CN100494379C

CN100494379C - 水稻hpfr基因、表达产物及其应用

Info

Publication number: CN100494379C
Application number: CNB200710020342XA
Authority: CN
Inventors: 邵敏; 高学文; 黄万春; 郭玲; 王金生
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2007-02-14
Filing date: 2007-02-14
Publication date: 2009-06-03
Anticipated expiration: 2027-02-14
Also published as: CN101037697A

Abstract

本发明涉及水稻hpfr基因、表达产物及其用途，属农业生物技术领域，用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。本发明为水稻hpfr基因，是首次从植物中发现具有类似植物病原细菌hrp基因功能的基因序列，编码产物具有激发子的功能，在烟草上产生过敏反应、诱导植物产生抗病性、促进植物生长和提高农作物产量等，由于hpfr基因来源于植物，表达产物hpfr蛋白质通过高效表达载体与微生物发酵产生，是经济环保的生物农药，可以用于大田和保护地植物病虫害防治和提高产量。本发明还提供了小麦hpfw基因，其表达产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。

Description

水稻hpfr基因、表达产物及其应用

一、技术领域

本发明涉及水稻hpfr基因、表达产物及其用途，属农业生物技术领域，用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。

二、背景技术

hrp基因是植物病原细菌中决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitiveresponse，HR)和在寄主植物上致病性的基因[Lindgren P B，The role of hrp genes duringplant-bacterial interaction.Annu Rev Phytopathol，1997，35：129～152]。过敏反应是植物产生的一种局部的、快速的细胞编程死亡(programmed cell death，PCD)形式。PCD可以引发一种或多种信号传导途径，赋予植物多种抗环境胁迫能力。

国内外对植物病原细菌的hrp基因做了较详细的研究。Wei等人首次发现梨火疫病菌Erwinia amylovora的hrpN基因编码的一种新蛋白质能诱导植物产生过敏反应，并将其命名为Harpin。该蛋白质的特点是富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸，热稳定，具有诱导植物产生过敏反应、诱导抗病和促进作物生长等生物活性[Wei Z M，Laby R J，ZumoffC H，et al.Harpin，elicitor of the hypersensitive response produced by the plant pathogen Erwinia amylovora.Science，1992.257：85～88]。现已陆续从丁香假单胞菌Pseudomonas syringae和黄单胞菌Xanthomonasoryzae等多种植物病原细菌中鉴定出具有harpin活性的蛋白质。它们是由相应的植物病原细菌hrp基因簇中特定hrp基因编码的。

闻伟刚等从水稻白叶枯病菌X.oryzae pv.oryzae中克隆了hrp基因，即hrfA_Xoo基因，该基因核苷酸序列大小为420bp，编码产物harpin_Xoo分子量为15.6kD，该蛋白质具有harpins的功能：注射烟草可以诱导植物产生过敏反应；在体外喷雾处理植物可以诱导植物产生抗性和促进作物生长等[闻伟刚，邵敏，陈功友，王金生，水稻白叶枯病蛋白质激发子诱导植物的防卫反应.农业生物技术学报，2003，11(2)：192～197]。表达该蛋白质的基因工程菌株已经正在进行产业化研究与开发，相关的研究已经申请国家专利保护[专利号：ZJ00135403.5]；将hrfA_Xoo基因转化水稻，具有提高水稻对稻瘟病、白叶枯病的抗性[邵敏，王金生，转hrfA_Xoo基因水稻对白叶枯病的抗性，南京农业大学学报2004，27(4)：36-40]，相关研究已受国家专利保护[专利号：ZL 02157213.5.]。因此，植物病原细菌中的hrp基因及其应用研究得较多，但植物中类似于harpin编码基因及其应用研究至今尚未有报道。

三、发明内容

技术问题本发明的目的是提供水稻中的hpfr基因、表达产物及其用途。来自于水稻的hpfr基因的表达产物，防治植物病害、促进作物生长。

技术方案本发明所提供的基因具有以下特征：

1.水稻hpfr基因来源：

设计引物：5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法从水稻中扩增出该片段。该基因片段命名为hpfr基因(图1)。以hpfr基因为探针，与水稻基因组总DNA杂交，杂交结果显示，在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。

2.水稻hpfr基因的核苷酸序列水稻hpfr基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1(图3)：确定该基因大小为405bp，起始密码子处存在EcoRI酶切位点GAATTC，编码区域富含GGT或GGC示编码甘氨酸(glycine，G)的密码子(阴影区)，有4个GGCGGC重复区域(方框区)。ATG示起始密码子，TAA示终止子。

3.水稻hpfr基因编码的推导氨基酸序列水稻hpfr基因编码的推导氨基酸序列为SEQ IDNO.2(图4)，根据hpfr基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列为134个氨基酸。富含甘氨酸(阴影区)，不含半光氨酸。

4.水稻hpfr基因体外表达将水稻hpfr基因构建于蛋白质体外高效表达载体pET30a(+)形成重组质粒pETR(图5)，产生水稻hpfr基因的体外表达产物，命名为hpfr蛋白质，其特征类似于harpin_xoo的功能：能够诱导非寄主植物烟草在24小时内产生过敏反应(图6)、亲水性、对热稳定性、对蛋白酶敏感性，经过SDS-PAGE电泳，确定该蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。

5.水稻hpfr蛋白质的理化特性

hpfr蛋白质经100℃水浴10min后，仍然能够在24h内激发烟草产生过敏性反应，活性也没有明显的下降；用蛋白酶水解30min后则完全丧失了激发过敏反应的能力，这表明hpfr蛋白质热稳定，但对蛋白酶敏感。

6.水稻hpfr基因的表达产物的应用

水稻hpfr基因的表达产物hpfr蛋白质配制成适当浓度，在作物的不同生长季节用于作物叶面喷施，也可以用于作物移栽时浸根处理，防治植物病害、促进作物生长。

7.来源于植物的与上述水稻hpfr基因的同源序列hpfx基因，其特征在于，用水稻hpfr基因引物：5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，以植物的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出hpfx基因，PCR扩增条件：94℃/5min的1个循环，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35个循环，72℃/7min的1个循环；hpfx基因编码产物具有诱导烟草产生过敏反应反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。hpfx基因所编码的产物为hpfx蛋白质。

8、来源于小麦的与水稻hpfr基因的同源序列hpfw基因，其序列为SEQ ID NO.3，其推导的氨基酸序列为SEQ ID NO.4，hpfw基因编码产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。

有益效果

本发明人将hrfA_Xoo基因转化水稻[邵敏，王金生，转hrfA_Xoo基因水稻对白叶枯病的抗性，南京农业大学学报，2004，27(4)：36-40]，在转基因水稻分子检测时发现水稻中存在与hrfA_Xoo基因同源序列，并将其克隆和在体外表达，其表达产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长等功能，在植物中发现类似于harpin编码基因尚属首次。

本发明为水稻中与水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)的hrp基因同源序列、表达产物及其用途，来源于水稻的hrp基因同源序列表达产物与水稻黄单胞菌hrp基因的编码产物harpin_Xoo有相似的功能，所以将该基因命名为hpfr(hrp-like function loci in rice)基因。该基因大小为405bp。

本发明研究发现hpfr基因在体外的表达产物与水稻黄单胞菌的hrp基因表达产物有相似的功能，即促进植物生长、诱导抗病虫性等，本发明已从水稻中克隆了hpfr基因，并构建至表达载体中，获得表达产物。

研究结果表明，hpfr蛋白质处理烟草有明显诱导烟草抗TMV的能力(图8)。将hpfr蛋白质处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9)，采摘期提前1周左右hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害发生明显减轻(图10)。

用hpfw蛋白质喷雾处理番茄，具有促进植物生长功能(图14)，同时，明显减少番茄早疫病的发生；用该蛋白质喷雾处理黄瓜，对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。

四、附图说明

图1水稻hpfr基因PCR扩增电泳图

图2水稻hpfr基因为探针与水稻基因组总DNA杂交结果

M-Marker，hplr-hplr基因阳性对照，1、2、3-水稻基因组总DNA

图3水稻hpfr基因的核苷酸序列SEQ ID NO.1

图4水稻hpfr基因推导氨基酸序列SEQ ID NO.2

图5水稻hpfr基因构建于pET30a(+)上酶切电泳图

图6水稻hpfr蛋白质诱导烟草产生过敏反应

A-BL21(DE3)/pETR的粗蛋白质抽提物，

B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物 C-H₂O

图7水稻hpfr蛋白质SDS-PAGE电泳图

M-Marker，1.BL21(DE3)/pETR提取的CFEP，2.纯化的水稻hpfr蛋白质

图8BL21(DE3)/pETR表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV

图9水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄、辣椒促进生长

图10水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄减轻病毒病害发生

图11小麦hpfw基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3

图12小麦hpfw基因推导氨基酸序列SEQ ID NO.4

图13小麦hpfw蛋白质SDS-PAGE电泳图

图14小麦hpfw蛋白质诱导烟草产生过敏反应

A-BL21(DE3)/pETW的粗蛋白质抽提物，

B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物 C-H₂O

图15小麦hpfw蛋白质叶面喷施番茄促进生长

五、具体实施方式

实施例1

1.水稻hpfr基因的发现与克隆根据水稻黄单胞菌白叶枯病致病变种hrfA_Xoo基因开放阅读框设计水稻hpfr基因引物：

5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法从水稻中扩增出来源于水稻中hpfr基因。PCR扩增条件：94℃/5min的1个循环，94℃/45sec+60℃/45sec+72℃/45sec的35个循环，72℃/7min的1个循环。将该基因片段命名为hpfr基因(图1)。以水稻hpfr基因为探针，与水稻基因组总DNA杂交，杂交结果显示，在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。

2.水稻hpfr基因的体外表达

PCR产物纯化后经NdeI和BamHI酶切，连接于表达载体pET30a(+)上，获得重组质粒为pETR[pET30a(+)::hpfr](图5)。将pETR转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组微生物BLTR[BL21(DE3)/pET30a(+)::hpfr]，在将重组微生物BLTR的单菌落接种20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振荡培养12h，转接于20ml的LB+Km 20μg/ml中37℃下振荡培养3h，将1M的IPTG(TaKaRa公司)加入其中，使其终浓度为1mM，继续培养2h。离心(5000rpm，10min)收集菌体。菌体于100℃水浴煮沸10min，冷却后离心(12000rpm，10min)，取上清(Cell-free Elicitor Protein，CFEP)，注射烟草叶片叶肉组织细胞中，24h内产生过敏反应(图6)。取上清液3μl进行12％SDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，水稻hpfr蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。

3.实验室小计量生产水稻hpfr蛋白质

将重组微生物BLTR9的单菌落接种20ml的LB+Km20μg/ml中37℃下振荡培养12h，转接于5L的玉米粉发酵培养基(味精1％，酵母膏1％，玉米粉3.5％)+Km 20μg/ml中37℃下发酵培养3h，加乳糖(终浓度为10mM)诱导培养2h。离心(5000rpm，10min)收集菌体。菌体于100℃水浴煮沸10min，冷却后离心(12000rpm，10min)，取上清，即为水稻hpfr蛋白质。1L玉米粉发酵培养基大约可以产生1.5g hpfr蛋白质。

实施例2 水稻hpfr基因表达产物hpfr蛋白质的直接使用

水稻hpfr基因的表达产物hpfr蛋白质按15、30、60μg/ml的浓度对植物进行叶面喷洒。

1.诱导Xanthi烟草对TMV的抗性表型

将水稻hpfr和harpin_Xoo蛋白质的CFEP母液分别稀释至浓度为15、30、60μg/ml，用微型喷雾器喷施成株期珊西烟，每处理5个重复；16h后，用摩擦接种活化的TMV于烟草叶片上；4天后观测结果，并统计病斑数。研究结果表明，水稻hpfr和harpin_Xoo处理烟草，都有明显诱导烟草抗TMV的能力(枯斑数目上的减少)(图8)。经LSD法多重比较分析(F_189.464)表明，BL21(DE3)/pETR和BL21(DE3)/pET30a(+)::hrfA_Xoo的蛋白质抽提物处理与pET30(a)/BL21(DE3)蛋白质抽提物对照相比差异极显著(表1)。在浓度为60μL/mL时诱导抗病性效果最显著，水稻hpfr蛋白质的防效为96.35％，与harpin_Xoo防效(95.9％)相近。

2.促进植物生长，提高产量

将水稻hpfr蛋白质CFEP母液稀释至浓度为60μg/ml；在番茄、辣椒大棚，分别在苗期、花期和座果期喷施，研究结果表明，处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9)，采摘期提前1周左右水稻hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3％，辣椒提高31.6％。番茄上病毒病害发生明显减轻(图10)。

表1 BL21(DE3)/pETR9表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV的效果

^*：P<0.01水平上的差异显著性

来源于植物的与上述水稻hpfr基因的同源序列统一命名为hpfx基因，其特征在于，用实施例1水稻hpfr基因引物，以植物的基因组DNA为模板，用PCR方法(方法同实施例1)扩增出hpfx基因，其编码产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。hpfx基因所编码的产物统一命名为hpfx蛋白质。

下面实施例以小麦为例，从小麦中获得与水稻hpfr基因同源的基因为hpfw，表达产物为hpfw蛋白质。

实施例3小麦中与水稻hpfr基因同源hpfw基因克隆与表达

1.小麦hpfw基因克隆与核苷酸序列用设计引物：

5’-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3’和5’-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3’，用PCR方法(方法同实施例1)从小麦中扩增与水稻hpfr基因同源基因，命名为hpfw基因。hpfw基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3(图11)，大小为414bp，与水稻hpfr基因的同源性为93％。hpfw基因推导氨基酸序列为SEQ ID NO.4(图12)。

2.小麦hpfw基因的体外表达和小计量生产hpfw蛋白质(方法同实施例1)

将小麦hpfw基因连接于表达载体pET30a(+)上，获得重组表达载体pETW9[pET30a(+)::hpfw]，通过大肠杆菌BL21(DE3)表达的产物，命名为hpfw蛋白质。该经12％SDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，小麦hpfw蛋白质的分子量约为14.8kD(图12)。

3.小麦hpfw蛋白质的生物活性

小麦hpfw蛋白质注射烟草叶片叶肉组织细胞中，24h内激发烟草产生过敏反应(图13)；用该蛋白质喷雾处理番茄，结果表明，该蛋白质具有促进植物生长功能(图14)，同时，明显减少番茄早疫病的发生；用该蛋白质喷雾处理黄瓜，对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。

表2.小麦hpfw蛋白质对作物病害的防治效果(相对防效，％)

序列表

<110>南京农业大学

<120>水稻hpfr基因、表达产物及其应用

<130>说明书

<140>00

<141>2007-02-05

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>405

<212>DNA

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>gene

<222>(1)..(405)

<223>

<400>1

<210>2

<211>134

<212>PRT

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>水稻hpfr基因表达的氨基酸序列

<222>(1)..(134)

<223>富含苷氨酸

<400>2

<210>3

<211>414

<212>DNA

<213>小麦(Triticum aestivum)

<220>

<221>小麦hpfw基因

<222>(1)..(414)

<223>

<400>3

<210>4

<211>137

<212>PRT

<213>小麦(Triticum aestivum)

<220>

<221>小麦hpfw氨基酸

<222>(1)..(137)

<223>

<400>4

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>水稻hpfr基因引物左序列

<222>(1)..(33)

<223>

<400>5

<210>6

<211>31

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>水稻hpfr基因引物右序列

<222>(1)..(31)

<223>

<400>6

Claims

1、水稻hpfr基因，其序列为SEQ ID NO.1。

2、权利要求1所述水稻hpfr基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3、权利要求1所述水稻hpfr基因的表达产物，命名为hpfr蛋白质，该蛋白质的分子量为14.5kDa。

4、权利要求3所述水稻hpfr基因的表达产物在防治植物病害、促进作物生长方面的应用。