CN109735541A - 一种敲除acadsb基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法。所述方法利用一种敲除ACADSB基因的gRNA的识别序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明利用发明人设计的gRNA，精确且高效的敲除ACADSB基因，有效的构建了一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞，本发明解决了RNAi技术存在干扰效率低的缺陷，提供了一种简便高效的构建基因敲除细胞系的方法。ACADSB基因作为与脂代谢、脂肪酸代谢相关的重要标志基因，其敲除细胞系的建立，也进一步为脂代谢及脂肪酸代谢通路相关基因功能的研究，提供了有效的基因素材与基因工具。

Description

一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法。

背景技术

CRISPR-Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因编辑技术，该技术来源于细菌和古细菌中存在抵抗噬菌体入侵的CRISPR-Cas获得性免疫系统，后经人工改造而逐渐发展起来。CRISPR-Cas基因组编辑技术主要是通过一段RNA来识别打靶位点，通过Cas 9核酸内切酶对打靶位点附近的核酸进行切割来实现对基因的定点编辑，大大的提高了基因编辑的效率，实现了对多种细胞模型和动物模型进行基因修饰的作用。

奶牛的乳腺组织具有合成和分泌乳汁的生理功能，可以作为大多数生物学研究的生物反应器。而在体外培养的乳腺上皮细胞可以保持这个合成和分泌乳汁的能力，并可以作为细胞的试验模型来研究乳汁中乳脂、乳蛋白等成分的基因表达情况。因此，体外培养的奶牛乳腺上皮细胞具有其重要的应用价值，并可作为一种基因素材应用于与乳脂代谢相关候选基因的验证研究中，也为基因功能的研究奠定基础。

ACADSB基因是短支链酰基辅酶A脱氢酶(acyl-coA dehydrogenase,short/branched chain，ACADSB)，是线粒体酶短支链酰基辅酶A(acyl-coAdehydrogenases,ACADs)家族的一员。它能促进酰基辅酶A衍生物在脂肪酸代谢过程和支链的氨基酸代谢过程中的脱氢作用。即ACADSB基因可直接参与脂肪酸氧化或脂肪酸降解的代谢通路。脂代谢过程中，脂肪经脂肪酶氧化分解为甘油三酯和游离脂肪酸，进一步再分解成为乙酰辅酶A参与三羧酸循环(TCA)，参与葡萄糖代谢、脂代谢、氨基酸代谢，最终生成水和CO₂。而且，ACADSB基因本身就作为线粒体内ACADs家族的成员之一，对于线粒体内的一种关键酶来说，基因一旦发生突变或者是缺失，会直接对线粒体的能量代谢产生影响，作用机体的有氧呼吸和糖酵解。而ACADSB也作为与脂代谢及脂肪酸代谢通路中的关键功能基因，深入探讨和研究该基因的功能成为遗传工作者研究的热点。

但是，目前尚无利用奶牛乳腺上皮细胞系建立的ACADSB基因敲除模型。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种利用奶牛乳腺上皮细胞系建立的ACADSB基因敲除模型，有效的克服了siRNA干扰不能稳定遗传的技术缺陷。即对于RNAi技术，通过瞬时转染干扰载体质粒，在一定水平上能够抑制基因的表达，但细胞的转染效果也受多种因素影响，如细胞状态、细胞活性、细胞代数等，所以其干扰效果并不稳定。而对于稳定表达，构建常见的慢病毒载体，其包装量小于4k，对于大于4k的基因，包装效果并不好。而对于腺病毒载体，其包装的周期很长，对于一些较难感染的细胞，滴度太低，很难感染。而本发明的目的在于克服缺陷，为后续的研究奠定基础。

本发明的第一个目的是提供一种敲除ACADSB基因的sgRNA的识别序列。

本发明的第二个目的是提供所述的sgRNA的识别序列在敲除ACADSB基因中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述识别序列的gRNA引物对。

本发明的第四个目的是提供所述的gRNA引物对在敲除ACADSB基因中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种奶牛乳腺上皮细胞系的ACADSB基因敲除的模型。

本发明的第六个目的是提供一种构建奶牛乳腺上皮细胞系的ACADSB基因敲除的模型的方法。

本发明的第七个目的是提供一对检测所述模型或所述方法构建的模型的引物

本发明的第八个目的是提供一种检测所述模型或所述方法构建的模型的方法

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

本发明利用CRISPR/Cas9系统敲除ACADSB基因建立奶牛乳腺上皮细胞敲除细胞系的方法。主要步骤如下：首先设计ACADSB基因sgRNA并构建ACADSB基因敲除载体的重组质粒，然后将重组质粒转染到奶牛乳腺上皮细胞中，并利用流式细胞术对阳性细胞进行筛选，再将单个阳性细胞的扩大培养后，利用检测引物进行PCR扩增目的片段并进行测序检测。通过上述方法能够在基因组中ACADSB靶位点造成移码突变，从而形成ACADSB基因的敲除突变体，进而达到从基因组中敲除ACADSB基因的目的。

一种敲除ACADSB基因的sgRNA的识别序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

所述的sgRNA的识别序列在敲除ACADSB基因中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述识别序列的gRNA引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3～4所示。

所述的gRNA在敲除ACADSB基因中的应用，也属于本发明的保护范围。

进一步，本发明要求保护一种奶牛乳腺上皮细胞系的ACADSB基因敲除的模型，所述模型为通过CRISPR-Cas9技术构建，gRNA识别序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1示。

一种构建奶牛乳腺上皮细胞系的ACADSB基因敲除的模型的方法，将核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示的单链DNA进行退火反应，得到双链DNA短片段，连接入CRISPR/Cas9载体，获得重组敲除载体，将重组敲除载体转染到奶牛乳腺上皮细胞中，经过筛选得到所述模型。

优选地，所述CRISPR/Cas9载体为PX458载体。

优选地，所述转染为瞬时转染。

优选地，所述筛选为流式细胞术分选阳性细胞。

进一步，本发明还要求保护以下内容：

一对检测所述模型或所述方法构建的模型的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示。

一种检测所述模型或所述方法构建的模型的方法，用权利要求8所述的引物进行PCR扩增，扩增产物与核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示序列进行比对。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用发明人设计的gRNA，精确且高效的敲除ACADSB基因，有效的构建了一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞，本发明解决了RNAi技术存在干扰效率低的缺陷，提供了一种简便高效的构建基因敲除细胞系的方法。ACADSB基因作为与脂代谢、脂肪酸代谢相关的重要标志基因，其敲除细胞系的建立，也进一步为脂代谢及脂肪酸代谢通路相关基因功能的研究，提供了有效的基因素材与基因工具。

附图说明

图1为ACADSB gRNA1和gRNA2退火及插入到PX458载体序列。

图2为PX458-ACADSB gRNA1和PX458-ACADSB gRNA2质粒测序结果。

图3为重组质粒PX458-ACADSB gRNA1和PX458-ACADSB gRNA2转染奶牛乳腺上皮细胞后的荧光检测图。

图4为敲除细胞DNA扩增、测序鉴定峰图及序列比对图。

图5为ACADSB基因敲除细胞系在mRNA水平和蛋白水平上的表达情况。

图6为ACADSB基因敲除细胞系转录组测序图。

图7为ACADSB基因敲除细胞系GO分析结果，参与多种代谢途径和多种信号通路。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1 ACADSB基因敲除靶位点的设定、sgRNA的设计

首先确定ACADSB(ENSBTAT00000024017.2)基因蛋白保守结构域的位置，更好的保证敲除效果。将待敲除的目标序列设计在相对应的编码区，即ACADSB基因第五外显子，进行sgRNA的设计，设计了2对识别序列(sgRNA)，如下所示，

ACADSB gRNA1:GAGATTATTACATCATCAAT GGG(SEQ ID NO：1)；

ACADSB gRNA2:GGAGATTATTACATCATCAATGG(SEQ ID NO：2)。

设计DNAoligos以合成双链gRNA，其具体的引物序列如下：

ACADSB gRNA1F：CACCGAGATTATTACATCATCAAT(SEQ ID NO：3)；

ACADSB gRNA1R：AAACATTGATGATGTAATAATCTC(SEQ ID NO：4)；

ACADSB gRNA2F：CACCGGAGATTATTACATCATCAA(SEQ ID NO：5)；

ACADSB gRNA2R：AAACTTGATGATGTAATAATCTCC(SEQ ID NO：6)。

ACADSB检测引物F：5’-CGATACATACAGGCTTTTGGAAG-3’(SEQ ID NO：7)；

ACADSB检测引物R：5’-AAGATGAGGGGCAATGGCT-3’(SEQ ID NO：8)。

实施例2构建gRNA表达载体

一、实验方法

将正反向的单链寡核苷酸序列进行退火反应，得到双链寡核苷酸片段，并将其与被BBSI酶切后线性化的PX458载体进行连接得到重组质粒，记为PX458-ACADSB gRNA1和PX458-ACADSB gRNA2。

具体操作如下：

(1)gRNA合成后，用ddH₂O水溶解引物(SEQ ID NO：3～6)至100μM，寡核苷酸单链退火获得双链寡核苷酸。

退火反应体系：上下游引物各加1μL，ddH₂O 43μL，NEB buffer(10x)5μL。

退火反应条件：PCR仪上95℃反应10min，随后以5℃/min的速度梯度降温，至温度降为25℃。将退火后的引物稀释50倍后备用。

(2)PX458载体线性化，利用BbsI限制性内切酶切割PX458载体。

酶切反应体系：PX458质粒2μg，BbsI 1μL，10×Buffer 5μL，加去离子水至总体积为50μL。

酶切反应条件：37℃4hour，1％琼脂糖凝胶电泳酶切产物，用胶回收试剂盒回收酶切产物。-20℃备用。

(3)gRNA与PX458酶切产物的连接。

连接体系：BbsI酶切后的PX458产物5μL，引物退火产物1μL，10×T4DNA连接酶缓冲液1μL，T4DNA连接酶0.5μL，加入去离子水至总体积为10μL。

连接条件：16℃过夜连接。

(4)连接产物转化DH5a感受态细胞之后，挑取单克隆菌落到含有氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养(12～6h)，细菌培养产物用去内毒素的质粒提取试剂盒提取无内毒素质粒。测序正确的重组质粒命名为PX458-ACADSB gRNA1和PX458-ACADSBgRNA2。

二、实验结果

gRNA与PX458酶切产物的连接如图1所示，PX458-ACADSB gRNA1和PX458-ACADSBgRNA2质粒测序结果如图2所示。成功构建了PX458-ACADSB gRNA1和PX458-ACADSB gRNA2质粒。

实施例3敲除细胞系的构建

将重组质粒瞬时转染到奶牛乳腺上皮细胞中,利用流式细胞术筛选表达绿色荧光蛋白的单个阳性细胞，进行扩大培养，获得ACADSB基因敲除的阳性细胞株。

一、实验方法

(1)细胞系的转染

将课题组前期构建的奶牛乳腺上皮细胞系作研究对象，将细胞培养在6孔板中，更换新鲜的含10％FBS的DMEM/F12培养基(不含抗性)，待细胞汇合度达到70～80％时开始进行转染。

将3μg重组质粒和6μL Fugene HD转染试剂稀释至200μL的opti-MEM中，轻轻混匀，静置20min后，轻轻滴加提前换至DMEM/F12基础培养基的细胞中，置于37℃细胞培养箱中进行培养，24h后将细胞换液，48h后观察荧光。

(2)流式细胞术分选阳性细胞(表达绿色荧光蛋白的细胞)

将准备分选的细胞用不含EDTA的胰酶进行消化，收集细胞沉淀，并用PBS重悬细胞，洗涤3次1000r离心5min收集细胞沉淀，然后取200ul准备好的含1％胎牛血清的PBS将细胞吹打混匀，把细胞过滤膜分散成单个细胞，去除细胞团块，收集在灭菌的1.5mL离心管中，上机前用枪头轻轻混匀。因PX458-ACADSB重组载体能够表达绿色荧光蛋白，所以在流式细胞仪中能够将表达绿色荧光蛋白的单个细胞筛选出来。

(3)单个阳性细胞培养

将筛选出来的单个阳性细胞养在预先配好的含有20％血清和1％抗性的完全培养基培养的96孔板中，约7天左右便可以在显微镜下观察到一小堆的细胞团，约15天左右便可以在显微镜下观察到一大片的细胞群。将细胞消化后转移到6孔板中继续培养。

(4)PCR鉴定及测序

收取6孔板中的细胞提取基因组DNA，并利用ACADSB基因的检测引物进行PCR扩增，其检测引物序列为：ACADSB检测引物F 5’-CGATACATACAGGCTTTTGGAAG-3’(SEQ ID NO：7)；ACADSB检测引物R 5’-AAGATGAGGGGCAATGGCT-3’(SEQ ID NO：8)。并将PCR产物送往北京金唯智生物公司进行测序，从中筛选出被编辑的细胞系。

二、实验结果

荧光观察转染结果如图3所示，图3为重组质粒PX458-ACADSB-gRNA1和PX458-ACADSB-gRNA2转染奶牛乳腺上皮细胞后的荧光检测图；从图中可以看出转染效率很高，大约达到了60％左右。

PCR鉴定被编辑的细胞系，PCR产物经电泳结果如图4A所示，测序结果如图4B所示。目的片段长度为344bp，单克隆细胞系序列与野生序列(其部分核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示：TAAAAAGGGAGATTATTACATCATCAATGGG)进行比对，结果发现两种突变类型，其一，转染gRNA1序列载体的阳性细胞，其gRNA序列如SEQ ID NO：1所示。在PAM位点附近缺失4个碱基其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示(TAAAAAGGGAGATTATTACATCATGGG)，造成移码突变。其二，转染gRNA2序列载体的阳性细胞，其gRNA序列如SEQ ID NO：2所示。在PAM位点前插入了一个碱基A其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示(TAAAAAGGGAGATTATTACATCATCAAAGGG)，造成移码突变如图4C所示。说明ACADSB基因组在奶牛乳腺上皮细胞中被成功编辑了，并将该细胞进行扩大培养。

实施例4 ACADSB基因敲除细胞系在mRNA水平的检测

一、实验方法

ACADSB基因敲除细胞系在mRNA水平上的检测。

将敲除的细胞系进行扩大培养，利用RNA提取试剂盒提取细胞的总RNA，调整一致RNA浓度，利用TAKARA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA,利用SYBR染料分子进行荧光定量PCR。

反应体系是：5μL SYBR mix；1μL cDNA；上下游引物各加0.25μL，ddH₂O 4.5μL。反应条件是：95℃30s；60℃10s 40个循环。

二、实验结果

结果显示：利用PX458-ACADSB gRNA1和PX458-ACADSB gRNA2载体转染到奶牛乳腺上皮细胞后，构建基因敲除细胞系。在两种不同敲除载体的细胞系中ACADSB基因的表达水平显著均低于在野生型奶牛乳腺上皮细胞的表达。虽然在mRNA上仍有少量表达，但不排除ACADSB基因存在其他的剪切体如图5A所示。同时，半定量结果发现：PCR产物于2％琼脂糖凝胶电泳，电泳结果发现，在基因敲除细胞组中并未发现目标产物的存在。而对照组，确定了目标产物的存在如图5B所示。同时我们发现，PX458-ACADSB gRNA1载体构建的敲除细胞系在mRNA水平上的表达要优于PX458-ACADSB gRNA2载体构建的敲除细胞系。其PX458-ACADSBgRNA1载体构建的敲除细胞系中CD44基因的表达降低了80.48％，而其PX458-ACADSB gRNA2载体构建的敲除细胞系中CD44基因的表达降低了76.49％，即ACADSB-gRNA1的序列的敲除效果要优于ACADSB-gRNA2的序列.

实施例5 ACADSB基因敲除细胞系在蛋白水平上的检测

一、实验方法

ACADSB基因敲除细胞系在蛋白水平上的检测。

使用RIPA蛋白裂解液裂解细胞，离心后测定蛋白浓度，取20μg蛋白样品与5×SDS蛋白上样缓冲液混匀后95℃煮沸10min，用10％的分离胶进行SDS-PAGE蛋白电泳，80V 30分钟后100V 40分钟；湿转200A转膜2h；用含5％脱脂牛奶的TBST溶液中室温封闭2小时；anti-ACADSB多克隆抗体(AV54586sigma,Germany)1：750稀释。-actin(Abcam,ab8227,Shanghai,China)1：10000稀释，室温下孵育2小时。TBST洗涤3次，每次10分钟。

二、实验结果

在前期的转录水平分析后，发现gRNA1的识别序列的敲除效果要比gRNA2的识别序列的敲除效果要好。所以在蛋白水平上的检测中，选择PX458-ACADSB gRNA1载体构建的敲除细胞系在蛋白水平上进行验证，结果如图5C所示：结果发现ACADSB基因敲除细胞系在蛋白水平上的表达显著降低，基本上达到了很明显的敲降效果，但可能是ACADSB基因尚存在着其他的转录本，在翻译表达后并未达到100％的敲除效果。但针对我们建立的基因敲除细胞系的目的，在一定程度上满足了后续实验的要求，对基因表达及其基因功能研究也能发挥重要的作用，充分说明了我们所设计的sgRNA具有显著的切割活性和编辑效率。

实施例6转录组测序检测ACADSB基因敲除细胞系

一、实验方法

1、6个奶牛乳腺上皮细胞样本的总RNA提取及质控。利用常规RNA提取的方法，提取样本的总RNA。测定其浓度及纯度，总RNA OD值在1.8至2.0之间；电泳检测28S:18S都在1.7以上。将纯化后的mRNA进行打断200-300bp。在通过随机引物和逆转录酶的作用合成cDNA的第一条链，合成第二条cDNA时，建链特异性文库，将T替换成U，大幅度提高结果的准确性。对cDNA文库进行质检，对文库进行定量后可利用荧光定量PCR的方法进行准确定量，保证文库的质量。

2.文库质量合格后，进行上机测序，获得原始测序序列后，通过数据质量检测和过滤处理获得的过滤后的数据(clean reads)与ensemble网站(http://asia.ensembl.org/index.html)中牛的基因组序列进行对比和生物学分析，主要包括测序深度分析，CG含量分析，测序长度分析及Mapping软件分析等。选择最优参数进行分析，得到统计结果。

3.基因表达量计算：国际常用RPKM或FPKM进行基因表达定量。对于差异基因的筛选，对于低丰度表达的基因采用upper-quartile算法进行校正，同时结合国际公认的算法进行差异表达基因的筛选。

4.GO analysis：研究差异基因在Gene ontology中的分布情况阐明实验中导致样本差异的基因在功能上的表现。利用KEGG数据库对基因参与的通路进行分类。

二、实验结果

转录组测序部分差异表达基因如表1所示。图6为ACADSB基因敲除细胞系转录组测序图。

结果发现ACADSB基因可通过调节下列基因的表达参与多种代谢途径并发挥其功能如图7所示。

实施例7 PCR array技术检测ACADSB基因敲除细胞系

一、实验方法

利用PCR array技术在前期工作的基础上进行深入验证，ACADSB基因敲除细胞和野生型奶牛乳腺上皮细胞之间进行比对。

利用RNA提取试剂盒，从奶牛乳腺上皮细胞中提取总RNA。然后使用反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA 1μg。再进行荧光定量PCR。通过RT2 Profiler PCRArray(PABT-007ZA，Qiagen)分析脂质和脂肪酸代谢途径中基因的转录水平。选择5种不同的管家基因作为内参基因：β-肌动蛋白(ACTB)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，酪氨酸3-单氧酶(YWHAZ)，次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)和TATA-盒结合蛋白(TBP)。

二、实验结果

ACADSB基因敲除细胞和野生型奶牛乳腺上皮细胞之间进行比对结果如表2所示。结果发现：22种基因在ACADSB基因敲除后被抑制其表达，如FABP3基因、ACAT2基因、CPT1B基因等；有两个基因在ACADSB基因敲除后促进其表达，如ACADL基因和ACOX2基因。

表2 ACADSB敲除后对脂肪酸代谢通路相关基因的调控作用：

综上所述，本发明利用CRICPR/Cas9系统构建的ACADSB基因敲除奶牛乳腺上皮细胞系，与RNAi技术相比较，是在DNA水平对ACADSB基因产生了编辑，沉默ACADSB基因在mRNA和蛋白水平上的表达，在前期分子水平的基础上对ACADSB基因的敲除细胞系进行验证，，对其进行RNA-seq测序，在转录组分析的基础上又利用PCR array技术对ACADSB调控的相关基因进行深入研究。ACADSB基因的敲除细胞系的构建为后续的基因功能研究奠定了坚实的基础，可作为有效的基因工具参与相关研究，在与奶牛乳脂代谢方面的研究具有较高应用价值。

序列表

<110> 广东海洋大学

<120> 一种敲除ACADSB基因的奶牛乳腺上皮细胞系及其构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagattatta catcatcaat ggg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagattatt acatcatcaa tgg 23

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caccgagatt attacatcat caat 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacattgat gatgtaataa tctc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccggagat tattacatca tcaa 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacttgatg atgtaataat ctcc 24

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgatacatac aggcttttgg aag 23

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aagatgaggg gcaatggct 19

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

taaaaaggga gattattaca tcatcaatgg g 31

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

taaaaaggga gattattaca tcatggg 27

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taaaaaggga gattattaca tcatcaaagg g 31

Claims (9)

1.一种敲除ACADSB基因的sgRNA的识别序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述的sgRNA的识别序列在敲除ACADSB基因中的应用。

3.权利要求1所述识别序列的gRNA引物对，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。

4.权利要求3所述的gRNA引物对在敲除ACADSB基因中的应用。

5.一种奶牛乳腺上皮细胞系的ACADSB基因敲除的模型，其特征在于，所述模型为通过CRISPR-Cas9技术构建，sgRNA识别序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

6.一种构建奶牛乳腺上皮细胞系的ACADSB基因敲除的模型的方法，其特征在于，将核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示的单链DNA进行退火反应，得到双链DNA短片段，连接入CRISPR/Cas9载体，获得重组敲除载体，将重组敲除载体转染到奶牛乳腺上皮细胞中，经过筛选得到所述模型。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体为PX458载体。

8.一对检测权利要求5所述模型或权利要求6所述方法构建的模型的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7～8所示。

9.一种检测权利要求5所述模型或权利要求6所述方法构建的模型的方法，其特征在于，用权利要求8所述的引物进行PCR扩增，扩增产物与核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示序列进行比对。