CN100549028C

CN100549028C - 植物抗病相关蛋白rar1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN100549028C
Application number: CN 200610001354
Authority: CN
Inventors: 张增艳; 廖勇; 辛志勇; 徐惠君; 杜丽璞; 姚乌兰
Original assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Crop Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2006-01-19
Filing date: 2006-01-19
Publication date: 2009-10-14
Anticipated expiration: 2026-01-19
Also published as: CN101003570A

Abstract

本发明公开了一种植物抗病相关蛋白及其编码基因与应用。该植物抗病相关蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的基因可以转入单子叶或双子叶植物中提高植物的抗病性，为植物广谱抗病育种打下良好的工作基础。

Description

植物抗病相关蛋白RAR1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗病相关蛋白RAR1及其编码基因与应用，特别涉及一种来源于中间偃麦草的植物抗病相关蛋白RAR1及其编码基因与应用。

背景技术

寄主抗病反应是寄主抗病基因直接或间接产物和病原无毒基因直接或间接产物相互识别、活化一系列信号基因表达、启动寄主防卫反应的结果。抗病反应最常见的方式是：通过植物抗病基因与病原的相互识别作用，通过一些信号分子的作用，激发活性氧爆发，产生活性氧中间物(reactive oxygen intermediates，ROI)及过敏反应(hypersensitive reaction，HR)，首先导致寄主植物在侵染点发生过敏反应(hypersensitive reaction，HR)，侵染部位细胞程序化死亡(programmed celldeath，PCD)(Dangl J L，Jones JDG.2001，Plant pathogens and integrateddefence responses to infection.Nature，411：826-833)，使病原菌不易获取养分，同时诱导周围细胞合成抑制病原菌生长的物质，从而限制了活体营养型的病原菌的生长繁殖(Hammond-Kosack K E，Jones J D G.1996，Resistance gene-dependentplant defence response.Plant Cell，8：1773-1791)。植物受病原菌侵染后局部发生超敏反应(HR)，会产生一些信号分子，诱发整个植株防卫基因的表达，随后延伸到远端组织产生系统获得抗性(system acquired resistance，SAR)，从而使植物对更多的病原菌产生抵抗作用。

RAR1是最早报道的植物防卫信号蛋白，首次从大麦抗白粉病基因Mla12介导的抗病信号途径中分离的一个重要信号元件(J.H.1988，Geneticanalysis of barley mutants with modifications of powdery mildew resistancegene Mla12.Genome，30，129-132)。RAR1编码一个大约25.5kD的锌结合蛋白，包含有两个由60个氨基酸组成的两个锌结合域(zine-bindind domains)CHORD-I和CHORD-II(cysteine and histidine-rich domain)。除了酵母外，这种串连的结构在原生动物、植物和后生动物中是高度保守的。近年研究发现拟南芥、大麦、烟草、番茄等的多个抗病(R)基因激活防御反应时需要RAR1介导。RAR1的功能定位于R基因与另一个抗病信号传导基因SGT1之间、活性氧激发之前，在植物抗病防御反应中，可激发一系列的防卫基因的表达，产生SAR，启动植物的全面防卫反应，使植物表现抗病性(Holt BF，Belkhadir Y，Dangle J l.2005，Antagonistic controlof disease resistance protein stability in plant immune system.Science，309：929-932)。在拟南芥中，RAR1对多个TIR-NBS-LRR抗病蛋白赋予的抗性是必需的。2002年Peart等人进一步研究了RAR1在烟草抗病反应中的功能，发现RAR1对于烟草抗花叶病毒基因N介导的对TMV抗性以及多个其它抗性蛋白所赋予的抗病反应都是必需的。Hein等(Hein I，Barciszewska-Pacak M，Hrubikova K，WilliamsonS，Dinesen M，Soenderby IE，Sundar S，Jarmolowski A，Shirasu K，Lacomme C.2005，Virus-induced gene silencing-based functional cha-racterization ofgenes associated with powdery mildew resistance in barley.Plant Physiol，138(4)：2155-64)发现RAR1与SGT1、HSP90是大麦抗白粉病基因Mla13介导的抗病途径中很重要的信号元件。Scofield等(Scofield SR，Huang L，Brandt AS，GillBS.Development of a virus-induced gene-silencing system for hexaploid wheatand its use in functional analysis of the Lr21-mediated 1eaf rust resistancepathway.Plant Physiol，2005，138(4)：2165-73)证明RAR1、SGT1和HSP90三个基因在小麦抗叶锈病基因Lr21介导的抗病途径中也是必须的。在大麦MLO/mlo-5介导的RAR1突变体研究中，发现在大麦受稻瘟病菌侵染不同时期，在表皮和叶肉检测到了RAR1基因的表达，并对抗病性有所贡献(Jarosch B，Collins NC，ZellerhoffN，Schaffrath U.RAR1，ROR1，and the actin cytoskeleton contribute to basalresistance to Magnaporthe grisea in barley.Mol Plant Microbe Interact.2005，18(5)：397-404)。上述结果提示我们，RAR1在小麦广谱抗病基因工程中是潜在的可利用的重要信号元件。

目前各种真菌、病毒、细菌病害常会导致重要农作物产量与品质的降低，是制约重要农作物生产的重要因素。小麦白粉病、条锈病等气传真菌病害、小麦纹枯病、赤霉病等土传真菌病害和病毒病害在我国小麦主产区的为害日益严重，轻则造成小麦减产20-30％，重则减产40-50％，甚至绝收。培育抗病品种是防治上述病害的首推途径。由于病原菌生理小种的变异，常使寄主抗病基因丧失抗性。因此，从免疫或高抗多种病害的植物中克隆重要抗病信号传导基因RAR1，应用于广谱抗病基因工程，诱导植物产生SAR，使植物对多种病原产生抗性，将解决上述问题。该策略从理论上讲应该比导入单一抗病基因更有效。

小麦近缘植物中间偃麦草，具有许多对小麦改良有益的重要基因，如具有抗小麦锈病、白粉病、赤霉病、病毒病、纹枯病等特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗病相关蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的植物抗病相关蛋白，名称为TiRAR1，来源于中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)，是具有下述氨基酸序列之一的蛋白质：

1)序列表中的SEQ ID №：2的氨基酸残基序列；

2)将序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2是由229个氨基酸残基组成，分子量为25kd，自序列2的氨基端第14-77位氨基酸残基和自序列2的氨基端第164-225位氨基酸残基为2个锌结合域CHORD-I和CHORD-II，为高度保守的胱氨酸、组氨酸富集结构域。

上述植物抗病相关蛋白的编码基因(TiRAR1)也属于本发明的保护范围。

上述植物抗病相关蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID №：2蛋白质序列的多核苷酸；

3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

上述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

其中序列表中序列1是由690个脱氧核苷酸组成，自5′端的第1位到第690位脱氧核苷酸为编码序列(ORF)。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明的TiRAR1基因可用现有的方法构建到现有的植物表达载体中，可在其转录超始核苷酸前加上包括组成型启动子、增强启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、发育阶段特异性启动子在内的任何一种启动子。为了便于对转TiRAR1基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(Bar基因、GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草或苜宿等。携带有本发明的TiRAR1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株，获得抗病性提高的植株。

实验结果表明，在白粉病菌诱导下TiRAR1的表达增强。将TiRAR1基因的完整表达序列(ORF)取代单子叶组成性表达载体pAHC25中GUS基因序列，构建了单子叶植物高效表达的转基因载体pURAR1，使该基因能在载体的Ubi启动子驱动下表达；通过转基因载体pURAR1将TiRAR1导入小麦，检测转基因小麦的抗病性，表明TiRAR1可提高小麦对白粉病菌的抗性。本发明的基因还可以转入其他单子叶或双子叶植物中提高植物的抗病性，为植物广谱抗病育种打下良好的工作基础。

附图说明

图1为从白粉病菌诱导的中间偃麦草中扩增TiRAR1基因片段的电泳图

图2为通过GenBank的BLASTP获得的结构图

图3为白粉病菌诱导的中间偃麦草TiRAR1表达分析图谱

图4为单子叶组成型表达载体pURAR1构建示意图

图5部分转基因植株中转化载体上筛选基因Bar的PCR检测

图6部分转基因植株中目的基因TiRAR1的PCR检测

图7为转pURAR1基因的小麦植株和对照植株接种白粉病的发病情况照片

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

T0表示由基因枪得到的转基因植株，T1表示T0代自交产生的种子及由它所长成的植株。

实施例1、TiRAR1全长cDNA的获得

将生长四周的中间偃麦草的叶片接种白粉病菌，24小时后，用TRIZOL的方法提取叶片的总RNA，按照大连宝生物公司提供的方法合成cDNA第1条链，并用其作为模板进行PCR扩增。根据大麦，水稻，拟南芥，烟草RAR1基因保守区段和具有同源性的小麦EST设计一对引物RAR1-F：5′-ATGTCGGCGGAGACGGAGA-3′和RAR1-R：5′-TCACACAGCATCGGCATTG-3′，PCR反应总体积为25μL，包括2μL cDNA(50ng)，100μmol/L dNTP，0.4μmol/L每条引物，1U Hotstar Taq酶及1×Ex PCR缓冲液(均购自大连宝生物公司)。PCR反应程序为：先95℃预变性5min；然后95℃ 30s，60℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃，10min补平末端。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离。结果如图1所示，结果表明，从接种白粉病菌的中间偃麦草cDNA中扩增出一条带，大约700bp。图1中泳道1和2为扩增的条带；M为DNA分子量标准(购自华美生物工程公司)；箭头指的条带大小为690bp RAR1基因。将此条带回收，克隆到pMD18-T载体(大连宝生物公司)上。经过菌落PCR分析后，挑选3个阳性克隆进行测序分析。测序分析结果表明，该PCR扩增产物具有序列表中序列1的全长ORF的核苷酸序列，将其命名为TiRAR1。TiRAR1开放阅读框(编码序列)为自序列表中序列1的5′端的第1位至第690位核苷酸序列，编码229个氨基酸(序列表中序列2)。将获得TiRAR1基因全长ORF序列编码的氨基酸序列在NCBI进行GenBank的BLASTP比较和结构域分析。结果如图2所示，结果表明，TiRAR1基因编码的蛋白TiRAR1具有2个锌结合域(zine-bindind domains)CHORD-I和CHORD-II，自序列表中序列2的氨基端第14位到第77位氨基酸残基为CHORD-I结构域；自序列表中序列2的氨基端第166位到第225位氨基酸残基为CHORD-II结构域。

实施例2、TiRAR1基因的表达特性检测

将生长四周的中间偃麦草的叶片，分别接种白粉病菌0，6，12，24，48小时后，用Trizol方法提取叶片的总RNA，用DNaseI酶解、纯化RNA，反转录成cDNA。先用组成性表达的Actin基因引物扩增各样品RNA，调整扩增模板mRNA/cDNA的起始浓度一致(即均一化)，然后以TiRAR1的引物RAR1-F和RAR1-R进行RT-PCR扩增，扩增产物进行凝胶分析。分析结果如图3所示，结果表明TiRAR1基因的转录表达受白粉病菌的诱导，在正常条件下，TiRAR1有微量表达，白粉病菌侵染6小时后，TiRAR1基因的表达量开始增加，在侵染12小时达到最大值。说明在白粉病菌诱导下TiRAR1的表达增强。

实施例3、转TiRAR1基因小麦植株的获得及其抗病性分析

以基因的cDNA为模板，用带有SmaI和SacI酶识别位点的引物：上游引物RAR-FS：5′TTCCCGGGATGTCGGCGGAGACGGAGA-3′(下划线标出的序列表示SmaI酶识别位点)，下游引物RAR-RS：5′-CCTCACACAGCATCGGCATTG-3′(

标出的序列表示SacI酶识别位点)；进行PCR扩增(PCR反应程序为：先95℃预变性5min；然后95℃30s，60℃1min，72℃1min，35个循环；最后72℃，10min补平末端)，获得加SmaI和SacI位点的TiRAR1基因全长ORF，回收扩增产物，连接到pMD18-T载体上，经测序表明该重组载体为含有TiRAR1基因的pMD18-T，将其命名为pTRAR1。将pTRAR1用SmaI和SacI酶切，回收TiRAR1基因片段，将TiRAR1基因构建到单子叶植物表达载体pAHC25的SmaI和SacI酶切识别位点之间，(载体pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米UBIQUITIN启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米UBIQUITIN启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子)，结果使TiRAR1基因替代单子叶植物表达载体pAHC25中GUS基因，形成载体pURAR1(Ubi::RAR1)，TiRAR1受Ubi启动子控制，把经过测序鉴定、含有TiRAR1基因的全长ORF、插入方向正确的载体命名为pURAR1(构建过程如图4所示)。该载体还具有1个受Ubi启动子控制的Bar基因表达盒，可为后续工作中利用除草剂双丙氨膦(Bialaphos)筛选转化再生植株提供抗性。

用基因枪将pURAR1轰击到小麦品种杨麦11和杨麦12的愈伤组织，选取了小麦品种杨麦11和杨麦12的幼胚愈伤组织共3044个作为基因枪轰击的受体，轰击后的愈伤组织在渗透压培养基上后处理16h。将愈伤组织转移到SD2(MS培养基的无机盐成分中添加VB₁1mg/L，天冬门酰胺150mg/L，2，4-D2mg/L)，26℃，暗培养，恢复培养2周。将恢复培养后的愈伤组织转移到分化筛选培养基中(1/2MS培养基中附加：NAA 1mg/L+KT 1mg/L，Bialaphos2-5mg/L)，24-26℃光照培养14d，将愈伤组织分化小苗后转移到生长筛选培养基中(1/2MS培养基+Bialaphos 2-3mg/L)，24-26℃光照培养。获得了265株再生植株。经过2-3次Bialaphos筛选的转化小苗转移到壮苗培养基(1/2MS培养基附加：0.5mg/L NAA)上，将苗高7-8cm且根系发达的转化苗移栽到花盆，在移栽到温室3周以后，有230株植株成活，其中转基因的杨麦11植株12株，其余为转基因的杨麦12株.提取成活的小麦叶片基因组DNA，对转化载体上Bar基因和目的基因TiRAR1进行PCR检测。

Bar基因PCR检测所用引物：

Bar-R：5’-CTTCAGCAGGTGGGTGTAGAGCGTG-3’

Bar-F：5’-CCTGCCTTCATACGCTATTTATTTGCC-3’

总体积25μl的扩增体系：10×PCR buffer 2.5μl，MgCl₂ 2mmol/L，dNTPs0.2mmol/L each，引物Bar-R/Bar-F各0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶(天为时代公司)1U，模板DNA约400ng，补水至25μl.

扩增程序：94℃变性5min；94℃45sec，62℃45sec，72℃1min，45个循环；72℃10min。扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外拍照(图5)。Bar基因PCR检测部分结果如图5所示，扩增得到450bp的Bar基因条带的植物为阳性的转基因植物。图5中M为100bp分子量标准；泳道1为质粒pURAR1中切下的Bar基因片段；泳道2-9为转基因后检测为阳性的植株；泳道10，11为转基因后检测为非阳性的植株；泳道12为ddH₂O。

目的基因RAR1 PCR检测所用引物：

RAR1-F′：5’-TACCCGGGATGTCGGCGGAGACGGAG-3’

RAR1-R′：5’-CGGAGCTCTCACACAGCATCGGCATTG-3’

总体积25μl的扩增体系：10×PCR buffer 2.5μl，MgCl₂2mmol/L，4种dNTPs各0.2mmol/L，引物RAR1-R′和RAR1-F′各0.3μmol/L，Taq DNA聚合酶(大连宝生公司)1U，模板DNA约200ng，补水至25μl.

扩增程序(touch down)：94℃变性5min；94℃变性45sec，62℃/61℃/60℃/59℃/58℃/57℃/56℃/55℃，各一个循环45sec，72℃延伸1min；94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物1％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外拍照。

目的基因TiRAR1部分PCR检测结果如图6所示，扩增得到708bp的含有TiRAR1基因条带的植物为阳性的转基因植物，图6M为100bp分子量标准；泳道1为质粒pURAR1中切下的TiRAR1基因片段；泳道2-9为转基因后检测为阳性的植株；泳道10-11为转基因后检测为非阳性的植株；泳道12为ddH₂O。

Bar基因检测和TiRAR1基因检测结果均为阳性的植株为23株，总的转化率为0.76％。

将上述Bar基因和TiRAR1基因PCR检测结果均为阳性的植株在温室生长发育，收获PCR检测阳性的T0种子。

收获的T0代PCR检测阳性的转pURAR1基因的小麦种子，打破休眠后，种植于温室，在三叶期再次接种白粉病菌种，三叶期每株取1叶片提取基因组DNA进行PCR检测，然后在三叶期接种白粉病菌种，菌种为温室采集的北京地区小麦白粉病菌(Erysiphe graminisf.sp.tritici)混合小种，采用活体摩擦结合抖落孢子的方法接种。2周后开始进行苗期和成株期的抗病鉴定。苗期以叶片上无孢子堆和坏死斑者定为高抗(0级)，叶片上有孢子堆者定为感病；成株期的抗病分级按照国际小麦玉米改良中心和国家标准(中华人民共和国国家标准农药田间药效试验标准(一)GB/T1798.22-200，杀菌剂防治禾谷类白粉病)分为9级。结果表明，在T1代转pURAR1杨麦12中有22株目的基因TiRAR1和BAR基因PCR检测为阳性，SOUTHERN杂交带为1-3条，结果为阳性，说明TiRAR1基因已经从T0代植株中传递到T1代植株中，并整合到小麦基因组中，转pURAR1杨麦12的T1代植株16株全生育期对温室白粉病混合小种高抗(0级)(图7)，杨麦12高感白粉病(8级)，说明TiRAR1基因在这些小麦中组成性表达能够赋予小麦对白粉病混合菌株高度抗性。

序列表

<160>2

<210>1

<211>690

<212>DNA

<213>中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)

<400>1

atgtcggcgg agacggagaa gagcgccgcc gcgcccgcgc ccatgcggtg ccagcgcata 60

ggctgcgacg ccacgttcac cgacgacgac aaccccgacg gctcctgcca ctaccacccc 120

tccggaccta tgtttcatga tggcatgaaa gagtggagct gttgcaagca aagaagccat 180

gattttagct tatttttggc tattcctgga tgcgccacag ggaagcatac aactgagaaa 240

ccagtcacaa aagctgtttc tcttaactca aaggcaaccc taccaaagtc agctccaatc 300

cagtcttcta agcagggtgt ggaaactgag gcctgctcca ggtgccgtca gggtttcttt 360

tgctccgacc atggatcaca gcccaaggca caaaaaccag ctgctttaaa tggtacaaat 420

acggaacctg tccagaaagg ctcagttcca cagcccaaga aaaaagttgt taatataaat 480

gagcctaggg tttgtaagaa taaagtatgt ggtaaaacct acaaggagaa ggataaccat 540

gatgctgcat gcgaatacca tccaggtcca gcagttttcc atgataggaa tagagggtgg 600

aagtgttgcg atgtccacgt caaggagctt gacgaattta tggagatacc tccatgcaca 660

aaggggtggc acaatgccga tgctgtgtga 690

<210>2

<211>229

<212>PRT

<213>中间偃麦草(Thinopyrum intermedium)

<400>2

Met Ser Ala Glu Thr Glu Lys Ser Ala Ala Ala Pro Ala Pro Met Arg

1 5 10 15

Cys Gln Arg Ile Gly Cys Asp Ala Thr Phe Thr Asp Asp Asp Asn Pro

20 25 30

Asp Gly Ser Cys His Tyr His Pro Ser Gly Pro Met Phe His Asp Gly

35 40 45

Met Lys Glu Trp Ser Cys Cys Lys Gln Arg Ser His Asp Phe Ser Leu

50 55 60

Phe Leu Ala Ile Pro Gly Cys Ala Thr Gly Lys His Thr Thr Glu Lys

65 70 75 80

Pro Val Thr Lys Ala Val Ser Leu Asn Ser Lys Ala Thr Leu Pro Lys

85 90 95

Ser Ala Pro Ile Gln Ser Ser Lys Gln Gly Val Glu Thr Glu Ala Cys

100 105 110

Ser Arg Cys Arg Gln Gly Phe Phe Cys Ser Asp His Gly Ser Gln Pro

115 120 125

Lys Ala Gln Lys Pro Ala Ala Leu Asn Gly Thr Asn Thr Glu Pro Val

130 135 140

Gln Lys Gly Ser Val Pro Gln Pro Lys Lys Lys Val Val Asn Ile Asn

145 150 155 160

Glu Pro Arg Val Cys Lys Asn Lys Val Cys Gly Lys Thr Tyr Lys Glu

165 170 175

Lys Asp Asn His Asp Ala Ala Cys Glu Tyr His Pro Gly Pro Ala Val

180 185 190

Phe His Asp Arg Asn Arg Gly Trp Lys Cys Cys Asp Val His Val Lys

195 200 205

Glu Leu Asp Glu Phe Met Glu Ile Pro Pro Cys Thr Lys Gly Trp His

210 215 220

Asn Ala Asp Ala Val

225

Claims

1、一种植物抗病相关蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2、权利要求1所述的植物抗病相关蛋白的编码基因。

3、根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述植物抗病相关蛋白的cDNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4、含有权利要求2或3所述基因的表达载体。

5、含有权利要求2或3所述基因的细胞系。

6、含有权利要求2或3所述基因的宿主菌。

7、权利要求1所述的植物抗病相关蛋白及其编码基因在提高植物抗病性中的应用；所述抗病性为白粉病抗性。

8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述提高植物抗病性为提高小麦的白粉病抗性。