CN113355356A - 一种csn1s1基因敲除载体及csn1s1基因敲除乳腺上皮细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CSN1S1基因敲除载体以及CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备方法，涉及基因工程技术领域，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体质粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。本发明通过该基因敲除载体简便、快速、高效地敲除了奶山羊CSN1S1基因，获得了纯合的敲除CSN1S1基因的奶山羊乳腺上皮细胞。

Description

一种CSN1S1基因敲除载体及CSN1S1基因敲除乳腺上皮细胞的 制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种CSN1S1基因敲除载体及CSN1S1基因敲除乳腺上皮细胞的制备方法。
背景技术
CRISPR/Cas系统最早可追溯至1987年，科学家发现在大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近存在重复序列，用于对抗病毒的入侵和外源DNA。根据Cas蛋白的不同分为三种主要类型，分别为I型、II型和III型，而CRISPR/Cas9是基于II型CRISPR系统开发而来的，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白至靶序列上，Cas9蛋白的两个功能域可以发挥内切酶的切割作用，即HNH和RuvC结构域，分别切割基因组上与crRNA的互补链和非互补链，造成DNA的双链断裂(doublestrandbreak,DSB)，从而启动细胞内的DNA损伤修复机制，导致修复后发生插入/缺失(indel)，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的，目前该技术已经成熟的运用于原核及真核生物的基因组编辑中。
乳中的蛋白质主要由酪蛋白组成，如羊乳中的酪蛋白含量则达到了总蛋白质的90％以上，酪蛋白包含αs1-酪蛋白(Csn1s1)，β-酪蛋白(Csn2)，αs2-酪蛋白(Csn1s2)以及κ酪蛋白(Csn3)。αs1-酪蛋白是一类单链多肽，包含199个氨基酸残基，在山羊乳中的含量为5.6％，而在母乳中却不含有的αs1-酪蛋白。αs1-酪蛋白是一种容易引起人类过敏的蛋白，易诱发婴幼儿湿疹、腹痛、腹泻等过敏反应，更易危及婴幼儿的生命。编码酪蛋白的基因普遍具有多态性，CSN1S1基因的多态性不仅会影响羊乳中酪蛋白的含量，还会影响羊乳的营养特性和工艺特性，同时有研究表明CSN1S1基因中11bp的indel突变与关中奶山羊乳中的酸度有显著影响。
目前，对CSN1S1基因的研究主要集中在与泌乳及乳成分相关性状的研究上，有效的构建一种CSN1S1基因敲除乳腺上皮细胞系对于探究CSN1S1调节奶山羊乳蛋白代谢的分子机制和构建精准而快速的改善奶山羊乳品质的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种CSN1S1基因敲除载体，所述基因敲除载体能高效、快速、简便地敲除CSN1S1基因。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种CSN1S1基因敲除载体，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体质粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述CRISPR/Cas9载体骨架为PX458。
优选地，所述的DNA片段为特异性靶向奶山羊CSN1S1基因的sgRNA。
本发明还提供了一种上述基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据奶山羊CSN1S1基因第一个外显子序列设计打靶位点，所述第一个外显子序列如SEQ ID NO:1所示，所述打靶位点的靶序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)根据SEQ ID NO:2所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
(3)将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链DNA；
(4)将所述双链DNA连入线性化的CRISPR/Cas9载体骨架，即得CSN1S1基因敲除载体。
优选地，所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，上述步骤(4)中，所述基因敲除载体按照如下方式连接：线性化的CRISPR/Cas9载体质粒1μL，双链DNA4μL，Solution I 5μL，所述线性化的CRISPR/Cas9载体质粒浓度为464.842ng/uL，所述的双链DNA的浓度为10μmol/L，16℃反应1h。
优选地，所述退火体系包括10μmol/L的正向寡核苷酸序列、10μmol/L反向寡核苷酸序列，所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列各为10μL、NEB缓冲液35μL，ddH2O 25μL，所述退火反应条件为98℃加热10min，自然冷却至室温。
本发明还提供了一种CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建上述任意一项基因敲除载体；
(2)将上述基因敲除载体转染到奶山羊乳腺上皮细胞中，利用CRISPR/Cas9系统进行基因沉默，通过筛选和鉴定获得CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞。所述的筛选方式优选为采用流式富集分选带有绿色荧光的细胞。
优选地，所述的转染为脂质体转染，所述的转染条件为接种细胞至70～90％汇合度时转染。
本发明还提供了一种根据上述任意一项制备方法制备得到敲除了CSN1S1基因的奶山羊乳腺上皮细胞。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果为：
本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除系统，以奶山羊CSN1S1为靶基因进行打靶位点的设计，得到靶向奶山羊CSN1S1基因的sgRNA，构建CSN1S1基因敲除载体，从而高效、快速、方便地获得CSN1S1基因敲除的奶山羊乳腺上皮细胞，为探究CSN1S1调节奶山羊乳蛋白代谢的分子机制和构建精准而快速的改善奶山羊乳品质的方法奠定理论基础。本发明基于CRISPR/Cas9基因敲除系统，首次提出了CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的构建方法，填补国内外相关技术的空白，具有较大的应用研究价值。
附图说明
图1为CRISPR/Cas9系统介导奶山羊CSN1S1基因定点敲除模式图；
图2为PX458质粒图谱结构示意图；
图3为CSN1S1基因敲除载体质粒测序的结果图；
图4为PCR测序鉴定奶山羊的碱基缺失情况与峰图。
具体实施方式
本发明提供了一种CSN1S1基因敲除载体，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体质粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列为TACCTGTCTTGTGGCTGTTG(SEQ ID NO:2)。
在本发明中，所述CRISPR/Cas9载体骨架优选为PX458。本发明对PX458的来源没有特殊限定，采用本领域熟知的产品即可。
在本发明中，所述DNA片段为特异性靶向奶山羊CSN1S1基因的sgRNA。
本发明还提供了一种上述基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据奶山羊CSN1S1基因第一个外显子序列设计打靶位点，所述第一个外显子序列为ATGAAACTTCTCATCCTTACCTGTCTTGTGGCTGTTGCTCTTGCCAGGCCT(SEQ ID NO:1)，所述打靶位点的靶序列TACCTGTCTTGTGGCTGTTG(SEQ ID NO:2)；
(2)根据SEQ ID NO:2所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
(3)将所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链DNA；
(4)将所述双链DNA连入线性化的CRISPR/Cas9载体骨架，即得CSN1S1基因敲除载体。
在本发明中，引物合成需要对靶序列加上接头，正向引物5’端前部添加CACCG，即得所述正向寡核苷酸序列CACCGCAACAGCCACAAGACAGGTA(SEQ ID NO:3)，反向引物5’端添加AAAC，3’端添加C，即得所述的反向寡核苷酸序列AAACTACCTGTCTTGTGGCTGTTGC(SEQ ID NO:4)。本发明中划横线的碱基为酶切位点，通过对靶序列加上接头才能保证将sgRNA与质粒成功连接。
在本发明中，采用BbsI酶酶切CRISPR/Cas9载体骨架PX458，所述的酶切体系如下：BbsI限制性内切酶1μL，PX458质粒0.5μg，缓冲液3μL，用ddH2O补至30μL；所述酶切条件为37℃反应2h；酶切后通过切胶回收获得含有粘性末端的PX458载体质粒即线性化的CRISPR/Cas9载体骨架。本发明的BbsI限制性内切酶购自NEB，货号R3539L，所述的缓冲液为BbsI酶试剂自带的缓冲液。
在本发明中，上述步骤(4)中所述基因敲除载体优选地按照如下方式连接：线性化的CRISPR/Cas9载体质粒1μL，双链DNA4μL，Solution I 5μL，所述线性化的CRISPR/Cas9载体质粒浓度为464.842ng/uL，所述双链DNA的浓度为10μmol/L，16℃反应1h。所述的Solution I购自TaKaRa，货号6022。
在本发明中，所述退火体系包括10μmol/L的正向寡核苷酸序列、10μmol/L反向寡核苷酸序列，所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列各为10μL、NEB缓冲液35μL，ddH2O25μL，所述退火反应条件为98℃加热10min，自然冷却至室温。本发明中的NEB缓冲液购自NEB，货号B7003V。
本发明还提供了一种CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建上述任意一项基因敲除载体；
(2)将上述基因敲除载体转染到奶山羊乳腺上皮细胞中，利用CRISPR/Cas9系统进行基因沉默，通过流式富集分选带有绿色荧光的细胞，随后通过单细胞分离的方法获得单克隆细胞株。
在本发明中，将上述基因敲除载体转染到奶山羊乳腺上皮细胞中，其中所述的转染方式优选为脂质体转染，转染条件优选为接种细胞至70～90％汇合度时转染。
在本发明中，所述的CRISPR/Cas9系统优选地含有Cas9蛋白、绿色荧光蛋白和上述特异性靶向奶山羊CSN1S1基因的sgRNA。
本发明还提供了一种根据上述任意一项制备方法制备得到敲除了CSN1S1基因的奶山羊乳腺上皮细胞。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
在本实施例中，提供了一种用于敲除CSN1S1基因的基因敲除载体的构建方法，包括以下步骤：
1、靶位点的设计
1)、利用NCBI在线数据库查找奶山羊CSN1S1基因序列，本发明的奶山羊CSN1S1基因组序列来源于NCBI Reference Sequence:NM_001285695.1，在上述CSN1S1基因的第一个外显子设计打靶位点，所述的第一个外显子的序列ATGAAACTTCTCATCCTTACCTGTCTTGTGGCTGTTGCTCTTGCCAGGCCT(SEQ ID NO:1)。
2)、利用在线设计网站设计打靶位点序列sgRNA：采用网站https://zlab.bio/guide-design-resources进行sgRNA的设计，选取评分最高的sgRNA，其中靶序列为TACCTGTCTTGTGGCTGTTG(SEQ ID NO:2)评分最高，设定为本实施例的最优靶序列。
2、引物添加接头
将靶标序列加上BbsI限制性内切酶酶切的粘性连接末端，如表1所示，划横线的碱基为酶切位点。
表1sgRNA序列接头
名称 引物序列(5’-3’)
sgRNA-F <u>CACCG</u>CAACAGCCACAAGACAGGTA
sgRNA-R <u>AAAC</u>TACCTGTCTTGTGGCTGTTG<u>C</u>
3、CSN1S1基因敲除载体的构建
用ddH2O将合成的上述两对寡核苷酸分别稀释至10μmol/L，退火形成双链DNA，退火反应体系如下：sgRNA-F和sgRNA-R各10μL，NEB缓冲液35μL，ddH2O 25μL。然后在98℃加热10min，自然冷却至室温，获得双链DNA。
用BbsI限制性内切酶酶切pSpCas9(BB)-2A-GFP载体(PX458)，所述酶切体系如下：BbsI限制性内切酶1μL，PX458质粒0.5μg，缓冲液3μL，用ddH2O补至30μL。酶切条件为37℃反应2h，酶切后通过切胶回收获得含有粘性末端的PX458载体质粒。
最后，将sgRNA与酶切后的载体质粒连接获得sgRNA和Cas9蛋白基因位于同一载体的共表达质粒，即CSN1S1基因敲除载体，命名为CSN1S1-sgRNA。所述基因敲除载体按照如下方式连接：线性化的CRISPR/Cas9载体质粒1μL，双链DNA4μL，Solution I 5μL，所述线性化的CRISPR/Cas9载体质粒浓度为464.842ng/uL，所述双链DNA的浓度为10μmol/L，16℃反应1h后转化至DH5α感受态细胞中，挑取菌落提质粒后测序鉴定。
本实施例将提取的质粒交上海生工生物工程有限公司测序，测序结果如图3所示，结果表明，原始序列与已知序列完全一致，成功获得表达sgRNA的CSN1S1基因敲除载体。
实施例2
本实施例提供了一种CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备与鉴定。
提前一天将生长状态良好的奶山羊乳腺上皮细胞铺板于6孔板，待接种细胞至50～70％汇合度时转染，每个孔分别转染5μg的实施例1所述的CSN1S1基因敲除载体，未转染的细胞作为阴性对照，48h后进行流式富集分选和单细胞分离，所述的转染方式为脂质体转染，转染条件为接种细胞至70～90％汇合度时转染。
1、所述的CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备方法，步骤如下：
(1)将转染48h后细胞消化，制成细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心6min，倒掉上清液并吸去残留液体，加入500μL的完全培养基重悬，随后加入流式管中，并置于泡沫保温箱中的碎冰上，运输至流式细胞仪室；
(2)取未转染细胞按照(1)进行相同的操作处理，为阴性对照组；
(3)到达流式细胞室后，将细胞进行重悬，然后使用40μm的细胞筛网对细胞进行过筛，过滤掉大的细胞团，避免堵塞流式细胞仪；
(4)将未转染过的细胞作为阴性对照组，置于流式细胞仪上对机器进行校正，将转染后48h的细胞上机进行流式分选，筛选出可以被激发绿色荧光强度较高的细胞，即得CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞。
2、单克隆挑选和鉴定
(1)将筛选后的细胞分离到含有完全培养基的96孔细胞培养板中，每孔1个细胞；
(2)取适量分选后没有分离的混池细胞，留作富集效果检测使用；
(3)当细胞长到第3d时，给96孔板每个孔加100μL的完全培养基，待细胞长到第7d时，将96孔板置于显微镜上观察细胞的生长状况并对发现细胞的孔做好标记；将所有孔内培养基全部吸弃，然后在每个孔中加入100μL新鲜的完全培养基，此后每隔3d重复第7d的操作，待细胞长满半个孔底的时将细胞用PBS洗涤，然后使用含EDTA的0.25％的胰酶将细胞消化下来，并转移到48孔培养板中，重复上述操作，待细胞长满半个孔底的时候取少量的细胞(5000个即可)用于基因组DNA的提取。
(4)本实施例采用筛选培养得到的5个细胞作为试验组，进行PCR扩增，其中以野生型的DNA和野生型氨基酸序列作为对照，所述野生型的DNA序列为ATGAAACTTCTCATCCTTACCTGTCTTGTGGCTGTTGCTCTTGCCAGGCCT(SEQ ID NO:1)，相应的野生型氨基酸序列为MKLLILTCLVAVALARP(SEQ ID NO:5)。根据sgRNA在基因组上的位置设计引物，交由上海生工生物工程有限公司设计合成，将引物稀释至10μmol/L的工作浓度，以细胞的基因组DNA为模板进行PCR扩增，所述的上游引物序列为TGATGCTTCTCTATTCCTCTGACAA(SEQ ID NO:6)，下游引物序列为ACTGCAATGTCTTGCACTTGATG(SEQ ID NO:7)，PCR扩增反应体系：2×Taq PCRStarMix(购自Genestar，货号A012-01)10μL，上下游引物各1μL，DNA2μL，用ddH2O补至20μL，PCR扩增反应条件：95℃5min，95℃30s，60℃30s，72℃30s，共40个循环，72℃10min，进行Sanger测序鉴定，结果如图4所示，其中DKO表示DNA双链敲除。
由图4中的A、B、C、D、E图中的结果表明，试验组与对照组相比，每张峰图代表产生了不同程度的敲除和敲入，表明每株细胞后续编码的氨基酸序列都已改变，因此，本发明成功构建了CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种CSN1S1基因敲除载体及CSN1S1基因敲除乳腺上皮细胞的制备方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 1
atgaaacttc tcatccttac ctgtcttgtg gctgttgctc ttgccaggcc t 51
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 2
tacctgtctt gtggctgttg 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 3
caccgcaaca gccacaagac aggta 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 4
aaactacctg tcttgtggct gttgc 25
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 5
Met Lys Leu Leu Ile Leu Thr Cys Leu Val Ala Val Ala Leu Ala Arg
1 5 10 15
Pro
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 6
tgatgcttct ctattcctct gacaa 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence(人工序列)
<400> 7
actgcaatgt cttgcacttg atg 23

Claims (10)

1.一种CSN1S1基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架与连接在所述载体质粒上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO:2所示。
2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体骨架为PX458。
3.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述DNA片段为特异性靶向奶山羊CSN1S1基因的sgRNA。
4.根据权利要求1～3任意一项所述基因敲除载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据奶山羊CSN1S1基因第一个外显子序列设计打靶位点，所述第一个外显子序列如SEQ ID NO:1所示，所述打靶位点的靶序列如SEQ ID NO:2所示；
(2)根据SEQ ID NO:2所示核苷酸序列设计正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
(3)将所述的正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列进行退火反应形成双链DNA；
(4)将所述双链DNA连入线性化的CRISPR/Cas9载体骨架，即得CSN1S1基因敲除载体。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中，所述基因敲除载体按照如下方式连接：线性化的CRISPR/Cas9载体质粒1μL，双链DNA 4μL，Solution I 5μL，所述线性化的CRISPR/Cas9载体质粒浓度为464.842ng/uL，所述的双链DNA的浓度为10μmol/L，16℃反应1h。
7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述退火体系包括10μmol/L的正向寡核苷酸序列、10μmol/L反向寡核苷酸序列，所述正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列各为10μL、NEB缓冲液35μL，ddH2O 25μL，所述退火反应条件为98℃加热10min，自然冷却至室温。
8.一种CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)构建权利要求1～7任意一项所述基因敲除载体；
(2)将所述基因敲除载体转染到奶山羊乳腺上皮细胞中，利用CRISPR/Cas9系统进行基因沉默，通过筛选和鉴定获得CSN1S1基因敲除奶山羊乳腺上皮细胞。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述转染为脂质体转染，所述转染条件为接种细胞至70～90％汇合度时转染。
10.根据权利要求8或9所述的制备方法制备得到敲除了CSN1S1基因的奶山羊乳腺上皮细胞。
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