CN111778289A - 一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用CRISPR‑Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，属于生物技术领域。本发明通过基因编辑技术沉默基因的表达为基因功能的研究提供了重要的技术手段，RISPR‑Cas9系统属于基因编辑技术中的一种，具有敲除效率高、操作简单、成本低等优点。为此，本发明利用RISPR‑Cas9技术构建Bmp4敲除载体，不仅能够从基因组上抑制Bmp4的表达，为更准确地研究Bmp4基因在鸡原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）形成过程中的功能提供实验素材，而且也有利于为将来构建基因敲除鸡模型奠定实验基础。

Description

一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法
技术领域
本发明涉及一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，属于生物技术领域。
背景技术
骨形成蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4,BMP4)是转化生长因子β(Transforming growth factor-β,TGF-β)超家族中的一员，属于一种多功能的细胞因子。在动物体内，Bmp4由早期胚胎外胚层释放，对生殖细胞的形成和发育起着重要的调控作用。鉴于其功能，Bmp4多被作为一种细胞诱导因子，用于研究哺乳动物生殖细胞的形成和发育等过程。此外，关于Bmp4在调节哺乳动物原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)形成中的功能已较为明晰，而其在调控鸡PGCs形成中的作用机制尚不清楚。
通过基因编辑技术沉默基因的表达是探究基因功能的一种重要方法。现有的基因敲除技术主要有锌指核酸酶(ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR-Cas9)系统，其中CRISPR-Cas9相较于前两种技术更为简单、高效，且成本低。因此，通过CRISPR-Cas9技术靶向敲除鸡Bmp4基因可为后续研究Bmp4在调控鸡PGC的形成过程中发挥的具体功能，以及构建基因敲除鸡模型奠定基础。
发明内容
相比于RNA干扰技术，CRISPR-Cas9技术能够实现基因组上的基因敲除，彻底阻断基因的表达，因此对基因功能的研究更为准确。鉴于此，本发明利用CRISPR-Cas9技术构建鸡Bmp4基因的敲除载体，以期在基因组上实现Bmp4基因的敲除，彻底阻断Bmp4的表达，为后续深入研究Bmp4基因在PGCs形成中的功能及基因敲除鸡模型的构建奠定基础。
本发明的技术方案如下：
通过基因编辑技术沉默基因的表达是探究基因功能一种重要方法。本课题组前期研究发现Bmp4对鸡PGCs的形成具有重要的调控作用，但具体的作用机制尚不清楚。为此，本发明设计了一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，以期为后续研究Bmp4对鸡PGCs形成的调控机制提供实验素材。具体的：
1、根据NCBI官网公布的Bmp4基因的CDS区序列信息以及https://zlab.bio/guide-design-resources网站上提供的的敲除靶点设计原则设计Bmp4基因第一外显子区的3个sgRNA靶位点，并分别合成相应的寡聚单链DNA，同时设置阴性对照sg-NC序列。接着，将寡聚单链DNA退火后形成的双链片段插入到CRISPR-Cas9敲除载体骨架PGMLV-GM1上，以构建Bmp4基因的3个敲除载体。为改善敲除载体转染效率低、作用时间段短缺陷，选择阳性重组质粒进行慢病毒包裹及Lentivirus滴度测定。
2、为验证Bmp4基因3个sgRNA载体的敲除活性，采用两步转染法将双载体(LentiCas9-Blast和sgRNA病毒载体)转染至生长状态良好的DF-1细胞。首先转染LentiCas9-Blast，用含有杀稻瘟菌素Blast的培养基筛选2周，收集存活的细胞进行第二次转染(sgRNA)，同时用Blast和嘌呤霉素Puro筛选2周。
3、收集筛选后的阳性细胞提取基因组，扩增Bmp4基因靶序列片段，回收PCR扩增产物进行T7E1酶切检测，通过灰度值计算基因敲除效率。
4、与此同时，设计特异性引物扩增靶点区段序列进行TA克隆测序，计算基因敲除效率。
本发明的有益效果如下：
本发明操作简单，切实可行，应用广泛。Bmp4是一种多功能细胞因子，由早期胚胎的外胚层释放，对生殖细胞的形成和发育起着重要的调控作用。本发明前期发现，Bmp4能够调控鸡PGCs的形成，但是其具体的作用机制尚不清楚。通过基因编辑技术沉默基因的表达为基因功能的研究提供了重要的技术手段，RISPR-Cas9系统属于基因编辑技术中的一种，具有敲除效率高、操作简单、成本低等优点。为此，本发明利用RISPR-Cas9技术构建Bmp4敲除载体，不仅能够从基因组上抑制Bmp4的表达，为更准确地研究Bmp4基因在鸡原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)形成过程中的功能提供实验素材，而且也有利于为将来构建基因敲除鸡模型奠定实验基础。
具体实施方式
1.Bmp4-sgRNA敲除载体构建及慢病毒包裹
为了构建Bmp4-sgRNA敲除载体，首先查找NCBI官网上公布的鸡Bmp4基因CDS区序列信息，根据https://zlab.bio/guide-design-resources网站提供的敲除靶点设计原则设计3个sgRNA靶位点(见表1)，并分别合成相应的寡聚单链DNA，进而合成和扩增靶序列，oligo引物序列见表2。同时，设置阴性对照sg-NC。
表1敲除靶点序列信息
靶点 序列(5’-3’)
sg-NC ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA
sg1 AAGAAAGTCGCAGAGCTTCA
sg2 CCAAAGCCATGAACTCTTGC
sg3 TGACGGCTGATTTGCTGGGC
表2 sgRNA oligo序列信息
oligo名称 寡聚单链DNA序列5’-3’
Primer-NC-F caccgACGGAGGCTAAGCGTCGCAA
Primer-NC-R aaacTTGCGACGCTTAGCCTCCGTc
Primer-F1 CACCGAAGAAAGTCGCAGAGCTTCA
Primer-R1 AAACTGAAGCTCTGCGACTTTCTTC
Primer-F2 CACCGCCAAAGCCATGAACTCTTGC
Primer-R2 AAACGCAAGAGTTCATGGCTTTGGC
Primer-F3 CACCGTGACGGCTGATTTGCTGGGC
Primer-R3 AAACGCCCAGCAAATCAGCCGTCAC
接着，将寡聚单链DNA退火后形成的双链片段分别插入到CRISPR-Cas9载体(PGMLV-GM1)中，构建CRISPR-Cas9重组质粒Bmp4-sgRNA1、Bmp4-sgRNA2、Bmp4-sgRNA3、Bmp4-NC。随后分别将重组质粒转化至感受态细胞，涂平板(含氨苄霉素的LB固体培养基)，过夜生长后挑取若干个单菌株进行菌液PCR测序，并将初步鉴定为阳性的菌落送生物公司测序，比对测序结果后确定敲除载体的准确性。为提高敲除载体的转染效率，并使其能在细胞中长期稳定表达，本研究将提取的阳性重组质粒进行了慢病毒包装，根据每孔病毒含量及qRT-PCR结果计算出3个慢病毒载体滴度。
2.Bmp4-sgRNA敲除载体活性验证
为了验证Bmp4基因3个sgRNA载体的敲除活性，本发明使用双载体(LentiCas9-Blast和sgRNA病毒载体)进行分步转染至生长状态良好的DF-1细胞。首先转染LentiCas9-Blast载体，并用杀稻瘟菌素Blast筛选，转化成功的细胞在含有药物的培养基中存活下来并增殖。Blast筛选两周后细胞重新消化铺板，并将Bmp4-sgRNA载体分组转染，之后使用同时含有Blast和嘌呤霉素Puro的培养基筛选两周。当细胞逐渐趋于稳定并开始增殖时，表明此时存活的细胞基因组已被修饰，表现出对Blast和Puro两个药物的耐受性。
3.T7E1酶切检测Bmp4基因敲除效率
为了检测Bmp4基因敲除效率，首先根据T7E1酶切实验原理设计扩增引物。收集步骤2中经Blast和Puro筛选后的细胞提取基因组，扩增敲除靶位点前后约500bp的片段。将PCR扩增产物纯化回收后进行T7E1酶切，对酶切产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，检测酶切结果，并通过灰度值分析计算基因敲除效率。
4.TA克隆测序检测Bmp4基因敲除效率
为进一步准确检测Bmp4基因敲除效率，首先设计特异性引物扩增靶点区段序列，产物回收后连接到T载体上，转化感受态细胞后挑菌送测序。对测序区段和靶序列进行比对，检测基因组上碱基数目的缺失情况。根据阳性菌株数与总菌株数的比值统计基因敲除效率。

Claims (5)

1.一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，包括：
1）Bmp4-sgRNA敲除载体构建及慢病毒包裹；
2）Bmp4-sgRNA敲除载体活性验证；
3）T7E1酶切检测Bmp4基因敲除效率；
4）TA克隆测序检测Bmp4基因敲除效率。
2.根据权利要求1所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤1）：
根据NCBI官网公布的Bmp4基因的CDS区序列信息以及https://zlab.bio/guide-design-resources网站上提供的的敲除靶点设计原则设计Bmp4基因第一外显子区的3个sgRNA靶位点，并分别合成相应的寡聚单链DNA，同时设置阴性对照sg-NC序列；
接着，将寡聚单链DNA退火后形成的双链片段插入到CRISPR-Cas9敲除载体骨架PGMLV-GM1上，以构建Bmp4基因的3个敲除载体；为改善敲除载体转染效率低、作用时间短缺陷，选择阳性重组质粒进行慢病毒包裹及Lentivirus滴度测定。
3.根据权利要求2所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤2）：
为验证Bmp4基因3个sgRNA载体的敲除活性，采用两步转染法将双载体（LentiCas9-Blast和sgRNA病毒载体）转染至生长状态良好的DF-1细胞；首先转染LentiCas9-Blast，用含有杀稻瘟菌素Blast的培养基筛选2周，收集存活的细胞进行第二次转染（sgRNA），同时用Blast和嘌呤霉素Puro筛选2周。
4.根据权利要求3所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤3）：
收集筛选后的阳性细胞提取基因组，扩增Bmp4基因靶序列片段，回收PCR扩增产物进行T7E1酶切检测，通过灰度值计算基因敲除效率。
5.根据权利要求4所述的一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，其特征是，所述步骤4）：
设计特异性引物扩增靶点区段序列进行TA克隆测序，计算基因敲除效率。
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