CN110055254A - 靶向敲除鸡irf7基因的方法及其在疫苗制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用；基于CRISPR/Cas9，设计针对鸡IRF7基因的gRNA靶序列并连接至VK001‑02质粒，获得鸡IRF7基因打靶载体；利用脂质体将打靶载体转染至鸡成纤维细胞中。通过嘌呤霉素筛选转染成功的细胞后，经有限倍比稀释法筛选获得敲除chIRF7基因的鸡成纤维细胞。该敲除细胞系经TCID50验证表明其可使病毒滴度增高。该方法适用于鸡天然免疫模式识别受体所介导的干扰素表达通路中重要转录因子IRF7的作用及功能的研究。同时本发明所构建的敲除细胞系可使许多先天免疫通路所介导的干扰素β表达水平下调，利于病毒繁殖，可用于疫苗制备中病毒的扩增。

Description

靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用。
背景技术
CRISPR/Cas9是广泛存在于细菌和古生菌中的天然免疫系统。该系统的基本结构包括tracrRNA序列区、cas基因序列区和CRISPR序列区。当噬菌体首次侵入宿主时，cas基因锁编码的蛋白复合物会裂解噬菌体DNA上的端间隔序列，随后将裂解片段整合到自身DNA的CRISPR 5’端。当噬菌体再次侵入宿主时，CRISPR序列区转录出pre-crRNA，并在RNaseⅢ、cas9及tracrRNA的共同作用下成熟为crRNA。crRNA与tracrRNA形成复合体，与噬菌体DNA特异位点互补配对结合，引导cas9核酸酶对结合位点进行切割。
为了便于应用，在实际操作中常将crRNA与tracrRNA改造成gRNA。故只需设计一段与目标DNA序列互补的gRNA序列，将该gRNA与编码cas9核酸酶的mRNA导入细胞，即可实现对目标DNA的切割。切割完成后，引发非同源性末端结合或同源重组使断裂DNA重新连接。在此修复过程中会发生部分碱基的缺失或插入从而造成移码突变，从而实现特定基因的敲除。
CRISPR/Cas9已被用于多种模式动物的基因敲除，然而该技术在禽类基因敲除上的应用仍较少，且已有的在禽类上的应用报道较低的敲除效率。本发明提供了一个高效的鸡CRISPR/Cas9基因敲除方法，用于敲除鸡IRF7基因效率较高。同时，本发明通过TCID50表明本发明所构建的鸡IRF7基因敲除细胞感染病毒后较野生型细胞病毒滴度更高，即相较于现有工具，本发明提供了一个更高效的病毒扩增工具，可用于包括但不限于疫苗制备中的病毒扩增。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，用于但不限于鸡成纤维细胞(DF-1)。
本发明的另一目的是在于，提供利用上述方法制备的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系及其作为细胞模型在IRF7在先天免疫信号转导通路中的功能研究的应用。
本发明的又一目的是在于，提供可用于包括但不限于在疫苗制备中病毒扩增的更高效工具。
本发明根据CRISPR/Cas9系统原理及gRNA设计原理，利用靶标设计软件设计出两对针对鸡IRF7的gRNA，构建基因CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，作为鸡IRF7基因打靶载体。gRNA作用位点的DNA序列分别为：AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGG SEQ ID NO.2；和AAGGGATGCGGAAGATACGGCGG SEQ ID NO.3；用于构建所述表达载体的出发载体为VK001-02。
本发明的目的具体是通过以下技术方案来实现的：
第一方面，本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)根据CRISPR/Cas9设计原则，设计针对鸡IRF7基因的gRNA序列；
(2)构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，作为鸡IRF7基因的打靶载体；
(3)将打靶载体转染细胞；
(4)筛选稳定细胞株；
(5)测定打靶效率；
(6)筛选阳性克隆株，获得鸡IRF7基因敲除细胞系。
优选的，所述gRNA序列为：
IRF7-gRNA1:AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGG SEQ ID NO.2；
IRF7-gRNA2：AAGGGATGCGGAAGATACGGCGG SEQ ID NO.3。
优选的，所述打靶载体的出发载体是VK001-02。
优选的，转染的细胞是鸡成纤维细胞DF-1。
优选的，所述筛选稳定细胞株的方法是使用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。
优选的，所述测定打靶效率为取细胞悬液测序获得打靶效率。
具体为：取细胞悬液，进行PCR扩增测序分析。
优选的，用于测定打靶效率的特异性PCR引物为：
CRISPR-IRF7-G200U(g2+g1)TGCCGCCCCGCAGGGACGCCCAG SEQ ID NO.8；
CRISPR-IRF7-G1100L(g2+g1)GGTCCGGGCTCACCTGAGGCAACC SEQ ID NO.9；
CRISPR-IRF7-G600L(g2)TCCCACAGAACCATTAAGGCTGGAA SEQ ID NO.10；
CRISPR-IRF7-G500U(g1)GGGCACTGGTGAGATCGCTGTGC SEQ ID NO.11。
优选的，所述筛选阳性克隆株即鉴定中靶阳性细胞克隆。具体为对稀释所得各单克隆进行PCR扩增测序比对分析。
优选的，用于鉴定中靶阳性细胞克隆的特异性PCR引物为：
CRISPR-IRF7-G200U(g2+g1)TGCCGCCCCGCAGGGACGCCCAG SEQ ID NO.8；
CRISPR-IRF7-G600L(g2)TCCCACAGAACCATTAAGGCTGGAA SEQ ID NO.10。
第二方面，本发明涉及一种鸡IRF7基因的打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，所述gRNA表达载体的出发载体为VK001-02质粒；所述gRNA序列为：
IRF7-gRNA1:AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGG SEQ ID NO.2；
或IRF7-gRNA2：AAGGGATGCGGAAGATACGGCGG SEQ ID NO.3。
优选的，所述gRNA表达载体的出发载体为VK001-02质粒。
优选的，所述打靶载体是根据gRNA序列，人工合成反向互补的寡核苷酸，将互补的寡核苷酸变性退火后与质粒VK001-02连接构建得到的。
所述gRNA表达载体为CRISPR-chIRF7-g1或CRISPR-chIRF7-g2。
第三方面，本发明还涉及一种鸡IRF7基因的打靶载体在制备鸡IRF7基因敲除细胞系中的应用。
第四方面，本发明还涉及一种鸡IRF7基因敲除DF-1细胞系，用前述的打靶载体转染鸡成纤维细胞(DF-1)，获得的中靶阳性细胞克隆，即为鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系。
优选的，利用脂质体将打靶载体转染至鸡成纤维细胞(DF-1)。
优选的，使用本发明构建的鸡IRF7基因敲除DF-1细胞系，突变后的IRF7基因对应的DNA序列如下SEQ ID NO.13所示：
突变型：GAAGA—CGGCGGT SEQ ID NO.12；
野生型：GAAGATACGGCGGT SEQ ID NO.13。
可见，使用本发明构建的细胞模型鸡IRF7敲除的DF-1细胞系，缺失了IRF7基因序列，而对上下游基因序列并未产生突变。
第五方面，本发明还涉及一种前述的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系及其作为细胞模型在IRF7在先天免疫信号转导通路中的功能研究的应用。
第六方面，本发明还涉及一种前述的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系在包括但不限于疫苗制备中病毒扩增的应用。
本发明通过双荧光报告基因实验表明本发明所构建的鸡IRF7敲除的DF-1细胞系相较于DF-1细胞可使先天免疫信号通路所介导的干扰素β表达水平下调；通过TCID50表明，鸡IRF7敲除的DF-1细胞系相较于DF-1细胞病毒滴度更高，故可应用于更高效的病毒扩增。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明通过CRISPR/Cas9技术首次敲除掉鸡成纤维细胞(DF-1)的IRF7基因，具有效率高、速度快、简便经济的优点。
2)同时相比于RNAi、沉默等手段，本发明可以更好地敲除掉鸡IRF7基因。
3)本发明提供了一个鸡IRF7基因敲除的理想细胞模型，有利于研究IRF7在先天免疫信号模式识别受体信号转导通路中的作用，对先天免疫干扰素的诱导表达及细胞抵御病毒感染能力的研究具有重要意义。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明所述的基于CRISPR/Cas9的针对鸡IRF7基因所设计的gRNA序列示意图；
图2为本发明所述的基于CRISPR/Cas9的gRNA表达载体结构图；
图3为鸡IRF7基因敲除细胞株测序鉴定结果；
图4为双荧光报告基因系统检测干扰素β表达水平结果；
图5为病毒滴度实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1、利用CRISPR/Cas9技术敲除DF-1细胞IRF7基因的方法
1.靶向鸡IRF7的gRNA的设计
通过GeneBank查找鸡IRF7的基因序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。
将该基因外显子作为靶标设计区域。基于CRISPR/Cas9的针对鸡IRF7基因所设计的gRNA序列示意图如图1所示，设计得出gRNA序列为：
IRF7-gRNA1:AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGG SEQ ID NO.2；
IRF7-gRNA2：AAGGGATGCGGAAGATACGGCGG SEQ ID NO.3。
2.CRISPR/Cas9打靶载体的构建
根据1中设计的gRNA1和gRNA2序列，分别设计并合成两对反向互补的寡核苷酸，合成的两对寡核苷酸序列分别为：
1)5’AAGGCCAGCGGCAGGTACGAGGG 3’SEQ ID NO.4；
3’TTCCGGTCGCCGTCCATGCTCCC 5’ SEQ ID NO.5；
2)5’AAGGGATGCGGAAGATACGGCGG 3’ SEQ ID NO.6；
3’TTCCCTACGCCTTCTATGCCGCC 5’ SEQ ID NO.7；
将互补的寡核苷酸变性退火后与质粒VK001-02(由苏州泓迅生物科技股份有限公司提供)连接。将连接产物转入感受态细胞(本实施例中感受态细胞选用DH5α)获得菌液。
取菌液在浓度1‰的氨苄平板中划线，37℃培养12h,挑取单克隆，在1mL含1‰氨苄的LB培养液中37℃培养5h，测序并选取包含1中所设计的gRNA序列的克隆。
所述的基于CRISPR/Cas9的gRNA表达载体结构图如图2所示。
3.无内毒素质粒的制备
上一步经测序鉴定选择符合预期的克隆，用OMEGA Endo-free Plasmid Mini KitII试剂盒大量制备无内毒素的质粒CRISPR-IRF7-g1和CRISPR-IRF7-g2，测定其浓度和纯度。质粒提取步骤依照说明书进行。
4.鸡IRF7基因敲除细胞系的构建
(1)细胞转染
观察鸡成纤维细胞(DF-1)细胞密度，当其密度达到70％-90％时，将上步中提取的CRISPR-IRF7-g1和CRISPR-IRF7-g2质粒分别转染DF-1细胞。转染体系及转染步骤如下：
转染体系：
打靶质粒 3μg/孔
脂质体核酸转染试剂 2μL/孔
转染步骤：
a.按需求预先配制一定体积的完全培养基(含7％FBS的DMEM，且使用Gibco公司生产的FBS及HyClone公司生产的DMEM)；
b.取无菌1.5ml EP管，质粒CRISPR-IRF7-g1和CRISPR-IRF7-g2分别取6μg，于EP管内稀释入400μl DMEM中，通过涡旋来混合均匀；
c.取无菌2ml EP管，在EP管中取8μl脂质体核酸转染试剂稀释入800μl DMEM中，颠倒混匀；
d.向每管经DMEM稀释的质粒中加入400μl(c)中的稀释后转染试剂，轻轻吹吸并颠倒混合均匀后，常温下静静放置20min；
e.取出六孔板，用移液枪吸出孔中的培养液，舍弃，加入1.6ml步骤a中配制的完全培养基；
f.将步骤d中静置20min后的混合液取400μl均匀加入至一孔细胞里，共可滴加两孔细胞，即两个重复；
g.转染5-6h后，用工具吸取细胞孔中的液体，弃去，加入2ml步骤a中配制的完全培养基。
(2)稳定细胞株的筛选
转染后48h，向转染了CRISPR-IRF7-g1和CRISPR-IRF7-g2质粒的DF-1细胞中分别加入浓度1.5mg/mL的嘌呤霉素进行筛选。24h后观察细胞，换液并继续用同浓度嘌呤霉素筛选质粒转染成功的细胞。打靶质粒所含的GFP基因使其可发出荧光。药筛期间通过观察发出荧光的细胞所占的比例了解药筛进程。直至荧光细胞比例达90％，将嘌呤霉素浓度调至1mg/mL维持2-3天。
(3)打靶效率的测定
利用胰酶消化转染后贴壁的细胞。收集细胞悬液，通过PCR扩增靶点序列。
所用扩增引物序列为：
CRISPR-IRF7-G200U(g2+g1)TGCCGCCCCGCAGGGACGCCCAG SEQ ID NO.8；
CRISPR-IRF7-G1100L(g2+g1)GGTCCGGGCTCACCTGAGGCAACC SEQ ID NO.9；
CRISPR-IRF7-G600L(g2)TCCCACAGAACCATTAAGGCTGGAA SEQ ID NO.10；
CRISPR-IRF7-G500U(g1)GGGCACTGGTGAGATCGCTGTGC SEQ ID NO.11。
PCR反应体系为：
(P1、P2是指用于PCR扩增的引物，引物序列如前述所用扩增引物序列)
PCR扩增程序为：
95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃再延伸5min。
PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察跑胶结果，使用TaKaRa MiniBest AgaroseGel DNA Extraction Kit试剂盒回收DNA，回收步骤如说明书所述。
使用零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(艾德莱生物)将DNA连接pTOPO-BluntVector。
连接体系为：
(其中pTOPO Blunt Vector及10×Enhancer为上述艾德莱生物公司生产的零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒中所包含的试剂)
连接方法为将连接体系中所述内容涡旋混合均匀后，置于常温下反应5min。
将连接产物转化感受态细胞，具体方法为：
a.在超净工作台内取出经高压灭菌处理之1.5ml离心管，将50μl感受态细胞加入EP管中。感受态细胞储存在-80℃中，需提前5-10min拿出置在冰上冻融。
b.在超净工作台内使5μL连接的产物与50μl感受态细胞混合均匀。
c.冰浴20min后，置于42℃水浴锅里45秒，立即取出，再次冰浴2min.
d.将转化产物全部吸到含1‰氨苄青霉素的LB固体培养基表面，匀而涂布后置于37℃烘箱内倒置培养15h。
培养15h后各挑取_40_个单克隆测序。序列分析发现CRISPR-IRF7-g1和CRISPR-IRF7-g2打靶效率分别为25％(10/40)and 90％(36/40)。CRISPR-IRF7-g2打靶效率高，故选取该组细胞用于后续单克隆细胞株筛选。
将CRISPR-IRF7-g2细胞进行有限倍比稀释，在96孔板中培养单细胞克隆，用于筛选敲除鸡IRF7阳性细胞。
(4)检测靶位点突变
96孔板中细胞克隆扩大培养后，取细胞悬液，扩增靶点序列。
所用特异性引物序列为：
CRISPR-IRF7-G200U(g2+g1)TGCCGCCCCGCAGGGACGCCCAG SEQ ID NO.8；
CRISPR-IRF7-G600L(g2)TCCCACAGAACCATTAAGGCTGGAA SEQ ID NO.10；
PCR反应体系为：
(P1、P2是指用于PCR扩增的引物，引物序列如上述所用特异性引物序列)
PCR扩增程序为：
95℃预变性3min，95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min。
PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，观察跑胶结果，使用TaKaRa MiniBest AgaroseGel DNA Extraction Kit试剂盒回收DNA，回收步骤如说明书所述。
将DNA连接pTOPO-Blunt Vector,连接体系及方法如零背景pTOPO-Blunt平末端克隆试剂盒(艾德莱生物)试剂盒说明书所述。
取10μL连接产物与50μL感受态细胞混合，室温放置5分钟后在含氨苄1‰平板中37℃培养12h后挑取单克隆测序。重复上述步骤直至挑取送测序的单克隆达80个。
得到测序结果后，进行序列比对。将测序结果与原始序列比对，确定具体突变位置及其突变序列。经比对发现上述96孔板筛选的细胞中存在一孔细胞(将该细胞编号为B-4-3)克隆的PCR产物测序结果显示全部突变，突变类型为缺失2个碱基,这些碱基的缺失导致鸡IRF7基因移码突变。序列比对鉴定结果如图3所示。对应序列如下所示：
B-4-3：GAAGA—CGGCGGT SEQ ID NO.12；
野生型：GAAGATACGGCGGT SEQ ID NO.13。
(5)双荧光报告基因验证鸡IRF7对鸡先天免疫中干扰素β表达的影响。
将所构建的鸡IRF7敲除的DF-1细胞系与DF-1细胞分别铺至24孔细胞板。当细胞密度达90％时，通过脂质体核酸转染试剂转染的方法在细胞中分别过表达STING,MDA5,MAVS,TBK1，以空质粒为对照，并同时转染双荧光报告系统，目的是监测干扰素β表达水平。转染24小时后检测双荧光水平，以反映干扰素β表达水平。
图4为双荧光报告基因系统检测干扰素β表达水平结果，由图4可知，敲除鸡IRF7，干扰素β的表达受到显著抑制。因干扰素β对于机体抵御病毒感染至关重要，故由此可推测敲除鸡IRF7将有利于病毒繁殖。
(6)TCID50验证鸡IRF7缺失对病毒扩增的影响。
将鸡IRF7敲除的DF-1细胞系与DF-1细胞系分别铺至96孔细胞板，感染不同稀释倍数的新城疫病毒，在不同时间点观察细胞病变结果，计算病毒滴度。
图5为病毒滴度实验结果；由图5可知，鸡IRF7缺失的细胞病毒滴度更高，亦即敲除鸡IRF7基因有利于病毒的增殖。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 靶向敲除鸡IRF7基因的方法及其在疫苗制备中的应用
<130> DAG38295
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1476
<212> DNA
<213> 鸡IRF7基因(Chicken IRF7)
<400> 1
atggcagcac tggacagcga gggggacgcc cagaagctgc gcttcgggcc atggctgctg 60
aacgccgtca gcagcgggct gtaccgcggc ctctgctgga tcgacccgga ccgccgtatc 120
ttccgcatcc cttggaagca caacgccagg aaggatgtca ccagcagcga cgtggagatc 180
ttcaaggcct gggcgaaggc cagcggcagg tacgagggga acgctgagga tccggccaaa 240
tggaagacca acttccgctg cgccctgagg agcactcaca tgttcatgct gctggaggac 300
cgctccaagt gcaacgacga cccgcacaag gtctacgcgg ttgcctcagg cgtccccaat 360
gacagaggtt ctgggggccc tgtggcaggc gccctgcaac agcagccgca gctgttgctc 420
aaccaccacg atttggcctt ggaaaacact cccacagaca gtactgaagg tgttgctgca 480
gcagccctga cgcaggtgga tttggacctg ctgcagtccg tactgcagca ctgtaacatc 540
tctgccctcg gctcccagcc aaccctgtgg gcacacacag gggatgcctt gcctgaggat 600
gctctgctgc ttcctggcca agatggctgc ctcccagggc cacagtttca ggattggaga 660
cagctggagg agcctctgct gctggggaac cagcccctca caggtggggg ctgtgggcag 720
gacggggccg gggccctccc tgtgagtgag gaatgtgcca tccctgcacc atccccggct 780
gaggagctac tcttccagtc tgccaacccc gcgcctccgc caccggcagg tgacatagga 840
gggctgcccc ccctcctgga catcactatc tactaccgag gaaagatggt ctaccaggag 900
caggtggacg acagccgctg tgtgctggcc taccagcccc tggacccggc cgtggccgag 960
cagcggctgg tgctgttccc cagccccgcg agcctgcccg accccaggca gcggcgctac 1020
actgagaact tgctggaggt ggcggggctg cggctggagc agcgtgccgg ccagctcctg 1080
gccacgcgcc tgaagaagtg caaggtcttc tgggccttgt cgcagcagct cgagggcggg 1140
gaacccccac tcaacctgct ccaccgggat caggagacca ccatcttcga cttcagggtg 1200
ttttgcacag agctccggga cttccgcgac agccgcaggg agcgctcccc cgacttcacc 1260
atcttcctct gcttcgggca gtgcttctcc agcacaaagc ccaaggagtc caagctcatc 1320
ctggtgaagc tggttcccca gttctgcgag tactggtacg agcaggtgca gcggggagga 1380
gcctcctccc tcaacagtgg caacgtcagc ctgcagctct ctgactcttt caacctcttc 1440
gagcttatcg agcaatacca catgcagaca gactga 1476
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaggccagcg gcaggtacga ggg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagggatgcg gaagatacgg cgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaggccagcg gcaggtacga ggg 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttccggtcgc cgtccatgct ccc 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagggatgcg gaagatacgg cgg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttccctacgc cttctatgcc gcc 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgccgccccg cagggacgcc cag 23
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggtccgggct cacctgaggc aacc 24
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcccacagaa ccattaaggc tggaa 25
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gggcactggt gagatcgctg tgc 23
<210> 12
<211> 12
<212> DNA
<213> B-4-3(Chicken anemia virus)
<400> 12
gaagacggcg gt 12
<210> 13
<211> 14
<212> DNA
<213> 野生型(Chicken anemia virus)
<400> 13
gaagatacgg cggt 14

Claims (10)

1.一种基于CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、根据CRISPR/Cas9设计原则，设计针对鸡IRF7基因的gRNA序列；
S2、构建基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，作为鸡IRF7基因的打靶载体；
S3、将打靶载体转染细胞；
S4、筛选稳定细胞株；
S5、测定打靶效率；
S6、筛选阳性克隆株，获得鸡IRF7基因敲除细胞系。
2.如权利要求1所述的基于CRISPR/Cas9技术敲除鸡IRF7基因的方法，其特征在于，所述gRNA序列为如SEQ ID NO.2所示的序列或如SEQ ID NO.3所示的序列；打靶载体的出发载体是VK001-02；转染的细胞是鸡成纤维细胞DF-1。
3.如权利要求1所述测定打靶效率的方法，其特征在于，用于测定打靶效率的特异性PCR引物分别为如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示序列的引物对，如SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11所示序列的引物对。
4.如权利要求1所述的敲除鸡IRF7基因的方法，其特征在于，用于筛选阳性克隆株的特异性PCR引物包括如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10所示序列的引物。
5.一种鸡IRF7基因的打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的gRNA表达载体，所述gRNA序列为如SEQ ID NO.2所示的序列或如SEQ ID NO.3所示的序列。
6.一种如权利要求5所述的打靶载体在制备鸡IRF7基因敲除细胞系中的应用。
7.一种鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系，其特征在于，用如权利要求6所述的打靶载体转染DF-1细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为所述鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系。
8.如权利要求7所述的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系，其特征在于，突变后的IRF7基因对应的DNA序列为如SEQ ID NO.12所示的序列。
9.一种如权利要求7或8所述的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系在先天免疫模式受体信号转导通路中IRF7的功能研究中的应用。
10.一种如权利要求7或8所述的鸡IRF7基因敲除的DF-1细胞系在包括但不限于疫苗制备中病毒扩增的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684736A (zh) * 2019-08-15 2020-01-14 扬州大学 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡Shp-2基因的细胞系及其构建方法
CN111304172A (zh) * 2020-02-18 2020-06-19 扬州大学 一种基于CRISPR-Cas9编辑技术的敲除鸡EphA2基因的细胞系的构建方法
CN114107303A (zh) * 2021-12-08 2022-03-01 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心 sgRNA、质粒、IRF7功能缺失的细胞系及其构建方法和应用

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