CN100396776C - 一种培育抗病小麦的方法及其专用基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培育抗病小麦的方法及其专用基因。本发明的用于培育抗病小麦的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。将该基因导入小麦中，能够显著提高小麦的纹枯病抗性。

Description

一种培育抗病小麦的方法及其专用基因

技术领域

本发明涉及一种培育抗病小麦的方法及其专用基因。

背景技术

抗菌肽是一类广泛存在于昆虫、动物和植物体内的小分子活性抗菌多肽。它分子量小，热稳定性好，具有广谱抗性(于健，邱芳萍，张玲.抗菌肽及其应用前景.长春工业大学学报[J]，2004，25(1)：65-67)。自从1975年瑞典科学家Boman从天蚕蛹中分离到抗菌肽天蚕素cecropin(BomanHG，Hultmark D.Cell-free immurityin insects[J].Ann Rev Microbiol，1987，41(2)：103-107)，大量抗菌肽已被逐渐发现、分离和利用。抗菌肽大体分为4类：杀菌肽(Cecropin)、蛙皮素(Magainin)、蜂毒素(Melitiny)和植保素(Defensin)。植保素(Defensin)是植物在长期进化过程中为抵御生物逆境而预存的一道天然屏障。迄今为止，已经从萝卜种子和叶片中分离到4种抗菌肽Rs-AFP，它们为富含胱氨酸的植保素，在体外均表现出不同程度的抗菌活性，其中Rs-AFP1、Rs-AFP2对于萝卜种子萌发过程中抵御真菌侵染起着重要作用(Terras F R G，Eggermont K，Kovaleva V，et al.Small cysteine-richantifungal proteins from radish：their role in host defense[J].PlantCell，1995，7：573-588)。体外实验表明，Rs-AFP1、Rs-AFP2对多种丝状病原真菌生长具有抑制作用，特别是Rs-AFP2在体外抑菌效果更强，能够强烈抑制小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)的菌丝生长(IC₅₀＝1-3μg/ml)，对粉色面包霉菌(Neurospora crassa)的菌丝生长也有较高的抑制活性(IC₅₀＝1μg/ml)，还对麦类德氏霉菌(Pyrenophora tritici-repentis)、稻瘟霉菌(Pyricularia oryzae)等具有广谱抗性(Spelbrink R G，Dilmac N，Allen A，et al.Differentialantifungal and Calcium Channel-Blocking activity among structurally relatedplant defensins[J].Plant Physiology，2004，8(135)：2055-1067)。2004年支大英等人用农杆菌介导法将Rs-AFP1基因转入小麦中，初步观察转基因株系表现出白粉病延迟发病或发病较对照明显减轻(支大英，徐春晖，薛哲勇，等.农杆菌介导AFP1基因转化小麦获得转基因植株[J].山东农业科学，2004(3)：14-16)。成熟的Rs-AFP1与Rs-AFP2蛋白的氨基酸序列除第5位和第27位外其他氨基酸相同，Rs-AFP1中第5位氨基酸为Glu，而Rs-AFP2第五位氨基酸为Gln，Rs-AFP1第27位氨基酸为Asn，而Rs-AFP2第27位氨基酸为Arg，Rs-AFP2具有更高的正电荷，显示出更高的抗真菌活性，特别是在高离子强度培养基中此现象尤为显著，而且Rs-AFP2的生物活性受Ca⁺⁺的影响很小(Terras F R G，Schoofs H M E，De Bolle MFC，et al.Analysis of two novel classes of antifungal proteins fromradish(Raphanus sativus L.)seeds[J].J.Biol.Chem，1992，267：15301-15309；Samblanx G W D，Goderis I J，Thevissen K.Mutational analysis of a plantdefensin from radish(Raphanus sativus L.)Reveals two adjacent sitesimportant for antifungal activity[J].J.Biol.Chem，1997，272(2)：1171-1179)。过量表达Rs-AFP2的转基因烟草明显抑制烟草赤星病(Alternarialongipes)(Terras F R G，Eggermont K，Kovaleva V，et al.Small cysteine-richantifungal proteins from radish：their role in host defense[J].PlantCell，1995，7：573-588)。

近年，随着肥水条件的改善和小麦产量水平的提高，小麦土传病害特别纹枯病在我国小麦生产区危害日益严重。小麦纹枯病又称小麦尖眼斑病(wheat sharpeyespot)，是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1和立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)AG4，AG5融合群引起的土传真菌病害。纹枯病一般可使小麦减产10％-20％，严重地块减产50％以上。据江苏省植保站统计，1995年全省小麦因纹枯病造成的损失达3.72×10⁶吨，超过江苏省当年小麦赤霉病和白粉病引起损失之和。据全国农技推广中心报道，2004年我国有1.2亿亩遭受纹枯病的危害，2005年小麦纹枯病发生面积达1亿亩。小麦纹枯病已对我国粮食安全构成严重威胁，成为小麦生产中亟待解决的重要问题。由于土传病害难以预测和预防，培育和利用抗病品种是防治小麦纹枯病最经济有效的措施之一。然而，纹枯病抗性是由多个基因控制的数量性状，小麦种属内抗源匮乏、遗传基础研究薄弱，常规育种进展缓慢。植物基因工程的发展为解决上述问题开辟了一条新途径。然而，关于利用基因工程获得抗纹枯病小麦的研究国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育抗病小麦的方法及其专用基因。

本发明所提供的用于培育抗病小麦的基因，名称为TaRs-AFP2，具有下述核苷酸序列之一：

(1)序列表中序列1的核苷酸序列；

(2)在高严谨条件下可以与序列表中序列1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

所述高严谨条件为在2×SSPE(或2×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜。

其中，序列表中序列1的核苷酸序列，由243个核苷酸组成，名称为TaRs-AFP2，自5′端第1-243位为编码序列。

本发明所提供的培育抗病小麦的方法，是将上述用于培育抗病小麦的基因导入小麦，筛选得到可表达所述用于培育抗病小麦基因的转基因植株，并进行抗病鉴定，得到抗病小麦。

所述用于培育抗病小麦的基因，可通过植物表达载体如Ti类质粒载体或病毒载体或其它重组表达载体导入小麦。

所述用于培育抗病小麦的基因，通过重组表达载体pUAFP2导入小麦；所述pUAFP2是将所述用于培育抗病小麦的基因插入pAHC25的限制性内切酶SmaI和SacI的识别位点间得到的重组表达载体。

所述含有用于培育抗病小麦的TaRs-AFP2基因的重组表达载体可通过基因枪法、使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化小麦细胞或组织。

所述含有用于培育抗病小麦的基因的重组表达载体优选通过基因枪法导入小麦。

所述方法中，是以小麦幼穗或幼胚为外植体，将含有用于培育抗病小麦的基因的重组表达载体导入小麦。

所述抗病小麦为抗纹枯病和/或白粉病小麦。

本发明用小麦偏爱密码子改造萝卜的Rs-AFP2基因得到用于培育抗病小麦的基因TaRs-AFP2，将TaRs-AFP2导入小麦，并对T0、T1代转基因植株进行分子检测和对T1代分子检测阳性植株接种纹枯病致病菌进行抗病鉴定，得到28株抗纹枯病小麦，其中2株还兼抗白粉病。

附图说明

图1为表达载体pUAFP2的构建图

图2为Sma I+Sac I酶切pAHC25电泳图谱

图3为Sma I+Sac I酶切pTAFP2电泳图谱

图4为重组表达载体pUAFP2酶切鉴定

图5为部分转pUAFP2小麦T₀代植株的Bar基因PCR检测图谱

图6为部分转pUAFP2小麦T₀代植株的TaRs-AFP2基因PCR检测图谱

图7为部分转pUAFP2小麦T₁代植株的TaRs-AFP2基因PCR检测图谱

图8为转pUAFP2小麦抗纹枯病检测照片

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、小麦偏爱的TaRs-AFP2基因获得及抗病小麦的培育

一、小麦偏爱的TaRs-AFP2基因获得和转化载体的构建

1、小麦偏爱的TaRs-AFP2基因获得

根据Terras等(Terras F R G，Schoofs H M E，De Bolle M FC，et al.Analysisof two novel classes of antifungal proteins from radish(Raphanus sativusL.)seeds[J].J.Biol.Chem，1992，267：15301-15309)发表的序列和小麦偏爱的密码子，设计小麦偏爱Rs-AFP2基因(序列2)，并在该基因的两端加上SmaI和SacI限制内切酶的酶切位点，进行人工合成、重组到pMD18-T vector上，转化到大肠杆菌细胞中，提取质粒和测序，将测序结果正确的小麦偏爱Rs-AFP2基因命名为TaRs-AFP2，该基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，将含有TaRs-AFP2的pMD18-T载体命名为pTAFP2。

2、转化载体的构建(载体构建过程如图1所示)

用限制内切酶Sma I和Sac I酶切质粒pTAFP2切下目的基因片段TaRs-AFP2，回收目的基因得到255bp的条带即为TaRs-AFP2，其酶切图谱如图3所示，图3中泳道M为PCR分子量标准；泳道1为Sma I+Sac I酶切pTAFP2质粒DNA。同时用SmaI和Sac I酶切下单子叶高效组成性表达载体pAHC25(载体pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米UBIQUITIN启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米UBIQUITIN启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子)的GUS基因，得到约7700bp的切去GUS基因的载体片段，其酶切图谱如图2所示，图2中泳道M为λDNA/HindIII双酶切分子量标准；泳道1为Sma I+Sac I酶切pAHC25质粒DNA。将上述切去GUS基因的载体片段回收，然后用T₄ DNA连接酶与TaRs-AFP2连接，转化大肠杆菌感受态细胞，经过单菌落蓝白斑筛选，选取阳性克隆重组质粒进行SmaI和SacI双酶切鉴定，结果如图4所示，将鉴定正确的含有TaRs-AFP2的pAHC25命名为pUAFP2，图4中，泳道M为PCR分子量标准；泳道1和泳道2为Sma I+Sac I酶切的重组表达载体pUAFP2质粒DNA。该pUAFP2载体中TaRs-AFP2基因表达受Ubiqutin组成性启动子控制，另外还具有1个受Ubiqutin启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续选择利用双丙胺膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性。

二、转pUAFP2小麦的获得

温室种植小麦品种扬麦12，采集授粉12-14天的未成熟种子，未成熟种子消毒后、取幼胚盾片向上，共1627个幼胚作为基因枪轰击的受体，接种于SD2(MS培养基的无机盐成分中添加维生素B1 1mg/L，天冬门酰胺150mg/L，2，4-D 2mg/L)或改良MS培养基(MS培养基添加2，4-D 2mg/L，谷氨酰胺500mg/L，水解酪蛋白100mg/L)上，置于26℃暗培养1周，1627个幼胚全部得到愈伤组织。将幼胚的愈伤组织集中于装有渗透压培养基(含0.4mol/L山梨醇和0.4mol/L甘露醇的MS培养基)的培养皿中，渗透压处理4-6h。经渗透压处理的幼胚愈伤组织，用BIO-RAD公司的PDS1000/He基因枪(金粉、pUAFP2质粒DNA浓度分别为45μg/枪、1μg/枪)进行轰击(psi1100，Hg27.5，轰击距离6cm)，轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。将愈伤组织转移到SD2或改良MS培养基，恢复培养2周，26℃，暗培养。恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(在1/2MS培养基中，添加NAA1mg/L+KT 1mg/L，Bialaphos 2mg/L)，24-26℃光照培养4-5周，将愈伤组织分化小苗转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基中添加Bialaphos 5mg/L)，24-26℃光照培养4-5周。经过2-3次Bialaphos筛选的转化小苗转移到壮苗培养基(1/2MS培养基中附加NAA 0.2mg/L，MET 0.5mg/L)上，待苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆，在可控温室生长发育。结果扬麦12获得了转pUAFP2植株316株，在移栽到温室3周以后，绝大部分植株成活，在三叶期成活的植株每株取1片叶提取基因组DNA。

由于载体pAHC25与Anand等(2003)(Anand A，Zhou T，Trick H N，et al.Greenhouse and field testing of transgenic wheat plants stably expressinggenes for thaumatin-like protein，chitinase and glucanase against fusariumgraminearum[J].Journal of Experimental Botany，2003，54(384)：1101-1111)文献描述的载体相同，所以根据此文献上发表的Bar基因序列合成了1对检测Bar基因的特异引物，预期扩增产物片段约450bp。

Bar基因PCR检测所用引物：

Bar-R：5’-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3’

Bar-F：5’-CCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCC-3’

扩增体系总体积为25μl，包含：1×PCR buffer(Mg²⁺-free，天为时代公司)，MgCl₂ 2.0mM，四种dNTP各0.2mM，引物Bar-R/Bar-F各0.4μM，1U TaqDNA聚合酶(天为时代公司)，模板DNA 400ng，补水至25μl。

扩增程序：94℃变性5min；94℃ 45sec，62℃ 45sec，72℃ 1min，45个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖EB凝胶电泳，紫外拍照。

TaRs-AFP2目的基因PCR检测所用引物是根据TaRs-AFP2基因序列和两端酶切位点序列设计的，预期扩增产物片段约249bp。

AFP-F：5’-GGGATGGCTAAGTTTGCTTCT-3’

AFP-R：5’-GAGCTCTTAACAAGGGAAATA-3’

扩增体系总体积为25μl，包含：1×PCR buffer(Mg²⁺-free，华美公司)，MgCl₂2.0mM，四种dNTP各0.2mM，引物AFP-R/AFP-F各0.4μM，1U Taq DNA聚合酶(华美公司)，模板DNA 200ng，补水至25μl。

扩增程序：94℃变性5min；94℃ 30sec，60℃/59℃/58℃/57℃/56℃，各一个循环45sec，72℃ 1min；94℃ 30sec，55℃ 45sec，72℃ 1min，35个循环；72℃10min。扩增产物经1％琼脂糖EB凝胶电泳，紫外拍照。

通过对表达载体上Bar基因和目的基因TaRs-AFP2的PCR检测，获得Bar基因和目的基因TaRs-AFP2检测均为阳性的T₀代转基因植株58株。证明同一载体上的筛选基因Bar基因和目的基因TaRs-AFP2是同时转入受体小麦扬麦12中，总的转化率达到3.56％。T₀代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T₁代。T₁代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T₂代。T₂代转基因植株所结的种子和由该种子长成的植株为T₃代。

部分转pUAFP2小麦T₀代植株的Bar基因PCR检测结果如图5所示，图5中，泳道M为100bp分子量标准；泳道P为质粒pUAFP2阳性对照；泳道1-8为转pUAFP2小麦植株；泳道9为非转pUAFP2小麦植株阴性对照。

部分转pUAFP2小麦T₀代植株的TaRs-AFP2基因PCR检测结果如图6所示，图6中，泳道M为100bp分子量标准；泳道P为质粒pUAFP2阳性对照；泳道1-11为转pUAFP2小麦植株；泳道12为非转pUAFP2小麦植株阴性对照。

对T₁代转pUAFP2小麦植株进行PCR检测TaRs-AFP2，部分结果如图7所示，结果表明，TaRs-AFP2基因已整合到小麦基因组中，能在小麦中遗传传递；图7中，泳道M为100bp分子量标准；泳道P为质粒pUAFP2阳性对照；其余泳道为转pUAFP2小麦T₁代植株。

三、对转pUAFP2小麦进行小麦纹枯病菌抗病性鉴定

在温室花盆种植如下小麦材料：68株T₁代转pUAFP2小麦和10株扬麦12，约4周(拔节-挑旗期)，用注射法接种小麦纹枯病菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)CAG-1的菌丝液10微升到小麦叶鞘部，然后用水保湿一次，隔一周喷一次水。在收获时考察叶鞘和茎秆的发病情况。病情分级标准按照李斯深等方法进行(李斯深，李安飞，李宪彬等.1997，小麦种质对纹枯病抗性鉴定初报.作物品种资源[J].(4)：31-33)

纹枯病病情分级标准为：

0：无病；

1：第1、2叶鞘发病，但茎秆无病；

2：第1、2叶鞘发病，但病斑绕茎秆小于1/3；

3：第3、4叶鞘发病，或病斑绕茎秆1/3-2/3；

4：第5、6叶鞘发病，或病斑绕茎秆2/3-1周；

5：出现枯、白穗或整株枯死。

在三叶期，每株取1叶片提取基因组DNA进行转入基因的PCR鉴定，并随后接种白粉病菌，菌种为温室采集的北京地区小麦白粉病菌(Erysiphegraminisf.sp.tritici)混合小种，采用活体摩擦结合抖落孢子的方法接种。接种2周后开始进行苗期和成株期的抗病鉴定。苗期以叶片上无孢子堆和坏死斑者定为高抗(0级)，叶片上有孢子堆者定为感病；成株期的抗病分级按照国际小麦玉米改良中心和国家标准(中华人民共和国国家标准农药田间药效试验标准(一)GB/T1798.22-200，杀菌剂防治禾谷类白粉病)分为9级。

结果表明，T1代转pUAFP2小麦中有28株全生育期对小麦纹枯病菌高抗(0级)(图8)，其中2株还兼免疫白粉病(0级)。杨麦12感纹枯病(3-4级)，高感白粉病(8级)。说明TaRs-AFP2基因在这些小麦中组成性表达能够赋予小麦对纹枯病等病害高度抗性。

序列表

<160>2

<210>1

<211>243

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggctaagt ttgcttctat catcgtcctt ctcttcgttg ctcttgtcgt ttttgccgct     60

ttcgaggaac caaccatggt ggaagcacag aagttgtgtc agaggccaag tggcacatgg    120

tcaggagtct gtggaaacaa taacgcatgc aagaatcagt gcatccgact tgagaaagca    180

cgacatgggt cttgcaacta tgtcttccca gctcacaagt gtatctgtta tttcccttgt    240

taa                                                                 243

<210>2

<211>255

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

cccgggatgg ctaagtttgc ttctatcatc gtccttctct tcgttgctct tgtcgttttt     60

gccgctttcg aggaaccaac catggtggaa gcacagaagt tgtgtcagag gccaagtggc    120

acatggtcag gagtctgtgg aaacaataac gcatgcaaga atcagtgcat ccgacttgag    180

aaagcacgac atgggtcttg caactatgtc ttcccagctc acaagtgtat ctgttatttc    240

ccttgttaag agctc                                                     255

Claims (10)

1.用于培育抗病小麦的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种培育抗病小麦的方法，是将权利要求1所述的用于培育抗病小麦的基因导入小麦，筛选得到可表达所述用于培育抗病小麦基因的转基因植株，得到抗病小麦。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述抗病小麦为抗纹枯病和/或白粉病小麦。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述用于培育抗病小麦的基因，通过重组表达载体pUAFP2导入小麦；所述pUAFP2是将所述用于培育抗病小麦的基因插入pAHC25的限制性内切酶SmaI和SacI的识别位点间得到的重组表达载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述用于培育抗病小麦的基因通过基因枪法导入小麦。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述用于培育抗病小麦的基因导入小麦的幼穗或幼胚。

7.根据权利要求2-6中任一所述的方法，其特征在于：所述小麦为扬麦12。

8.含有权利要求1所述的基因的表达载体。

9.含有权利要求1所述的基因的转基因细胞系。

10.含有权利要求1所述的基因的宿主菌。

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