CN117925423A - 具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株，属于微生物基因工程技术领域，所述基因工程菌株以少孢节丛孢为出发菌株，所述基因工程菌株为将少孢节丛孢基因组中的AoSkn7基因进行敲除而获得的菌株。所述少孢节丛孢基因工程菌株具有抑菌活性，可用于解除土壤中解淀粉芽孢杆菌对少孢节丛孢的抑制。本发明还提供了具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法和应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程技术领域，特别涉及具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株及其构建方法和应用。
背景技术
线虫，特别是植物寄生性线虫，作为植物重要的病原物，是引起全球范围内植物病害的主要原因。植物病原线虫多达数百种，数量巨大，对全世界的经济造成严重的损失，每年导致的全球作物经济损失高达数百亿元美元。在过去的几十年，防治植物病原线虫主要是以化学方法为主，化学制剂农药占市场上所有商业杀虫剂的90％以上，由于化学杀虫剂对环境和包括线虫在内的很多生物造成的伤害都是不可逆的，因此，研究开发生物杀线虫剂已经成为现代农业可持续发展中必须解决的关键问题。
少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)是研究捕食线虫真菌与线虫互作的模式菌株，在线虫以及其他诱导因子存在条件下，少孢节丛孢的营养菌丝会生成特异化的捕食器官，即三维粘性菌网，进而捕杀线虫，其是防治线虫病害的重要节点。然而少孢节丛孢在土壤中的生长会受到一些土壤细菌如解淀粉芽孢杆菌的抑制，因此解除这种物种之间的抑制对于线虫病害的防治至关重要。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株，通过基因工程技术敲除少孢节丛孢AoSkn7(AOL_s00097g218)基因，获得的少孢节丛孢基因工程菌株具有抑菌活性，可用于解除土壤中解淀粉芽孢杆菌对少孢节丛孢的抑制，为线虫的生物防治提供依据。
本发明还提供了具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法和应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株，所述基因工程菌株以少孢节丛孢为出发菌株，所述基因工程菌株为将少孢节丛孢基因组中的AoSkn7(即AOL_s00097g218)基因进行敲除而获得的菌株。
进一步的，所述出发菌株来自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，菌株号：ATCC24927。
基于同一发明构思，本发明提供具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法，所述构建方法包括：
以少孢节丛孢基因组为模板，AoSkn7-5f/AoSkn7-5r为引物PCR扩增AoSkn7基因的5’端同源臂，AoSkn7-3f/AoSkn7-3r为引物PCR扩增AoSkn7基因的3’端同源臂；
采用DNA连接酶将所述5’端同源臂、潮霉素抗性基因片段和所述3’端同源臂连接到线性载体pCE-zero-2上，获得AoSkn7基因敲除载体；
将所述AoSkn7基因敲除载体转入宿主菌中进行培养，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒，PCR扩增敲除片段验证阳性克隆；
以阳性菌落质粒为模板，以AoSkn7-5f/AoSkn7-3r为引物进行PCR反应，制备敲除片段；
将所述敲除片段转化至少孢节丛孢原生质体，获得少孢节丛孢基因工程菌株。
进一步的，所述AoSkn7-5f的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述AoSkn7-5r的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述AoSkn7-3f的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述AoSkn7-3r的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
进一步的，用于PCR扩增所述潮霉素抗性基因片段的引物包括hphF和hphR，所述hphF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述hphR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步的，所述少孢节丛孢来自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，菌株号：ATCC24927。
进一步的，所述宿主菌包括大肠杆菌DH5α。
基于同一发明构思，本发明还提供具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株在解除土壤中解淀粉芽孢杆菌对少孢节丛孢的抑制的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株，通过基因工程技术敲除少孢节丛孢AoSkn7基因，获得的少孢节丛孢基因工程菌株具有抑菌活性，能够解除土壤中解淀粉芽孢杆菌对少孢节丛孢的抑制，且抑菌活性较强，最大抑菌圈可达到17mm。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为AoSkn7基因的转化子PCR验证图谱。
图2为少孢节丛孢基因工程菌株AoSkn7基因敲除前后的抑菌活性图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
下面将结合实施例及实验数据对本申请具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株及其构建方法和应用进行详细说明。
实施例1
少孢节丛孢基因工程菌株的构建
1.培养基配制及用途
LB固体培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂15g，ddH2O定容至1000mL；
LB液体培养基：NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，ddH2O定容至1000mL；
PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，ddH2O定容至1000mL；
CMY培养基：玉米20g，酵母提取物2g，琼脂15g，ddH2O定容至1000mL；
TG培养基：胰蛋白胨10g，葡萄糖10g，ddH2O定容至1000mL；
ssPDA培养基：蛋白胨0.3g，胰蛋白胨0.3g，酵母提取物0.3g，蔗糖200g，琼脂7.5g，ddH2O定容至1000mL。
LB固体培养基用于解淀粉芽孢杆菌的纯化培养，LB液体培养基用于解淀粉芽孢杆菌的小量发酵，ssPDA培养基用于原生质体的再生，TG培养基用于真菌的液体培养，CMY培养基用于真菌的固体培养，PDA培养基用于判定真菌对细菌的抑制作用以及基因工程菌株AoSkn7敲除株的筛选。
2.试验真菌
本实施例以少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)野生型(购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，菌株号：ATCC24927)为出发菌株。
3.基因工程菌株的构建
本实施例采用同源重组法敲除AoSkn7基因，具体步骤如下：
(1)材料准备：少孢节丛孢基因组DNA,用于获取目的基因及上下游片段；pCSN44质粒用于扩增潮霉素抗性基因；ECORⅤ酶切的pCE-zero-2质粒，用于连接敲除载体片段及构建敲除载体；大肠杆菌DH5α，用于转化。
(2)引物设计：从NCBI数据库中获得AoSkn7基因序列，在该基因的上游选取接近2kb的侧翼序列(即5’端同源臂)和下游选取接近2kb的侧翼序列(即3’端同源臂)进行引物设计，同时对筛选标记潮霉素抗性基因进行引物设计，以上引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成获得。具体引物序列如下：
用于扩增AoSkn7基因5’端2020bp片段的引物
AoSkn7-5f:5’-aattcggatcttccagagatatcTGTCTGTGAGGGTGTGTG-3’
AoSkn7-5r:5’-atccttctttGCTAGGGTGGAATTCCCAC-3’
用于扩增AoSkn7基因3’端2238bp片段的引物
AoSkn7-3f:5’-tcatcttctgGCTGGTGGAGGATGATCC-3’
AoSkn7-3r:5’-ttcaactgccgttcgacgatatcGAAGAAGACGACGAAGGC-3’
用于扩增潮霉素抗性基因片段的引物
hphF:5’-ccaccctagcAAAGAAGGATTACCTCTAAAC-3’
hphR:5’-ctccaccagcCAGAAGATGATATTGAAGGAG-3’
用于PCR验证基因敲除的引物
AoSkn7-F:CGAAGCCGCTTAGTACGAC
AoSkn7-R:CGATGTCATGGCGATAACAGGAGG
(3)体外扩增片段：以少孢节丛孢ATCC24927的基因组为模板，用PCR高保真酶进行侧翼序列的扩增，反应体系25μL，基因组20-100ng，引物AoSkn7-5f/AoSkn7-5r扩增基因上游序列，引物AoSkn7-3f/AoSkn7-3r扩增基因下游序列。以PCSN44质粒DNA为模板，用PCR高保真酶扩增hph片段，反应体系25μL，质粒12ng-40ng，引物hphF/hphR扩增hph片段。PCR程序如下：
预变性95℃for 3min；变性95℃for 15s，56-68℃for 15s，72℃for 30s-60s/kb，30-35cycles；72℃for 5-10min；12℃for 10min。各取2μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，剩余产物-20℃保存。
(4)扩增片段的连接：采用C115连接酶2xclon ExPress mix将5’端同源臂，潮霉素抗性基因片段，3’端同源臂连接到已经被ECORV限制性内切酶酶切过的线性载体pCE-zero-2上。反应体系10uL，2×clon ExPress mix 5uL，载体使用量＝【0.02×其碱基对数】ng，各片段使用量＝【0.02×各片段的碱基对数】ng，注各组分的加样量≥1uL。PCR程序：50℃，15min。
(5)热激法转化大肠杆菌：从-80℃冰箱取出感受态细胞(大肠杆菌DH5α)，置于冰上慢慢溶解；吸取5uL连接好的质粒重组产物，涡旋打入50uL的感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激75-90s；立即放于冰上2-3min；在超净工作台内进行操作，加入500ul LB培养液；放于37℃，200rpm摇床培养1-2h,复苏；复苏结束后，5000rpm离心5min；去除部分上清，剩余沉淀轻轻悬起，涂布于含有抗生素的LB平板上；37℃培养12-16h；之后挑取单菌落培养并提取质粒。
(6)重组产物的验证：利用引物AoSkn7-5F/AoSkn7-3R进行PCR验证，同时采用酶切法验证质粒，若条带大小正确，则置于-20℃存储。
(7)敲除载体全长片段回收：用引物AoSkn7-5F/AoSkn7-3R扩增全长，按照胶回收试剂盒回收DNA片段。
(8)少孢节丛孢原生质体制备：CMY培养基上同步化培养5d的少孢节丛孢ATCC24927平板，接种至200ml的TG培养基中，28℃，180rpm过夜培养；用6层擦镜纸过滤收集菌丝，并用MN Buffer冲洗菌丝。将菌丝挑到酶液中，28℃110rpm酶解4h，显微镜观察透明球状的原生质体；6层擦镜纸过滤，收集原生质体，将过滤后的原生质体装入1.5ml无菌EP管中，5000rpm离心5min，弃上清，加入1mL STC Buffer清洗原生质体，5000rpm离心5min，弃上清。用100μL STC Buffer悬浮原生质体，镜检其浓度。
(9)转化少孢节丛孢原生质体：100μL原生质体中加入步骤(7)纯化回收的敲除片段10μL，冰浴30min。加入1mL PTC buffer，28℃培养1-2h。将上述混合物点在空白板上后，将温度适中的ssPDA+Amp+Kana培养基倒入封板，28℃培养3d；3d后再倒第二层加了1/1000潮霉素浓度的PDA培养基，28℃培养6-7天。
(10)敲除转化子验证：挑取转化子在加有潮霉素的PDA板上传代培养，后接到PDA培养基上，刮取菌丝提取基因组，以此为模板，以AoSkn7-F/AoSkn7-R为引物，PCR扩增目的基因全长片段与敲除片段，结果如图1所示，经电泳比对，片段大小与预测一致，即确定敲除成功。
目的基因AoSkn7的全长为1772bp，敲除片段全长2631bp，图1中，“+”代表阳性对照，“-”代表阴性对照，S55，S56,S61,S64,S65代表AoSkn7敲除株。
实施例2
少孢节丛孢基因工程菌株抑菌活性测定
1.试验细菌
本实施例试验细菌为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保存于云南大学云南生物资源保护与利用国家重点实验室菌种库。
2.解淀粉芽孢杆菌的活化及小量发酵
倒LB固体培养基于直径90mm培养皿中，从-80℃冰箱取出冻存的解淀粉芽孢杆菌，解冻后吸取100μL菌液加到LB板上，37℃过夜培养，将长好的菌苔用接种环划单菌落后继续于37℃过夜培养。待长出单菌落后，用灭菌枪头挑取单菌落接种于LB液体培养基中，于37℃，180rpm过夜培养备用。
3.基因工程菌株抑菌活性测定
在超净台内各取100ul培养好的细菌(解淀粉芽孢杆菌)菌液于PDA培养基，涂布均匀后，用约7mm打孔器从CMY培养基中获取少孢节丛孢野生型以及少孢节丛孢基因工程菌株的菌块，接种于涂布细菌的PDA培养基，培养2-3d，观察是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈大小，实验重复3次。结果如图2所示，图2中Ⅰ代表少孢节丛孢野生型菌株，Ⅱ代表少孢节丛孢基因工程菌株。
本实施例以解淀粉芽孢杆菌为受试菌进行抑菌活性测定，由图2可知，少孢节丛孢AoSkn7敲除株对解淀粉芽孢杆菌有显著的抑菌作用，抑菌圈可达1.7cm，而少孢节丛孢野生型菌株对解淀粉芽孢杆菌无明显的抑菌效果。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株，所述基因工程菌株以少孢节丛孢为出发菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为将少孢节丛孢基因组中的AoSkn7基因进行敲除而获得的菌株。
2.根据权利要求1所述的具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株，其特征在于，所述出发菌株来自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，菌株号：ATCC24927。
3.如权利要求1或2所述的具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
以少孢节丛孢基因组为模板，AoSkn7-5f/AoSkn7-5r为引物PCR扩增AoSkn7基因的5’端同源臂，AoSkn7-3f/AoSkn7-3r为引物PCR扩增AoSkn7基因的3’端同源臂；
采用DNA连接酶将所述5’端同源臂、潮霉素抗性基因片段和所述3’端同源臂连接到线性载体pCE-zero-2上，获得AoSkn7基因敲除载体；
将所述AoSkn7基因敲除载体转入宿主菌中进行培养，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒，PCR扩增敲除片段验证阳性克隆；
以阳性菌落质粒为模板，以AoSkn7-5f/AoSkn7-3r为引物进行PCR反应，制备敲除片段；
将所述敲除片段转化至少孢节丛孢原生质体，获得少孢节丛孢基因工程菌株。
4.根据权利要求3所述的具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述AoSkn7-5f的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述AoSkn7-5r的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述AoSkn7-3f的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。所述AoSkn7-3r的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求3所述的具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法，其特征在于，用于PCR扩增所述潮霉素抗性基因片段的引物包括hphF和hphR，所述hphF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述hphR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
6.根据权利要求3所述的具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述少孢节丛孢来自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，菌株号：ATCC24927。
7.根据权利要求3所述的具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株的构建方法，其特征在于，所述宿主菌包括大肠杆菌DH5α。
8.如权利要求1或2所述的具有抑菌活性的少孢节丛孢基因工程菌株在解除土壤中解淀粉芽孢杆菌对少孢节丛孢的抑制的应用。
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