CN111304172A - 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到基于CRISPR‑Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法，本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向鸡EphA2基因的sgRNA，之后转染带有sgRNA和Cas9基因的lentiCRISPR v2质粒，利用CRISPR‑Cas9系统达到基因沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源EphA2敲除的细胞系。通过本发明，构建一种基于CRISPR‑Cas9靶向敲除鸡EphA2基因的方法，及其靶向鸡EphA2基因的sgRNA，以期获得鸡源EphA2基因敲除的细胞模型，用于相关疾病的研究。本发明基于CRISPR‑Cas9靶向敲除鸡EphA2基因的细胞系构建在相关领域未见报道，本发明将填补国内外相关技术的空白，具有较大的应用研究价值。

Description

一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系 的构建方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，涉及到一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法。

背景技术

CRISPR-Cas系统最早发现于细菌的天然免疫系统，用于对抗病毒的入侵和外源DNA。其中Ⅱ型CRISPR-Cas系统运用最为广泛，主要由RNA导向的Cas9核酸内切酶、一条导向RNA(sgRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)组成。在这一系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA结合形成双链RNA，引导Cas9蛋白到靶序列上，在PAM序列上游3bp位置特异性剪切DNA双链，造成DNA双链断裂(DSB，double strand break)，从而启动细胞内的DNA损伤修复机制，导致修复后发生碱基缺失或插入，达到移码突变的效果，最终实现基因敲除的目的。目前该技术已经成熟的运用于真核细胞的基因组编辑中。

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(Erythropoietin producinghepatocellular receptor A2,EphA2)是受体酪氨酸激酶EphA家族中的一员。EphA2具有受体酪氨酸激酶的活性，在对肿瘤细胞生长、增殖、转移等相关的信号转导通路的调控过程中起到关键性的作用。EphA与其配体Ephrin相互作用可以调节细胞间的黏附，肿瘤的发生以及血管的生成等病理生理过程。而抑制EphA2的活化，则可削弱肿瘤血管形成。然目前对鸡源EphA2功能研究鲜有报道。本研究通过CRISPR/Cas9技术，药物筛选后通过亚克隆的方法，成功获得鸡源EphA2敲除的细胞株，用于探究鸡源EphA2的功能及其在禽类相关疾病所起作用。

发明内容

本发明的目的是在于构建一个鸡源EphA2敲除的细胞系，提供一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法。本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向鸡EphA2基因的sgRNA，之后转染带有sgRNA和Cas9基因的lentiCRISPR v2质粒，利用CRISPR-Cas9系统达到基因沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源EphA2敲除的细胞系。

本发明的目的是这样实现的，一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)、构建一种特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA，所述的sgRNA位于鸡EphA2基因的第三个外显子区域，且靶序列唯一；

步骤2)、准备一种用于靶向敲除鸡EphA2基因的CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cas9系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列；CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白基因和sgRNA序列位于同一载体上，所述载体为lentiCRISPR v2；

步骤3)、将步骤2)构建的含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA的lentiCRISPR v2质粒转染到细胞中，利用CRISPR-Cas9系统达到基因沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源EphA2敲除的细胞系。

步骤1)中，对鸡EphA2基因设计了1条sgRNA，所述sgRNA的靶位点位于EphA2基因的第三个外显子，该外显子序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA编码链及互补链，其序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤1)中，靶向鸡EphA2基因的sgRNA制备方法，包括将合成的sgRNA编码链和互补链退火形成双链DNA，之后通过BsmBI限制性内切酶酶切载体，将双链DNA置于T7启动子之下构建获得。

步骤3)中，所述的细胞系为敲除鸡EphA2基因的DF-1细胞。

本发明方法先进科学，通过本发明，本发明首先提供了一种特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA，所述的sgRNA位于鸡EphA2基因的第三个外显子区域，且靶序列唯一，所述sgRNA如表1所示。本发明所述sgRNA针对鸡EphA2基因的靶位点，其序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供了一种用于靶向敲除鸡EphA2基因的CRISPR-Cas9系统，在所述的系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列。

其次，本发明所述的CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白的编码序列与sgRNA的编码序列位于同一质粒上，所述的质粒为lentiCRISPR v2。

敲除的具体操作如下：

(1)利用NCBI在线数据库查找鸡EphA2基因组序列

NCBI Reference Sequence:XM_001234813.5

在该基因的第三个外显子设计敲除靶位点，第三个外显子的序列如SEQ ID NO.1所示。

(2)sgRNA的构建：设计好的sgRNA编码链和互补链分别命名为sgRNA_F和sgRNA_R，把引物稀释至100uM浓度，体系如下：sgRNA_F和sgRNA_R各1uL，PCR buffer 1μL，ddw 7μL，退火程序为5℃/min梯度降温至25℃，获得双链DNA。另一方面，利用BsmBI限制性内切酶酶切lentiCRISPR v2载体，酶切体系如下：BsmBI限制性内切酶1μL，lentiCRISPR v2质粒1μg，0.1M DTT 0.5μL，NEB buffer3.1 5μL，其余用ddw补至50μL，酶切条件为55℃15min，之后通过跑胶后胶回收获得含有粘性末端的lentiCRISPR v2载体质粒。最后，将获得的sgRNA与酶切后的载体质粒通过连接酶连接，最终将sgRNA放入lentiCRISPR v2质粒中，获得sgRNA和Cas9蛋白基因位于同一载体的质粒，命名为EphA2-sgRNA。

(3)敲除细胞系的获得：6孔板中转染构建好的EphA2-sgRNA，每孔4μg质粒，设立不转染的细胞作对照。48h后加入含有嘌呤霉素的培养基进行药物筛选，每天换药，待阴性对照细胞全部死亡后，换成不含药物的完全培养基，存活的细胞生长至适当密度后，利用有限稀释法进行亚克隆至96孔板中，待细胞生长至足够数量时进行鉴定，之后冻存阳性细胞。

通过本发明，构建一种基于CRISPR-Cas9靶向敲除鸡EphA2基因的方法，及其靶向鸡EphA2基因的sgRNA，以期获得鸡源EphA2基因敲除的细胞模型，用于相关疾病的研究。本发明基于CRISPR-Cas9靶向敲除鸡EphA2基因的细胞系构建在相关领域未见报道，本发明将填补国内外相关技术的空白，具有较大的应用研究价值。

附图说明

图1为lentiCRISPR v2载体质粒的酶切；

泳道M：super DNA marker；泳道2：酶切后lentiCRISPR v2载体质粒。

图2为亚克隆EphA2-KO细胞系的鉴定；

泳道1:EphA2-KO细胞系；泳道2：正常DF-1细胞。

图3为亚克隆EphA2-KO细胞系的测序鉴定。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明技术方案进一步说明，但本发明的内容并不局限于此。

1、查找目的基因:利用NCBI在线数据库查找鸡EphA2基因组序列。NCBI ReferenceSequence:XM_001234813.5，在该基因的第三个外显子设计敲除靶位点，第三个外显子的序列如SEQ NO.1所示。

2、利用在线设计网站设计针对靶序列的sgRNA：利用张锋实验室网站https://zlab.bio/guide-design-resources进行sgRNA的设计，选取评分最高的sgRNA，在sgRNA_F的5’端前部添加CACCG，在sgRNA_R的5’端添加AAAC，3’端添加C，具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

SEQ ID NO.2表1.靶向针对鸡EphA2基因的sgRNA

3、双链sgRNA的获得：用ddw将sgRNA_F和sgRNA_R溶解，使其终浓度为100μM浓度，利用以下退火体系：sgRNA_F和sgRNA_R各1μL，10×PCR buffer 1μL，ddw 7μL，退火程序为5℃/min梯度降温至25℃，获得双链DNA。

4、载体质粒的酶切：利用BsmBI限制性内切酶酶切lentiCRISPR v2载体，酶切体系如下：BsmBI限制性内切酶1μL，lentiCRISPR v2质粒1μg，0.1M DTT 0.5μL，NEB buffer3.15μL，其余用ddw补至50μL，酶切条件为55℃15min，之后通过跑凝胶电泳(图1)，胶回收获得含有粘性末端的lentiCRISPR v2载体质粒。

5、表达sgRNA载体质粒的构建：将退火获得的双链sgRNA进行100倍稀释，同时将胶回收的载体质粒稀释至50ng/μL，之后按照以下体系进行连接：载体质粒1μL，双链sgRNA 1μL，T4连接酶1μL，10×T4buffer 1μL，ddw 6μL，在4℃连接过夜，随后转化至stbl3感受态细胞中，挑取菌落提质粒后送测序鉴定。

6、敲除细胞系的筛选：准备一个6孔板的DF-1细胞，每个孔分别转染4μg的sgRNA，不转染的细胞作为对照,转染6h后换成5％生长液，48h后弃去原培养基，加入含有6μM嘌呤霉素的5％FBS DMEM培养基进行筛选，每隔2d换液，待阴性对照组的细胞全部死亡后，加入无药物的5％FBS DMEM，当细胞密度达到80％左右时，进行亚克隆，同时收集细胞进行WB验证(图2)，选择保留sgRNA工作效率较高的亚克隆的细胞板。

7、敲除细胞系的鉴定：待亚克隆的细胞生长至足够密度时，传代至48孔板，24孔板，12孔板，6孔板，之后收集细胞进行WB鉴定，以正常DF-1细胞为阴性对照，结果如图3。

SEQ ID NO.1

鸡EphA2基因第三个外显子序列：

tgggacctgcagcagcacgtgctgaacgacacggggatctacatctacgcggtgtgcagcgtgctgcagggcgagcaggagaactggctgcgcaccaactggatctaccgcagcgaggcccagcgcatcttcatcgagctcaaattcaccgtccgcgactgcaacagcttccctggaggcggcggctcctgcaaggagaccttcaacctcttctatgctgaatctgacgttgactacggcaccaatttccagaagcgacagttcaaaaagatcgacaccatcgctccggatgagatcacggtgcaagaagactttgagacgcggaacgtcaaactcaacgtggaggtgcgctcggtgggacctctgcaccggaaaggtttctacctggcttttcaggacctgggggcctgcgtgtccctgctgtccgtgcgggtgtactacaagacatgcccggctgtgctgcggggcctggcggtgttccccgagacggtggcgggcgctgactcgcagcagctggcgaaggtgcagggggcctgcgtggagaacgcggtggctgacagggcgccgatgctgcactgcaacatggatggagagtggttggtgcccatcgagcagtgccagtgccaggctggctacgaggcagcaggagagcaatgtcaag

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccgggcct gcgtggagaa cgcgg 25

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacccgcgt tctccacgca ggccc 25

<210> 3

<211> 661

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggacctgc agcagcacgt gctgaacgac acggggatct acatctacgc ggtgtgcagc 60

gtgctgcagg gcgagcagga gaactggctg cgcaccaact ggatctaccg cagcgaggcc 120

cagcgcatct tcatcgagct caaattcacc gtccgcgact gcaacagctt ccctggaggc 180

ggcggctcct gcaaggagac cttcaacctc ttctatgctg aatctgacgt tgactacggc 240

accaatttcc agaagcgaca gttcaaaaag atcgacacca tcgctccgga tgagatcacg 300

gtgcaagaag actttgagac gcggaacgtc aaactcaacg tggaggtgcg ctcggtggga 360

cctctgcacc ggaaaggttt ctacctggct tttcaggacc tgggggcctg cgtgtccctg 420

ctgtccgtgc gggtgtacta caagacatgc ccggctgtgc tgcggggcct ggcggtgttc 480

cccgagacgg tggcgggcgc tgactcgcag cagctggcga aggtgcaggg ggcctgcgtg 540

gagaacgcgg tggctgacag ggcgccgatg ctgcactgca acatggatgg agagtggttg 600

gtgcccatcg agcagtgcca gtgccaggct ggctacgagg cagcaggaga gcaatgtcaa 660

g 661

Claims (5)

1.一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)、构建一种特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA，所述的sgRNA位于鸡EphA2基因的第三个外显子区域，且靶序列唯一；

步骤2）、准备一种用于靶向敲除鸡EphA2基因的CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cas9系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列；CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白基因和sgRNA序列位于同一载体上，所述载体为lentiCRISPR v2；

步骤3）、将步骤2)构建的含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA的lentiCRISPR v2质粒转染到细胞中，利用CRISPR-Cas9系统达到基因沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源EphA2敲除的细胞系。

2. 根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1）中，对鸡EphA2基因设计了1条sgRNA，所述sgRNA的靶位点位于EphA2基因的第三个外显子，该外显子序列如SEQ ID NO.1所示。

3. 根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，所述的特异性靶向鸡EphA2基因的sgRNA编码链及互补链，其序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤1）中，靶向鸡EphA2基因的sgRNA制备方法，包括将合成的sgRNA编码链和互补链退火形成双链DNA，之后通过BsmBI限制性内切酶酶切载体，将双链DNA置于T7启动子之下构建获得。

5.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤3）中，所述的细胞系为敲除鸡EphA2基因的DF-1细胞。

Images