CN100494379C - 水稻hpfr基因、表达产物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及水稻hpfr基因、表达产物及其用途,属农业生物技术领域,用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。本发明为水稻hpfr基因,是首次从植物中发现具有类似植物病原细菌hrp基因功能的基因序列,编码产物具有激发子的功能,在烟草上产生过敏反应、诱导植物产生抗病性、促进植物生长和提高农作物产量等,由于hpfr基因来源于植物,表达产物hpfr蛋白质通过高效表达载体与微生物发酵产生,是经济环保的生物农药,可以用于大田和保护地植物病虫害防治和提高产量。本发明还提供了小麦hpfw基因,其表达产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。
Description
一、技术领域
本发明涉及水稻hpfr基因、表达产物及其用途,属农业生物技术领域,用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。
二、背景技术
hrp基因是植物病原细菌中决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitiveresponse,HR)和在寄主植物上致病性的基因[Lindgren P B,The role of hrp genes duringplant-bacterial interaction.Annu Rev Phytopathol,1997,35:129~152]。过敏反应是植物产生的一种局部的、快速的细胞编程死亡(programmed cell death,PCD)形式。PCD可以引发一种或多种信号传导途径,赋予植物多种抗环境胁迫能力。
国内外对植物病原细菌的hrp基因做了较详细的研究。Wei等人首次发现梨火疫病菌Erwinia amylovora的hrpN基因编码的一种新蛋白质能诱导植物产生过敏反应,并将其命名为Harpin。该蛋白质的特点是富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸,热稳定,具有诱导植物产生过敏反应、诱导抗病和促进作物生长等生物活性[Wei Z M,Laby R J,ZumoffC H,et al.Harpin,elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora.Science,1992.257:85~88]。现已陆续从丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和黄单胞菌Xanthomonasoryzae等多种植物病原细菌中鉴定出具有harpin活性的蛋白质。它们是由相应的植物病原细菌hrp基因簇中特定hrp基因编码的。
闻伟刚等从水稻白叶枯病菌X.oryzae pv.oryzae中克隆了hrp基因,即hrfAXoo基因,该基因核苷酸序列大小为420bp,编码产物harpinXoo分子量为15.6kD,该蛋白质具有harpins的功能:注射烟草可以诱导植物产生过敏反应;在体外喷雾处理植物可以诱导植物产生抗性和促进作物生长等[闻伟刚,邵敏,陈功友,王金生,水稻白叶枯病蛋白质激发子诱导植物的防卫反应.农业生物技术学报,2003,11(2):192~197]。表达该蛋白质的基因工程菌株已经正在进行产业化研究与开发,相关的研究已经申请国家专利保护[专利号:ZJ00135403.5];将hrfAXoo基因转化水稻,具有提高水稻对稻瘟病、白叶枯病的抗性[邵敏,王金生,转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性,南京农业大学学报2004,27(4):36-40],相关研究已受国家专利保护[专利号:ZL 02157213.5.]。因此,植物病原细菌中的hrp基因及其应用研究得较多,但植物中类似于harpin编码基因及其应用研究至今尚未有报道。
三、发明内容
技术问题 本发明的目的是提供水稻中的hpfr基因、表达产物及其用途。来自于水稻的hpfr基因的表达产物,防治植物病害、促进作物生长。
技术方案 本发明所提供的基因具有以下特征:
1.水稻hpfr基因来源:
设计引物:5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’,用PCR方法从水稻中扩增出该片段。该基因片段命名为hpfr基因(图1)。以hpfr基因为探针,与水稻基因组总DNA杂交,杂交结果显示,在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。
2.水稻hpfr基因的核苷酸序列水稻hpfr基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1(图3):确定该基因大小为405bp,起始密码子处存在EcoRI酶切位点GAATTC,编码区域富含GGT或GGC示编码甘氨酸(glycine,G)的密码子(阴影区),有4个GGCGGC重复区域(方框区)。ATG示起始密码子,TAA示终止子。
3.水稻hpfr基因编码的推导氨基酸序列水稻hpfr基因编码的推导氨基酸序列为SEQ IDNO.2(图4),根据hpfr基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列为134个氨基酸。富含甘氨酸(阴影区),不含半光氨酸。
4.水稻hpfr基因体外表达将水稻hpfr基因构建于蛋白质体外高效表达载体pET30a(+)形成重组质粒pETR(图5),产生水稻hpfr基因的体外表达产物,命名为hpfr蛋白质,其特征类似于harpinxoo的功能:能够诱导非寄主植物烟草在24小时内产生过敏反应(图6)、亲水性、对热稳定性、对蛋白酶敏感性,经过SDS-PAGE电泳,确定该蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。
5.水稻hpfr蛋白质的理化特性
hpfr蛋白质经100℃水浴10min后,仍然能够在24h内激发烟草产生过敏性反应,活性也没有明显的下降;用蛋白酶水解30min后则完全丧失了激发过敏反应的能力,这表明hpfr蛋白质热稳定,但对蛋白酶敏感。
6.水稻hpfr基因的表达产物的应用
水稻hpfr基因的表达产物hpfr蛋白质配制成适当浓度,在作物的不同生长季节用于作物叶面喷施,也可以用于作物移栽时浸根处理,防治植物病害、促进作物生长。
7.来源于植物的与上述水稻hpfr基因的同源序列hpfx基因,其特征在于,用水稻hpfr基因引物:5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’,以植物的基因组DNA为模板,用PCR方法扩增出hpfx基因,PCR扩增条件:94℃/5min的1个循环,94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35个循环,72℃/7min的1个循环;hpfx基因编码产物具有诱导烟草产生过敏反应反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。hpfx基因所编码的产物为hpfx蛋白质。
8、来源于小麦的与水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因,其序列为SEQ ID NO.3,其推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.4,hpfw基因编码产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。
有益效果
本发明人将hrfAXoo基因转化水稻[邵敏,王金生,转hrfAXoo基因水稻对白叶枯病的抗性,南京农业大学学报,2004,27(4):36-40],在转基因水稻分子检测时发现水稻中存在与hrfAXoo基因同源序列,并将其克隆和在体外表达,其表达产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长等功能,在植物中发现类似于harpin编码基因尚属首次。
本发明为水稻中与水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)的hrp基因同源序列、表达产物及其用途,来源于水稻的hrp基因同源序列表达产物与水稻黄单胞菌hrp基因的编码产物harpinXoo有相似的功能,所以将该基因命名为hpfr(hrp-like function loci in rice)基因。该基因大小为405bp。
本发明研究发现hpfr基因在体外的表达产物与水稻黄单胞菌的hrp基因表达产物有相似的功能,即促进植物生长、诱导抗病虫性等,本发明已从水稻中克隆了hpfr基因,并构建至表达载体中,获得表达产物。
研究结果表明,hpfr蛋白质处理烟草有明显诱导烟草抗TMV的能力(图8)。将hpfr蛋白质处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9),采摘期提前1周左右hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3%,辣椒提高31.6%。番茄上病毒病害发生明显减轻(图10)。
用hpfw蛋白质喷雾处理番茄,具有促进植物生长功能(图14),同时,明显减少番茄早疫病的发生;用该蛋白质喷雾处理黄瓜,对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。
四、附图说明
图1水稻hpfr基因PCR扩增电泳图
图2水稻hpfr基因为探针与水稻基因组总DNA杂交结果
M-Marker,hplr-hplr基因阳性对照,1、2、3-水稻基因组总DNA
图3水稻hpfr基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1
图4水稻hpfr基因推导氨基酸序列SEQ ID NO.2
图5水稻hpfr基因构建于pET30a(+)上酶切电泳图
图6水稻hpfr蛋白质诱导烟草产生过敏反应
A-BL21(DE3)/pETR的粗蛋白质抽提物,
B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物 C-H2O
图7水稻hpfr蛋白质SDS-PAGE电泳图
M-Marker,1.BL21(DE3)/pETR提取的CFEP,2.纯化的水稻hpfr蛋白质
图8BL21(DE3)/pETR表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV
图9水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄、辣椒促进生长
图10水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄减轻病毒病害发生
图11小麦hpfw基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3
图12小麦hpfw基因推导氨基酸序列SEQ ID NO.4
图13小麦hpfw蛋白质SDS-PAGE电泳图
图14小麦hpfw蛋白质诱导烟草产生过敏反应
A-BL21(DE3)/pETW的粗蛋白质抽提物,
B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物 C-H2O
图15小麦hpfw蛋白质叶面喷施番茄促进生长
五、具体实施方式
实施例1
1.水稻hpfr基因的发现与克隆根据水稻黄单胞菌白叶枯病致病变种hrfAXoo基因开放阅读框设计水稻hpfr基因引物:
5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’,用PCR方法从水稻中扩增出来源于水稻中hpfr基因。PCR扩增条件:94℃/5min的1个循环,94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35个循环,72℃/7min的1个循环。将该基因片段命名为hpfr基因(图1)。以水稻hpfr基因为探针,与水稻基因组总DNA杂交,杂交结果显示,在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。
2.水稻hpfr基因的体外表达
PCR产物纯化后经NdeI和BamHI酶切,连接于表达载体pET30a(+)上,获得重组质粒为pETR[pET30a(+)::hpfr](图5)。将pETR转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组微生物BLTR[BL21(DE3)/pET30a(+)::hpfr],在将重组微生物BLTR的单菌落接种20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振荡培养12h,转接于20ml的LB+Km 20μg/ml中37℃下振荡培养3h,将1M的IPTG(TaKaRa公司)加入其中,使其终浓度为1mM,继续培养2h。离心(5000rpm,10min)收集菌体。菌体于100℃水浴煮沸10min,冷却后离心(12000rpm,10min),取上清(Cell-free Elicitor Protein,CFEP),注射烟草叶片叶肉组织细胞中,24h内产生过敏反应(图6)。取上清液3μl进行12%SDS-PAGE电泳,根据标准蛋白质的分子量推算,水稻hpfr蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。
3.实验室小计量生产水稻hpfr蛋白质
将重组微生物BLTR9的单菌落接种20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振荡培养12h,转接于5L的玉米粉发酵培养基(味精1%,酵母膏1%,玉米粉3.5%)+Km 20μg/ml中37℃下发酵培养3h,加乳糖(终浓度为10mM)诱导培养2h。离心(5000rpm,10min)收集菌体。菌体于100℃水浴煮沸10min,冷却后离心(12000rpm,10min),取上清,即为水稻hpfr蛋白质。1L玉米粉发酵培养基大约可以产生1.5g hpfr蛋白质。
实施例2 水稻hpfr基因表达产物hpfr蛋白质的直接使用
水稻hpfr基因的表达产物hpfr蛋白质按15、30、60μg/ml的浓度对植物进行叶面喷洒。
1.诱导Xanthi烟草对TMV的抗性表型
将水稻hpfr和harpinXoo蛋白质的CFEP母液分别稀释至浓度为15、30、60μg/ml,用微型喷雾器喷施成株期珊西烟,每处理5个重复;16h后,用摩擦接种活化的TMV于烟草叶片上;4天后观测结果,并统计病斑数。研究结果表明,水稻hpfr和harpinXoo处理烟草,都有明显诱导烟草抗TMV的能力(枯斑数目上的减少)(图8)。经LSD法多重比较分析(F189.464)表明,BL21(DE3)/pETR和BL21(DE3)/pET30a(+)::hrfAXoo的蛋白质抽提物处理与pET30(a)/BL21(DE3)蛋白质抽提物对照相比差异极显著(表1)。在浓度为60μL/mL时诱导抗病性效果最显著,水稻hpfr蛋白质的防效为96.35%,与harpinXoo防效(95.9%)相近。
2.促进植物生长,提高产量
将水稻hpfr蛋白质CFEP母液稀释至浓度为60μg/ml;在番茄、辣椒大棚,分别在苗期、花期和座果期喷施,研究结果表明,处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9),采摘期提前1周左右水稻hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3%,辣椒提高31.6%。番茄上病毒病害发生明显减轻(图10)。
表1 BL21(DE3)/pETR9表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV的效果
*:P<0.01水平上的差异显著性
来源于植物的与上述水稻hpfr基因的同源序列统一命名为hpfx基因,其特征在于,用实施例1水稻hpfr基因引物,以植物的基因组DNA为模板,用PCR方法(方法同实施例1)扩增出hpfx基因,其编码产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。hpfx基因所编码的产物统一命名为hpfx蛋白质。
下面实施例以小麦为例,从小麦中获得与水稻hpfr基因同源的基因为hpfw,表达产物为hpfw蛋白质。
实施例3小麦中与水稻hpfr基因同源hpfw基因克隆与表达
1.小麦hpfw基因克隆与核苷酸序列用设计引物:
5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’,用PCR方法(方法同实施例1)从小麦中扩增与水稻hpfr基因同源基因,命名为hpfw基因。hpfw基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3(图11),大小为414bp,与水稻hpfr基因的同源性为93%。hpfw基因推导氨基酸序列为SEQ ID NO.4(图12)。
2.小麦hpfw基因的体外表达和小计量生产hpfw蛋白质(方法同实施例1)
将小麦hpfw基因连接于表达载体pET30a(+)上,获得重组表达载体pETW9[pET30a(+)::hpfw],通过大肠杆菌BL21(DE3)表达的产物,命名为hpfw蛋白质。该经12%SDS-PAGE电泳,根据标准蛋白质的分子量推算,小麦hpfw蛋白质的分子量约为14.8kD(图12)。
3.小麦hpfw蛋白质的生物活性
小麦hpfw蛋白质注射烟草叶片叶肉组织细胞中,24h内激发烟草产生过敏反应(图13);用该蛋白质喷雾处理番茄,结果表明,该蛋白质具有促进植物生长功能(图14),同时,明显减少番茄早疫病的发生;用该蛋白质喷雾处理黄瓜,对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。
表2.小麦hpfw蛋白质对作物病害的防治效果(相对防效,%)
序列表
<110>南京农业大学
<120>水稻hpfr基因、表达产物及其应用
<130>说明书
<140>00
<141>2007-02-05
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>405
<212>DNA
<213>Oryza sativa(水稻)
<220>
<221>gene
<222>(1)..(405)
<223>
<400>1
<210>2
<211>134
<212>PRT
<213>Oryza sativa(水稻)
<220>
<221>水稻hpfr基因表达的氨基酸序列
<222>(1)..(134)
<223>富含苷氨酸
<400>2
<210>3
<211>414
<212>DNA
<213>小麦(Triticum aestivum)
<220>
<221>小麦hpfw基因
<222>(1)..(414)
<223>
<400>3
<210>4
<211>137
<212>PRT
<213>小麦(Triticum aestivum)
<220>
<221>小麦hpfw氨基酸
<222>(1)..(137)
<223>
<400>4
<210>5
<211>33
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>水稻hpfr基因引物左序列
<222>(1)..(33)
<223>
<400>5
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<221>水稻hpfr基因引物右序列
<222>(1)..(31)
<223>
<400>6
Claims (4)
1、水稻hpfr基因,其序列为SEQ ID NO.1。
2、权利要求1所述水稻hpfr基因编码的蛋白,其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3、权利要求1所述水稻hpfr基因的表达产物,命名为hpfr蛋白质,该蛋白质的分子量为14.5kDa。
4、权利要求3所述水稻hpfr基因的表达产物在防治植物病害、促进作物生长方面的应用。
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水稻白叶枯病菌毒性基因的克隆和功能分析. 何晨阳等.植物病理学报,第22卷第4期. 1992 |
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