CN111944811B - 靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。本发明提供了靶向敲除FRZB基因的双sgRNA，针对FRZB基因第一外显子上两个位点进行切割，后将所述sgRNA构建至表达载体后通过优化的电转体系转染猪成纤维细胞，再利用流式细胞仪分选出高纯度的阳性单克隆细胞，经基因组鉴定筛选得到FRZB敲除的细胞系。本发明解决了构建敲除细胞系过程中转染效率、打靶效率低、单克隆纯度低的难题，操作简便且得到了较长片段删除的编辑细胞系。涉及到的细胞系可作为体细胞核移植的供体，用于转基因猪的制备，为深度挖掘FRZB基因生物学功能提供了较好的研究工具。

Description

靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细 胞系及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。

背景技术

基因敲除是研究基因功能和遗传改良的有效手段。CRISPR/Cas9是目前最常用的基因编辑系统，广泛用于基因功能和转基因动物制备等的研究中。主要原理是通过sgRNA将Cas9蛋白引导至和其序列互补的基因组区域，使得Cas9蛋白和目标基因组序列结合，进行基因组切割导致DNA双链断裂，常通过非同源末端修复的方式，在靶位点处产生一个或几个碱基的插入或缺失，以达到基因功能敲除的目的。然而，由于预测sgRNA效率的方法还不是很完善，1个sgRNA只能靶向基因的1个位点，打靶效率低，即使靶向成功，也可能因为只产生个别几个碱基的indel而不造成移码突变，不影响蛋白的功能。

FRZB(Frizzled motif associated with bone development)基因编码分泌型卷曲相关蛋白3，是Wnt的天然拮抗剂，可以通过竞争性结合调控Wnt信号途径，在特异类型细胞中调节细胞生长和分化。有研究表明，猪FRZB可能是生长性状的候选基因，在骨骼、肌肉发育和脂肪沉积中发挥调节作用，干扰FRZB能促进肌细胞的增殖、迁移和分化。因此，敲除FRZB可能使猪生长速度加快，减少脂肪沉积，增加瘦肉率，提高产量。目前，有关猪源FRZB基因功能研究的报道还很少，也没有相关基因敲除细胞系。

因此，针对Cas9系统的不足，可以通过高效的手段制备一种能实现沉默彻底且能长期稳定体外培养的猪FRZB基因缺失细胞株，期望通过FRZB基因缺失成纤维细胞株制备转基因猪，为生产FRZB基因敲除猪和深入挖掘FRZB基因生物学功能提供有利的工具。

发明内容

为了至少解决现有技术存在的一种问题，本发明提供靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用。

第一方面，本发明提供一种靶向FRZB基因的双sgRNA，包括：

FRZB-sgRNA1和FRZB-sgRNA2；

所述FRZB-sgRNA1的靶向序列为：CAGCACTCAGGCCAACGCCA，(SEQ ID NO：1)

所述FRZB-sgRNA2的靶向序列为：CTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC。(SE Q ID NO：4)

进一步地，所述FRZB-sgRNA1的核苷酸序列包括：

FRZB-sgRNA1Oligo1：5'-CACCgTGGCGTTGGCCTGAGTGCTG-3'，(SE Q ID NO：2)

FRZB-sgRNA1Oligo2：5'-AAACCAGCACTCAGGCCAACGCCAC-3'；(SE Q ID NO：3)

所述FRZB-sgRNA2的核苷酸序列包括：

FRZB-sgRNA2Oligo1：5'-CACCgCCAGGCTTTCCGGCCACGAG-3'，(SE Q ID NO：5)

FRZB-sgRNA2Oligo2：5'-AAACCTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC-3'。(S EQ ID NO：6)

本发明采用双sgRNA靶向敲除法，在FRZB基因的第一外显子上同时产生两个DNA双链断裂点，增加基因组片段缺失的频率，得到了2个sgRNA之间较长片段丢失的敲除细胞，造成移码突变，相较于单位点敲除法敲除效率高、种系突变多，更易造成移码突变，并且由于本发明的2个sgRNA设计在同一个外显子上，即使没有片段丢失，2个sgRNA造成阅读框发生错位突变的概率也远大于单独一个sgRNA。除此之外，本发明提供的2个sgRNA的活性差异很大，2个sgRNA中的一个活性高就可以敲除基因，如果2个活性都高，敲除效率会更高，更易造成移码突变。

进一步地，本发明提供用于编码所述双sgRNA的DNA分子。

本发明进一步提供包括所述双sgRNA的生物材料，所述生物材料为载体、表达盒或转基因细胞中的一种或多种。

例如，可以将所述双sgRNA连接至载体pX330上，具体方法为：

将序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6磷酸化退火后分别与经过BbsI酶切的线性pX330-EGFP载体连接，依次构建表达载体pX330-EGFP-FRZB-sgRNA1和pX330-EGFP-FRZB-sgRNA2。

第二方面，本发明提供一种敲除了FRZB基因的细胞系的构建方法，包括：利用CRISPR/Cas9系统敲除所述细胞系的FRZB基因，所述CRISPR/Cas9系统使用的sgRNA为所述双sgRNA。

进一步地，所述利用CRISPR/Cas9系统敲除所述细胞系的FRZB基因中使用p X330载体，

进一步地，所述细胞系为猪成纤维细胞系。

作为一种优选的实施方式，本发明提供一种猪成纤维细胞系的构建方法，包括：

S1、培养猪成纤维细胞至70～90％汇合度时，将表达载体pX330-EGFP-FRZB-sgRNA1和pX330-EGFP-FRZB-sgRNA2共同电击转染进猪成纤维细胞中；

S2、流式分选筛选单克隆细胞并培养；

S3、待细胞数目长满后提取细胞基因组并进行PCR鉴定；

S4、将PCR产物测序，测序结果与野生型参考序列SEQ ID NO：10进行比对，确定突变体。

进一步地，所述步骤S3中PCR鉴定所用的上游引物、下游引物分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9。

本发明进一步提供所述构建方法构建得到的猪成纤维细胞系在制备FRZB基因功能研究模型中的应用。

本发明进一步提供所述猪成纤维细胞系在转基因猪制备中的应用。

本发明具备如下有益效果：

1、本发明首次得到FRZB基因敲除的猪成纤维细胞系，利用CRISPR/Cas9系统设计双sgRNA从猪成纤维细胞中敲除FRZB基因，有效改进了抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默基因表达的缺点，敲除效果更加彻底，适于对FRZB缺失的猪成纤维细胞进行更加深入的研究，填补国内外相关技术的空白，具有较大的应用研究价值；

2、本发明通过向猪成纤维细胞转染CRISPR/Cas9表达载体达到FRZB基因敲除的目的，获得的基因敲除细胞系可作为体细胞核移植的供体，制备转基因猪，为深度挖掘FRZB基因生物学功能提供有利的研究工具。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的pX330-EGFP载体骨架图谱；

图2为本发明实施例1提供的重组表达载体测序序列比对分析；

图3为本发明实施例1提供的重组表达载体靶向切割效率检测；

图4为本发明实施例2提供的转染后猪成纤维细胞的荧光表达结果；

图5为本发明实施例2提供的突变型细胞Clone D5的碱基序列及对应氨基酸序列的比对分析，碱基序列比对中框出的为靶点序列，氨基酸序列比对中星号为终止密码子；

图6为本发明实施例2提供的突变型细胞Clone 1H7的碱基序列及对应氨基酸序列的比对分析，碱基序列比对中框出的为靶点序列，氨基酸序列比对中星号为终止密码子。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1靶向FRZB基因的CRISPR/Cas9打靶载体的构建及检测

1、FRZB基因sgRNA的序列设计

从NCBI网站下载猪FRZB基因序列(登录号NC_010457.5)，利用网站http://crispr.mit.edu/在该基因的第一个外显子上设计敲除靶位点，挑选的10个sgRNA经PCR测序显示套峰均不明显，编辑效率低，筛选出套峰相对较高的四个sgRNA进行两两组合，编辑效率有所提高，最终优选出测序套峰最高、编辑效率最高的一组双sgRNA，两条靶序列分别为FRZB-sgRNA1：CAGCACTCAGGCCAACGCCA(如SEQ ID NO：1所示)，FRZB-sgRNA2：CTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC(如SEQ ID NO：4所示)。根据BbsI限制性内切酶在sgRNA的两端设计酶切位点，在sgRNA的5'端加上CACCG；反向互补序列的5'端加上AAAC，3'端加上C，设计2对sgRNA寡核苷酸链，对应的序列如下：

FRZB-sgRNA1Oligo1：5'-CACCgTGGCGTTGGCCTGAGTGCTG-3'；(SEQ ID NO：2)

FRZB-sgRNA1Oligo2：5'-AAACCAGCACTCAGGCCAACGCCAC-3'；(SEQ ID NO：3)

FRZB-sgRNA2Oligo1：5'-CACCgCCAGGCTTTCCGGCCACGAG-3'；(SEQ ID NO：5)

FRZB-sgRNA2Oligo2：5'-AAACCTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC-3'；(SEQ ID NO：6)

2、pX330-EGFP质粒表达载体的构建

(1)pX330-EGFP载体骨架如图1所示。按照表1配制酶切体系，配制完成以后将体系置于37℃的水浴锅中酶切4～5h。酶切结束后进行1％琼脂糖凝胶电泳，根据Tiangen胶回收试剂盒回收纯化含粘性末端的酶切产物。

表1-pX330-EGFP酶切体系试剂配制表

(2)sgRNA Oligo退火及双链的形成。按照表2的用量配制Oligo退火体系，置于PCR仪中。设置PCR仪程序，首先37℃孵育30min使Oligo5'端磷酸化，然后95℃变性5min，最后以5℃/min的速度降温至25℃，即得到退火产物双链DNA分子。

表2-Oligo退火体系

(3)取1μL退火产物，加入199μL ddH₂O，稀释混匀。

(4)配置Oligo引物与酶切后的pX330-EGFP质粒的连接体系，按照表3配置连接体系，于16℃连接过夜。

表3-连接体系

(5)将重组载体转化进DH5α大肠杆菌感受态细胞中，混匀后冰浴30min，然后在42℃热激转化90s，随后冰浴2min，加入37℃温育好的无菌LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％氯化钠)950μL，在37℃，180rpm/min的条件下震荡培养2h，取100μL菌液均匀涂布在氨苄青霉素抗性固体LB培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)上，37℃培养箱过夜倒置培养12～16h。

(6)测序：取单菌落，在1mL含100μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中培养，150rpm摇菌至浑浊，菌液送往测序公司，测序使用U6启动子的正向引物，其序列为：5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3'(如SEQ ID NO：7所示)。

(7)保菌：测序结果如图2所示，将连接正确的菌落挑选出来，命名为pX330-EGFP-FRZB-sgRNA1和pX330-EGFP-FRZB-sgRNA2，扩大培养，然后加入20％的硝酸甘油，在-80℃冰箱中保存。

3、打靶效率检测

待六孔板中猪成纤维细胞生长至70％～90％的汇合度时，使用Lonza电转仪的T-024程序进行电穿孔转染，转染体系为150μL电击液加10μg表达载体，其中表达载体设置为三组，分别为单独转染pX330-EGFP-FRZB-sgRNA1、单独转染pX330-EGFP-FRZB-sgRNA2以及二者各5μg共转。转染后的细胞培养48h后，收集细胞提取基因组，进行PCR扩增，将得到的650bp产物送公司测序，以检测打靶效率。PCR鉴定所用的上游引物、下游引物分别为SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9所示。PCR扩增使用20uL反应体系：10μL 2×Power Taq PCR MasterMix，8μL ddH₂O，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃终延伸5min。

测序结果如图3所示，采用共转质粒pX330-EGFP-FRZB-sgRNA1和pX330-EGFP-FRZB-sgRNA2能在猪成纤维细胞基因组的靶位点附近发生切割，且活性远高于单独转染组，双sgRNA靶向体系可用于后续实验。

实施例2 FRZB基因敲除猪成纤维细胞系的构建及基因组鉴定

1、阳性单克隆细胞的筛选

(1)待猪成纤维细胞生长至70％～90％的汇合度时，配制含有150μL电击液、5μgpX330-EGFP-FRZB-sgRNA1和5μg pX330-EGFP-FRZB-sgRNA2表达载体的混合液，使用Lonza电转仪的T-024程序进行电转。

(2)电转6h后换成含10％胎牛血清生长培养基。转染电转48h后，可在显微镜下看到大片转染成功的绿色荧光阳性细胞(如图4所示)，利用流式细胞仪分选出带有绿色荧光的阳性单克隆，以每孔1个细胞的量打入装有预热培养基的96孔板中，每隔3～4天补加一次培养基，待细胞长满后依次传代到48、24和12孔板中用于鉴定和冻存。

2、阳性单克隆细胞的鉴定

(1)以细胞提取基因组为模板进行PCR。PCR鉴定所用的上游引物、下游引物分别如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。PCR扩增使用20uL反应体系：10μL 2×Power Taq PCRMaster Mix，8μL ddH₂O，上下游引物各0.5μL，DNA模板1μL；PCR反应条件：94℃预变性5min；30个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃终延伸5min。

(2)将650bp的PCR产物测序，测序结果与野生型参考序列SEQ ID NO：10进行比对，确定有2个单克隆在第一外外显子上的靶位点附近发生了非三倍数的碱基indel，且均在两个靶位点之间发生大片段缺失，导致阅读框移码突变，或出现提前终止密码子的突变，则可判断为FRZB基因敲除，具体突变序列鉴定分析如图5和图6所示，图5发生了212bp的缺失，图6发生了230bp的缺失。

综上所述，本发明采用双sgRNA靶向敲除法，在FRZB基因的第一外显子上同时产生两个DNA双链断裂点，增加基因组片段缺失的频率，得到了2个sgRNA之间较长片段丢失的敲除细胞，造成移码突变。与单个sgRNA相比，双sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多。设计2个sgRNA还有另外一个优点，不同sgRNA的活性差异很大，2个sgRNA中的一个活性高就可以敲除基因，如果2个活性都高，敲除效率会更高，更易造成移码突变，并且由于本发明采用的双sgRNA靶点均设计在同一个外显子上，即使没有片段丢失，2个sgRNA造成阅读框发生错位突变的概率也远大于单独一个sgRNA；

本发明首次得到FRZB基因敲除的猪成纤维细胞系，利用CRISPR/Cas9系统从猪成纤维细胞中敲除FRZB基因，有效改进了抑制剂、沉默、敲低、干扰等方法特异性不强、沉默不彻底或者无法沉默基因表达的缺点，敲除效果更加彻底，适于对FRZB缺失的猪成纤维细胞进行更加深入的研究，填补国内外相关技术的空白，具有较大的应用研究价。

本发明通过向猪成纤维细胞转染CRISPR/Cas9表达载体达到FRZB基因敲除的目的，获得的基因敲除细胞系可作为体细胞核移植的供体，制备转基因猪，为深度挖掘FRZB基因生物学功能提供有利的研究工具。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 靶向敲除FRZB基因的双sgRNA和敲除FRZB基因的猪成纤维细胞系及其应用

<130> KHP201113907.4

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcactcag gccaacgcca 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caccgtggcg ttggcctgag tgctg 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaccagcac tcaggccaac gccac 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcgtggccg gaaagcctgg c 21

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgccagg ctttccggcc acgag 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacctcgtg gccggaaagc ctggc 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gagggcctat ttcccatgat tcc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atcattgtgt ccacttccag 20

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agggcgagta acaaggac 18

<210> 10

<211> 650

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atcattgtgt ccacttccag gggtaggagg agccggcgga gcgggcctct cggcgtcctc 60

tgcactgctg caccctgccc cgtcctgccg ggatcatggt ctgcggcagc ccaggaggca 120

tgctgttgct gcgggctggg ctgcttgccc tggcggcgct ctgcctgctc cgcgtgcctg 180

gagcccgggc tgcagcctgt gagcccgtcc gcatccccct gtgcaagtct ctgccatgga 240

acatgaccaa gatgcccaac cacctgcacc acagcactca ggccaacgcc atcctggcca 300

tcgagcagtt cgaaggtctg ctgggcaccc actgcagccc ggatctgctc ttcttcctct 360

gtgccatgta cgcgcccatc tgcaccattg acttccaaca cgagcctatt aagccctgca 420

agtctgtgtg cgagcgggcc cggcagggct gtgagcccat tctcatcaag taccgccact 480

cgtggccgga aagcctggcc tgcgaagagc tgccggttta tgaccgtggc gtatgcatct 540

ctccagaggc cattgtcact gccgatggag caggtgagtc ctggcactac ccagcctcct 600

cccctgcctt ccatcctctc acttcttaaa gggtccttgt tactcgccct 650

Claims (10)

1.靶向FRZB基因的双sgRNA组合，其特征在于，包括FRZB-sgRNA1和FRZB-sgRNA2；

所述FRZB-sgRNA1的靶向序列为：CAGCACTCAGGCCAACGCCA，

所述FRZB-sgRNA2的靶向序列为：CTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC。

2.根据权利要求1所述的双sgRNA组合，其特征在于，所述FRZB-sgRNA1的核苷酸序列为：

FRZB-sgRNA1 Oligo1：5'-CACCgTGGCGTTGGCCTGAGTGCTG-3' ，

FRZB-sgRNA1 Oligo2：5'-AAACCAGCACTCAGGCCAACGCCAC-3' ；

所述FRZB-sgRNA2的核苷酸序列为：

FRZB-sgRNA2 Oligo1：5'-CACCgCCAGGCTTTCCGGCCACGAG-3' ，

FRZB-sgRNA2 Oligo2：5'-AAACCTCGTGGCCGGAAAGCCTGGC-3' 。

3.用于编码权利要求1或2所述双sgRNA组合的DNA分子。

4.一种生物材料，其特征在于，包括权利要求1或2所述双sgRNA组合，所述生物材料为载体、表达盒或转基因细胞中的一种或多种。

5.一种敲除了FRZB基因的细胞系的构建方法，其特征在于，包括：利用CRISPR/Cas9系统敲除所述细胞系的FRZB基因，所述CRISPR/Cas9系统使用的sgRNA为权利要求1或2所述的双sgRNA组合。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述利用CRISPR/Cas9系统敲除所述细胞系的FRZB基因中使用pX330载体，

和/或，

所述细胞系为猪成纤维细胞系。

7.一种猪成纤维细胞系，其特征在于，所述猪成纤维细胞系由权利要求5或6所述方法构建得到。

8.用于鉴定权利要求7所述猪成纤维细胞系的突变类型的引物对，其特征在于，所述引物对包括如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的引物。

9.权利要求7所述猪成纤维细胞系在制备FRZB基因功能研究模型中的应用。

10.权利要求7所述猪成纤维细胞系在转基因猪的制备中的应用。

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