervariablen Region durch die entsprechenden Sequenzen eines
humanen Antikörpers
ausgetauscht werden. Folglich sind solche „humanisierte" Antikörper chimäre Antikörper (US-Pat.
Nr. 4,816,567), worin erheblich weniger als eine intakte humane
variable Domäne
durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-humanen Spezies ausgetauscht wurde.
In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise humane
Antikörper,
in denen einige Reste einer hypervariablen Region und möglicherweise
einige FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nager-Antikörpern ersetzt
wurden.
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Die
Auswahl von humanen variablen Domänen, sowohl leicht als auch
schwer, die bei der Herstellung der humanisierten Antikörper verwendet
werden sollen, ist sehr wichtig, um die Antigenität zu verringern.
Gemäß dem so
genannten „Best-Fit"-Verfahren wird die
Sequenz der variablen Domäne
eines Nager-Antikörpers gegen
die gesamte Bibliothek bekannter humaner variable-Domäne-Sequenzen
gescreent. Die humane Sequenz, die derjenigen des Nagers am nächsten kommt,
wird dann als die humane Gerüstregion
(FR) für
den humanisierten Antikörper
akzeptiert (Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993); Chothia
et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987)). Ein weiteres Verfahren
benutzt eine bestimmte Gerüstregion,
die von der Konsensussequenz aller humanen Antikörper einer bestimmten Untergruppe
von leichten oder schweren Ketten abgeleitet ist. Das gleiche Gerüst kann
für mehrere
verschiedene humanisierte Antikörper
verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)).
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Es
ist außerdem
wichtig, dass die Antikörper
unter Beibehaltung einer hohen Affinität für das Antigen und anderer vorteilhafter
biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu
erreichen, werden gemäß einem
bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper mittels eines Verfahrens
der Analyse der Elternsequenzen und von verschiedenen konzeptionellen
humanisierten Produkten unter Verwendung dreidimensionaler Modelle
der Eltern- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale
Immunglobulinmodelle sind allgemein verfügbar und sind dem Fachmann
bekannt. Computerprogramme sind verfügbar, die wahrscheinliche dreidimensionale
Konformationsstrukturen von ausgewählten Kandidaten-Immunglobulinsequenzen
veranschaulichen und darstellen. Die Untersuchung dieser Darstellungen
erlaubt die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste bei der
Funktion der Kandidaten-Immunglobulinsequenz,
d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins,
sein Antigen zu binden, beeinflussen. Auf diese Weise können FR-Reste
aus den Rezipienten- und Import-Sequenzen ausgewählt und kombiniert werden,
sodass die gewünschte
Antikörpereigenschaft,
so wie eine erhöhte
Affinität
für das(die)
Zielantigen(e) erreicht wird. Im Allgemeinen sind die Reste einer
hypervariablen Region direkt und am wesentlichsten daran beteiligt, die
Antigenbindung zu beeinflussen.
-
Verschiedene
Formen des humanisierten Antikörpers
oder des Affinitäts-gereiften
Antikörpers
werden in Betracht gezogen. Zum Beispiel kann der humanisierte Antikörper oder
der Affinitäts-gereifte
Antikörper
ein Antikörperfragment
sein, so wie ein Fab, das wahlweise mit einem oder mehreren Targeting-Mittel(n)
konjugiert ist, um ein Immunkonjugat zu erzeugen. Alternativ kann
der humanisierte Antikörper
oder der Affinitäts-gereifte Antikörper ein
intakter Antikörper,
so wie ein intakter IgG1-Antikörper, sein.
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Fab'-SH-Fragmente können direkt
aus E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um F(ab')2-Fragmente
zu bilden (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Gemäß einer
weiteren Herangehensweise können
F(ab')2-Fragmente
direkt aus einer rekombinanten Wirtszellkultur isoliert werden.
Andere Techniken für
die Herstellung von Antikörperfragmenten
werden für
den Fachmann ersichtlich sein. In anderen Ausführungsbeispielen ist der Antikörper der
Wahl ein einzelkettiges Fv-Fragment
(scFv) (WO 93/16185; US-Pat. Nr. 5,571,894 und 5,587,458). Das Antikörperfragment
kann auch ein „linearer
Antikörper" sein, z.B. wie in
US-Pat. Nr. 5,641,870 beschrieben. Solche linearen Antikörperfragmente
können
monospezifisch oder bispezifisch sein.
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Bispezifische
Antikörper
sind Antikörper,
die Bindungsspezifitäten
für wenigstens
zwei verschiedene Epitope aufweisen. Exemplarische bispezifische
Antikörper
können
an zwei verschiedene Epitope des Dkk-1-Proteins binden. Bispezifische
Antikörper
können
als Antikörper
mit vollständiger
Länge oder
als Antikörperfragmente
(z.B. F(ab')2-bispezifische Antikörper) hergestellt werden.
-
Gemäß einer
anderen Herangehensweise werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Bindungsstellen)
an Sequenzen konstanter Immunglobulindomänen gekoppelt. Die Kopplung
erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Domäne einer schweren Kette eines
Immunglobulins, die wenigstens einen Teil der Scharnier(„hinge")-, CH2- und CH3-Regionen
umfasst. Es ist bevorzugt, dass die erste konstante Region der schweren
Kette (CH1), die die notwendige Stelle für die Bindung der leichten
Kette enthält,
in wenigstens einer der Fusionen vorhanden ist. DNAs, die die Fusionen
der schweren Immunglobulinkette und, falls gewünscht, die leichte Immunglobulinkette
kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und
werden in einen geeigneten bakteriellen Wirtsorganismus kotransfiziert.
Dies liefert eine große
Flexibilität
bei der Anpassung der wechselseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente
in Ausführungsbeispielen,
bei denen ungleiche Verhältnisse
der drei bei der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten die optimalen
Ausbeuten liefern. Es ist jedoch möglich, die kodierenden Sequenzen
für zwei
oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren,
wenn die Ex pression von wenigstens zwei Polypeptidketten in gleichen
Verhältnissen
zu hohen Ausbeuten führt
oder wenn die Verhältnisse
nicht von besonderer Bedeutung sind.
-
In
einem bevorzugten Ausführungsbeispiel
dieser Herangehensweise bestehen die bispezifischen Antikörper aus
einer hybriden schweren Immunglobulinkette mit einer ersten Bindungsspezifität auf einem
Arm und einem hybriden schwere-leichte-Immunglobulinkette-Paar (das die zweite
Bindungsspezifität
liefert) auf dem anderen Arm. Es wurde gefunden, dass diese asymmetrische
Struktur die Abtrennung der gewünschten bispezifischen
Verbindung von unerwünschten
Kombinationen von Immunglobulinketten erleichtert, da die Anwesenheit
einer leichten Immunglobulinkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls eine
leichte Art der Trennung ermöglicht.
Diese Herangehensweise ist in WO 94/04690 offenbart. Für weitere
Details der Herstellung bispezifischer Antikörper siehe, zum Beispiel, Suresh
et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).
-
Gemäß einer
weiteren, in US-Pat. Nr. 5,731,168 beschriebenen Herangehensweise
kann die Grenzfläche
zwischen einem Paar von Antikörpermolekülen manipuliert
werden, um den Prozentsatz an Heterodimeren, die aus der rekombinanten
Zellkultur gewonnen werden, zu maximieren. Die bevorzugte Grenzfläche umfasst
wenigstens einen Teil der CH3-Domäne einer
konstanten Antikörperdomäne. Bei
diesem Verfahren werden eine oder mehrere kleine Aminosäure-Seitenketten
aus der Grenzfläche
des ersten Antikörpermoleküls durch
größere Seitenketten
(z.B. Tyrosin oder Tryptophan) ersetzt. Kompensatorische „Kavitäten" von identischer
oder ähnlicher
Größe zu der(den)
großen
Seitenkette(n) werden auf der Grenzfläche des zweiten Antikörpermoleküls durch
Ersetzen großer
Aminosäure-Seitenketten
durch kleinere (z.B. Alanin oder Threonin) erzeugt. Dies stellt
einen Mechanismus für
die Erhöhung
der Ausbeute des Heterodimers gegenüber unerwünschten Endprodukten, so wie
Homodimeren, bereit.
-
Bispezifische
Antikörper
schließen
kreuzvernetzte oder „Heterokonjugat"-Antikörper ein.
Zum Beispiel kann einer der Antikörper in dem Heterokonjugat
an Avidin, der andere an Biotin gekoppelt sein. Solche Antikörper wurden
zum Beispiel vorgeschlagen, um Zellen des Immunsystems gegen unerwünschte Zellen
zu richten (US-Pat. Nr. 4,676,980), sowie zur Behandlung der HIV-Infektion
(WO 91/00360, WO 92/200373 und
EP 03089 ).
Heterokonjugat-Antikörper
können
unter Verwendung aller beliebigen geeigneten Kreuzvernetzungsverfahren
hergestellt werden. Geeignete kreuzvernetzende Mittel sind in der
Technik wohlbekannt und sind in US-Pat. Nr. 4,676,980 gemeinsam
mit einer Anzahl von Kreuzvernetzungsverfahren offenbart.
-
Techniken
für die
Herstellung bispezifischer Antikörper
aus Antikörperfragmenten
wurden ebenfalls in der Literatur beschrieben. Zum Beispiel können bispezifische
Antikörper
unter Verwendung einer chemischer Kopplung hergestellt werden. Brennan
et al., Science, 229: 81 (1985) beschreiben ein Verfahren, wobei
intakte Antikörper
proteolytisch gespalten werden, um F(ab')2-Fragmente
herzustellen. Diese Fragmente werden in der Gegenwart des Dithiol-Komplexierungsmittels
Natriumarsenit reduziert, um benachbarte Dithiole zu stabilisieren
und eine intermolekulare Disulfidbildung zu verhindern. Die hergestellten
Fab'-Fragmente werden dann
in Thionitrobenzoat(TNB)-Derivate
umgewandelt. Eines der Fab'-TNB-Derivate
wird dann durch Reduktion mit Mercaptoethylamin in das Fab'-Thiol rückumgewandelt
und mit einer äquimolaren
Menge des anderen Fab'-TNB-Derivats
gemischt, um den bispezifischen Antikörper herzustellen. Die hergestellten
bispezifischen Antikörper
können
als Mittel für
die selektive Immobilisierung von Enzymen verwendet werden.
-
Außerdem können Fab'-SH-Fragmente direkt
aus E. coli gewonnen und chemisch gekoppelt werden, um bispezifische
Antikörper
zu bilden (Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992)).
-
Verschiedene
Techniken für
die Herstellung und Isolierung bispezifischer Antikörperfragmente
direkt aus der rekombinanten Zellkultur wurden ebenfalls beschrieben.
Zum Beispiel wurden bispezifische Antikörper unter Verwendung von Leucinzippern
hergestellt (Kostelny et al., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992)).
Die Leucinzipperpeptide aus den Fos- und Jun-Proteinen werden an
die Fab'-Teile von
zwei verschiedenen Antikörpern
mittels Genfusion gekoppelt. Die Antikörper-Homodimere werden an der
Scharnier(„hinge")-Region reduziert,
um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere
zu bilden. Dieses Verfahren kann auch für die Herstellung von Antikörper-Homodimeren
verwendet werden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 90: 6444-6448 (1993) beschriebene „Diabody"-Technologie hat einen alternativen Mechanismus
für die
Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente
bereitgestellt. Diese Fragmente umfassen eine variable Domäne der schweren
Kette (VH), die mit einer variablen Domäne der leichten
Kette (VL) mittels eines Linkers verbunden
ist, der zu kurz ist, um eine Paarung zwischen den beiden Domänen auf
der gleichen Kette zu erlauben. Somit werden die VH-
und VL-Domänen eines Fragments gezwungen,
mit den komplementären
VL- und VH-Domänen eines
weiteren Fragments zu paaren, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen
gebildet werden. Es wurde auch über
eine weitere Strategie für
die Herstellung bispezifischer Antikörperfragmente unter der Verwendung
von einzelkettigen Fv(sFV)-Dimeren berichtet (Gruber et al., J.
Immunol., 152: 5368 (1994)).
-
Es
werden Antikörper
mit mehr als zwei Valenzen in Betracht gezogen. Zum Beispiel können trispezifische
Antikörper
hergestellt werden (Tutt et al., J. Immunol., 147: 60 (1991)).
-
Nukleinsäuremoleküle, die
Polypeptidvarianten kodieren, werden mittels einer Vielzahl von
in der Technik bekannten Verfahren hergestellt. Diese Verfahren
schließen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, die Isolierung aus einer natürlichen Quelle (in dem Fall
von natürlicherweise
vorkommenden Aminosäure-Sequenzvarianten)
oder die Herstellung durch Oligonukleotid-vermittelte (oder ortsspezifische)
Mutagenese, PCR-Mutagenese
oder Kassettenmutagenese einer zuvor hergestellten Variante oder
einer nicht-varianten Version des Polypeptids ein.
-
Es
kann wünschenswert
sein, den erfindungsgemäßen Antikörper im
Hinblick auf die Effektorfunktion zu modifizieren, z.B. um die Fc-Rezeptorbindung
zu verstärken.
Dies kann erreicht werden, indem eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen
in eine Fc-Region
des Antikörpers
eingeführt
werden. Alternativ oder zusätzlich
kann (können)
(ein) Cysteinrest(e) in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch die Bildung
von Disulfidbindungen zwischen Ketten in dieser Region ermöglicht wird.
-
Um
die Serumhalbwertszeit des Antikörpers
zu erhöhen,
kann ein Rettungsrezeptor-Bindungsepitop in
den Antikörper
(speziell ein Antikörperfragment),
zum Beispiel wie in US-Pat. 5,739,277 beschrieben, eingeführt werden.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Rettungsrezeptor-Bindungsepitop" auf ein Epitop der
Fc-Region eines IgG-Moleküls
(z.B. IgG1, IgG2,
IgG3 oder IgG4),
das verantwortlich für
die Erhöhung der
in-vivo-Serumhalbwertszeit des IgG-Moleküls ist.
-
Andere
Modifikationen des Antikörpers
werden hierin in Betracht gezogen. Zum Beispiel kann der Antikörper an
eines aus einer Vielzahl von nicht-Protein-Polymeren, z.B. Polyethylenglycol,
Polypropylenglycol, Polyoxyalkylenen oder Kopolymeren von Polyethylenglycol
und Polypropylenglycol, gekoppelt sein.
-
B. Insertion von Nukleinsäure in einen
replizierbaren Vektor
-
Die
heterologe Nukleinsäure
(z.B. cDNA oder genomische DNA) wird passender Weise in einen replizierbaren
Vektor für
die Expression in dem Bakterium unter der Kontrolle eines passenden
Promotors insertiert. Viele Vektoren sind für diesen Zweck erhältlich,
und die Auswahl des geeigneten Vektors wird hauptsächlich von
der Größe der Nukleinsäure, die
in den Vektor insertiert werden soll, und der jeweiligen Wirtszelle,
die mit dem Vektor transformiert werden soll, abhängen. Jeder
Vektor enthält
verschiedene Komponenten, die von der jeweiligen Wirtszelle abhängen, mit
der er kompatibel ist. Abhängig
von dem jeweiligen Wirtstyp, schließen die Vektorkomponenten im
Allgemeinen, aber ohne Beschränkung,
ein oder mehrere der folgenden ein: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung,
ein oder mehrere Markergene, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
-
Im
Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die ein Replikon und Kontrollsequenzen
enthalten, die von Spezies abgeleitet sind, die mit der Wirtszelle
kompatibel sind, in Verbindung mit E.-coli-Wirten verwendet. Der Vektor
trägt gewöhnlich eine
Replikationsstelle, sowie Markersequenzen, die fähig sind, eine phenotypische Selektion
in transformierten Zellen zu gewährleisten.
Zum Beispiel wird E. coli typischerweise unter Verwendung von pBR322
transformiert, einem Plasmid, das von einer E.-coli-Spezies abgeleitet
ist (siehe z.B. Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 enthält Gene
für eine
Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz, und stellt somit einfache
Mittel für
die Identifizierung transformierter Zellen bereit. Das pBR322-Plasmid
oder ein anderes bakterielles Plasmid oder Phage enthält im Allgemeinen
Promotoren, die von dem E.-coli-Wirt für die Expression der selektierbaren
Markergene verwendet werden können,
oder ist so modifiziert, dass es diese enthält.
-
(i) Signalsequenz-Komponente
-
Die
DNA, die das hierin interessierende Polypeptid kodiert, kann nicht
nur direkt, sondern auch als eine Fusion mit einem weiteren Polypeptid,
vorzugsweise einer Signalsequenz oder einem anderen Polypeptid,
das eine spezifische Schnittstelle an dem N-Terminus des reifen Polypeptids aufweist,
exprimiert werden. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz ein Bestandteil
des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der Polypeptid-DNA sein,
die in den Vektor insertiert wird. Die ausgewählte heterologe Signalsequenz
sollte solcherart sein, dass sie von der Wirtszelle erkannt und
prozessiert (d.h. durch eine Signalpeptidase gespalten) wird.
-
Bei
prokaryontischen Wirtszellen, die die native oder eine eukaryontische
Polypeptid-Signalsequenz nicht
erkennen und prozessieren, wird die Signalsequenz durch eine prokaryontische
Signalsequenz ersetzt, die zum Beispiel aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus der Alkalischen Phosphatase, der Penicillinase, 1pp oder
hitzestabilen Enterotoxin-II-Leadern besteht.
-
(ii) Replikationsursprung-Bestandteil
-
Expressionsvektoren
enthalten eine Nukleinsäuresequenz,
die den Vektor in die Lage versetzt, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen
zu replizieren. Solche Sequenzen sind für eine Vielzahl von Bakterien
wohlbekannt. Der Replikationsurspung aus dem Plasmid pBR322 ist
für Gram-negative
Bakterien, so wie E. coli, geeignet.
-
(iii) Selektionsgen-Bestandteil
-
Expressionsvektoren
enthalten im Allgemeinen ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer
Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert ein Protein, das für das Überleben
oder das Wachstum von transformierten Wirtszellen erforderlich ist,
die in einem selektiven Kulturmedium wachsen gelassen werden. Wirtszellen, die
nicht mit dem Vektor transformiert sind, der das Selektionsgen enthält, werden
in dem Kulturmedium nicht überleben.
Dieser selektierbare Marker ist getrennt von den in dieser Erfindung
verwendeten und definierten genetischen Markern. Typische Selektionsgene
kodieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen
Toxinen, z.B Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin,
verleihen, (b) andere auxotrophe Mängel als diejenigen, die durch
die Gegenwart des(der) genetischen Marker(s) verursacht werden, komplementieren
oder (c) kritische Nährstoffe
bereitstellen, die aus Komplexmedien nicht verfügbar sind, z.B. das Gen, das
die D-Alanin-Racemase für
Bacilli kodiert.
-
Ein
Beispiel eines Selektionsschemas verwendet ein Arzneimittel, um
das Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. In diesem Fall produzieren
diejenigen Zellen, die erfolgreich mit der Nukleinsäure von
Interesse transformiert sind, ein Polypeptid, das Resistenz gegen
das Arzneimittel verleiht, und überleben
somit die Selektionsstrategie. Beispiele einer solchen dominanten
Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin (Southern et al.,
J. Molec. Appl. Genet., 1: 327 (1982)), Mycophenolsäure (Mulligan
et al., Science, 209: 1422 (1980)) oder Hygromycin (Sugden et al.,
Mol. Cell. Biol., 5: 410-413 (1985)). Die oben angegebenen drei
Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryontischer Kontrolle,
um eine Resistenz gegen das entsprechende Arzneimittel G418 oder
Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
-
(iv) Promotorbestandteil
-
Der
Expressionsvektor für
die Herstellung des Polypeptids von Interesse enthält einen
geeigneten Promotor, der von dem Wirtsorganismus erkannt wird und
funktionell mit der Nukleinsäure
verbunden ist, die das Polypeptid von Interesse kodiert. Geeignete
Promotoren für
die Verwendung bei prokaryontischen Wirten schließen die
beta-Lactamase-
und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature, 275: 615 (1978);
Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)), das Arabinose-Promotorsystem
(Guzman et al., J. Bacteriol., 174: 7716-7728 (1992)), das Alkalische
Phosphatase-, ein Tryptophan(trp)-Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids
Res., 8: 4057 (1980) und
EP 36,776 )
und Hybridpromotoren, so wie den tac-Promotor (deBoer et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25 (1983)) ein. Andere bekannte bakterielle
Promotoren sind jedoch geeignet. Ihre Nukleotidsequenzen wurden
veröffentlicht,
wodurch ein Fachmann in die Lage versetzt wurde, sie unter Verwendung
von Linkern oder Adaptern, um jede beliebige erforderliche Restriktionsstelle
bereitzustellen, mit DNA zu koppeln, die das Polypeptid von Interesse
kodiert (Siebenlist et al., Cell., 20: 269 (1980)).
-
Promotoren
für die
Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten außerdem im Allgemeinen eine Shine-Dalgarno(S.D.)-Sequenz,
die funktionell mit der DNA verbunden ist, die das Polypeptid von
Interesse kodiert. Der Promotor kann aus der bakteriellen Ursprungs-DNA
durch Restriktionsenzymspaltung entfernt und in den Vektor insertiert
werden, der die gewünschte
DNA enthält.
-
(v) Konstruktion und Analyse
von Vektoren
-
Die
Konstruktion von geeigneten Vektoren, die ein oder mehrere der oben
aufgelisteten Bestandteile enthalten, verwendet Standard-Ligationstechniken.
Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurecht
geschnitten und in der gewünschten
Form religiert, um die erforderlichen Plasmide zu erzeugen.
-
Für die Analyse
zur Bestätigung
der korrekten Sequenzen in den konstruierten Plasmiden werden Ligationsgemische
verwendet, um E. coli K12, Stamm 294 (ATCC 31,446) oder andere Stämme zu transformieren,
und erfolgreiche Transformanten werden mittels Ampicillin- oder
Tetracyclinresistenz, soweit zutreffend, selektiert. Die Plasmide
aus den Transformanten werden präpariert,
durch Restriktionsendonukleasespaltung analysiert und/oder nach
dem Verfahren von Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:
5463-5467 (1977) oder Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309
(1981) oder nach dem Verfahren von Maxam et al., Methods of Enzymology,
65: 499 (1980) sequenziert.
-
C. Selektion und Transformation
von Wirtszellen
-
E.-coli-Wirte,
die als parentale Wirte für
erfindungsgemäße Expressionplasmide
geeignet sind, schließen
E.coli W3110 (ATCC 27,325), E. coli 294 (ATCC 31,446) E. coli B
und E. coli X1776 (ATCC 31,537) ein. Diese Beispiele sind illustrativ
und nicht beschränkend.
Mutierte Zellen eines beliebigen der oben genannten Stämme können ebenfalls
als die Ausgangswirte verwendet werden, die dann weiter mutiert
werden, um zumindest den minimalen, erfindungsgemäß erforderlichen
Genotyp zu enthalten. Der E.-coli-Stamm W3110 ist ein bevorzugter
parentaler Wirt, weil er ein gebräuchlicher Wirt für rekombinante
DNA-Produkt-Fermentationen ist. Beispiele von Ausgangs-E.-coli-Wirten, die
als parentale Wirte verwendet werden sollen, sind gemeinsam mit
ihren Genotypen in der Tabelle unten eingeschlossen:
-
-
Ebenfalls
geeignet sind die Intermediate bei der Herstellung von Stamm 36F8,
d.h. 27B4 (US-Pat. Nr. 5,304,472) und 35E7 (ein spontanes, temperaturresistentes
Kolonieisolat, das besser als 27B4 wächst). Ein zusätzlicher
geeigneter Stamm ist der E.-coli- Stamm,
der die in US-Pat. Nr. 4,946,783, erteilt am 7. August 1990, offenbarte(n),
mutierte(n) periplasmatische(n) Protease(n) aufweist.
-
Die
erfindungsgemäßen Stämme können durch
chromosomale Integration des Parentalstammes oder andere Techniken,
einschließlich
der in den Beispielen unten dargestellten, hergestellt werden.
-
Die
Nukleinsäure,
die das Polypeptid kodiert, wird in die Wirtszellen insertiert.
Vorzugsweise wird dies durch Transformieren der Wirtszellen mit
den oben beschriebenen Expressionsvektoren und Kultivieren in herkömmlichen
Nährmedien,
die wie für
die Induktion der verschiedenen Promotoren geeignet modifiziert
wurden, erreicht.
-
Transformation
bedeutet Einführen
von DNA in einen Organismus, so dass die DNA entweder als ein extrachromosomales
Element oder durch chromosomale Integration replizierbar ist. Abhängig von
der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation unter Verwendung
von Standardtechniken, die für
solche Zellen geeignet sind, durchgeführt. Die, wie in dem Abschnitt
1.82 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschriebene
Kalziumbehandlung unter Verwendung von Kalziumchlorid wird im Allgemeinen
für prokaryontische
Zellen und andere Zellen verwendet, die erhebliche Zellwandbarrieren
enthalten. Ein weiteres Verfahren für die Transformation verwendet
Polyethylenglycol/DMSO, wie beschrieben in Chung und Miller, Nucleic
Acids Res., 16: 3580 (1988). Ein noch weiteres Verfahren ist die
Verwendung der Elektroporation genannten Technik.
-
D. Kultivieren der Wirtszellen
-
Prokaryontische
Zellen, die verwendet werden, um das Polypeptid von Interesse herzustellen,
werden in geeigneten, wie im Allgemeinen in Sambrook et al., supra,
beschriebenen Medien kultiviert. Die Kulturbedingungen, so wie Temperatur,
pH und dergleichen, sind diejenigen, die zuvor bei der Wirtszelle
verwendet wurden, die für
die Expression ausgewählt
wurde, und sind dem Fachmann bekannt.
-
Wenn
der Alkalische-Phosphatase-Promotor verwendet wird, werden E.-coli-Zellen,
die verwendet werden, um das erfindungsgemäße Polypeptid von Interesse
herzustellen, in geeigneten Medien kultiviert, in denen der Alkalische-Phosphatase-Promotor
zum Teil oder vollständig,
wie im Allgemeinen in z.B. Sambrook et al., supra, beschrieben,
induziert werden kann. Die Kultivierung darf nie in der Abwesenheit
von anorganischem Phosphat oder bei Phosphat-Hungerspiegeln stattfinden.
Zunächst
enthält
das Medium anorganisches Phosphat in einer Menge oberhalb des Induktionsspiegels
der Proteinsynthese und ausreichend für das Wachstum des Bakteriums.
Während
die Zellen wachsen und das Phosphat verwenden, verringern sie den Spiegel
an Phosphat in dem Medium, wodurch sie die Induktion der Synthese
des Polypeptids auslösen.
-
Alle
beliebigen anderen notwendigen Medienbestandteile außer Kohlenstoff-,
Stickstoff- und anorganischen Phosphat-Quellen können auch in geeigneten Konzentrationen
enthalten sein, die alleine oder als ein Gemisch mit einem weiteren
Bestandteil oder Medium, so wie einer komplexen Stickstoffquelle,
eingeführt werden.
Der pH des Mediums kann jeder beliebige pH von in etwa 5-9 sein,
der hauptsächlich
von dem Wirtsorganismus abhängt.
-
Falls
der Promotor ein induzierbarer Promotor ist, werden die Zellen für die Induktion
typischerweise kultiviert, bis eine bestimmte optische Dichte erreicht
ist, z.B. eine A550 von in etwa 200, wobei
ein Verfahren mit hoher Zelldichte verwendet wird, wobei an diesem
Punkt die Induktion eingeleitet wird (z.B. durch Zugabe eines Induktors,
durch Depletieren eines Mediumbestandteils, etc.), um die Expression
des Gens, das das Polypeptid von Interesse kodiert, zu induzieren.
-
E. Nachweis der Expression
-
Die
Genexpression kann direkt in einer Probe gemessen werden, z.B. durch
konventionelles Southern-Blotting, Northern-Blotting, um die Transkription
von mRNA zu quantifizieren (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77: 5201-5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder in situ-Hybridisierung
unter Verwendung einer entsprechend markierten Sonde auf der Basis
der Sequenzen des Polypeptids. Verschiedene Markierungen können verwendet
werden, am häufigsten
radioaktive Isotope, insbesondere 32P. Jedoch
können auch
andere Techniken verwendet werden, so wie die Verwendung von Biotin-modifizierten
Nukleotiden für den
Einbau in ein Polynukleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle
für Avidin
oder Antikörper,
die mit einer großen
Vielzahl von Markierungen, so wie Radionukliden, Fluoreszenzien,
Enzymen oder dergleichen markiert sein können. Alternativ können Tests
oder Gele für
den Nachweis von Protein verwendet werden.
-
Für die Sekretion
eines exprimierten Genprodukts wird die Wirtszelle unter Bedingungen
kultiviert, die für
die Sekretion des Genprodukts ausreichen. Solche Bedingungen schließen z.B.
Temperatur-, Nährstoff- und
Zelldichte-Bedingungen ein, die die Sekretion durch die Zelle erlauben.
Außerdem
sind solche Bedingungen diejenigen, unter denen die Zelle grundlegende
Zellfunktionen der Transkription, Translation und Passage von Proteinen
aus einem zellulären
Kompartiment in ein anderes durchführen kann, die dem Fachmann
bekannt sind.
-
F. Reinigung von Polypeptiden
-
Die
folgenden Verfahren sind einzeln oder in Kombination beispielhaft
für geeignete
Reinigungsverfahren, wobei das(die) verwendete(n) spezifische(n)
Verfahren von dem Typ des Polypeptids abhängt: Fraktionierung auf Immunaffinitäts- oder
Ionenaustauschsäulen,
Ethanolfällung,
Umkehrphasen-HPLC, Hydrophobe-Wechselwirkungs-Chromatographie, Chromatographie auf
Siliciumdioxid, Chromatographie auf einem Ionenaustauschharz, so
wie S-SEPHAROSETM und DEAE, Chromatofokusierung,
SDS-PAGE, Ammoniumsulfatfällung
und Gelfiltration unter Verwendung von zum Beispiel SEPHADEXTM G-75.
-
Die
monoklonalen Antikörper
können
in geeigneter Weise mittels konventioneller Antikörper-Reinigungsverfahren,
so wie zum Beispiel Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie,
Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, vom Kulturmedium
abgetrennt werden.
-
Die
Erfindung wird vollständiger
unter Verweis auf die folgenden Beispiele verstanden werden. Sie sollten
jedoch nicht in der Weise ausgelegt werden, dass sie den Umfang
der Erfindung begrenzen. Alle Literatur- und Patentzitate hierin
sind durch Verweis einbezogen.
-
BEISPIEL 1
-
Material und Methoden
-
A. Expressionsplasmide
-
1. Plasmide für die Expression
von rhuFab'2-LZ(xCD18)
und getaggten Derivaten pS1130
-
Das
Plasmid pS1130 ist ein auf pBR322 basierendes Plasmid, das in US-Pat.
Nr. 6, 180,367 und 6,258,560 beschrieben ist. Die Synthese von rhuFab'2-LZ(xCD18) wird
von dem Promotor der Alkalischen Phosphatase (AP) von E. coli reguliert.
Wenn der AP-Promotor durch die Depletierung von Phosphat induziert wird,
bildet er eine bi cistronische Messenger-RNA in der Reihenfolge der
STII-Signal-leichte-Kette-Kappa-kodierende
Sequenz, STII-Signal-schwere-Kette-kodierende Sequenz, gefolgt von
einer Leucinzipper-Sequenz. Ein Lambda-Transkriptionsterminator
wurde nahe des Translationsterminations-Kodons angeordnet.
-
pcyc34
-
Das
Plasmid pcyc34 ist ein tacII-Promotor-Gegenstück von pS1130.
-
pxCD18-7T3
-
Das
zwei-Promotor-Plasmid pxCD18-7T3, das zwei getrennte Translationseinheiten
enthält,
erlaubt die zeitliche Trennung der Transkription der leichten Kette
von der Transkription der schweren Kette. Wie in pS1130 bleibt die
leichte Kette unter der Kontrolle des phoA-Promotors. Jedoch folgt
in pxCD18-7T3 ein λt0-Transkriptionsterminator
auf die kodierende Sequenz der leichten Kette. Stromabwärts dieses
Terminators wurde der tacII-Promotor hinzugefügt, um die Transkription des
Schwere-Kette-Fragments/C-terminalen Leucinzippers zu kontrollieren
(DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80: 21-25 (1983)). Ein
zweiter λt0-Transkriptionsterminator folgt auf diese
kodierende Sequenz. Stille Kodonvarianten der STII-Signalsequenz
wurden verwendet, um die Sekretion beider Ketten zu steuern (Simmons
und Yansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996)). Insbesondere
wurden die Nukleotide in der STII-Signalsequenz so modifiziert,
dass die leichte Kette eine relative TIR-Stärke von 7 und die schwere Kette
eine relative TIR-Stärke
von 3 aufwies, und die letzten drei Nukleotide der Signalsequenz,
die sowohl der leichten als auch der schweren Kette vorausgingen, waren
GCT. In diesem Zwei-Promotor-System sind die phoA-Promotorsequenz und
die DNA für
die leichten und schweren Antikörperketten
die gleichen wie in pS1130.
-
pAB3
-
Das
Plasmid pAB3 ist dafür
entworfen, ein anti-CD18-F(ab')2
in dem Periplasma von E. coli unter der Kontrolle des Alkalische-Phosphatase-Promotors
zu exprimieren (Kikuchi et al., Nucleic Acids Res., 9 (21) 5671-5678
(1981)) und weist einen Leucinzipper auf und ist His-getaggt. Die
Signalsequenz des hitzestabilen Enterotoxins II (Picken et al.,
Infect. Immun., 42: 269-275 (1983)) geht den leichten und schweren
Ketten voran, und an das C-terminale Ende der schweren Kette ist
der GCN4-Leucinzipper aus Hefe fusioniert, gefolgt von sechs Histidinresten.
Die kodierenden Sequenzen der leichten und schweren Kette befinden
sich in einer polycistronischen Anordnung, wobei der λt0-Transkriptionsterminator (Scholtissek und
Grosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)) auf das Gen der schweren
Kette folgt.
-
Das
Plasmid pAB3 wurde durch Zusammenligieren von drei DNA-Fragmenten
konstruiert, wobei das erste der Vektor pS1130 war, in dem das kleine
KpnI-SphI-Fragment
entfernt worden war. Der zweite Teil bei der Ligation war ein KpnI-HindIII-Fragment von in etwa
645 Basenpaaren von pS1130. Der Endteil bei der Ligation war eine
synthetische DNA-Duplex mit der folgenden Sequenz:
5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCCATCACCATCACCATCACTAAGCATG
(SEQ ID Nr: 6)
ACAGCCCCTCGCGGTAGTGGTAGTGGTAGTGATTC-5' (SEQ ID Nr: 7)
-
pAB21
-
Das
Plasmid pAB21 ist ein Derivat von pAB3, in dem die sechs Histidinreste
an dem C-terminalen Ende der schweren Kette durch sechs Lysinreste
ersetzt wurden. Dieses Plasmid wurde auf eine identische Weise wie
pAB3 hergestellt, mit der Ausnahme, dass die synthetische DNA, die
bei der Ligation verwendet wurde, die folgende war:
5'-AGCTTGTCGGGGAGCGCAAAAAGAAAAAGAAAAAGTAAGCATG
(SEQ ID Nr.:8)
ACAGCCCCTCGCGTTTTTCTTTTTCTTTTTCATTC-5' (SEQ ID Nr.:9)
-
2. Plasmid für die Expression
von anti-TF-Fab'2-LZ-6xHis
-
Das
Plasmid D3H44-F(ab')2
(auch als pD3h44f2 bekannt), das konstruiert wurde, um die Produktion von
anti-Prothrombinase("tissue
factor")-Fab'2-Leucinzipper-6xHis
zu steuern, besitzt exakt die gleiche Rückgrat-DNA-Sequenz wie pAB3,
mit der Ausnahme, dass die variablen Regionen für HC und LC von xCD18-VL/VH
zu xTF-VL/VH geändert
wurden. Die Konstruktion dieses Plasmids ist in WO 01/70984, veröffentlicht
am 27. September 2001, beschrieben.
-
Insbesondere
wurde zuerst das Plasmid für
die Expression von anti-TF-Fab (D3H44-F(ab)) wie folgt hergestellt: Das Plasmid
pEMX1, das für
die Mutagenese und Expression von F(ab)s in E. coli verwendet wurde,
wurde in Werther et al., J. Immunol., 157: 4986-4995 (1996) beschrieben.
Kurz gesagt, enthält
das Plasmid ein DNA-Fragment, das eine Konsensus-leichte Kette der
humanen Kappa-Untergruppe-I (VLκI-CL),
eine Konsensus-schwere Kette der humanen Untergruppe-III (CHIII-CHI)
und einen Alkali sche-Phosphatase-Promotor kodiert. Die Verwendung
der Konsensussequenzen für
VL und VH wurde in Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992),
Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285-4289 (1992)
beschrieben.
-
Die
ortsspezifische Mutagenese (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82: 488-492 (1985)) wurde an einer Desoxyuridin-enthaltenden Vorlage
von pEMX1 durchgeführt.
Die sechs CDRs wurden in die murine D3-Sequenz umgewandelt; die
in jeder CDR enthaltenen Reste stammen aus den Sequenz-basierten CDR-Definitionen
(Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest,
5. Aufl., Public Health Service (National Institutes of Health,
Bethesda, MD, (1991)), mit der Ausnahme von CDR-H1, die unter Verwendung einer
Kombination von CDR-H1-Definitionen von Kabat et al., supra, und
Chothia et al. K, Nature, 342: 877-883 (1989) definiert wurde, d.h.
CDR-H1 wurde so definiert, dass sie sich von den Resten H26-H35
in der schweren Kette erstreckt. D3H44-F(ab) kodierte deshalb ein
F(ab), das aus einem vollständigen
humanen Gerüst (VLκ-Untergruppe
I und VH-Untergruppe III) mit den sechs vollständigen murinen CDR-Sequenzen
bestand.
-
D3H44-F(ab')2 wurde durch Hinzufügen des
Schwere-Kette-Scharniers("hinge") (CPPCPAPELLGG, SEQ
ID Nr: 10) an den C-Terminus von D3H44-F(ab), gefolgt von dem GCN4-Leucinzipper
und einem (His)6-Tag für
die Reinigung erzeugt (siehe die Beschreibung für pAB3, oben, für den Leucinzipper
und das Hisx6-Tag).
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3. Plasmide für die Expression
von anti-VEGF-Fab
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Yp0317
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Das
Affinitäts-gereifte
anti-VEGF-Fab-Protein Y0317 ist in Chen et al., J. Mol. Biol., 293:
865-881 (1999) beschrieben. Für
die Konstruktion eines Plasmids für seine Herstellung, pY0317,
wurde, kurz gesagt, eine Expressionskassette in das Gerüst des E.-coli-Plasmids pBR322
an der EcoRI-Stelle kloniert (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)). Die Expressionskassette enthielt
wenigstens die folgenden Grundbestandteile: (1) phoA-Promotor für die Kontrolle
der Transkription; (2) λt0-Terminator, um die Transkription zu beenden,
und (3) die Shine-Dalgarno-Sequenz
aus dem E.-coli-trp- oder dem hitzestabilen Enterotoxin II(STII)-Gen
oder eine Kombination von beiden, um die Translation zu ermöglichen.
Die grundlegenden Komponenten von bakteriellen Expressionskassetten
sind in der Technik bekannt und wurden zum Beispiel in Kikuchi et
al., Nucleic Acids Res., 9(21): 5671-5678 (1981) (für den phoA-Promotor),
Scholtissek und Grosse, Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987) (für den λt0-Terminator), Yanofsky et al., Nucleic Acids
Res., 9: 6647-6668 (1981) (für
trp), Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983) (für STII)
und Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987) (für die gemeinsame Verwendung
von trp und der STII-Shine-Dalgarno-Sequenz)
beschrieben. Außerdem
ging die STII-Signalsequenz oder stille Kodonvarianten davon der
kodierenden Sequenz für
sowohl die leichten als auch die schweren Ketten in pY0317 voran,
um anti-VEGF-Fab herzustellen, und steuerten die Sekretion des Proteins
in das Periplasma. Picken et al., Infect. Immun., 42: 269-275 (1983),
Simmons und Yansura, Nature Biotechnology, 14: 629-634 (1996). Die
Nukleotid- und Aminosäuresequenzen
für die
1952-Basenpaar-Expressionskassette, die für die Herstellung des rekombinanten
Proteins in die EcoRI-Stelle insertiert war, sind in der 1 gezeigt (SEQ ID Nr. 1 bzw. 2).
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RhuFab-V2-Y0317
wurde durch die Humanisierung des murinen monoklonalen Antikörpers A.4.6.1 (Presta
et al., Cancer Res., 57: 4593-4599 (1997)) unter Verwendung eines
zuvor für
andere Antikörper
beschriebenen Verfahrens (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. 89: 4285-4289 (1992), Presta et al., J. Immunol., 151: 2623-2632
(1993), Werther et al., J. Immunol. 157: 4986-4995 (1996)) hergestellt.
Kurz gesagt, wurden cDNAs, die die variablen leichten und variablen
schweren Ketten von muMAb A.4.6.1 kodierten, unter Verwendung von
RT-PCR aus Hybridomzellen isoliert, die den murinen monoklonalen
Antikörper
produzieren. Diese cDNAs wurden kloniert und an humane CL- und humane
CH1-Domänen
fusioniert (Werther et al., J. Immunol., 157: 4986-4995 (1996)),
wodurch ein Maus-Mensch-chimäres
Fab erzeugt wurde. Die sechs Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDRs)
(in der 1 in Fettdruck angegeben)
wurden in einen zuvor humanisierten Antikörpervektor überführrt, der eine humane Konsensus-leichte-Kette
der κ-Untergruppe
und eine humane Konsensus-schwere-Kette
der Untergruppe III kodierte (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 4285-4289 (1992)). Der Transfer alleine der CDR-Reste in
das humane Gerüst
verursachte eine 1000fache Verringerung der Bindung an das VEGF-Antigen.
Mehrere Gerüstreste
nahe den CDRs (in der 1 durch kursive
und unterstrichene Schreibweise angegeben) wurden ebenfalls verändert, um
die Bindung an das Ziel zu verbessern (Presta et al., Cancer Res.,
57: 4593-4599 (1977)). Insgesamt wurden sieben Reste der schweren
Kette und ein Rest der leichten Kette außerhalb der CDRs verändert. Die
schweren und leichten Ketten wurden dann in einen Phagendisplay-Vektor überführt (Baca
et al., J. Biol. Chem., 272: 10678-10684 (1997)), wobei das hGH-Gen
durch pHGHam-g3 ersetzt wurde (Bass et al., Proteins, 8: 309-314
(1990)). Die ortsspezifische Mutagenese wurde verwendet, um VL-Met4Leu
zu verändern,
um die Methioninoxidation zu verhindern und um VH-Thr231Leu zu verändern, um
die Klonierung an die GenIII-Fusion zu erleichtern. Dieser Vektor
wird Y0101 genannt und wurde als der Ausgangspunkt für die Optimierung
der CDRs bei der Bindung an das VEGF-Antigen verwendet (Muller et
al., Structure, 6: 1153-1167 (1998)). Es wurde nur bei Mutationen
in den CDRs H1 und H3 gefunden, dass sie die Bindung verbesserten,
und sie wurden in die Endversion pY0317 eingefügt. Die Veränderungen von dem Plasmid pY0101
zu dem Plasmid pY0317 sind: Thr28Asp, Asn31His, His101Tyr, Ser105Thr.
Alle diese Veränderungen
befinden sich in der variablen Region der schweren Kette. Das pY0317-Plasmid
ist ein Fab-Phagendisplay-Vektor. Ein Plasmiddiagramm dieses Plasmids
erscheint in der 2A.
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pY0317tet20
-
Das
Plasmid pY0317tet20 wurde konstruiert, um die Produktion des rhuFab-V-2
in E. coli zu steuern. Die 2A und 2B zeigen
ein Flussdiagramm der Plasmidkonstruktion, die mit pY0317 beginnt.
Das Plasmid pY0317tet20 ist eine modifizierte Version des gut charakterisierten
Plasmids pBR322. Das 639-Basenpaar-AvaI-PvuII-Fragment wurde aus dem pBR322-Teil des
Plasmids entfernt. Diese Deletion entfernt das rop-Gen, das an der
Kontrolle der Kopienzahl beteiligt ist (Cesareni et al., Proc. Natl.
Acad. Sci., USA, 79: 6313-6317 (1982)). Folglich weist das Plasmid
eine leicht erhöhte
Kopienzahl im Vergleich zu pBR322 auf. Die 1952-Basenpaar-Expressionskassette
(1) wurde für die rekombinante Proteinherstellung
in die EcoRI-Stelle insertiert. Das Plasmid pY0317tet20 ist sowohl
gegenüber
Tetracyclin als auch gegenüber β-Lactam-Antibiotika
resistent. Die Expressionskassette enthält eine einzige Kopie der leichten
Kette und der schweren Kette, die hintereinander angeordnet und
miteinander verbunden sind. Die Transkription jedes Gens in eine einzige
bicistronische mRNA wird von dem phoA-Promotor von E. coli gesteuert
(Chang et al., Gene, 44: 121-125 (1986)). Translations-Initiationssignale
für jede
Kette werden von E.-coli-STII(hitzestabiles Enterotoxin)-Shine-Dalgarno-Sequenzen
bereitgestellt. Die Translation jeder Kette beginnt an einem 23-Rest-STII-Signalpeptid
(Picken et al., Infection and Immunity, 42: 269-275 (1983)), das
die Translokation des Peptids über die
Cytoplasmamembran in den periplasmatischen Raum steuert. Das STII-Signalpeptid
wird dann von einer E.-coli-Leaderpeptidase entfernt. Die leichten
und schweren Ketten falten sich nach der Sekretion in das Periplasma
in ihren nativen Konformationen und werden durch eine intermolekulare
Disulfidbindung kovalent miteinander verbunden.
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Die
Tetracyclinresistenz wurde durch Modifikationen von pY0317 in den
endgültigen
Vektor eingefügt (siehe
die 2A und 2B). Ein
3642-Basenpaar-SapI/ApaI-Fragment
von pY0317, das den Replikationsursprung von pBR322, das β-Lactamasegen, den
phoA-Promotor, die gesamte leichte Kette und die aminoterminale Hälfte der
schweren Kette (VH) enthält,
wurde an ein 2738-Basenpaar-SapI/ApaI-Fragment von p6G4V11N35A.PEG ligiert.
Dieses zweite Fragment enthält
die CH1-Region der
schweren Kette und das Tetracyclin-Resistenzgen von pBR322. Dieses
Fragment enthält
auch vier zusätzliche
Aminosäuren
an dem Carboxylterminus der schweren Kette zur ortsspezifischen
Modifizierung des Proteins. Die Region, die die vier zusätzlichen
Reste enthält,
und die CH1-Region wurden durch eine BssHII/HpaI-Spaltung entfernt und durch das BssHII/XbaI-Fragment
von pY0317 ersetzt, wodurch die ursprüngliche Sequenz der schweren
Kette wiederhergestellt und die ortsspezifische Modifizierungsregion
deletiert wurde. Die XbaI-Spaltung wurde zuerst durchgeführt, und
der Überhang
wurde mit Klenow und Desoxynukleotiden aufgefüllt. Dem folgte die BssHII-Spaltungs-Gelreinigung
des 433-Basenpaar-Fragments. Eine abschließende Manipulation des Plasmids wurde
durchgeführt,
indem das NheI-bis-NdeI-Fragment
von pBR322 durch ein NheI/NdeI-Fragment von pBR322, das eine 639-Basenpaar-AvaI-PvuII-Deletion
enthielt, ersetzt wurde. Das endgültige Plasmid pY0317tet20 ist
resistent gegenüber
Tetracyclin und β-Lactam-Antibiotika,
und enthält
den phoA-Promotor und die Gene, die für die leichten und schweren
Ketten von anti-VEGF
kodieren.
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4. Plasmid für die Expression
von Apo2L
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pAPApo2-P2RU
ist in WO 01/00832, veröffentlicht
am 4. Januar 2001, beschrieben. Kurz gesagt, kodiert dieses Plasmid,
dessen Konstruktion in der 3 gezeigt
ist, die Koexpression von Apo-2L (Aminosäurereste 114-281) und der von
pro2 und argU kodierten tRNAs, wobei die Koexpression von dem alkalische-Phosphatase-Promotor
reguliert wird. Das auf pBR322 basierende Plasmid pAPApo2-P2RU (Sutcliffe, Cold
Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 43: 77-90 (1978)) wurde verwendet,
um das Apo-2L in
E. coli herzustellen. Die für
die Expression von Apo-2L erforderlichen transkriptionellen und
translationellen Sequenzen werden von dem alkalische-Phosphatase-Promotor und der
trp-Shine-Dalgarno, wie für
das Plasmid phGH1 beschrieben (Chang et al., Gene, 55: 189-196 (1987)),
bereitgestellt. Die kodierende Sequenz für Apo-2L (von 114-281) ist
stromabwärts
des Promotors und der Shine-Dalgarno-Sequenzen angeordnet, und ihr
geht ein Initiations-Metheonin voran. Die kodierende Sequenz schließt Nukleotide
ein (in der 4 gezeigt), die die Reste 114-281
von Apo-2L kodieren (4 (SEQ ID Nr. 3 bzw. 4 für die Nukleotid-
und Aminosäuresequenzen)), mit
der Ausnahme, dass das Kodon, das den Rest Pro119 kodiert, zu „CCG" anstelle von „CCT" verändert ist, um
eine potentielle Sekundärstruktur
zu beseitigen. Die Sequenz, die den Lambda-t0-Transkriptionsterminator kodiert
(Scholtissek et al., Nucleic Acids Res., 15: 3185 (1987)) folgt
der kodierenden Sequenz von Apo-2L.
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Außerdem schließt dieses
Plasmid Sequenzen für
die Expression der pro2-tRNAs (Komine et al., J. Mol. Biol., 212:
579-598 (1990)) und von argU/dnaY (Garcia et al., Cell, 45: 453-459
(1986)) ein. Diese Gene wurden mittels PCR aus E. coli W3110 kloniert
und stromabwärts
der Lambda-t0-Transkriptionsterminatorsequenz
angeordnet. Dieses Plasmid verleiht dem Produktionswirt sowohl Resistenz
gegenüber
Tetracyclin als auch gegenüber
Ampicillin.
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B. Zelltransformationen
-
Kompetente
Zellen des entsprechenden Stamms wurden hergestellt und mit dem
passenden Plasmid unter Verwendung von Standardverfahren transformiert,
und erfolgreiche Transformanten wurden selektiert und in Kultur
wachsen gelassen. Bei Plasmiden, die gegenüber Tetracyclin resistent waren,
wurden die Transformanten von LB-Platten gepickt, die 20 μg/ml Tetracyclin
(LB+Tet20) enthielten, durch Ausstreichen gereinigt und in LB-Brühe mit 20 μg/ml Tetracyclin
in einem 30-°C-Schüttler/Inkubator
wachsen gelassen, bevor sie in DMSO bei –80 °C aufbewahrt wurden.
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In
dem Fall der Plasmide pxCD18-7T3 und pcyc34 wurde ein zusätzliches
Plasmid, pMS421, gemeinsam mit pxCD18-7T3 oder pcyc34 kotransformiert.
pMS421 ist ein auf pSC101 basierendes Plasmid, das den lacIq-Suppressor überexprimiert,
der die Induktion des tacII-Promotors unterdrückt, bis IPTG zugegeben wurde,
um ihn zu entsupprimieren, und das außerdem Resistenz gegenüber Spectinomycin
und Streptomycin verleiht. Dieses Plasmid liefert zusätzliche
Kopien des chromosomalen lacIq-Gens unter der Kontrolle von dessem
eigenem Promtors aus einem lacIq-Stamm, wobei das Gen in das kompatible
Plasmid pSC101 eingefügt ist.
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C. Antikörperextraktion
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Die
lösliche
Fraktion von E-coli-Zellen wurde hergestellt, indem ein 20-OD-ml-Sediment in 500 μl 200 mM
TRIS-HCl (pH 8,0) mit 20 μl
0,1 M EDTA (pH 8,0) und 10 μl
Lysozym (6 mg/ml) suspendiert wurde. Die Mischung wurde gevortext,
durch 7–10
Impulse mit Ultraschall behandelt, dann bei 15.000 upm für 15 Minuten bei
4 °C zentrifugiert.
Die Überstandsfraktion
nach der Zentrifugation wird der Hochsalzextrakt (HSE) genannt. Das
verbleibende Sediment wurde für
die Analyse der unlöslichen
Fraktion verwendet.
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D. Proteinidentifizierung
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Die
eindimensionale SDS-PAGE-Gelelektrophorese wurde in einem 4–12% linearen
Acrylamidgradienten von Novex durchgeführt. Insbesondere wurde das
NOVEX®-NuPageTM-System
verwendet, das aus vorgefertigten NuPAGE-Bis-TRIS-Gelen (für Proteine
mit niedrigem bis mittlerem Molekulargewicht) besteht.
-
Die
zweidimensionale Gelelektrophorese wurde, wie von Champion et al.,
Electrophoresis, 20 (4-5): 994-1000 (1999)) beschrieben, mit immobilisierten
pH-Gradienten (pH 3–10)
in der ersten Dimension und einem linearen Acrylamidgradienten (9–18 % T)
in der zweiten Dimension, die von Amersham Pharmacia Biotech gekauft
wurden, durchgeführt.
Die Proteinidentifizierung wurde unter Verwendung einer Kombination
einer Silber/Coomassie-Färbung,
NH2-terminaler Sequenzierung und massenspektormetrischer
Analyse bestimmt. Für
analytische Gele wurden die E.-coli-Zelllysate (~40 μg Protein)
wie von Champion et al., supra, beschrieben, mit Rehydratisierungslösung zusammengegeben.
18-cm-Gelstreifen eines nicht-linearen, immobilisierten pH-Gradienten (IPG)
mit pH 3–10
(Amersham Pharmacia Biotech) wurden für die isoelektrische Fokussierung
bis zu einem Gesamtbetrag von 50.000 VStd verwendet.
-
Präparativ
beladene Gele wurden auf Polyvinylidendifluorid(PVDF)-Membranen
(ProBlott; Applied Biosystems), wie von dem Hersteller beschrieben,
geblottet. Die NH2-terminale Sequenzierung
wurde unter Verwendung eines 20-minütigen Edman-Zyklus und eines Horizontalflussreaktors
für mehrere
Proben für
die Sequenzanalyse der PVDF-elektrogeblotteten Proteine durchgeführt (Henzel
et al., Analytical Biochemistry, 267: 148-160 (1999)). Das Molekulargewicht
der für
die leichte Kette spezifischen Flecken wurde mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie
und Kapillar-LC-MS von Proben, die aus Gelen eluiert waren, durchgeführt (Champion
et al., supra):
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E. Messung der Zielproteinspezies
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Der
AME5TM-Umkehrphasen-Doppelsäulen-Test
(AME5TM/RP-Doppelsäulentest) wurde, wie unten
beschrieben, für
die Titerbestimmung von anti-CD18-F(ab')2-LZ verwendet.
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F. AME5TM/RP-Doppelsäulen-Test
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1. Geräte und Ausrüstung
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Eine
INTEGRALTM-Workstation (von PerSeptive Biosystems)
wurde in der Doppelsäulen-Gradientenkonfiguration
eingerichtet. Eine Affinitätssäule, die
einen antileichte-Kette(Kappa)-Fab-Antikörper enthielt (AME5TM), der auf Glas mit definierten Poren (CPG)
immobilisiert war, wurde verwendet, um das Zielprotein zu fangen.
Eine Umkehrphasensäule,
Temperatur bei 60 °C
geregelt, wurde verwendet, um die gefangenen Antikörperspezies
weiter aufzulösen.
Aktiviertes Aldehyd-Immunaffinitätsharz
(AL-20), Umkehrphasen-POROS-Harze (R220) und Säulenpackmittel wurden von PerSeptive
Biosystems (Cambridge, MA, USA) bezogen. CPG-Empty-PEEK-Säulen, 30 × 2,1 mm
(100 μl),
wurden von Upchurch Scientific (Oak Harbor, WA, USA) gekauft. E-coli-Proben
wurden unter Verwendung von 5-Micron-ACRODISCTM-PF-Spritzenfiltern (von
Gelman Sciences) filtriert.
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2. Reinigung von AME5TM-anti-humanes-Kappa-FAb-(His-Gly)4-His-(Lys)
-
Phosphat-gepufferte
Saline, pH 7,2 (PBS), die 9,4 mM Natriumphosphat, 136,9 mM Natriumchlorid und
2,7 mM Kaliumchlorid enthält,
wird hierin als Auftragspuffer bezeichnet. Monoklonale Antikörper wurden von
einem murinen Fab, AME5TM-anti-humanes-Kappa-FAb-(His-Gly)4-His-(Lys)3, erhalten,
das aus E-coli-Masse gereinigt wurde und für die vorliegenden Zwecke AME5TM-FAb-hgk genannt wird. Die E.-coli-Masse wurde aus einer
10-Liter-Fermentation von 27C7-Zellen erhalten. Ein Microfluidizer
wurde verwendet, um die Zellen nach der Suspendierung in 20 mM Natriumphosphat,
0,25 M Natriumchlorid, 10 mM Magnesiumchlorid und 2 mM Immidazol
bei pH 7,0 zu homogenisieren. Der E.-coli-Extrakt wurde durch Zugabe
von 0,2 % Polyethylenimin (PEI) geklärt und zentrifugiert. Der geklärte Extrakt
wurde unter Verwendung einer Kombination von Innenaustausch- und
immobilisierte-Metallionen-Chelatbildungs(IMAC)-Chromatographie-Schritten
gereinigt. Die chelatbildenden SEPHAROSE-FAST-FLOWTM-
und SP-SEPHAROSE-FAST-FLOWTM-Harze stammen
von Amersham Pharmacia.
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3. Immobilisierung von
AME5TM-FAb-hgk an aktiviertes, Glyceryl-beschichtetes
CPG
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Das
gereinigte Fab wurde auf Periodat-aktiviertem, Glyceryl-beschichtetem
Glass mit definierten Poren (CPG) immobilisiert, um das affinitätsharz herzustellen.
Der AME5TM-Fab-hgk-Antikörper wurde unter Verwendung
einer Abwandlung des Verfahrens von Roy et al. J. Chromatography,
303: 225-228 (1984) auf aktiviertem, Glyceryl-beschichtetem CPG immobilisiert.
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Trockenes
CPG wurde mit gereinigtem Wasser befeuchtet, in eine Chromatographiesäule gepackt und
für 30
Minuten aktiviert, indem 1 % Natriummetaperiodat (Sigma S-1878TM)
durch die Säule
rezirkuliert wurde. Das aktivierte Harz wurde dann in 20 mM Natriumphosphat,
0,15 M Natriumchlorid, pH 7,2 (Kopplungspuffer) gewaschen.
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AME5TM-FAb-hgk-Antikörper mit einer Konzentration
von in etwa 5 mg/ml in Kopplungspuffer, der 1 λg/ml (1 :g/ml) des Reduktionsmittels
Natriumcyanborhydrid (Sigma S8628) enthielt, wurde durch das aktivierte
Harzbett rezirkuliert. Die Kopplung des Antikörpers an das Harz wurde durch
die Abnahme der Absorption bei 280 nm überwacht. Sobald keine weitere
Abnahme der Absorption erfolgte, wurde jeglicher möglicherweise übrig gebliebener
Antikörper
mit Kopplungspuffer ausgewaschen und gewonnen. Die Kopplungsdichte
wurde als die Differenz zwischen der Ausgangsmenge und der gewonnenen
Menge nach dem Abschluss der Reaktion bestimmt und wird in mg FAb
pro ml Harz angegeben.
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Sämtliche
möglicherweise
verbliebenen aktiven Stellen auf dem Harz wurden dann durch Rezirkulieren
von 1 M Ethanolamin, pH 8,0, (ICN, Katalog-Nr. 151078) in der Gegenwart
von 1 λg/ml
(1 :g/ml) Natriumcyanborhydrid für
2 Stunden zur Reaktion gebracht. Das Harz wurde dann für die Lagerung
in Kopplungspuffer, der 0,01 % Thimerosal (GDL International) enthielt,
gewaschen. Vor dem Auftrag von Protein wurde das Harz dreimal einer
Vorbehandlung mit einem Wechsel zwischen den zu verwendenden Äquilibrierungs-
und Eluierungspuffern unterzogen.
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4. Reagenzien
und Testverfahren
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Die
Lösungsmittelreservoirs
waren: Lösungsmittel
1A, Affinitäts-Auftragspuffer;
Lösungsmittel
1B, wässriger
Umkehrphasenpuffer und Affinitäts-Eluierungspuffer,
0,1 % TFA in Wasser, Lösungsmittel
2A, Wasser. Lösungsmittel
2B, organischer Umkehrphasen-Eluierungspuffer, 0,09 % TFA/80 % Acetonitril.
50 μl E-coli-HSEs
(1:2 verdünnt)
oder der Überstand
der Fermentationsbrühe
in Auftragspuffer wurden injiziert. Alle Formen von anti-CD-18,
die in Fermentationszellextrakten gefunden wurden, wurden von diesem
AME5TM-Antikörper gebunden, wie durch den
Vergleich von 2-D-Gelen
eines Leer-Laufs, eines Produktionslaufs und des Affinitäts-gefangenen
(AME5TM-) Materials aus einem Produktionslauf
bestimmt wurde. Nachdem die unspezifische Adsorption verringert
worden war (durch Waschen mit PBS) wurde die Affinitätssäule in einer
In-line-Anordnung mit einer Umkehrphasen-Säule angeordnet, und die gefangenen
Bestandteile wurden durch Eluieren mit verdünnter Säure transferiert. Diese Bestandteile
wurden nachfolgend durch Eluieren der Umkehrphasen-Säule mit einem
flachen Acetonitrilgradienten aufgelöst. Der Nachweis wurde durch
Messung der dekadischen Extinktion bei 280 nm durchgeführt, und
der intakte Antikörper
wurde durch Vergleich der Scheitelpunktsflächen von ähnlich behandelten Standards
quantifiziert.
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G. Chromatgramm-Scheitelpunktidentifizierung
-
Dieser
Test löste
anti-CD18-Fragmente in fünf
Scheitelpunkte auf, die mit Antikörper im Zusammenhang stehen,
die die folgenden Antikörperfragmente
repräsentieren:
- Scheitelpunkt 1: LC-115 (115-Aminosäuren-Abbauprodukt
der leichten Kette Kappa)
- Scheitelpunkt 2: nicht-assemblierte, freie leichte Kette und
glutathionierte leichte Kette
- Scheitelpunkt 3: Dimer der leichten Kette
- Scheitelpunkt 4: das Fab-ähnliche
Fragment
- Scheitelpunkt 5: das Fab'2-LZ-
oder Fab'2-Fragment
-
Ein
gereinigtes Material mit dem Großteil des freigesetzten anti-CD18-Fab'2 (5 mg/ml) wurde
als der Standard verwendet. Ein E-coli-Extrakt, der aus einer Fermentation
mit hoher Zelldichte von 49A5/pS1130 gewonnen wurde, wurde bei –70 °C eingefroren
und als die positive Kontrolle verwendet. Bei allen verglichenen Proben
wurde eine gleiche Zellmasse aufgetragen.
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H. Gesamt-HC/LC-POROSTM-Umkehrphasen-Test
-
Um
die Gesamtmenge an Fragmenten der leichten Kette und der schweren
Kette zu bestimmen, die bei den Fermentationen hergestellt wurden,
wurde ein alternativer Umkehrphasen-HPLC-Test (RP-HPLC) verwendet.
Für die
Gesamt-Antikörperexpression
wurden zu 100 μl
Gesamtbrühe
100 μl 0,2
M TRISpH 8,0 zugegeben. Nach Ultraschallbehandlung für 10 Impulse
wurden 650 μl
Guanidinium-HCl/50 mM TRIS, pH 9, und 50 μl 2 M DTT zugegeben und bei
Raumtemperatur für
15 Minuten inkubiert. Vor dem Laden auf die Säule wurden 200 μl Acetonitril
zugegeben und durch eine Größenausschluss-Zentrifugationssäule (Pharmacia)
filtriert. 5 μl
dieser Suspension wurden mittels des POROSTM-Umkehrphasen-Tests
analysiert.
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Für die Umkehrphasen-Methode
wurde eine HEWLETT-PACKARDTM-1100-HPLC mit
einer Perseptive-POROSTM-R-1-Umkehrphasen-Säule verwendet.
Die Analysen wurden durchgeführt,
wobei die Säule
auf 60 °C
erhitzt wurde, und die dekadische UV-Extinktion bei 278 nm wurde überwacht.
Die Säule
wurde in einer 28%igen Acetonitrillösung in Wasser mit 0,1 % Trifluoressigsäure äquilibriert.
25 μl pro
Probe wur den als Nächstes
auf die Säule
geladen, und die Eluierung wurde unter Verwendung eines linearen
Gradienten von 28 % bis 38 % Acetonitril während 28 Minuten, gefolgt von
einem 17-minütigen
Regenerierungsintervall bei 95 % Acetonitril und einer Reäquilibrierung
bei 28 % Acetonitril durchgeführt.
Scheitelpunkte für
Spezies, die im Zusammenhang mit der leichten Kette und der schweren
Kette standen, wurden durch Vergleich mit Standards und durch eine
Analyse unter Verwendung eines HEWLETT-PACKARDTM-Massenselektions-Detektors
zur Bestätigung
identifiziert. Fermentationsproben aus einem Leer-Lauf, in dem der
gleiche Wirt mit der Ausnahme eines Plasmids, das die Sequenzen
für die
schwere und leichte Kette nicht enthielt, verwendet wurde, wurden auf ähnliche
Weise hergestellt und analysiert, um die passenden Basislinien für die Analysen
zu bestimmen. Die Integration der Scheitelpunktflächen wurde
unter Verwendung der HEWLETT-PACKARDTM 1100-Software durchgeführt, und
die Standards wurden in Proben von Leer-Läufen eingeführt, um eine Kalibrierungskurve
zu erzeugen, um die relative Menge der verschiedenen Spezies in
der Probe zu bestimmen.
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Für die löslichen
Proben wurden Lysate wie für
den Ionenaustausch-Test hergestellt. Typischerweise wurden 100 μl Probe mit
650 μl 6
M Guanidinium-HCl, 50 mM TRIS-HCl,
pH 9, verdünnt.
50 μl 2
M Dithiothreitol (frisch aufgetaut) wurden dann zugegeben, gefolgt
von 200 μl
Acetonitril, gefolgt von einer Filtration mit einem 0,2-μm-Filter vor dem Auftrag
auf die HPLC.
-
Die
unlöslichen
Lysatproben wurden auch auf ähnliche
Weise analysiert, indem die mit PBS gewaschenen, unlöslichen
Sedimente, die nach der Zellextraktion erhalten wurden, in 100 μl 0,2 M TRISpH
8,0 resuspendiert und gut gemischt wurden. Dann wurden 650 μl 6 M Guanidinium-HCl/50
mM TRIS-HCl, pH 9,50 μl
2 M DTT und 200 μl
Acetonitril zugegeben. Die Proben wurden dann filtriert, und 10 μl der filtrierten
Proben wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie für die löslichen
Lysatproben analysiert.
-
I. CSX-Test
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Die
Spaltung des anti-CD18-Fab'2-LZ
wurde mittels HPLC-Kationenaustauschchromatographie
analysiert. Insbesondere wurden die Proben wenigstens 1:1 verdünnt, und
200 μl wurden
auf eine BAKERBONDJTM-Carboxysulfon(CsX)-50x4,6-mm-Säule aufgetragen
(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ), die in einem Hewlett-Packard-1090-HPLC-System
bei 55 °C
unterhalten wurde. Die Proben wurden unter Verwendung eines Gradienten
von in etwa 5 bis 50 mM Natrium phosphat (pH 7,0) während 14
Minuten eluiert, und die Scheitelpunkte wurden unter Verwendung
der dekadischen UV-Extinktion bei 278 nm überwacht. Der Scheitelpunkt, der
den anti-CD18-Fab'2-Leucinzipper
enthielt, wurde identifiziert und durch Vergleich mit gereinigten
Standards quantifiziert.
-
J. Zelllinien-Konstruktionen
-
Die
Wirte, die in der rhuFab'2-LZ(xCD18)-Fermentation
verwendet wurden, sind Derivate von E. coli W3110 (Bachmann, Cellular
and Molecular Biology, Bd. 2 (Washington, D.C.: American Society
for Microbiology, 1987), S. 1190-1219) und werden wie folgt bezeichnet:
49A5, 58B3, 59A7, 43H1, 58H2, 45F8, 41H1 und 33D3. Die 5 zeigt
ein Diagramm der Ableitung der E-coli-Stämme 59A7, 49A5 und 43H1.
-
1. Stamm 49A5
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Der
vollständige
Genotyp von 49A5 ist ΔfhuA
phoA ΔE15Δ (argF-lac)169
deoC2 degP41(Δpst1-Kanr)IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr) ΔfucP ΔmalE. Der
Ausgangsstamm, E. coli W3110, ist ein Derivat von E. coli K-12,
das F'- und Lambda-minus
ist. Es wurde gezeigt, dass er eine Inversion des Chromosoms zwischen
rrnD und rrnE trägt
(Bachmann, supra; Hill und Harnish, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
78: 7069-7072 (1981)). Das fhuA-Gen (früher als tonA bezeichnet) wurde
aus W3110 durch ungenaue Exzision von Tn10 nach dessen Insertion
in das fhuA-Gen deletiert. Der resultierende Stamm, 1A2, ist resistent
gegenüber
den Bakteriophage T1, T5 und ø80.
-
Die
beiden Deletionsmutationen, phoA ΔE15
(Sarthy A. et al., J. Bacteriol., 145: 288-292 (1981)) und Δ(arg-lac)169 (Schweizer et al.,
Mol. Gen. Genet., 192: 293-294 (1983)), wurden gleichzeitig in den
Stamm 1A2 durch P1-Kotransduktion mit einer gekoppelten Tn5-Insertion
in das proC-Gen eingeführt.
Die präzise
Exzision des Transposons stellte das proC-Gen wieder her. Die Mutation
phoA ΔE15
beseitigt die Expression der Alkalischen Phosphatase, und die Mutation Δ(argF-lac)169
ist für
den lac–-Phänotyp dieses
Stamms, der als 7C1 bezeichnet wird, verantwortlich.
-
Die
Mutation deoC2, die die Expression der Desoxyribosephosphat-Aldolase
beseitigte, wurde durch die P1-Kotransduktion eingeführt. Der
deoC-Locus ist genetisch an den Threonin-Biosynthese-Locus gekoppelt.
Eine Threonin-Auxotrophe wurde durch Tn10-Insertion und ungenaue
Exzision erzeugt. Diese Threonin-Auxotrophe wurde dann mit dem P1-Phagen,
der auf einer deoC2-Mutante gezogen war, zur Threonin-Prototrophen transduziert.
Die Anwesenheit der deoC2-Mutation wurde durch die Un fähigkeit
des resultierenden Stamms, 16C9, auf 0,2 % Thymidin als einer Kohlenstoffquelle
zu wachsen, bestätigt.
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Die
degP41(ΔPst1-Kannr)-Mutation, eine Mutation in dem Gen für eine periplasmatische
Protease, wurde durch Transduktion eingeführt. Diese Mutation wurde in
vitro konstruiert, indem ein Abschnitt des degP-Gens durch ein Kanamycin-Resistenzgen
ersetzt wurde (Strauch und Beckwith, J. Bacteriol., 171: 2689-2696
(1989)). Dieses ist kein Transposon, aber erlaubt die Selektion
der Deletion unter Verwendung der Kanamycinresistenz. Der resultierende
Stamm wird als 23E3 bezeichnet.
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Die
Mutation ilvG2096 (Valr) (Lawther et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 922-925 (1981)) wurde durch Homogenotisierung
eingeführt.
Diese Mutation repariert eine Leserahmenverschiebung, die verursacht, dass
der Wildtyp E. coli K-12 gegenüber
Valin empfindlich ist. Der Stamm 23E3 wurde mit dem Plasmid pAH29 (Lawther
et al., supra) transformiert, das den Marker ilvG2096 (Valr) und ein Ampicillin-Resistenzgen enthält. Ein
als 33B6 bezeichneter Stamm, der das Plasmid spontan verloren hatte,
und der das gewünschte
Allel erworben hatte, wurde durch Screenen von Ampicillin-empfindlichen Klonen
auf Valinresistenz identifiziert.
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Schließlich wurden
zwei Mutationen in dem Stoffwechselweg für die Kohlenhydrat-Nutzung eingeführt, um
diesen Wirt, von anderen rekombinanten Wirten durch einen einfachen
Kohlenhydrat-Nutzungstest unterscheiden zu können. Deletionsmutationen von
fucP und malE wurden mittels PCR konstruiert und wurden unabhängig voneinander
in einen Plasmidvektor eingefügt,
der die beta-Lactamase und die Levansucrase enthielt (Bass et al.,
supra). Jedes vollständige
Plasmid wurde in das Chromosom eines W3110-Derivats rekombiniert,
das die unabhängige
Replikation des Vektorplasmids nicht unterstützte (Bass et al., supra).
Der Stamm 33B6 wurde dann mit dem P1-Phagen, der auf dem W3110-Derivat gewachsen
war, das das fucP-Deletionsplasmid in integrierter Form in seinem
Chromosom trug, zur Carbenicillinresistenz transduziert. Derivate,
die die Levansucrase nicht länger
exprimierten und deshalb gegenüber
Saccharose resistent waren, wurden selektiert und auf den Verlust
der Carbenicillinresistenz und die Unfähigkeit, Fucose zu verwenden,
gescreent. Es wurde unter Verwendung von PCR bestätigt, dass
der resultierende Stamm, 49B2, die geplante fucP-Deletion trug.
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Diese
Schritte wurden wiederholt, um die malE-Deletion einzuführen. Der
Stamm 49B2 wurde unter Verwendung des P1-Phagen, der auf dem Stamm
gewachsen war, der das malE-Deltionsplasmid in integrierter Form
in seinem Chromosom trug, zur Carbenicillinresistenz transduziert.
Dann wurden Saccharose-resistente Derivate selektiert und auf den
Verlust der Carbenicilllinresistenz und die Unfähigkeit, Maltose zu verwenden,
gescreent, und die Anwesenheit der malE-Deletion wurde mittels PCR
bestätigt.
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Die
wichtigen Merkmale des Stamms 49A5 schließen die folgenden ein:
- • Er
ist resistent gegenüber
dem T1-Phagen.
- • Er
führt keine Überproduktion
der alkalischen Phosphatase durch, wenn das Phosphat depletiert
wird (welches die Bedingung ist, die verwendet wird, um die Produktsynthese
zu induzieren).
- • Ihm
fehlt eine Protease.
- • Er
ist gegenüber
der Toxizität
von Valin nicht empfindlich.
- • Er
kann von anderen Wirten durch einen Kohlenhydrat-Nutzungstest unterschieden
werden.
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2. Stamm 58B3
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Der
Stamm 58B3 wurde ebenfalls von dem 33B6-Stamm abgeleitet. Der Genotyp Δprc::pS1080
(Bass et al., supra; Metcalf et al., Gene, 138: 1-7 (1994)) wurde
in ein kans-Derivat des Stamms 33B6 (56G4)
mittels P1-Transduktion eingeführt,
wobei auf Kolonien selektiert wurde, die auf LB mit halber Stärke mit
niedrigem Salz bei 42 °C
nicht gut wuchsen. Der kans-Stamm trägt die degP-Deletion,
die von pKS16 abgeleitet ist (Strauch und Beckwith, 1989, supra),
was zu einem Kanamycin-empfindlichen Phänotyp führt. Deshalb ist der 58B3-Stamm
ein kans-Stamm, der sowohl die degP- als
auch die prc-Deletion trägt.
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Der
vollständige
Genotyp des Stamms 58B3 ist W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1 Kans ilvG2096(Valr) Δprc.
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3. Stamm 59A7
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Dieser
Stamm wird konstruiert, indem der Prc-Suppressor (Spr-Mutante) in
den 58B3-Stamm eingeführt wird.
Das P1-Phagenlysat des Stamms 51B9 (tonA prc prc sup zeg722::Tn10)
wurde in den 58B3-Stamm transduziert, indem auf Tet-resistente Kolonien
selektiert und auf den Prc-Suppressorphänotyp gescreent wurde (gutes
Wachstum auf LB mit halber Stärke
mit niedrigem Salz bei 42 °C).
Der neue Stamm wird 58F1 genannt. Die Δprc-Mutante kann bei 42 °C nicht überleben.
Das Tetracyclin-Resistenzgen
wurde durch Plattieren auf Malloy-Platten aus 58F1 entfernt, was
zu ei nem tets-empfindlichen Stamm führte, der
59A7 genannt wurde. Der vollständige
Genotyp des Stamms 59A7 ist W3110 ΔfhuA phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 deoC degP41 IN(rrD-rrE)1
Kans ilvG2096(Valr) Δprc sprW148R.
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Der
ursprüngliche
Stamm 51B9 weist einen Prc-Suppressor Spr auf, der eine Punktmutation
W148R trug, die die gleiche wie Spr in den Stämmen 43H1 und 59A7 ist.
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4. Stamm 43H1
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Der
vollständige
Genotyp des Stamms 43H1 ist sehr ähnlich zu demjenigen von 49A5:
W3110 ΔfhuA phoAΔE15(argF-lac)169
degP41(ΔpstI-Kanr) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096 (Valr)
ptr3 ΔompT
prc::kanr sprW148R. Er trägt
im Vergleich zu 49A5 drei weitere Proteasemarker, Ptr3, OmpT und
Prc. Dieser Stamm weist die Punktmutation (W148R) in Spr auf. Er
ist Kanr.
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5. Stamm 58H2
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Der
Stamm 43H1 wurde mit dem P1-Phagen, der auf dem Stamm 42E3 gewachsen
war, zur tetr transduziert. Dieser Stamm
(58F9) wurde bezüglich
der prc::kanr-Mutation repariert; deshalb wurde er
kans. Dieser Stamm wurde dann auf Minimal-Glucuronsäuremedium
plattiert, um das eda::Tn10 zu entfernen. Der erzeugte neue Stamm,
58H2, ist kans und wurde eine Dreifach-Proteasemutante
mit dem Wildtyp-prc. Der vollständige Genotyp
des Stamms 58H2 ist W3110 ΔfhuA
phoAΔE15 Δ(argF-lac)169 degP41(ΔpstI-Kanr) IN(rrD-rrE)1 ilvG2096(Valr)ptr3 ΔompT sprW148R.
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6. Stamm 45F8
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Der
vollständige
Genotyp des Stamms 45F8 ist W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169 degP41 Kans ΔompT ptr3
ilvG2096(Valr) phoS*(T104). Dies ist ein
phoS-Stamm mit dreifachen Proteasemarkern.
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7. Stamm 41H1
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Der
vollständige
Genotyp des Stamms 41H1 ist W3110 ΔfhuA phoS*(T104) Δ(argF-lac)169 degP41 (Δpst1-Kanr) ptr3 ilvG2096(Valr),
der bei 37 °C
T-adaptiert ist. Dies ist ein phoS-Stamm mit doppelten Proteasemarkern.
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B. Stamm 33D3
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Der
vollständige
Genotyp des Stamms 33D3 ist W3110 ΔfhuA ptr3 lacIq lacL8 ΔompT degP41 (ΔpstI-kanR). Eine Beschreibung der Konstruktion kann
z. B. in US-Pat. Nr. 5,789,199 gefunden werden.
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K. Schüttelflaschen- und Fermentationskulturen
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Für das Schüttelflaschenexperiment
wurden Luria-Bertani(LB)-Brühe
und C.R.A.P.-Minimalmedium mit
5 μg/ml
des AMPICILLINETM-Antibiotikums verwendet.
Das C.R.A.P.-Minimalmedium wurde wie folgt zubereitet: 3,57 g (NH4)2SO4,
0,71 g Na-Citrat-2H2O, 1,07 g KCl, 5,36 g Hefeextrakt und 5,36
g HYCASE SF-SHEFFIELDTM wurden gemischt,
der pH wurde mit KOH auf 7,3 eingestellt, und das Volumen wurde
mit entionisiertem Wasser auf 872 ml angepasst. Dieses Gemisch wurde
dann autoklaviert und auf 55 °C
abgekühlt.
110 ml 1M MOPS-Puffer mit pH 7,3, 11 ml 50 %ige Glucose und 7,0
ml 1 M MgSO4 wurden zugegeben.
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Das
hierin verwendete E-coli-Fermentationsverfahren war ein wie oben
definiertes Verfahren mit hoher Zelldichte. Um höhere Zelldichten zu erreichen,
wurde kontinuierlich Ammoniak zugegeben, und zusätzliche Nebennährstoffe
(P, K, S und Mg) wurden an bestimmten Stadien der Fermentation zugegeben,
um das Zellwachstum zu unterstützen.
Die Verringerung der Menge von Nährstoffen
führte
zu einem weiteren Verfahren, das eine geringere endgültige optische
Dichte der Brühe
bei der gleichen Qualität
des Produkts aufwies, das hierin als Verfahren mit niedriger Zelldichte
bezeichnet wird.
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Ein
einzelnes Röhrchen,
das 1,5 ml Kultur in 10–15
% DMSO enthielt, wurde in eine 1-l-Schüttelflasche aufgetaut,
die 500 ml LB-Medium enthielt, das mit 0,5 ml Tetracyclinlösung (5
mg/ml) und 2,5 ml 1 M Natriumphosphat-Lösung supplementiert war. Diese
Saatkultur wurde für
in etwa 16 Stunden bei 30 °C
wachsen gelassen und dann verwendet, um einen 10-l-Fermenter zu
inokulieren.
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Der
Fermenter startete anfänglich
mit in etwa 6,5 l Medium, das in etwa 4,4 g Glucose, 100 ml 1 M Magnesiumsulfat,
10 ml einer Spurenelementlösung
(100 ml Salzsäure,
27 g Eisen-(III)-chlorid-Hexahydrat, 8 g Zinksulfat-Heptahydrat,
7 g Kobaltchlorid-Hexahydrat,
7 g Natriummolybdat-Dihydrat, 8 g Kupfersulfat-Pentahydrat, 2 g
Borsäure
und 5 g Mangansulfat-Monohydrat in einem Endvolumen von 1 l), 20
ml einer Tetracyclinlösung
(5 mg/ml in Ethanol), 10 ml FERMAX ADJUVANT 27TM (oder
irgendein gleichwirkendes Antischaummittel), einen Beutel HCD-Salze
(37,5 g Ammo niumsulfat, 19,5 g dibasisches Kaliumphosphat, 9,75
g monobasisches Natriumphosphat-Dihydrat, 7,5 g Natriumcitrat-Dihydrat
und 11,3 g monobasisches Kaliumphosphat) und 200 g NZ Amine A (ein
Proteinhydrolysat) enthielt. Die Fermentationen wurden bei 30 °C mit 10
slpm Luftfluss durchgeführt
und bei einem pH von 7,0 ± 0,2
reguliert (obwohl in einigen Fällen
gelegentlich Abweichungen außerhalb
dieses Bereichs vorkamen). Der Gegendruck des Fermenters und die
Rührgeschwindigkeit
wurden variiert, um die Sauerstoff-Transferrate in dem Fermenter
zu manipulieren und folglich die zelluläre Atmungsrate zu kontrollieren.
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Nach
der Inokulation des Fermenters mit dem Zell-enthaltenden Medium
aus der Schüttelflasche
wurde die Kultur in dem Fermenter bis zu hohen Zelldichten wachsen
gelassen, wobei ein Computer-basierter Algorithmus verwendet wurde,
um dem Fermenter eine konzentrierte Glucoselösung zuzuführen. Ammoniumhydroxid (58%ige
Lösung)
und Schwefelsäure
(24%ige Lösung)
wurden dem Fermenter ebenfalls wie erforderlich, um den pH zu steuern,
zugeführt.
Weitere Zugaben von Antischaum wurden außerdem in einigen Fällen verwendet,
um die Schaumbildung zu kontrollieren. Wenn die Kultur eine Zelldichte
von in etwa 40 OD550 erreichte, wurden zusätzlich 100 ml 1 M Magnesiumsulfat
zu dem Fermenter zugegeben. Zusätzlich
wurde mit einer Zugabe von konzentriertem Salz (das aus in etwa
10 g Ammoniumsulfat, 26 g dibasischem Kaliumphosphat, 13 g monobasischem
Natriumphosphat-Dihydrat, 2 g Natriumcitrat-Dihydrat und 15 g monobasischem Kaliumphosphat
in 1 l Wasser bestand) zu dem Fermenter mit einer Rate von 2,5 ml/min
begonnen, sobald die Kultur in etwa 20 OD550 erreichte, und wurde
fortgesetzt, bis in etwa 1250 ml zu der Fermentation zugegeben waren.
Die Fermentationen wurden typischerweise für 72–80 Stunden fortgesetzt.
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Während der
Fermentation wurde, sobald der Sollwert für den gelösten Sauerstoff für die Fermentation erreicht
war, die konzentrierte Glucoselösung
auf der Basis des Signals der Sonde für gelösten Sauerstoff zugeführt, um
die Konzentration des gelösten
Sauerstoffs bei dem Sollwert zu steuern. Folglich manipulierten
bei diesem Regulationsschema Manipulationen der Fermenter-Betriebsparameter,
so wie die Rührgeschwindigkeit
oder der Gegendruck, die die Sauerstoff-Transferkapazität in der
Fermentation beeinflussen, in entsprechender Weise die Sauerstoff-Aufnahmerate
oder Stoffwechselrate der Zellen.
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Ein
Massenspektrometer wurde verwendet, um die Zusammensetzung des Abgases
aus der Fermentation zu überwachen
und ermöglichte
die Berechnung der Sauerstoffaufnahme- und Kohlendioxid-Bildungsraten
bei der Fermentation.
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Wenn
die Kultur eine Zelldichte von in etwa 220 OD550 erreichte, wurde
das Rühren
von einer anfänglichen
Rate von 1000 upm auf in etwa 725 upm während in etwa 12 Stunden verringert.
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Für die Fermentation
von Zellen, die mit pMS421 und pcyc34 (worin der tacII-Promotor verwendet
wurde, um die Expression sowohl der schweren als auch der leichten
Kette zu steuern) transformiert waren, oder von Zellen, die mit
pMS241 und dem zwei-Promotorplasmid pxCD18-7T3 (worin der tacII-Promotor
verwendet wurde, um die Expression der schweren Kette zu steuern)
transformiert waren, wurden 50 ml 200 mM IPTG in etwa 12 Stunden,
nachdem die Kultur eine Zelldichte von 220 OD550 erreichte, zugegeben,
um die Synthese der schweren und leichten Kette bei pcyc34 und die
Synthese der schweren Kette bei pxCD18-7T3 zu induzieren.
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Ergebnisse
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A. Die entdeckten und
identifizierten Spaltungsprodukte der leichten Kette Kappa
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Lösliche E-coli-Extrakte
(siehe HSE in Material und Methoden) und die verbleibenden Sedimente,
die in SDS-Probenpuffer suspendiert waren (ein allgemein erhältliches
kommerzielles Produkt für
den Betrieb eines SDS-Gels) wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
Die Proben wurden von den 20-OD-ml-Sedimenten, die während der
Fermentation von E. coli mit hoher Zelldichte (HCD) in dem Stamm
49A5, der das Plasmid pS1130 trug, für die Herstellung von rhuF(ab)'2LZ(xCD18) gesammelt
wurden, abgeleitet. In der löslichen Fraktion
wurde das Fragment der Kappa-LC-Spaltung mit 115 Aminosäuren Länge identifiziert.
Die unlösliche Fraktion
des Fragments der Kappa-LC-Spaltung mit 182 Aminosäuren Länge, wurde
identifiziert. Alle Fragmente wurden auf eine PVDF-Membran transferiert
und sequenziert. Beide besaßen
den korrekten N-Terminus wie die prozessierten Formen von Kappa-LC.
Die Massen wurden mittels einer massenspektroskopischen Analyse
als 12488,5 bzw. 19857,2 bestimmt. Die Stellen der proteolytischen
Spaltung befanden sich zwischen den Resten Val 115 und Phe 116 für LC-115
und zwischen den Resten Ser182 und Lys183 für LC-182. Nur eine Stelle sah
wie eine typische Prc-Schnittstelle aus.
-
Ein
weiteres 20-OD-ml-Sediment von E.-coli an dem Ende dieser Fermentation
wurde mittels zweidimensionaler Gelelektorphorese analysiert. Das
E-coli-Zelllysat des Sediments (~40 μg Protein) wurde wie von Champion
et al., supra, beschrieben, mit Rehydratisierungslösung zusammengegeben.
In dem 2-D-Gelmuster der aus der 49A5/pS1130-Fermentation gewonnenen
Zellen wurden die spezifischen Flecken der leichten Kette Kappa
identifiziert, indem das Produktionsgel mit einem Leerwert-2-D-Gel verglichen wurde,
das von Zellsedimenten einer (49A5/pBR322)-Fermentation an einem ähnlichen
Zeitpunkt gewonnen wurden. Die Sedimente wurden von dem gleichen
Zeitpunkt zweier Fermentationen gewählt, wobei angenommen wurde,
dass die Zellen sich in vergleichbaren Stoffwechselzuständen befinden
sollten. Alle Kappa-LC-Flecken
wurden durch Immunblot unter Verwendung eines anti-Alkalische-Phospatase-konjugierten
anti-humanen Kappa-LC-Antikörpers
identifiziert.
-
Außer den
beiden Hauptabschnitten, die mittels 1-D-Gelanalyse identifiziert
wurden, zeigte das 2-D-Gel intaktes LC, eine Isoform des intakten
LCs und wenigstens 5 weitere kleinere LC-Abschnitte (siehe 6).
Die entsprechenden Flecken wurden eluiert und sequenziert. Alle
LC-spezifischen Peptide wiesen den korrekten N-Terminus auf, was
darauf hindeutete, dass sie alle korrekt prozessiert waren, wobei
das STII-Signal gespalten wurde. Alle diese Peptide wurden mittels
des Massenspektrometers analysiert, um die annähernde Masse zu bestimmen.
Aufgrund der Spurenmenge der vorhandenen kleineren Abschnitte konnte
eine korrekte Masse nicht erhalten werden, um die Schnittstellen
dieser Fragmente zu bestimmen.
-
Drei
kleinere Abschnitte bildeten eine Gruppe mit dem Kappa-LC-115-Abschnitt
bei einem pI-Wert um 9. Der vierte wies einen pI-Wert um 6,5 auf,
und der fünfte
wies den gleichen pI-Wert wie der LC-182-Abschnitt bei einem pI
um 6 auf. Um die Löslichkeit
dieser LC-Fragmente zu bestimmen, wurde ein HSE eines identischen
Sediments auf ein 2-D-Gel geladen. Das LC 182-Fragment kam nur in
der unlöslichen
Fraktion vor.
-
B. Prc ist die einzige
für die
Spaltung der leichten Kette Kappa verantwortliche Protease
-
1-D-SDS-PAGE-Gele,
die mit der unlöslichen
Fraktion der Zellen, die von den vier verschiedenen Fermentationen
Proteasemutanten 49A5, 45F8, 41H1 und 43H1 von E. coli abgeleitet
waren, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimierten,
beladen waren, wurden verglichen. Die proteolytische Spaltung LC-182
war in drei der vier Proben vorhanden (nicht in dem prc-Deletionsstamm
43H1), was darauf hindeutete, dass die Prc-Protease an der Kappa-LC-Spaltung
beteiligt sein könnte.
Der Scheitelpunkt 1, der dem LC-115-Abschnitt entspricht, der in
den von dem Stamm 49A5 (prc-plus) abgeleiteten Proben vorhanden
war, verschwand ebenfalls aus den von 43H1 abgeleiteten Proben,
wenn Chromatogramme verglichen wurden, die durch den AME5TM/RP-Doppelsäulen-Test
aufgelöst
worden waren. Dieser Test adsorbierte selektiv Kappa- LC-enthaltende Antikörperspezies
und löste
sie dann, wie oben in dem Abschnitt Material und Methoden beschrieben,
in fünf
Scheitelpunkte auf.
-
Wenn
das 2-D-Gel von Sedimenten analysiert wurde, die aus 43H1-Zellen
gewonnen wurden, wurde gefunden, dass nicht nur die LC-115- und
LC-182-Fragmente aus dem Gel verschwanden, sondern dass auch alle
anderen LC-verwandten kleineren Spezies verschwanden (siehe 7).
Dieses Ergebnis deutet stark darauf hin, dass Prc das einzige Enzym
ist, das für
die Kappa-LC-Spaltungen verantwortlich ist. Dieses 43H1-Zellsediment wurde
aus einer Fermentation mit niedriger Zelldichte gewonnen.
-
C. Stammkonstruktion,
um zu bestätigen,
dass Prc das einzige an der Spaltung der leichten Kette Kappa beteiligte
Enzym ist
-
1. Ein prc-Deletionsstamm,
der prc-plus werden soll
-
Der
Beweis, dass Prc das einzige Enzym ist, das an der Kappa-LC-Spaltung
beteiligt ist, wurde erhalten, indem der 43H1-Stamm (ein prc-minus-Wirt
mit vierfachen Proteasemarkern) repariert wurde, um ein prc-positiver,
dreifach-Proteasestamm (58H2) zu werden. Ein Stamm 42E3 trägt eda-51::Tn10,
das mit prc kotransduzierbar ist. Der 43H1-Stamm wurde mit dem P1-Phagen,
der auf 42E3 gewachsen war, zu tetr transduziert.
Der resultierende Stamm (58F9) wurde bezüglich der prc::kanr-Mutationen
repariert; dadurch wurde er kanr. Der Stamm
wurde dann auf Minimal-Glucuronsäuremedium
plattiert, um das eda::Tn10 zu entfernen. Der erzeugte neue Stamm,
58H2, wurde eine dreifach-Protease-Mutante mit dem Wildtyp prc.
Dieses Isolat ist entweder eine Transduktante oder ein spontanes
Eda+-Isolat. Der prc-plus-Genotyp wurde mittels
PCR bestätigt. Dieser
Stamm 58H2 trägt
immer noch den von 43H1 abgeleiteten prc-Suppressor (sprW148R) und ist kans.
Das Wiedertreten von LC-Abschnitten
in diesem Stamm 58H2 wurde mittels des AME5TM/RP-Doppelsäulen-Tests nachgewiesen
(siehe 8).
-
2. Das prc-Gen wurde aus
einem nativen Stamm deletiert, damit dieser prc-minus wurde
-
Der
Stamm 49A5 war ein wie oben beschriebener prc-Wildtypstamm. Als
die prc-Deletion
in diesen Stammhintergrund eingeführt wurde, um den Stamm 58B3
zu konstruieren, und die Zellextrakte mittels des AME5TM/RP-Doppelsäulen-Verfahrens
getestet wurden, verschwand der LC-115-Abschnitt (Scheitelpunkt
1). Der Stamm 58B3 war von dem Stamm 33B6 abgeleitet, der nur einen
Proteasemarker, DegP, trägt.
Die Δprc:.pS1080
(Bass et al., supra; Metcalf et al., supra) wurde mittels P1-Transduktion
in ein kans-Derivat von 33B6 (56G4) eingeführt, um
einen degP-Δprc-Doppelproteasestamm,
59A7, zu erzeugen.
-
Die
Zusammenfassung der Spaltungsergebnisse für alle sieben Stämme ist
in der Tabelle 1 gezeigt.
-
Tabelle
1: E.-coli-Wirtsstämme,
die anti-CD18-(Fab)'2-Leucinzipper
exprimieren
-
D. Verbesserung der Ausbeute
von rhuFab'2-LZ-(xCD18)
in prc-minus-Wirten
-
1. Schüttelflaschen-Ergebnisse
-
Drei
Stämme
(49A5, 43H1 und 58H2), die rhuFab'2-LZ-(xCD18) exprimierten, wurden zunächst in LB-Brühe +Amp über Nacht
bei 30 °C
wachsen gelassen. Dann wurden alle Kulturen in gleicher Weise in Schüttelflaschen
inokuliert, die 25 ml des C.R.A.P.-Minimalmediums +Amp enthielten,
und über
Nacht bei 30 °C
weitergeschüttelt.
20-OD-ml-Sedimente wurden gesammelt, um lösliche Lysate (HSE) herzustellen.
25 μl von
530 μl wurden
auf die AME5TM/Umkehrphasensäulen geladen.
-
Die 8 zeigt
das Balkendiagramm, das die fünf
Scheitelpunkte repräsentiert,
die in diesem Test aufgelöst
wurden. Die y-Achse ist die spezifische Scheitelpunktfläche von
Scheitelpunkt 1 bis 5 (siehe Material & Methoden). Die x-Achse zeigt die
rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Produktionsstämme. Beide
prc+-Stämme,
49A5 und 58H2, produzierten nahezu gleiche Mengen des Produkts,
und beide von ihnen zeigten nahezu gleiche Mengen des LC-115-Fragments
(Scheitelpunkt 1) im Vergleich zu nahezu nichts in dem Scheitelpunkt
1 und mehr Scheitelpunkt-5-Produkt in dem Δprc-Stamm (43H1). Dieses Diagramm
zeigte die Verteilung von Antikörperfragmenten.
Größere Mengen
von löslichem,
intaktem LC und LC-Dimer wurden in dem 43H1-Wirt als in den 49A5- und 58H2-Wirten
beobachtet. In den Schüttelflaschen
produzierte der prc–-Wirt nahezu 5-fach
mehr von dem rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Produkt
als die nativen prc-Stämme.
-
2. Fermentationsergebnisse
-
Der
durchschnittliche rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Titer,
der bei der Standardfermentation mit hoher Zelldichte (HCD) erhalten
wurde, betrug 893 mg/l in dem Wildtyp-prc-Wirt (49A5, n=6) auf der
Basis des AME5TM/RP-Doppelsäulen-Tests.
Eine nahezu zweifache Verbesserung des Titers wurde in der 43H1/pS1130-Fermentation
beobachtet. Der dramatische Unterschied zwischen den Titern der
Schüttelflasche
(5×) und
der Fermentation (< oder
gleich 2×)
für die
43H1- bzw. 49A5-Wirte beruhte, ohne Beschränkung auf irgendeine Theorie,
vermutlich auf dem Unterschied der Sekretionseffizienz der Produkte.
Wenn die Gesamtlysate von Schüttelflaschensedimenten
analysiert wurden, waren in dem prc-plus-Hintergrund nur 50% der
Antikörperfragmente
korrekt prozessiert, während
die Lysate, die von 43H1-Schüttelflaschen-Zellen
abgeleitet waren oder alle Zellen, die von einer Fermentation abgeleitet
waren (prc-plusv und -minus) 100% Prozessierung zeigten. Es wurde
gefunden, dass die Prozessierung des Prc-Proteins von secY, secA
abhängig war
(Hara et al., 1991, supra). Ohne Begrenzung auf irgendeine Theorie
wird angenommen, dass das Schüttelflaschenergebnis
zeigt, dass das Prc-Protein
mit den Antikörperfragmenten
um die Translokation kompetitierte.
-
3. Die Gesamtexpression
von Antikörperfragmenten
wurde gemessen
-
Ein
POROSTM-Säulentest der Gesamt-Fermentationsbrühe-Proben
wurde, wie in dem Abschnitt Material & Methoden beschrieben, entwickelt,
um die Effizienz der Antikörperfaltung
und -assemblierung zu beurteilen. Wenn gleiche Injektionen von Gesamtbrühe-Proben,
die von drei anti-CD18-HCD-Fermentationen gewonnen wurden, in verschiedenen
Wirten verglichen wurden, wurde gefunden, dass die 43H1-Fermentation eine ähnliche
Menge an HC wie die 49A5-Fermentation, aber eine höhere Menge
an intaktem Kappa-LC exprimierte (siehe Tabelle 2). Der rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Titer
betrug 1830 mg/l für
43H1 im Vergleich zu 887,8 mg/l für 49A5. Die 59A7-Fermentation
produzierte nicht nur extra Antikörperfragmente, sondern sie
führte
auch zu dem höchsten
Titer von rhuFab'2-LZ-(xCD18)
mit 2403 mg/l.
-
Tabelle
2: Die Gesamtexpression von Antikörperfragmenten und die Fab'2-LZ-Titer von verschiedenen
Stämmen,
die rhuFab'2-LZ-(xCD18)
exprimieren, in einem Standard-HCD-Fermentationsverfahren
-
E. Der Prc-Suppressor
ist für
das Überleben
in der stationären
Phase erforderlich
-
Es
wurde gefunden, dass der Stamm 58B3, der die degP- und prc-Deletionen
trägt,
eine Lyse während des
Wachstums in der verlängerten
stationären
Phase einer HCD-Fermentation
zeigte, wobei er das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimierte. Die Zelllyse
begann bei 50 Stunden nach der Inokulation. Sie erzeugte nur 320
mg/l rhu-Fab'2LZ(xCD18), während die
59A7/pS1130-Fermentation ein gutes Wachstum in der stationären Phase
bis zu 72 Stdn einer HCD-Fermentation aufrechterhielt, wobei eine
hohe Zelldichte (in etwa 300 OD550-ml) erreicht
wurde. Die 9 zeigt den Wachstumsvergleich
der beiden Fermentationen. Außerdem wurde
eine besonders hohe Expression sowohl der HC- als auch der LC-Fragmente
in diesem Stammhintergrund gefunden, die die Ausbeute des rhuFab'2-LZ-(xCD18)-Moleküls auf 2403
mg/l erhöhte.
Wiederum wurden keine Kappa-LC-Abschnitte in Proben gefunden, die
sowohl aus dem 58B3- als auch dem 59A7 prc-Deletionsstamm gewonnen
wurden.
-
Der
prc-Suppressor (spr) (der Prcsup kodiert)
wurde hierin ursprünglich
aus dem Stamm 40A6 (prc::kan spr) als eine spontane Mutation, d.h.
eine thermoresistente Revertante der prc-Deletionsmutante, isoliert. Nachdem
das Gen sequenziert und durch Konjugationskartierung war, wurde
gefunden, dass es bei in etwa 48 min auf dem E.-coli-Chromosom lokalisiert
ist. Die Nukleotidsequenz seines PCR-Produkts entsprach derjenigen
des E.-coli-spr-Gens, die von Hara et al., 1996, supra, berichtet
wurde, mit Ausnahme einer Punktmutation bei der Aminosäure 148,
bei der ein TGG-Kodon zu CGG verändert
war, was zu einer Änderung
eines Tryptophanrestes zu einem Arginin (W148R) führte. Dieser
prc-Suppressor wies die W148R-Mutation auf, wenn er in den Stamm
59A7 eingeführt
wurde. Es wurde berichtet, dass das Wildtyp-spr-Gen ein Li poprotein in
der Hüllfraktion
kodiert, von dem angenommen wird, dass es ein Peptidoglycan-hydrolysierendes
Enzym ist (Hara et al., 1996, supra).
-
Der
Prc-Suppressor wurde mittels eines Tn10, das mit diesem Suppressor
verbunden war, in den Stamm 59A7 eingeführt, und es wurde auf Kotransduktanten
selektiert, die sowohl Tetracyclin-resistent als auch fähig waren,
auf einer LB-Platte mit halber Stärke und Niedrigsalz bei 42 °C zu wachsen.
Die neue Punktmutation ereignete sich zu der Zeit, als Tn10 mittels
Malloy-Platten entfernt wurde.
-
Auf
der Basis der Ergebnisse der anti-CD18-Fab'2-Fermentation des 58B3- im Vergleich
zu dem 59A7-Stamm wurde gezeigt, dass der Prc-Suppressor für das erfolgreiche
Wachstum einer ΔPrc-Mutante
erforderlich ist, speziell in einer E.-coli-Fermentation mit hoher Zelldichte. Der
Stamm, als 58B3 bezeichnet, trägt exakt
denselben Genotyp wie 59A7, mit Ausnahme von spr (W148R), und konnte
in einer Standard-HCD-Fermentation nach 50 Stunden nicht lebensfähig bleiben.
-
F. Die Prc-Deletionsmutante
kann aufgrund der Anordnung der Prc-Spaltungstellen die Produktionsspiegel verschiedener
Antikörper
erhöhen
-
Die 10 zeigt
die humanisierte Kappa-LC-Sequenz (SEQ ID Nr: 5). Die berechneten
pI-Werte von potentiellen Prc-Abschnitten sind in der Tabelle 3
gezeigt.
-
Tabelle
3: Berechnete pI-Werte von potentiellen Prc-Abschnitten
-
Ohne
Beschränkung
auf irgendeine Theorie wird auf der Grundlage der 10 und
der Tabelle 3 angenommen, dass die Prc-Protease begann, das Kappa-LC
von dessen C-Terminus aus 9 oder 18 Aminosäuren innerhalb der LC-Sequenz
zu spalten und es dann nach und nach in Richtung auf den N-Terminus
zu abzuknabbern, um die S/K-Stelle
für die
Wirkung einer Serin-spezifischen Protease zu öffnen. Es war möglich, dass
eine weitere Kappa-LC-Spezies (möglicherweise
in einem anderen Faltungszustand) hauptsächlich bis auf 115 Aminosäuren gespalten
wurde. Viele mögliche
Spal tungsprodukte weisen Molekulargewichte und berechnete pI-Werte
auf, die mit den in dem 2-D-Gel gefundenen Kappa-LC-Flecken ziemlich
gut übereinstimmt.
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Die 11 zeigt,
dass der prc-Deletionsstamm (43H1) den LC-182-Abschnitt aus Zellen
entfernte, die anti-VEGF-Fab-, anti-CD19-Fab'2-LZ-, anti-CD18-Fab'2-LZ-6xHis-Moleküle und anti-Prothrombinase("tissue factor")-Fab'2-LZ-6xHis-Moleküle exprimierten.
Die von cab2826 (33B6/D3H44-F(ab')2)
und cab2847 (43H1/D3H44-F(ab')2) abgeleiteten
Fermentationsproben waren Fermentationen mit hoher Zelldichte, die
das anti-Prothrombinase("tissue
factor")-Fab'2-LZ-6xHis-Molekül exprimieren
sollten. Das Fermentationsverfahren war das gleiche Standard-HCD-Verfahren
wie oben für
die anti-CD18-Fab'2-LZ-Fermentationen
beschrieben. Cab2793 war die 49A5/pAB3-Fermentation, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-6xHis-Molekül exprimieren
sollte. Cab2846 war die 41H1/pS1130-Fermentation, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimieren
sollte. Die JJ81(43H1/pY0317)- und die JJ67(43E7/pY0317)-Fermentationen sollten
anti-VEGF-Fab erzeugen. Cab2814 war (49A5/pBR322), die Leerwert-Fermentation,
die das gleiche Plasmidrückgrat
ohne Antikörper-exprimierende Gene
enthält.
-
Die
20-OD-Fermentationssedimente wurden mit TRIS/EDTA/Lysozym extrahiert,
um die löslichen HSEs
zu entfernen. Die verbliebenen Sedimente wurden in 400 μl 1x-SDS-Probenpuffer
plus 20 μl
beta-Mercaptoethanol suspendiert und dann bei 95 °C auf einem
Heizblock für
5 Minuten erhitzt. Dann wurden 5 μl
auf ein 4–12%iges
NUPA-GETM-Gel
aufgetragen. Die Stämme
33B6, 41H1, 49A5 und 43E7 sind prc-plus-Stämme. Der
Stamm 43H1 war ein prc-minus-Stamm. Alle von dem nativen prc-Stamm abgeleiteten
Proben weisen das abgebaute 19,8-kD-LC-Produkt auf. Die cab2829(33B6/pD3H44TB)-Fermentationsprobe,
die anti-TF-Fab exprimierte, konnte ebenfalls das LC-Abbaufragment
mit der gleichen Größe nachweisen.
Alle diese Fragmente wurden Aminosäure-sequenziert, und es wurde
bei allen gefunden, dass sie die korrekten N-terminalen LC-Sequenzen
aufwiesen.
-
G. Der Stamm 59A7 zeit
in Schüttelflaschen
eine höhere
Expression von anti-CD18-His-
und -Lys-getaggtem Fab'2-LZ-
und Apo2L-cytoplasmatischem Protein
-
Zusätzliche
Schüttelflaschendaten,
die in der Tabelle 4 gezeigt sind, zeigen, dass der Stamm 59A7 pAB3
(das anti-CD18-His-getaggte Fab'2-LZ)
besser exprimierte als der Stamm 43H1 und 49A5. Der Stamm 59A7 exprimierte
pAB21 (Lys-getaggtes Fab'2-LZ) um das 2,4-fache
besser als der Stamm 33B6. Die Stämme 59A7 und 43H1 exprimierten
pS1130 (Fab'2-LZ
ohne Tag) um das 2,9-fache besser als der 49A5-Stamm.
-
Jedoch
zeigten die Fermentationsergebnisse stets, dass der Stamm 59A7 bei
der pS1130-Expression besser als der Stamm 43H1 ist.
-
Für das cytoplasmatische
Nicht-Antikörper-Protein
Apo2L ist die spezifische Aktivität in etwa 20–30 % höher, wenn
es in dem Stamm 59A7 exprimiert wird, als in dem Stamm 43E7 (in
Schüttelflaschen).
Da der Stamm 43E7 bis zu einer höheren
OD550 wuchs, war die Gesamtexpression ähnlich. Der 43E7-Stamm ist
ein ompT-ptr3-degP-Stamm
ohne prc und spr.
-
Tabelle
4: Die höheren
spezifischen Titer von verschiedenen Proteinen, die in 59A7 und
anderen Stämmen
in Schüttelflaschenkulturen
exprimiert wurden
-
H. Der Stamm 59A7 zeit
eine bessere Expression mittels Fermentation für anti-CD18-Fab'2-LZ
-
Die
Tabelle 5 zeigt, dass der Stamm 59A7 anti-CD18-Fab'2-LZ von dem zwei-Promotor-Plasmid pxCD18-7T3 überlegen
war und 49A5 bei der Expression von anti-CD18-Fab'2-LZ von dem Plasmid pcyc34 überlegen
war.
-
Tabelle
5: Die höheren
spezifischen Titer von anti-CD 18-Fab'2-LZ, das in 59A7 im Vergleich zu 33D3
und 49A5 unter Verwendung von zwei verschiedenen Plasmiden mittels
Fermentation exprimiert wurde
-
-
Diskussion
-
In
der vorliegenden Arbeit wurde der Abbau von Kappa-LC in E.-coli-Zellen
untersucht, die das anti-CD18-Fab'2-LZ-Molekül exprimieren. Frühere Studien
haben viele potentielle Prc-Substrate gezeigt, aber, so sicher wie
festgestellt werden kann, hat niemand die Entdeckung von Antikörperfragmenten
als das Substrat dieser Protease berichtet. Hierin wird gezeigt,
dass Prc die einzige Protease ist, die an der Kappa-LC-Spaltung innerhalb
von E.-coli-Zellen beteiligt ist. Das Prc-Protein schien Kappa-LC
selektiv an bestimmten Stellen zu schneiden, was zu zwei Hauptabschnitten
(LC-115 & LC-182)
und fünf
zusätzlichen
kleinen Spaltungsprodukten führte,
wie anhand von 2-D-Gel-Ergebnissen
beobachtet wurde. Da einer der Hauptabschnitte ein S/K-Spaltungsprodukt
war, das den Charakteristika der Prc-Spaltungsstellen nicht entsprach
(Keiler et al., supra), wurde es genauer untersucht. Es wurde jetzt
gefunden, dass der Abbau der leichten Kette Kappa in E.-coli-Zellen
mit einer periplasmatischen Protease von E. coli in Beziehung steht
(Prc/Tsp). Produkte der gespaltenen leichten Kette Kappa wurden
durch analytische Verfahren (1-D/2-D-SDS-PAGE, Massenspektrometrie und
N-terminale Sequenzanalyse) an E.-coli-Extrakten identifiziert,
die von verschiedenen, proteolytisch defizienten Stämmen stammen,
die das anti-CD18-F(ab)'2-Leucinzipper-Molekül exprimieren,
um zu bestätigen, dass
Prc/Tsp die einzige Protease ist, die für die Spaltung der leichten
Kette Kappa verantwortlich ist.
-
Es
wird gefunden, dass die spezielle Kombination der degP prc-Deletion
mit einem prc-Suppressor (spr-Mutante) einen einzigartigen E.-coli-Stamm
darstellt, der fähig
ist, sehr hohe Mengen an rekombinantem Protein oder eine höhere spezifische
Aktivität
des Proteins zu produzieren, wie hierin anhand des Apo2-Liganden
und aktiven Antikörpers
veranschaulicht wird.
-
Die
Fermentation unter Verwendung des vorliegenden degP prc-spr-Stammes
führt zu
einem Wachstum mit hoher Zelldichte (bis 300 OD oder mehr) und zu
der Produktion von hohen Ausbeuten des rhuxCD18-Fab'2-Leucinzipper-Produkts
im Vergleich zut der Expression von Antikörpern in dem Wildtypstamm oder
in proteolytisch defizienten Stämmen.
-
Das
vorliegende Fermentationsverfahren erlaubt die Produktion von 100–200 g/l
an Zelltrockengewicht in 72 Stunden mit einer mehr 200%igen Zunahme
des aktiven Antikörpers,
der in einem bevorzugten Stamm 59A7 produziert wird, der die Kombination
degP prc spr aufweist. Der vollständige Genotyp des Stamms 59A7
ist W3110 ΔfhuA
phoA ΔE15 Δ(argF-lac)169
deoC degP41 IN(rrD-rrE)l kans ilvG2096(Valr) Δprc sprW148R. Sein Elternstamm ist 58B3, der identische
genetische Marker wie der Stamm 59A7 mit der Ausnahme ohne den prc-Suppressor,
spr, aufweist. Der Stamm 58B3 war nicht fähig, sein Wachstum in der stationären Phase
eines Fermentationsverfahrens von E. coli mit hoher Zelldichte aufrecht
zu erhalten. Er produzierte weniger Antikörperprodukt als ein nativer
prc-Stamm (49A5), der auch den degP-Deletionsmarker und andere identische
Genotypen wie der 59A7-Stamm trägt,
mit der Ausnahme, dass 49A5 ein Kanamycin-resistenter, bezüglich prc
nativer Stamm ist, während
59A7 ein Kanamycin-sensitiver Δprc-Stamm
ist.
-
Somit
wurde hiermit entdeckt, dass die Anwesenheit des prc-Suppressors
(spr) essentiell für
ein gutes Wachstum und einen hohen Spiegel der Antikörperproduktion
in einem degP prc-Deletionsstamm ist, speziell in einem Fermentationsverfahren
mit hoher Zelldichte, aber auch in einem Fermentationsverfahren
mit niedriger Zelldichte.
-
Eine
DegPΔ-Einzelprotease-Mutante
und andere mehrfach-proteasedefiziente Stämme, die degPΔ enthielten,
produzierten keinen besonders hohen Spiegel an rekombinanten Proteinen.
Die beiden zuvor erwähnten
Stämme,
degP rpoH und degP prc, exprimierten mehr Produkt als viele andere
Stämme,
mit denen sie verglichen wurden, aber nicht annähernd so viel wie der Stamm
59A7. In spezifischerer Weise zeigte der Stamm 58B3 mit der degP
prc-Kombination ohne den spr-Suppressor keinerlei Vorteil bei der
Produktion von Antikörperfragmenten,
wie anhand des anti-CD18-Fab'2-LZ-Moleküls veranschaulicht
wurde.
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Es
werden analytische Ergebnisse vorgestellt, um zu beweisen, dass
die Spaltung von Kappa-LC in E.-coli-Zellen, die ein humanisiertes
anti-CD18-Fab'2-Leucinzipper-Molekül exprimieren,
mit dem periplasmatischen, C-terminalen Prozessierungsprotein (Prc)
in Zusammenhang steht. Das Prc-Protein ist die einzige Protease,
die für
die Spaltung der leichten Kette Kappa verantwortlich ist, was sowohl
mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese als auch durch genetische
Manipulation von Antikörper-Produktionsstämmen bewiesen wurde.
Um zu bestätigen,
dass die Prc-Protease wirklich das einzige Enzym ist, das an Kappa-LC-Spaltungen beteiligt
ist, erschienen die Kappa-LC-gespaltenen Produkte erneut, wenn ein Δprc-Stamm
zu einem nativen prc-Stamm
repariert wurde. Auf ähnliche
Weise verschwanden die LC-gespaltenen Pro dukte, wenn das prc-Gen
aus einem nativen prc-Stamm deletiert wurde. Beide Stammkonstruktionen
wurden mittels P1-Transduktion durchgeführt.
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Zusätzlich werden
die Titervergleiche des anti-CD18-Fab'2-Leucinzipper-Moleküls, das aus proteolytischen
Mutanten von E. coli mit oder ohne prc-Deletion, gewonnen wurde,
bereitgestellt. Diese Daten bewiesen, dass der Stamm 59A7 ein starker
Produzent der Antikörperexpression
ist. Verschiedene Nukleinsäuren, die
für die
Expression des anti-CD18-F(ab)'2-Leucinzipper-Moleküls konstruiert
wurden, werden beschrieben; alle Expressionsplasmide, die in den
Stamm 59A7 transformiert wurden, produzierten größere Mengen an Antikörperfragmenten
als im Vergleich eine degPΔ-Einzelprotease-Mutante
oder eine degP-prc-Mutante ohne spr. Ein weiterer Stamm, 43H1, der
den Genotyp degP prc spr zusätzlich
zu den ompP- und ptr3-Mutationen aufwies, wuchs nicht so gut wie
der Stamm 59A7, obwohl der Stamm 43H1 die gleiche spr-Mutation aufwies wie
diejenige in 59A7, weil er an der Position 520 eine Veränderung
von T nach C enthält,
die zu einer Veränderung
von der Aminosäure
W zu R an der Position 148 führt.
Er produzierte anti-CD18-Fab'2-LZ
mit einem höheren
Titer als derjenige, der von dem degP-Stamm (49A5) produziert wurde,
aber nicht so hoch wie derjenige, der von dem Stamm 59A7 in dem
Fermentor produziert wurde.
-
Es
wurde berichtet, dass die Prc-Protease ihre Substrate an einer bestimmten
Anzahl von Stellen, aber mit einer ziemlich breiten Sequenzspezifität schneidet
(Keiler et al., supra). Es wurde hierin gefunden, dass die Prc-Schnittstellen
sich in dem Kappa-LC-Fragment
in der konstanten Region befinden, die die Rückgratsequenz ist, im Allgemeinen
für die
Konstruktion verschiedener Expressionsplasmide für humanisierte Antikörper verwendet
wird. Auf der Basis der vorliegenden Ergebnisse wird erwartet, dass
die Prc-Deletionsmutante die Titer von verschiedenen Antikörperfragmenten,
so wie: Fab, Fab',
Fab'2 (mit oder
ohne Leucinzipper), einschließlich
Antikörpern
mit voller Länge,
die in Zellen von Escherichia coli exprimiert werden, erhöhen sollte. Es
wird auch erwartet, dass das Antikörperfragment, das von einer
His-Tag- oder einer Lys-Tag-Sequenz an dem C-Terminus von HC flankiert
ist, profitiert.
-
Es
wurde gefunden, dass der Stamm 59A7 dem Stamm 49A5 bei der Expression
von pAB3 überlegen ist
und dem Stamm 43E7 bei der spezifischen Expression des cytoplasmatischen
Proteins Apo2L in Schüttelflaschen überlegen
ist und den Stämmen
43H1 und 49A5 bei der Expression von pS1130 und pcyc34 (dem tacII-Promotor-Gegenstück von pS1130)
mittels Fermentation überlegen
ist. Außerdem
war er dem Stamm 33D3 bei der Expression des Zwei-Promotor-Plasmids
pxCD18-7T3 überlegen.
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BEISPIEL 2
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Material und
Methoden
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A. Expressionsplasmide
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Das
Plasmid D3H44-F(ab')2
ist in Beispiel 1 beschrieben. Das Plasmid pY0317tet20 ist in Beispiel
1 beschrieben.
-
B. Stämme
-
Der
Stamm, der für
die Expression von xVEGF Fab verwendet wurde, ist ähnlich zu
anderen Stämmen,
die in Beispiel 1 beschrieben wurden. Er ist ein Derivat von E.
coli W3110 und wird als 60C1 bezeichnet. Der vollständige Genotyp
des Stamms 60C1 ist W3110 ΔfhuA Δ(argF-lac)169
ptr3 degP41 Kans ΔompT ilvG2096(Valr) Δ(nmpc-fepE) ΔssrA. Ähnlich zu
dem Stamm 45F8 trägt
er dreifache Proteasemarker ohne prc.
-
Die
Stämme
43H1, 59A7 und 33B6 sind alle in Beispiel 1 beschrieben.
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C. Kulturverfahren
-
Die
Kultivierung in Schüttelflaschen
wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt. Das Wachstum der Schüttelflaschenkulturen,
die das xTF-Fab'2-LZ-6xHis-Molekül exprimierten,
wurde bis 42 Stunden bei 30 °C
fortgesetzt, und zwei Sätze
von Proben wurden an verschiedenen Stadien des Wachstums für Vergleichszwecke
entnommen. Bei dem Vergleich der xVEGF-Fab-Expression wurden doppelte
Kulturen wachsen gelassen und es wurden nur die 24-Stunden-Zeitpunkte
entnommen.
-
D. Proteinidentifizierung
-
Die
2-D-Gelelektrophorese wurde, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
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Ergebnisse
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Die
Daten über
die Schüttelflaschenkulturen
sind in der Tabelle 6 unten gezeigt. Es ist in Beispiel 1 im Hinblick
auf die rhuFab'2LZ-(xCD18)-Produktion
klar, dass die Prc–-Stämme
43H1 und 59A7 den Prc+-Stämmen 60C1
und 33B6 hinsichtlich der Mengen der gebildeten Produkte (anti-VEGF-Fab' und anti-Prothrombinase("tissue factor")-Fab'2-LZ-6xHis) überlegen
waren.
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Die 12 ist
ein 2-D-Gel, das zeigt, dass die prc-Deletion (Stamm 59A7, der prc-negative Stamm), die
anti-VEGF-Fab (pY0317tet20) produziert, das gesamte abgebaute anti-VEGF-LC
und zwei abgebaute xVEGF-HC-Fragmente (die in dem prc-plus-Stamm gefunden werden)
beseitigt, auch wenn zwei getrennte HC-Abschnitte in 59A7 entdeckt
wurden, die entweder OmpT- oder Ptr3-gespaltene Produkte sind. Die 13 ist
ein 2-D-Gel, das zeigt, dass der Stamm 60C1 (prc-plus-Stamm), der
das anti-VEGF-Fab
(pY0317tet20) als ein heterologes Polypeptid exprimiert, mehrere
abgebaute anti-VEGF-LC- und zwei abgebaute HC-Fragmente enthielt.
-
Tabelle
6: Schüttelflaschen-Daten
zum Vergleich der Expression von xVEGF-Fab in einem prc
+/–-Wirt
und der Expression von xTF-Fab'2-LZ-6xHis
in einem prc
+/–-Wirt
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