CN112522269A

CN112522269A - 特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列及应用

Info

Publication number: CN112522269A
Application number: CN202011508193.3A
Authority: CN
Inventors: 朱桂玉; 孟璐; 黄晓晨; 满秋; 侯博文; 彭哲伦; 王恒
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2020-12-19
Filing date: 2020-12-19
Publication date: 2021-03-19

Abstract

本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列及应用。本发明涉及鸡TYR基因的第一外显子上设计4个sgRNA，利用CRISPR/Cas9系统，从中挑选出能够特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的一条sgRNA。通过将本发明提供的sgRNA序列以及CRISPR/Cas9系统的结合使用，可以实现鸡中TYR基因的编辑或敲除，进而实现TYR的标记辅助选择或基因的低表达，为制备TYR转基因鸡奠定了技术基础。

Description

特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列及应用

技术领域

本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列及应用，本发明涉及特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的sgRNA导向序列。

背景技术

细菌和古细菌通过CRISPR/Cas系统识别和破坏入侵的高变病毒DNA或质粒DNA来进行免疫防御，CRISPR/Cas是由crRNA(CRISPR RNA)介导DNA识别、Cas核酸酶介导DNA裂解。II类CRISPR系统需要一个单分子蛋白Cas9，依赖于双链断裂(DSB)产生以及细胞DNA修复过程，成熟的crRNA与tracrRNA结合，形成tracrRNA/crRNA复合物，引导Cas9到达靶位点。CRISPR/cas9介导的靶位点特异性切割需要一个与crRNA匹配的DNA序列和PAM(protospacer adjacent motif)序列，对于Ⅱ类CRISPR系统，PAM序列为NGG。为了便于CRISPR系统在基因编辑中应用，Jinek等研究人员在2012年设计了一种精细的向导RNA(gRNA)，含有所有必需的crRNA、tracrRNA组分。CRISPR/Cas9系统在特定位点切割后会诱发细胞的DNA进行非同源末端修复或同源重组修复，获得在切割位置附近碱基的缺失、插入或者实现靶位点的突变和目的片段的插入与敲除。使用CRISPR/Cas9可以精准简便地操纵感兴趣的基因组元件，并有助于阐明生物学和疾病中的靶基因功能，现已广泛应用于功能基因组学、转基因生物和基因治疗等相关研究中。

TYR基因(Tyrosinase)编码酪氨酸酶，在无脊椎动物和脊椎动物中都有分布，在各种生理活动方面起至关重要作用。酪氨酸酶是一种负责从酪氨酸中产生黑色素的多功能的初始酶，这种酶本身就足以促进非黑色素生成细胞的黑色素生成，同时对黑素细胞的黑色素生物合成至关重要。Chang等人在2006年的研究中指出黑色素合成途径中酪氨酸酶功能不足会导致动物白化表型。在鸟类动物方面，鸡的TYR基因已经被成功克隆并且发现了一些突变，若通过利用CRISPR/Ca9系统对鸡TYR基因进行修饰，对于研究TYR基因对鸡毛色表型中的功能及其毛色的选育工作具有深远意义。敲除TYR基因的动物无法合成黑色素，因此这个基因也被广泛用作基因编辑技术的参考基因，敲除后可获得易观察的白化表型动物，对于动物本身杀伤力也比较低，如今TYR敲除的小鼠模型已经构建成熟，在鸡TYR敲除模型中还是空白。而获得TYR转基因动物的首要步骤就是找到能够特异性靶向TYR的sgRNA，即该sgRNA与CRISPR/Cas9结合使用，能够对靶点处进行编辑。本发明则提供了特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA序列，为研究鸡TYR基因的功能机制以及制备转基因鸡奠定基础。

发明内容

为了更方便的产生并研究TYR转基因鸡，本发明的目的是提供能够特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA序列及其应用，该序列可用于靶向修饰鸡TYR基因，为制备转基因鸡奠定基础。

本发明的技术方案如下所述：

本发明设计了一条特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列，其核苷酸序列位于鸡TYR基因的第一外显子，具体核苷酸序列见SEQ ID NO：1。

针对上述鸡TYR基因上的靶标序列，本发明设计了四条sgRNA，并通过筛选，发现一条能够特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的sgRNA导向序列，申请人将这四个序列分别命名为TYR-sgRNA1(序列为SEQ ID NO：2)、TYR-sgRNA2(序列为SEQ ID NO：3)、TYR-sgRNA3(序列为SEQ ID NO：4)和TYR-sgRNA4(序列为SEQ ID NO：5)。

在进行特异性靶向验证时，本发明设计了一对鉴定引物，将特异性扩增得到的DNA片段命名为TYR-fragment(即SEQ ID NO：6所示的序列，片段长度为626bp)。

本发明的优势在于靶向序列选在鸡TYR基因的第一外显子，只要sgRNA打靶成功，TYR基因的转录与翻译就会受到影响，从而实现TYR基因的有效修饰与突变。

本发明提供了一条特异性打靶鸡TYR基因第一外显子的sgRNA，其特异性强效率高。在进行基因修饰时能有效减少CRISPR/Cas9系统引起的脱靶现象。

具体地本发明的技术方案使这样的：

一种特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的sgRNA导向序列的TYR-sgRNA1重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1和腺病毒载体ADV-TYR-sgRNA1，上述两个载体均含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

序列表SEQ ID NO:2所示序列的sgRNA导向序列在鸡的基因编辑中的应用，所述的应用包括以下步骤：

(1)根据鸡TYR基因的基因组序列，在其第一外显子上设计4个TYR-sgRNA，分别为TYR-sgRNA1，序列为SEQ ID NO：2；TYR-sgRNA2，序列为SEQ ID NO：3；TYR-sgRNA3，序列为SEQ ID NO：4和TYR-sgRNA4，序列为SEQ ID NO：5；在sgRNA导向序列的5’端加上CACC碱基得到TYR-sgRNA-F引物序列，所述TYR-sgRNA-F引物序列的左引物序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；同时根据sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链，且在5’端加上AAAC碱基得到TYR-sgRNA-R引物序列所述TYR-sgRNA-R引物序列的右引物序列分别如如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示范；分别合成上述单链TYR-sgRNA-F，它们的序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:13所示，以及单链TYR-sgRNA-R，它们的序列分别如SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示，将合成的这两段单链核苷酸通过变性退火形成双链DNA；

(2)将步骤(1)中得到的双链DNA与CRISPR/Cas9系统中的载体pX330连接，得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有TYR-sgRNA1的pX330-TYR-sgRNA1载体，其序列如SEQID NO：2所示；含有TYR-sgRNA2的pX330-TYR-sgRNA2载体，其序列为SEQ ID NO：3所示；含有TYR-sgRNA3的pX330-TYR-sgRNA3载体，其序列为SEQ ID NO：4所示，含有TYR-sgRNA4的pX330-TYR-sgRNA4载体，其序列为SEQ ID NO：5所示；

(3)将步骤(2)制得的重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1、pX330-TYR-sgRNA2、pX330-TYR-sgRNA3和pX330-TYR-sgRNA4采用脂质体转染的方法分别转染鸡的成纤维细胞系DF-1，48h后收集细胞并进行特异性靶向验证，所述的验证方法包括产物测序以及TA克隆，最终获得一条具有特异性靶向的sgRNA导向序列，该sgRNA导向序列的核苷酸序列如SEQID NO:2所示；

(4)将重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1用腺病毒进行包装，得到表达TYR-sgRNA1的腺病毒载体ADV-TYR-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

本发明的特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的sgRNA导向序列的重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1和腺病毒载体ADV-TYR-sgRNA1(核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示)可在鸡TYR基因编辑中应用。

附图说明

图1:四条含有sgRNA的pX330测序结果。附图标记说明：图1中的A图是sgRNA1，为含有TYR-sgRNA1的Px330载体；图1中的B图是sgRNA2，为含有TYR-sgRNA2的Px330载体；图1中的C图是sgRNA3，为含有TYR-sgRNA3的Px330载体，图1中的D图是sgRNA4，为含有TYR-sgRNA4的Px330载体。

图2:质粒转染细胞后的测序结果。附图标记说明：图2中的A图是sgRNA1，为含有TYR-sgRNA1的Px330载体转染细胞后用鉴定引物特异性扩增得到的DNA片段TYR-fragment；图2中的B图是sgRNA2，为含有TYR-sgRNA2的Px330载体转染细胞后用鉴定引物特异性扩增得到的TYR-fragment；图2中的C图是sgRNA3，为含有TYR-sgRNA3的Px330载体转染细胞后用鉴定引物特异性扩增得到的TYR-fragment；图2中的D图是sgRNA4，为含有TYR-sgRNA4的Px330载体转染细胞后用鉴定引物特异性扩增得到的TYR-fragment；图2中的E图是对照(简称NC)，为空质粒)，转染细胞后得到的DNA片段命名为TYR-fragment。

图3：质粒转染细胞后的TA克隆结果。附图标记说明：pX330-TYR-sgRNA1转染的部分细胞基因组在DNA片段TYR-fragment(626bp)中发生了突变。图3中的A图是TYR-fragment1在PAM位点前发生了碱基替换(核苷酸序列见SEQ ID NO：7，其中加下划线的粗体字A碱基为突变碱基，原碱基G被替换成了碱基A)；图3中的B图是TYR-fragment2在PAM位点处发生了碱基的缺失(核苷酸序列见SEQ ID NO：8，其中在加下划线的粗体字GA之间发生了14个连续碱基的缺失,缺失这14个碱基为CAAAGGACTGTGTG)；图3中的C图是TYR-fragment3在PAM位点前发生了碱基的缺失(核苷酸序列见SEQ ID NO：9，其中在加下划线的粗体字GA之间发生了17个连续碱基的缺失，缺失这17个碱基为TGGGACTGGCGAGATGC)；图3中的D图是对照NC，NC质粒(空质粒)转染细胞后得到的DNA片段TYR-fragment(核苷酸序列见SEQ IDNO：6)，在PAM位点附近没有任何突变且序列是完整无误的。

图4：腺病毒载体侵染效率的观察结果。附图标记说明：图4中的A图为含有GFP元件的腺病毒载体侵染细胞后，在明场条件下拍摄的鸡DF-1细胞；图4中的B图为含有GFP元件的腺病毒载体侵染细胞后，在荧光条件下拍摄的鸡DF-1细胞。

图5：腺病毒载体侵染细胞后测序结果。附图标记说明：图5中的A图是腺病毒载体ADV-sgRNA1,含有TYR-sgRNA1，侵染细胞后，用鉴定引物特异性扩增得到的DNA片段TYR-fragment；图5中的B图是对照(简称NC)，为含有GFP元件的腺病毒载体侵染细胞后，用鉴定引物特异性扩增得到的DNA片段TYR-fragment。

图6：含有四条sgRNA的pX330质粒图谱。附图标记说明：图6中的A图是含有TYR-sgRNA1的Px330载体；图6中的B图是含有TYR-sgRNA2的Px330载体；图6中的C图是含有TYR-sgRNA3的Px330载体，图6中的D图是含有TYR-sgRNA4的Px330载体。

图7：含有TYR-sgRNA1的腺病毒载体图谱。图7为含有TYR-sgRNA1的pADM-U6-gRNA-CMV-spCas9载体。

图8：用于TA克隆的PMD 19T Vector质粒图谱。

具体实施方式

对序列表的说明：

序列表SEQ ID NO:1是本发明克隆鸡TYR基因的一个DNA片段的核苷酸序列(927bp)，具体序列如下：

CCCAGTTGGGAGGAAAAGTTTCTTTCACACTCAGGTCATTGGAGCGGTCAGAGAGAACTCTCCATGCACTGAAGCATAACACTGATGCTCTCCTGCTGCTCTGTGAGGATGTTTCTGTTTGCCATGGGCTTACTGCTGGTCATCCTTCAGCCGTCCACTGGGCAGTTCCCCAGAGTCTGTGCAAACACGCAGAGCTTGCTGAGGAAGGAGTGCTGTCCGCCCTGGGATGGAGATGGGACCCCTTGCGGGGAGCGTTCCAACAGAGGAACCTGCCAGCGCATCCTTCTCTCTCAGGCTCCTCTGGGACCACAGTTCCCTTTCTCAGGAGTGGATGACAGAGAGGATTGGCCTTCTGTCTTTTACAACCGGACATGCAGATGCAGAGGCAATTTCATGGGGTTCAACTGTGGGGAGTGCAAGTTTGGCTTCTCAGGACAAAACTGCACTGAAAGGCGACTGAGAACGAGAAGAAACATCTTCCAGCTCACCATCAGTGAGAAGGACAAGTTCCTTGCCTACCTTAACCTAGCAAAGAACATCCCCAGCAAGGACTATGTAATTGCTACTGGCACATATGCTCAGATGAACAACGGCTCCAACCCCATGTTCAGAAATATCAACGTGTACGATCTCTTCGTCTGGATGCATTATTATGCCTCTCGAGACACACTCTTAGGTGGCTCCAATGTGTGGAGAGACATTGATTTTGCCCATGAAGCCCCTGGTTTTCTGCCTTGGCATCGTGCTTTTCTGCTGCTGTGGGAACGTGAGATACAGAAGATAACAGGTGATGAGAATTTCACCATCCCCTACTGGGACTGGCGAGATGCAGAGGACTGTGTGATCTGCACTGATGAATACATGGGTGGCCAACACCCCACCAACCCTAATTTACTCAGCCCAGCATCATTTTTCTCCTCATGGCAG

序列表SEQ ID NO:2是TYR-sgRNA1序列(19bp)，具体序列如下：

TGGGACTGGCGAGATGCAG

序列表SEQ ID NO:3是TYR-sgRNA2序列(20bp)，具体序列如下：

CTGGTTTTCTGCCTTGGCAT

序列表SEQ ID NO:4是TYR-sgRNA3序列(20bp)，具体序列如下：

CGTGAGATACAGAAGATAAC

序列表SEQ ID NO:5是TYR-sgRNA4序列(20bp)，具体序列如下：

GAATTTCACCATCCCCTACT

序列表SEQ ID NO:6是本发明克隆鸡TYR基因的第二个DNA片段的核苷酸序列(626bp)，具体序列如下：

TGCTCAGATGAACAACGGCTCCAACCCCATGTTCAGAAATATCAACGTGTACGATCTCTTCGTCTGGATGCATTATTATGCCTCTCGAGACACACTCTTAGGTGGCTCCAATGTGTGGAGAGACATTGATTTTGCCCATGAAGCCCCTGGTTTTCTGCCTTGGCATCGTGCTTTTCTGCTGCTGTGGGAACGTGAGATACAGAAGATAACAGGTGATGAGAATTTCACCATCCCCTACTGGGACTGGCGAGATGCAGAGGACTGTGTGATCTGCACTGATGAATACATGGGTGGCCAACACCCCACCAACCCTAATTTACTCAGCCCAGCATCATTTTTCTCCTCATGGCAGGTAAGGACAGGCAAAGGGATGAAGGTAAGGGGAGGGCAAGAGGTAAGGGCAGAGCCAGGGGAAGGGAAAAGCTGATCATGGACAAACTATCCAATCTGACTTTAGGTACTTAAGTGAGGTGCGCTATCTGGAGAGAAAGTAAACTGCTTTCCAGATTTTATGTGGATCTTCATTTAGAGTATTCATTCATCTCTCTAACTCTGTAGAACATAGTTTAATTATGAATAAAAGTCAGTCTAGAGGGAGGAAAGTCATGCCGTTGTTTCCAAGCATG

序列表SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:14的序列是本发明设计的四条sgRNA对应的寡核苷酸序列：

序列表SEQ ID NO:7是本发明的TYR-sgRNA1的左引物TYR-sgRNA-F序列(24bp)，具体序列如下：

CACCGTGGGACTGGCGAGATGCAG

序列表SEQ ID NO:8是本发明的TYR-sgRNA1的右引物TYR-sgRNA-R序列(24bp)，具体序列如下：

AAACCTGCATCTCGCCAGTCCCAC

序列表SEQ ID NO:9是本发明的TYR-sgRNA2的左引物TYR-sgRNA-F序列(25bp)，具体序列如下：

CACCGATGCCAAGGCAGAAAACCAG

序列表SEQ ID NO:10是本发明的TYR-sgRNA2的右引物TYR-sgRNA-R序列(25bp)，具体序列如下：

AAACCTGGTTTTCTGCCTTGGCATC

序列表SEQ ID NO:11是本发明的TYR-sgRNA3的左引物TYR-sgRNA-F序列(25bp)，具体序列如下：

CACCGCGTGAGATACAGAAGATAAC

序列表SEQ ID NO:12是本发明的TYR-sgRNA3的右引物TYR-sgRNA-R序列(25bp)，具体序列如下：

AAACGTTATCTTCTGTATCTCACGC

序列表SEQ ID NO:13是本发明的TYR-sgRNA4的左引物TYR-sgRNA-F序列(24bp)，具体序列如下：

CACCGAATTTCACCATCCCCTACT

序列表SEQ ID NO:14是本发明的TYR-sgRNA3的右引物TYR-sgRNA-R序列(24bp)，具体序列如下：

AAACAGTAGGGGATGGTGAAATTC

序列表SEQ ID NO:15是TYR-fragment1的核苷酸序列，序列长度为582bp(加下划线粗体字为突变碱基)具体序列如下：

序列表SEQ ID NO:16是TYR-fragment2的核苷酸序列，序列长度为568bp(加下划线粗体字为突变碱基)具体序列如下：

序列表SEQ ID NO:17是TYR-fragment3的核苷酸序列序列，序列长度为565bp(加下划线粗体字为突变碱基),具体序列如下：

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。

下属实施例中所使用的方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明通过从数据库中下载鸡TYR基因(登陆号AADN05000588.1)的核苷酸序列，基于对该序列的分析，并且依据CRISPR/Ca9(参见文献：Cong L and Zhang F,2015)中sgRNA的设计原理，在鸡TYR基因第一外显子上设计和筛选sgRNA，最终筛选获得特异性靶向的1条sgRNA。以下实施例中以本发明设计的4条sgRNA为例进行说明。

实施例1 sgRNA序列的获得

根据鸡TYR基因的基因组序列【登陆号为AADN05000588.1(4876628..4926481)】，在其第一外显子上设计4个TYR-sgRNA，即在其5’端加上CACC碱基得到TYR-sgRNA-F引物(即左引物)序列；同时根据导向序列获得其对应的DNA互补链，并且在5’端加上AAAC碱基得到TYR-sgRNA-R引物(即右引物)序列；分别合成上述TYR-sgRNA-F和TYR-sgRNA-R序列，将合成的这两段寡核苷酸进行PCR，PCR反应条件：95℃变性10min，65℃退火50min，形成带有粘性末端的双链DNA，具体寡核苷酸序列见表1。

表1四条sgRNA对应的寡核苷酸序列

实施例2构建表达sgRNA的载体

(1)线性化载体的构建：取质粒载体pX330(Addgene，见图6中的E图)用Bbs Ⅰ酶切，酶切体系为50μL体系：Bbs Ⅰ 2μL，10X NEB Buffer 5μL，质粒2ug，用双蒸水补至50μL；酶切条件：37℃酶切2h；将酶切产物琼脂糖凝胶电泳后利用胶回收试剂盒(Omega公司)进行胶回收，回收方法见试剂盒的说明书。

(2)连接：将回收的酶切后的pX330与实施例1制得的双链DNA进行连接，连接体系为10μL体系：质粒pX330 50ng，退火后的双链sgRNA 1μL，SolutionⅠ：2.5μL，用双蒸水补至10μL；连接条件为16℃连接2h。

(3)转化：将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，具体转化方法为：-80℃取出大肠杆菌感受态DH5α，置于冰上溶解；然后用电动移液枪上下吹匀，取出50μL大肠杆菌感受态于新的1.5mL离心管中，再加入5μL上述的连接产物，混匀后冰浴5min；42℃水浴热激45s，立刻冰浴2min；然后将其全部均匀涂含有氨苄抗生素(100mg/mL,1000X)的平板中，倒置放于37℃恒温培养箱中，过夜培养。

(4)筛选阳性菌落并进行测序鉴定：挑取步骤(3)中培养得到的单个菌落，进行菌液PCR：(95℃5min；95℃15s；60℃30s；72℃15s；72℃5min；15℃2min，共35个循环)，用琼脂糖凝胶电泳检测。合格的菌落进行摇菌，将1mL菌液送相关商业测序公司进行测序，测序引物如下：5’-GCATATACGATACAAGGCTG-3’。对测序正确的菌液样品进行保菌和质粒提取。将测序正确的含有4个sgRNA的载体分别命名为：sgRNA1(含有TYR-sgRNA1的Px330载体，具体序列为：SEQ ID NO:2)；sgRNA2(含有TYR-sgRNA2的Px330载体，具体序列为：SEQ ID NO:3)；sgRNA3(含有TYR-sgRNA3的Px330载体，具体序列为：SEQ ID NO:4)和sgRNA4(含有TYR-sgRNA4的Px330载体，具体序列为：SEQ ID NO:5)。测序结果见图1所示。

实施例3四条sgRNA的特异性靶向验证

(1)细胞培养与收集：使用完全培养基复苏鸡DF-1细胞(来源：ATCC细胞库，编号：CRL-12203)，传代2-3次后进行转染，转染前一天，将5×10⁵～8×10⁵个细胞接种至6孔板，当密度达到70％时进行转染。

(2)转染：转染的具体步骤参照Lipo2000操作说明进行。将实施例2中构建的4个载体用lipo2000(购自Invitrogen公司)进行转染，48h后收集细胞，以NC质粒(空质粒)作为对照。

(3)sgRNA的特异性靶向验证：根据所设计的sgRNA序列位置，设计鉴定引物，所述引物序列如表2所示，48h后抽提细胞DNA，并用鉴定引物进行PCR扩增，反应体系为50μL：10XBuffer：5μL，dNTP：4μL，Lataq：0.5μL，F：1μL，R：1μL，DNA：100-250ng，用说双蒸水补至50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火38s，72℃延伸30s，共35个循环；之后在72℃延伸5min。将所获得DNA片段命名为TYR-fragment。PCR产物经产物回收试剂盒(宝生物工程大连有限公司)进行回收，然后对回收产物进行测序分析。

(4)测序分析

将PCR回收产物进行测序分析，测序结果见图2。结果表明，与对照组(图2中的E图，TYR-fragment片段呈现单峰)相比，pX330-TYR-sgRNA1转染的细胞基因组在DNA片段TYR-fragment中发生了突变(图2中A图的测序结果显示：PAM位点后有双峰出现)，而pX330-TYR-sgRNA2、pX330-Pax7-sgRNA3和pX330-Pax7-sgRNA4与对照组相比则没有变化(图2中的B图、图2中的C图和图2中的D图的测序结果显示：TYR-fragment片段呈现单峰)。

(5)TA克隆

将PCR产物经产物回收试剂盒进行回收，对该产物进行TA克隆。质粒载体为PMD19T Vector(购自宝生物工程大连有限公司，质粒图谱见图8)，按照实施例2的步骤(1)和步骤(2)所述的方法对载体PMD 19T Vector进行线性化并连接，然后将连接产物转化感受态DH5α，具体方法详见实施例2的步骤(3)，然后筛选阳性菌落并进行测序鉴定，挑取培养所得的单个菌落，进行菌液PCR，用琼脂糖凝胶电泳检测。将合格的菌落进行摇菌，将1mL菌液送测序公司，测序引物为：5’-GCATATACGATACAAGGCTG-3’。测序的部分结果见图3，结果显示，pX330-TYR-sgRNA1转染的部分细胞基因组在DNA片段TYR-sgRNA1(626bp)中发生了突变。TYR-sgRNA1-1在PAM位点前发生了碱基替换(见图3中的A图)，即，原碱基G替换成了碱基A；TYR-sgRNA1-2在PAM位点处发生了14个连续碱基的缺失(见图3中的B图)，即，缺失的14个碱基为CAAAGGACTGTGTG；TYR-sgRNA1-3在PAM位点处发生了17个连续碱基的缺失(见图3中的C图)，即，缺失的17个碱基为TGGGACTGGCGAGATGC；对照组的序列在PAM位点附近没有任何突变，是完整无误的(见图3中的D图)。

表2 sgRNA特异性靶向鉴定引物

	核苷酸序列(5’至3’)
		TYR-fragment-F	TGCTCAGATGAACAACGGCT
TYR-fragment-R	CATGCTTGGAAACAACGGCA

实施例4构建表达TYR-sgRNA1的腺病毒载体

为了进一步提高TYR-sgRNA1的靶向敲除效率，将TYR-sgRNA1(序列见SEQ ID NO：2)发至山东维真生物科技有限公司进行腺病毒包装，将包装好的表达TYR-sgRNA1的腺病毒载体命名为ADV-TYR-sgRNA1(载体图谱见图7)。

实施例5利用ADV-TYR-sgRNA1进行特异性靶向验证

(1)细胞培养与收集：使用完全培养基复苏鸡DF-1细胞，传代2-3次后进行转染，转染前一天，将5×10⁵～8×10⁵个细胞接种至6孔板，当密度达到70％时进行转染。

(2)侵染：侵染的具体步骤参照山东维真生物科技有限公司的腺病毒操作说明书进行操作。将实施例4中包装好的ADV-TYR-sgRNA1侵染鸡DF-1细胞，侵染带有GFP(绿色荧光蛋白)元件的腺病毒(ADV-GFP，山东维真生物科技有限公司)的鸡DF-1细胞作为NC，48h后收集细胞。

(3)ADV-TYR-sgRNA1特异性靶向效率验证：在ADV-TYR-sgRNA1侵染后48h后抽提细胞DNA，按照实施例3的步骤(3)所述的PCR反应条件和反应体系，使用表2中所示的鉴定引物进行扩增，将所获得DNA片段命名为TYR-fragment(核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示)。PCR产物经产物回收试剂盒(宝生物工程大连有限公司)进行回收，然后对回收的产物进行测序分析。

(4)测序分析

将PCR回收产物进行测序分析，测序结果见图5。结果表明，ADV-TYR-sgRNA1侵染的细胞基因组在DNA片段TYR-fragment中发生了突变(图5中的A图的测序结果显示：TYR-fragment片段相比于图2中的A图的双峰，呈现更加明显的双峰)，而对照组NC则没有变化(图5中的B图的测序结果显示：TYR-fragment片段呈现单峰)。

综上所述，本发明成功获得了一条特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的sgRNA，通过靶向验证结果可以看出，TYR-sgRNA1具有编辑TYR基因的功能。为了进一步提高TYR-sgRNA1的特异性靶向效率，本发明使用腺病毒载体包装TYR-sgRNA1，通过靶向验证结果可以看出，ADV-TYR-sgRNA1可以更高效地靶向并编辑鸡TYR基因，本发明为鸡TYR基因的功能研究及其进一步应用提供了一种基因的编辑方法。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列及应用

<141> 2020-12-18

<160> 17

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 927

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(927)

<400> 1

cccagttggg aggaaaagtt tctttcacac tcaggtcatt ggagcggtca gagagaactc 60

tccatgcact gaagcataac actgatgctc tcctgctgct ctgtgaggat gtttctgttt 120

gccatgggct tactgctggt catccttcag ccgtccactg ggcagttccc cagagtctgt 180

gcaaacacgc agagcttgct gaggaaggag tgctgtccgc cctgggatgg agatgggacc 240

ccttgcgggg agcgttccaa cagaggaacc tgccagcgca tccttctctc tcaggctcct 300

ctgggaccac agttcccttt ctcaggagtg gatgacagag aggattggcc ttctgtcttt 360

tacaaccgga catgcagatg cagaggcaat ttcatggggt tcaactgtgg ggagtgcaag 420

tttggcttct caggacaaaa ctgcactgaa aggcgactga gaacgagaag aaacatcttc 480

cagctcacca tcagtgagaa ggacaagttc cttgcctacc ttaacctagc aaagaacatc 540

cccagcaagg actatgtaat tgctactggc acatatgctc agatgaacaa cggctccaac 600

cccatgttca gaaatatcaa cgtgtacgat ctcttcgtct ggatgcatta ttatgcctct 660

cgagacacac tcttaggtgg ctccaatgtg tggagagaca ttgattttgc ccatgaagcc 720

cctggttttc tgccttggca tcgtgctttt ctgctgctgt gggaacgtga gatacagaag 780

ataacaggtg atgagaattt caccatcccc tactgggact ggcgagatgc agaggactgt 840

gtgatctgca ctgatgaata catgggtggc caacacccca ccaaccctaa tttactcagc 900

ccagcatcat ttttctcctc atggcag 927

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(19)

<400> 2

tgggactggc gagatgcag 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 3

ctggttttct gccttggcat 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 4

cgtgagatac agaagataac 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(20)

<400> 5

gaatttcacc atcccctact 20

<210> 6

<211> 626

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(626)

<400> 6

tgctcagatg aacaacggct ccaaccccat gttcagaaat atcaacgtgt acgatctctt 60

cgtctggatg cattattatg cctctcgaga cacactctta ggtggctcca atgtgtggag 120

agacattgat tttgcccatg aagcccctgg ttttctgcct tggcatcgtg cttttctgct 180

gctgtgggaa cgtgagatac agaagataac aggtgatgag aatttcacca tcccctactg 240

ggactggcga gatgcagagg actgtgtgat ctgcactgat gaatacatgg gtggccaaca 300

ccccaccaac cctaatttac tcagcccagc atcatttttc tcctcatggc aggtaaggac 360

aggcaaaggg atgaaggtaa ggggagggca agaggtaagg gcagagccag gggaagggaa 420

aagctgatca tggacaaact atccaatctg actttaggta cttaagtgag gtgcgctatc 480

tggagagaaa gtaaactgct ttccagattt tatgtggatc ttcatttaga gtattcattc 540

atctctctaa ctctgtagaa catagtttaa ttatgaataa aagtcagtct agagggagga 600

aagtcatgcc gttgtttcca agcatg 626

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(24)

<400> 7

caccgtggga ctggcgagat gcag 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(24)

<400> 8

aaacctgcat ctcgccagtc ccac 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<400> 9

caccgatgcc aaggcagaaa accag 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<400> 10

aaacctggtt ttctgccttg gcatc 25

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<400> 11

caccgcgtga gatacagaag ataac 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(25)

<400> 12

aaacgttatc ttctgtatct cacgc 25

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(24)

<400> 13

caccgaattt caccatcccc tact 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(24)

<400> 14

aaacagtagg ggatggtgaa attc 24

<210> 15

<211> 582

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(582)

<400> 15

acgtgtacga tctcttcgtc tggatgcatt attatgcctc tcgagacaca ctcttaggtg 60

gctccaatgt gtggagagac attgattttg cccatgaagc ccctggtttt ctgccttggc 120

atcgtgcttt tctgctgctg tgggaacgtg agatacagaa gataacaggt gatgagaatt 180

tcaccatccc ctactgggac tggcgagatg caaaggactg tgtgatctgc actgatgaat 240

acatgggtgg ccaacacccc accaacccta atttactcat cccagcatca tttttctcct 300

catggcaggt aaggacaggc aaagggatga aggtaagggg agggcaagag gtaagggcag 360

agccagggga agggaaaagc tgatcatgga caaactatcc aatctgactt taggtactta 420

agtgaggtgc gctatctgga gagaaagtaa actgctttcc agattttatg tggatcttca 480

tttagagtat tcattcatct ctctaactct gtagaacata gtttaattat gaataaaagt 540

cagtctagag ggaggaaagt catgccgttg tttccaagca tg 582

<210> 16

<211> 568

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(568)

<400> 16

acgtgtacga tctcttcgtc tggatgcatt attatgcctc tcgagacaca ctcttaggtg 60

gctccaatgt gtggagagac attgattttg cccatgaagc ccctggtttt ctgccttggc 120

atcgtgcttt tctgctgctg tgggaacgtg agatacagaa gataacaggt gatgagaatt 180

tcaccatccc ctactgggac tggcgagatg atctgcactg atgaatacat gggtggccaa 240

caccccacca accctaattt actcagccca gcatcatttt tctcctcatg gcaggtaagg 300

acaggcaaag ggatgaaggt aaggggaggg caagaggtaa gggcagagcc aggggaaggg 360

aaaagctgat catggacaaa ctatccaatc tgactttagg tacttaagtg aggtgcgcta 420

tctggagaga aagtaaactg ctttccagat tttatgtgga tcttcatttt gagtattcat 480

tcatctctct aactctgtag aacatagttt aattatgaat aaaagtcagt ctagagggag 540

gaaagtcatg ccgttgtttc caagcatg 568

<210> 17

<211> 565

<212> DNA

<213> 鸡(Gallus gallus domesticus)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(565)

<400> 17

acgtgtacga tctcttcgtc tggatgcatt attatgcctc tcgagacaca ctcttaggtg 60

gctccaatgt gtggagagac attgattttg cccatgaagc ccctggtttt ctgccttggc 120

atcgtgcttt tctgctgctg tgggaacgtg agatacagaa gataacaggt gatgagaatt 180

tcaccatccc ctacagagga ctgtgtgatc tgcactgatg aatacatggg tggccaacac 240

cccaccaacc ctaatttact cagcccagca tcatttttct cctcatggca ggtaaggaca 300

ggcaaaggga tgaaggtaag gggagggcaa gaggtaaggg cagagccagg ggaagggaaa 360

agctgatcat ggacaaacta tccaatctga ctttaggtac ttaagtgagg tgcgctatct 420

ggagagaaag taaactgctt tccagatttt atgtggatct tcatttagag tattcattca 480

tctctctaac tctgtagaac atagtttaat tatgaataaa agtcagtcta gagggaggaa 540

agtcatgccg ttgtttccaa gcatg 565

Claims

1.一种特异性靶向鸡TYR基因的sgRNA导向序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的sgRNA导向序列的TYR-sgRNA1重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1和腺病毒载体ADV-TYR-sgRNA1，上述两个载体均含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.权利要求1所述sgRNA导向序列在鸡的基因编辑中的应用，所述的应用包括以下步骤：

(1)根据鸡TYR基因的基因组序列，在其第一外显子上设计4个TYR-sgRNA，分别为TYR-sgRNA1，序列为SEQ ID NO：2；TYR-sgRNA2，序列为SEQ ID NO：3；TYR-sgRNA3，序列为SEQ IDNO：4和TYR-sgRNA4，序列为SEQ ID NO：5；在sgRNA导向序列的5’端加上CACC碱基得到TYR-sgRNA-F引物序列，所述TYR-sgRNA-F引物序列的左引物序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示；同时根据sgRNA导向序列获得其对应的DNA互补链，且在5’端加上AAAC碱基得到TYR-sgRNA-R引物序列所述TYR-sgRNA-R引物序列的右引物序列分别如如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示范；分别合成上述单链TYR-sgRNA-F，它们的序列分别如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:13所示，以及单链TYR-sgRNA-R，它们的序列分别如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示，将合成的这两段单链核苷酸通过变性退火形成双链DNA；

(2)将步骤(1)中得到的双链DNA与CRISPR/Cas9系统中的载体pX330连接，得到重组表达载体，所述的重组表达载体含有TYR-sgRNA1的pX330-TYR-sgRNA1载体，其序列如SEQ IDNO：2所示；含有TYR-sgRNA2的pX330-TYR-sgRNA2载体，其序列为SEQ ID NO：3所示；含有TYR-sgRNA3的pX330-TYR-sgRNA3载体，其序列为SEQ ID NO：4所示，含有TYR-sgRNA4的pX330-TYR-sgRNA4载体，其序列为SEQ ID NO：5所示；

(3)将步骤(2)制得的重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1、pX330-TYR-sgRNA2、

pX330-TYR-sgRNA3和pX330-TYR-sgRNA4采用脂质体转染的方法分别转染鸡的成纤维细胞系DF-1，48h后收集细胞并进行特异性靶向验证，所述的验证方法包括产物测序以及TA克隆，最终获得一条具有特异性靶向的sgRNA导向序列，该sgRNA导向序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

4.包含权利要求2所述的特异性靶向鸡TYR基因第一外显子的sgRNA导向序列的重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1和ADV-TYR-sgRNA1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示。

5.包含权利要求2所述的sgRNA序列的重组表达载体pX330-TYR-sgRNA1和腺病毒载体ADV-TYR-sgRNA1在鸡TYR基因编辑中的应用。