CN108587992B - 一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效分泌表达抗VEGF‑Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法，其保藏编号为CCTCC M2017823，本发明通过RED重组无痕敲除的方法，删减了E.coliDH1基因组中11个非必需区，最终删减了总基因组的10.59%，确定了最优的Fab表达载体组合为pelB+HC+pelB+LC，通过无痕敲除方法在DH11基础上同时敲除prc和degp蛋白酶基因，与原始宿主DH11相比，有更高的分泌Fab的能力，最终提供了高产菌株DH11‑prc‑degp。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法。
背景技术
抗VEGF-Fab抗体片段是一种重组人源化单克隆抗体，目前，抗体Fab片段在癌症，病毒感染和炎症等疾病的诊断治疗中越发重要，占抗体市场份额逐渐上升。但是在降低表达成本，提高表达产量上一直存在着较大的困难。我们以E.coli作为表达菌株进行Fab的表达有明显的优势，不仅周期短成本低，可以高效地进行基因重组，引入突变，通过各种优化方法，能在短时间内提高Fab的表达量，溶解度和稳定性，而且与相应的scFv相比具有更高的抗体亲和力和稳定性。但是，Fab在E.coli中表达低是制约其大规模生产和应用的主要因素。目前，40％的E.coli基因组功能还未确定，只含有必要基因的最小基因组菌株有望成为代谢工程和计算机模拟的理想平台；而从另一方面，Fab抗体片段由于其结构的完整性以及功能多样性，是抗体成员中的一个研究重点，由于缺少Fc段，因此能够在E.coli中表达，但分泌始终是难点。Fab在E.coli中的分泌表达通常是分泌到周质腔中，进一步分泌到培养基中。在此过程中，Fab的表达序列以及宿主都会对其表达量产生很大的影响。
相较于无痕敲除来说，有痕敲除方法虽然相对比较简单，但通常会在基因组上留下抗性筛选标记，此标记会在基因组上永久存在。而菌株能够使用的抗性筛选标记是有限的，因此在同一个菌株中进行多次删除就受到了限制，且抗性标记整合到基因组上还会产生极性效应，影响上下游基因的表达，因此实现对E.coli的无痕删除就显得尤为重要了。
核酸归巢内切酶I-SceI被用作染色体双链断裂的诱导剂，对E.coli DH11的基因组分析发现，其中不含有I-SceI识别位点，避免了基因组被I-SceI酶切成碎片的风险，也为实现在同一菌株中进行连续敲除奠定基础。因此，I-SceI可以用来删除在基因组特定位点上的筛选标记。应用特异性的引物通过PCR的方法，就可以将删除了抗性基因的克隆挑选出来，从而获得菌株的无痕删除突变株。
我们基于基因删减的E.coli，从蛋白酶、基因组删减以及表达载体的角度对Fab的表达进行了优化。以此基因组功能更为确定的E.coli作为工程菌，优化表达抗VEGF抗体Fab片段。本发明通过建立E.coli DH11的无痕突变菌株，多次传代后，验证该DH11突变株的稳定性，最终成功获得了高产的无痕突变株。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株及其构建方法，通过无痕敲除技术，删减了E.coli DH1基因组中11个非必需区，最终删减了总基因组的10.59％。该删减菌我们命名为DH11；将DH11基因组上的蛋白酶基因prc和degp删除，最终总Fab分泌量由最初的17.1mg/L提高到46.6mg/L，成功构建了高产菌株DH11-prc-degp。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株，命名为DH11-prc-degp，已于2017年12月21日保藏于中国典型微生物保藏中心(武汉大学保藏中心)，其保藏编号为CCTCC M2017823。
本发明高产菌株的构建方法具体包括如下步骤：
(1)通过RED重组无痕敲除的方法，删减E.coli DH1基因组中非必需区，构建删减菌DH11；
(2)构建重链、轻链、信号肽不同排列组合的表达载体，将构建的表达载体到删减菌DH11中，诱导表达，筛选确定表达载体组合；
具体构建了四种不同排列组合顺序的表达载体，分别为pET3b-ompA-LC-pelB-HC，pET3b-ompA-HC-pelB-LC，pET3b-pelB-HC-pelB-LC，pET3b-pelB-LC-pelB-HC，以下简称oLpH，oHpL，pHpL，pLpH，将上述构建的四种表达载体与分子伴侣p15cfd共同转化到DH11中，诱导表达24h，比较不同表达载体产生Fab片段的产量，最终获得了最优的Fab表达载体组合为pelB+HC+pelB+LC，简称pHpL。
(3)通过无痕敲除将E.coli DH11蛋白酶基因trmc,ptr,prc,degp敲除，构建DH11-trmc,DH11-ptr,DH11-prc,DH11-degp,DH11-ptr-degp,DH11-ptr-trmc,DH11-pr c-degp，DH11-ptr-trmc-degp几种不同菌株，之后将表达质粒pHpL及分子伴侣p15cfd转化至上述单一以及多蛋白酶缺陷菌株中，30℃培养24h，诱导表达，筛选得到高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株。
其中，所述删减菌的构建方法如下：
(1)供体质粒p15AD2IC-XLR-SacB的构建(X代表敲除基因名称)
PCR分别扩增左右同源臂XL，XR以及抗性筛选标记片段IS-Cm(带有I-SceI酶切位点)，在XL的3'端引入50bp的右同源臂的5'端同源序列的反向互补序列用于同源重组自连。基础载体为带有SacB致死基因的p15AD2IK-SacB载体，为Kan抗性。连接酶切后的XL，XR，IS-Cm以及p15AD2IK-SacB，形成供体质粒p15AD2IC-XLR-SacB。
利用Cm抗性标记和SacB蔗糖致死基因负筛选双重筛选，不含供体质粒的菌株在Cm抗性板上无法生长，而含有供体质粒却未进行重组的菌株含有SacB基因，在蔗糖平板上无法生长。选用在Cm抗性的蔗糖板上生长的单克隆用于无痕敲除第一步的重组鉴定。
(2)Cm基因替换目标删除区域
将辅助质粒PAAICDGBE、供体质粒p15AD2IC-XLR-SacB共转入DH11感受态细胞中，涂布于Amp/Cm双抗LB固体平板上，辅助质粒PAAICDGBE为温敏型质粒，平板于30℃恒温培养箱中过夜培养；之后进行诱导重组，挑取A/C平板上的单克隆于1ml A/C液体培养基中，30℃，220rpm摇床震荡培养过夜；次日按1％接种量转接至5ml Amp液体LB中，30℃，220rpm培养至菌液OD值为0.2-0.3时，加入终浓度为0.2％的L-Ara，培养4h，菌液涂布Cm抗性板，37℃恒温培养过夜。诱导表达I-CreI内切酶和Red同源重组酶，最终用Cm基因替换目标删除区域。PCR鉴定阳性克隆，阳性菌株转接后37℃过夜培养，保存，命名为DH11-X。
所述辅助质粒PAAICDGBE可表达I-CreI内切酶，作用于IC酶切位点，释放打靶片段，同时又能表达Red同源重组酶，是在L-阿拉伯糖的诱导下进行诱导表达的，为Amp抗性。
(3)去除基因组上Cm基因
将温敏质粒SN3K转化至DH11-X，涂布Kan/Cm双抗板，30℃过夜培养；挑单菌落于1ml Kan/Cm液体LB中，30℃，220rpm过夜；次日转接至5ml Kan液体LB中，摇至OD值为0.2-0.3，此时加入终浓度为0.2％的L-Ara诱导，涂板培养；最后PCR鉴定阳性重组克隆，验证Cm基因是否删除，最终获得基因删减菌株。
所述温敏质粒SN3K在Ara诱导下表达I-SceI内切酶和Red重组酶。
本发明有益效果如下：
本通过无痕敲除技术，删减了E.coli DH1基因组中11个非必需区，最终删减了总基因组的10.59％。该删减菌我们命名为DH11；将DH11基因组上的蛋白酶基因prc和degp删除，最终总Fab分泌量由最初的17.1mg/L提高到46.6mg/L，成功构建了高产菌株DH11-prc-degp，此外，本发明提供了只将Fab分泌至E.coli周质腔中的宿主菌株DH11-prc；另外本发明对蛋白酶敲除的进行研究，表明缺失的蛋白酶的确能够在不同程度上抑制目的蛋白Fab片段的降解，提供了改造菌株DH11-prc，即缺失蛋白酶基因prc时，Fab抗体片段只表达聚集在周质腔中，无法进一步分泌到培养基中，而在敲除prc的基础上进一步敲除degp基因则会大幅度地提高培养基中分泌表达量，周质加培养基总分泌目的蛋白浓度能够达到46.6mg/L。
附图说明
图1实施例2表达载体pHpL在不同表达宿主中Fab的表达情况；
图2实施例2所述不同表达载体表达产生Fab片段的产量；
图3实施例3Fab抗体片段在不同蛋白酶基因敲除菌中的分泌表达。
具体实施方式
实施例1Fab表达载体的构建
我们研究了载体质粒构建以及基因表达序列的改变对表达同一重组Fab片段的影响。表达载体骨架是传统的表达质粒pET3b，设计构建了五种不同排列组合顺序的表达载体，构建oLoH、oLpH、oHpL、pHpL、pLpH。以pET3b-ompA-LC-pelB-HC为例，对构建步骤进行详细说明：
1)以已有表达质粒pET3b-pelB-HC-ompA-LC为模板，LucL51，LucL31为引物，进行ompA-LC片段PCR扩增，以LucH31，LucH52为引物，进行ompA-HC片段PCR扩增，PCR结束后立即进行跑胶、回收处理。
2)用Nde I和BamH I限制性内切酶酶切pET3b载体和ompA-LC片段，并进行跑胶、回收。
3)用T4连接酶将酶切过的载体片段和LC片段，16℃连接2h，转化涂布Amp抗性的平板，37℃培养过夜，次日进行菌液PCR鉴定，以pET载体通用引物T7/T7t为鉴定引物，菌液为模板，阳性条带为800bp左右条带。
4)挑取阳性菌落过夜培养，提取质粒，用Xho I和BamH I限制性内切酶酶切单链载体质粒和ompA-HC片段，并进行跑胶、回收。
5)用T4连接酶将酶切过的载体片段和HC片段，16℃连接2h，转化涂布Amp抗性的平板，37℃培养过夜，次日进行菌液PCR鉴定，同样以T7/T7t为鉴定引物，菌液为模板，阳性条带为1500bp左右条带。
6)有阳性条带的菌落送测序，验证序列的正确性。
其他不同序列的表达载体构建流程与pET3b-ompA-LC-pelB-HC的过程一致。
实施例2表达宿主的选择
为了进一步验证删减菌DH11与野生菌DH1的蛋白表达差异，选择以上其中一个表达载体pHpL与辅助质粒p15cfd共转到DH11和DH1宿主菌感受态细胞中，并对菌株生长状况和蛋白表达情况进行分析。菌株在150ml锥形瓶中进行Fab抗体片段的表达，并在不同培养时间点收集样品。
收集的样品处理后置于-20℃，以备后续Elisa实验验证。当菌体在30℃，200rpm摇床培养24h左右，目的蛋白Fab片段的分泌表达量最高。
实施例3不同表达载体在DH11菌株中的Fab抗体片段的表达差异
将构建的四种不同表达载体与辅助质粒p15cfd共同转化至DH11表达宿主感受态细胞中，菌体最终在30℃，200rpm摇床培养24h。提取菌液进行处理，Fab抗体蛋白最终用Elisa分析表达量。最终发现最优的Fab表达载体组合为pelB+HC+pelB+LC，即pHpL。
实施例4抗体Fab片段在不同蛋白酶敲除菌中的表达。
我们以DH11为出发菌株，在此基础上敲除蛋白酶基因trmc，ptr，degp，prc，获得单一以及多蛋白酶缺陷菌株DH11-trmc，DH11-ptr，DH11-degp，DH11-prc，DH11-ptr-degp，DH11-ptr-trmc，DH11-prc-degp，DH11-ptr-trmc-degp。把表达质粒pHpL以及分子伴侣p15cfd共转至单一以及多蛋白酶缺陷菌株中。蛋白表达诱导阶段条件依旧是30℃，200rpm培养24h。
Claims (1)
1.一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株，其特征在于，所述高产菌株为DH11-prc-degp，其保藏编号为CCTCC M2017823；
所述的一种高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株的构建方法，具体步骤如下：
（1）通过RED重组无痕敲除的方法，删减E.coli DH1基因组中非必需区，构建删减菌DH11；
（2）构建重链、轻链、信号肽不同排列组合的表达载体，将构建的表达载体转入到删减菌中，诱导表达，筛选确定表达载体组合；
（3）通过无痕敲除方法将E.coli DH11蛋白酶基因trmc,ptr,prc,degp敲除，构建不同菌株，之后将上述表达载体质粒转化到构建菌株中，诱导表达，筛选得到高效分泌表达抗VEGF-Fab抗体片段的高产菌株；
所述删减菌的构建方法如下：
（1）供体质粒p15AD2IC-XLR-SacB的构建，X代表敲除基因名称
PCR分别扩增左右同源臂XL，XR以及抗性筛选标记片段IS-Cm，在XL的3'端引入50bp的右同源臂的5'端同源序列的反向互补序列用于同源重组自连；基础载体为带有SacB致死基因的p15AD2IK-SacB载体，为Kan抗性；连接酶切后的XL，XR，IS-Cm以及p15AD2IK-SacB，形成供体质粒p15AD2IC-XLR-SacB；
（2）Cm基因替换目标删除区域
将辅助质粒PAAICDGBE、供体质粒p15AD2IC-XLR-SacB共转入DH11感受态细胞中，涂布于Amp/Cm双抗LB固体平板上，于30℃恒温培养箱中过夜培养；之后进行诱导重组，挑取Amp/Cm平板上的单克隆于1ml Amp/Cm液体培养基中，30℃，220rpm摇床震荡培养过夜；次日按1%接种量转接至5ml Amp液体LB中，30℃，220rpm培养至菌液OD值为0.2-0.3时，加入终浓度为0.2%的L-Ara，培养4h，菌液涂布Cm抗性板，37℃恒温培养过夜，诱导表达I-CreI内切酶和Red同源重组酶；PCR鉴定阳性克隆，阳性菌株转接后37℃过夜培养，保存，为DH11-X；
（3）去除基因组上Cm基因
将温敏质粒SN3K转化至DH11-X，涂布Kan/Cm双抗板，30℃过夜培养；挑单菌落于1mlKan/Cm液体LB中，30℃，220rpm过夜；次日转接至5ml Kan液体LB中，摇至OD值为0.2-0.3，此时加入终浓度为0.2%的L-Ara诱导，涂板培养；最后PCR鉴定阳性重组克隆，验证Cm基因是否删除，最终获得基因删减菌株；
所述温敏质粒SN3K在Ara诱导下表达I-SceI内切酶和Red重组酶；
所述步骤（2）中辅助质粒PAAICDGBE可表达I-CreI内切酶，作用于IC酶切位点，释放打靶片段，同时又能表达Red同源重组酶，是在L-阿拉伯糖的诱导下进行诱导表达的，为Amp抗性。
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| High-Level Accumulation of a Recombinant Antibody Fragment in the Periplasm of Escherichia coli Requires a Triple-Mutant (degP prc spr) Host Strain;Christina Chen,et al.;《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》;20040305;第85卷(第5期);摘要，第464页全部，第465页表1，第469-473页全部 * |
| 一种新的基于Red重组及I-Sec I体内切割的大肠杆菌基因组无痕删减方法;朱美勤等;《生物工程学报》;20160125;第32卷(第1期);摘要，第116页右栏第1段以及表1，第116-121页全部，第124页右栏倒数第2段 * |
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