CN105483034B - 一种转换酵母交配型的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种转换酵母交配型的方法。本发明所述转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。本发明所述转换酵母交配型的方法可高效、快速转换酿酒酵母单倍体交配型，不依赖酿酒酵母自身染色体结构HMLα和HMRa，无需经过二倍体酿酒酵母阶段，且无需对待转换酿酒酵母菌株进行诱导等处理，直接获得相反交配型酿酒酵母菌株，实验周期短。

Description

一种转换酵母交配型的方法
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种转换酵母交配型的方法，尤其是涉及一种快速转换酿酒酵母交配型的方法。
背景技术
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，不仅因为传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其作用相当于原核的模式生物大肠杆菌。酿酒酵母具有单倍体和双倍体两种常见生活方式。单倍体的生活史较简单，通过有丝分裂繁殖。在环境压力较大时通常则死亡。二倍体细胞(酵母的优势形态)也通过简单的有丝分裂繁殖，但在外界条件不佳时能进入减数分裂，生成一系列单倍体的孢子。单倍体可以交配，重新形成二倍体。它们之间的转换可通过交配(单倍体孢子融合产生双倍体)和孢子形成(双倍体减数分裂产生单倍体孢子)来实现，而这些变化的发生则是由菌株的交配型所决定。酿酒酵母的交配型是由位于酵母染色体Ⅲ上MAT基因座控制的，MAT基因座包括两个等位基因MATa和MATα，因此将酿酒酵母单倍体菌株的交配型(mating-type)分为两种：MATa和MATα。
酿酒酵母MATa和MATα两种交配型的转换主要由HO基因的产物引起的。HO基因在自身启动子作用下表达Ho蛋白，该蛋白会在MAT基因座处产生双链断裂，激活Ⅲ号染色体两端的沉默的HMLα或者HMRa基因座将自身的Yα或者Ya序列复制至MAT基因座处修补双链断裂。在此过程中，酿酒酵母菌株的交配型发生了转换(图1)。
大多数实验室菌株的HO基因己积累了很多突变或者进行了基因失活处理，故不能自发的发生交配型的转换过程，而交配型的相互转化却是酵母研究的重要手段。
交配型转换的传统方法为将载有HO基因的质粒转化到这些细胞中，诱使这些细胞发生交配型的转换。不过利用HO基因诱导酿酒酵母细胞交配型的转换后，异种交配型细胞会立刻相互接触从而产生二倍体细胞，因此还需要进行生孢实验来获得单倍体菌株，实验周期较长。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的问题提供一种快速转换酿酒酵母交配型的方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。
其中，本发明所述转换酵母交配型的方法具体操作为将酿酒酵母感受态细胞与转化体系混合进行酵母转化，然后筛选，分纯；其中所述酿酒酵母感受态细胞为包含pRS415+Cas9质粒的酿酒酵母菌株，所述转化体系包含质粒DNA，所述质粒DNA包括guide-RNA质粒和限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒片段。
优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述感受态细胞的制备方法为挑取携带pRS415+Cas9质粒的酵母菌株单菌落于SC-Leu液体培养基中，30℃过夜培养，然后接种过夜培养液到YPD中30℃、220rpm条件下培养至OD600达到0.5，离心，收集细胞；用0.1MLiOAc重悬细胞，离心，吸除部分上清，剩余的LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
在一些实施方案中，所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4741感受态细胞。
在另一些实施方案中，所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4742感受态细胞。
优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述guide-RNA质粒的构建方法包括以下步骤：
a)选择guide-RNA质粒的protospacer，并合成引物；
b)退火粘合两个引物，得到双链DNA
c)限制性内切酶NotI和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
d)Gibson组装将pRS426+SNR52p-gRNA线性化质粒和双链DNA进行组装；
e)转化大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒测序鉴定。
在一些实施方案中，所述guide-RNA质粒为pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的protospacer如SEQ ID NO:1所示。
所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
在另一些实施方案中，所述guide-RNA质粒为pRS426+SNR52P-gRNA.MATα。
其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATα质粒的protospacer如SEQ ID NO:4所示。
所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATα质粒的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒的构建方法包括以下步骤：
a)合成引物:
b)以酿酒酵母基因组为模板，使用Thermo Scientific高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA片段MATα表达盒，电泳回收；
c)利用平末端质粒克隆，将MATα表达盒连接到pTOPO平末端载体上，大肠杆菌转化后涂布于LB+Kan平板上，37℃过夜培养；
d)挑取单菌落接种于LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，提取质粒测序鉴定；
e)限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒。
在一些实施方案中，所述MAT基因表达盒质粒为pTOPO+MATα。
在另一些实施方案中，所述MAT基因表达盒质粒为pTOPO+MATa。
其中，所述MAT基因表达盒质粒的引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
所述pTOPO+MATα质粒的模板为酿酒酵母BY4742基因组。
所述pTOPO+MATa质粒的模板为酿酒酵母BY4741基因组。
本发明所述转换酵母交配型的方法所述转化体系中所述质粒DNA组成为每150μL中含50ng guide-RNA质粒和5μL MAT基因表达盒质粒，余量为水。
进一步的，所述转化体系还包括50％PEG3350、1M LiOAc和10mg/mL ssDNA。
其中50％PEG3350、1M LiOAc、10mg/mL ssDNA和质粒DNA的体积比为62:9:4:15。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。本发明所述转换酵母交配型的方法可高效、快速转换酿酒酵母单倍体交配型，不依赖酿酒酵母自身染色体结构HMLα和HMRa，无需经过二倍体酿酒酵母阶段，且无需对待转换酿酒酵母菌株进行诱导等处理，直接获得相反交配型酿酒酵母菌株，实验周期短。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示基于HO基因转换酿酒酵母交配型方法示意图；
图2示本发明所述转换酵母交配型方法的示意图；
图3示实施例1将酿酒酵母菌株BY4741交配型转换为MATα的效率统计图；
图4示实施例2将酿酒酵母菌株BY4742交配型转换为MATa的效率统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。
本发明所述转换酵母交配型的方法利用Cas9蛋白取代Ho蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，并利用外源导入的MAT片段对双链断裂进行修补，对酿酒酵母交配型进行转换，具体如图2所示。
其中，本发明所述转换酵母交配型的方法具体操作为将酿酒酵母感受态细胞与转化体系混合进行酵母转化，然后筛选，分纯；其中所述酿酒酵母感受态细胞为包含pRS415+Cas9质粒的酿酒酵母菌株，所述转化体系包含质粒DNA，所述质粒DNA包括guide-RNA质粒和限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒片段。
优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述感受态细胞的制备方法为挑取携带pRS415+Cas9质粒的酵母菌株单菌落于SC-Leu液体培养基中，30℃过夜培养，然后接种过夜培养液到YPD中30℃、220rpm条件下培养至OD600达到0.5，离心，收集细胞；用0.1MLiOAc重悬细胞，离心，吸除部分上清，剩余的LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
其中，所述携带pRS415+Cas9质粒的酵母菌可以按照本领域公知的转化方法将pRS415-Cas9质粒转化入酿酒酵母菌株。
在一些实施方案中，携带pRS415+Cas9质粒的酵母菌具体为利用LiOAc转化法将携带Cas9基因的pRS415+Cas9质粒转化入酿酒酵母菌株中，转化后的细胞涂布于SC-Leu平板上进行筛选，30℃培养2天，挑取单克隆转化子在SC-Leu平板上划线分纯。
所述SC-Leu平板为缺省亮氨酸的合成完全培养基平板。SC-Leu平板具体配制方法为合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉。而所述pRS415+Cas9质粒为携带Cas9基因的pRS415质粒。
本发明中所述感受态细胞的制备方法所涉及的SC-Leu液体培养基为缺省亮氨酸的合成完全液体培养基。SC-Leu液体培养基具体配制方法为合成酵母氮源YNB 6.7g/L，葡萄糖20g/L，单缺亮氨酸的混合氨基酸粉末2g/L。所涉及的YPD为酵母浸出粉胨葡萄糖培养基。YPD具体配制方法为酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。
在一些实施方案中，所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4741感受态细胞。
在另一些实施方案中，所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4742感受态细胞。
本发明所述转换酵母交配型的方法中所述转化体系包含质粒DNA，所述质粒DNA包括guide-RNA质粒和限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒片段。
其中，所述guide-RNA质粒为指导RNA质粒，作为插入前间区序列(protospacer)碱基的模板，为后续构建pRS426+SNR52P-gRNA.MATa等质粒提供模板。而添加protospacer的guide RNA质粒则用于转录得到guide RNA，然后引导Cas9蛋白在特定位点对DNA进行切割，产生双链断裂。
优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述guide-RNA质粒的构建方法包括以下步骤：
a)选择guide-RNA质粒的protospacer，并合成引物；
b)退火粘合两个引物，得到双链DNA
c)限制性内切酶NotI和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
d)Gibson组装将pRS426+SNR52p-gRNA线性化质粒和双链DNA进行组装；
e)转化大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒测序鉴定。
在一些实施方案中，所述guide-RNA质粒为pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的protospacer如SEQ ID NO:1所示。
所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的引物如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
在另一些实施方案中，所述guide-RNA质粒为pRS426+SNR52P-gRNA.MATα。
其中，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATα质粒的protospacer如SEQ ID NO:4所示。
所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATα质粒的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
本发明所述guide-RNA质粒的构建方法中利用限制性内切酶NotI和CIP消化质粒。所述CIP为Calf Intestinal Alkaline Phosphatase，即牛小肠碱性磷酸酶。经限制性内切酶酶切的质粒5'端带有磷酸基团。牛小肠碱性磷酸酶消化质粒可以去除DNA 5′末端的磷酸基团，防止DNA片断自连。
本发明所述guide-RNA质粒的构建方法中所述pRS426+SNR52p-gRNA线性化质粒和双链DNA采用Gibson组装方法进行组装。Gibson组装是一种新兴的克隆方法，只需要简单的等温一步拼接。
本发明所述guide-RNA质粒的构建方法在Gibson组装后转化大肠杆菌感受态细胞筛选后提取质粒。
其中所述大肠杆菌感受态细胞优选为大肠杆菌DH5α感受态细胞。所述筛选为转化后的体系涂布LB+Carb平板上，37℃培养12h。所述LB+Carb平板为含有羧苄青霉素的LB固体培养基平板。LB+Carb平板具体配制方法为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，羧苄青霉素75μg/mL，pH＝7.0。
本发明所述转换酵母交配型的方法中所述限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒片段为MAT基因表达盒质粒经限制性内切酶NsiI消化后的片段。
优选的，本发明所述转换酵母交配型的方法中所述限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒的构建方法包括以下步骤：
a)合成引物:
b)以酿酒酵母基因组为模板，使用Thermo Scientific高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA片段MATα表达盒，电泳回收；
c)利用平末端质粒克隆，将MATα表达盒连接到pTOPO平末端载体上，大肠杆菌转化后涂布于LB+Kan平板上，37℃过夜培养；
d)挑取单菌落接种于LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，提取质粒测序鉴定；
e)限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒。
其中，所述MAT基因表达盒质粒的引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中，所述MAT基因表达盒质粒为pTOPO+MATα。所述pTOPO+MATα质粒的模板为酿酒酵母BY4742基因组。
在另一些实施方案中，所述MAT基因表达盒质粒为pTOPO+MATa。所述pTOPO+MATa质粒的模板为酿酒酵母BY4741基因组。
上述LB+Kan平板为含有卡那霉素的LB固体培养基平板。LB+Kan平板具体配制方法为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50μg/mL，pH＝7.0
所述LB+Carb液体培养基为含有羧苄青霉素的LB液体培养基。LB+Carb液体培养基的具体配制方法为胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，羧苄青霉素75μg/mL，pH＝7.0。
本发明所述转换酵母交配型的方法所述转化体系中所述DNA除了guide-RNA质粒和限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒片段外还含有水。
在一些实施方案中，所述转化体系中所述质粒DNA组成为每150μL中含50ngguide-RNA质粒和5μL MAT基因表达盒质粒，余量为水。
在一些实施例中，所述质粒DNA为pRS426+SNR52p-gRNA.MATa，50ng；pTOPO+MATα酶切体系，5μL，加水补至150μL。
在另一些实施例中，所述质粒DNA为pRS426+SNR52p-gRNA.MATα，50ng；pTOPO+MATa酶切体系，5μL，加水补至150μL。
进一步的，所述转化体系还包括50％PEG3350、1M LiOAc和10mg/mL ssDNA。
其中，优选的，所述转化体系中50％PEG3350、1M LiOAc、10mg/mL ssDNA和质粒DNA的体积比为62:9:4:15。
在一些实施方案中所述每900μL转化体系的成分体积为
本发明所述转换酵母交配型的方法中所述酵母转化可以按照本领域公知的方法进行。在一些实施方案中，所述酵母转化具体为感受态细胞加入至转化体系中，混匀；30℃培养箱中孵育30min；加入DMSO，混匀；42℃热激15min；离心收集细胞；吸出上请，加入CaCl2，重悬细胞，静置5min；离心吸出上清。
本发明所述转换酵母交配型的方法在转化后对细胞进行筛选。所述筛选可以按照本领域公知的方法进行。
在一些实施方案中，所述筛选具体为无菌水中重悬细胞涂布SC-Leu-Ura培养板进行筛选。其中所述SC-Leu-Ura培养板为缺省亮氨酸和尿嘧啶的合成完全培养基平板。SC-Leu-Ura培养基具体配制方法为合成酵母氮源YNB6.7g/L，葡萄糖20g/L，缺省亮氨酸和尿嘧啶的混合氨基酸粉末2g/L，2％琼脂粉。
本发明所述转换酵母交配型的方法在筛选后还可以进一步在SC-Leu-Ura培养板上对筛选获得的单菌落进行划线分纯。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种转换酵母交配型的方法，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型。本发明所述转换酵母交配型的方法可高效、快速转换酿酒酵母单倍体交配型，不依赖酿酒酵母自身染色体结构HMLα和HMRa，无需经过二倍体酿酒酵母阶段，且无需对待转换酿酒酵母菌株进行诱导等处理，直接获得相反交配型酿酒酵母菌株，实验周期短。
为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述。如无特殊说明，本发明所述质粒、载体等均可通过商业渠道购买得到。如pTOPO平末端载体为商业载体pCR-Blunt II-TOPO vector(Invitrogen/Life Technologies,45-0245)。pRS426+SNR52p-gRNA是根据商业化载体Addgene plasmid#43802改造而来。
实施例1
利用基于CRISPR/Cas9技术的酿酒酵母交配型转换技术，对酿酒酵母BY4741进行交配型转换，包括以下步骤：
1、利用LiOAc转化法将携带Cas9基因的质粒pRS415+Cas9转化入酿酒酵母菌株BY4741中，转化后的细胞涂布于SC-Leu平板上进行筛选，30℃培养2天。挑取单克隆转化子在SC-Leu平板上划线分纯，备用。
2、构建靶位点为MATa的guide-RNA质粒，其构建步骤如下：
a)选择protospacer为acaaaaatatttctaacaat；
b)合成引物：“GCAGTGAAAGATAAATGATCacaaaaatatttctaacaatGTTTTAGAGCTAGAAATAGC”和“GCTATTTCTAGCTCTAAAACattgttagaaatatttttgtGATCATTTATCTTTCACTGC”；
c)退火粘合两个引物，得到双链DNA；
d)利用限制性内切酶NotI和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
e)利用Gibson组装将线性化质粒和双链DNA进行组装；
f)将反应体系转化如DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37℃培养12h；
g)挑取5个单菌落接种于5mL LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，进行Sanger测序；
h)测序正确的质粒命名为pRS426+SNR52P-gRNA.MATa。
3、构建MATα表达盒质粒，其构建步骤如下：
a)合成引物:
MAT-amplify-F：ACGATAACTGGTTGGAAAGCGTAA
MAT-amplify-R：AGACTTGTGGCGAAGATGAATAGT；
b)以酿酒酵母BY4742基因组为模板，使用Thermo Scientific高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA片段MATα表达盒，并进行琼脂糖电泳回收，目标片段长度为3398bp；
c)利用平末端质粒克隆，将MATα表达盒连接到pTOPO平末端载体上，大肠杆菌DH5α转化后涂布于LB+Kan平板上，37℃过夜培养；
d)挑取3个单菌落接种于5mL LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，进行Sanger测序；
e)测序正确的质粒命名为pTOPO+MATα。
4、利用限制性内切酶NsiI对质粒pTOPO+MATα进行消化。
5、酿酒酵母转化，其步骤如下：
a)挑取携带pRS415+Cas9质粒的BY4741单菌落于5mL SC-Leu液体培养基中，30℃过夜培养；
b)测量过夜培养的酿酒酵母培养液OD600，接种过夜培养液到5mL YPD液体培养基中(0.1250D600/mL)，30℃、220rpm条件下培养至OD600达到0.5(约需要3.5h-4.5h)；
c)吸取1.5mL步骤b)得到的酿酒酵母培养液至1.5mL EP管内，5000rpm离心1min，收集细胞；用1mL无菌水重悬细胞，同上离心，收集细胞；用1mL 0.1M LiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；用移液器吸除900μL上清，剩余的100μL LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
d)准备转化体系，其中质粒DNA为pRS426+SNR52p-gRNA.MATa，50ng；pTOPO+MATα酶切体系，5μL，加水补至150μL：
成分体积(μL)
e)将100μL感受态细胞中加入至转化体系中，吹吸均匀，最高速涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min；加入90μL DMSO，涡旋震荡10s；42℃热激15min；3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上请，加入400μL 5mM CaCl2，重悬细胞，静置5min；3600rpm离心30s，吸出上请，在无菌水中重悬后涂布SC-Leu-Ura筛选培养板筛选。
6、待酵母在筛选培养板上生长2天，挑取单菌落于SC-Leu-Ura平板上划线分纯。
7、利用酵母菌落PCR方法验证分纯后的菌株交配型(Huxley,C.,et al.TrendsGenet(1990),6,236)，统计酿酒酵母菌株BY4741交配型转换为MATα的效率结果见图3。随后挑选MATα交配型的菌株进行保存，命名为BY4741-MATα。
结果显示利用在对BY4741进行交配型转换时，分别挑选96的转化子进行交配型的验证。对照组(转化pRS426质粒或者转化pRS426质粒和pTOPO+MATα酶切DNA片段)基本保持原交配型(100％和94.79％)，并未能获得转换交配型的单倍体酵母菌株。对照组(转化pRS426+SNR52p-gRNA.MATa质粒)中有9.38％的菌株转换交配型至MATα的单倍体菌株，其余为二倍体菌株，说明所选择的Cas9蛋白替代了Ho蛋白的功能，在对酵母菌株MATa表达盒进行切割后导致HMLα对双链断裂进行修复，同时转换了酵母菌株的交配型。实验组(转化pRS426+SNR52p-gRNA.MATa质粒和pTOPO+MATα酶切DNA片段)利用本发明方法对酵母菌株进行交配型的转换，筛选得到的交配型转换后的单倍体酵母菌株比例为26.04％，明显高于对照组，说明本发明所述方法可以有效转换酿酒酵母交配型。
实施例2
利用基于CRISPR/Cas9技术的酿酒酵母交配型转换技术，对酿酒酵母BY4742进行交配型转换，包括以下步骤：
1、利用LiOAC转化法将携带Cas9基因的质粒pRS415+Cas9转化入酿酒酵母菌株BY4742中，转化后的细胞涂布于SC-Leu平板上进行筛选，30℃培养2天。挑取单克隆转化子在SC-Leu平板上划线分纯，备用。
2、构建靶位点为MATα的guide-RNA质粒，其构建步骤如下：
a)选择protospacer为caaatcatacagaaacacag；
b)合成引物:
“GCAGTGAAAGATAAATGATCcaaatcatacagaaacacagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC”和
“GCTATTTCTAGCTCTAAAACctgtgtttctgtatgatttgGATCATTTATCTTTCACTGC”；
c)退火粘合两个引物，得到双链DNA；
d)利用限制性内切酶NotI和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
e)利用Gibson组装将线性化质粒和双链DNA进行组装；
f)将反应体系转化如DH5α大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37℃培养12h；
g)挑取5个单菌落接种于5mL LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，进行Sanger测序；
h)测序正确的质粒命名为pRS426+SNR52P-gRNA.MATα。
3、构建MATa表达盒质粒，其构建步骤如下：
a)以酿酒酵母BY4741基因组为模板，以实施例1中的引物MAT-amplify-F和MAT-amplify-R为扩增引物，使用Thermo Scientific高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA片段MATa表达盒，并进行琼脂糖电泳回收，目标片段长度为3293bp；
b)利用平末端质粒克隆，将MATa表达盒连接到pTOPO平末端载体上，大肠杆菌DH5α转化后涂布于LB+Kan平板上，37℃过夜培养；
c)挑取3个单菌落接种于5mL LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，进行Sanger测序；
d)测序正确的质粒命名为pTOPO+MATa。
4、利用限制性内切酶NsiI对质粒pTOPO+MATa进行消化。
5、酿酒酵母转化，其步骤如下：
a)挑取携带pRS415-Cas9质粒的BY4742单菌落于5mL SC-Leu液体培养基中，30℃过夜培养；
b)测量过夜培养的酿酒酵母培养液OD600，接种过夜培养液到5mL YPD中(0.1250D600/mL)，30℃、220rpm条件下培养至OD600达到0.5(约需要3.5h-4.5h)；
c)吸取1.5mL酿酒酵母培养液至1.5mL EP管内，5000rpm离心1min，收集细胞；用1mL无菌水重悬细胞，同上离心，收集细胞；用1mL 0.1M LiOAc重悬细胞，同上离心，收集细胞；用移液器吸除900μL上清，剩余的100μL LiOAc重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
d)准备转化体系，其中质粒DNA为pRS426+SNR52p-gRNA.MATα，50ng；pTOPO+MATa酶切体系，5μL，加水补至150μL：
成分体积(μL)
e)将100μL感受态细胞中加入至转化体系中，吹吸均匀，最高速涡旋10s；30℃培养箱中孵育30min；加入90μL DMSO，涡旋震荡10s；42℃热激15min；3600rpm离心30s，收集细胞；吸出上请，加入400μL 5mM CaCl2，重悬细胞，静置5min；3600rpm离心30s，吸出上请，在无菌水中重悬后涂布SC-Leu-Ura培养板进行筛选。
6、待酵母在筛选培养板上生长2天，挑取单菌落于SC-Leu-Ura平板上划线分纯。
7、利用酵母菌落PCR方法验证分纯后的菌株交配型，统计酿酒酵母菌株BY4742交配型转换为MATa的效率结果见图4。挑选MATα交配型的菌株进行保存，命名为BY4742-MATa。
结果显示利用在对BY4742进行交配型转换时，分别挑选96的转化子进行交配型的验证。对照组(转化pRS426质粒或者转化pRS426质粒和pTOPO+MATa酶切DNA片段)基本保持原交配型(100％和84.38％)，并未能获得转换交配型的单倍体酵母菌株。对照组(转化pRS426+SNR52p-gRNA.MATα质粒)中有83.63％的菌株转换交配型至MATa的单倍体菌株，2.08％的菌株仍未交配型MATα的单倍体菌株，其余为二倍体菌株，说明所选择的Cas9蛋白替代了Ho蛋白的功能，在对酵母菌株MATa表达盒进行切割后导致HMLα对双链断裂进行修复，同时转换了酵母菌株的交配型。实验组(转化pRS426+SNR52p-gRNA.MATa质粒和pTOPO+MATa酶切DNA片段)利用本发明方法对酵母菌株进行交配型的转换，筛选得到的交配型转换后的单倍体酵母菌株比例为92.19％，明显高于对照组，说明该方法可以有效转换酿酒酵母交配型。

Claims (8)

1.一种转换酿酒酵母交配型的方法，其特征在于，利用Cas9蛋白在MAT基因座处产生双链断裂，外源导入的MAT片段对该双链断裂进行修补，转换酿酒酵母交配型；
具体操作为将酿酒酵母感受态细胞与转化体系混合进行酵母转化，然后筛选，分纯；其中所述酿酒酵母感受态细胞为所述感受态细胞为包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4741感受态细胞或包含质粒pRS415+Cas9的酵母菌株BY4742感受态细胞；所述转化体系包含质粒DNA，所述质粒DNA包括guide-RNA质粒和限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒片段；所述guide-RNA质粒为pRS426+SNR52P-gRNA.MATa或pRS426+SNR52P-gRNA.MATα；所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的protospacer如SEQ ID NO:1所示，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATα质粒的protospacer如SEQ ID NO:4所示；所述MAT基因表达盒质粒为pTOPO+MATα或pTOPO+MATa。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述感受态细胞的制备方法为挑取携带pRS415+Cas9质粒的酵母菌株单菌落于SC-Leu液体培养基中，30℃过夜培养，然后接种过夜培养液到 YPD 中30℃、220rpm条件下培养至OD600达到0. 5，离心，收集细胞；用0.1M LiOAc重悬细胞，离心，吸除部分上清，剩余的LiOAc 重悬细胞，置于冰上，得到感受态细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述guide-RNA质粒的构建方法包括以下步骤：
a）选择guide-RNA质粒的protospacer，并合成引物；
b）退火粘合两个引物，得到双链DNA
c）限制性内切酶NotI和CIP消化质粒pRS426+SNR52p-gRNA，使之线性化；
d）Gibson组装将pRS426+SNR52p-gRNA线性化质粒和双链DNA进行组装；
e）转化大肠杆菌感受态细胞中，涂布于LB+Carb平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种于LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒测序鉴定。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATa质粒的protospacer如SEQ ID NO:1所示，引物如SEQ ID NO:2和3所示；所述pRS426+SNR52P-gRNA.MATα质粒的protospacer如SEQ ID NO:4所示，引物如SEQ ID NO:5和6所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒的构建方法包括以下步骤：
a）合成引物，所述引物如SEQ ID NO:7和8所示；
b）以酿酒酵母基因组为模板，使用Thermo Scientific Phusion®高保真DNA聚合酶进行PCR获得DNA片段MAT基因表达盒，电泳回收；
c）利用平末端质粒克隆，将MAT基因表达盒连接到pTOPO平末端载体上，大肠杆菌转化后涂布于LB+Kan平板上，37℃过夜培养；
d）挑取单菌落接种于LB+Carb液体培养基中，37℃过夜培养后，提取质粒，提取质粒测序鉴定；
e）限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述pTOPO+MATα质粒的模板为酿酒酵母BY4742基因组；所述pTOPO+MATa质粒的模板为酿酒酵母BY4741基因组。
7.根据权利要求2-6任意一项所述的方法，其特征在于，所述转化体系中所述质粒DNA组成为每150μL中含50ng guide-RNA质粒和5μL 限制性内切酶NsiI消化的MAT基因表达盒质粒，余量为水。
8.根据权利要求2-6任意一项所述的方法，其特征在于，所述转化体系还包括50%PEG3350、1M LiOAc和10mg/mL ssDNA；其中50% PEG3350、1M LiOAc、10mg/mL ssDNA和质粒DNA的体积比为62:9:4:15。
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