CN110982715B - 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用 - Google Patents

高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用，属生物农药技术领域。本发明基因工程菌ΔPlflbD为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因；基因工程菌的保藏编号为CCTCC M 2019347，PlflbD基因的序列如SEQ ID NO.1所示，PlflbD氨基酸的序列如SEQ ID NO.2所示。本发明构建PlflbD基因敲除载体；将供体质粒、受体、PflbD基因5’端同源重组片段和3’端同源重组片段进行Gateway BP反应得到PlflbD基因敲除载体；将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中；再将农杆菌转化紫色紫孢菌；筛选flbD转化子，并依次采用验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3和随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3进行验证，即得高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD。

Description

高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与 应用
技术领域
本发明涉及高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用，属生物农药技术领域。
背景技术
植物寄生线虫已经上升为仅次于真菌病害的第二大农业病害，其中尤以根结线虫和胞囊线虫的危害最为突出。
目前防治植物寄生线虫的方法主要是使用化学农药。但高毒化学农药的滥用往往产生危害人类健康和污染环境等负面效果。因此，早期使用的化学农药，包括克线磷、灭线磷、溴甲烷、涕灭威等几乎全部被禁用，使蔬菜基地根结线虫发生呈上升趋势。因此，研究开发安全和环境友好型杀线虫剂已经成为现代农业可持续发展中必须解决的关键问题。
由于主要化学杀线虫剂被禁用，利用自然界中线虫的天敌微生物进行生物防治成为本领域研究的热点。与传统化学农药相比，微生物菌剂具有安全、无污染、无残留等优点，同时也存在防效不高和不稳定等问题。
淡紫拟青霉是一类重要的食线虫真菌，淡紫拟青霉对多种植物线虫都有防治效能。淡紫拟青霉主要侵染植物寄生线虫的雌虫、胞囊和卵，而这种杀线虫方式往往更有利于控制土壤线虫的数量。紫孢菌属(Purpureocillium)，包含两个物种：淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)(Luangsaard et al.,2011)和紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)(Perdomo et al.,2013)。与淡紫紫孢菌相比，紫色紫孢菌由于不能在35℃以上生长，其人畜安全性更高。
分生孢子是紫色紫孢菌侵染线虫的重要武器。对于食线虫真菌而言，分生孢子在侵染线虫过程中扮演着重要角色。分生孢子随着空气和水等流动媒介扩散传播，接触宿主后粘附于宿主体表或体内，待时机成熟后萌发(Herrera-Estrella et al.,2016)。萌发出的菌丝特化成附着胞等侵染结构并借助分泌的蛋白酶和几丁质酶等体壁降解酶的作用侵入宿主组织，随后杀死和消解宿主。因此大量的分生孢子是提高菌株杀虫效率的关键。分生孢子也是大部分线虫生防菌剂的制剂形式。
现有研究中，flbD基因作为曲霉产孢调控基因，通过敲除曲霉的flbD基因，却使得曲霉产孢量下降，使得产孢基因工程菌的研究停滞不前。
发明内容
为了提高紫色紫孢菌的产孢量，本发明提供高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用，本发明通过对紫色紫孢菌菌株进行基因改造，获得提高产孢数量的基因工程菌株，可用于开发高效生物杀线虫制剂；紫色紫孢菌基因工程菌株(Purpureocillium lavendulumΔPlflbD)与出发菌株相比具有相同的生长速率和形态；在PDA或MM培养基上培养10天后期产孢量比出发菌株分别提高4.6倍和3.3倍。
高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD，所述基因工程菌为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因；该基因工程菌株已于2019年5月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址：武汉大学保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2019347；菌株为紫色紫孢菌基因工程菌株Purpureocillium lavendulumΔPlflbD-1；
所述PlflbD基因的序列如SEQIDNO.1所示，PlflbD氨基酸的序列如SEQIDNO.2所示。
所述高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD的构建方法，具体步骤如下：
(1)利用OSCAR方法构建PlflbD基因敲除载体：以紫色紫孢菌基因DNA为模板，通过引物flbD5F/flbD5R克隆PflbD基因5’端同源重组片段，通过引物flbD3F/flbD3R克隆3’端同源重组片段；
(2)将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段和3’端同源重组片段进行Gateway BP反应得到PlflbD基因敲除载体；
(3)将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中得到含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
(4)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌；
(5)筛选flbD转化子，并依次采用验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3和随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3进行验证，即得高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD。
所述步骤(1)引物flbD5F/flbD5R用于扩增PlflbD基因上游1048bp片段；引物flbD5F的序列为ggggacagctttcttgtacaaagtggaaTCATTGTCATTTGGTGGAGTC；引物flbD5R的序列为ggggactgcttttttgtacaaacttgtATACCATCCGACCGACAGA。
所述步骤(1)引物flbD3F/flbD3R用于扩增PlflbD基因下游1015bp片段；引物flbD3F的序列为ggggacaactttgtatagaaaagttgttTAGGTGACTGGCTGAAGGAG；引物flbD3R的序列为ggggacaactttgtataataaagttgtTCAACACGCACCATTTCC。
所述BP反应体系为
Figure GDA0002344162230000021
质粒浓度为60ng/μl，上下游片段浓度为80～150ng/μl；
BP反应：
将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段、3’端同源重组片段和BP clonase依次加入EP管中，混匀，离心，置于温度为25℃反应16～18h，加入1μl蛋白酶k置于温度为37℃孵育10～15min终止反应；将连接产物转化至DH5α，涂布于含kan+抗性的LB平板上，置于温度为37℃倒置过夜培养；挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，将验证有正确条带的转化子，用含Kan+抗性的LB液体试管过夜摇菌，小提质粒后送测序，通过Seqman软件，将检测的序列与理论序列比较，对测序正确的质粒保菌，用于后续的农杆菌转化；
所述步骤(3)将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中的具体方法为
将农杆菌感受态置于冰上融化，加入PlflbD基因敲除载体并混合均匀，依次进行冰浴处理5min，液氮速冻5min，温度为37℃水浴处理5min，冰浴处理5min，无菌条件下加入700～1000μl无抗生素的LB液体培养基并置于温度为28℃、180rpm振荡培养2～3h，农杆菌体复苏，4500～6000rpm离心1～3min收菌，吹打重悬菌体，将菌液涂布于Kan+的LB平板上并置于温度为28℃培养箱中倒置培养48～72h，挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，即得含PlflbD基因敲除载体的农杆菌。
所述步骤(4)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌的具体方法为
1)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌接种于含Kan+液体LB培养基中，置于温度为28℃，180～220rpm条件下震荡培养至OD600为0.5～0.8，4500～6000rpm离心1～3min收菌，采用液体IM培养基重悬菌体，并稀释为OD600为0.15，置于温度为28℃，200～220rpm条件下避光诱导至OD600为0.45得到诱导菌液；
2)采用液体IM培养基稀释紫色紫孢菌孢子至浓度为105个/mL得到孢子悬浮液；
3)将诱导菌液与孢子悬浮液等体积混合得到混合菌液，将微孔滤膜平铺在固体IM培养基上，将混合菌液均匀涂布于铺有微孔滤膜的固体IM培养基上，倒置于温度为22℃条件下避光诱导48h，将微孔滤膜转移至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的固体M-100培养基上，置于温度为28℃避光培养至长出单菌落，无菌条件下挑取菌体至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的M-100斜面上，置于温度为28℃下培养8～15，再置于液体MM培养基中，温度为28℃、140～180rpm下震荡培养3～4d，采用CTAB法提取基因组验证。
所述步骤(5)验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3中，引物flbD验证5的序列为GCCAGCCAGACTACAACAAA，引物flbD验证3的序列为GCACATACGCATACACTACCG；随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3中，引物随机插入验证5的序列为CACCTTGATGCCGTTCTT，引物随机插入验证3的序列为ACCCTTTGGCTCGCTTA。
转化子验证原理：在flbD上游同源臂和下游同源臂区域内设计一对引物flbD验证5和flbD验证3在转化子基因组中扩增，由于筛选标记sur(氯密磺隆抗性基因)和目的基因flbD的大小不同，扩增出来的片段大小会不一致，琼脂糖凝胶检测即可验证真假；在农杆菌介导的遗传转化过程中，会存在异常重组，即随机的整合到宿主基因组的任意位置，本发明中称为随机插入，随机插入可能会破坏其他基因的完整性；在验证同源重组之后还需要验证是否有随机插入，判断是否有随机插入的方法是看T-DNA内同源臂外的序列是否整合到基因组中，所以在LB位点和上游同源臂之间设计一对引物(随机插入验证5/随机插入验证3)作为随机插入的验证。
转化子验证方法：用验证引物flbD验证5/flbD验证3扩增，阳性对照大小为3525bp，阴性对照的大小为1928bp；如果扩增条带只有一条，且大小为3525bp，说明发生同源重组，即fibC基因已被氯嘧磺隆替代；然后进一步验证是否发生随机插入，该验证用随机插入验证5/随机插入验证3扩增，如果没有条带出现，则说明未发生随机插入，反则说明发生了随机插入。
所述高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD在制备分线虫生防菌剂中的应用。
进一步地，紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD所产孢子在制备分线虫生防菌剂中的应用。
本发明的紫色紫孢菌的筛选参照文献“An efficient gene disruption systemfor the nematophagous fungus Purpureocillium lavendulum”进行；
本发明紫色紫孢菌的抗性筛选为氯密磺隆抗性筛选法，其具体步骤：把固体IM培养基上的滤膜转移到含有10μg/ml sur(氯密磺隆抗性基因)与500μg/ml头孢霉素的固体M-100培养基上，此时，如果氯密磺隆抗性基因sur没有通过同源重组整合到紫色紫孢菌基因组中，则菌株将不含有氯密磺隆抗性基因sur，因此就没有氯密磺隆抗性，菌株不能该培养基上存活；如果氯密磺隆抗性基因sur通过同源重组整合到紫色紫孢菌基因组中，则菌株将含有氯密磺隆抗性基因sur，因此就有氯密磺隆抗性，菌株可以在该培养基上存活。最后，待存活菌株长成单菌落会，在无菌条件下将单菌落用已灭菌竹签挑至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的M-100斜面上培养8～15d，备用。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过对紫色紫孢菌菌株进行基因改造，获得提高产孢数量的基因工程菌株，可用于开发高效生物杀线虫制剂；
(2)本发明紫色紫孢菌基因工程菌株(Purpureocillium lavendulumΔPlflbD)与出发菌株相比具有相同的生长速率和形态；在PDA或MM培养基上培养10天后期产孢量比出发菌株分别提高4倍和2.5倍；
(3)本发明紫色紫孢菌基因工程菌株(Purpureocillium lavendulumΔPlflbD)由于可提高产孢数量，在用作生物杀线虫制剂时可极大降低使用成本。
附图说明
图1为紫色紫孢菌Δku80和紫色紫孢基因工程菌ΔPlflbD在MM培养基上的菌落状态；图a为紫色紫孢菌Δku80的菌落状态；图b为紫色紫孢基因工程菌ΔPlflbD的菌落状态；
图2为紫色紫孢菌Δku80和紫色紫孢基因工程菌ΔPlflbD在MM培养基上的产孢量对比图；
图3为紫色紫孢菌Δku80和紫色紫孢基因工程菌ΔPlflbD在PDA培养基上的菌落状态；图a为紫色紫孢菌Δku80的菌落状态；图b为紫色紫孢基因工程菌ΔPlflbD的菌落状态；
图4为紫色紫孢菌Δku80和紫色紫孢基因工程菌ΔPlflbD在PDA培养基上的产孢量对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1：高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD的构建方法，具体步骤如下：
(1)利用OSCAR方法构建PlflbD基因敲除载体：以紫色紫孢菌基因DNA为模板，通过引物flbD5F/flbD5R克隆PflbD基因5’端同源重组片段，通过引物flbD3F/flbD3R克隆3’端同源重组片段；其中引物flbD5F/flbD5R用于扩增PlflbD基因上游1048bp片段；引物flbD5F的序列为ggggacagctttcttgtacaaagtggaaTCATTGTCATTTGGTGGAGTC，flbD基因上游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD5R的序列为ggggactgcttttttgtacaaacttgtATACCATCCGACCGACAGA，flbD基因上游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD3F/flbD3R用于扩增flbD基因下游982bp片段；引物flbD3F的序列为ggggacaactttgtatagaaaagttgttTAGGTGACTGGCTGAAGGAG，flbD基因下游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD3R的序列为ggggacaactttgtataataaagttgtTCAACACGCACCATTTCC，flbD基因下游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；其原理为含有同源臂的上下游片段，供体质粒，受体质粒在Bp Clonase的催化作用下发生重组反应；
(2)将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段和3’端同源重组片段进行Gateway BP反应得到PlflbD基因敲除载体；
BP反应体系为
Figure GDA0002344162230000061
质粒浓度为60ng/μl，上下游片段浓度为100ng/μl；
BP反应：
将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段、3’端同源重组片段和BP clonase依次加入EP管中，混匀，离心，置于温度为25℃反应16h，加入1μl蛋白酶k置于温度为37℃孵育10min终止反应；将连接产物转化至DH5α，涂布于含kan+抗性的LB平板上，置于温度为37℃倒置过夜培养；挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，将获取的带有正确条带的菌落进行小提质粒或甘油保存备用；
(3)将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中得到含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
将100μl农杆菌感受态置于冰上融化，加入100ng的PlflbD基因敲除载体并混合均匀，依次进行冰浴处理5min，液氮速冻5min，温度为37℃水浴处理5min，冰浴处理5min，无菌条件下加入700μl无抗生素的LB液体培养基并置于温度为28℃、180rpm振荡培养2h，农杆菌体复苏，5000rpm离心1min收菌，留100μl上清液，吹打重悬菌体，将菌液涂布于Kan+的LB平板上并置于温度为28℃培养箱中倒置培养50h，挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，即得含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
(4)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌；
1)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌接种于含Kan+液体LB培养基中，其中Kan+的浓度为100μg/ml，置于温度为28℃，220rpm条件下震荡培养至OD600为0.5，6000rpm离心1min收集菌体，采用液体IM培养基重悬菌体，并稀释为OD600为0.15，置于温度为28℃，220rpm条件下避光诱导至OD600为0.45得到诱导菌液；
2)采用液体IM培养基稀释紫色紫孢菌孢子至浓度为105个/mL得到孢子悬浮液；
3)将诱导菌液与孢子悬浮液等体积混合得到混合菌液，将微孔滤膜平铺在固体IM培养基上，其中微孔滤膜的孔径0.45μm，直径80mm；将混合菌液均匀涂布于铺有微孔滤膜的固体IM培养基上，倒置于温度为22℃条件下避光诱导48h，将微孔滤膜转移至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的固体M-100培养基上，其中固体M-100培养基中sur(氯密磺隆抗性基因)含量为10μg/ml，头孢霉素含量为500μg/ml；置于温度为28℃避光培养4-7天至长出单菌落，无菌条件下挑取菌体至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的M-100斜面上，其中M-100斜面中sur(氯密磺隆抗性基因)含量为10μg/ml，头孢霉素含量为500μg/ml；置于温度为28℃下培养10d,再置于液体MM培养基中，温度为28℃、140rpm下震荡培养3d，采用CTAB法提取基因组验证是否转化成功；
(5)筛选flbD转化子，并依次采用验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3和随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3进行验证，即得高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD；
验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3中，引物flbD验证5的序列为GCCAGCCAGACTACAACAAA，引物flbD验证3的序列为GCACATACGCATACACTACCG；随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3中，引物随机插入验证5的序列为CACCTTGATGCCGTTCTT，引物随机插入验证3的序列为ACCCTTTGGCTCGCTTA；
转化子验证原理：在flbD上游同源臂和下游同源臂区域内设计一对引物flbD验证5和flbD验证3在转化子基因组中扩增，由于筛选标记sur(氯密磺隆抗性基因)和目的基因flbD的大小不同，扩增出来的片段大小会不一致，琼脂糖凝胶检测即可验证真假；在农杆菌介导的遗传转化过程中，会存在异常重组，即随机的整合到宿主基因组的任意位置，本发明中称为随机插入，随机插入可能会破坏其他基因的完整性；在验证同源重组之后还需要验证是否有随机插入，判断是否有随机插入的方法是看T-DNA内同源臂外的序列是否整合到基因组中，所以在LB位点和上游同源臂之间设计一对引物(随机插入验证5/随机插入验证3)作为随机插入的验证；
转化子验证方法：用验证引物flbD验证5/flbD验证3扩增，阳性对照大小为3694bp，阴性对照的大小为2116bp；如果扩增条带只有一条，且大小为3694bp，说明发生同源重组，即fibC基因已被氯嘧磺隆替代；然后进一步验证是否发生随机插入，该验证用随机插入验证5/随机插入验证3扩增，如果没有条带出现，则说明未发生随机插入，反则说明发生了随机插入；
本实施例高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因，PlflbD基因的序列如SEQIDNO.1所示，PlflbD氨基酸的序列如SEQIDNO.2所示。
实施例2：高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD的构建方法，具体步骤如下：
(1)利用OSCAR方法构建PlflbD基因敲除载体：以紫色紫孢菌基因DNA为模板，通过引物flbD5F/flbD5R克隆PflbD基因5’端同源重组片段，通过引物flbD3F/flbD3R克隆3’端同源重组片段；其中引物flbD5F/flbD5R用于扩增PlflbD基因上游1048bp片段；引物flbD5F的序列为ggggacagctttcttgtacaaagtggaaTCATTGTCATTTGGTGGAGTC，flbD基因上游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD5R的序列为ggggactgcttttttgtacaaacttgtATACCATCCGACCGACAGA，flbD基因上游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD3F/flbD3R用于扩增flbD基因下游982bp片段；引物flbD3F的序列为ggggacaactttgtatagaaaagttgttTAGGTGACTGGCTGAAGGAG，flbD基因下游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD3R的序列为ggggacaactttgtataataaagttgtTCAACACGCACCATTTCC，flbD基因下游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；其原理为含有同源臂的上下游片段，供体质粒，受体质粒在Bp Clonase的催化作用下发生重组反应；
(2)将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段和3’端同源重组片段进行Gateway BP反应得到PlflbD基因敲除载体；
BP反应体系为
Figure GDA0002344162230000081
质粒浓度为60ng/μl，上下游片段浓度为150ng/μl；
BP反应：
将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段、3’端同源重组片段和BP clonase依次加入EP管中，混匀，离心，置于温度为25℃反应18h，加入1μl蛋白酶k置于温度为37℃孵育15min终止反应；将连接产物转化至DH5α，涂布于含kan+抗性的LB平板上，置于温度为37℃倒置过夜培养；挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，将获取的带有正确条带的菌落进行小提质粒或甘油保存备用；
(3)将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中得到含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
将100μl农杆菌感受态置于冰上融化，加入100ng的PlflbD基因敲除载体并混合均匀，依次进行冰浴处理5min，液氮速冻5min，温度为5℃水浴处理5min，冰浴处理5min，无菌条件下加入1000μl无抗生素的LB液体培养基并置于温度为28℃、180rpm振荡培养3h，农杆菌体复苏，6000rpm离心1min收菌，留100μl上清液，吹打重悬菌体，将菌液涂布于Kan+的LB平板上并置于温度为28℃培养箱中倒置培养72h，挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，即得含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
(4)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌；
1)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌接种于含Kan+液体LB培养基中，其中Kan+的浓度为100μg/ml，置于温度为28℃，220rpm条件下震荡培养至OD600为0.8，6000rpm离心1min收集菌体，采用液体IM培养基重悬菌体，并稀释为OD600为0.15，置于温度为28℃，220rpm条件下避光诱导至OD600为0.45得到诱导菌液；
2)采用液体IM培养基稀释紫色紫孢菌孢子至浓度为105个/mL得到孢子悬浮液；
3)将诱导菌液与孢子悬浮液等体积混合得到混合菌液，将微孔滤膜平铺在固体IM培养基上，其中微孔滤膜的孔径0.45μm，直径80mm；将混合菌液均匀涂布于铺有微孔滤膜的固体IM培养基上，倒置于温度为22℃条件下避光诱导48h，将微孔滤膜转移至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的固体M-100培养基上，其中固体M-100培养基中sur(氯密磺隆抗性基因)含量为10μg/ml，头孢霉素含量为500μg/ml；置于温度为28℃避光培养4-7天至长出单菌落，无菌条件下挑取菌体至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的M-100斜面上，其中M-100斜面中sur(氯密磺隆抗性基因)含量为10μg/ml，头孢霉素含量为500μg/ml；置于温度为28℃下培养15d，再置于液体MM培养基中，温度为28℃、180rpm下震荡培养3d，采用CTAB法提取基因组验证是否转化成功；
(5)筛选flbD转化子，并依次采用验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3和随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3进行验证，即得高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD；
验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3中，引物flbD验证5的序列为GCCAGCCAGACTACAACAAA，引物flbD验证3的序列为GCACATACGCATACACTACCG；随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3中，引物随机插入验证5的序列为CACCTTGATGCCGTTCTT，引物随机插入验证3的序列为ACCCTTTGGCTCGCTTA；
转化子验证原理：在flbD上游同源臂和下游同源臂区域内设计一对引物flbD验证5和flbD验证3在转化子基因组中扩增，由于筛选标记sur(氯密磺隆抗性基因)和目的基因flbD的大小不同，扩增出来的片段大小会不一致，琼脂糖凝胶检测即可验证真假；在农杆菌介导的遗传转化过程中，会存在异常重组，即随机的整合到宿主基因组的任意位置，本发明中称为随机插入，随机插入可能会破坏其他基因的完整性；在验证同源重组之后还需要验证是否有随机插入，判断是否有随机插入的方法是看T-DNA内同源臂外的序列是否整合到基因组中，所以在LB位点和上游同源臂之间设计一对引物(随机插入验证5/随机插入验证3)作为随机插入的验证；
转化子验证方法：用验证引物flbD验证5/flbD验证3扩增，阳性对照大小为3694bp，阴性对照的大小为2116bp；如果扩增条带只有一条，且大小为3694bp，说明发生同源重组，即fibC基因已被氯嘧磺隆替代；然后进一步验证是否发生随机插入，该验证用随机插入验证5/随机插入验证3扩增，如果没有条带出现，则说明未发生随机插入，反则说明发生了随机插入；
本实施例高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因，PlflbD基因的序列如SEQIDNO.1所示，PlflbD氨基酸的序列如SEQIDNO.2所示。
实施例3：高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD的构建方法，具体步骤如下：
(1)利用OSCAR方法构建PlflbD基因敲除载体：以紫色紫孢菌基因DNA为模板，通过引物flbD5F/flbD5R克隆PflbD基因5’端同源重组片段，通过引物flbD3F/flbD3R克隆3’端同源重组片段；其中引物flbD5F/flbD5R用于扩增PlflbD基因上游1048bp片段；引物flbD5F的序列为ggggacagctttcttgtacaaagtggaaTCATTGTCATTTGGTGGAGTC，flbD基因上游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD5R的序列为ggggactgcttttttgtacaaacttgtATACCATCCGACCGACAGA，flbD基因上游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD3F/flbD3R用于扩增flbD基因下游982bp片段；引物flbD3F的序列为ggggacaactttgtatagaaaagttgttTAGGTGACTGGCTGAAGGAG，flbD基因下游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；引物flbD3R的序列为ggggacaactttgtataataaagttgtTCAACACGCACCATTTCC，flbD基因下游片段，小写序列与质粒att位点同源序列；其原理为含有同源臂的上下游片段，供体质粒，受体质粒在Bp Clonase的催化作用下发生重组反应；
(2)将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段和3’端同源重组片段进行Gateway BP反应得到PlflbD基因敲除载体；
BP反应体系为
Figure GDA0002344162230000101
质粒浓度为60ng/μl，上下游片段浓度为80ng/μl；
BP反应：
将供体质粒pA-sur(氯密磺隆抗性基因)-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段、3’端同源重组片段和BP clonase依次加入EP管中，混匀，离心，置于温度为25℃反应16h，加入1μl蛋白酶k置于温度为37℃孵育10min终止反应；将连接产物转化至DH5α，涂布于含kan+抗性的LB平板上，置于温度为28℃倒置过夜培养；挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，将获取的带有正确条带的菌落进行小提质粒或甘油保存备用；
(3)将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中得到含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
将100μl农杆菌感受态置于冰上融化，加入100ng的PlflbD基因敲除载体并混合均匀，依次进行冰浴处理5min，液氮速冻5min，温度为5℃水浴处理5min，冰浴处理5min，无菌条件下加入700μl无抗生素的LB液体培养基并置于温度为28℃、180rpm振荡培养48h，农杆菌体复苏，4500rpm离心3min收菌，留100μl上清液，吹打重悬菌体，将菌液涂布于Kan+的LB平板上并置于温度为28℃培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，即得含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
(4)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌；
1)将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌接种于含Kan+液体LB培养基中，其中Kan+的浓度为100μg/ml，置于温度为28℃，200rpm条件下震荡培养至OD600为0.45，4500rpm离心3min收集菌体，采用液体IM培养基重悬菌体，并稀释为OD600为0.15，置于温度为28℃，200rpm条件下避光诱导至OD600为0.45得到诱导菌液；
2)采用液体IM培养基稀释紫色紫孢菌孢子至浓度为105个/mL得到孢子悬浮液；
3)将诱导菌液与孢子悬浮液等体积混合得到混合菌液，将微孔滤膜平铺在固体IM培养基上，其中微孔滤膜的孔径0.45μm，直径80mm；将混合菌液均匀涂布于铺有微孔滤膜的固体IM培养基上，倒置于温度为22℃条件下避光诱导48h，将微孔滤膜转移至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的固体M-100培养基上，其中固体M-100培养基中sur(氯密磺隆抗性基因)含量为10μg/ml，头孢霉素含量为500μg/ml；置于温度为28℃避光培养4-7天至长出单菌落，无菌条件下挑取菌体至含sur(氯密磺隆抗性基因)和头孢霉素的M-100斜面上，其中M-100斜面中sur(氯密磺隆抗性基因)含量为10μg/ml，头孢霉素含量为500μg/ml；置于温度为28℃下培养8d，再置于液体MM培养基中，温度为28℃、140rpm下震荡培养4d，采用CTAB法提取基因组验证是否转化成功；
(5)筛选flbD转化子，并依次采用验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3和随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3进行验证，即得高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD；
验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3中，引物flbD验证5的序列为GCCAGCCAGACTACAACAAA，引物flbD验证3的序列为GCACATACGCATACACTACCG；随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3中，引物随机插入验证5的序列为CACCTTGATGCCGTTCTT，引物随机插入验证3的序列为ACCCTTTGGCTCGCTTA；
转化子验证原理：在flbD上游同源臂和下游同源臂区域内设计一对引物flbD验证5和flbD验证3在转化子基因组中扩增，由于筛选标记sur(氯密磺隆抗性基因)和目的基因flbD的大小不同，扩增出来的片段大小会不一致，琼脂糖凝胶检测即可验证真假；在农杆菌介导的遗传转化过程中，会存在异常重组，即随机的整合到宿主基因组的任意位置，本发明中称为随机插入，随机插入可能会破坏其他基因的完整性；在验证同源重组之后还需要验证是否有随机插入，判断是否有随机插入的方法是看T-DNA内同源臂外的序列是否整合到基因组中，所以在LB位点和上游同源臂之间设计一对引物(随机插入验证5/随机插入验证3)作为随机插入的验证；
转化子验证方法：用验证引物flbD验证5/flbD验证3扩增，阳性对照大小为3694bp，阴性对照的大小为2116bp；如果扩增条带只有一条，且大小为3694bp，说明发生同源重组，即fibC基因已被氯嘧磺隆替代；然后进一步验证是否发生随机插入，该验证用随机插入验证5/随机插入验证3扩增，如果没有条带出现，则说明未发生随机插入，反则说明发生了随机插入；
本实施例高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因，PlflbD基因的序列如SEQIDNO.1所示，PlflbD氨基酸的序列如SEQIDNO.2所示。
实施例4：紫色紫孢菌基因工程菌株(Purpureocillium lavendulumΔPlflbD)所产孢子可用于制备分线虫生防菌剂；
紫色紫孢菌基因工程菌株(Purpureocillium lavendulumΔPlflbD)培养和孢子获取的方法：
(1)试管种培养：培养基配方MM培养基(L)：20g Glucose、20ml 50*Vogels、20gAgar、1000mlH2O；将紫色紫孢菌ΔKu80或紫色紫孢菌基因工程菌株(PurpureocilliumlavendulumΔPlflbD)的孢子接种到分装好的含10μg/ml sur(氯密磺隆抗性基因)和500μg/ml头孢霉素MM试管斜面上，置于温度为28℃下培养10至15天，获得紫色紫孢菌ΔKu80试管种或紫色紫孢菌基因工程菌试管种；
(2)获取对照组紫色紫孢菌ΔKu80孢子与实验组紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD孢子：待紫色紫孢菌株或紫色紫孢菌基因工程菌株培养10d左右至产孢后，试管中加入1ml灭菌的浓度为0.5‰吐温80，将试管在漩涡振荡器上剧烈震荡3min，液体倒回EP管，2500rpm离心3min，用ddH2O洗两遍(弃上清液，加ddH2O吸打混匀，2500rpm离心3min)，加入一定量的ddH2O，混匀，得到紫色紫孢菌ΔKu80初始孢子悬液或紫色紫孢菌基因工程菌初始孢子悬液，计数；将初始悬液稀释到相同浓度，备用；
(3)MM固体平板培养：将MM固体培养基在微波炉中融化，均匀倒入6cm平板中，待培养基凝固后，向不同平板中心位置加入2ul对照组紫色紫孢菌ΔKu80孢子悬液或实验组紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD孢子悬液(每个菌株分别接3个平板，作为平行实验)，转移到28℃培养箱中生长10d；
(4)PDA固体平板培养：培养基配方PDA培养基(L)：20g Glucose、1000ml土豆汁(200g土豆加水1200ml煮沸过滤)，20g Agar；将PDA固体培养基在微波炉中融化，均匀倒入6cm平板中，待培养基凝固后，向中心位置加入2ul对照组紫色紫孢菌ΔKu80孢子悬液或实验组紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD孢子悬液(每个菌株分别接3个平板，作为平行实验)，转移到28℃培养箱中生长10d；
(5)孢子获取与计数：在对照组紫色紫孢菌ΔKu80菌丝或实验组紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD菌丝均匀生长的平板上用8mm的打孔器进行打孔，将菌块转移到1.5mlEP管中，加入1ml浓度为0.5‰吐温80，在旋涡振荡器上震荡3min，稀释适当倍数后用血球计数版计数；
初始菌株紫色紫孢菌ΔKu80与紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD在MM与PDA培养基上培养10天后，二者菌落大小均相同，但紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD的菌落颜色明显较深(见图1和图3)；在对菌落进行打孔时，须在初始菌株紫色紫孢菌ΔKu80与紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD菌落相同位置且长势均匀的地方打孔；获取孢子计数后，发现紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD在MM或PDA培养基上的产孢量比初始菌株紫色紫孢菌ΔKu80分别提高3.3、4.6倍(见图2和图4)。
Figure GDA0002344162230000141
Figure GDA0002344162230000151
Figure GDA0002344162230000161
序列表
<110> 云南大学
<120> 高产孢量紫色紫孢菌基因工程菌ΔPlflbD及其构建方法与应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1347
<212> DNA
<213> 紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)
<400> 1
atggccagcg ctggtgctgg tgctggctct atcggcggtg ccggtgctgg ctctaacggc 60
ggtggtggtg ctggctctaa cggcggtggt ggtgctggct ctaacagcgg tgccggttcc 120
aagccttccc acaggagagg cccttggtcc accgccgagg atcagatact catggaactc 180
atccacgtca atggccctct caactgggtg accatttccg ccgccttggg cacgcgctcc 240
cccaagcagt gccgcgagcg ctaccaccag aacctcaaac cttccctcaa ccacagtccc 300
atcacaagcg aggagggcgc tcaaatcggc gagcatgtga gagtaatggg caagcgctgg 360
gctgaaattg cccgtcgcct caacggtcgc agcgacaatg ccgtcaagaa ctggtggaac 420
ggcagcgtag cccgccaaaa gcgcggcacc aaacgcctag cgcaggattc ggcagaaatg 480
ccaggttcgg cgttgcagat gcaacagaac atcaacccgg ctcccacgca tgcctcgacc 540
ctcacgcacg actcggctcc cacgcacgcc tccgcctcgt cccctgttta tccgctcacc 600
ctgcggtcat cgtcccagag ccttgccctg aacgatttaa gccgtcccca cggtatgctt 660
cctctgccac cacccccagc gtccatgggc accatgcagt ctacggcaag ggaccctgcc 720
gtgcggcagt cacttcccac ggaaaacccc tacggctatg gtcgacgctc catcagagga 780
ggccggccgt cgatattatc cccctgggca aacacctcca ggtatgatcg gtccgccatc 840
acagagagca ggcagccgat gcgatctccc agcgagccag atctagagtc tgaggcggat 900
gtcgcgaatt atgtcacttc gtcgcgacgt cgctcgcatc catacactcg gacgagcctg 960
ccacttcctc ctcttcgaga ctggccaagc gacattcccc gtactcccct ccccagcttc 1020
cgtgatgtga cgtcaacacc accctctctg ggtccggaca ttgccatgtc gcggctggcg 1080
ccactgcctc aacatcatcg ggtgcatcat cagggacagt tgccaactgc ccctgactcg 1140
cctaatgagg ggcagcaacc aggctggcaa ccccgtcacg gtcactggcc ccacgagctc 1200
ccgcttctgc aagcgtcacg gcaacgcgag cagaggcagg acgaggatgg tgatggggat 1260
gaggaagcgc gcgactgtgg cgttgagccg ccaaagctat cacgcgtcaa ggacaagcgt 1320
atggatgtgt cttcactcct ccattaa 1347
<210> 2
<211> 448
<212> PRT
<213> 紫色紫孢菌(Purpureocillium lavendulum)
<400> 2
Met Ala Ser Ala Gly Ala Gly Ala Gly Ser Ile Gly Gly Ala Gly Ala
1 5 10 15
Gly Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ser Asn Gly Gly Gly Gly Ala
20 25 30
Gly Ser Asn Ser Gly Ala Gly Ser Lys Pro Ser His Arg Arg Gly Pro
35 40 45
Trp Ser Thr Ala Glu Asp Gln Ile Leu Met Glu Leu Ile His Val Asn
50 55 60
Gly Pro Leu Asn Trp Val Thr Ile Ser Ala Ala Leu Gly Thr Arg Ser
65 70 75 80
Pro Lys Gln Cys Arg Glu Arg Tyr His Gln Asn Leu Lys Pro Ser Leu
85 90 95
Asn His Ser Pro Ile Thr Ser Glu Glu Gly Ala Gln Ile Gly Glu His
100 105 110
Val Arg Val Met Gly Lys Arg Trp Ala Glu Ile Ala Arg Arg Leu Asn
115 120 125
Gly Arg Ser Asp Asn Ala Val Lys Asn Trp Trp Asn Gly Ser Val Ala
130 135 140
Arg Gln Lys Arg Gly Thr Lys Arg Leu Ala Gln Asp Ser Ala Glu Met
145 150 155 160
Pro Gly Ser Ala Leu Gln Met Gln Gln Asn Ile Asn Pro Ala Pro Thr
165 170 175
His Ala Ser Thr Leu Thr His Asp Ser Ala Pro Thr His Ala Ser Ala
180 185 190
Ser Ser Pro Val Tyr Pro Leu Thr Leu Arg Ser Ser Ser Gln Ser Leu
195 200 205
Ala Leu Asn Asp Leu Ser Arg Pro His Gly Met Leu Pro Leu Pro Pro
210 215 220
Pro Pro Ala Ser Met Gly Thr Met Gln Ser Thr Ala Arg Asp Pro Ala
225 230 235 240
Val Arg Gln Ser Leu Pro Thr Glu Asn Pro Tyr Gly Tyr Gly Arg Arg
245 250 255
Ser Ile Arg Gly Gly Arg Pro Ser Ile Leu Ser Pro Trp Ala Asn Thr
260 265 270
Ser Arg Tyr Asp Arg Ser Ala Ile Thr Glu Ser Arg Gln Pro Met Arg
275 280 285
Ser Pro Ser Glu Pro Asp Leu Glu Ser Glu Ala Asp Val Ala Asn Tyr
290 295 300
Val Thr Ser Ser Arg Arg Arg Ser His Pro Tyr Thr Arg Thr Ser Leu
305 310 315 320
Pro Leu Pro Pro Leu Arg Asp Trp Pro Ser Asp Ile Pro Arg Thr Pro
325 330 335
Leu Pro Ser Phe Arg Asp Val Thr Ser Thr Pro Pro Ser Leu Gly Pro
340 345 350
Asp Ile Ala Met Ser Arg Leu Ala Pro Leu Pro Gln His His Arg Val
355 360 365
His His Gln Gly Gln Leu Pro Thr Ala Pro Asp Ser Pro Asn Glu Gly
370 375 380
Gln Gln Pro Gly Trp Gln Pro Arg His Gly His Trp Pro His Glu Leu
385 390 395 400
Pro Leu Leu Gln Ala Ser Arg Gln Arg Glu Gln Arg Gln Asp Glu Asp
405 410 415
Gly Asp Gly Asp Glu Glu Ala Arg Asp Cys Gly Val Glu Pro Pro Lys
420 425 430
Leu Ser Arg Val Lys Asp Lys Arg Met Asp Val Ser Ser Leu Leu His
435 440 445

Claims (5)

1.紫色紫孢菌（Purpureocillium lavendulum）的基因工程菌ΔPlflbD，其特征在于：所述基因工程菌为敲除紫色紫孢菌的PlflbD基因；基因工程菌的保藏编号为CCTCC M2019347；PlflbD基因的序列如SEQIDNO.1所示，PlflbD氨基酸的序列如SEQIDNO.2所示。
2.权利要求1所述紫色紫孢菌（Purpureocillium lavendulum）的基因工程菌ΔPlflbD的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）利用OSCAR方法构建PlflbD基因敲除载体：以紫色紫孢菌基因DNA为模板，通过引物flbD5F/flbD5R克隆PflbD基因5’端同源重组片段，通过引物flbD3F/flbD3R克隆3’端同源重组片段；
所述引物flbD5F/flbD5R用于扩增flbD基因上游1049bp片段；引物flbD5F的序列为ggggacagctttcttgtacaaagtggaaTCATTGTCATTTGGTGGAGTC；引物flbD5R的序列为ggggactgcttttttgtacaaacttgtATACCATCCGACCGACAGA；引物flbD3F/flbD3R用于扩增flbD基因下游982bp片段；引物flbD3F的序列为ggggacaactttgtatagaaaagttgttTAGGTGACTGGCTGAAGGAG；引物flbD3R的序列为ggggacaactttgtataataaagttgtTCAACACGCACCATTTCC；
（2）将供体质粒pA-氯密磺隆抗性基因sur-OSCAR、受体pPK2-OSCAR-GFP、PflbD基因5’端同源重组片段和3’端同源重组片段进行Gateway BP 反应得到PlflbD基因敲除载体；
（3）将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中得到含PlflbD基因敲除载体的农杆菌；
（4）将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌；
（5）筛选flbD转化子，并依次采用验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3和随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3进行验证，即得高产孢量紫色紫孢菌的基因工程菌ΔPlflbD；
所述验证引物对引物flbD验证5/flbD验证3中，引物flbD验证5的序列为GCCAGCCAGACTACAACAAA，引物flbD验证3的序列为GCACATACGCATACACTACCG；随机引物对随机插入验证5/随机插入验证3中，引物随机插入验证5的序列为CACCTTGATGCCGTTCTT，引物随机插入验证3的序列为ACCCTTTGGCTCGCTTA。
3.根据权利要求2所述紫色紫孢菌（Purpureocillium lavendulum）的基因工程菌ΔPlflbD的构建方法，其特征在于：步骤（3）将PlflbD基因敲除载体转入农杆菌中的具体方法为
将农杆菌感受态置于冰上融化，加入PlflbD基因敲除载体并混合均匀，依次进行冰浴处理5min，液氮速冻5min，温度为37℃水浴处理5min，冰浴处理5min，无菌条件下加入无抗生素的LB液体培养基并置于温度为28℃、180rpm振荡培养2~3h，农杆菌体复苏，离心收菌，吹打重悬菌体，将菌液涂布于Kan+的LB平板上并置于温度为28℃培养箱中倒置培养48~72h，挑取单菌落划线，长大后进行菌落PCR验证，即得含PlflbD基因敲除载体的农杆菌。
4.根据权利要求2所述紫色紫孢菌（Purpureocillium lavendulum）的基因工程菌ΔPlflbD的构建方法，其特征在于：步骤（4）将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌转化紫色紫孢菌的具体方法为
1）将含PlflbD基因敲除载体的农杆菌接种于含Kan+液体LB培养基中，置于温度为28℃，200~220rpm条件下震荡培养至OD600为0.5~0.8，离心收集菌体，采用液体IM培养基重悬菌体，并稀释为OD600为0.15，置于温度为28℃，180~220rpm条件下避光诱导至OD600为0.45得到诱导菌液；
2）采用液体IM培养基稀释紫色紫孢菌孢子至浓度为105个/mL得到孢子悬浮液；
3）将诱导菌液与孢子悬浮液等体积混合得到混合菌液，将微孔滤膜平铺在固体IM培养基上，将混合菌液均匀涂布于铺有微孔滤膜的固体IM培养基上，倒置于温度为22℃条件下避光诱导48h，将微孔滤膜转移至含氯密磺隆抗性基因sur和头孢霉素的固体M-100培养基上，置于温度为28℃避光培养至长出单菌落，无菌条件下挑取菌体至含氯密磺隆抗性基因sur和头孢霉素的M-100斜面上，置于温度为28℃下培养8~15d，再置于液体MM培养基中，温度为28℃、140~180rpm下震荡培养3~4 d，采用CTAB法提取基因组验证。
5.权利要求1所述高产孢量紫色紫孢菌（Purpureocillium lavendulum）的基因工程菌ΔPlflbD在制备线虫生防菌剂中的应用。
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