TWI629358B - 細長聚球藻ｐｃｃ ７９４２之基因表現干擾系統以及抑制細長聚球藻ｐｃｃ ７９４２基因表現之方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，包含細長聚球藻PCC 7942細胞、dCas9表達質體和sgRNA質體。本發明另提供一種抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，包含分別構築dCas9表達質體和sgRNA質體，分別將dCas9表達質體和sgRNA質體轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中以得到第二轉型株，再培養所述第二轉型株並加入誘導物，以抑制目標基因之表現。藉此，可長時間穩定且有效的抑制目標基因之表現。

Description

細長聚球藻PCC 7942之基因表現 干擾系統以及抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法

本發明是有關於一種藍綠菌之基因表現干擾系統及應用，特別是藍綠菌基因表現干擾系統以及抑制藍綠菌基因表現之方法。

隨著氣候變遷以及能源危機的驅動下，已有許多生質能利用微生物結合基因工程大規模的被生產出來。藍綠菌生活的棲息地相當廣泛，具有高多樣性能適應於高鹽類濃度、溫差變化大或者是高濃度二氧化碳的環境。且藍綠菌能進行光合作用將二氧化碳轉換成可用的生質能，相較於其他異養的生物，藍綠菌不需提供額外的碳水化合物來當作碳源。僅需提供陽光、二氧化碳、水、氮、磷以及微量的礦物質等簡單的生活需求，被認為近年來最具有潛力的微生物之一。

新一代基因工程的目標已從利用微生物表現單一蛋白發展至從基因層次全面性的操控微生物的代謝路徑，使其能夠分解或生產特定物質。因此，同時針對基因組上多個位置進行基因嵌入/基因剔除，或調控基因表現成為基因工程研究上非常重要的課題。

目前被廣泛應用的基因剪輯系統包含源於噬菌體，發展成熟且常應用於大腸桿菌的同源重組系統(homologous recombination system)，以及近年來興起的類轉錄活化因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases；TALENs)。然而，源自噬菌體的同源重組系統在染色體嵌入外源基因時有其長度限制，無法嵌入大於3.5kb的DNA片段。而TALENs則牽涉到酵素的設計與更動，執行上較為繁複、耗時。此外，若欲使用質體做為載體來生產目標蛋白，質體的不穩定性及其對抗生素的需求會影響基因表現的穩定性，並增加生產成本。

目前已能利用代謝工程技術獲得高產量生質能的微生物，但若要更有效率的使微生物製造生質能，了解微生物染色體中各個基因，並抑制與目標產物競爭的代謝路徑，來最佳化其表現為重要目標之一，其中包含使用基因剔除(knockout)及基因減弱(knockdown)兩種方式。目前在藍綠菌當中若要使目標基因無法表現，來達到抑制其他與目標產物競爭的代謝路徑，傳統上是利用同源重組的方法來剔除目標基因，進而調控代謝路徑。但由於藍綠菌為多倍體生物，利用傳統方法不能明確且有效的剔除目標基因。此外， 若要剔除多個目標基因時，需結合FLP/Frt或Cre/loxp等重組酶系統(Berla BM,et al.2013.Synthetic biology of cyanobacteria：unique challenges and opportunities.Front Microbiol 4：246.)，執行上較為繁複且需花較長時間篩選，還會留下剩餘的FLP或Cre序列，當下次再使用同樣的重組酶系統時，可能會造成不必要的基因移除。因此，即使是生長速度最快的藍綠菌，若要完全剔除單一個目標基因也需花大約3個禮拜的時間，且還會受限於無法調控目標基因以及無法剔除會對細胞有負面影響之必要基因等問題。

本發明之一態樣是在提供一種細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，包含細長聚球藻PCC 7942細胞、dCas9表達質體和sgRNA質體。dCas9表達質體包含依序排列之第一同源互換左臂、第一啟動子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互換右臂，其中第一同源互換左臂和第一同源互換右臂構成第一同源互換區。sgRNA質體包含依序排列之第二同源互換左臂、第二啟動子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互換右臂序列，其中第二同源互換左臂和第二同源互換右臂構成第二同源互換區，sgRNA上spacer之序列與目標基因之序列相對應，所述目標基因位於細長聚球藻PCC 7942細胞之染色體或外源質體上，第二同源互換區和第一同源互換區不相同，且抵抗第二抗生素基因和抵抗第一抗生素基因不相同。

依據前述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，其中第一同源互換區可為NSI(neutral site I)基因或NSII(neutral site II)基因。

依據前述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，其中第二同源互換區可為NSI基因或NSII基因。

依據前述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，抵抗第一抗生素基因可為抵抗卡納黴素(kanamycin resistance,Km^R)基因、抵抗氯黴素(chloramphenicol resistance,Cm^R)基因或抵抗觀黴素(Spectinnomycin resistance,Spec^R)基因。

依據前述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，抵抗第二抗生素基因可為抵抗卡納黴素基因、抵抗氯黴素基因或抵抗觀黴素基因。

依據前述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，第一啟動子可為Smt啟動子、LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、LlacO1啟動子、BAD啟動子、Trc啟動子、Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子、J23101啟動子或J23119啟動子。

依據前述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，第二啟動子可為Smt啟動子、LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、LlacO1啟動子、BAD啟動子、Trc啟動子、Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子、J23101啟動子或J23119啟動子。

本發明之另一態樣是在提供一種抑制細長聚球 藻PCC 7942基因表現之方法，包含下述步驟：先構築dCas9表達質體和sgRNA質體。構築之dCas9表達質體包含依序排列之第一同源互換左臂、第一啟動子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互換右臂，其中第一同源互換左臂和第一同源互換右臂構成第一同源互換區。構築之sgRNA質體包含依序排列之第二同源互換左臂、第二啟動子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互換右臂，其中第二同源互換左臂和第二同源互換右臂構成第二同源互換區，sgRNA上spacer之序列與目標基因之序列相對應，所述目標基因位於細長聚球藻PCC 7942細胞之染色體或外源質體上，第二同源互換區和第一同源互換區不相同，且抵抗第二抗生素基因和抵抗第一抗生素基因不相同。將dCas9表達質體轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中，以得到第一轉型株，其中dCas9表達質體之第一同源互換區與第一轉型株之染色體之第一同源互換區進行同源交換，將第一啟動子、dCas9基因及抵抗第一抗生素基因嵌入第一轉型株之染色體之第一同源互換區中。再將sgRNA質體轉型至第一轉型株中，以得到第二轉型株，其中sgRNA表達質體之第二同源互換區與第二轉型株之染色體之第二同源互換區進行同源交換，將第二啟動子、sgRNA及抵抗第二抗生素基因嵌入第二形株之染色體之第二同源互換區中。培養第二轉型株，並加入誘導物誘導dCas9表達質體表現dCas9蛋白，dCas9蛋白與sgRNA質體表現之sgRNA會形成dCas9蛋白複合體，且dCas9蛋白複合體結合至目標基因序列上， 以抑制目標基因之表現。

依據前述之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，更包含第一篩選步驟，係以含有第一抗生素之培養基培養第一轉型株，其中抗生素可為卡納黴素(kanamycin)、氯黴素(chloramphenicol)或觀黴素(Spectinnomycin)。

依據前述之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，更包含第二篩選步驟，係以含有第二抗生素之培養基培養第二轉型株，其中第二抗生素可為卡納黴素、氯黴素或觀黴素。

藉此，本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統及抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，不僅不會對細長聚球藻PCC 7942造成負面影響外，又能長時間穩定且有效的抑制目標基因之表現，且相較於傳統之方法，僅需設計sgRNA之序列，sgRNA之設計容易而且基因表現的抑制幅度是可以隨意調控，因而具有multiplexing的潛力，在應用於未來生產上非常具有優勢。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

100‧‧‧細長聚球藻PCC 7942基因編輯之方法

110、120、130、140‧‧‧步驟

300‧‧‧抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法

310、320、330、340、350‧‧‧步驟

500‧‧‧調控細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法

510、520、530‧‧‧步驟

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與 實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖繪示本發明之CRISPR/Cas9表達質體構築示意圖；第1B圖繪示本發明之CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球藻PCC 7942運作示意圖；第2A圖為本發明之CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球藻PCC 7942運作後菌落變化之結果圖；第2B圖為本發明之CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球藻PCC 7942運作後死亡率之結果圖；第3圖繪示本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯之方法之步驟流程圖；第4圖繪示本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統構築及轉型示意圖；第5A圖為經本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統同源互換後之菌落圖；第5B圖為經本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統將外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體之數量長條圖；第6A圖為利用菌落(colony)PCR確認外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942染色體之結果圖；第6B圖為利用qPCR確認本發明之CRISPR/Cas9表達質體在轉型後會自行消失之結果圖； 第7圖為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統以不同劑量之CRISPR/Cas9表達質體和模板質體共轉型至細長聚球藻PCC 7942後之同源互換效率結果圖；第8A圖為具有不同長度同源互換臂之模板質體之構築示意圖；第8B圖為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統以不同長度的同源互換臂進行同源互換之同源互換效率的結果圖；第9A圖為外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體平均套數之結果圖；第9B圖為利用菌落PCR確認本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統將外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體之結果圖；第10圖為外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體後穩定性之結果圖；第11A圖為細長聚球藻PCC 7942內代謝路徑及調控基因之示意圖；第11B圖為利用基因編輯系統剔除細長聚球藻PCC 7942染色體上glgc基因所需質體之建構示意圖；第11C圖為細長聚球藻PCC 7942剔除glgc基因後肝醣產量變化之結果圖；第11D圖為細長聚球藻PCC 7942剔除glgc基因後琥珀酸產量變化之結果圖； 第12A圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之誘導型啟動子之建構示意圖；第12B圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之誘導型啟動子之分析圖；第13A圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之持續表現型啟動子之建構示意圖；第13B圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之持續表現型啟動子之分析圖；第14圖為繪示本發明之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法之步驟流程圖；第15A圖為本發明之dCas9表達質體構築和同源互換之示意圖；第15B圖為本發明之sgRNA質體構築和同源互換之示意圖；第16A圖和第16B圖為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統抑制目標基因表現之結果圖；第17A圖為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統對細胞造成毒性之分析結果圖；第17B圖為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統之基因調控穩定性之分析結果圖；以及第18圖繪示本發明之細長聚球藻PCC 7942基因調控之方法之步驟流程圖。

本說明書中所述之「細長聚球藻(Synechococcus elongates)PCC 7942」係指法國巴斯德研究所(Pasteur Culture Collection)藍藻保存庫編號7942的藍綠菌，其為格蘭氏陰性菌(Gram-negative)，具有兩種內源性的質體pANL、pANS以及環型染色體，為多倍體之單細胞生物，平均4套染色體，其基因體大小約2.8Mb，外型呈長桿狀，為專性自養生物，能生活於低養分的淡水環境下，其理想生長溫度為38℃，在適當生長環境下，每12小時即可複製一代。細長聚球藻PCC 7942被發現可以藉由自然轉型方式將外源性DNA在染色體做同源性的重組交換以執行基因轉型作用，因此是藍綠菌中的一個成功將外來的DNA轉型的菌種，具有高的轉型效率以及同源重組效率。常被嵌入之位置分別有染色體中neutral Site I(NSI)以及neutral Site II(NSII)。目前常被研究用來生產生質能的藍綠菌另有常溫藍綠菌PCC 6803(Synechocystis sp.PCC 6803)、Synechococcus sp.PCC7002和Anabaena variabilis PCC 7120。細長聚球藻PCC 7942與另一常見用做基因工程菌株-常溫藍綠菌PCC 6803雖同屬藍綠菌，但其許多特性並不相同。在單體細胞型態上，已觀察到細長聚球藻PCC 7942常由多個細胞連接成長鏈狀，而常溫藍綠菌PCC 6803單體細胞則常聚合在一起。而對核醣體16 S之RNA序列進化樹狀圖分析結果也顯示兩者之差異。在生長特性及染色體特性部分，細長聚球藻PCC 7942之細胞倍增時間為12-24小時且為自營菌，其染色體大小僅為2.8 Mbp，多倍體大約為4套染色體。而常溫藍綠菌PCC 6803之細胞倍增時間較短為6-12小時並且為兼性營養菌，染色體較大達到了3.6Mbp，同時多倍體變化較大，最高時可達到218套染色體。另外在基因工程使用工具(如啟動子)選用上兩者亦各有偏好之處，因此雖然常溫藍綠菌PCC 6803較早被了解研究並被用來生產生質化學品，但在實際應用之細節部分仍須根據細長聚球藻PCC 7942本身特性來進行部分策略及工具選用上的調整。

本說明書中所述之「CRISPR/Cas9」係指Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPRs)和CRISPR-associated protein(Cas9)系統，為源自於原核生物的後天免疫系統，可抑制外來核酸片段在胞內的活性，消滅外來的質體或者噬菌體。依機制的不同可分為三型，CRISPR/Cas9系統為源自於化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的第二型CRISPR系統。第二型CRISPR/Cas9系統的作用機制可分為兩階段。第一階段為獲得免疫，CRISPR/Cas9系統將藉由病毒或接合作用(conjugation)入侵細胞內的外來核酸片段加以處理後，將之嵌入CRISPR基因位之中，稱為「spacer」。第二階段為抑制外來核酸片段活性，CRISPR基因位含有多個與目標核酸序列互補的spacer，而每個spacer各編碼一段CRISPR RNA(crRNA)，並被一段固定的repeat序列(direct repeats)所包夾。首先，CRISPR基因位轉錄出pre-crRNA，並與trans-activating crRNAs(tracrRNAs) 結合。接著，pre-crRNA-tracrRNA複合物經過RNase III的處理，成為成熟的crRNA。隨後Cas9蛋白會與tracrRNA及成熟的crRNA螯合，形成核醣蛋白共聚體，並藉著crRNA上的spacer將共聚體引導至與spacer互補的目標基因序列(protospacer)。最後藉由Cas9蛋白上HNH以及RuvC核酸酶結構域在protospacer 3’端上游3bp處造成齊頭的(blunt-ended)雙股斷裂(double strand break,DSB)。而protospacer除了含有與spacer互補的序列外，其3’端下游必須存在特定之protospacer-adjacent motif(PAM)-在化膿性鏈球菌第二型CRISPR/Cas9系統中其序列為NGG(N代表任意DNA密碼子)-才會造成雙股斷裂。

本說明書中所述之「CRISPRi」係指CRISPR interference(CRISPRi)系統，為將修改源自於化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)的第二型CRISPR/Cas9系統-改質Cas9蛋白使其失去核酸內切酶活性(RuvC1 and HNH)，被稱為dCas9(Cas9 D10A and H841A)，其作用原理一樣藉由sgRNA或crRNA-trancrRNA複合物的誘導結合至目標基因的指定序列，但卻不會對目標基因造成切割，因此可用來阻擋RNA聚合酶進行基因轉錄，進而抑制目標基因表現。

茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材 料及方法。

<試驗例>

一、本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯之系統1.建立CRISPR/Cas9細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統

本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統包含細長聚球藻PCC 7942細胞(GeneArt® Synechococcus Engineering Kits；Life technology)、CRISPR/Cas9表達質體和模板質體。

CRISPR/Cas9表達質體包含tracrRNA、Cas9基因及crRNA。於本試驗例中所示之一實施例，CRISPR/Cas9表達質體為pCas9-NSI質體，其tracrRNA之序列如序列辨識編號1所示，Cas9基因之序列如序列辨識編號2所示，crRNA之序列如序列辨識編號3所示，並將tracrRNA、Cas9基因及crRNA構築於pCas9載體(addgene)上，以得到pCas9-NSI質體。

模板質體包含依序排列之同源互換左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互換右臂，其中同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區，且同源互換區之序列與細長聚球藻PCC 7942細胞之染色體序列相對應。於本試驗例中所示之一實施例，模板質體為pHR-trcS質體，其同源互換左臂之序列如序列辨識編號4所示，抵抗抗生素基因為如序列辨識編號5所示之抵抗觀黴素(Spectinnomycin resistance,Spec^R)基因，外源基因之序列如序列辨識編號6所示，同源互換右臂之序列如序列辨識編號7所示，由同 源互換左臂和同源互換右臂所構成的同源互換區為細長聚球藻PCC 7942之NSI(neutral site I)部分序列。將上述之同源互換左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互換右臂構築於pSYN_1載體(Life technology)上，以得到pHR-trcS質體。

為了在細長聚球藻PCC 7942中建立CRISPR/Cas9基因編輯系統，必須先測試CRISPR/Cas9表達質體是否可成功造成細長聚球藻PCC 7942的DNA雙股斷裂。細長聚球藻PCC 7942有4套染色體，若能成功同時造成4套染色體斷裂，則可造成細長聚球藻PCC 7942細胞死亡，因此細胞死亡率可作為測試CRISPR/Cas9表達質體是否可成功造成DNA雙股斷裂的指標。

請參照第1A圖和第1B圖，第1A圖繪示CRISPR/Cas9表達質體構築示意圖，第1B圖繪示CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球藻PCC 7942運作示意圖。於本試驗例中構築了兩個CRISPR/Cas9表達質體，分別為pCas9Ø質體和pCas9-NSI質體。其中pCas9Ø之crRNA並無對應至細長聚球藻PCC 7942之染色體中任何序列，而pCas9-NSI之crRNA則對應至細長聚球藻PCC 7942之染色體中NSI(neutral site I)基因中不在模板質體同源臂上的部分序列，故pCas9-NSI之crRNA可以結合到細長聚球藻PCC 7942之染色體中之NSI基因位置並進行雙股斷裂。

為了證實CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球 藻PCC 7942中確實有效果，於本試驗例中利用構築好的質體設計以細長聚球藻PCC 7942死亡率為基礎的切割效率試驗，其目的是將設計好的CRISPR/Cas9質體送入細長聚球藻PCC 7942細胞內，並觀察是否按照預期製造出Cas9蛋白複合體並對細長聚球藻PCC 7942之染色體上目標位置進行雙股斷裂。若成功進行雙股斷裂，則細長聚球藻PCC 7942會因此死亡，便可以經由存活下的菌落數對比來驗證CRISPR/Cas9表達質體是否有效果，並驗證CRISPR/Cas9表達質體對於細長聚球藻PCC 7942本身是否會造成毒害作用。

試驗上包含實驗組及控制組，實驗組分別加入250ng、500ng、1000ng和2000ng的pCas9-NSI質體至細長聚球藻PCC 7942細胞進行轉型，而控制組為不加入任何質體的細長聚球藻PCC 7942細胞，試驗上同時設計一組加入不會對細長聚球藻PCC 7942染色體造成雙股斷裂的pCas9Ø質體，將其作為CRISPR/Cas9表達質體本身是否具有毒性毒害細長聚球藻PCC 7942之控制組，並以此進行實驗，藉由細菌死亡率來驗證CRISPR/Cas9系統在細長聚球藻中造成雙股斷裂的效率。

請參照下表一、第2A圖和第2B圖，表一為CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球藻PCC 7942運作後的菌落數，計算單位為菌落形成單位(colony forming unit,CFU)，第2A圖為CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球藻PCC 7942運作後菌落變化之結果圖，第2B圖為 CRISPR/Cas9表達質體在細長聚球藻PCC 7942運作後死亡率之結果圖，死亡率的計算如下述公式：

與控制組相比可以發現細長聚球藻PCC 7942菌落數隨著加入pCas9-NSI質體的劑量提升而減少，到了1000ng時菌落數達到最低，且在加入1000ng的pCas9-NSI質體時死亡率達到最高，死亡率(雙股斷裂效率)最高可達到85±3%。另外，雖與控制組相比，實驗組的細長聚球藻PCC 7942死亡率顯著的提高，但加入pCas9Ø質體的組別與控制組相較則沒有顯著死亡現象，表示CRISPR/Cas9表達質體對細長聚球藻PCC 7942本身並不會造成任何毒害作用，僅在加入對應之crRNA/tracrRNA後才會造成目標位置之雙股斷裂。

2.細長聚球藻PCC 7942基因編輯之方法

請參照第3圖為本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯之方法100之步驟流程圖。第3圖中，細長聚球藻PCC 7942基因編輯之方法100包含步驟110、步驟120、步驟130和步驟140。

步驟110為構築CRISPR/Cas9表達質體，所構築之CRISPR/Cas9表達質體包含tracrRNA、Cas9基因及crRNA。

步驟120為構築模板質體，所構築之模板質體包含依序排列之同源互換左臂、抵抗抗生素基因、外源基因及同源互換右臂，其中同源互換左臂和同源互換右臂構成同源互換區，且同源互換區之序列與細長聚球藻PCC 7942之染色體序列相對應。

步驟130為將CRISPR/Cas9表達質體和模板質體共轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中，以得到轉型株。

步驟140為培養轉型株，其中CRISPR/Cas9表達質體表現之tracrRNA、Cas9蛋白和crRNA會形成Cas9蛋白複合體，對轉型株之染色體之同源互換區進行雙股斷裂，且模板質體之同源互換區與轉型株之染色體之同源互換區會進行同源交換，將抵抗抗生素基因和外源基因嵌入轉型株之染色體之同源互換區中。

請再參照第4圖，為細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統構築及轉型示意圖，於本試驗例中所示之一實施例，CRISPR/Cas9表達質體為pCas9-NSI質體，模板質體為pHR-trcS質體。試驗時將pCas9-NSI質體和pHR-trcS質體共轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中，pCas9-NSI 質體會對細長聚球藻PCC 7942之染色體之NSI基因進行雙股斷裂，而於pHR-trcS質體的同源互換左臂(NSIL)和同源互換右臂(NSIR)與細長聚球藻PCC 7942之染色體之NSI基因會進行同源互換，將pHR-trcS質體上的抵抗觀黴素基因和外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體之NSI基因中。

3. CRISPR/Cas9系統在細長聚球藻PCC 7942中促進同源互換效率

為了驗證本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統可以提升傳統同源互換技術的成功率，於本試驗設計同源互換效率的實驗，將CRISPR/Cas9表達質體及pHR-trcS質體共轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中以得到轉型株，並觀察最後將外源基因成功插入轉型株之染色體的菌落數來檢驗同源互換效率。試驗上共有3個組別，分別為僅轉型2000ng的pHR-trcS質體作為同源重組模板的控制組、共轉型2000ng的pHR-trcS質體和500ng的pCas9-NSI質體的實驗組，以及共轉型2000ng的pHR-trcS質體和pCas9Ø質體的組別。轉型株再經由含有觀黴素的培養基進行篩選，最終存活下來之菌落數便代表成功將外源基因同源重組進入轉型株之染色體中之細長聚球藻PCC 7942數量。

請參照下表二和第5A圖和第5B圖，表二為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統在細長聚球藻PCC 7942運作後的菌落數，第5A圖為經本發明之細長聚球 藻PCC 7942之基因編輯系統同源互換後之菌落圖，第5B圖為經本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統將外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體之數量長條圖。

結果顯示，實驗組的存活之細長聚球藻PCC 7942菌落數相較控制組有所提升，表示在細長聚球藻PCC 7942中利用本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統確實可提高外源基因同源重組進入細長聚球藻PCC 7942染色體中的效率。

試驗上更利用菌落(colony)PCR進一步驗證送入的外源基因是否嵌入至細長聚球藻PCC 7942染色體上正確的位置，菌落PCR之引子係設計於細長聚球藻PCC 7942染色體及嵌入之外源基因兩端交界處，進行PCR後可分別得到之左端及右端PCR產物約為2kb。請參照第6A圖，為利用菌落PCR確認外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942染色體之結果圖。由第6A圖中結果可知，僅轉型pHR-trcS質體的組別(傳統方法)，有一組菌落右端沒有PCR訊號，表示該菌落可能沒有正確嵌入外源基因。但使用本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統的組別，外源基因皆確實正確的嵌入細長聚球藻PCC 7942的染色體內。

為了證明CRISPR/Cas9表達質體在轉型後會自行消失，試驗上分別將轉型株在轉型CRISPR/Cas9表達質體後第0天、第9天和野生型菌株(wild type,WT)進行qPCR(quantitative real-time PCR)偵測Cas9基因拷貝數，並以第0天的Cas9基因拷貝數為基準進行相對定量。請再參照第6B圖，為利用qPCR確認本發明之CRISPR/Cas9表達質體在轉型後會自行消失之結果圖，其中N.D.(Not detectable)表示未偵測到Cas9相對數量。結果顯示，在轉型CRISPR/Cas9表達質體後第9天偵測不到Cas9相對數量，顯示CRISPR/Cas9表達質體為短暫存在於轉型株中。

4.優化在細長聚球藻PCC 7942的同源互換效率

本試驗例進一步優化及驗證本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統提高細長聚球藻PCC 7942外源基因同源重組的最佳效率以及極限能力。首先藉由調整不同劑量的pCas9-NSI及pHR-trcS質體來找出後續最適條件之劑量。試驗上分別加入250ng、500ng、1000ng以及2000ng的pCas9-NSI質體和pHR-trcS質體，並觀察pCas9-NSI質體和pHR-trcS質體交互作用後同源互換的效率。

請參照第7圖，為不同劑量之CRISPR/Cas9表達質體和模板質體共轉型至細長聚球藻PCC 7942後的同源互換效率結果圖，結果顯示，當pCas9-NSI質體的劑量為250ng時，幾乎沒有促進同源互換的作用。但將pCas9-NSI質體劑量提升至500ng，我們發現同源互換的效率呈現劑 量依賴性。且在所有組別中，加入2000ng的pHR-trcS質體與1000ng的pCas9-NSI質體的組別，其存活的菌落數最高，可達1.4±0.3×10⁵CFU，與僅加入2000ng的pHR-trcS質體的組別(傳統方式的控制組，菌落數僅為8.9±2.2×10⁴CFU)相比增加57%。顯示本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統可提升同源互換效率達57%。

而在pHR-trcS質體的劑量方面，加入250ng的pHR-trcS質體且同時配合適量的細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統(加入500-1000ng的pCas9-NSI質體)的組別，可以讓同源互換的成功率維持與加入2000ng的pHR-trcS質體組別近似的效率，這表示藉由本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統，可以使用較少量的模板質體就能達到相較傳統方法(加入2000ng的pHR-trcS質體)近似的同源互換效率。

本試驗例中進一步嘗試縮短模板質體上同源互換臂(homology arm)的長度，並嘗試藉由本發明之細長聚球藻PCC 7942基因編輯系統提升縮短同源互換臂後的同源互換效率。

請參照第8A圖，為具有不同長度同源互換臂之模板質體之構築示意圖。試驗上以先前構築的模板質體(pHR-trcS質體，同源互換左臂和同源互換右臂的長度分別為700bp)為基礎，構築一系列的質體(基因表現匣相同，但同源互換左臂和同源互換右臂的長度縮短為400bp、100bp或50bp)。再將新構築的模板質體與pCas9-NSI質體共 轉型入細長聚球藻PCC 7942中，觀察同源互換的效率。

請再參照第8B圖，為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統以不同長度的同源互換臂進行同源互換之同源互換效率的結果圖，結果顯示當同源互換臂長度縮短至400bp時，同源互換的效率仍可與700bp相近，但當同源互換臂長度縮短至100bp和50bp時，同源互換效率則大幅降低。此結果顯示，利用本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統可以縮短模板質體的同源互換臂的長度而不影響同源互換效率。

5.利用CRISPR/Cas9增加細長聚球藻PCC 7942同源重組之效率

細長聚球藻PCC 7942在非生長時期平均有4套相同染色體，傳統轉型方法進行同源互換時，往往只能將外源基因嵌入其中1-2套染色體，成為雜合重組體(heterozygous recombinant)。這類細胞在持續培養後，會逐漸失去外源基因，因此傳統方法往往需要再以增加抗生素濃度方式篩選三周以上，藉由抗生素給予的篩選壓力讓外來基因嵌入於所有染色體，而成為同源重組體(homozygous recombinant)。

為測試本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統是否可以加速篩選出同源重組體(所有染色體均含有外源基因)，試驗上以pCas9-NSI質體及pHR-trcS質體共轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中，並塗盤於培養皿，挑出菌落作為實驗組(Cas9-NSI組)。試驗上同時單獨轉型 pHR-trcS質體至細長聚球藻PCC 7942細胞，並塗盤於培養皿，挑出菌落作為傳統方式的控制組(HR-trcS組)。再將菌落送入養菌管培養至OD₇₃₀約達2.0時[此時為染色體約為4套的靜止期(stationary phase)]，取出染色體DNA以qPCR分析外源基因的拷貝數。

本試驗例進一步探討利用本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統是否可以減少在細長聚球藻PCC 7942中剃除染色體上基因所耗費的時間。試驗上將細胞(實驗組和控制組)重新塗盤於觀黴素濃度的固態培養基上，挑菌落並再移置養菌管培養，分析外源基因的拷貝數，此繼代步驟共進行3次。此外，試驗上為測試重覆以CRISPR切割染色體是否可加速篩選出同源重組體，在第二次及第三次繼代過程中自養菌管中取出細胞，並轉型pCas9-NSI質體至細胞中破壞未嵌入外源基因之染色體，再塗盤挑出菌落，送入養菌管培養至靜止期時，取出染色體DNA以qPCR分析外源基因的拷貝數(rCas9-NSI組)。

請參照第9A圖，為外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體平均套數之結果圖。結果顯示顯示，傳統方法(HR-trcS組)在第一次繼代時，外源基因平均拷貝數為1.6±0.8，到第三次繼代時也僅達3.0±0.4，顯示以傳統方法即使進行三次繼代和提升抗生素濃度進行篩選，也無法使轉型株達到同源重組體。實驗組(Cas9-NSI組)的外源基因平均拷貝數則在第一次繼代時就達到2.6±0.2，並在第三次繼代時達到3.9±0.3。而在rCas9-NSI組的外源基因平均 拷貝數則在第二次繼代時就達到3.5±0.5，並在第三次繼代時達到4.1±0.4，顯示本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統可加速得到同源重組體的速度。

為確認經基因改造的細胞已完全替代完畢，試驗上第三次篩選繼代後之HR-trcS及rCas9-NSI組任意選10個菌落經由菌落PCR測試NSI位置訊號是否仍然存在，由於細長聚球藻本身具有4套染色體，若將外源基因完全嵌入4套染色體中，則NSI位置之訊號(1.6kb)將會消失。請參照第9B圖，為利用菌落PCR確認本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統將外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體之結果圖，電泳結果顯示HR-trcS組幾乎每個菌落皆仍有NSI位置之訊號(1.6kb)，而rCas9-NSI組則完全沒有NSI位置訊號，藉此可證明本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統可以有效加速同源重組的速度。

為確認經基因改造的細胞穩定性，試驗上從rCas9-NSI組任意取1個菌落至入養菌管持續繼代培養4周，並在每週取細胞進行qPCR分析外源基因的平均拷貝數。請參照第10圖，為外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體後穩定性之結果圖，結果顯示，即使培養四週後，外源基因的拷貝數仍維持在4.1±0.2，證實細長聚球藻PCC 7942內的外源基因數目仍保持穩定。

6.利用CRISPR/Cas9編輯細長聚球藻PCC 7942代謝網路

本試驗例進一步探討是否可以利用本發明之細 長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統進行細長聚球藻PCC 7942代謝網路的編輯。請參照第11A圖至第11D圖，第11A圖為細長聚球藻PCC 7942內代謝路徑及調控基因之示意圖，第11B圖為利用基因編輯系統剔除細長聚球藻PCC 7942染色體上glgc基因所需質體之建構示意圖，第11C圖為細長聚球藻PCC 7942剔除glgc基因後肝醣產量變化之結果圖，第11D圖為細長聚球藻PCC 7942剔除glgc基因後琥珀酸(succinate,SUCC)產量變化之結果圖。

為建構能產出琥珀酸之細長聚球藻PCC 7942，本試驗例利用細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統中剔除glgc基因，並嵌入gltA基因和ppc基因至細長聚球藻PCC 7942細胞中。試驗上先構築pCas9-glgc質體、pGlgGtr-gltA-ppc質體和pGlgGtr質體。其中pCas9-glgc質體為將前述CRISPR/Cas9表達質體之crRNA序列修改為對應glgc基因位置，而glgc基因為可生產肝醣之基因。pGlgGtr-gltA-ppc質體和pGlgGtr質體為模板質體，其中pGlgGtr-gltA-ppc質體以部分glgc基因序列為同源互換臂，內含gentamycine抵抗基因以及兩個外源基因-gltA基因及ppc基因，gltA基因及ppc基因可以增加碳源進入檸檬酸循環，藉此增加琥珀酸產量。而pGlgGtr質體為控制組的模板質體，其係以部分glgc基因序列為同源互換臂，且僅有gentamycine抵抗基因而不具有外源基因。

在共轉型pCas9-glgc及模板質體(pGlgGtr-gltA-ppc質體或pGlgGtr質體)後，挑出單一菌 落進行缺氮培養分析肝醣及琥珀酸產量變化。請參照第11C圖，其中WT表示野生型細長聚球藻PCC 7942，△glgc表示剔除glgc基因的細長聚球藻PCC 7942，0×N表示在缺氮條件下培養。結果顯示，缺氮培養下，野生型細長聚球藻PCC 7942的肝醣產量為140.5±6.1ug/L/OD，而剔除glgc基因的細長聚球藻PCC 7942的肝醣產量可減少至9±1.2ug/L，表示利用本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統可以快速的將glgc基因剔除，進而降低肝醣之生產。請在參照第11D圖，其中WT表示野生型細長聚球藻PCC 7942，△glgc表示剔除glgc基因的細長聚球藻PCC 7942，△glgc：：ppc：：gltA表示剔除glgc基因並嵌入gltA基因和ppc基因的細長聚球藻PCC 7942，0×N表示在缺氮條件下培養，N.D.表示未偵測到琥珀酸。結果顯示，缺氮培養下，野生型細長聚球藻PCC 7942的琥珀酸產量為40.5±6.6ug/L，而剔除glgc基因並嵌入gltA基因及ppc基因的細長聚球藻PCC 7942，其琥珀酸產量可增加約10倍至435±35ug/L，顯示利用本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統可以剔除glgc基因並嵌入gltA基因及ppc基因以提升碳流進入檸檬酸循環，來達到提高琥珀酸產量的目的。

上述結果顯示，本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統及細長聚球藻PCC 7942基因編輯之方法，可以同時且有效的使細長聚球藻PCC 7942的4套染色體上基因組的目標位置雙股斷裂，以造成細長聚球藻PCC 7942細胞的死亡，並使欲嵌入的外源基因藉由轉型模板質體，精 確的與細長聚球藻PCC 7942的基因組整合，且在轉型後的第9天即偵測不到模板質體上的Cas9基因和crRNA。而本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統，其誘導的雙股斷裂對細長聚球藻PCC 7942施加內在選擇壓力，因而可提高同源重組效率，並可降低模板質體的使用量以及可以縮短同源互換臂的長度。本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統所誘導的雙股斷裂，亦可增加外源基因同時嵌入細長聚球藻PCC 7942的4套染色體的機會，因而可加速得到穩定的同源重組體的程序，且所得的同源重組體的外源基因表現穩定。此外，本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因編輯系統可以同步和精確的進行基因剔除和基因嵌入，以提高細長聚球藻PCC 7942中的琥珀酸產量。

二、本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾之系統

1.不同啟動子之螢光表現系統

目前在細長聚球藻PCC 7942中，對於不同種類啟動子的表現強度所知甚少，為了能夠在細長聚球藻PCC 7942中成功建立本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，本試驗例將會比較多種啟動子在細長聚球藻PCC 7942中的驅動活性。

啟動子的類型可分為誘導型(inducible)以及持續表現(constitutive)型兩大類。請參照第12A圖至第13B圖，第12A圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之誘導型啟動子之建構示意圖，第12B圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之誘導型啟動子之分析圖，第 13A圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之持續表現型啟動子之建構示意圖，第13B圖為本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之持續表現型啟動子之分析圖。

本試驗例將黃色螢光蛋白(eyfp)基因作為報導基因，並將多種不同啟動子接在其上游處，所建構的質體皆帶有細長聚球藻PCC 7942的NSI基因的同源互換序列，以及抵抗氯黴素(chloramphenicol resistance,Cm^R)基因，其中誘導型啟動子包含Smt啟動子、LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、Trc啟動子、LlacO1啟動子和BAD啟動子，其誘導物分別為8μM的Zn²⁺離子、1μM的aTc、2mM的茶鹼(theophylline)、1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；IPTG)、1mM的IPTG和1mM的阿拉伯糖(arabinose)。而Smt啟動子之序列如序列辨識編號8所示，LtetO1啟動子之序列如序列辨識編號9所示，ConII-ribo啟動子之序列如序列辨識編號10所示，Trc啟動子之序列如序列辨識編號11所示，LlacO1啟動子之序列如序列辨識編號12所示，以及BAD啟動子之序列如序列辨識編號13所示。持續表現型啟動子包含Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子、J23101啟動子和J23119啟動子。而Trc’啟動子之序列如序列辨識編號14所示，LlacO1’啟動子之序列如序列辨識編號15所示，ConII啟動子之序列如序列辨識編號16所示，J23101啟動子之序列如序列辨識編號17所示，以及J23119啟動子之序列如序列辨識編號18所示。

將建構好的質體藉由自然轉型的方式送入細長聚球藻PCC 7942，並塗佈於含有抗生素Cm之BG-11培養皿上進行篩選。大約等至7~9天後，刮取一個接種環的菌量在20mL含有氯黴素的BG-11培養基中培養，當培養至OD₇₃₀約為0.6~0.8，在誘導型啟動子組別中加入誘導劑，而持續表現型啟動子組別則不添加任何誘導劑。再經過24小時培養後(OD₇₃₀約為1~1.5)，以流式細胞儀來分析誘導型與持續表現型啟動子之螢光表現。

第12B圖和第13B圖的結果顯示，在誘導型啟動子組別中，以Zn²⁺離子誘導之Smt啟動子其誘導率最高(6.6倍)，而且誘導後又能達到最高的表現量(80.3a.u.)，其餘誘導型啟動子之螢光倍率與誘導後之螢光表現分別為LtetO1啟動子(2.3倍與4.7a.u.)、ConII-ribo啟動子(2.4倍與77.9a.u.)、Trc啟動子(2倍與37.7a.u.)、LlacO1啟動子(5.2倍與8.6a.u.)和BAD啟動子(1.4倍與7.0a.u.)。而在持續表現型啟動子組別中，螢光表現強度依序為ConII啟動子PJ23119啟動子>J23101啟動子>Trc’啟動子>LlacO1’啟動子，螢光強度分別為339a.u.、338a.u.、158a.u.、77a.u.以及46a.u.。由上述結果可知，在細長聚球藻PCC 7942中，Smt啟動子為誘導率最高(6.6倍)，而且誘導後又能達到最高的表現量，而ConII啟動子和J23119啟動子為持續表現強度最佳的啟動子。因此於後續試驗例中會挑選此三種啟動子建立本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統。但在細長聚球藻PCC 7942中，若需表現外 加蛋白基因時，並非大量表現外加蛋白基因即可達到目標產物產量最大化，還需考慮誘導率和基因表現幅度，因此並非只有最強表現之啟動子為最佳，其他啟動子亦可以使用於本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統中，來達到不同基因表現幅度，以優化目標產物的產量。

2.建立CRISPRi細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統

本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統包含細長聚球藻PCC 7942細胞、dCas9表達質體和sgRNA質體。

dCas9表達質體包含依序排列之第一同源互換左臂、第一啟動子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互換右臂，其中第一同源互換左臂和第一同源互換右臂構成第一同源互換區。於本試驗例中所示之一實施例，dCas9表達質體為pSdCas9-CY’質體，係利用黃螢光蛋白來當作測試模型，細長聚球藻PCC 7942細胞中不具有黃螢光蛋白，因而以pSdCas9-CY’質體中已具有的eyfp基因作為目標基因，並於eyfp基因前插入一持續型啟動子以表現黃螢光蛋白。pSdCas9-CY’質體之第一同源互換左臂之序列如序列辨識編號19所示，於本實施例中所使用的第一啟動子為一誘導型啟動子，其為序列如序列辨識編號8所示之Smt啟動子，dCas9基因之序列如序列辨識編號20所示，持續表現型啟動子為序列如辨識編號16所示之ConII啟動子，eyfp基因之序列如序列辨識編號21所示，抵抗第一抗生素基因為如序列辨識編號22所示之抵抗氯黴素基因，以 及第一同源互換右臂之序列如序列辨識編號23所示，由第一同源互換左臂和第一同源互換右臂所構成的第一同源互換區為細長聚球藻PCC 7942之NSI基因。將上述之第一同源互換左臂、Smt啟動子、dCas9基因、ConII啟動子、eyfp基因、抵抗氯黴素基因及第一同源互換右臂構築於pdCas9載體(Addgene)上，以得到pSdCas9-CY’質體。因此pSdCas9-CY’質體之Smt啟動子可以調控dCas9基因的表現，ConII啟動子可以驅動eyfp基因表現，而抵抗氯黴素基因則由此抗生素之啟動子驅動其表現。

sgRNA質體包含依序排列之第二同源互換左臂、第二啟動子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互換右臂序列，其中第二同源互換左臂和第二同源互換右臂構成第二同源互換區，sgRNA上spacer之序列與目標基因之序列相對應，而目標基因位於細長聚球藻PCC 7942細胞之染色體或外源質體上，第二同源互換區和第一同源互換區不相同，且抵抗第二抗生素基因和抵抗第一抗生素基因不相同。於本試驗例中建立sgRNA系列質體，分別為psgRNA：：Φ質體、psgRNA：：P1質體、psgRNA：：NT1質體和psgRNA：：NT2質體，這些sgRNA系列質體之差異在於sgRNA之序列不同，可以辨識目標基因表現匣非模板股上的不同位置(P1、NT1和NT2)，其餘部分相同，其第二同源互換左臂之序列如序列辨識編號24所示，於本實施例中所使用的第二啟動子為一持續表現型啟動子，其為序列如序列辨識編號18所示之J23119啟動子，抵抗第二抗生素基因 為如序列辨識編號25所示之抵抗卡納黴素(kanamycin resistance,Km^R)基因，以及第二同源互換右臂之序列如序列辨識編號26所示，由第二同源互換左臂和第二同源互換右臂所構成的第二同源互換區為細長聚球藻PCC 7942之NSII(neutral site II)基因。在sgRNA之序列部分，psgRNA：：Φ質體之sgRNA序列如序列辨識編號27所示，psgRNA：：P1質體之sgRNA序列如序列辨識編號28所示，psgRNA：：NT1質體之sgRNA序列如序列辨識編號29所示，psgRNA：：NT2質體之sgRNA序列如序列辨識編號30所示。將上述之第二同源互換左臂、第二啟動子、sgRNA之序列、抵抗第二抗生素基因及第二同源互換右臂構築於NSII_plus載體上，以得到sgRNA系列質體。

本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統中之第一啟動子除上述之Smt啟動子外，亦可為LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、LlacO1啟動子、BAD啟動子、Trc啟動子、Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子、J23101啟動子或J23119啟動子。第二啟動子除上述之J23119啟動子外，亦可為Smt啟動子、LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、LlacO1啟動子、BAD啟動子、Trc啟動子、Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子或J23101啟動子。於dCas9表達質體的第一同源交換區可為NSI基因或NSII基因，而於sgRNA質體的第二同源交換區亦可為NSI基因或NSII基因，但第一同源交換區之序列和第二同源交換區之序列不相同。於dCas9表達質體的抵抗第一抗生 素基因可為抵抗卡納黴素基因、抵抗氯黴素基因或抵抗觀黴素基因，於sgRNA質體的第二抵抗抗生素基因可為抵抗卡納黴素基因、抵抗氯黴素基因或抵抗觀黴素基因，但抵抗第一抗生素基因和抵抗第二抗生素基因不相同。

3.抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法

請參照第14圖，為本發明之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法300之步驟流程圖，本發明之調控細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法300包含步驟310、步驟320、步驟330、步驟340和步驟350。

步驟310為構築dCas9表達質體，所構築之dCas9表達質體包含依序排列之第一同源互換左臂、第一啟動子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互換右臂，其中第一同源互換左臂和第一同源互換右臂構成第一同源互換區。

步驟320為構築sgRNA質體，所構築之sgRNA質體包含依序排列之第二同源互換左臂、第二啟動子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互換右臂，其中第二同源互換左臂和第二同源互換右臂構成第二同源互換區，sgRNA上spacer之序列與目標基因之序列相對應，所述目標基因位於細長聚球藻PCC 7942細胞之染色體或外源質體上。第二同源互換區和第一同源互換區不相同，且抵抗第二抗生素基因和抵抗第一抗生素基因不相同。

步驟330為將dCas9表達質體轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中，以得到第一轉型株。dCas9表達質體 之第一同源互換區會與第一轉型株之染色體之第一同源互換區進行同源交換，將第一啟動子、dCas9基因及抵抗第一抗生素基因嵌入第一轉型株之染色體之第一同源互換區中。

步驟340為將sgRNA質體轉型至第一轉型株中，以得到第二轉型株。sgRNA表達質體之第二同源互換區與第二轉型株之染色體之第二同源互換區進行同源交換，將第二啟動子、sgRNA及抵抗第二抗生素基因嵌入第二形株之染色體之第二同源互換區中。

步驟350為培養第二轉型株，若第一啟動子為誘導型啟動子，另加入誘導物誘導dCas9表達質體表現dCas9蛋白，dCas9蛋白與sgRNA質體表現之sgRNA會形成dCas9蛋白複合體，且dCas9蛋白複合體結合至目標基因序列上，以抑制目標基因之表現。

請再參照第15A圖和第15B圖，第15A圖為本發明之dCas9表達質體構築和同源互換之示意圖，第15B圖為本發明之sgRNA質體構築和同源互換之示意圖，於本試驗例中所示之一實施例，dCas9表達質體為pSdCas9-CY’質體。試驗時先將pSdCas9-CY’質體轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中，pSdCas9-CY’質體的第一同源互換左臂和第一同源互換右臂與細長聚球藻PCC 7942之染色體之NSI基因會進行同源互換，將pSdCas9-CY’質體上的Smt啟動子、dCas9基因、ConII啟動子、eyfp基因和抵抗卡納黴素基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體之NSI基因中，以得到第一轉型株。再將sgRNA質體轉型至第一轉型 株中，sgRNA質體的第二同源互換左臂和第二同源互換右臂與細長聚球藻PCC 7942之染色體之NSII基因會進行同源互換，將sgRNA質體上的J23119啟動子、sgRNA序列和抵抗氯黴素基因嵌入細長聚球藻PCC 7942之染色體之NSII基因中，以得到第二轉型株。

4.本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統之成效

為測試本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統是否能成功抑制細長聚球藻PCC 7942中目標基因的表現，於本試驗例中，先將pSdCas9-CY’質體轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中得到第一轉型株，再分別將psgRNA：：Φ質體、psgRNA：：P1質體、psgRNA：：NT1質體和psgRNA：：NT2質體轉型至第一轉型株中，以得到第二轉型株(分別為dCas9：：Φ組、dCas9：：P1組、dCas9：：NT1組和dCas9：：NT2組)，第二轉型株將同時表現dCas9蛋白、黃螢光蛋白以及sgRNA，預期dCas9蛋白會與sgRNA形成dCas9蛋白複合體，並標的至啟動子ConII或是eyfp基因來抑制黃螢光蛋白的表現。而psgRNA：：Φ質體的sgRNA並無對應至細長聚球藻PCC 7942之染色體中任何序列。

為了確定需同時表現dCas9蛋白以及sgRNA才能展現本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統的抑制效用，試驗上利用不具有dCas9基因之pConII-EYFP質體先轉型至細長聚球藻PCC 7942細胞中，嵌入至細長聚球藻PCC 7942染色體中的NSI基因，再 轉型psgRNA：：P1質體並嵌入至細長聚球藻PCC 7942染色體中NSII(P1組)。試驗上亦包含僅轉型pSdCas9-CY’質體，但未轉型sgRNA質體至細長聚球藻PCC 7942細胞中的組別(dCas9組)，以此兩組來為實驗的控制組，驗證僅具有dCas9蛋白或sgRNA無法造成黃螢光蛋白的表現抑制。

確認上述轉型株已成功將質體嵌入至染色體正確位置後，先將dCas9：：Φ組之螢光值與dCas9組以及P1組相比，來確認表現dCas9蛋白以及sgRNA：：Φ不會干擾螢光值，並確定需同時表現dCas9蛋白以及sgRNA才會表現本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統。由於在試驗過程中發現Smt啟動子無法良好的調控dCas9蛋白，造成持續表現系統，因此在後續培養過程中不加入Zn²⁺離子誘導劑，並將單株菌落養至含40ml BG-11之震盪錐形瓶中，培養至OD₇₃₀為1~1.5時，進行螢光顯微鏡以及流式細胞儀分析，觀察本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統的抑制情形。

請參照第16A圖和第16B圖，為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統抑制目標基因表現之結果圖。其中第16A圖為利用螢光顯微鏡觀察之結果，第16B圖為利用流式細胞儀進行各試驗組的螢光分析，並以dCas9：：Φ組為基準計算其他組別的抑制效果。第16A圖中紅螢光的部分為細長聚球藻PCC 7942之自體螢光，可用以判斷細胞健康狀況以及觀察黃螢光表現時細胞相對位置。結果顯示，若單獨表現dCas9蛋白(dCas9組)或是sgRNA(P1 組)時，仍可觀察到黃色螢光訊號之產生，且所表現出的螢光強度與dCas9：：Φ組之間並沒有太大的差別。而dCas9：：P1組和dCas9：：NT1組則可發現黃色螢光訊號非常弱，表示以本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統標的P1(啟動子位置)及NT1(基因的5’端位置)可達到良好的抑制效果，而在dCas9：：NT2組仍可以觀察到些許的螢光訊號，因此以本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統標的NT2(離基因轉錄起始點較遠位置)只有部分的抑制效果產生。

由第16B圖流式細胞儀分析結果顯示，dCas9組(263.4a.u.)和P1組(288.7a.u.)所表現出的螢光強度與dCas9：：Φ組(281.9a.u.)之間沒有太大的差別(p>0.05)，並無觀察到任何抑制效果的產生。但使用本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統之組別，所表現出的螢光強度與dCas9：：Φ組之間則皆具有顯著差異(p<0.05)。其中不論是在轉錄初始期(dCas9：：P1組)或是延長期(dCas9：：NT1組)相較於dCas9：：Φ組，皆能有效的抑制基因之表現(p<0.05)，其抑制率分別為95%以及99%。而抑制標的改為更靠近基因中間之位置(dCas9：：NT2組)，只產生了部分的抑制效果(p<0.05)，其抑制率降低為76%，與先前螢光顯微鏡分析中觀察到的結果相同。由以上結果可知，在細長聚球藻PCC 79421中，本發明之細長聚球藻之基因表現干擾系統確實需要同時表現dCas9蛋白以及sgRNA才會對目標基因產生抑制效果，且能有效的在轉錄初始期就能阻擋RNA 聚合酶與啟動子之結合，以及在轉錄過程中之延長期時能中斷RNA聚合酶轉錄之過程，以達到抑制目標基因表現的效果。

5.本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現干擾系統之穩定性和毒性分析

為了觀察持續表現本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統是否會對細胞造成毒性，以及本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統是否能持續且穩定的抑制基因表現，本試驗以dCas9：：Φ組作為控制組來計算本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統之抑制情形，試驗組包含dCas9：：P1組、dCas9：：NT1組和dCas9：：NT2組。將各組別之單株菌落養至40mL含有卡納黴素和氯黴素的BG-11培養基中。試驗上另外也培養野生型的細長聚球藻PCC 7942至40mL的BG-11培養基中做為觀察各組菌生長曲線之控制組。後續進行21天之長期觀察，每天從各組中取1mL的樣品進行生長曲線分析，另外每三天取1mL的樣品以流式細胞儀分析各組的螢光表現情況，並回補4mL的BG-11培養基來維持錐形瓶中培養基之總體積。

請參照第17A圖，為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統對細胞造成毒性之分析結果圖，其係以細長聚球藻PCC 7942之生長曲線來觀察本發明之細長聚球藻PCC 7942是否對細胞造成毒性。結果顯示，所有試驗組的生長曲線與控制組(野生型細長聚球藻PCC 7942) 之間並沒有太大的差別(p>0.05)，由此可知持續表現本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統並沒有對細長聚球藻PCC 7942細胞產生負面影響。

請再參照第17B圖，為本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統之基因調控穩定性之分析結果圖，結果顯示，本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統在細長聚球藻PCC 7942生長初期(第三天時)，即可表現良好的抑制效果(96.5%)，而即便在生長後期(第21天時)，控制組(dCas9：：Φ組)之螢光持續上升，dCas9：：NT1組別仍可以維持良好的抑制效果(99%)。

由上述結果可知，本發明之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統及抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，不僅不會對細長聚球藻PCC 7942造成負面影響外，又能長時間穩定且有效的抑制目標基因之表現，且相較於傳統之方法，僅需設計sgRNA之序列，sgRNA之設計容易而且基因表現的抑制幅度是可以隨意調控，可利用部分抑制目標基因之方式來抑制必要基因之表現，因而具有multiplexing的潛力。此外CRISPRi系統則屬於外源的基因調控與編輯系統，不會與內源系統競爭，未來可望成為優化細長聚球藻PCC 7942生產之有力工具，在應用於未來生產上非常具有優勢。

三、本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現調控之系統

1.建立CRISPR細長聚球藻PCC 7942基因表現調控系統

本發明之細長聚球藻PCC基因表現調控之系統包含細長聚球藻PCC 7942細胞、基因編輯單元和基因表現干擾單元。其中基因編輯單元包含CRISPR/Cas9表達質體和模板質體，基因表現干擾單元包含dCas9表達質體和sgRNA質體。

基因編輯單元中的CRISPR/Cas9表達質體包含tracrRNA、Cas9基因及crRNA，模板質體包含依序排列之第三同源互換左臂、抵抗第三抗生素基因、外源基因以及第三同源互換右臂，第三同源互換左臂和第三同源互換右臂構成第三同源互換區，且第三同源互換區之序列與細長聚球藻PCC 7942之染色體之第一特定序列相對應，crRNA序列則對應細長聚球藻PCC 7942之染色體之第二特定序列。

基因表現干擾單元中的dCas9表達質體包含依序排列之第一同源互換左臂、第一啟動子、dCas9基因、抵抗第一抗生素基因及第一同源互換右臂，其中第一同源互換左臂和第一同源互換右臂構成第一同源互換區。sgRNA質體包含依序排列之第二同源互換左臂、第二啟動子、sgRNA、抵抗第二抗生素基因及第二同源互換右臂序列，其中第二同源互換左臂和第二同源互換右臂構成第二同源互換區，sgRNA之序列與目標基因之序列相對應，所述目標基因位於細長聚球藻PCC 7942細胞之染色體或外源質體上，第二同源互換區和第一同源互換區不相同，且抵抗第二抗生素基因和抵抗第一抗生素基因不相同。

本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現調控 之系統中之第一啟動子和第二啟動子可為Smt啟動子、LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、LlacO1啟動子、BAD啟動子、Trc啟動子、Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子、J23101啟動子或J23119啟動子。第一同源交換區、第二同源交換區和第三同源交換區可為NSI基因或NSII基因，但第一同源交換區之序列、第二同源交換區之序列和第三同源交換區之序列彼此不相同。抵抗第一抗生素基因、抵抗第二抗生素基因和抵抗第三抗生素基因可為抵抗卡納黴素基因、抵抗氯黴素基因或抵抗觀黴素基因，但抵抗第一抗生素基因、抵抗第二抗生素基因和抵抗第三抗生素基因彼此不相同。

2.調控細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法

請參照第18圖，為本發明之細長聚球藻PCC 7942基因調控之方法500之步驟流程圖，細長聚球藻PCC 7942基因調控之方法500包含步驟510、步驟520和步驟530。

步驟510為提供細長聚球藻PCC 7942細胞。

步驟520為提供基因編輯步驟，係利用基因編輯單元將外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942細胞中，其包含共轉型CRISPR/Cas9表達質體和模板質體至細長聚球藻PCC 7942細胞中，以得到第一轉型株。培養第一轉型株，其中CRISPR/Cas9表達質體表現之tracrRNA、Cas9蛋白和crRNA會形成Cas9蛋白複合體，對第一轉型株之染色體之第一同源互換區進行雙股斷裂，且模板質體之第一同源互 換區與第三轉型株之染色體之第一同源互換區進行同源交換，將抵抗第一抗生素基因和外源基因嵌入第一轉型株之染色體之第一同源互換區中。

步驟530為提供抑制基因表現步驟，利用基因表現干擾單元抑制目標基因之表現，其包含轉型dCas9表達質體至第一轉型株中，以得到第二轉型株，其中dCas9表達質體之第二同源互換區與第二轉型株之染色體之第二同源互換區進行同源交換，將第一啟動子序列、dCas9基因及抵抗第二抗生素基因嵌入第二轉型株之染色體之第二同源互換區中。再轉型sgRNA質體轉型至第二轉型株中，以得到第三轉型株，其中sgRNA表達質體之第三同源互換區與第三轉型株之染色體之第三同源互換區進行同源交換，將第二啟動子、sgRNA及抵抗第三抗生素基因嵌入第三轉型株之染色體之第三同源互換區中。培養第三轉型株，並加入誘導物誘導dCas9表達質體表現dCas9蛋白，dCas9蛋白與sgRNA質體表現之sgRNA會形成dCas9蛋白複合體，且dCas9蛋白複合體結合至目標基因上，以抑制目標基因之表現。

藉此，本發明之細長聚球藻PCC 7942基因表現調控之系統及調控細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，可全面的操控細長聚球藻PCC 7942的代謝路徑，利用基因編輯單元將外源基因嵌入細長聚球藻PCC 7942細胞中，再利用基因表現干擾單元抑制細長聚球藻PCC 7942細胞中目標基因之表現，達到優化目標產物產量之目的。

然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立清華大學

<120> 細長聚球藻PCC 7942之基因表現調控系統及其應用

<160> 30

<210> 1

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> tracrRNA

<400> 1

<210> 2

<211> 4107

<212> DNA

<213> Streptococcus pyogenes

<223> Cas9基因

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> crRNA

<400> 3

<210> 4

<211> 799

<212> DNA

<213> Synechococcus elongates

<223> 同源互換左臂

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 抵抗觀酶素基因

<400> 5

<210> 6

<211> 2663

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 外源基因

<400> 6

<210> 7

<211> 703

<212> DNA

<213> Synechococcus elongates

<223> 同源互換右臂

<400> 7

<210> 8

<211> 545

<212> DNA

<213> Synechococcus elongates

<223> smt啟動子

<400> 8

<210> 9

<211> 709

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> LtetO1啟動子

<400> 9

<210> 10

<211> 97

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> ConII-ribo啟動子

<400> 10

<210> 11

<211> 1503

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Trc啟動子

<400> 11

<210> 12

<211> 1564

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> LlacO1啟動子

<400> 12

<210> 13

<211> 1190

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> BAD啟動子

<400> 13

<210> 14

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> Trc’啟動子

<400> 14

<210> 15

<211> 151

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> LlacO1’啟動子

<400> 15

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> ConII啟動子

<400> 16

<210> 17

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> J23101啟動子

<400> 17

<210> 18

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> J23119啟動子

<400> 18

<210> 19

<211> 799

<212> DNA

<213> Synechococcus elongates

<223> 第一同源互換左臂

<400> 19

<210> 20

<211> 4107

<212> DNA

<213> Streptococcus pyogenes

<223> dCas9基因

<400> 20

<210> 21

<211> 720

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> eyfp基因

<400> 21

<210> 22

<211> 660

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 抵抗氯黴素基因(Cm^R)

<400> 22

<210> 23

<211> 783

<212> DNA

<213> Synechococcus elongates

<223> 第一同源互換右臂

<400> 23

<210> 24

<211> 925

<212> DNA

<213> Synechococcus elongates

<223> 第二同源互換左臂

<400> 24

<210> 25

<211> 795

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> 抵抗卡納黴素基因(Km^R)

<400> 25

<210> 26

<211> 1045

<212> DNA

<213> Synechococcus elongates

<223> 第二同源互換右臂

<400> 26

<210> 27

<211> 465

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> psgRNA：：Φ質體之sgRNA

<400> 27

<210> 28

<211> 485

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> psgRNA：：P1質體之sgRNA

<400> 28

<210> 29

<211> 485

<212> DNA

<213> psgRNA：：NT1質體之sgRNA

<223> Artificial Sequence

<400> 29

<210> 30

<211> 485

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<223> psgRNA：：NT2質體之sgRNA

<400> 30

Claims (12)

1. 一種細長聚球藻(S.elongates)PCC 7942之基因表現干擾系統，包含：一細長聚球藻PCC 7942細胞；一dCas9表達質體，其中該dCas9表達質體包含依序排列之一第一同源互換左臂、一第一啟動子、一dCas9基因、一抵抗第一抗生素基因及一第一同源互換右臂，該第一同源互換左臂和該第一同源互換右臂構成一第一同源互換區；以及一sgRNA質體，其中該sgRNA質體包含依序排列之一第二同源互換左臂、一第二啟動子、一sgRNA、一抵抗第二抗生素基因及一第二同源互換右臂序列，該第二同源互換左臂和該第二同源互換右臂構成一第二同源互換區，該sgRNA上之一序列與一目標基因之序列相對應，其中該目標基因位於該細長聚球藻PCC 7942細胞之該染色體或一外源質體上，該第二同源互換區和該第一同源互換區不相同，且該抵抗第二抗生素基因和該抵抗第一抗生素基因不相同。
2. 如申請專利範圍第1項所述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，其中該第一同源互換區為NSI(neutral site I)序列或NSII(neutral site II)序列。
3. 如申請專利範圍第1項所述之細長聚球藻 PCC 7942之基因表現干擾系統，其中該第二同源互換區為NSI(neutral site I)序列或NSII(neutral site II)序列。
4. 如申請專利範圍第1項所述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，其中該抵抗第一抗生素基因為抵抗卡納黴素(kanamycin resistance,Km^R)基因、抵抗氯黴素(chloramphenicol resistance,Cm^R)基因或抵抗觀黴素(Spectinnomycin resistance,Spec^R)基因。
5. 如申請專利範圍第1項所述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，其中該抵抗第二抗生素基因為抵抗卡納黴素基因、抵抗氯黴素基因或抵抗觀黴素基因。
6. 如申請專利範圍第1項所述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，其中該第一啟動子為Smt啟動子、LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、LlacO1啟動子、BAD啟動子、Trc啟動子、Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子、J23101啟動子或J23119啟動子。
7. 如申請專利範圍第1項所述之細長聚球藻PCC 7942之基因表現干擾系統，其中該第二啟動子為Smt啟動子、LtetO1啟動子、ConII-ribo啟動子、LlacO1 啟動子、BAD啟動子、Trc啟動子、Trc’啟動子、LlacO1’啟動子、ConII啟動子、J23101啟動子或J23119啟動子。
8. 一種抑制細長聚球藻(S.elongates)PCC 7942基因表現之方法，包含：構築一dCas9表達質體，其中該dCas9表達質體包含依序排列之一第一同源互換左臂、一第一啟動子、一dCas9基因、一抵抗第一抗生素基因及一第一同源互換右臂，該第一同源互換左臂和該第一同源互換右臂構成一第一同源互換區；構築一sgRNA質體，其中該sgRNA質體包含依序排列之一第二同源互換左臂、一第二啟動子、一sgRNA、一抵抗第二抗生素基因及一第二同源互換右臂，該第二同源互換左臂和該第二同源互換右臂構成一第二同源互換區，該sgRNA上之一序列與一目標基因之序列相對應，其中該目標基因位於該細長聚球藻PCC 7942細胞之該染色體或一外源質體上，該第二同源互換區和該第一同源互換區不相同，且該抵抗第二抗生素基因和該抵抗第一抗生素基因不相同；將該dCas9表達質體轉型至一細長聚球藻PCC 7942細胞中，以得到一第一轉型株，其中該dCas9表達質體之該第一同源互換區與該第一轉型株之一染色體之該第一同源互換區進行同源交換，將該第一啟動子、該dCas9基因之序列及該抵抗第一抗生素基因嵌入該第一轉型株之該染色體之該第一同源互換區中； 將該sgRNA質體轉型至該第一轉型株中，以得到一第二轉型株，其中該sgRNA表達質體之該第二同源互換區與該第二轉型株之該染色體之該第二同源互換區進行同源交換，將該第二啟動子、該sgRNA及該抵抗第二抗生素基因嵌入該第二轉型株之該染色體之該第二同源互換區中；以及培養該第二轉型株，並加入一誘導物誘導該dCas9表達質體表現一dCas9蛋白，該dCas9蛋白與該sgRNA質體表現之該sgRNA形成一dCas9蛋白複合體，且該dCas9蛋白複合體結合至該目標基因上，以抑制該目標基因之表現。
9. 如申請專利範圍第8項所述之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，其中更包含一第一篩選步驟，係以含有一第一抗生素之一培養基培養該第一轉型株。
10. 如申請專利範圍第9項所述之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，其中該第一抗生素為卡納黴素(kanamycin)、氯黴素(chloramphenicol)或觀黴素(Spectinnomycin)。
11. 如申請專利範圍第8項所述之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，其中更包含一第二篩選步驟，係以含有一第二抗生素之該培養基培養該第二轉 型株。
12. 如申請專利範圍第11項所述之抑制細長聚球藻PCC 7942基因表現之方法，其中第二抗生素為卡納黴素、氯黴素或觀黴素。