CN117660515A - VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用，属于土传病害防治技术领域，VdFtr1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供的VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用，首次揭示VdFtr1基因在大丽轮枝菌中的作用，并证实VdFtr1基因对大丽轮枝菌菌丝生长、微菌核形成、致病力有显著的正向作用；可以为大丽轮枝菌引起的黄萎病的有效防治、为保证农民稳产提供新的策略；可以为作物的基因抗性育种提供理论依据，为黄萎病抗性育种的早日实现贡献力量。

Description

VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用
技术领域
本发明涉及土传病害防治技术领域，尤其是涉及VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用。
背景技术
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是土传真菌病原中最具代表性的种类之一，它从根部侵染定植在植物维管组织中，从而引起植物的黄萎病。大丽轮枝菌是寄主范围最为宽泛的植物病原真菌之一，可以侵染200多种农作物，其中包括世界最主要的纤维作物—棉花、第二大油料作物—向日葵以及第四大粮食作物—马铃薯等一系列关系国计民生的重要作物。大丽轮枝菌引起的作物黄萎病每年造成的损失触目惊心，仅棉花一项，每年在我国的直接经济损失就高达200亿元。由于危害巨大、防控困难，至今该菌都被我国海关总署列为重要的植物病原检疫对象。
作物黄萎病长期以来被学界和民间称为“作物的癌症”，其可持续的防控一直以来都面临着巨大挑战，究其原因主要有以下几点：
(1)大丽轮枝菌在土壤中生活，无法实现像气传病害一样在侵染前期和初期等最佳防治时期，大面积使用化学农药进行有效防治；(2)大丽轮枝菌可以形成抗逆性强的休眠结构—微菌核，微菌核可以在没有寄主的情况下存活10年以上，并且一旦定植很难彻底根除，这就造成长期以来以轮作倒茬为代表的农业防治措施效果不理想；(3)大丽轮枝菌在与寄主的协同进化、异核融合下，表现出极强的侵染能力，并不断产生新的致病类型；(4)尽管水旱轮作对黄萎病的防控效果明显，但我国水稻种植和棉花、向日葵、马铃薯等的种植区域重合度很低，不具备实际可操作性；(5)目前尚未找到棉花、向日葵、马铃薯等大宗易感作物的黄萎病抗原，抗原依赖型的传统育种或抗病基因依赖性的分子育种进展不尽如人意(参考中国科学院微生物所“与植物病原菌的斗争—大丽轮枝菌篇”)。
大丽轮枝菌的菌丝体初无色，有分隔，老熟时加粗变褐，大多能产生黑色微菌核，菌丝上生长直立无色的轮状分生孢子梗，一般为2-4轮生，每轮着生3-5个小枝，多者为7枝，呈辐射状。分生孢子呈现卵圆形，单细胞，大小不一。在PDA平板培养基上大丽轮枝菌的菌落颜色表面为白色、黑色和灰黑色三种类型，底部为黑色或淡褐色，为微菌核，并多数带有辐射状皱褶条纹。
微菌核是由菌丝特化形成的菌组织结构，主要由两种不同类型的细胞即拟薄壁组织和疏丝组织所组成，其中沉积在拟薄壁组织中的黑色素用于保护菌丝体细胞免受外界不良环境的影响。已有研究结果表明，微菌核形成的最初阶段是单根或数根菌丝体膨大，并产生大量的隔膜，然后具有隔膜的细胞继续增大，成为球状并产生侧芽，最后外层菌丝细胞膨大，分泌出黑色素(Melanin)，填充在细胞间隙。大量黑色素颗粒成纤维状包裹在菌丝的细胞壁上，最外层菌丝细胞自溶形成紧密结构，即形成成熟的微菌核。微菌核能保护大丽轮枝菌度过低温等严酷的外界环境。
发明内容
本发明的目的是提供VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用，以为由大丽轮枝菌造成的作物黄萎病的有效防治贡献力量。
为实现上述目的，本发明提供VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用，VdFtr1基因在大丽轮枝菌中的作用，VdFtr1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
进一步地，VdFtr1基因对大丽轮枝菌菌丝营养生长、微菌核形成及致病性具有正向调控作用。
一种如上所述的VdFtr1基因在土传真菌病害防治中的应用，所述土传真菌病害为大丽轮枝菌引起的植物病害。
本发明提供的VdFtr1基因对大丽轮枝菌菌丝的营养生长、微菌核形成及致病性具有正向的调控作用：
①敲除VdFtr1基因的大丽轮枝菌基本不能形成微菌核，显微镜下观察发现敲除VdFtr1基因的大丽轮枝菌基本丧失了形成微菌核的能力，说明VdFtr1基因可以促进大丽轮枝菌微菌核的形成；
②敲除VdFtr1基因的大丽轮枝菌菌株生长速度显著慢于野生型和回补菌株；敲除VdFtr1基因的大丽轮枝菌的产孢量显著低于野生型和回补菌株，说明敲除VdFtr1基因能降低大丽轮枝菌的产孢能力；
③野生型菌株的过氧化氢含量随培养时间的增加而增加，但敲除VdFtr1基因的大丽轮枝菌的过氧化氢含量不会随时间的增加而改变，一直处于稳定的低水平状态，说明VdFtr1的缺失会降低大丽轮枝菌过氧化氢的含量，从而抑制微菌核的形成；
④伤根接种向日葵幼苗实验发现，接种敲除VdFtr1基因的菌株的向日葵幼苗健康程度明显好于接种野生型和回补菌株的向日葵幼苗，病情指数统计结果表明敲除菌株的致病力较野生型菌株显著下降，病情指数介于20.35～23.55之间，相比野生型的45.50下降了48.24％～55.27％，qPCR验证野生型菌株、敲除菌株ΔVdFtr1和回补菌株ComVdFtr1在向日葵茎基部上的定植数量，表明VdFtr1基因缺失后，敲除菌株的定植能力相比野生型菌株显著下降。
因此，本发明提供的VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用，其具体技术效果如下：
(1)本发明首次揭示VdFtr1基因在大丽轮枝菌中的作用，并证实VdFtr1基因对大丽轮枝菌菌丝生长、微菌核形成、致病力有显著的正向作用；
(2)本发明可以为大丽轮枝菌引起的黄萎病的有效防治、为保证农民稳产提供新的策略；
(3)本发明可以为作物的基因抗性育种提供理论依据，为黄萎病抗性育种的早日实现贡献力量。
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例二中敲除载体的PCR验证结果；
图2是实施例五中回补载体的PCR验证结果；
图3是实施例七中敲除菌株(A部分)、实施例八中回补菌株(B部分)的验证结果，；
图4是效果例一中野生型菌株、回补菌株和敲除菌株的菌落照片；
图5是效果例一中野生型菌株、回补菌株和敲除菌株的菌落直径统计结果；
图6是效果例二中VdFtr1基因对大丽轮枝菌产孢量的影响考察结果；
图7是效果例三中VdFtr1基因对大丽轮枝菌微菌核形成过程的影响考察结果；
图8是效果例四中VdFtr1基因对大丽轮枝菌过氧化氢含量的影响考察结果；
图9是效果例五中VdFtr1基因对大丽轮枝菌致病力的影响考察结果，其中A部分为接种野生型菌株、回补菌株和敲除菌株的向日葵幼苗照片；B部分为接种野生型菌株、回补菌株和敲除菌株的病情指数统计结果；C部分为野生型菌株、回补菌株和敲除菌株在向日葵基部的定植数量统计结果。
具体实施方式
以下通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
为了使得本申请的目的、技术方案及优点更加明确、透彻和完整，下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。以下详细说明均是实施例的说明，旨在对本发明提供进一步详细说明。除非另有指明，本发明所采用的所有技术术语与本申请所属领域的一般技术人员通常理解的含义相同。
实施例中所用的仪器设备、试剂材料无特别说明的，均通过商业途径获得。
大丽轮枝菌VdGn3、农杆菌感受态LBA4404和大肠杆菌Trans1-T1感受态购自北京全式金生物技术有限公司；pUCATPH(含潮霉素抗性基因，潮霉素磷酸转移酶基因Hph)由山东聊城大学赵培宝教授惠赠，pCAMBIA1300-XR为申请人改造的载体，pKN-cmpacC由华中农业大学李国庆教授惠赠。
向日葵品种为食葵杂交种LD5009购自北京凯福瑞种业公司。
实施例中所用的培养基的配方为：
PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g，蒸馏水定容至1L，0.22μm滤膜除菌即可。
LB液体培养基：酵母提取物5g、胰蛋白胨10g、NaCl 10g、蒸馏水定容至1000mL。
LB固体培养基：
诱导培养基(IM)：在MM培养基中加入MES 7.8g、Glycerol 5mL，定容至1000mL，pH调至5.6。
基本培养基(MM)：K2PO42.05g、KH2PO41.45g、MgSO4·7H2O 0.5g、(NH4)2SO40.5g、NaCl 0.15g、CaCl20.051g、EDTA-Na2·7H2O 0.00375g、FeSO4·7H2O 0.0025g、Glucose 2g，定容至1000mL，pH调至5.8至6.0之间。
共培养培养基(CM)：在IM中加入20g琼脂，定容至1000mL。
筛选培养基(SM)：在MM中加入20g琼脂，定容至1000mL。
BM培养基：葡萄糖5g、NaNO30.2g、KCl 0.52g、MgSO4·7H2O 0.52g、K2HPO41.52g、0.01％维生素B110mL、0.001％维生素B7100μL，蒸馏水定容至1L，0.22μm滤膜除菌即可。
实施例一
提取大丽轮枝菌DNA，采用CTAB法，具体步骤如下：
(1.1)将大丽轮枝菌野生型菌株VdGn3在PDA培养基上培养7d后，用盖玻片刮取0.1g菌丝于2mL离心管中，加入6mm小钢珠，液氮速冻完全后置于组织研磨仪中2min研至粉末。
(1.2)加入1mL的2％CTAB抽提缓冲液，摇匀后置于65℃中水浴30min，每隔10min轻微的上下晃动2～3次。
(1.3)从水浴锅中拿出离心管后冷却2min，依次加入960μL氯仿和40μL异戊醇，剧烈摇晃后静置10min。
(1.4)4℃，12000rpm离心10min，吸取上清600μL至1.5mL离心管中，加入600μL异丙醇，混匀后放置在-20℃冰箱中30min。
(1.5)取出后4℃，12000rpm离心10min，弃上清，留沉淀，用700μL 75％乙醇清洗沉淀两次，待沉淀完全干燥后溶解于40μL 65℃预热的ddH2O中。
(1.6)待沉淀完全溶解后加入1μL RNA酶，-20℃冰箱保存备用。
实施例二
构建VdFtr1基因敲除载体，采用无缝克隆法进行，具体步骤如下：
(2.1)将含有pCAMBIA1300-XR质粒的大肠杆菌接种于含有50mg/L的卡那霉素的LB液体培养基中，含有pUCATPH质粒和pKN-cmpacC质粒的大肠杆菌接种于含有50mg/L的氨苄霉素的LB液体培养基中，均于37℃，220rpm条件下振荡培养12h后收集菌体，用质粒提取试剂盒分别提取质粒。
(2.2)以实施例一提取的大丽轮枝菌野生型菌株VdGn3的DNA为模板，以同源臂扩增引物VdFtr1-AF(序列如SEQ ID NO:2所示)和VdFtr1-AR(序列如SEQ ID NO:3所示)扩增VdFtr1基因(序列如SEQ ID NO:1所示)的上游1100bp的同源臂片段，以同源臂扩增引物VdFtr1-BF(序列如SEQ ID NO:4所示)和VdFtr1-BR(序列如SEQ ID NO:5所示)扩增VdFtr1基因的下游1000bp的片段。
以pUCATPH质粒为模板，以Hph-F(序列如SEQ ID NO:6所示)和Hph-R(序列如SEQID NO:7所示)为引物扩增潮霉素磷酸转移酶基因(Hph)片段。扩增体系均如表1所示，扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物-20℃保存备用。
表1
引物F/R 各1μL
5×PrimeSTARBuffer 5μL
dNTPMixture 2μL
PrimeSTARHSDNAPolymerase 0.5μL
模板DNA 1μL
ddH2O 14.5μL
共25μL
(2.3)将pCAMBIA1300-XR质粒用BamHI进行单酶切，胶回收线性化质粒。酶切体系如表2所示。
表2
将获得的线性化质粒与步骤(2.2)获得的PCR产物放入PCR管中，用无缝克隆试剂盒进行无缝连接，得到敲除载体pCAMBIA-up-Hph-down。无缝连接体系如表3所示。将样品轻轻混合，50℃反应15min，反应结束后置于冰上冷却数秒，之后将重组载体保存于-20℃备用。
表3
2×BasicAssemblyMix 5μL
1300XR-BamHI 1.3μL
VdFtr1-up 0.3μL
Hph 0.4μL
VdFtr1-down 0.3μL
ddH2O 2.7μL
共10μL
采用以同源臂扩增引物VdFtr1-AF(序列如SEQ ID NO:2所示)和VdFtr1-AR(序列如SEQ ID NO:3所示)、VdFtr1-BF(序列如SEQ ID NO:4所示)和VdFtr1-BR(序列如SEQ IDNO:5所示)、Hph-F(序列如SEQ ID NO:6所示)和Hph-R(序列如SEQ ID NO:7所示)分别以表1所示的扩增体系和(2.2)所述的扩增程序对构建的敲除载体进行PCR扩增，扩增结果见图1。
由图1可以看出，三对引物均能扩增出正确条带，表明敲除载体构建成功。
实施例三
将实施例二获得的敲除载体转化大肠杆菌，方法如下：
(3.1)在冰上融化大肠杆菌感受态Trans1-T1，取50μL大肠杆菌感受态细胞，加入2μL实施例二得到的敲除载体pCAMBIA-up-Hph-down，轻轻弹动离心管壁混匀后，在冰上放置30min。
然后42℃水浴热激30s，之后马上转至冰上冷却2min，加入450μL常温LB液体培养基，之后37℃摇床中250rpm培养1h。取100μL培养物均匀地涂在含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，37℃培养箱中过夜培养。
(3.2)挑选单克隆至10μL无菌水中，涡旋混合，吸取1μL混合液采用表1所示体系，用HP-F/R引物(序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示)鉴定阳性克隆，反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性40s；56℃退火40s，72℃延伸40s，35个循环；最后72℃延伸10min。
实施例四
将敲除载体转化农杆菌，方法如下：
(4.1)用质粒提取试剂盒提取实施例三得到的阳性克隆的质粒。取100μLLBA4404感受态置于冰上，融化后加入1μg提取的质粒，用移液枪轻轻吹匀后，置于冰上30min，在液氮中速冻1min，迅速取出后，置于37℃温浴3min，再冰浴2min，接着加入500μL LB液体培养基，然后置于摇床上，在28℃，250rpm条件下振荡预表达3h。
(4.2)取预表达菌液于4000rpm离心3min后，弃450μL上清，用移液枪将剩余菌液轻轻吹匀，涂布于含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，在28℃培养箱中倒置培养24～48h后，挑选单菌落，采用实施例三步骤(3.2)所述的鉴定方法对转化子进行鉴定，将鉴定正确的农杆菌于-20℃保存备用。
实施例五
构建回补载体，方法如下：
(5.1)以实施例一提取的大丽轮枝菌野生型菌株VdGn3的DNA为模板，利用ComVdFtr1-F/R引物(序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示)进行PCR扩增获得ComVdFtr1片段，片段全长4538bp，包含VdFtr1基因ORF区2038bp及上游2000bp和下游500bp。扩增体系为表1所示体系，扩增条件为：94℃预变性10min；94℃变性40s，58℃退火15s，72℃延伸4min，30个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物于-20℃保存备用。
(5.2)将获得的ComVdFtr1片段与实施例二提取的pCAMBIA1300-XR质粒，用限制性内切酶SalI和PstI进行双酶切，酶切体系如表4所示。
表4
PCMBIA1300-XR/comVdFtr1 5μL
SalI 1μL
PstI 1μL
10×FastDigestBuffer 2μL
ddH2O 11μL
共20μL
胶回收目的片段，用T4 DNA连接酶连接过夜即得到回补载体pCom-VdFtr1。连接体系如表5所示。
表5
PCMBIA1300-XR-SalI&PstI 2μL
comVdFtr1-SalI&PstI 2μL
10×buffer 2μL
T4DNA连接酶 1μL
ddH2O 13μL
共20μL
取20μL连接产物用SalI、PstI和XbaI进行酶切，酶切体系如表6所示，结果见图2，由图2可以看出，酶切后的回补载体产生了4.5kb左右的回补片段、2kb左右的neo基因片段，条带大小正确，回补载体构建成功，能够用于回补菌株的获得。
表6
pCom-VdFtr1 5μL
SalI 1μL
PstI 1μL
XbaI 1μL
10×FastDigestBuffer 2μL
ddH2O 10μL
共20μL
实施例六
将实施例五构建的回补载体转化大肠杆菌和农杆菌，方法与实施例三和四完全相同，只是经涂板、挑取单克隆进行菌落PCR鉴定后，挑取阳性克隆，提取质粒进行如实施例五所述的酶切鉴定，采用实施例四的方法将酶切鉴定正确的质粒转入农杆菌LBA4404中，-20℃保存质粒和菌液备用。
实施例七
获得VdFtr1基因敲除菌株，采用ATMT介导的遗传转化方法，具体步骤如下：
(7.1)将实施例四得到的含有VdFtr1基因敲除载体pCAMBIA-up-Hph-down的农杆菌LBA4404在含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，在28℃条件下倒置培养24～48h。
(7.2)挑取单菌落至5mL含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，在28℃，210rpm条件下振荡培养24～48h。
(7.3)取50μL培养好的菌液至5mL MM液体培养基中，加入50mg/mL的利福平和50mg/mL卡那霉素各50μL，在28℃，210rpm条件下振荡培养48h。
(7.4)将菌液收集至2mL离心管中，4000rpm离心5min，收集菌体；菌体重悬于1mL未加AS和抗生素的IM培养基中，4000rpm离心5min，清洗两次；将菌液收集至50mL离心管中，用IM稀释至OD600为0.25；吸取10mL稀释后的菌液至试管，加入200mmol/L AS和50mg/mL卡那霉素各10μL，在28℃，210rpm条件下振荡培养至OD600在0.4～0.6之间。
(7.5)将置于25℃培养5d的大丽轮枝菌VdGn3平板用10mL无菌水冲洗分生孢子后，用4层灭菌擦镜纸进行过滤，滤液5000rmp离心10min，弃上清，用IM液体培养基进行重悬，重复两次，制备孢子悬浮液，血球计数板计算孢子数量；将分生孢子浓度调至1×106孢子/mL。
(7.6)吸取(6.4)中摇好的农杆菌菌液和(6.5)中配制好的分生孢子悬浮液各500μL于2mL离心管中混合，28℃，210rpm振荡培养10min。
(7.7)将混合纤维微孔滤膜(0.22μm)放置在CM固体培养基平板上，将步骤(6.5)获得的混合菌液均匀的涂布于CM平板上，25℃共培养48h。
(7.8)将滤膜转移至含有50mg/L卡那霉素和50mg/L潮霉素B的SM培养基上，25℃培养3～4d。
(7.9)挑取SM培养基上长出的单菌落至含有50mg/L潮霉素B的PDA培养基上，于25℃条件下培养，长出的菌落即为VdFtr1敲除候选菌株。
挑取敲除候选菌株ΔVdFtr1以及野生型菌株WT，分别提取菌丝的RNA，以YFtr1-F/R(序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示)以及HP-F/R(序列如SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:9所示)两对引物筛选敲除菌株，其中VdFtr1基因引物YFtr1-F/R无法扩增出正确条带，而引物Hp-F/R能扩增出正确条带的突变体为正确敲除突变体菌株，见图3的A部分，其中M代表Marker，+代表野生型菌株，1～6为敲除菌株，-为水。
实施例八
将回补载体转入VdFtr1敲除菌株中，获得回补菌株，方法与实施例七完全相同，只是将实施例五得到的含有pCom-VdFtr1的质粒(回补载体)转入实施例七中经验证的VdFtr1敲除菌株中，即得到敲除菌株的回补菌株。所用抗生素为终浓度50mg/L的G418。
挑取回补菌株ComVdFtr1以及野生型菌株WT，分别提取菌丝的RNA，经G418抗性筛选(50mg/L)和引物YFtr1-F/R(序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示)检测后，能扩增出正确条带的为回补菌株，见图3的B部分，其中M代表Marker，+代表野生型菌株，1-14为回补菌株，-为水。
效果例一
测定VdFtr1基因对大丽轮枝菌菌落形态和菌株生长速度的影响，方法如下：
将随机挑选的3株敲除菌株ΔVdFtr1-3、ΔVdFtr1-7、ΔVdFtr1-16和3株回补菌株comVdFtr1-51、comVdFtr1-54、comVdFtr1-61与野生型菌株WT在PDA培养基上培养15d，菌落形态见图4，菌落直径统计结果见图5。
由图4和图5可以看出，野生型和回补菌株菌落形态基本没有差异，均能形成白色的气生菌丝，并产生大量的微菌核，微菌核的形成速度也与野生菌菌株没有明显的差异，但敲除菌株基本不能形成微菌核，仅在接种菌饼处形成了极少的微菌核，且菌株生长速度显著慢于野生型和回补菌株。
效果例二
考察VdFtr1基因对大丽轮枝菌产孢量的影响，方法如下：
将大丽轮枝菌的野生型菌株WT、敲除菌株ΔVdFtr1、回补菌株comVdFtr1，接种至PDA培养基上进行活化。培养10d后，加入10mL无菌水冲洗培养皿，用血球计数板计算孢子浓度，每个处理设置3次重复，结果见图6。
由图6可以看出，大丽轮枝菌野生型WT和回补型菌株comFtr1的产孢量基本无差异，均显著高于敲除菌株的产孢量，说明缺失VdFtr1能够降低大丽轮枝菌的产孢能力。
效果例三
考察VdFtr1基因对大丽轮枝菌微菌核形成过程的影响，方法如下：
将大丽轮枝菌的野生型菌株WT、敲除菌株ΔVdFtr1、回补菌株comVdFtr1，接种至PDA培养基上进行活化。培养10d后，加入10mL无菌水冲洗培养皿，用血球计数板计算孢子浓度，并调至1×106孢子/mL备用。吸取50μL 1×106孢子/mL孢子悬浮液均匀涂布在BM固体培养基中，分别在0h、48h、60h、72h、96h、7d、10d，挑取菌丝在显微镜下观察微菌核形态并拍照记录，结果见图7。
由图7可以看出，通过比较野生型菌株WT、敲除菌株ΔVdFtr1、回补菌株comVdFtr1的菌落形态发现VdFtr1基因缺失后，敲除菌株基本丧失了形成微菌核的能力。为了更直观的观察VdFtr1基因缺失后，微菌核的变化情况，连续10d对大丽轮枝菌的微菌核形成进行了观察。在这10d中，野生型和回补型菌株均无明显差异，都可在72h时菌丝开始厚垣孢子化，96h时有微菌核的形成，并伴有黑色素的产生，但敲除菌株并未产生微菌核。直到培养至10d时，敲除菌株菌丝才开始厚垣孢子化，但仍未见有黑色素沉积。说明VdFtr1基因可以促进大丽轮枝菌微菌核的形成。
效果例四
有研究表明，过氧化氢在大丽轮枝菌形成微菌核的过程中具有重要作用，因此，对野生型菌株、敲除菌株以及回补菌株菌丝中过氧化氢含量进行了测定，来考察VdFtr1基因对大丽轮枝菌过氧化氢含量的影响，方法如下：
吸取50μL效果例三中制备的1×106孢子/mL孢子悬浮液均匀涂布在BM固体培养基中，分别在48h、72h、96h取样，采用过氧化氢试剂盒进行测定，每个时间点设置3次重复，测定结果见图8。
由图8可以看出，随着培养时间的增加，野生型菌株过氧化氢含量也随之增加，并在96h时含量达到最大为2.24μmol/g；而敲除菌株的过氧化氢含量与野生型相比显著下降，且不会随着时间的增加而改变，一直处于稳定的低水平状态；回补型菌株表现与野生型菌株一致，且过氧化氢含量并没有显著差别。说明VdFtr1的缺失会降低大丽轮枝菌过氧化氢的含量，从而抑制微菌核的形成。
效果例五
考察VdFtr1基因对大丽轮枝菌致病力的影响，方法如下：
将向日葵LD5009的种子种植于装有灭菌土的营养钵中，每个营养钵中播种6粒种子。每个处理种植5盆，设置3次重复。待向日葵幼苗长至2～4片真叶时，用配制好的分生孢子液进行伤根接种。每个营养钵接种50mL的分生孢子液。接种30d后，根据向日葵黄萎病分级标准(如表7所示)，调查向日葵黄萎病的病级，按照下面的公式计算病情指数，数据计算在SPSS 18.0专业版统计分析软件上完成，并计算方差检验处理间的差异显著性，同时取接种后向日葵植株的茎基部，利用大丽轮枝菌特异性引物VerBt-F/R(序列如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示)进行qPCR，定量分析接种后向日葵植株中病原菌定植数量，结果见图9。
表7
级别 黄萎病病斑面积及描述
0 健株，无表观症状
1 植株25％以下表现褪绿、黄化、萎蔫、枯死等症状
2 26％-50％的植株表现症状，植株矮化
3 51％-75％的植株表现症状，植株矮化
4 75％以上的叶片表现出严重症状，植株枯萎死亡
由图9可以看出，室内人工接种25d后，接种野生型菌株和回补菌株的向日葵幼苗表现出明显的黄萎症状，接种敲除菌株的向日葵幼苗生长健康，出现轻微黄化褪绿等黄萎病症状(图9的A部分)。病情指数的统计结果表明，敲除菌株的致病力较野生型菌株显著下降，病情指数介于20.35～23.55之间，相比野生型的45.50下降了48.24％～55.27％。而回补菌株的致病力则恢复至野生型菌株的水平，病情指数在44.07～46.21之间(见图9的B部分)。通过qPCR验证野生型菌株、敲除菌株ΔVdFtr1和回补菌株ComVdFtr1在向日葵茎基部上的定植数量，结果见图9的C部分，结果表明VdFtr1基因缺失后，敲除菌株的定植能力相比野生型菌株显著下降。说明VdFtr1能够正向调控大丽轮枝菌的致病能力。
因此，本发明提供的VdFtr1基因在大丽轮枝菌引起的土传病害中的应用，首次揭示VdFtr1基因在大丽轮枝菌中的作用，并证实VdFtr1基因对大丽轮枝菌菌丝生长、微菌核形成、致病力有显著的正向作用；可以为大丽轮枝菌引起的黄萎病的有效防治、为保证农民稳产提供新的策略；可以为作物的基因抗性育种提供理论依据，为黄萎病抗性育种的早日实现贡献力量。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (3)

1.VdFtr1基因在大丽轮枝菌中的作用，其特征在于：VdFtr1基因的序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的VdFtr1基因在大丽轮枝菌中的作用，其特征在于：VdFtr1基因对大丽轮枝菌菌丝营养生长、微菌核形成及致病性具有正向调控作用。
3.一种如权利要求1所述的VdFtr1基因在土传真菌病害防治中的应用，其特征在于：所述土传真菌病害为大丽轮枝菌引起的植物病害。
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